Диагностическая значимость уровней экспрессии мРНК сурвивина, металлопротеиназы-7 и циклооксигеназы-2 при раке желудка

Высоцкая, Ольга Владимировна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Диагностическая значимость уровней экспрессии мРНК сурвивина, металлопротеиназы-7 и циклооксигеназы-2 при раке желудка
ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Диагностическая значимость уровней экспрессии мРНК сурвивина, металлопротеиназы-7 и циклооксигеназы-2 при раке желудка"

484753

На правах рукописи

Высоцкая Ольга Владимировна

ДИАГНОСТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ УРОВНЕЙ ЭКСПРЕССИИ мРНК СУРВИВИНА, МЕТАЛЛОПРОТЕИНАЗЫ-7 И ЦИКЛООКСИГЕНАЗЫ-2 ПРИ РАКЕ ЖЕЛУДКА

03.01.04 - Биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2011

2 6 МАЙ 2011

4847537

Работа выполнена в ГУЗ «Московский научно-исследовательский институт медицинской Экологии» Департамента здравоохранения

г. Москвы

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

Глухов Александр Иванович

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Герштейн Елена Сергеевна

доктор биологических наук, профессор Мяндина Галина Ивановна

Ведущая организация: Московский государственный

университет им. М.В. Ломоносова, биологический факультет

Защита состоится «17» июня 2011 г. В 14 часов на заседании диссертационного совета Д 212.203.13 при Российском университете дружбы народов по адресу: 117198, Москва, улица Миклухо-Маклая,

д. 8, Медицинский факультет.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Российского университета дружбы народов по адресу: 117198, Москва, улица Миклухо-Маклая, д. 6.

Автореферат диссертации разослан « » Л/ЯЛ' 2011 г.

Ученый секретарь диссертационного совета Д 212.203.13 профессор, доктор биологических наук ^¿.¿¡4Е.В. Лукашева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Рак желудка (РЖ) в России занимает одно из ведущих мест в общей структуре онкологической заболеваемости и второе место среди опухолей желудочно-кишечного тракта (ЖКТ). У 75% первично выявленных больных заболевание диагностируется в III—IV стадии, что предопределяет неудовлетворительные результаты лечения. Частота обнаружения ранних форм РЖ не превышает 1020%, а у 83% больных при первично выявленной злокачественной опухоли уже существуют регионарные метастазы [Симонов H.H. и соавт, 2001]. В связи с отсутствием каких-либо специфических клинических проявлений диагностика раннего РЖ должна быть основана исключительно на применении фиброгастроскопии с биопсией в качестве метода скрининга. В Японии, где давно практикуется эндоскопический скрининг ЖКТ, выявляемость раннего РЖ наиболее высокая в мире (54-56%). Однако при тяжелой дисплазии в условиях хронического воспаления, при подслизистом опухолевом росте, а также при изъязвленной опухоли, покрытой некротическим налетом, сложно объективно трактовать морфологические изменения слизистой. В этом случае большие надежды возлагают на использование молекулярно-биологических методов диагностики с целью выявления эффективных онкомаркеров.

Эпителий желудка относится к тканям, которым свойственно непрерывное клеточное обновление. В основе возникновения изменений в слизистой желудка, приводящих к развитию рака, лежит дисбаланс между апоптозом и пролиферацией клеток [Маев И.В. и соавт, 2006].

Среди белков, ингибирующих апоптоз, ключевую роль играет сурвивин. Его экспрессия обнаруживается в большинстве видов опухолей, в то время как в нормальных тканях она практически не детектируется. Экспрессия гена сурвивина, по разным данным, обнаруживается в 35 - 82% опухолей желудка [Meng Н. et al., 2004, Krieg А., et al., 2002, Da C.L., et al., 2009] и ассоциируется с неблагоприятным прогнозом заболевания.

В случае диффузного РЖ одним из ведущих событий в канцерогенезе считается мутация Е-кадгерина [Имянитов E.H., 2009]. Металлопротеиназа ММР-7 (матрилизин) инициирует эпителиально-мезенхимальный переход в ткани желудка путем протеолиза Е-кадгерина, что приводит к дистантным метастазам [Yin Y. et al., 2010]. Особенностью ММР-7 является то, что она экспрессируется

самими опухолевыми клетками и участвует в развитии рака, начиная с его ранних стадий [II М., 2006].

Замечено, что в ряде интестинальных опухолей желудка наблюдается повышенная экспрессия циклооксигеназы-2 (СОХ-2), при этом в нормальной ткани желудка она отсутствует или находится на низком уровне [Samaka R.M., 2006]. Гиперэкспрессия СОХ-2 в злокачественных опухолях определяет устойчивость к апоптозу, усиление пролиферативной активности клеток, инвазивность, ангиогенез и метастазирование [Konturek P.C. et al., 2005]. В настоящее время клиническая значимость указанных выше онкомаркеров для диагностики РЖ только начинает изучаться.

Цель исследования - оценить значимость определения уровней экспрессии мРНК сурвивина, ММР-7 и СОХ-2 в различных областях слизистой желудка для повышения эффективности диагностики РЖ и для установления границ распространения опухоли.

Задачи исследования.

1. Оптимизировать условия проведения анализа экспрессии гена сурвивина методом совмещенных реакций обратной транскрипции и ПЦР (ОТ-ПЦР) на различном клеточном и клиническом материале.

2. Провести анализ относительной экспрессии мРНК генов сурвивина, СОХ-2 и ММР-7 методом ОТ-ПЦР в клинических образцах слизистой от пациентов с аденокарциномой желудка, взятых из опухоли и на расстоянии 2, 5 и 8 см от её видимой границы.

3. Сопоставить уровни экспрессии выбранных онкомаркеров с основными клиническими показателями и морфологическими характеристиками опухоли у больных РЖ.

4. Оценить с помощью ROC-анализа значимость предложенных онкомаркеров для диагностики РЖ и выбрать те из них, которые имеют наилучшую диагностическую эффективность.

Научная новизна исследования. Впервые проведено одновременное комплексное исследование относительных уровней экспрессии генов сурвивина, СОХ-2 и ММР-7 в опухолях и в прилегающих к ним трех участках слизистой желудка, полученных от больных с РЖ. Получены новые данные об участии этих факторов в развитии опухолевого процесса в данном органе. Комплексный подход к исследованию этих маркеров позволит в дальнейшем с высокой степенью достоверности осуществлять дифференциальную диагностику РЖ.

Показано, что в аденокарциномах наблюдаются достоверно высокие уровни экспрессии маркеров по сравнению с интактной

слизистой желудка как у пациентов с РЖ, так и у пациентов контрольной группы. В работе впервые установлено, что повышение экспрессии онкомаркеров в одном или двух участках слизистой за видимой границей опухоли может указывать на распространение опухолевого процесса вдоль стенки желудка. Впервые показано, что в случае перстневидноклеточного рака (ПКР) наблюдается низкий уровень экспрессии маркеров в самой опухоли и высокий - в прилегающей к ней слизистой желудка. Кроме того, выявлена корреляция между повышенным уровнем экспрессии ММР-7 в слизистой желудка за границей опухоли и глубиной инвазии опухоли.

Впервые обнаружено, что уровень экспрессии сурвивина-2В повышается на поздних стадиях развития опухоли, а уровни экспрессии мРНК общего сурвивина и СОХ-2 в аденокарциномах кишечного типа достоверно выше таковых при раке диффузного типа.

Практическая значимость работы. Исследование экспрессии мРНК генов СОХ-2, ММР-7 и сурвивина показало, что данные онкомаркеры обладают различной клинической ценностью для диагностики РЖ. Установлено, что наименьшей чувствительностью обладает анализ экспрессии СОХ-2, наибольшей - ММР-7'. Анализ уровня экспрессии ММР-7 позволяет детектировать РЖ уже на I стадии его развития. Кроме того, уровень экспрессии мРНК СОХ-2 и сурвивина позволяет дифференцировать кишечный и диффузный типы РЖ. Анализ экспрессии генов СОХ-2, ММР-7 и сурвивина в их комбинации улучшает чувствительность диагностики РЖ по сравнению с анализом экспрессии этих онкомаркеров в отдельности.

Анализ уровней экспрессий мРНК генов сурвивина, СОХ-2 и ММР-7 в зоне опухоли и в трех участках слизистой желудка, находящихся на различном расстоянии от нее, позволяет повысить эффективность диагностики РЖ и установить истинные границы опухоли. Это дает возможность не только определять злокачественный потенциал опухоли, но и сократить количество рецидивов РЖ за счет коррекции объема оперативного вмешательства и показаний к послеоперационному курсу химиотерапии.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту. 1. Экспрессия СОХ-2 и сурвивина коррелирует с глубиной инвазии, размером опухоли, но не зависит от степени поражения лимфоузлов и наличия отдаленных метастазов. Повышение уровня экспрессии ММР-7 в слизистой желудка за границей опухоли коррелирует с глубиной инвазии опухоли (г Спирмана равен 0,313, р=0,025).

2. Опухоли на I стадии развития имеют низкие уровни экспрессии мРНК СОХ-2.

3. По уровню экспрессии ММР-7 можно достоверно верифицировать опухоли уже на I стадии их развития, на что указывает высокая чувствительность (80,4%) и специфичность (90,9%) теста.

4. Диффузный тип РЖ, в частности перстневидноклеточный рак, характеризуется более низким уровнем экспрессии сурвивина и СОХ-2 непосредственно в опухоли и повышением экспрессии этих маркеров в слизистой желудка за видимыми границами опухоли.

5. Применение метода скрининга слизистой желудка у раковых больных позволяет повысить чувствительность и специфичность диагностических тестов.

Апробация работы. Результаты работы докладывались на Российских и Международных конференциях: XXIII конференции IATMO "Cancer, cell death and differentiation" (октябрь 2007 г., Триест, Италия); V конференции молодых ученых России с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины», (май 2008 г., Москва); 6-ой международной научно-практической конференции «Достижения фундаментальных наук в решении актуальных проблем медицины», (сентябрь 2008 г., Астрахань); 7-ой международной научно-практической конференции «Достижения фундаментальных наук в решении актуальных проблем медицины», (май 2010 г., Астрахань), VII Конференция с международным участием "Молекулярная медицина и

биобезопасность" (октябрь 2010 г., Москва), IV международная пироговская научная медицинская конференция студентов и молодых ученых (24 марта 2011г., Москва).

Апробация диссертационной работы состоялась на заседании Ученого совета ГУЗ «Московский научно-исследовательский институт медицинской экологии» Департамента здравоохранения г. Москвы.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 10 печатных работ, в том числе 4 статьи в центральных периодических изданиях, рекомендованных ВАК.

Структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 143 страницах машинописного текста и содержит разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты исследования и их обсуждение, выводы и список литературы, включающий 148 источников. Работа иллюстрирована 36 рисунками и 13 таблицами.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Клинический материал. Оптимизацию метода определения экспрессии сурвивина в злокачественных опухолях проводили на первичных культурах клеток меланом (18 образцов), на парных первичных культурах фибробластов кожи и клеток меланомы, полученных от двух пациентов с меланомой, на постоперационных образцах, полученных от 20 больных с новообразованиями надпочечников (2 пациента с адренокортикальным раком, 9 - с аденомой, 5 - с феохромоцитомой и 4 - с феохромобластомой).

Материалом для основного клинического исследования служили постоперационные образцы тканей желудка от 62 пациентов, проходивших обследование и лечение в Факультетской хирургической клинике им. Н.Н. Бурденко ГОУ ВПО ММА им. И.М. Сеченова. Среди пациентов, принявших участие в исследовании, было 37 мужчин и 25 женщин. Средний возраст больных составил 62±20 лет.

В работе исследовали 51 образец аденокарцином (АК) желудка. Опухоли были дифференцированы по стадиям развития, по степени дифференцировки и по типам в соответствии с классификацией Лаурена (табл. 1).

Таблица 1. Распределение больных РЖ на группы в зависимости от гистологических параметров опухоли

Параметры кол-во Параметры кол-во

опухоли пациен- опухоли пациен-

тов тов

Тип (по классификации Степень дифференцировки:

Лаурена):

Кишечный 26 Высокая 5

Диффузный 25 Умеренная 19

Стадия: I 15 Низкая 15

II 13

III 16 Перстневидноклеточный рак 11

IV 7

В соответствии с классификацией ТТЧМ опухоли были распределены на подгруппы согласно размеру, глубине инвазии в стенку желудка, а также наличия метастазов в лимфоузлы. Отдаленные метастазы детектировались у 7 пациентов.

У каждого пациента клинический материал забирали из области опухоли и из двух-трех участков слизистой резецированного желудка на расстоянии от 1 до 10 см вверх (к пищеводу) и вниз (к кишечнику) от видимой границы опухоли. В прилежащих к опухолям участках слизистой желудка, по результатам гистологического исследования, в 111 образцах отмечался гастрит, в 20 образцах - метаплазия и в 9 -дисплазия. В контрольную группу вошли 11 образцов слизистой желудка, взятых от пациентов с диагнозом стеноз желудка (п=2), ахалазия кардии (п=1), ожог пищевода (п=1), рак пищевода (п=5) и рак головки поджелудочной железы (п=2).

Выделение РНК. Тотальную клеточную РНК выделяли из клинических образцов тканей и культур клеток описанным ранее методом [СЬотсгупэкл Р., БассЫ N.. 1987]. Концентрацию и чистоту препаратов РНК определяли спектрофотометрически по отношениям поглощений при длинах волн 260, 280, 230 нм. Для оценки целостности выделенной РНК проводили электрофорез образцов РНК (по 1 мкг) в 1,5%-ном агарозном геле с 0,5 мкг/мл бромистого этидия.

Обратная транскрипция (ОТ). Реакцию ОТ (синтез кДНК) проводили в реакционной смеси конечным объемом 20 мкл, приготовленной на обработанной ДЭПК деионизованной стерильной воде, содержащей 67 мМ Трис-НС1 (рН 8,8), 16,6 мМ (ТЧН^ЗО^ 0,01% (в/о) Т\уееп 20, 4 мМ Т^СЬ, 1 мМ каждого (ЮТР, 3,2 мкг смеси гексамерных праймеров со случайной последовательностью, 10 мМ дитиотреитола, 10 ед. акт. ингибитора рибонуклеаз, 30 ед. рекомбинантной обратной транскриптазы М-МЬУ, 1 мкг тотальной РЖ. Смесь инкубировали при 42°С в течение 1 часа. Реакцию останавливали путем тепловой инактивации обратной транскриптазы, выдерживая смесь при 94°С в течение 10 мин.

ПЦР с праймерами к генам ММР-7, СОХ-2, суре ив и и а, САРИН, р-актина. ПЦР проводили в реакционной смеси конечным объемом 50 мкл, содержащей 67 мМ Трис-НС1 (рН 8,8), 16,6 мМ (КЩЬЗО,», 0,01% (в/о) Т\уееп 20, 1,5 мМ Р^С12, 0,2 мМ каждого сНЧТР, 15 пкмоль каждого из пары праймеров, 2,5 ед. акт. рекомбинантной Тац ДНК-полимеразы, 5 мкл реакционной ОТ-смеси, содержащей кДНК. Для амплификации кДНК использовали описанные ранее последовательности специфических праймеров для ММР-7 [УашашоШ Н., е1 а1., 2004], СОХ-2 [Ьо С.У., а а1., 2005], /?-актина [СЬоу М.У., е1 а1., 2004], вАРПН и сурвивина [ИгоЬаэЫ У., е1 а1., 2002]. ОТ-ПЦР с праймерами для определения мРНК сурвивина была опробована нами

на клиническом материале от пациентов с меланомами и новообразованиями надпочечников. Реакции ОТ-ПЦР с праймерами для определения мРНК ММР-7 и СОХ-2 были оптимизированы и применены в нашей лаборатории ранее при работе с образцами опухолей щитовидной железы [Марченко И.А., 2009].

Продукты ОТ-ПЦР разделяли электрофорезом в 1,5%-ном (для СОХ-2 и ММР-7) или 1,8%-ном (для сурвивина) агарозных гелях, содержащих 0,5 мкг/мл бромистого этидия. В качестве электрофорезного буфера использовали ТВЕ. Гели снимали на цифровую фотокамеру Kodak и проводили анализ изображения на компьютере с помощью программ ImageJ 1.351 и Quanty One v.4.4.0.

Уровни экспрессии исследуемых генов нормализовали по отношению к уровню экспрессии конститутивного гена ф-актина или GAPDH), который принимали за единицу.

Статистическая обработка результатов. Статистический анализ проводили с использованием программ Statistica v7.1 и SPSS Statistics-17. Для обнаружения различий между группами применяли непараметрический критерий Манна-Уитни (U-тест). Для оценки связи между экспрессиями анализируемых маркеров в АК рассчитывали коэффициент ранговой корреляции Спирмана. Статистически достоверными различия принимали при уровне значимости р<0,05. Для определения диагностической значимости, чувствительности и специфичности тест-систем использовали ROC-анализ.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Оптимизация условий проведения ОТ-ПЦР. На основании литературных данных нами были выбраны праймеры, позволяющие детектировать одновременно три сплайсинговых варианта сурвивина (2В, wt, АЕхЗ), а также индивидуальные праймеры на сурвивин-2В и -ДЕхЗ. Ранее исследования с данными парами праймеров были проведены на РНК, полученной только из клеточных линий. В связи с этим мы дополнительно оптимизировали условия ОТ-ПЦР с данными праймерами на РНК, полученной как из клеток меланомы человека линии Вго-В19, так и из первичных культур фибробластов кожи и клеток меланомы, полученных от пациентов с меланомой, а также на клиническом материале (опухоли надпочечников). Наши исследования показали, что все пары праймеров на разные варианты кДНК сурвивина эффективно работали в ОТ-ПЦР при температуре отжига 61°С. На основании анализа экспоненциальных кривых выхода специфических ампликонов было определено оптимальное количество циклов ПЦР: 33 - для праймеров, детектирующих все три варианта

сплайсинга мРНК сурвивина, и 31 - для праймеров, используемых для детекции сурвивина-2В и-АЕхЗ.

Нами был проведен анализ уровня экспрессии гена сурвивина в первичных культурах фибробластов и клеток меланомы. Гиперэкспрессия сурвивина (выше 1 отн. ед.) детектировалась в первичных культурах фибробластов кожи, полученных как от здоровых доноров, так и от больных меланомой. Однако у больных меланомой уровень экспрессии сурвивина в нормальных клетках кожи и в клетках меланомы заметно различался (1,5 отн. ед. и 1,06 отн. ед. соответственно). Уровень экспрессии сурвивина-2В и сурвивина-ДЕхЗ в меланомных клетках пациентов был существенно повышен (0,5 отн. ед.) по сравнению с нормальными клетками от тех же больных (0,2 отн. ед.). Из полученных данных можно сделать вывод, что для корректного анализа и постановки диагноза следует использовать образцы нормальных клеток кожи и клеток меланомы от одного и того же больного, а также использовать тест-системы на сплайсинговые варианты сурвивина 2В и ДЕхЗ.

Первичные культуры клеток меланомы не являются истинным клиническим материалом, поэтому для исследования эффективности нашей тест-системы на клиническом материале мы провели анализ относительной экспрессии сурвивина в образцах опухолей надпочечников. Средние значения уровней экспрессии мРНК сурвивина составили: при аденомах коры надпочечников - 0,11 отн. ед., при адренокортикальном раке - 0,29 отн. ед., при феохромоцитомах - 0,49 отн. ед., а при феохромобластомах - 0,55 отн. ед. Следует отметить, что экспрессия сурвивина в образцах адренокортикального рака в среднем в 3 раза превышала таковую в аденомах коры надпочечников. В 40% феохромоцитом (2 из 5 образцов) и в 75% феохромобластом (3 из 4 образцов) уровень экспрессии сурвивина был выше среднего значения (0,5 отн. ед.). Наши предварительные исследования подтверждаются другими авторами, которые иммуногистохимическим методом обнаружили, что уровень сурвивина в аденомах коркового слоя надпочечников значительно ниже, чем в адренокарциномах, а в феохромоцитомах существенно ниже по сравнению с феохромобластомами (р<0,05) [С^п Z.YL., 2007 ].

Основные исследования с использованием тест-систем для анализа мРНК сурвивина, СОХ-2 и ММР-7 были проведены нами на клиническом материале от пациентов с РЖ.

Исследование экспрессии мРНК генов сурвивина, СОХ-2, ММР-7 и [¡-актина в опухолях желудка. В большинстве исследованных нами образцов ткани желудка экспрессия мРНК САРБН была слабой, а в некоторых случаях вообще не детектировалась, тогда как уровень экспрессии мРНК [¡-актина хорошо определялся во всех образцах. В связи с этим в качестве внутреннего стандарта был выбран уровень экспрессии актина, относительно которого нормализовали экспрессию исследуемых генов.

Исследование экспрессии гена сурвивина в опухолях желудка.

Как видно из рис.1, в слизистой желудка экспрессируется три сплайсинговых варианта мРНК гена сурвивина: М (полноразмерный), 2В и ДЕхЗ. Общий уровень экспрессии гена сурвивина, рассчитанный как сумма уровней экспрессии этих трех вариантов, в слизистой желудка пациентов контрольной группы в среднем составил 0,53 отн. ед. Статистический анализ данных показал, что уровень экспрессии гена сурвивина в образцах опухоли достоверно превышал таковой в слизистой желудка пациентов контрольной группы (р<0,05).

жЗ ж21 ж61 ж51 ж13 ж73 ж22 ж26 ж47 ж55 ж?4 К+ К- Д

424 п.н.

355 п.н.

236 п.н.

368 п.н.

424 п.н.

355 п.н.

236 п.н.

368 п.н.

Рис. 1. Анализ методом ОТ-ПЦР экспрессии сплайсинговых вариантов генов сурвивина и ß-актина в клинических образцах от пациентов без онкопатологии желудка (А) и с РЖ (Б). Электрофорез ампликонов в 1,8% агарозном геле с 0,5 мкг/мл бромистого этидия. Цифры с буквой - номер клинического образца, римские цифры - место взятия образца (II - опухоль, I, III - на расстоянии 5 см от опухоли в сторону кардии или антрума, IV - на расстоянии более 8 см в сторону антрума). К+ - положительный контрольный образец (клеточная линия ВгО). К— отрицательный контрольный образец. 424 п.н. - сурвивин-2В, 355 п.н. - полноразмерный сурвивин, 236 п.н. -сурвивин-ДЕхЗ, 368 п.н. - ß-актин

Уровень экспрессии гена сурвивина у пациентов с РЖ был максимален в области опухоли (рис.1, Б, II), сохранялся достаточно высоким в зоне инфильтрации опухоли (рис.1, Б, III) и снижался в гистологически интактных участках слизистой желудка (рис.1, Б, I и IV). При этом высокий уровень экспрессии гена сурвивина в образцах опухоли (>0,69 отн. ед.) наблюдался в 76% (39 из 51) образцов, средний (от 0,31 до 0,69 отн. ед.) - в 20% (10 из 51), низкий (от 0 до 0,3 отн. ед.) - в 4% (2 из 51) образцов. У 63% (32 из 51) пациентов в одном или двух образцах слизистой желудка, взятых на разном расстоянии от опухоли, наблюдались высокие уровни экспрессии сурвивина. При этом у 40% (20 из 51) пациентов уровень экспрессии сурвивина был повышен в участках слизистой желудка на расстоянии до 5 см от видимых границ опухоли и у 23% (12 из 51) пациентов - на расстоянии более 8 см. У остальных 37% (19 из 51) пациентов уровень экспрессии сурвивина оставался низким во всех образцах слизистой, прилежащей к опухоли.

Анализ зависимости уровня относительной экспрессии гена сурвивина от клинико-патологических характеристик опухоли показал, что уровень экспрессии мРНК сурвивина повышается с ростом опухоли. Между АК диаметром 2-5 см и 5,5-9 см наблюдались достоверные отличия уровней экспрессии исследуемого гена (р=0,024). Уровни экспрессии мРНК сурвивина в АК с глубиной инвазии до мышечной оболочки (рТ1,2) были достоверно ниже, чем в АК, прорастающих за капсулу органа (рТ4) (р=0,019). Опухоли с глубиной инвазии рТ1,2 имели более низкий уровень экспрессии вариантов сурвивина-2В и -АЕхЗ, чем опухоли с рТЗ-4 (р=0,001 и р=0,046 соответственно). Относительный уровень экспрессии мРНК сурвивина-2В, но не сурвивина-^ или -ДЕхЗ, достоверно повышался на поздних стадиях опухоли по сравнению с ранними стадиями (р=0,018, и-тест Манна-Уитни). Более того, на поздних стадиях опухоли экспрессия мРНК сурвивина-2В превышала экспрессию мРНК сурвивина-АЕхЗ (корреляция по Спирману г=0,63, р=0,009). Было обнаружено, что опухоли на разных стадиях развития экспрессируют сурвивин на высоком уровне, при этом только в опухолях П-1У стадий развития экспрессия была достоверно выше, чем в слизистой желудка пациентов контрольной группы (рис. 2).

Следует отметить, что нами не было установлено корреляции между уровнем экспрессии гена сурвивина и степенью инвазии опухолевых клеток в лимфоузлы, а также наличием отдаленных метастазов.

Рис. 2. Относительный уровень экспрессии мРНК сурвивина в опухолях разных стадий. Указаны медиана (-), 25%-75% процентили

(прямоугольники) и уровни значимости различий между группами (р), и-тест Манна-Уитни.

К - интактная слизистая желудка пациентов контрольной группы.

стадия

Уровень экспрессии гена сурвивина не зависел также и от степени дифференцировки опухоли. В группах ВД, УД и НД АК наблюдались высокие уровни экспрессии мРНК сурвивина (медианы > 1 отн. ед.), достоверно превышающие эти уровни в группе с ПКР (медиана 0,6 отн. ед.) и в контрольной группе (медиана 0,44 отн. ед.). Уровень экспрессии мРНК сурвивина в группе с ПКР не отличался от уровня в интактной слизистой желудка пациентов контрольной группы (р=0,130). Однако анализ соотношения уровней экспрессии мРНК сплайсинговых вариантов сурвивина-^, -2В, -АЕхЗ показал, что при низкой экспрессии мРНК общего сурвивина в опухолях повышение экспрессии мРНК сурвивина-АЕхЗ до уровня сурвивина-2В может указывать на наличие ПКР.

Для установления возможности проведения дифференциального анализа, позволяющего различать АК (кишечный тип рака) от ПКР (диффузный тип рака), нами сравнивались максимальные значения экспрессии сурвивина из выборки образцов окружающей опухоль слизистой с его уровнями экспрессии в самой опухоли. На рис. 3 показано, что при диффузном раке (группа ПКР) уровни экспрессии сурвивина в окружающей опухоль слизистой желудка статистически значимо превышали уровни экспрессии в опухоли (р=0,038) и в интактной слизистой желудка пациентов контрольной группы (р=0,004). При кишечном типе РЖ не наблюдалось достоверных отличий в уровне экспрессии сурвивина в опухоли и в прилегающей к ней слизистой (р=0,117). Полученные нами данные позволяют дифференцировать АК от ПКР по уровню экспрессии сурвивина за границами опухоли.

р=0,117

I-1

опухоль

прилежащая слизистая

р=0,013

р=0,0016 1— -1 -4

р=0,038

р-0,004

'р=0,130

Рис.3. Относительные уровни экспрессии мРНК сурвивина в образцах опухоли и в прилежащей к ней слизистой желудка. Указаны медиана (-), 25%-75% процентили (прямоугольники) и уровни статистической значимости различий (р) между группами, и-тест Манна-Уитни. К - интактная слизистая желудка пациентов контрольной группы.

АК

ПКР

Высокий (>0,75 отн. ед.) уровень экспрессии мРНК гена сурвивина в слизистой желудка пациентов с РЖ чаще всего ассоциировался с опухолями, прорастающими серозную оболочку, и, как правило, коррелировал с высоким уровнем экспрессии ММР-7 в этих образцах. Таким образом, обнаружение повышенного уровня экспрессии мРНК гена сурвивина в слизистой желудка за видимыми границами опухоли может быть связано с активным распространением опухолевого процесса.

Исследование экспрессии мРНК гена ММР-7 в опухолях желудка.

Результаты анализа экспрессии гена ММР-7 в образцах слизистой желудка пациентов контрольной группы и пациентов с РЖ представлены на рис. 4. Относительные уровни экспрессии мРНК гена ММР-7 в слизистой желудка пациентов контрольной группы в большинстве образцов были низкими и не превышали 0,42 отн. ед. (рис. 4, А). Среди больных РЖ экспрессия была максимальна в области опухоли (рис. 4, Б, II), сохранялась высокой в зоне инфильтрации опухоли (рис. 4, Б, III) и снижалась в гистологически интактных участках слизистой желудка (рис. 4, Б, I и IV). Статистический анализ данных показал, что уровень экспрессии гена ММР-7 в образцах опухоли достоверно превышал уровень в окружающих её образцах слизистой желудка, а также в слизистой желудка пациентов контрольной группы (р<0,05).

Рис. 4. Анализ методом ОТ-ПЦР экспрессии генов ММР-7 и р-актина в клинических образцах, полученных от пациентов без онкопатологии

желудка (А) и с РЖ (Б). Электрофорез ампликонов в 1,5% агарозном геле, содержащем 0,5 мкг/мл бромистого этидия. Обозначения дорожек как на рис.1

Высокий уровень экспрессии ММР-7 (0,7 - 2,5 отн. ед.) в опухолях наблюдался у 55% пациентов, средний (0,31 - 0,69 отн. ед.) -у 30% пациентов, низкий (0,03 - 0,3 отн. ед.) - у 15% пациентов (табл.

Таблица 2. Распределение уровней экспрессии мРНК ММР-7 в опухоли и в прилежащих к ней участках слизистой желудка с признаками гастрита, метаплазии и дисплазии._

Уровень экспрессии ММР-7 Количество образцов

гастрит метаплазия дисплазия опухоль

высокий 11/1И (10%) 5/20 (25%) 2/9 (22%) 28/51 (55%)

средний 31/111 (28%) 5/20 (25%) 4/9 (45%) 15/51 (30%)

низкий 69/111 (62%) 10/20 (50%) 3/9 (33%) 8/51 (15%)

В окружающей опухоль слизистой желудка также наблюдались участки с высокой экспрессией гена ММР-7. Высокий и средний (>0,3 отн. ед.) уровни экспрессии ММР-7 за границами опухоли детектировались в 38% образцов, взятых от пациентов с гастритом, в 50% образцов с метаплазией и в 67% образцов с дисплазией. Количество образцов с высоким и средним (>0,3 отн. ед.) уровнем экспрессии ММР-7 в слизистой желудка постепенно увеличивалось в ряду гастрит < метаплазия < дисплазия < аденокарцинома (табл. 2). Эти данные могут подтверждать известный факт участия ММР-7 в индукции эпителиально-мезенхимального перехода в тканях желудка, предшествующего развитию карцином.

Наличие высокой экспрессии ММР-7 в слизистой желудка за границами опухоли может быть связано не только с возникновением нового очага опухоли, но и с инвазией опухолевых клеток из основной опухоли. В подтверждение этого предположения мы обнаружили, что уровень экспрессии ММР-7 в слизистой желудка за границей опухоли коррелировал с глубиной инвазии самой опухоли (г=0,313 р=0,026). За границами опухолей с глубиной инвазии рТЗ,4 чаще наблюдался повышенный уровень экспрессии ММР-7. В одном из образцов слизистой, окружающей опухоль, уровень экспрессии ММР-7 выше порогового (0,42 отн. ед.) наблюдался у 67% пациентов (34 из 51). Из них у 24 пациентов (71%) опухоли имели инвазию в серозную оболочку (рТЗ,4). '

Статистический анализ корреляции экспрессии ММР-7 с клинико-патологическими характеристиками опухоли показал, что уровень экспрессии ММР- 7 не зависел от диаметра, глубины инвазии опухоли в стенку желудка, степени поражения лимфоузлов и наличия отдаленных метастазов. В то же время было замечено, что опухоли, локализованные в кардиальном отделе желудка, имели более высокий уровень экспрессии ММР-7 по сравнению с опухолями тела желудка (р=0,006) и антрума (р=0,028). Кроме того, относительные уровни экспрессии ММР-7 на разных стадиях развития опухоли были достоверно выше, чем в интактной слизистой желудка пациентов

Рис. 5. Относительный уровень экспрессии мРНК ММР-1 в опухолях разных стадий.

Указаны медиана (-), 25%-75%) процентили

(прямоугольники) и уровни значимости различий между группами (р), и-тест Манна-Уитни.

К - интактная слизистая желудка пациентов контрольной группы.

Более того, уровни экспрессии мРНК ММР-7 в опухолях разной степени дифференцировки также достоверно превышали уровни в интактной слизистой желудка пациентов контрольной группы. При

контрольной группы (р<0,008, рис. 5).

р=0,00в

р=0,003

I и ш IV к

п=15 п=13 п-16 п=7 п=11 стадия

этом ВД и УД АК экспрессировали ММР-7 на высоком уровне (медианы > 0,9 отн. ед), а НД АК и ПКР - на среднем уровне (медианы 0,62 отн. ед.) (рис. 6).

Рис. 6. Относительный уровень экспрессии мРНК ММР-7 в аденокарциномах разной степени дифференцировки.

Указаны медиана (-), 25%-75% процентили (прямоугольники) и уровни статистической значимости различий (р) между группами, и-тест Манна-Уитни. ВД — высокодифференцированная, УД -умереннодифференцированная, НД -низкодифференцированная АК. ПКР - перстневидноклеточный рак. К - интактная слизистая желудка пациентов контрольной группы.

Таким образом, анализ уровня экспрессии ММР-7 позволяет достоверно выявлять опухоли, включая ПКР, начиная с ранних стадий.

Исследование экспрессии мРНК гена СОХ-2 в опухолях желудка. Результаты анализа экспрессии гена СОХ-2 в образцах слизистой желудка пациентов контрольной группы и пациентов с РЖ представлены на рис. 7. Относительный уровень экспрессии гена СОХ-2 в образцах интактной слизистой пациентов контрольной группы в большинстве случаев не привышал 0,3 отн. ед. У пациентов с РЖ уровень экспрессии гена СОХ-2 был высокий в области опухоли (рис. 7, Б, II) и снижался до нуля по мере удаления от опухоли (рис. 7, Б, I, III и IV). Высокий уровень экспрессии СОХ-2 (0,7 - 1,5 отн. ед.) в опухолях наблюдался у 34% пациентов, средний (0,31 - 0,69 отн. ед.) -у 25% пациентов, низкий (0 - 0,3 отн. ед.) - у 41% пациентов. Статистический анализ данных показал, что уровень экспрессии гена СОХ-2 в образцах опухоли достоверно превышал таковой в окружающих её образцах слизистой желудка, а также в слизистой желудка пациентов контрольной группы (р<0,05).

р=0,002 ' р=0,0005 '

..............1 г 1 р=0,004

Г ! р=0,008 — i 1 Т 1~

-0,21—•-■-■------

ВД УД НД ГКР к

ß-актпн

Рис. 7. Анализ методом ОТ-ПЦР экспрессии генов СОХ-2 и ß-актина в клинических образцах от пациентов без онкопатологии желудка (А) и с РЖ (Б). Электрофорез ампликонов в 1,5% агарозном геле с 0,5 мкг/мл бромистого этидия. Обозначения дорожек как на рис.1

Экспрессия СОХ-2 коррелировала с глубиной инвазии (г Спирмана = 0,507, р<0,001) и с диаметром опухоли (г Спирмана =

0.371, р=0,007). Кроме того, была выявлена тенденция к повышению уровня экспрессии СОХ-2 у пациентов с поражением лимфоузлов по сравнению с больными без инвазии в лимфоузлы (медианы 0,6 и 0,33 отн. ед. соответственно). Более того, экспрессия СОХ-2 в образцах опухолей была высокой при наличии отдаленных метастазов.

Экспрессия СОХ-2 в опухолях у пациентов с ранним РЖ (стадия

1, рис. 8) была слабой (медиана 0,1 отн. ед.) и соответствовала экспрессии в интактной слизистой желудка пациентов контрольной группы (р=0,330). Уровень экспрессии СОХ-2 в опухолях II, III и IV стадий был выше, чем в интактной слизистой желудка (рис. 8).

р=0,330

Рис. 8. Относительный уровень экспрессии мРНК СОХ-2 в опухолях разных стадий.

Т р=0,001

s h

О 1,00"

Р'0,001

р=0,002

Указаны медиана (-), 25%-75% процентили (прямоугольники). Уровень значимости различий между группами (р), и-тест Манна-Уитни.

I и m IV к п«15 п=13 п=16 п=7 п=11 стадия

К - интактная слизистая желудка пациентов контрольной группы.

Опухоли ранних стадий (I и II) экспрессировали СОХ-2 на достоверно более низком уровне, чем опухоли поздних (III и IV) стадий (р=0,028, и критерий Манна-Уитни). Таким образом, полученные нами результаты показывают, что анализ уровня экспрессии СОХ-2 является неэффективным при выявлении раннего РЖ.

При исследовании экспрессии СОХ-2 в АК разных степеней дифференцировки было выявлено достоверное превышение уровней экспрессии маркера в УД и НД АК по сравнению с контрольной группой (р<0,01) и ПКР (р=0,0009 и 0,036 соответственно). При этом следует заметить, что в группе ПКР экспрессия СОХ-2 не превышала уровни в контрольной группе (р>0,05) (рис. 9).

Рис. 9. Относительный уровень экспрессии мРНК СОХ-2 в аденокарциномах разных степеней дифференцировки.

Указаны медиана (-), 25%-75% процентили (прямоугольники) и уровни статистической значимости различий (р) между группами, и-тест Манна-Уитни. В Д — высокодифференцированная, УД -умереннодифференцированная, НД -низкодифференцированная АК. ПКР - перстневидноклеточный рак. К - интактная слизистая желудка пациентов контрольной группы.

Однако в образцах слизистой желудка, прилежащих к опухоли, у 55% пациентов с ПКР уровень экспрессии СОХ-2 был достоверно выше, чем в интактной слизистой желудка пациентов контрольной группы (р=0,015) и превышал уровень экспрессии в опухоли (р=0,148). В остальных группах АК (ВД, УД, НД) уровни экспрессии СОХ-2 в образцах слизистой за границами опухоли были достоверно ниже, чем в самой опухоли (р=0,0002) и статистически не отличались от уровня экспрессии у пациентов контрольной группы (р=0,087). Как видно из

р=0,0003

1 р=0,004 1

1 1 р=0,0009

0 1 ! р=0,036

Т 1 1 г

ВД УД ВД ГКР к

рис. 10, в группах пациентов с ВД, УД, и НД АК уровень экспрессии СОХ-2 выше 0,3 отн. ед. наблюдался более чем в 60% образцов, взятых из области опухоли. Процент образцов с повышенной экспрессией маркера за границами опухоли возрастал по мере уменьшения степени дифференцировки опухоли (в группе ВД АК - 0%, УД АК - 17%, НД АК - 27%, ПКР - 55%).

ВД УД

п=5 п=19

кишечный тип

НД ПКР

п=15 п=11

диффузный ТИП

Рис. 10. Доля (%) образцов с экспрессией СОХ-2 выше порогового уровня 0,3 отн. ед. у пациентов с кишечным и диффузным типом РЖ.

п - количество пациентов.

Таким образом, в слизистой желудка, окружающей опухоль, уровень экспрессии СОХ-2 выше 0,3 отн. ед. наблюдался у 33% (17 из 51) пациентов. Из них 82,4% (14 из 17) пациентов имели диффузный тип опухоли, а 17,6% (3 из 17) пациентов - кишечный тип. Более того, практически у всех 17 пациентов в слизистой желудка пороговые значения превышали и уровни экспрессии двух других маркеров (ММР-7 и сурвивина), что ещё раз подтверждает наличие у этих пациентов злокачественного процесса за видимыми границами опухоли. Наши данные показывают, что анализ уровня экспрессии СОХ-2 при РЖ позволяет с высокой долей вероятности диагностировать УД и НД АК при взятии клинического материала из самой опухоли. Для диагностики ПКР необходимо брать клинический материал и за пределами опухоли.

Ж)С-анализ диагностической ценности онкомаркеров. Анализ ЯОС-кривых для всех исследуемых онкомаркеров (рис. 11) показал, что метод определения относительных уровней экспрессии мРНК общего сурвивина, ММР-7 и СОХ-2 непосредственно в опухолях имеет очень хорошую диагностическую эффективность (площади под кривыми АиС более 0,810) для дифференцирования больных РЖ от больных с другими патологиями ЖКТ (контрольная группа).

Максимальной чувствительностью (82%) и специфичностью (90,9%) обладал онкомаркер ММР-7 при пороговом уровне экспрессии равном 0,42 отн. ед. При высокой специфичности (90,9%) онкомаркер СОХ-2 имел низкую чувствительность (58,8%), а пороговый уровень экспрессии составлял 0,3 отн. ед. Сурвивин обладал хорошей чувствительностью (74,5%) и специфичностью (81,8%) при пороговом уровне экспрессии равном 0,75 отн. ед. (рис. 11). При комбинации всех трех маркеров чувствительность диагностики РЖ повысилась до 92,2%, но специфичность снизилась до 73%.

ЯОС-кривые

"1-1-1-1-г

3,0 ОД 0,4 ОД 0,8 1,0

1 - Специфичность

100%

■ чувствительность " специфичность

СОХ-2

сурвивин

ММР-7

Рис. 11. Определение чувствительности и специфичности экспрессии онкомаркеров сурвивипа, ММР-7 и СОХ-2 для диагностики РЖ по анализу ЯОС-кривых. Площадь под кривой: для сурвивина АиС=0,840, для ММР-7 АиС=0,854, для СОХ-2 АиС=0,813. Рассчитанное программой оптимальное значение порогового уровня для сурвивина равно 0,75, для ММР-7 - 0,42, для СОХ-2 - 0,3 отн. ед.

Наши исследования показали, что уровни экспрессии онкомаркеров могут быть повышены не только в самой опухоли, но и в участках слизистой желудка, расположенных на разном расстоянии от неё. Анализ уровня экспрессии онкомаркеров в клиническом материале, взятом из четырех участков слизистой желудка, включая опухоль, (метод скрининга слизистой) позволяет повысить чувствительность диагностических тестов: для онкомаркера СОХ-2 с 58,8% до 68,6%, для сурвивина с 74,5% до 84%, для ММР-7 с 82% до 94%.

выводы

1. Уровни экспрессии сурвивина, ММР-7 и СОХ-2 в аденокарциномах желудка достоверно выше, чем в интактной слизистой желудка пациентов контрольной группы (р<0,05).

2. У больных РЖ высокие уровни экспрессии сурвивина, ММР-7 и СОХ-2 детектируются не только в опухоли, но и в окружающей ее слизистой желудка.

3. Впервые обнаружено, что у большинства больных перстневидноклеточным РЖ наблюдается низкий уровень экспрессии генов СОХ-2 и сурвивина в опухоли и высокий за видимыми границами опухоли.

4. Установлено, что эффективными онкомаркерами, позволяющими дифференцировать перстневидноклеточный рак от аденокарциномы желудка, являются сурвивин и СОХ-2.

5. Для диагностики ранних стадий РЖ наиболее чувствительным и специфичным онкомаркером является ММР-7.

6. Комплексное определение экспрессии генов сурвивина, ММР-7 и СОХ-2 в опухоли и в трех участках слизистой желудка на разном расстоянии от опухоли позволяет повысить чувствительность диагностического теста.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Glukhov A.I., Vysotskaya O.V., Marchenko I.A., Zimnik O.V., Ippolitov L.I., Zhulikov D.V., Gordeev S.A. Study of survivin expression in melanomas and adrenal and thyroid neoplasms // J Tumor Marker Oncology: XXIIIIATMO CONFERENCE ITALY "Cancer, cell death and differentiation". - Italy, Trieste, 2007. - P. 18

2. Высоцкая O.B., Марченко И.А. Исследование экспрессии металлопротеиназ при новообразованиях надпочечников // Тезисы V конференции молодых ученых России с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины». Приложение к журналу «Вестник Российской Академии медицинских наук».- Москва, 2008. -№ 6. - С. 97-98

3. Высоцкая О.В., Глухов А.И., Апрятин С.А., Жуликов Д.В., Зимник О.В., Северин С.Е., Гордеев С.А., Свинарева Л.В., Марченко И.А. Оценка уровня экспрессии генов металлопротеиназ, сервивина, транскрипционных факторов E1AF и SP-1 при онкопатологиях надпочечников // Материалы 6-ой международной научно-практической конференции «Достижения фундаментальных наук в решении актуальных проблем медицины». Приложение к журналу

«Астраханский медицинский журнал». - Астрахань, 2008. - Т. 3, № 3. -С. 152-153.

4. Высоцкая О.В., Глухов А.И., Марченко И.А., Зимник О.В., Жуликов Д.В., Ипполитов Л.И., Северин С.Е. Определение экспрессии мРНК сервивина и ее сплайсинговых вариантов методом совмещенных реакций обратной транскрипции и ПЦР в опухолях надпочечников и меланомах // Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. - 2010. №1. -С. 27-31.

5. Высоцкая О.В., Глухов А.И., Быков И.И., Хоробрых Т.В., Северин С.Е. Теломераза и сервивин, как перспективные маркеры рака желудка // Материалы 7-ой международной научно-практической конференции «Достижения фундаментальных наук в решении актуальных проблем медицины». Приложение к журналу «Астраханский медицинский журнал». - Астрахань, 2010. - №1.-С. 26-29.

6. Высоцкая О.В., Глухов А.И., Быков И.И., Хоробрых Т.В. Исследование уровня экспрессии генов сервивина и ММР-7 для диагностики онкопатологий желудка // Материалы VII международной конференции «Молекулярная медицина и биобезопасность». - Москва, 2010. - С. 46-47.

7. Черноусов А.Ф., Хоробрых Т.В., Быков И.И., Немцова М.В., Глухов А.И., Свинарева Л.В., Высоцкая О.В. Первый опыт использования маркеров молекулярно-генетической нестабильности слизистой в диагностике рака желудка // Материалы конференции «Актуальные вопросы неотложной хирургической гастроэнтерологии». Приложение к журналу «Вестник хирургической гастроэнтерологии». - 2010. - №3. - С. 84.

8. Глухов А.И., Высоцкая О.В., Свинарева Л.В., Зимник О.В., Быков И.И., Хоробрых Т.В. Антиапоптотические факторы сервивин и теломераза в диагностике рака желудка. // Молекулярная медицина. -2011.№1.-С. 35-40.

9. Быков И.И., Микерова М.С., Свинарева Л.В., Высоцкая О.В. Молекулярно-генетические маркеры в диагностике рака желудка // Вестник РГМУ. - 2011. №1. _ с. 342.

10. Высоцкая О.В., Глухов А.И., Гордеев С.А. Экспрессия сурвивина и его сплайсинговых вариантов -2В и dEx3 при аденокарциноме желудка // Молекулярная медицина. -2011. №2.-С. 22-27

Высоцкая Ольга Владимировна Диагностическая значимость уровней экспрессии мРНК сурвивина, металлопротеиназы-7 и циклооксигеназы-2 при раке

желудка.

Данная работа посвящена оценке значимости экспрессии генов сурвивина, металлопротеиназы-7 (ММР-7) и циклооксигеназы-2 (СОХ-2) в диагностике рака желудка. Установлено, что эффективными онкомаркерами, позволяющими дифференцировать

перстневидноклеточный рак от аденокарциномы желудка, являются сурвивин и СОХ-2, тогда как для выявления ранних стадий рака желудка наиболее чувствительным и специфичным онкомаркером является ММР-7. Описанный в настоящем исследовании метод анализа уровней экспрессий мРНК генов сурвивина, СОХ-2 и ММР-7 непосредственно в зоне опухоли и в трех участках слизистой желудка, взятых на расстоянии до 8 см от нее, позволяет улучшить диагностику рака желудка и более достоверно устанавливать истинные границы опухоли.

Vysotskaja Olga Vladimirovna The diagnostic significance of survivin, metalIoproteinase-7 and cyclooxygenase-2 rnRNA expression levels at gastric cancer

This study is devoted to assessment of survivin, metalloproteinase-7 (MMP-7) and cyclooxygenase-2 (COX-2) genes expression significance in gastric cancer diagnostics. We found that survivin and COX-2 were more effective markers, which allow to differentiate signet ring cell carcinoma and adenocarcinoma, whereas the most sensitive and specific marker for detection of gastric cancer at early stages was MMP-7. The method, described in the present research, consist in analysis of survivin, COX-2 and MMP-7 mRNA expression levels directly in tumour zone and in three sites of gastric mucosa , taken in distance from it. This allows to improve gastric cancer diagnostics and to establish true tumour borders more reliably.

Подписано в печать:

05.05.2011

Заказ № 5469 Тираж -100 экз. Печать трафаретная. Типография «11 -й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499)788-78-56 www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Высоцкая, Ольга Владимировна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.4,

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Распространённость рака желудка.

1.2. Причины возникновения рака желудка.

1.3. Классификация рака желудка.

1.4. Диагностика рака желудка.

1.5. Сурвивин, СОХ-2 и ММР-7 как маркеры онкогенеза.

1.5.1.1. Структура и функции сурвивина.

1.5.1.2. Роль сурвивина в апоптозе.

1.5.1.3. Роль сурвивина в процессе деления клеток.

1.5.1.4. Регуляция экспрессии гена сурвивина.

1.5.1.5. Сурвивин и ангиогенез.

1.5.1.6. Экспрессия сурвивина в нормальных тканях.

1.5.1.7. Экспрессия сплайсинговых вариантов сурвивина.

1.5.1.8. Сурвивин - перспективный маркер опухолевого развития.

1.5.2.1. Циклооксигеназа СОХ-2.

1.5.2.2. СОХ-2 и рак желудка.

1.5.3 Металлопротеиназа ММР-7.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1. Материалы.

2.1.1. Реактивы.

2.1.2. Приборы и компьютерные программы.

2.1.3. Клеточные линии.

2.1.4. Клинический материал.

2.1.4.1. Опухолевые образцы надпочечников.

2.1.4.2. Образцы опухоли и слизистой оболочки желудка.

2.2. Методы исследования.

2.2.1. Выделение РНК.

2.2.2. ОТ-ПЦР.

2.2.3. Статистическая обработка результатов.

2.2.4. БЮС-анализ диагностической ценности онкомаркеров.70'

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Оптимизацияусловий проведения ОТ-ПЦР с праймерами для анализа* мРНК вариантов альтернативного сплайсинга сурвивина.

3.1.1. Проведение оптимизации на клеточной линии.

3.1.2. Анализ экспрессии мРНК сурвивина и его сплайсинговых вариантов в . меланомах.

3.1.3. Экспрессия мРНК гена сурвивина в опухолях надпочечников.

3.2. Исследование экспрессии мРНК генов сурвивина, СОХ-2, ММР-7 и

3-актина у пациентов с РЖ.

3.2.1. Экспрессия конститутивных генов ОАРБН и ¡3-актина в ткани желудка.

3.2.2.1. Исследование экспрессии мРНК гена сурвивина в опухолях желудка.

3.2.2.2. Анализ экспрессии мРНК сплайсинговых вариантов сурвивина-^, -2В и -АЕхЗ.

3.2.2.3. Экспрессия сурвивина в окружающей опухоль слизистой желудка.

3.2.3.1. Исследование экспрессии мРНК гена ММР-7 в опухолях желудка.

3:2.3.2. Экспрессия ММР-7 в окружающей-опухоль слизистой желудка.

3.2.4.1. Исследование экспрессии мРНК гена СОХ-2 в опухолях желудка.

3.2.4.2. Экспрессия СОХ-2 в окружающей опухоль слизистой желудка.

3.2.5. Диагностическая значимость анализа экспрессии мРНК сурвивина,

ММР-7 и СОХ-2 для детекции РЖ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Диагностическая значимость уровней экспрессии мРНК сурвивина, металлопротеиназы-7 и циклооксигеназы-2 при раке желудка"

Актуальность проблемы.

В России рак желудка (РЖ) занимает одно из ведущих мест в общей структуре онкологической заболеваемости и второе место среди опухолей желудочно-кишечного тракта (ЖКТ). В России ежегодно регистрируется 4050 тыс. новых случаев РЖ и около 45 тыс. больных умирает от этого заболевания. Только в Москве в настоящее время РЖ заболевает в год около 3,5 тыс. человек [12]. К сожалению, у 75% первично выявленных больных заболевание диагностируется в Ш-1У стадии, когда хирургическое лечение может быть малоэффективным. Частота обнаружения ранних форм РЖ не превышает 10-20%, а у 83% больных при первично выявленной злокачественной опухоли уже существуют регионарные метастазы [10]. Улучшение результатов лечения РЖ во многом связывают с диагностикой и лечением опухолей на ранних стадиях развития.

Основные трудности в своевременной диагностике обусловлены тем, что рак может длительное время существовать под видом или на фоне других заболеваний желудка. Кроме того, до сих пор остается нерешенным вопрос объективной трактовки морфологических изменений слизистой, особенно при тяжелой дисплазии в условиях хронического воспаления и при под слизистом росте опухоли [2]. Несмотря на это в настоящее время решающую роль в диагностике РЖ играет эндоскопическое исследование с гистологическим анализом биоптатов [3]. Различные исследования показали, что множественные биопсии в подозрительных участках слизистой оболочки желудка повышают вероятность постановки правильного диагноза. Например, при биопсии, выполненной только в одной точке малигнизированной язвы желудка, вероятность постановки правильного диагноза составляет 70%, а при биопсии, выполненной в восьми точках, эта вероятность повышается до 95-99%. В Японии выявляемость раннего РЖ наиболее высокая в мире (54-56%), поскольку там в обязательную диагностику введено исследование биоптатов, взятых не менее чем из шести точек пораженного опухолью желудка [4]. Но даже при таком высоком уровне диагностики количество пропущенных случаев раннего рака желудка составляет 19%. Таким образом, диагностика РЖ остается достаточно сложной и актуальной задачей, особенно в случае высокодифференцированных и ранних форм злокачественной опухоли. В этом случае большие надежды возлагают на молекулярно-биологические методы диагностики.

Эпителий желудка относится к тканям, которым свойственно непрерывное клеточное обновление: постоянство структуры эпителия обеспечивается только при координации фаз пролиферации, дифференцировки и апоптоза. В основе возникновения изменений в слизистой желудка, приводящих к развитию рака, лежит дисбаланс между апоптозом и пролиферацией клеток [8]. Среди белков, ингибирующих апоптоз, ключевую роль играет сурвивин. Экспрессия сурвивина обнаруживается в большинстве видов опухолей, в то время как в нормальных тканях она практически не детектируется. Экспрессия гена сурвивина, по разным данным, обнаруживается в 35 - 82% опухолей желудка [85, 67, 37] и ассоциирована с неблагоприятным прогнозом заболевания.

Известно, что в случае диффузного РЖ одним из ведущих событий в канцерогенезе считается мутация Е-кадгерина [7]. Металлопротеиназа ММР-7 инициирует эпителиально-мезенхимальный переход в ткани желудка путем протеолиза Е-кадгерина, что приводит к отдалённым метастазам [139]. Особенностью ММР-7 является то, что она экспрессируется самими опухолевыми клетками и участвует в развитии рака, начиная с его ранних стадий [56].

Замечено, что в ряде интестинальных опухолей желудка наблюдается повышенная экспрессия циклооксигеназы-2 (СОХ-2) [7]. Гиперэкспрессия мРНК СОХ-2 в карциномах желудка коррелирует с глубиной инвазии, с прорастанием лимфатических сосудов, с метастазами в лимфоузлы [109].

В настоящее время клиническая значимость выше указанных онкомаркеров для диагностики РЖ только начинает изучаться. Цель исследования. Цель данной работы оценить значимость определения экспрессии мРНК сурвивина, ММР-7 и СОХ-2 в различных областях слизистой желудка для диагностики РЖ и для установления границ распространения опухоли. Задачи исследования.

4. Оценить с помощью ЖЭС-анализа значимость предложенных маркеров для диагностики РЖ и выбрать онкомаркеры, имеющие наилучшую диагностическую эффективность.

Научная новизна исследования.

Впервые проведено одновременное комплексное исследование относительных уровней экспрессии генов сурвивина, СОХ-2 и ММР-7 в опухолях и в прилегающих к ним трех участках слизистой желудка, полученных от больных с РЖ. Исследование позволило получить новые данные об участии этих факторов в развитии опухолевого процесса в данном органе. Комплексный подход к исследованию этих маркеров позволит в дальнейшем с высокой степенью достоверности осуществлять дифференциальную диагностику РЖ.

Показано, что в аденокарциномах наблюдаются достоверно' высокие уровни экспрессии маркеров по сравнению с интактной слизистой желудка как у пациентов с РЖ, так и у пациентов контрольной группы. В работе впервые установлено, что повышение экспрессии онкомаркеров в одном или двух участках слизистой за видимой границей опухоли может указывать .на распространение опухолевого процесса вдоль стенки желудка. Впервые показано, что в случае перстневидноклеточного рака (ПКР) наблюдается низкий уровень экспрессии маркеров в самой опухоли и высокий уровень в прилегающей к ней слизистой желудка. Кроме того, выявлена корреляция между повышенным уровнем экспрессии ММР-7 в слизистой желудка за границей опухоли и глубиной инвазии опухоли.

Практическая значимость работы.

Исследование экспрессии мРНК генов СОХ-2, ММР-7 и сурвивина показало, что данные онкомаркеры обладают различной клинической ценностью для диагностики РЖ. Установлено, что наименьшей чувствительностью обладает анализ экспрессии СОХ-2, наибольшей — ММР-7. Анализ уровня экспрессии ММР-7 позволяет детектировать РЖ уже на I стадии его развития. Кроме того, уровень экспрессии мРНК СОХ-2 и сурвивина позволяет дифференцировать кишечный и диффузный типы РЖ. Анализ экспрессии генов СОХ-2, ММР-7 и сурвивина в их комбинации улучшает чувствительность диагностики РЖ, по сравнению с анализом экспрессии этих онкомаркеров в отдельности.

Анализ уровней экспрессий мРНК генов сурвивина, СОХ-2 и ММР-7 в зоне опухоли и в трех участках слизистой желудка, взятых на различном расстоянии от нее, позволяет повысить диагностику РЖ и установить истинные границы опухоли. Это дает возможность не только определять злокачественный потенциал опухоли, но и сократить количество рецидивов РЖ за счет коррекции объема оперативного вмешательства и показаний к послеоперационному курсу химиотерапии.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту.

1. Экспрессия СОХ-2 и сурвивина коррелирует с глубиной инвазии, с размером опухоли, но не зависит от степени поражения лимфоузлов и наличия отдаленных метастазов. Повышение уровня экспрессии ММР-7 в слизистой желудка за границей опухоли коррелирует с глубиной инвазии опухоли (г Спирмана равен 0,313, р=0,025).

2. Опухоли на I стадии развития имеют низкие уровни экспрессии мРНК СОХ-2 и сурвивина.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Высоцкая, Ольга Владимировна

выводы

3. Впервые обнаружено, что у большинства больных перстневидноклеточным раком желудка наблюдается низкий уровень экспрессии генов СОХ-2 и сурвивина в опухоли и высокий за видимыми границами опухоли.

4. Установлено, что эффективными онкомаркерами позволяющими дифференцировать перстневидноклеточный рак от аденокарциномы желудка являются сурвивин и СОХ-2.

5. Для диагностики ранних стадий РЖ наиболее чувствительным и специфичным онкомаркером является ММР-7.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

На сегодняшний день проблема диагностики онкологических заболеваний является одной из наиболее острых ввиду высокого- уровня* заболеваемости и смертности от данного типа патологий. Отсутствие высокоэффективных скрининговых программ для диагностики рака желудка заставляют искать специфичные онкомаркеры, позволяющие эффективно выявлять опухоли на ранних стадиях. Таким образом, совершенствование-подходов к дифференциальной диагностике рака желудка представляется-актуальной задачей для научной и практической медицины.

Злокачественная трансформация клеток сопровождается изменениями в экспрессии генов, отвечающих за регуляцию клеточного деления, дифференцировки и программированной гибели — апоптоза. С другой стороны злокачественный фенотип клетки является результатом нарушения-работы внутриклеточной сети сигнальной трансдукции. В данной работе мы исследовали экспрессию мРНК СОХ-2 - фермента, участвующего в образовании простагландинов, которые стимулируют ЕР-рецепторы и активируют пути сигнальной трансдукции, потенцирующие пролиферацию клеток, ангиогенез, инвазию и метастазирование, а также подавляющие апоптоз и реакции иммунного ответа. Более того, мы изучили экспрессию мРНК гена антиапоптотического белка сурвивина, который участвует не только в ингибировании апоптоза, но и в регуляции митоза.

Кроме того, современные исследования показали, что одним из ключевых этапов инвазии и метастазирования злокачественных новообразований, является активация металлопротеиназ в стромальных клетках вокруг опухоли. Одна из металлопротеиназ - матрилизин (ММР-7) может экспрессироваться непосредственно опухолевыми клетками, являясь опухолеассоциированным белком. В настоящее время показана ведущая роль этих онкомаркеров в патогенезе опухолей различной локализации.

Цель диссертационного исследования заключалась в оценке значимости определения экспрессии мРНК сурвивина, ММР-7 и СОХ-2 в различных областях слизистой желудка для диагностики РЖ и для установления границ и характера распространения опухоли.

Исследование уровней экспрессии мРНК сурвивина, СОХ-2 и ММР-7 в опухолях и в трёх участках нормальной слизистой желудка больного РЖ показало, что непосредственно в опухоли уровень экспрессии анализируемых маркеров значительно- превышал их уровень в окружающей! ее слизистой. Однако, приблизительно у 60% этих пациентов в одном из. образцов нормальной слизистой желудка всегда детектировалось превышение порогового уровня экспрессии этих маркеров. При этом уровень экспрессии мРНК сурвивина, СОХ-2 и ММР-7 в образцах слизистой желудка не зависел от их расстояния до опухоли. На основании* этого, можно предположить, что повышение экспрессии онкомаркеров в одном или двух участках слизистой за видимой границей опухоли указывает на распространение опухолевого процесса вдоль стенки желудка у каждого конкретного пациента. Нужно отметить, что повышенный уровень экспрессии ММР-7 в слизистой желудка за границей опухоли коррелировал с глубиной инвазии опухоли, а высокие уровни экспрессии мРНК сурвивина и СОХ-2 в нормальной слизистой желудка за границами опухоли коррелировали с диффузным типом опухоли. При этом у большинства больных диффузным ПКР в области опухоли наблюдались низкие уровни экспрессии СОХ-2 и сурвивина, тогда как у пациентов с аденокарциномами кишечного типа чаще детектировался высокий уровень экспрессии этих маркеров в опухоли. Это можно объяснить тем, что ПКР имеет низкий пролиферативный потенциал, по сравнению с быстро пролиферирующими аденокарциномами желудка. Таким образом при анализе уровней экспрессии сурвивина и СОХ-2 в опухоли и в прилежащей к ней слизистой желудка можно дифференцировать аденокарциномы кишечного типа от ПКР диффузного типа.

При исследовании связи уровней экспрессии онкомаркеров с основными клинико-морфологическими характеристиками опухоли мы обнаружили, что уровни экспрессии сурвивина и СОХ-2" коррелировали с' диаметром опухоли и,с глубиной её инвазиш в стенку желудка;.

Уровень экспрессии мРНК ММР-7 всегда был высоким в опухолях вне: зависимости от их степени дифференцировки и стадии, развития;. Таким; образом . для выявления ранних стадий РЖ. ММР-7 \ является* высокочувствительным и специфичным онкомаркером. Анализ относительного уровня экспрессии СОХ-2 на разных стадиях развития^ опухоли показал, что в опухолях поздних стадий (III, IV) уровень,экспрессии; достоверно выше, чем в опухолях ранних стадий (Г, II). Можно предположить, что СОХ-2 участвует в прогрессии опухоли, тогда как ММР-7 в инициации опухолевого роста. Более того, активация ММР-7 и сурвивина происходит уже в предраковых изменениях слизистой желудка, в ряду гастрит —> метаплазия —> дисплазия —> аденокарцинома наблюдается тенденция к снижению количества образцов с низким уровнем и повышению с высоким уровнем экспрессии этих маркеров в слизистой желудка;

В результате проведения ROC-анализа мы установили, что наименьшей чувствительностью обладает анализ экспрессии СОХ-2 (57%), средней -сурвивин (74|,5%) и наибольшей — ММР-7 (82%). Анализ уровня*экспрессии маркеров в клиническом материале, взятом из четырех участков слизистой желудка, включая опухоль (метод скрининга слизистой) позволяет повысить» чувствительность диагностических тестов на 10-12%.

Анализ экспрессии генов СОХ-2, ММР-7 и сурвивина в их комбинации улучшает чувствительность диагностики РЖ до 92%, по сравнению1 с анализом экспрессии этих маркеров в отдельности.

Мы надеемся, что результаты, полученные в настоящем исследовании, позволят уже на дооперационном этапе с высокой точностью диагностировать рак желудка и определять истинные границы опухолевой инфильтрации.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Высоцкая, Ольга Владимировна, Москва

1. Алексеева М.Л., Гусарова Е.В., Муллабаева С.М., Понкратова Т.С. Онкомаркеры, их характеристика и некоторые аспекты клинико-диагностического использования // Проблемы репродукции. 2005. - №3. -С. 65-79'.

2. Аруин Л.И., Капуллер Л.Л., Исаков В.А. Морфологическая диагностика болезней желудка и кишечника // М.: Триада-Х. 1998. С. 80-85, 272.

3. Баранская Е.К., Ивашкин ВТ. Клинический спектр предраковой патологии желудка // Рос. журн. гастроэнтерол., гепатол., колопроктол. -2002.-Т. 12, №3.-С. 7-14.

4. Бондарь Г.В., Думанский Ю.В., Попович А.Ю., Бондарь В.Г. Рак желудка: профилактика, диагностика и лечение на современном этапе // Онкология. 2006. - Т.8, №2. - С. 171-175.

5. Букин Ю.В., Драудин-Крыленко В.А. Молекулярно-биологические механизмы гастроканцерогенеза и подходы к профилактике рака желудка // Успехи биологической химии. 2000. - Т. 40. — С. 329-356.

6. Давыдов М.И., Тер-Ованесов М.Д., Абдихакимов А.Н., Марчук В.А. Рак желудка: предоперационное обследование и актуальные аспекты стадирования // Практическая онкология. 2001. - №3 (7). - С. 9-17.

7. Имянитов E.H. Эпидемиология и биология рака желудка // Практическая онкология. 2009. - Т.10, №1. - С. 1-7.

8. Маев И.В., Зайратьянц О.В., Кучерявый Ю.А. Кишечная метаплазия слизистой оболочки желудка в практике гастроэнтеролога: современный взгляд на проблему // Рос. Журн. гастроэнтерол, гепатол, колопроктол. -2006.-№4.-С. 38-48.

9. Марченко И.А. Исследование диагностической значимости теломеразы и других маркеров злокачественной трансформации при новообразованиях щитовидной железы человека // дис. .канд. биол. наук. — М., 2009.-С.84-86, 101-107, 123-125.

10. Симонов Н.Н., Мяукина JI.M., Филин А.В., Рыбалкин Ю.И. Проблемы1 диагностики и рационального лечения раннего рака желудка (TisNOMO и T1N0M0) // Практическая онкология. 2001. - №3 (7). - С. 25-30i

11. Справочник по онкологии. Под редакцией академика РАМН >Н.Н.*

12. Трапезникова и профессора ЖВ. Поддубной / Онкоцентр РАМН.' / М., КАППА. 1996: - Выпуск 4.

13. Статистика злокачественных новообразований в Россин и странах СНГ в 2006г. // Вестник РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН Том 19,№2 (прил. 1), 2008 Под редакцией академика РАН и РАМН М.И. Давыдова, и дбн Е.М. Аксель, АНО «Усия» с. 53

14. Adrenocortical carcinoma. PDQ — NCI's comprehensive cancer database.

15. Ahmadi M., Emery D.C., Morgan DJ. Prevention of both direct and cross-priming of antitumor CD8+ T-cell responses following overproduction of prostaglandin E2 by tumor cells in vivo. Cancer Res. 2008. - V. 68. - P. 75207529.

16. Ajisaka H., Yonemura Y., Miwa K. Correlation of lymph node metastases and expression of matrix metalloproteinase-7 in patients with gastric cancer // Hepatogastroenterology. 2004. - V. 51 (57). - P. 900-905.

17. Alderazi Y., Yeh M.W. et al. Phaeochromocytoma: current concepts. MJA, 2005, 183(4):201-204.

18. Allen S.M., Florell S.R., Hanks A.N., et al. Survivin expression in mouse skin prevents papilloma regression and promotes chemical-induced tumor progression // Cancer Res. 2003. - V. 63(3). P. 567-572.

19. Altieri D.C. Survivin, cancer networks and pathway-directed drug discovery //Nat. Rev. Cancer. 2008. - V. 8. - P. 61-70.

20. Altieri D.C. The molecular basis and potential role of survivin in cancer diagnosis and therapy // Trends Mol Med. 2001. - V. 7. - P. 542-547.

21. Altznauer F., Martinelli S., Yousefi S., et al. Inflammation-associated cell cycle-independent block of apoptosis by survivin in terminally differentiated neutrophils // J Exp Med. 2004. - V. 199. - P. 1343-1354.

22. Asanuma K, Tsuji N, Endoh T, Yagihashi A, Watanabe N. Survivin Enhances Fas Ligand Expression via Up-Regulation. of Specificity Protein 1-Mediated1 Gene Transcription in Colon Cancer Cells // J. Immunol1. 2004. - V. 172.-P. 3922-3929.

23. Badran A., Yoshida A., Ishikawa K. et al. Identification of a nover, splice variant of the human anti-apoptopsis gene survivin // Biochem Biophys Res Commun. -2004. V. 314.-P. 902-907.

24. Barber R.D., Harmer D.W., Coleman R.A., Clark BJ. GAPDH as a housekeeping gene: analysis of GAPDH mRNA expression in a panel of 72 human tissues // Physiol Genomics. 2005. - V. 21(3). - P. 389-395.

25. Caldas H., Fangusaro J.R., Boue D.R., Holloway M.P., Altura R.A. Dissecting the role of endothelial SURVIVIN DeltaEx3 in angiogenesis // Blood. -2007.-V. 109.-P. 1479-1489.

26. Caldas H., Honsey L.E., Altura R.A. Survivin 2a: a novel survivin splice variant expressed in human malignancies // Mol Cancer. 2005. - V. 4. - P. 11.

27. Castellone M.D., Teramoto H., Williams B.O., et al. Prostaglandin E2 promotes colon cancer cell growth through a Gs-axin-beta-catenin signaling axis // Science. 2005.-V. 310.-P. 1504-1510.

28. Cervello M., Montalto G. Cyclooxygenases in hepatocellular carcinoma. // World J. Gastroenterol.-2006.-V. 12 (32).-P. 5113-5121.

29. Chang Y.J., Wu M.S., Lin J.T., Chen C.C. Helicobacter pylori-induced invasion and angiogenesis of gastric cells is mediated by cyclooxygenase-2 induction through TLR2/TLR9 and promoter regulation // J Immunol. 2005. — V. 175.-P. 8242-8252.

30. Chantalat L., Scoufias D.A., Kleman J.P., et al. Crystal structure of survivin reveals a bow tieshaped dimmer with two unusual alpha helical extentions // Mol. Cell. 2000. - V. 6. - P. 183-189.

31. Chiou S.K., Moon W.S., Jones M.K., Tarnawski A.S. Survivin expression in the stomach: implications for mucosal integrity and protection // Biochem Biophys Res Commun. 2003. - V. 305. - P. 374-379.

32. Ghomczynski P., Sacchi N. Single-step method' of RNA isolation by acid" guanidinium thiocyanate- phenol-chloroform extraction // Anal Biochem. — 1987. -V. 162.-P. 156-159.

33. Choy M.Y., Siu S. N., Leung T. N., Lau T. K. Human decidual production of hepatocyte-growth factor is not influenced by trophoblastic invasion in vivo // Fertility and Sterility. 2004. - Vol. 82(3). - P. 1220-1225.

34. Colnaghi R., Connell C.M., Barrett R.M.A., Wheatley S.P. Separating the Anti apoptotic and Mitotic Roles of Survivin // J. Biol. Chem. 2006. - V. 281. -P.33450-33456.

35. Conway E.M., Zwerts F., Eygen V.V., et al. Survivin-dependent angiogenesis in ischemic brain, molecular mechanisms of hypoxia-induced' up-regulation // Am. J. Pathol. 2003. - V. 163. - P. 935-946.

36. Cosgrave N, Hill AD, Young LS. Growth factor-dependent regulation of survivin by c-myc in human breast cancer // J Mol Endocrinol. — 2006. V. 37(3). -P. 377-390.

37. Da C.L., Xin Y., Zhao J., Luo X.D. Significance and relationship between Yes-associated protein and survivin expression in gastric carcinoma and precancerous lesions // World J Gastroenterol. 2009. - V. 15 (32> - P. 40554061.

38. Da M.X., Wu X.T., Guo T.K., et al. Clinical significance of telomerase activity in peritoneal lavage fluid from patients with gastric cancer and its relationship with cellular proliferation // World J Gastroenterol. — 2007. V. 13 (22).-P. 3122-3127.

39. Dalwadi H, Krysan K, Heuze-Vourc'h N, et al. Cyclooxygenase-2-dependent activation of signal transducer and activator of transcription 3 by interleukin-6 in non-small cell lung cancer // Clin Cancer Res. 2005. - V. 11(21). - P. 7674-82.

40. Ding Y., Prieto V.G., Zhang P.S., et al. Nuclear expression of the antiapoptotic protein survivin in malignant melanoma // Cancer. — 2006. V. 106. -P. 1123-1129.

41. Duffy M.J., O'Donovan N., Brennan D.J., et.al. Survivin: a promising tumor biomarker // Cancer Lett. 2007. - V. 249. - P: 49-60:

42. Esteve P.O., Chin H. G., and Pradhan S. Human maintenance DNA (cytosine-5)-methytransferase and p53 modulate expression of p53-repressed promoters // PNAS. 2005. - V. 102 (4). -P. 1000-1005.

43. Fortugno P., Beltrami E., Plescia J., et al. Regulation of survivin function by Hsp90 // PNAS. 2003. - V. 100 (24). - P. 13791-13796.

44. Fujino K., Ueda M., Takehara M., et al. Transcriptional expression of survivin and its splice variants in endometriosis // Mol. Hum. Reprod. — 2006. V. 12.- P.383—388.

45. Fukuda S. and Pelus L.M. Survivin, a cancer target with an emerging role in normal adult tissues // Mol Cancer Ther. 2006. - V. 5 (5). - P. 1087-1098.

46. Fukuda S., Mantel C.R., Pelus L.M. Survivin regulates hematopoietic progenitor cell proliferation through p21WAFl/Cipl-dependent and -independent pathways // Blood. 2004. - V. 103. - P. 120-127.

47. Galizia G., Lieto E., Orditura M., et al. Epidermal growth factor receptor (EGFR) expression is associated with a worse prognosis in gastric cancer patients undergoing curative surgery // World J. Surg. 2007. - V. 31. - P. 1458-1468.

48. Gerstein E.S., Shcherbakov A.M., Kaz'min A.I., Ognerubov N.A., Kushlinskii N.E. Urokinase and tissue type plasminogen activators and their type-1 inhibitor (PAI-1) in gastric cancer // Vopr Onkol. 2003. - V. 49 (2). - P. 165-9.

49. Gonzalez L.O., Corte M.D., Vazquez J., et al. Study of matrix metalloproteinases and their tissue inhibitors in ductal in situ carcinomas of the breast // Histopathology. 2008. - V. 53 (4). - P. 403-415.

50. Greenhough A., Smartt H.J.M., Moore A.E., Roberts H.R., et al. The COX-2/PGE2 pathway: key roles in the hallmarks of cancer and adaptation to the tumour microenvironment // Carcinogenesis. 2009. - V. 30(3). - P. 377—386.

51. Gurbuxani S, Xu Y, Keerthivasan G, et al. Differential requirements for survivin in hematopoietic cell development // Proc Natl Acad Sci USA. — 2005. -V. 102.-P: 11480-11485.

52. Haghpanah V., Shooshtarizadeh P., Heshmat R., et al. Immunohistochemical analysis of survivin expression in thyroid follicular adenoma^ and carcinoma // Appl. Immunohistochem // Mol. Morphol. 2006. - V. 14. - P. 422-425.

53. Hanley J.A. The meaning and use of the area under a receiver operating characteristic (ROC) curve // Radiology. 1989. - Vol. 143(1). - P. 29-36.

54. Hirohashi Y., Torigoe T., Maeda A. et al. An HLA-A24-restricted cytotoxic T lymphocyte epitope of a tumor-associated protein, surviving // Clin. Cancer Res.- 2002. V. 8. - P. 1731-1739.

55. Hoffman W.H., Biade S., Zilfou J.T., Chen J., Murphy M. Transcriptional repression of the anti-apoptotic survivin gene wild type p53 // J. Biol. Chem. -V.277. 2002. - P. 3247-3257.

56. II M., Yamamoto H., Adachi Y., et al. Role of Matrix Metalloproteinase-7 (Matrilysin) in- Human Cancer Invasion, Apoptosis, Growth, and Angiogenesis // Exp Biol Med. 2006. - V. 231. - P. 20-27.

57. Jeyaprakash A.A., Klein U.R., Lindner D., et al. Structure of a Survivin Borealin-INCENP Core Complex Reveals How Chromosomal Passengers Travel Together // Cell. 2007. - V. 131. - P. 271-285.

58. Jiang Y., Saavedra H.I., Holloway M.P., Leone G., Altura R.A. Aberrant Regulation of Survivin by the RB/E2F Family of Proteins // J. Biol. Chem. 2004.- V. 279. P. 40511-40520.

59. Johnson S.M., Evers B.M. Translational research in gastric malignancy // Surg. Oncol. Clin. N. Am. 2008. - V. 17. - P. 323-340.

60. Kawasaki H,! Toyoda* M; Shinohara H, et al. Expression of survivin correlates with apoptosis, proliferation, and angiogenesis during human.colorectal tumorigenesis // Cancer. 2001. - V. 91(11). - P. 2026-2032.

61. Kawasaki K, Kawakami T, Watabe H, Itoh F, Mizoguchi M,, Soma Y. Expression of matrilysin (matrix metalloproteinase-7) in primary cutaneous and metastatic melanoma // Br. J. Dermatol. 2007. - V. 156 (4). - P. 613-619.

62. Koch C.A., Vortmeyer A.O., Diallo R., et al. Survivin: a novel neuroendocrine marker for pheochromocytoma // Eur. J. Endocrinol. 2002. - V. 146.-P. 381-388.

63. Konno R., Yamakawa H., Utsunomiya H., et al. Expression of survivin and Bcl-2 in the normal human endometrium // Mol. Hum. Reprod. 2000. - V. 6. — P. 529-534.

64. Konturek P.C., Kania J., Burnat G., Hahn E.G., Konturek S.J. Prostaglandins as mediators of COX-2 derived carcinogenesis in gastrointestinal tract // J Physiol Pharmacol. 2005. - V. 56 . - P. 57-73.

65. Krieg A., Mahotka C., Krieg T., et al. Expression of different survivin variants in gastric carcinomas: first clues to a role of survivin-2B in tumour progression // Br. J. Cancer. 2002. - V. 86. - P. 737-743.

66. Krysan K., Merchant F.H., Zhu L., COX-2-dependent stabilization of survivin in non-small cell lung cancer // FASEB J. 2004. - V. 18 (1). - P. 206208.

67. Lauren P. The two histological main types of gastric carcinoma: diffuse and so-called intestinal-type carcinoma. An attempt at a histo-clinical classification // Acta Pathol Microbiol Scand. 1965. -V. 64. - P. 31-49.

68. Lee K.E., Lee H.J., Kim Y.H., et al. Prognostic significance of p53, nm23, PCNA and c-erbB-2 in gastric cancer // Jpn J Clin Oncol. 2003. - V. 33 (4). - P. 173-9.

69. Lee K.H., Shin S.J., Kim K.O., et al. Relationship between E-cadherin, matrix, metalloproteinase-7 gene expression and1 clinicopathological features, in, gastric carcinoma // Oncol Rep. 2006. - V. 16 (4). - P. 823-830.

70. Li F., Altieri D.C. Transcriptional analysis of human survivin gene expression // Biochem. J. 1999. -V. 344. - P. 305-311.

71. Li Y-J., Wei Z.-M., Meng Y-X., Ji X.-R. (3-catenin up-regulates the expression of cyclinDl, c-myc and MMP-7 in human pancreatic cancer: Relationships with carcinogenesis and metastasis // World J Gastroenterol. 2005. -V. 11 (14).-P.2117-2123.

72. Lin L.J., Zheng C.Q., Jin Y., Ma Y., Jiang W.G., Ma T. Expression of survivin protein in human colorectal carcinogenesis // World J. Gastroenterol. — 2003.-V.9.-P. 974-977.

73. Ling X., Yang J., Tan D., et al. Differential expression of survivin-2B and survivin-DeltaEx3 is inversely associated with disease relapse and patient survival in non-small-cell lung cancer // Lung Cancer. 2005. - V. 49. - P. 353-361.

74. Liu D., Nakano J., Ishikawa S., et al. Overexpression of matrix metalloproteinase-7 (MMP-7) correlates with tumor proliferation, and a poor prognosis in non-small cell lung cancer // Lung Cancer. — 2007. — V. 58 (3). P. 384-391.

75. Lo C.Y., Lam K.Y., Leung P.P., Luk J.M. High prevalence of cyclooxygenase 2 expression in papillary thyroid carcinoma // European Journal of Endocrinology. 2005. - Vol. 152(4). - P. 545-550.

76. Lohr K., Moritz C., Contente A., and Dobbelstein Mi p21/CDKNlA Mediates Negative Regulation of Transcription by p53 // J. Biol. Chem. 2003. -V. 278.(35). -P. 32507-32516.

77. Lu C.D, Altieri D.C., Tanigawa N. Expression of A Novel Antiapoptosis Gene, Survivin, Correlated with Tumor Gell Apoptosis and p53' Accumulation in Gastric Carcinomas // Cancer Res. 1998. - V. 58. - P. 1808-1812.

78. Ma H., Nguyen C., Lee K.S., Kahn M. Differential roles for the coactivators CBP and p300 on TCF/beta-catenin-mediated survivin gene expression // Oncogene. -2005. -V. 24 (22). -P. 3619-3631.

79. Mahboubi K., Li F., Plescia J., et al. Interleukin-11 up-regulates surviving expression in endothelial cells through a signal transducer and activator of transcription-3 pathway // Lab Invest. 2001. - V. 81. - P. 327-334.

80. Mahotka C., Krieg T., Krieg A., et al. Distinct in vivo expression patterns of survivin splice variants in renal cell carcinomas // Int. J. Cancer. 2002. - V. 100. -P. 30-36.

81. Malcles M.H., Wang H.W., Koumi A., et al. Characterisation of the anti-apoptotic function of survivin-DeltaEx3 during TNFalpha-mediated cell death // Br. J. Cancer. 2007. - V. 96. - P. 1659-1666.

82. Meng H., Lu C.D., Sun Y.L., Dai D.J., Lee S.W., Tanigawa N. Expression level of wild-type survivin in gastric cancer is an independent predictor of survival // World J Gastroenterol. 2004. - V. 10 (22). - P. 3245-3250

83. Nakano J., Huang C., Liu D., et.al. The clinical significance of splice variants and subcellular localisation of survivin in non-small cell lung cancers // Br J Cancer. 2008. - V. 98(6). - P. 1109-1117.

84. Noton E.A., Colnaghi R., Tate Sh., et al. Molecular Analysis of Survivin Isoforms. Evidence that alternatively spliced variants do not play a role in mitosis // J. Biol. Chem. 2006. - V. 281. - P. 1286-1295.

85. Nzeako U.C., Guicciardi M.E., Yoon J.H., Bronk S.F., Gores G.J. COX-2 inhibits Fas-mediated apoptosis in cholangiocarcinoma cells // Hepatolog. 2002. -V. 35 (3).-P. 552-559.

86. O'Connor D.S., Grossman D., Plescia J., Li F., et al. Regulation of apoptosis at cell division by p34cdc2 phosphorylation of survivin // Proc Natl Acad Sci USA. -2000. — V. 97.-P. 13103-13107,

87. O'Connor D.S., Schechner J.S., Adida C., et al. Control of apoptosis during angiogenesis by survivin expression in endothelial cells // Am. J. Pathol. — 2000. —1. V. 156.-P. 393-398.i

88. Okada H., Bakal C., Shahinian A., et al. Survivin loss in thymocytes triggers p53 mediated growtharrest and p53-independent cell death // J Exp Med. 2004. -V.-199.-P. 399-410.

89. Ozaki I., Mizuta T., Zhao G., et al. Involvement of the Ets-1 gene in overexpression of matrilysin in human hepatocellular carcinoma // Cancer Res. -2000. -V. 60 (22). P. 6519-6525.

90. Pai R., Soreghan B., Szabo I.L., et al. Prostaglandin E2 transactivates EGF receptor: a novel mechanism for promoting colon cancer growth and gastrointestinal hypertrophy //Nat Med. 2002. - V. 8(3). - P. 289-293.

91. Qin Z.K., Zhou F.J., Dai Y.P:, et al. Expression and clinical significance of survivin and PTEN in adrenal tumors // Ai Zheng. 2007. - V. 26. - P. 11431147.

92. Raj D, Liu T, Samadashwily G, Li F, Grossman D. Survivin repression by p53, Rb and E2F2 in normal human melanocytes // Carcinogenesis. 2008. - V. 29.-P: 194-201.

93. Rosa J., Canovas P., Islam A., Altieri D.C., Doxsey S J. Survivin Modulates Microtubule Dynamics and Nucleation throughout the Cell Cycle // Mol. Biol. Of Cell:-2006.-V. 17.-P. 1483-1493.

94. Sah N.K., Khan Z., Khan G.J., Bisen P.S. Structural, functional and therapeutic biology of survivin // Cancer Letters. 2006. - V. 244. - P. 164-171.

95. Samaka R.M., Abdou A.G., Abd El-Wahed M.M., et al. Cyclooxygenase-2 Expression in Chronic Gastritis and Gastric Carcinoma, Correlation with Prognostic Parameters // J Egypt Natl Cane Inst. 2006. - V. 18(4). - P. 363-374.

96. Schwandner O., Schlamp A., Broil R., Bruch H.P. Clinicopathologic and' prognostic significance of matrix metalloproteinases in rectal cancer // Int J Colorectal Dis.- 2007. V. 22 (2). - P. 127-136.

97. Shen C., Hu L., Xia L., Li Y. Quantitative real-time RT-PCR detection for survivin, CK20 and CEA in peripheral blood of colorectal cancer patients // Jpn. J. Clin. Oncol. 2008. - V. 38. - P. 770-776.

98. Sheng H., Shao J., Morrow J.D., Beauchamp R.D., DuBois R N. Modulation of apoptosis and Bcl-2 expression by prostaglandin E2 in human colon cancer cells // Cancer Res. 1998. - V. 58. - P. 362-366.

99. Smith,W.L., DeWitt D.L., and Garavito R.M. Cyclooxygenases: structural, cellular, and molecular biology // Annu. Rev. Biochem. 2000 — V. 69. - P. 145182

100. Span P.N., Tjan-Heijnen V.C., Heuvel J.J., et al. Do the survivin (BIRC5) splice variants modulate or add to the prognostic value of total survivin in breast cancer? // Clin. Chem. 2006. - V. 52. - P. 1693-1700.

101. Sun W.H., Sun Y.L., Fang R.N., et al. Expression of Cyclooxygenase-2 and Matrix Metalloproteinase-9 in Gastric Carcinoma and its Correlation with Angiogenesis // Jpn. J. Clin. Oncol. 2005. - V. 35 (12). - P. 707-713.

102. Suzuki A., Hayashida M., Ito T., et al. Survivin initiates cell cycle entry by the competitive interaction with Cdk4/pl6(INK4a) and Cdk2/cyclin E complex activation // Oncogene. 2000. - V. 19 (29). - P. 3225-3234.

103. Suzuki A., Ito T., Kawano H., et al. Survivin initiates procaspase 3/p21 complex formation as a result of interaction with Cdk4 to resist Fas-mediated cell death//Oncogene.-2000.-V. 19.-P. 1346-1353.

104. Taubert H., Kappler M., Bache M., et al. Elevated expression of survivin-splice variants predicts a poor outcome for soft-tissue sarcomas patients // Oncogene. -2005. -V. 24. P. 5258-5261.

105. Teh S.H., Hill A.K., Foley D.A., et al. COX inhibitors modulate bFGF-induced cell survival in MCF-7 breast cancer cells // J. Cell. Biochem. 2004. - V. 91 (4).-P. 796-807.

106. Tessner T.G., Muhale F., Riehl T.E. et al. Prostaglandin E2 reduces radiation-induced epithelial apoptosis through a mechanism involving AKT activation and bax translocation // J. Clin. Invest. 2004. - V. 114(11). - P. 16761685.

107. Udayakumar T.S., Stratton M.S., Nagle R.B., Bowden G.T. Fibroblast growth factor-1 induced promatrilysin expression through the activation of extracellular regulated kinases and STAT3 // Neoplasia. 2002. - V. 4 (1). - P. 60-67.

108. UICC & AJCC Cancer Staging Manual, 5th Edition. Lippincott7 Raven Pubis. - 1997.

109. Varro A., Kenny S., Hemers E., et al. Increased gastric expression of MMP-7 in hypergastrinemia and significance for epithelial-mesenchymal signaling // Am J. Physiol. Gastrointest // Liver Physiol. 2007. - V. 292(4). - P: 1133-1140.

110. Vegran F, Boidot R, Oudin C, et al. Association of p53 gene alterations with the- expression of antiapoptotic survivin splice variants in breast cancer // Oncogene.-2007.-V. 26. -P. 290-297. • ■

111. Verdecia M.A., Huang H., Dutil E., Kaiser D.A., Hunter T., Noel J.P. Structure of the- human anti-apoptotic protein survivin> reveal's' a• dimeric arrangement // Nat. Struct. Biol. 2000. - V. 7(7). - P. 602-608.

112. Voutsadakis I.A. Pathogenesis of colorectal carcinoma and therapeutic implications:the roles of the ubiquitin-proteasome system and Cox // J. Cell. Moll Med. V. 11 (2).-2007.-P. 252-285.

113. Wang R.H., Zheng Y., Kim H.S., et al. Interplay among BRCA1, SIRT1, and Survivin during BRCA1-associated tumorigenesis // Mol Cell. - 2008. - V. 32. -P. 11-20.

114. Wheatley S.P., Barrett R.M., Andrews P.D., et al. Phosphorylation by aurora-B negatively regulates survivin function during mitosis // Cell Cycle. -2007. -V. 6. P. 1220-1230. 32.

115. Wroblewski L. E. Noble P.-J. M., Paglioccal A., et al. Stimulation of MMP-7 matrilysin) by Helicobacter pylori in human gastric epithelial" cells: role in epithelial cell migration // Journal of Cell Science. 2003. - V. 116. - P. 30173026.

116. Wu C.Y., Wang C.J., Tseng C.C., et al. Helicobacter pylori promote gastric cancer cells invasion through a NF-kappaB and COX-2-mediated pathway // World'J Gastroenterol. 2005. - V. 11(21). - P. 3197-203.

117. Wu K. K. Transcription-based COX-2 inhibition: A therapeutic strategy // Thromb, Haemost. 2006. - V. 96(4). - P. 417-422.

118. Xing Z., Conway E.M., Kang C., Winoto A. Essential role of survivin, an inhibitor of apoptosis protein, in T cell development, maturation, and homeostasis // J Exp Med. 2004. - V. 199. - P. 69-80.

119. Xue Y.W., Zhang Q.F., Zhu Z.B., Wang Q., Fu S.B. Expression of cyclooxygenase-2 and clinibopathologic features in human gastric adenocarcinoma // World J Gastroenterol. 2003. - V. 9 (2). - P. 250-253

120. Yamada Y., Kuroiwa, T., Nakagawa, T., et al. Transcriptional expression of survivin and its splice variants in brain tumors in humans // J. Neurosurg. 2003. -V. 99.-P. 738-745.

121. Yamamoto H., Horiuchi S., Adachi Y., et al. Expression of ets-related transcriptional factor E1AF is associated with tumor progression and overexpression of matrilysin in human gastric cancer // Carcinogenesis. 2004. - V. 25 (3).-P. 325-332,

122. Yeh T-S., Wu C-W, Hsu K-W, et al. The Activated Notchl Signal Pathway Is Associated with Gastric Cancer Progression through Cyclooxygenase-2 // Cancer Res. 2009. - V. 69(12). - P. 5039-5048

123. Yin Y., Grabowska A.M., Clarke P.A., et al. Helicobacter pylori potentiates epithelial ¡mesenchymal transition in gastric cancer: links to soluble HB-EGF, gastrin and matrix metalloproteinase-7 // Gut. 2010. - V. 59(8). - P. 1037-1045.

124. You R.I., Chen M.C., Wang H.W., et al. Inhibition of Lymphotoxin-B Receptor-Mediated Cell Death by Survivin-dEx3 // Cancer Res. 2006. - V. 66. -P. 3051-3061.

125. Yu J., Leung W.K., Ebert M.P., et al. Increased expression of survivin in gastric cancer patients and in first degree relatives // Br. J. Cancer. — 2002. — V. 87. -P.91-97.

126. Zhang J.T., Wang M.W., Zhu Z.L., et al. Increased expression of cyclooxygenase-2 in first-degree relatives of gastric cancer patients // World J Gastroenterol. -2005. -V. 11 (31). -P. 4918-4922.

127. Zhang M., Yang J., Li F. Transcriptional and post-transcriptional controls of survivin in cancer cells: novel approaches for cancer treatment // J Exp Clin Cancer Res. 2006. - V. 25 (3). - P. 391-402.

128. Zhao J., Tenev T., Martins L.M., Downward J., Lemoine N.R. The ubiquitin-proteasome pathway regulates survivin degradation in a cell cycle-dependent manner // J Cell Sci. 2000. - V. 113. - P. 4363-4371.

129. Ziaee S.A., Moula S.J., Hosseini Moghaddam S.M., Eskandar-Shiri D. Diagnosis of bladder cancer by urine survivin, an inhibitor of apoptosis: a preliminary report // Urol. J. 2006. - V. 3. - P. 150-153.

130. Zweig M.H. Receiver-operating characteristic (ROC) plots: A fundamental evaluation tool in clinical medicine // Clin. Chem. 1993. - V. 39(4). - P. 561— 577.

Информация о работе

Высоцкая, Ольга Владимировна
кандидата биологических наук
Москва, 2011
ВАК 03.01.04

Диссертация

Диагностическая значимость уровней экспрессии мРНК сурвивина, металлопротеиназы-7 и циклооксигеназы-2 при раке желудка - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы