Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Создание нового ингибитора Сурвивина на основе изучения опухолеспецифичных функций этого белка

ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Создание нового ингибитора Сурвивина на основе изучения опухолеспецифичных функций этого белка"

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт бноорганнческой химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии паук

на правах рукописи

005058317

Павлюков Марат Самвелович

СОЗДАНИЕ НОВОГО ИНГИБИТОРА СУРВИВИНА НА ОСНОВЕ ИЗУЧЕНИЯ ОПУХОЛЕСПЕЦИФИЧНЫХ ФУНКЦИЙ ЭТОГО БЕЛКА

Специальность - 03.01.03 - молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на сонскание учёной степени кандидата биологических наук

1 р идя 2013

Москва 2013

005058317

Работа выполнена в лаборатории мембранных биоэнергетачесык систем Института бноорганнческой химии им. академиков М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова РАН.

Научный руководитель:

доктор химических наук Михаил Иванович Шахпаронов Официальные оппоненты:

Габибов Александр Габибовнч, доктор химических наук, член-кор. РАН, профессор, руководитель лаборатории биокатализа Ннспгтута биооргашгческой ивпш им. академиков М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова РАН.

Кочетков СергеП Николаевич, доктор химических наук, член-кор. РАН, профессор, руководтель лаборатории молекулярных основ действия физиологически активных соединений Института молекулярной биологии им. В. А. Энгельгарта РАН.

Ведущая организация:

Государственное научное учреждение Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной биотехнологии Российской академии сельскохозяйственных наук.

Защита диссертации состоится «23» мая 2013 г. в 10:00 на заседании диссертационного совета Д.002.019.01 при Институте бноорганнческой химии им. академиков М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова РАН по адресу: 117997, ГСП-7, Москва В-437, ул. Миклухо-Маклая, д. 16/10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института бноорганнческой химии им. академиков М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова РАН.

Автореферат разослан «19» апреля 2013 г.

Учёный секретарь диссертационного совета,

доктор физико-математических наук

В.А. Олейников

ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Онкологические заболевания являются одной из главных причин смертности в развитых странах. II хотя за последние тридцать лет наши знания о генах и белках, участвующих в опухолевой трансформации клеток, увеличились многократно, это так и не привело к эквиватентному прогрессу в борьбе с раковыми заболеваниями. II по сей день основными способами лечения большинства онкологических больных остаются разработанные десятилетня назад малоэффективные и крайне опасные методы радио- и химнотерагаш.

Большой прогресс в этой области могло бы принести создание высокоспецифнчных лекарств, действующих на продукты генов, жизненно необходимых для опухолевых клеток, но играющих меньшее значение в нормальных тканях человека. II действительно, эта стратегия привела к разработке ряда весьма эффективных препаратов для борьбы с не Ходжкиновой лимфомой и хронической миелогенной лейкемией. Однако, большинство типов рака не имеют единого «главного» онкогена. II поэтому лечение таких опухолей с помощью точечного воздействия на один ген или белок оказывается пли не эффективным вовсе, или даёт лшпь кратковременные результаты из-за быстрого возникновения резистентности к данному типу лечения.

Однако последние результаты исследований протеома опухолевых клеток могут послужить ключом к решению этой проблемы. Недавно стаю известно, что в клетках существуют так называемые «узловые» белки, которые образуют сложнейшую сеть взаимодействий с белками-посредниками и координируют сразу несколько процессов жизнедеятельности клетки. Поэтому лекарства, действующие на один из этих белков, будут обладать довольно широким эффектом, что, с одной стороны, позволит избежать быстрого возникновения резистентности к таким препаратам, а с другой, сделает их пригодными для лечения сразу нескольких типов опухолей.

Настоящая работа посвящена исследованию белка Сурвивин, который, с одной

стороны, вход1гт в пятерку наиболее опухолеспецнфичных белков человека, а с другой,

является «узловым» белком и участвует в таких процессах как апоптоз, чекпошп-

формирования веретена деления, регуляция динамики роста микротрубочек, ответ клетки

на стресс, а также играет важную роль в регулящш клеточного цикла. Полученные наш!

данные позволяют по-новому взглянуть на роль белков Сурвивин, Smac/DIABLO, Ran и

Трансглутаминаза 2 в норматьных и опухолевых клетках, а также раскрывают механизм,

по которому повышение экспрессии Сурвивина способствует раковой трансформашш

клеток и метастазнровашпо опухолей. Кроме того, в ходе данного исследования был

1

создан и протестирован низкомолекулярный ингибитор Сурвивнна, который без сомнения может иметь большое прикладное значение дяя лечения различных типов опухолей.

Цели и задачи работы

Целью данной работы было исследование функций Сурвнвина в опухолевых клетках н создание ннзкомолекулярного ннгнб1ггора Сурвивнна. В рамках поставленной цели были сформулированы следующие экспериментальные задачи: 1) Исследование функций мономера и днмера Сурвивнна в опухолевых клетках; 2) Определение участка Сурвивнна, блокирование которого приведёт к нарушению функций этого белка в опухолевых клетках; 3) Синтез и тестирование низкомолекулярного ингибитора Сурвивнна; 4) Исследование механизма действия полученного ингибитора на опухолевые клетки.

Научная новизна н практическая значимость работы

В данной работе была впервые исследована рать мономера Сурвивнна в регуляции аноптоза. Было показано, что именно мономер Сурвнвина участвует в защите опухолевых клеток от запрограммированной гибели, в то время как димер Сурвнвина, по-видимому, выполняет другие функции, например стабилизирует микротрубочки в интерфазе. На основажш полученных результатов мы выдвинули новую модель регулящш функцнй Сурвнвина в клетках, основанную на смещешш равновесия между димерной и мономерной формами существования этого белка внутри клетки. Опубликованные нами данные по этой теме нашли подтверждение в более поздних работах других авторов. Помимо этого, мы предположили, что блокирование участка днмеризацнн Сурвнвина с помощью низкомолекулярных лигандов окажется наиболее эффективно для ингибирования функций Сурвивнна в опухолевых клетках.

В сотрудничестве с профессором Накано Иширо (США) методом компьютерного моделирования была определена структура вещества, способного взаимодействовать с участком днмеризации Сурвивнна, после чего было синтезировано 11 соединений со сходной химической структурой. Для всех полученных веществ была определена способность влиять на пролиферацию стволовых клеток глиомы. Вещество под названием LLP-3 оказалось наиболее эффективным для подавления роста опухолевых клеток и было выбрано доя дальнейших исследований. Изучение механизма действия LLP-3 на опухолевые и нормальные клетки показало, что основной эффект этого препарата связан с ннгнбнрованием взаимодействия Сурвнвина и малой ОТРазы Ran. Более детальные исследования данного процесса показали, что в клетках существует и естественный,

2

эндогенный механизм ингабирования взаимодействия этих белков. Он осуществляется проапоптозным белком Smac/DIABLO и активируется на самых ранних стадиях апоптоза, вызывая остановку клеточного цикла.

Наконец, для того чтобы понять почему ингнбирование взаимодействия Сурвивина с белком Ran оказывает сильное влияние на опухолевые клетки мы исследовали функции комплекса Сурвпвин-Ran. Оказалось, что Сурвивин усиливает СТРазную активность Ran, и ускоряет экспорт РНК и некоторых белков из ядра. А это, в свою очередь, многократно повышает экспрессию целого ряда онкогенов и способствует деградации белка р53. Также, по нашим данным, активация Ran приводит к существенному повышению экспрессии Трансглутамнназы 2, что, с одной стороны, увеличивает устойчивость опухолевых клеток к химиотерапии, а, с другой, способствует метастазироваюпо опухолей. На основашш всех вышеперечисленных данных нами была предложена модель регуляции активности Ran белками Сурвивин и Smac/DIABLO.

Структура диссертации

Диссертационная работа изложена на 101 странице и cocroin из введения, обзора литературы, экспериментальной части, результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 100 ссылок. Диссертация содержэт 45 рисунков и 2 таблицы.

Апробация работы

Результаты работы представлены на российских и международных конференциях: Международная конференция НБХ, посвященная 75-леппо Ю.А Овчинникова (Москва, 2009); Школа-конференция молодых ученых «Фундаментальная наука для бнотехнолопш и меднцины-2010» (Москва, 2010); 14-ая Международная Пущинская школа -конференция молодых ученых «Биология - Наука XXI века» (Пущино, 2010); 12-ая Молодёжная научная школа (Москва 2010); Experimental Biology 2012 (Сан-Диего, США, 2012).

Публикации

По теме диссертационной работы опубликовано три статьи в рецензируемых журналах.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Функции димера и мономера Сурвивнна в опухолевых клетках

Долгое время считалось, что в клетке весь Сурвивнн находится лишь в виде димера, а мономер не имеет биологических функций. Однако постепенно накапливаются данные в пользу того, что в некоторых процессах участвует мономер, а не димер Сурвивнна. Так, например, именно мономер Сурвивнна входит в состав комплекса белков-пассажиров хромосом (СРС), и только в форме мономера Сурвивин экспортируется из ядра. Наконец, недавно полученные данные говорят о том, что в клетках существует специальный механизм регуляции равновесия между димерной и мономерноП формами Сурвивина благодаря ацетилированию этого белка по разшгчным остаткам лизина.

Поскольку в настоящее время основной функцией Сурвивина считается защита клеток от апоптоза, мы в первую очередь исследовали антнапоптозную активность димерной и мономерной форм Сурвивина. Существует, по крайней мере, три основных модели того, как Сурвивин защищает клетку от апоптоза: во-первых, Сурвивин способен ингибировать проапоптозный белок Smac/DIABLO, выходящий m межмембранного пространства митохондрия на ранних стадиях апоптоза, во-вторых, Сурвивин защищает от убиквнтннилирования и повышает стабильность антиапоптозного белка XIAP, и, наконец, Сурвивин препятствует транслокации в ядро белка AIF - главного медиатора каспазнезависимого апоптоза. Помимо этих, наиболее исследованных гипотез, также существуют данные о том, что Сурвивин защищает раковые клетки от действия некоторых противоопухолевых препаратов, благодаря его способности стабилизировать мнкротрубочкн.

Мы исследовали способность мономера Сурвивина ингибировать проапоптозный белок Smac/DIABLO с помощью анализа взаимодействия соответствующих рекомбинантных белков (рис. 1 А), а также используя метод регистрации FRET с техникой фотообесцвечивания акцептора (рис. 1Б). Полученные результаты свидетельствуют о том, что in vitro и in viw мутант Сурвивина, не способный к димеризащш (CypBiraiiHF101A/L102A)> может взаимодействовать с белком Smac/DIABLO. Также нами было показано, что для взаимодействия этих белков необходим участок димеризации Сурвивина. Далее, используя метод РНК ннтерференщш и созданные нами клеточные линии, стабильно экспресснрующие различные мутанты Сурвивина, мы получили данные, говорящие в пользу того, что мутант Сурвивина, не способный к димеризащш, более эффективно ннгибирует Smac/DIABLO, чем Сурвивин дикого Tima (WT) (рис. 1В и 1Г)-

4

Survivin Surm-iiiM°li,UKÍ

Рис 1. А. Результат иммунодетекции Сурвивина дикого типа и CypeueunF,01A/L102A, в образцах, полученных при элюции белков, связавшихся с иммобилизованным Smac/DIABLO 11 его делецнонным мутантом. Б. Графики зависимости интенсивности флуоресценции CFP от времени фотообесцвечивания YFP в клетках, коэкспрессирующих YFP-Сурвивин или YFP-CypeueuHF""A/L,02A и CFP, Smac/DIABLO-CFP tau Mi Smac/DIABLO-CFP. В. Активация каспазы-3 до и после обработки цисплатином клеток линии НТ1080, экспрессирующих различные мутанты Сурвивина. Г. Влияние миРНК против Smac/DIABLO и контрольной миРНК на активацию каспазы-3, вызванную цисплатином, в клетках линии НТ1080, экспрессирующих различные мутанты Сурвивина.

Исследуя участие мономера Сурвивина в защите клетки от апоптоза через увеличение стабильности антиапоптозного белка Х1АР, нам удалось показать, что Х1АР способен взаимодействовать не только с Сурвивином дикого типа, но и с его мутантом, не образующим димеров (рис. 2А и 2Б). И, в заключение, мы получили результаты о том, что

Сурвивин^'

лучше, чем Сурвивин дикого типа ингибирует каспазнезависимый

путь апоптоза в клетках фибросаркомы человека НТ1080 (рис. 2В).

dr4 с*«

oí4

„а*

ir

Я*

IP:anti-XIAP W: anti-XIAP

IP: «inti-XIAP W: ¿inti-Survivín

В

i 0 (|M (.C: iü ||M z-VAD-FMK; 4И h ■ 50цМ CPrO (tM z VAD FMK:48 h 50MM CP:20 MM ;-VAD-FMK: 48 li

150

70

60

XIAP-iurvUJlL - XIAP-SurvH(ílA/LlU¿A

Время (с.)

I

/ ¿ /

Acetyl-alpha tubulin

Рис. 2. А. Иммунодетекция различных мутантов Сурвивина, коиммунопреципитирующих с белком Х1АР. Б. Графики зависимости интенсивности флуоресценции СТР от времени фотообесцвечивания УТР в клетках, коэкспрессирующих УГР-Сл'рвивин или КРР-СурвивиГ/""ЛЛ'02Л и CFP-.XI.4P. В. Экспонирование фосфатидилсерина на наружную поверхность клеточной мембраны в клетках, экспрессируюи/их различные мутанты Сурвивина после обработки этих кчеток цисплатином в отсутствии или в присутствии ингибитора каспаз. Г. Иммунодетекцш ацетилированного а-тубулина, маркера стабилизированных микротрубочек, в клетках, экспрессируюи/их различные мутанты Сурвивина.

Таким образом, из наших данных следует, что неспособный к димеризашш Сурвивин обладает более высокой антнапоптозной активностью, чем Сурвивин дикого типа, который существует как в виде димера, так и в виде мономера. И поэтому, на основании полученных результатов мы можем предположить, что в защите от апоптоза участвует именно мономерная форма Сурвивина. Эта гипотеза хорошо согласуется с ранее полученными данными о том, что неацетилированный и в большей степени находящийся в виде мономера Сурвивин в цитоплазме защищает опухолевые клетки от активации каспаз. в то время как ацетилированный. и более подверженный димеризашш Сурвивин играет роль проапоптозного белка, понижая транскрипцию таких важнейших белков ингибиторов апоптоза как ВСЬХЬ и МЬС1

Предложенная нами модель антиапоптозного действия Сурвивина также даёт возможность объяснить каким образом Сурвивин способен выполнять разные, и даже во многом противоположные, функции в одних и тех же клеточных процессах. Так, например, можно предположить, что при делении часть Сурвивнна. находясь в виде мономера, входит в состав комплекса белков пассажиров хромосом и участвует в дестабилизировании неправильно прикреплённых к кинетохорам микротрубочек, а димерная фракция Сурвивина, взаимодействует с микротрубочками веретена деления , напротив, повышает их стабильность. Такая гипотеза кажется нам крайне вероятной, так как доказано, что в состав СРС входит именно мономер Сурвивина. а в нашей работе мы впервые показали, что только димер Сурвивина увеличивает стабильность микротрубочек в ннтерфазе (рис. 2Г), и. вероятно, только он, способен связываться с полимеризованным тубулином, играя роль адаптера между микротрубочками и стабилизирующими их белками. Таким образом, если предположить, что часть своих функций Сурвивин выполняет в виде димера, а часть в виде мономера, то регуляция равновесия димер -мономер может служить для «переключения» между различными функциями этого белка (рис. 3).

Всё вышеперечисленное свидетельствует о том, что, во-первых, участок димеризации играет ключевую роль в регуляции активности Сурвивина в клетках и, во-вторых, что именно мономер Сурвивина (т.е. Сурвивин с открытым участком димеризашш) выполняет наиболее важные для раковых клеток функции - защищает их от запрограмированной клеточной гибели. Такие рузультаты позволили нам предположить новую модель функционирования Сурвивина в опухолевых клетках (рис. 3).

Ствбигшзвиия ыинротюбснек

Комплекс белков пассажиров хроиосоы

Инзибированив STAT3

Инвибироеание каслаз

Защите от каслазнемаисиыого апоппюза

Посттрзнстцюннъп иодифмаиич

Рис. 3. Предполагаемая модель функционирования Сурвивина. В клетке димерная и мономерная формы Сурвивина находятся в состоянии динамического равновесия, которое может сдвигаться в ту или иную сторону с помощью различных посттрансляционных модификации этого бейка. Поскольку для каждой формы Сурвивина характерны свои функции, то сдвиг равновесия приводит к усилению одних функции Сурвивина и ослаблению друг/а.

Схема, приведённая выше, дала нам основание утверждать, что соединения, взаимодействующие с участком днмеризации Сурвивина. вероятнее всего, будут наиболее эффективными ингибиторами активности этого белка в опухолевых клетках.

2. Тестирование потенциальных ингибиторов Сурвивина

Ранее с помощью крупномасштабного ЯМР скрининга библиотеки химических веществ было обнаружено соединение, влияющее на положение аминокислот участка димеризации Сурвивина. Мы выбрали эту молекулу в качестве основы для моделирования ингибиторов Сурвивина. Компьютерные расчёты проводились в лаборатории профессора Накано Иширо (США) с помощью программ AutoGrid4, Autodock4 и AMBER99. На основании анализа полученных гипотетических структур, нашими коллегами было синтезировано 11 веществ, которые по данным компьютерных предсказаний, должны связываться с высокой аффинностью с участком димеризации Сурвивина (рис. 4А). Способность полученных соединений ннгибировать пролиферацию опухолевых клеток была проверена in vitro на культуре стволовых клеток глиомы (рис. 4Б). Результаты этого эксперимента показали, что вещество, названное «LLP-З» (4-[3,5-бис(бензнлокси)фенил]-6-(5-хлоро-2-п1Дроксифенил)-2-оксо-1,2-дш-вдропиридин-3-карбонитрил), наиболее эффективно понижает жизнеспособность раковых клеток.

✓у ?

LIK-W

rri .

&

уЧ. Л

(7

LLP-5

JUUL.

cmpd IC50

LIP1 54.4

-ш- LLP2 306

fCT- LLP3 31.2

— LLP4 71.0

LLP5 68.3

LLP6 >100

— LLP7 61.8

— LLP8 81.4

— LLP9 84.4

-о- LLP15 61.5

LLP16 >100

0 1 10 25 50 75 100 (microM)

Рис. 4. А. Структуры предполагаемых ингибиторов Сурвиаина. Б. Влияние синтезированных соединении на жизнеспособность стволовых клеток глиомы.

Важно отметить, что по данным компьютерных расчётов 1ХР-3 способен одновременно взаимодействовать с обоими мономерами, входящими в состав гомодимера Сурвивина. Другими словами. 1ХР-3 связывается с димером Сурвивина на участке контакта двух мономеров и, по-видимому, стабилизирует димерную форму существования Сурвивина (рис. 5).

Рис. 5. Взаимодействие LLP-3 с димером Сурвивина.

По приблизительным оценкам энергия димеризацин Сурвивина составляет около 18 ккал/моль, в то время как энергия взаимодействия LLP-3 с димером Сурвивина примерно равна 12 ккал/моль. Таким образом, LLP-3 может вносить чрезвычайно существенный вклад в стабилизацию димерной формы существования Сурвивина, увеличивая энергию димеризацин почти вдвое.

Чтобы подтвердить результаты компьютерного моделирования in vitro мы исследовали взаимодействие LLP-3 с Сурвивином дикого типа, а также с Сурвивином, имеющим замены 101ой и 102ой аминокислот (Сурвивинр101А/1*102А). Эти аминокислоты находятся на участке димеризацин и, по данным нашей компьютерной модели, необходимы для связывания LLP-3. Ранее мы обнаружили, что LLP-3 обладает сильной флуоресценцией с максимумом возбуждения при 390 нм и максимумом испускания при 560 нм (рис. 6А), причём после связывашш с белками интенсивность флуоресценции LLP-3 увеличивается более чем в 4 раза. Мы использовали это свойство для исследования взаимодействия LLP-3 с Сурвивином (рис. 6Б). Расчитанная константа диссоциации LLP-3 от Сурвивина дикого типа составила около 0.2 цМ, в то время как заметного связывания

LLP-3 с Сурвивином

,F101A/L102A

в условиях такого эксперимента обнаружено не было. Этот

результат полностью подтверждает данные компьютерного моделирования.

900

ООО

700

О 600

ее 500

3

400

О о> 300

о i». 700

е 100

0

KD = 0.2цМ

400 500 ООО

Длинна волны (нм.)

0,5

• LLP-3 + Survivin WT » LLP-3 + SuivivinF101A/L102A

1 1,5 2 zs 3 3,5 [белок]/[лиганд]

В 200 70 20 7 2 0.6 О

HM LLP3

GST-GFPSurvivIn

Рис. 6. А. Спектры возбуждения (синий) и испускания (зелёный) LLPS. Б. Изменение флуоресценции LLP-3 при титровании 1 ftM раствора LLP-3 рекомбинантным Сурвивином или C\peiieiiHOMF""A/L'02A. В. Результат иммунодетекции GST-GFP-сурвнвина е образцах, полученных при элюции белков, связавшихся с иммобилизованными мономерами Сурвивина в присутствии различных концентраций LLP-3.

10

Наконец, мы исследовали влияние 1ХР-3 на димеризашпо рекомбинантного Сурвивина. Для этого мономеры Сурвивнна, не способные Д1Гмеризоваться в присутствии 2М мочевины, были иммобилизованы в лунках планшета и затем инкубированы с ОБТ-ОРР-Сурвивином в присутствии различных концентраций 1ХР-3. Связавшийся Сурвивин элюировался и детектировался методом Вестерн блота. Результаты этого эксперимента (рнс. 6В) подтверждают, что 1ХР-3 действительно стабилизирует димеры Сурвивина.

3. Исследование механизма действия LLP-3 на опухолевые клетки

Как упоминалось выше, основной функцией Сурвивина в раковых клетках считается зашита от апоптоза. II поэтому, в первую очередь мы исследовали способность LLP-3 ингибировать взаимодействие Сурвивина с белком Smac/DIABLO и вызывать запрограммированную гибель опухолевых клеток. Действительно, по нашим данным. LLP-3 препятствует связыванию рекомбинантного Сурвивина и Sinac/DIABLO in vitro (рис. 7А) и вызывает каспаззавнсимый апоптоз в культуре опухолевых клеток (рис. 7Б).

70 30 7 2 0.8 0.3

рМ LLF3

GSTGFPSvnñin

х 25 £

S 20 >

1 15

и к о

10

о

LLP-3 z-VAD-fmk

■

I

+ +

Рис. 7. А. Результат иммунодетекции GST-GFP-Сурвивина в образцах, полученных при эпюции белков, связавшихся с иммобилизованным Smac/DIABLO в присутствии различных концентраций LLP-3. Б. Экспонирование фосфатидилсерина на наружную поверхность меточной мембраны в клетках линии НТ1080 после обработки этих клеток 40 //А/ LLP-3 в отсутствии или в присутствии ингибитора каспаз.

Однако 1ХР-3 эффективно ингибирует взаимодействие Сурвивина и Бтас/ОГАВЬО только в концентрациях более 10 цМ, а 48мн часовая инкубация клеток в присутствии 40 цМ 1ХР-3 вызывает апоптоз менее чем у 20% клеток. Исходя из этого, мы предположили, что сильный эффект 1ХР-3 на пролиферацию опухолевых клеток (рнс. 4Б) вряд ли связан с ннгпбированием антнапоптозной функции Сурвивина.

Другой важной функцией Сурвивнна является его участие в процессе митоза, где он выступает в роли белка пассажира хромосом и координирует правильное прикрепление микротрубочек к кинетохорам. Мы исследовали влияние 1ХР-3 на деление клеток с помощью иммунофлуоресцентной микроскопии (рис. 8).

0М50

ир-з

Рис. 8. Флуоресцентная микрофотография клеток, окрашенных антителами на ацетилированный а-тубулин (красный), Сурвивин (зелёный) и красителем ДНК (синий). Клетки линии НТ1080, обработанные 20 цМ ИР-З или ОМЗО (контроль), фотографировались на разных стадиях митоза и в интерфазе. Стрелки указывают на Сурвивин в составе комплекса белков пассажиров хромосом.

Как видно из рисунка 8, уже при 20 рМ концентрации 1ХР-3 практически во всех делящихся клетках были заметны видимые нарушения митоза. В метафазе в большинстве клеток, обработанных 1ХР-3, наблюдалось формирование множественных укороченных веретён деления, в телофазе было заметно явно неравномерное распределение ДНК между дочерними клетками, а многие ннтерфазные клетки содержали по несколько ядер. Однако, ни одно из перечисленных выше нарушении митоза не характерно для клеток с ненормальной активностью комплекса белков пассажиров хромосом (СРС), также верно и обратное: в клетках, обработанных 1ХР-3, не наблюдалось тех эффектов, которые обычны при неправильном функционировании хромосомнопассажирного комплекса. Более того, в клетках, обработанных Ы.Р-3, на протяжении всех стадий митоза Сурвивин сохранял свою нормальную локализацию, являясь частью СРС: в метафазе концентрируясь на кинетохорах, а в телофазе полностью перемещаясь в остаточное тельце. Таким образом,

12

LLP-3 действительно оказывает сильнейшее воздействие на деление опухолевых клеток, однако его эффект, по-видимому, не связан с нарушением тех функций, которые Сурвнвин выполняет в составе СРС.

Следует отметить, что наблюдаемые нами нарушения в митозе характерны при неправильном функционировании малой GTPa3bi Ran. В интерфазе эта ОТРаза регулирует экспорт из ядра РНК и некоторых белков, а во время митоза Ran координирует формирование веретена деления и дупликацию центросом. Недавно было показано, что Сурвивин может напрямую связываться с Ran, однако биологический смысл этого взаимодействия до настоящего момента был не известен. Основываясь на этих данных, мы исследовали влияние LLP-3 на взаимодействие Сурвивина и Ran in vitro (рис. 9А). Результаты наших экспериментов показали, что LLP-3 уже в концентрации 2 рМ эффективно ингибирует взаимодействие рекомбинантных Сурвивина и Ran (для сравнения, для ингибирования взаимодействия Сурвивина и Smac/DIABLO необходима по крайней мере 20 цМ концентрация LLP-3). Чтобы определить влияние LLP-3 на функционирование белка Ran in vivo мы исследовали внутриклеточною локализацию главной эффекторной молекулы Ran - белка ТРХ2. Как упоминалось выше, во время митоза Ran обеспечивает нормальное формирование веретена деления. Это происходит благодаря тому, что белок Ran способствует прикреплению ТРХ2 к правильно сформированным микротрубочкам. Оказавшись на мнкротрубочках, ТРХ2 защищает их от деградации, в то время как, не связанные с белком ТРХ2 неправильно сформированные микротрубочкн мало стабильны и быстро разрушаются. Как видно из рисунка 9Б, LLP-3 действительно препятствует колокатизацни ТРХ2 со стабилизированными микротрубочками как в метафазе так и в телофазе митоза, что свидетельствует о нарушении функций белка Ran.

А

ТО

В 4.35 0 5 0,25

S 02

< 0,55 0,1 0,05 0

Рис. 9. А. Результат имчунодетекции GST-GFP-Ratt в образцах, полученных при элюцин белков, связавшихся с иммобилизованным Сурвивином, в присутствии различных концентраций LLP-3. Б. Флуоресцентная микрофотография клеток, окрашенных антителами на ацетилированный а-тубулин (красный), ТРХ2 (зелёный) и красителем ДНК (амий). Клетки линии HTJOSO, обработанные 20 рМLLP-3 или DMSO (контроль), фотографировались на разных стадиях митоза. В. Количество GST-GFP-Ran связавшихегося с иммобилизованным Сурвивином дикого типа или СуреившюмГ")'Ау1")м в присутствии различных концентраций LLP-3. Детекция проводилась методом твёрдофазного ИФА.

Выше приведённые данные подтверждают нашу гипотезу, что LLP-3 ннгибирует взаимодействие Сурвпвина с белком Ran и, таим образом, нарушает функции Ran в клетке, что в конечном итоге и приводит к наблюдаемым дефектам в процессе деления.

В заключение мы попытались определить, каким именно образом LLP-3 ннгибирует взаимодействие Сурвивина и Ran. Для этого мы исследовали влияние LLP-3 на связывание белка Ran с мутантом Сурвивина, не образующим димеров (рис. 9В). Результаты этого эксперимента показывают, что Ran с одинаковой интенсивностью взаимодействует как с Сурвивином дикого типа так и с СурвивнномГ101А/1л0гА. II LLP-3 способен ингабнровать связывание обоих исследованных форм Сурвивина с белком Ran, однако в случае СурвивинаГ101АЯЛ02А для эффективного ингибирования необходима существенно более высокая концентрация LLP-3, так как аффинность СурвивннаП01А/и02А к LLP-3 гораздо ниже. Эти данные говорят о том, что, вероятнее всего, LLP-3, связываясь с Сурвивином, изменяет конформацию белка в целом и делает невозможным его взаимодействие с Ran. Это хорошо согласуется с ранее полученными результатами о том, что связывание лигандов с участком димеризации Сурвивина оказывает сильное влияние на его третичную структуру. С другой стороны, мало вероятно, чтобы LLP-3 мог напрямую конкурировать с Ran за взаимодействие с Сурвивином, так как в молекуле Сурвивина их сайты связывания находятся на существенном пространственном удалении друг от друга.

4. Исследование роли белкового комплекса Сурвпвин-Ran в опухолевых клетках

Из результатов приведённых выше очевидно, что взаимодействие Сурвивина с белком Ran имеет крайне важное значение для опухолевых клеток. Однако до настоящей работы не было никаких данных о биологической роли такого белкового комплекса.

Чтобы начать исследование этого вопроса мы сравнили эффекты LLP-3 и двух недавно описаных ингибиторов Сурвивина на его взаимодействия с белками Smac/DIABLO и Ran. Структуры и краткая характеристика использованных соединений приведены в таблице 1

Табл. 1. Ингибиторы Сурвивина, использованные в данной работе.

Структура соединения Краткое описание

ГЛ а^т) LLP-3. Впервые описан в данной работе, связывается с участком димеризации Сурвивина с Ка ~ 0.2 рМ. Стабилизирует димер Сурвивина. Ингибирует взаимодействие Сурвивина с белками Ran и Sinac/DIABLO

ОН 1 О ч' /V о »IN х 11 8 Vxr«' I- но TL32711-. Разработан в 2010 году компанией Tetralogie Pharmaceuticals, в настоящее время проходит II фазу клинических испытаний. Бивалентный мнметик белка Sinac/DIABLO. Связывается с высокой аффинностью с BIR доменом белка XIAP и с низкой аффинностью с BIR доменом Сурвивина.

PVHE-0136. Обнаружен в 2010 году Tsuyosbi Oikawa и соавторами в результате крупномасштабного скрининга химических библиотек. Ингибирует взаимодействие Сурвивина и Smac/DIABLO с 1С50 = 2.2 рМ. Данных о механизме ингибнрования нет.

Как видно из результатов эксперимента (рис. 10А) и 1ХР-3 и РУНЕ-0136 способны ннгибировать взаимодействие Сурвивина с белком ЭшасТЛАШХ), что полностью согласуется с полученными ранее данными. С другой стороны 1X32711 не оказывает заметного эффекта на взаимодействие этих белков, так как аффинность 1X32711 к Сурвивину не достаточно высока для конкуренции с белком БшасЯЛАВЬС). Гораздо более интересные результаты удалось получить при исследовании влияния этих соединений на взаимодействие Сурвивина с белком Яап. Как видно из рисунка 10Б, из всех протестированных веществ 1ХР-3 наиболее эффективно ингибирует это взаимодействие, однако и РУНЕ-0136 и ТЬ32711 также препятствуют образованию комплекса Сурвивин-

Ran. Поскольку TL32711 является мнметиком белка Smac/DIABLO, то он взаимодействует с тем же участком Сурвивина, что и Smac/DIABLO, однако с меньшей аффинностью (результаты эксперимента на рис. 10А). Таким образом, логично предположить что, если TL32711 способен ингибировать взаимодействие Сурвивина и Ran, то и белок Smac/DIABLO также будет вытеснять Ran из комплекса с Сурвивином.

Концентрация (цМ) Концентрация (цМ)

Рис. 10. А. Количество GST-GFP-Сурвпвина связавшегося с иммобилизованным Smac/DIABLO в присутствии различных концентрации LLP-3, PVHE-0136 или TL32711. Б. Количество GST-GFP-Ran связавшегося с иммобилизованным Сурвивином в присутствии различных концентрации одного из вышеперечисленных соединений. В обоих экспериментах детекция проводилась методом твердофазного ИФА.

Чтобы проверить эту гипотезу мы исследовали влияние Smac/DIABLO на взаимодействие Сурвивина и Ran in vivo. К сожалению, ни один из стандартных методов не позволяет следить за локализацией и интенсивностью естественных белок-белковых взаимодействий внутри клетки, даже используя метод детекции FRET, описанный выше, мы всегда будем сталкиваться с тем, что экспрессия интересующей нас пары белков будет многократно повышена, а влияние других белков на это взаимодействие, напротив, нивелировано. Чтобы решить эту проблему, мы применили новейший метод под названием "in situ proximity ligation assay" (PLA). PLA анализ позволяет визуализировать внутриклеточные белок-белковые взаимодействия в виде точечных флуоресцирующих областей, количество которых пропорционально интенсивности связывания исследуемых белков. Используя этот метод, мы определили влияние сверхэкспрессни экзогенного Smac/DIABLO на взаимодействие Сурвивина и Ran (рис. 11А и 11Б). Данные такого эксперимента подтверждают, что Smac/DIABLO действительно препятствует образованию комплекса Сурвивпн-Ran. Следующим шагом мы исследовали как

16

изменяется интенсивность взаимодействий с Сурвнвном белков Ran, Smac/DIABLO и XIAP при индукции апоптоза различными противоопухолевыми препаратами. Как видно из рисунка 11В, в клетках, обработанных стауроспорином и цисплатином, интенсивность взаимодействий Сурвивин-Smac/DIABLO и Сурвивин-XIAP возрастает, что полностью согласуется с предполагаемым механизмом антиапоптозной активности Сурвивина. С другой стороны, как и ожидалось, LLP-3 не оказывает заметного влияния на эти взаимодействия. Однако, именно LLP-3 наиболее эффективно снижает количество комплекса Сурвнвин-Rau. Но самым важным результатом этого эксперимента является то, что в клетках, обработанных цисплатином и стауроспорином, паралельно с усилением взаимодействия Сурвивина и Smac/DIABLO наблюдается эквивалентное ослабление взаимодействия Сурвивина и Ran. Это свидетельствует о том, что при индукции апоптоза, вышедший из межмембранного пространства митохондрий Smac/DIABLO, вытесняет Ran из комплекса с Сурвивином. Таким образом, можно утверждать, что в клетке существует собственный, эндогенный механизм ингибирования взаимодействия Сурвивина и Ran, который активируется на начальных стадиях апоптоза и выполняется белком Smac/DIABLO.

Б

mSmac-CFP

CFP

о» Ct ° 8

i

£ 6-

CD

Х>

% 4'

X CD

5 2

X

о»

•••

«««»" UU

И—Ц——W ■■■■ III

■mJillll» ■!■■■ I—

В

■ DMSO

■ LLP-3 20цМ

■ STSO.SuM

■ CP 60цМ

M

mSmac-CFP

1 ■■ IB

■■■ ■ ■■

■ ■■■ ■ ■■■

—■■ ■ Mil

CFP

Ran

Smac

XIAP

Рис. И. А. Визуализация взаимодействия белков Сурвивин и Ran методом PLA в клетках линии U87-MG, трансфецированных плазмидой, кодирующей Smac-CFP или CFP в качестве контроля. Б. Интенсивность взаимодействия белков Сурвивин и Ran в метках линии US7-MG, трансфецированных плазмидой кодирую/цеп Smac-CFP или CFP. В. Влияние LLP-}, цисгтатина и стауроспорина на взаимодействие белков Ran, Smac/DIABLO и ЖАР с Сурвивином в клетках линии U87-MG.

Получив данные о механизмах регуляции взаимодействия Сурвивина и Rail, мы решили исследовать функции этого белкового комплекса. Как упоминалось выше, во время митоза Rail обеспечивает правильное формирование веретена деления, а в ннтерфазе. основной функцией Ran считается транспортировка через ядерную пору из ядра в цитоплазму некоторых белков и РНК. Чтобы проверить, может ли Сурвивин влиять на роль ОТРазы Rail в ядерном экспорте, мы использовали Лептомицин Б (LMB) -антибиотик, специфически блокирующий CRM 1-зависимый транспорт из ядра. Как видно из рисунка 12А, добавление LMB в концентрации всего 10 нМ (слаботоксичной для клеток) вызывает более чем двухкратное усиление апоптоза, индуцируемого LLP-3. Факт, что эффекты от ингибирования ядерного экспорта и блокирования образования комплекса Сурвивин-Raii усиливают друг друга, дал нам основание предполагать, что эти процессы могут быть взаимосвязаны. Чтобы понять каким именно образом Сурвивин влияет на функции белка Ran в ядерном экспорте, мы в первую очередь решили определить в каком компартменте клетки происходит взаимодействие этих беков в интерфазе. Как видно из рисунка 12Б, в необработаных клетках подавляющее большинство комплексов Сурвивин-Ran было детектировано в цитоплазме и в особенности у поверхности ядра (вероятно на ядерной оболочке), обработка же клеток LMB приводит к перемещению комплекса Сурвивин-Rau из цитоплазмы в ядро (это связано с вызванным LMB накоплением в ядре Сурвивина), однако не снижает общего уровня взаимодействия исследуемых белков.

А 30

* ■ 24h

| 25 и48Н i

I §0

. it

DMSO LLP-3 LLP-3 + LMB LMB

18

i

Untreated

LMB

Рис. 12. А. Экспонирование фосфатидилсерина на наружную поверхность меточной мембраны в клетках линии U87-MG, обработанных LLP-3, LMB и обоими препаратами одновременно. Б. Визуализация взаимодействия белков Сурвивин и Ran методом PLA в мешках линии US7-MG до (слева) и после (справа) обработки клеток LMB. Стрелки указывают на взаимодействия Сурвивина и Ran у поверхности ядра.

Работы по исследованию процессов ядерного экспорта показали, что для опухолевых клеток характерно усиление СТРашой активности белка Rail в цитоплазме. Это приводит к ускорению экспорта из ядра некоторых мРНК и белков, что в свою очередь является причиной повышенной экспрессию целого ряда онкогенов, а также способствует деградации белка р53. Чтобы изучить влияние Сурвивина на Rau-зависимьш ядерный экспорт, мы исследовали эффекты LLP-3 и LMB на транспорт через ядерную пору 28S рибосомальной РНК, в переносе которой, как было показано ранее, участвует белок Ran. Как видно из рисунка 13А и LLP-3 и LMB заметно снижают количество 28S рРНК в цитоплазме, а добавление обоих соединений вместе дополнительно усиливает этот эффект. Такой результат говорит в пользу того, что взаимодействие Ran с Сурвнвнном приводит к усилению ядерного экспорта, а ингибированне этого взаимодействия, напротив, замедляет процессы выхода макромолекул из ядра. Чтобы подтвердить эту гипотезу, мы исследовали как LLP-3 влияет на экспрессию таких онкогенов, как Трансглутаминаза 2 и SMOC2. Ранее было показано, что количество этих белков существенно увеличено в клетках с повышенной ОТРазной активностью белка Rail в цитоплазме. Как видно из рисунка 13Б, LLP-3 действительно значительно снижает экспрессию исследуемых генов. Это подтверждает наше предположение о том, что взаимодействие Сурвивина и Ran в опухолевых клетках необходимо для усиления процессов ядерного экспорта.

Л DAP! 28S rRNA 28S rRNA Intensity

о

0 -^-T-^-1-

TG2 ЯМОС2 Mcl-I

Pue. 13. A. Локализация 28S pPHK в метках линии U87-MG, обработанных DMSO (контроль), LLP-i, LMB или обоими препаратами одновременно. На флуоресцентных микрофотографиях слева - ядра, окрашенные DAP1; в центре- 28S рРНК, окрашенная методом FISH; справа - интенсивность окрашивания клеток пробой к 28S рРНК, шкапа от белого (высокая интенсивность) к черному (низкая интенсивность). Б. Изменение экспрессии генов Трансгчутаминазы 2, SMOC2 и Мс1-1 после обработки мешок линии U87-MGразличными концентрациями LLP-3.

Таким образом, можно предположить, что в нормальных клетках, где Сурвивин присутствует только во время митоза, функция комплекса Сурвивин-Rau заключается в обеспечении правильного формирования веретена деления. В раковых же клетках Сурвивин экспрессируется на протяжении всех фаз клеточного цикла и поэтому получает возможность взаимодействовать с белком Ran в интерфазе и увеличивает его СГРазную активность в цитоплазме. Это влечёт за собой повышение экспрессии целого ряда онкогенов, а также вызывает ускоренную деградацию важнейшего белка супрессора опухолей - р53. Всё перечисленное выше в конечном итоге способствует приобретению опухолями более агрессивного фенотипа и высокой резистентности к противоопухолевым препаратам.

5. Заключение

Экспрессия Сурвивина многократно повышена в раковых клетках, однако значит ли это, что Сурвивин жизненно необходим для опухолевой трансформации или же он всего лишь является маркёром некоторых событий, происходящих при превращении нормальных клеток в раковые? Ответ на этот вопрос был получен уже давно. Подавление экспрессии Сурвивина с помощью миРНК, вирусных частиц или рибозимов действительно приводит к гибели раковых клеток, что говорит о безусловной важности этого белка для опухолей. Однако ни один из перечисленных методов не применим для лечения больных, а все разработанные к настоящему моменту низкомолекулярные ингибиторы Сурвивина оказались недостаточно эффективны. На наш взгляд причина этих неудач может крыться в недостаточном понимании функций Сурвивина в клетках. До настоящего момента все усилия были направлены исключительно на поиск соединений ингибирующнх антиапоптозную активность этого белка. Но является ли это «самой важной» функцией Сурвивина в опухолевых клетках? Данные, впервые приведённые в этой работе, свидетельствуют об обратном. Мы показали, что Сурвивин через взаимодействие с малой GTPa3ofl Ran способен регулировать процесс ядерного экспорта, вызывая целый каскад событий, придающих опухолям ряд наиболее опасных черт. Более того, в отличие от всех прочих функций Сурвивина, его взаимодействие с белком Rail является в полной мере опухолеспецифнчным, так как только в раковых клетках экспрессии этих белков повышены настолько, что они могут взаимодействовать в интерфазе. Все эти данные, на наш взгляд, представляют большой фундаментальный интерес, а также могут послужить основой для создания новых противоопухолевых препаратов. Более того, исследования впервые описанного в данной работе ингибитора Сурвивина под названием «LLP-З» без сомнения будут продолжены, и, как мы надеемся,

21

принесут ещё немало интересных результатов, так, например, нам уже удалось показать, что LLP-3 способен препятствовать росту опухолей ;>) vivo (рис. 14).

DMSO

LLP3

Рис. 14. Влияние ЫР-З на размер опухоли при введении в мозг голым мышам ство ловых

клеток глиомы человека

Выводы

1. Мутант Сурвивина, не способный к димеризации. эффективнее, чем Сурвнвин дикого типа, защищает опухолевые клетки от каспаззависимого и каспазнезависимого апоптоза, однако, только Сурвивин дикого типа способен увеличивать стабильность микротрубочек в интерфазе. Таким образом, димеризация Сурвивина имеет важное значение для регуляции активности этого белка в клетках.

2. В ходе данной работы был синтезирован низкомолекулярный ингибитор Сурвивина. получивший название «LLP-3» и взаимодействующий с участком димеризации Сурвивина с константой диссоциации Kj = 0.2 цМ. Это соединение показало высокую способность ингибировать пролиферацию клеток глиобластомы и фибросаркомы человека in vitr o и in vivo, вызывая нарушения в процессе митоза, остановку клеточного цикла и апоптоз. Такой эффект LLP-3 связан с ингибированием взаимодействия белков Сурвивин и Ran.

3. Белок Smac/DIABLO способен ингибировать взаимодействие Сурвивина и Ran in vitro и при индукции апоптозя in vivo.

4. Сурвивин, взаимодействуя с Ran, усиливает экспорт из ядра некоторых белков и РНК, что приводит к повышению экспрессии таких онкогенов как Трансглутаминаза 2 и SMOC2.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

Статьи

1. Marat S. Pavlyukov, Nadezhda V. Antipova, Maria V. Balashova, Tatjana V. Vinogradova, Evgenij P. Kopantzev and Mihail I. Shakhparonov. Survivin Monomer Plays an Essential Role in Apoptosis Regulation. J Biol Chem. 2011, Vol. 286, No. 26, pp. 23296-23307.

2. Marat S. Pavlyukov, Nadezhda V. Antipova, Maria V. Balashova and Mikhail I. Shakhparonov. Detection of Transglutaminase 2 conformational changes in living cell. Biochem Biophys Res Commun. 2012, Vol. 421, No. 4, pp. 773-779.

3. Hacer Guvenc, Marat S. Pavlyukov, Habibe Kurt, Ping Mao, Kauslial Joshi, Ryosuke Yainada, Cliang-Hyuk Kwon, Gaspar Kitange, In-Hee Park, Jann N Sarkaria, Chenglong Li, Mihail I. Shakhparonov and Ichiro Nakano. Impairment of glioma stem cell survival and growth by a novel inhibitor for Survivin/Ran protein complex. Clin Cancer Res. 2013, Vol. 19, No. 3, pp. 631-642.

1. Павлюков I\L С., Антнпова H. В., Заваюва JI. Л., Шахпаронов М. И.. Изучение взаимодействия рекомбинантных белков Survivin и Smac/DIABLO in vivo. Международная конференция ИБХ, посвященная 75-летию Ю.А Овчинникова, Москва, 2009 г., тезисы докладов, стр. 314.

2. Павлюков ¡SL С., Антипова Н. В., Шахпаронов М. И.. Создание новых противоопухолевых препаратов на основе белка сурвивнн. Школа-конференция молодых ученых «Фундаментальная наука для биотехнолопш и медицины -2010», Москва, 2010 г., тезисы докладов, стр. 4.

3. Павлюков 1\L С., Антипова Н. В., Завалова Л. Л., Шахпаронов М. И.. Изучение механизмов ингнбнрования апоптоза белком Сурвивнн. 14-ая Международная Путинская школа - конференция молодых ученых «Биология - Наука XXI века», Пущнно, 2010 г., тезисы докладов, стр. 167.

4. Павлюков М. С., Антипова Н. В., Шахпаронов М. И.. Участие мономера сурв1гвина в регуляции апоптоза. 12-ая зимняя молодёжная научная школа, Москва, 2010 г., тезисы докладов, стр. 47.

5. IVL S. Pavlyukov, М. I. Shakhparonov. Localization of different conformation forms of transglutaminase 2 in living cells. Конференция Experimental Biology 2012, Сан-Диего, США, 2012 г. The FASEB Journal. 2012; 26: 798.2.

Тезисы докладов на конференциях

/

t

ООО «Хорошая типография» Подписано в печать 16.04.13, тираж 75 экз. г. Москва, ул. Валовая, д. 14, стр. 8 Тел.: 8(495) 940-70-17 e-mail: 2202758@mail.ru mvw.niceprint.ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Павлюков, Марат Самвелович, Москва

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук

на правах рукописи

04201357017 Павлюков Марат Самвелович

СОЗДАНИЕ НОВОГО ИНГИБИТОРА СУРВИВИНА НА ОСНОВЕ ИЗУЧЕНИЯ ОПУХОЛЕСПЕЦИФИЧНЫХ ФУНКЦИЙ ЭТОГО БЕЛКА

Специальность - 03.01.03 - молекулярная биология

ДИССЕРТАЦИЯ НА СОИСКАНИЕ УЧЁНОЙ СТЕПЕНИ КАНДИДАТА БИОЛОГИЧЕСКИХ НАУК

Научный руководитель д.х.н. в.н.с. Шахпаронов М. И.

Москва 2013

Оглавление

Список сокращений...........................................................................................3

I. Обзор литературы.............................................................................................6

1. Введение................................................................................................................................6

2. Сурвивин................................................................................................................................7

2.1. Структура Сурвивина...................................................................................................7

2.2. Экспрессия и деградация Сурвивина..........................................................................9

2.3. Локализация Сурвивина в клетке..............................................................................10

2.4. Роль Сурвивина в апоптозе........................................................................................13

2.5. Комплекс белков пассажиров хромосом...................................................................21

2.6. Влияние Сурвивина на микротрубочки....................................................................25

3. Малая СТРаза Ran...............................................................................................................28

3.1. ОТРазный цикл Ran....................................................................................................28

3.2. Внутриклеточная локализация GTPa3bi Ran и важнейших белков регуляторов её активности...........................................................................................................................31

3.3. Участие йТРазы Ran в экспорте маромолекул из ядра...........................................34

3.4. Участие йТРазы Ran в импорте белков в ядро........................................................36

3.5. Роль вТРазы Ran в регуляции клеточного цикла....................................................37

3.6. Регуляция митоза ОТРазой Ran.................................................................................39

4. Заключение..........................................................................................................................43

II. Цели и задачи..........................................................................................................................45

III. Материалы и методы.......................................................................................46

1. Материалы...........................................................................................................................46

1.1. Оборудование..............................................................................................................46

1.2. Расходные материалы.................................................................................................46

1.3. Фирменные наборы.....................................................................................................47

1.4. Реактивы.......................................................................................................................47

1.5. Маркёры.......................................................................................................................48

1.6. Ферменты.....................................................................................................................48

1.7. Буферные растворы.....................................................................................................48

1.8. Микробиологические среды.......................................................................................49

1.9. Антитела и их разведения...........................................................................................50

1.10. Среды для культивирования эукариотических клеток..........................................50

1.11. Олигонуклеотиды......................................................................................................50

2. Методы.................................................................................................................................51

2.1. Методы работы с нуклеиновыми кислотами............................................................51

2.2. Методы работы с бактериями Escherichia Coli.........................................................56

2.3. Методы работы с белками..........................................................................................57

2.4. Методы работы с культурами опухолевых клеток человека..................................61

IV. Результаты и обсуждение.....................................................................................................68

1. Функции димера и мономера Сурвивина в опухолевых клетках...................................68

2. Тестирование потенциальных ингибиторов Сурвивина.................................................75

3. Исследование механизма действия LLP-3 на опухолевые клетки.................................77

4. Исследование роли белкового комплекса Сурвивин-Ran в опухолевых клетках........82

5.Заключение...........................................................................................................................91

V. Выводы.....................................................................................................................................93

VI. Список цитируемой литературы..........................................................................................94

Список сокращений

AIF - apoptosis inducing factor

AIP - aryl hydrocarbon receptor-interacting protein

BIR - baculoviral iap repeat

cAMP - cyclic Adenosine Triphosphate

СВР - CREB binding protein

Cdk - cyclin dependant kinase

CPC - chromosomal passenger complex

CRM1 - Chromosome Region Maintenance 1

dADP - deoxyadenosine diphosphate

DAPI - 4',6-diamidino-2-phenylindole

DEPC - diethyl pyrocarbonate

DTT - Ditiotreitol

FISH - Fluorescence in situ hybridization

FRET - Fluorescence resonance energy transfer

GDP - Guanosine Diphosphate

GST - Glutathione ¿»-Transferase

GTP - Guanosine Triphosphate

HBXIP - Hepatitis В X-Interacting Protein

Hsp - Heat shock protein

IAP - Inhibitor of Apoptosis Protein

IBM - lap Bindig Motif

INCENP - inner centromere protein

NES - nuclear export signal

NIAP - neurinoma inhibitor of apoptosis protein

NLS - nuclear localization signal

PKA2 - cAMP-dependent Protein Kinase A

PLA - Proximity Ligation Assay

PP2A - Protein Phosphatase 2A

Ran - RAs-related Nuclear protein

RanBPl - Ran Binding Protein 1

RanGAPl - Ran GTPase activating protein 1

RNA - ribonucleic acid

SDS - sodium dodecil sulfate

siRNA - small interfering RNA

Smac/DIABLO - Second Mitochondria-derived Activator of Caspases/Direct IAp Binding protein with LOw pi

Tom - translocase of the outer membrane molecule

TPX2- Targeting Protein for Xklp2

XIAP - X-linked inhibitor of apoptosis protein

а.к. - аминокислота

АМФ - аденозинмонофосфат

АТФ - аденозинтрифосфат

БВГ - буфер верхнего геля

БСА - бычий сывороточный альбумин

БНГ - буфер нижнего геля

ИПТГ - изопропил-Р-Э-тиогалактозид

ИФА - иммуноферментный анализ

миРНК - малая интерферирующая РНК

мРНК - матричная РНК

об/мин - оборотов в минуту

п.н. - пара нуклеотидов

ПААГ - полиакриламидный гель

ПСА - персульфат аммония

ПЦР - полимеразная цепная реакция

рРНК - рибосомальная РНК

СПК - сыворотка плода коровы

ТЕМЕД - тетраэтилметилендиамин

ТМБ - 3,3',5,5'-Тетраметилбензидин

ФЭУ - фотоэлектронный умножитель

ЭДТА - этилендиаминтетраацетат

/. Обзор литературы 1. Введение.

Онкологические заболевания являются одной из главных причин смертности в развитых странах. И хотя за последние тридцать лет наши знания о генах и белках, участвующих в опухолевой трансформации клеток, увеличились многократно, это так и не привело к эквивалентному прогрессу в борьбе с раковыми заболеваниями. И по сей день основными способами лечения большинства онкологических больных остаются разработанные десятилетия назад малоэффективные и крайне опасные методы радио- и химиотерапии.

Большой прогресс в этой области могло бы принести создание высокоспецифичных лекарств, действующих на продукты генов, жизненно необходимых для опухолевых клеток, но играющих меньшее значение в нормальных тканях человека. И действительно, эта стратегия привела к разработке ряда весьма эффективных препаратов для борьбы с не Ходжкиновой лимфомой и хронической миелогенной лейкемией. Однако большинство типов рака не имеют единого «главного» онкогена. И поэтому лечение таких опухолей с помощью точечного воздействия на один ген или белок оказывается или не эффективным вовсе, или даёт лишь кратковременные результаты из-за быстрого возникновения резистентности к данному типу лечения [57].

Однако последние результаты исследований протеома опухолевых клеток могут послужить ключом к решению этой проблемы. Недавно стало известно, что в клетках существуют так называемые «узловые» белки, которые образуют сложнейшую сеть взаимодействий с белками-посредниками и координируют сразу несколько процессов жизнедеятельности клетки. Поэтому лекарства, действующие на один из этих белков, будут обладать довольно широким эффектом, что, с одной стороны, позволит избежать быстрого возникновения резистентности к таким препаратам, а с другой, сделает их пригодными для лечения сразу нескольких типов опухолей.

Настоящая работа посвящена исследованию белка Сурвивин, который, с одной стороны, входит в пятёрку наиболее опухолеспецифичных белков человека [10], а с другой, является «узловым» белком [50] и участвует в таких процессах как апоптоз [26], чекпоинт формирования веретена деления [27], регуляция динамики роста микротрубочек [33], ответ клетки на стресс [И], играет важную роль в регуляции клеточного цикла [22], и, как впервые было показано в данной работе, активирует Кап-зависимый яденый экспорт.

2. Сурвивин.

Впервые Сурвивин был описан в 1997 году, как белок-ингибитор апоптоза и отнесён к семейству IAP (inhibitor of apoptosis proteins) [4]. Белки этого семейства были открыты у бакуловирусов. Но позже были найдены IAP не вирусной природы [25]. К настоящему моменту в клетках человека обнаружено 8 IAP белков [32]. Они характеризуются наличием одного или нескольких участков, называемых Baculoviral lap Repeat (BIR). BIR домен считается основным медиатором антиапоптозных функций [9]. Сурвивин является самым маленьким 1АР человека, он имеет молекулярную массу 16,5 кДа [30] и в растворе существует в виде гомодимера [24]. Ранее предполагалось, что мономер Сурвивина не имеет биологических функций [18, 19], однако, в последнее время, накапливаются данные о том, что во многих процессах участвует именно мономер, а не димер Сурвивина [1, 23].

Как упоминалось выше, Сурвивин является крайне многофункциональным белком, однако, наибольшее внимание среди всех его функций привлекло участие Сурвивина в защите клеток от апоптоза. Повышенная экспрессия этого белка придаёт раковым клеткам устойчивость к действию противоопухолевых препаратов, а ингибирование активности Сурвивина, напротив, приводит к спонтанному апоптозу опухолевых клеток, не влияя на нормальные ткани организма [34, 5]. Однако, несмотря на большое количество работ, посвященных изучению роли Сурвивина в клетке, механизм, по которому этот белок ингибирует апоптоз, до сих пор остаётся неясным.

2.1. Структура Сурвивина.

Сурвивин (наиболее распространённая изоформа) состоит из 142 аминокислот и имеет массу 16,5 кДа. Этот белок образует единую третичную структуру без отделённых

друг от друга доменов, о чём говорит его стабильность при обработке протеазами [23]. В

2+

молекуле сурвивина присутствует BIR домен (15-87 а.к.), связывающий атом Zn . В состав BIR домена входят 3 антипараллельные нити, образующие [5-складки, и окруженные четырьмя короткими а спиралями (рис.1). Цинк хелатируют высоко консервативные Cys-57, Cys-60, Cys-84 и His-77. На С-конце сурвивин имеет длинную си-спираль (99-142 а.к. ), сочетающую в себе амфифильные и гидрофильные свойства [18] (рис.1).

л

87 99

142

У///Л

В1Р ^ТоНей-соИ ¡nterface

Рис. 1. Структура мономера Сурвивина. (Л) Структура мономера Сурвивина, изображённая с помощью ленты. Зелёным изображены (3-складки; синим- а-спирали; фиолетовым - области, принимающие участие в димеризации. (Б) Схематическая диаграмма Сурвивина. Обозначены участки димеризации, В1Я домен и С-концевая а-спираль [18, 16].

В растворе Сурвивин существует в виде гомодимера, однако, в каком состоянии он находится в различных компартментах клетки до сих пор однозначно неизвестно. Методом ЯМР и рентгенокристаллографии было показано, что димер сурвивина имеет форму «галстука-бабочки» (рис.2) [24]. Димеризация Сурвивина осуществляется благодаря двум гидрофобным областям: одна из которых находится на N конце (6-10 а.к.), а вторая в линкерном участке между В1Я доменом и С концевой а-спиралью (89-102 а.к.) [1].

5ип/Мп

Бип/тп

Рис. 2. Структура димера Сурвивина. Структура димера белка сурвивин изображена с помощью ленты. Увеличенный участок показывает аминокислотные остатки, необходимые для димеризации и формирующие гидрофобное ядро димеризационной поверхности [23].

При образовании димера Сурвивина Leu98 одной молекулы заходит в гидрофобный карман, сформированный другой молекулой (Leu6Sur, TrplOSur, Phe93Sur, Phel01Sur и Leul02Sur) [23].

Интересно отметить, что в недавно опубликованной работе доктора Ванга и соавторов было убедительно показано, что в клетке существует особый механизм регуляции равновесия между димерной и мономерной формами существования Сурвивина. Это происходит благодаря ацетилированию Сурвивина по различным остаткам лизина ацетилтрансферазой гистонов, белком СВР (CREB binding protein). По-видимому, наибольшее значение здесь имеет присоединение ацильной группы к 129ому лизину Сурвивина, такая модификация значительно усиливает гомодимеризацию этого белка [58].

2.2. Экспрессия и деградация Сурвивина.

В нормальных, не опухолевых, клетках количество Сурвивина жёстко регулируется прогрессией клеточного цикла. В интерфазе этот белок почти полностью отстутствует, однако при начале митоза, в G2/M стадии клеточного цикла, наблюдается резкое усиление экспрессии гена Сурвивина и соответсвующее увеличение количества данного белка. На протяжении всего митоза Сурвивин присутствует в клетках на достаточно высоком уровне (в сравнении с интерфазными клетками, однако значительно ниже количества Сурвивина в опухолевых клетках), а по завершении процесса деления, в начале G| стадии клеточного цикла, количество Сурвивина резко падает благодаря быстрой деградации этого белка в протеасоме [20].

В отличие от нормальных клеток, в опухолевых клетках Сурвивин присутствует на высоком уровне на протяжении всех фаз клеточного цикла, и причины этого кроются как в дерегуляции экспрессии гена Сурвивина, так и в нарушении процессов деградации данного белка [49]. Механизмы работы промотора гена Сурвивина крайне сложны и не являются темой данной работы, однако процесс разрушения этого белка представляет большой интерес.

Сигналом к деградации Сурвивина служит его полиубиквитинилирование. Этот процесс регулируется участком, расположенным в С-концевой области от BIR домена [3].

Из-за убиквитинилирования и последующего разрушения в протеасоме Сурвивин в клетке имеет довольно короткое время полужизни, около 6 часов. Интересно, что скорость полиубиквитинилирования Сурвивина регулируется многими белками, например, взаимодействие Сурвивина с Smac/DIABLO сокращает время полужизни Сурвивина более чем в два раза [13], а связывание Сурвивина с белком AIP, напротив, почти в два раза увеличивает его стабильность [16]. Кроме AIP деградация Сурвивина также ингибируется и шапероном Hsp90, взаимодействующим с участком 79-90 а.к. Сурвивина [17].

Помимо убиквитинилирования, ведущего к разрушению белков в протеасоме, Сурвивин также подвергается убиквитинилированию, не связанному с деградацией, а играющему роль в регуляции белок-белковых взаимодействий. Так в начале митоза Сурвивин убиквитинилируется комплексом p97-Ufdl-Npl4, что улучшает связывание Сурвивина с центромерами во время деления клетки. Был описан и противоположный процесс - деубиквитинилирование Сурвивина, осуществляемое белком hFAM (USP9x), который, наоборот, усиливает диссоцицию Сурвивина от хромосом. Таким образом, осуществляется тонкая регуляция взаимодействия Сурвивина и центромер, которая играет важнейшую роль в системы чекпоинта формирования веретена деления (см. пункт 2.6.1) [39].

2.3. Локализация Сурвивина в клетке.

В интерфазе Сурвивин локализуется преимущественно в цитоплазме в соотношении цитозоль:ядро 6:1 [3]. В настоящее время выделяется три пула Сурвивина: ядерный - контролирующий клеточное деление, цитозольный - участвующий в регуляции стабильности микротрубочек и митохондриальный - несущий антиапоптозную функцию [2]. Различие этих пулов связано с тем, что в разных компартментах клетки Сурвивин имеет различные посттрансляционные модификации [12, 35].

Сурвивин способен перемещаться из цитоплазмы в ядро и обратно. Выход Сурвивина из ядра осуществляется по CRM1 зависимому пути. CRM1 - экспортный рецептор, связывающий последовательность ядерного экспорта (NES) и переносящий белки, имеющие NES, из ядра в цитозоль. Сурвивин имеет, как минимум, две NES последовательности. Они располагаются на участках 84-109 а.к. и 119-142 а.к. и каждой из них в отдельности достаточно для экспорта Сурвивина из ядра. Из структуры димера Сурвивина (рис.2) видно, что NES, находящаяся на участке 84-109 а.к., перекрывается с областью димеризации (89-102 а.к.), и, следовательно, при образовании димера она оказывается закрытой для связывания с CRM1. Таким образом, димер Сурвивина имеет намного более низкую аффинность к CRM1 рецептору и значительно хуже мономера

10

выходит из ядра. Всё это является причиной того, что Сурвивин, ацетилированный по 129ому лизину, который, как упоминалось выше, гораздо более подвержен димеризации, преимущественно имеет ядерную локализаци, а не ацетилированный Сурвивин напротив находится в цитоплазме [58].

Маловероятно, чтобы Сурвивин подвергался активному импорту в ядро. Эксперименты показали, что он не имеет последовательности ядерной локализации (NLS). Однако, низкий молекулярный вес (16,5 кДа) Сурвивина позволяет ему входить в ядро путём пассивной диффузии.

Было показано, что Сурвивин кроме ядра и цитозоля также присутствует и в межмембранном пространстве митохондрий. Механизм перемещения Сурвивина в митохондрию до сих пор неизвестен, однако, отсутствие в нём последовательности митохондриальной локализации предполагает участие в транспорте Сурвивина других белков. Вероятным кандидатом на такую роль являются шаперон Hsp90 [11, 55] и транспортный ком