Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Обнаружение опухолей на основе идентификации экзосомальных белков в сыворотке крови

ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Обнаружение опухолей на основе идентификации экзосомальных белков в сыворотке крови"

На правах рукописи

НИКИТИНА Инна Геннадьевна

ОБНАРУЖЕНИЕ ОПУХОЛЕЙ НА ОСНОВЕ ИДЕНТИФИКАЦИИ ЭКЗОСОМАЛЬНЫХ БЕЛКОВ В СЫВОРОТКЕ КРОВИ

Специальность - 03.01.03 - молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2014

005550271

005550271

Работа выполнена в Лаборатории регуляции внутриклеточного протеолиза Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук

Научный Ведущий научный сотрудник Лаборатории регуляции внутриклеточного

руководитель: протеолиза Федерального государственного бюджетного учреждения

науки Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук, доктор биологических наук, профессор

Берестень С.Ф.

Официальные Старший научный сотрудник Лаборатории структуры и функций генов оппоненты: человека Федерального государственного бюджетного учреждения

науки Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук, доктор биологических наук

Николаев Л.Г.

Ведущий научный сотрудник Группы генетической инженерии грибов Центра «Биоинженерия» Российской академии наук, кандидат биологических наук

Эльдаров М.А.

Ведущая Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт

организация: биологии развития им. Н.К. Кольцова Российской академии наук

Защита состоится << УК /¿Я&А/и! 2014 г. в часов на заседании Диссертационного Совета Д 002.235.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук по адресу: 119991, Москва, ул. Вавилова, 32.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук по адресу: 119991, Москва, ул. Вавилова, 32.

Автореферат разослан «ХЗ»/*2014 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат химических наук

рицын А.М.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Одной из актуальных проблем современной молекулярной биологии является разработка новых способов молекулярной диагностики заболеваний, одним из наиболее распространённых типов которых является рак толстой кишки (РТК). Современные методы сывороточной диагностики рака основаны на количественном анализе содержания проникающих в кровоток биомаркеров (белков, ДНК и некодирующих РНК), содержание которых заметно возрастает в сыворотке крови при развитии опухоли. Однако идентифицированные до настоящего времени потенциальные белковые маркеры РТК пока недостаточно надежны, а имеющиеся методы их детекции недостаточно чувствительны для диагностики рака в образцах сыворотки крови населения из групп повышенного риска.

Одним из наиболее перспективных подходов к созданию клинических тестов для обнаружения опухолей является анализ молекулярного состава опухолевых экзосом. Экзосомы (т.е. покрытые липидной мембраной микропузырьки) экспортируются в кровоток большинством типов клеток в процессе межклеточной коммуникации. Молекулярный состав и количество экзосом заметно изменяются при возникновении опухолей и целого ряда других заболеваний. Многочисленные исследования показали, что количество экзосом в крови (в норме составляющее 100-400 миллионов частиц на мл) резко возрастает в процессе канцерогенеза. На последних стадиях развития опухолей различных типов (в отсутствие метастазирования) количество опухолевых экзосом может составлять до 30% от общего количества экзосом сыворотки крови.

Полученные в последние годы результаты показывают, что анализ белкового и РНК-состава сывороточных экзосом позволяет заметно увеличить чувствительность диагностики, прогнозирования и послеоперационного мониторинга различных видов опухолей. Анализ биомаркеров опухолевых экзосом обладает рядом преимуществ по сравнению с традиционными методами детекции сывороточных биомаркеров. Поскольку опухолевые экзосомы формируются из эндоплазматической мембраны клетки, репертуар имеющихся на их поверхности мембранных белков хорошо коррелирует с репертуаром мембранных белков экспортирующих их опухолевых клеток. Аффинная очистка опухолевых экзосом с использованием иммобилизованных антител к опухолеспецифичным или тканеспецифичным поверхностным белкам позволяет полностью удалить компоненты сыворотки (или другой биологической жидкости), а также экзосомы неопухолевой природы и тем самым резко повысить специфичность диагностического теста. Дополнительным преимуществом анализа экзосом является то, что число копий индивидуального белка в их мембране обычно весьма велико. В результате, вследствие амплификации сигнала, тесты, основанные на детекции присутствия индивидуального белка или другого биомаркера в составе экзосом, заметно более чувствительны, чем при использовании традиционных методов иммуноанализа.

Большинство современных иммунологических тестов включают как минимум три основных компонента: 1) детектируемый белок (антиген образца); 2) антитело и 3) присоединенную к антителу метку, которая детектируется с использованием высокочувствительного химического, биологического или физического метода. Перед началом тестирования антитела или антиген иммобилизуют на носителе (в лупке плашки, на магнитных шариках и т.п.) в результате адсорбции или ковалентного присоединения. После взаимодействия антигена с антителом неспецифические комплексы, образуемые антителами, разрушают хаотропным агентом (т.е. веществом, частично дестабилизирующим трёхмерную структуру макромолекул), а затем проводят количественный анализ специфичных комплексов. Дополнительное повышение чувствительности иммунологических тестов может быть достигнуто в результате использования методов пробоподготовки, повышающих концентрацию антигена в анализируемом образце. Наиболее эффективные способы такого

типа основаны на фишинге, а в случае анализа биолошчсских жидкостей - на выделении экзосом.

Одним из наиболее чувствительных методов иммуноанализа в настоящее время является иммуно-ПЦР. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) является уникальным по специфичности и чувствительности способом детекции комплексов антиген-антитело, поскольку позволяет экспоненциально амплифицировать и детектировать присутствие конъюгированной с детектирующим антителом ДНК-метки (вплоть до одной молекулы) с использованием простого оборудования. Использование иммуно-ПЦР понижает предел детекции антигена по сравнению со стандартным методом колориметрического иммуно-ферментного анализа в 10 тыс. раз. Однако достижение низких пределов детекции требует как высокой аффинности антител, так и использования методов конъюгации ДНК с антителами, не изменяющих активности антител.

Для конъюгации как одно- так и двухцепочечных ДНК-меток (репортеров) с детектирующими антителами используются три основных способа. Первый способ основан на введении в один из концов ДНК-репортера молекулы биотина в процессе химического синтеза. Для последующей конъюгации используется рекомбинантный белок-химера, в состав которого входят: 1) связывающийся с биотином белок стрептавидин, имеющий четыре сайта связывания биотина; 2) присоединённый к стрептавидину белок А, образующий прочные комплексы с Рс-фрагментом антител. Второй способ конъюгации (т.н. «универсальный иммуно-ПЦР») предполагает введение биотиновой метки, как в конец ДНК-репортера, так и в детектирующее антитело (в этом случае присоединение биотина к антителу происходит по остаткам лизина и аргинина, что вызывает частичную инактивацию детектирующих антител). Конъюгация происходит в результате добавления стрептавидина в смесь детектирующих антител и ДНК-репортера. Одна из модификаций этого протокола предполагает образование больших надмолекулярных комплексов, включающих несколько молекул стрептавидина одновременно связывающихся с молекулой антитела. Часть иммуно-ПЦР протоколов такого типа основана на использовании липосом, что позволяет более чем в сто раз повысить чувствительность иммуноанализа. Используемая в этом случае метка, присоединяемая к детектирующему антителу, представляет собой окруженную липидной мембраной частицу, внутри которой находится большое количество молекул ДНК-репортера. Для конъюгации с антителом (которая также как и в базовом протоколе происходит через стрептавидин) в состав липидной мембраны вводится биотинилированное производное полиэтиленгликоля. Наконец, последний описанный в литературе способ конъюгации антител с репортером предполагает прямую ковалентную пришивку ДНК к лизиновым и аргининовым аминокислотным остаткам антител, что также приводит к частичной потере их активности.

Цели и задачи работы. Целью работы являлась разработка нового способа обнаружения опухолей толстой кишки, основанного на сывороточной детекции белков опухолевых экзосом с использованием иммуно-ПЦР.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Сбор коллекции образцов нормальных и опухолевых тканей толстой кишки, а также сывороток здоровых доноров и сывороток крови пациентов с диагнозом аденокарцинома толстой кишки.

2. Биоинформатический поиск мембранных белков эпителия толстой кишки, секретируемых в кровоток в составе опухолевых экзосом.

3. Получение высокоаффинных антител к идентифицированным белкам.

4. Разработка новой модификации метода очистки опухолевых экзосом из образцов сыворотки пациентов с диагнозом аденокарцинома толстой кишки.

5. Разработка нового формата иммуно-ПЦР, основанного на использовании бинарных конъюгатов ДНК-репортера и антител к активированной поверхности микрошариков. Определение предела чувствительности детекции антигена разработанного формата иммуно-ПЦР.

6. Сравнительный анализ содержания идентифицированных в п. 2 мембранных белков в составе опухолевых экзосом, аффинно очищенных из сыворотки крови пациентов с диагнозом рак толстой кишки и здоровых доноров с использованием разработанного формата иммуно-ПЦР.

Научная новизна. В ходе выполнения диссертации были разработаны:

1. Новый алгоритм биоинформатического поиска мембранных белков, секретируемых в

кровоток в составе опухолевых экзосом.

2. Новый протокол синтеза бинарного конъюгата детектирующих моноклональных антител и ДНК-репортера с активированной поверхностью магнитных микрошариков.

3. Новый протокол связывания опухолевых экзосом с иммобилизованными на мембране

захватывающими антителами.

4. Новый высокочувствительный формат иммуно-ПЦР для обнаружения рака толстой кишки.

Практическая ценность. Сывороточные тесты для обнаружения опухолей толстой кишки в группах повышенного риска позволяют увеличить выживаемость пациентов и уменьшить затраты системы здравоохранения на их лечение.

Апробация работы. Результаты работы были представлены в марте 2013 г. на отчётной конференции РФФИ (грант № 11-04-12082-офи-м «Разработка высокоэффективного метода иммуно-ПЦР для анализа низкокопийных белков»).

Публикация. По теме диссертации опубликовано восемь работ в рецензируемых научных журналах.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения, выводов и

списка литературы (136 наименований). Работа изложена на 99_страницах

машинописного текста, содержит б таблиц и 27 рисунков.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

В обзоре литературы описана роль экзосом в процессе канцерогенеза и рассмотрены основные методы иммуноанализа белков.

Результаты н обсуждение.

1. Бноннформатическпи поиск мембранных белков эпителия толстой кишки, секретируемых в кровоток в составе опухолевых экзосом.

Поиск мембранных белков, секретируемых в кровоток в составе опухолевых экзосом, осуществляли с использованием модификации разработанного нами ранее алгоритма (Букурова Ю.А. и др., 2011), схема которого показана на рисунке 11. Алгоритм основан на отборе мРНК-мишеней тех микроРНК, уровень синтеза которых наиболее часто понижается в опухолях по сравнению с нормой. Это должно приводить к увеличению содержания кодируемых этими мишенями белков в образцах опухолей. На первом этапе поиска на основе анализа литературных данных и имеющихся баз данных отбирали микроРНК, уровень синтеза которых наиболее заметно и часто понижается в опухолях толстой кишки. Затем с использованием имеющихся в интернете компьютерных программ были идентифицированы мРНК-мишени отобранных микроРНК, которые ранжировали в соответствии с рассчитанной интегральной скоринг-функцией в!.

Построение списка дифференциально экспрессируемых микроРНК

Анализ литературы, БД экспрессии микроРНК

Расчёт скоринг-функции

Число

TargetScan score j ( предсказывающих ресурсов

Отбор мембранных белков в соответствии с Gene Ontology

Отбор эксзосомных белков в соответствии с Exocarta

Рисунок экзосом.

1.

Схема, поясняющая алгоритм биоинформатического поиска мембранных белков

В результате поиска было отобрано 20 мембранных белков с наибольшими значениями SI, уровень синтеза которых должен заметно повышаться в опухолях толстой кишки. На последнем этапе были введены три дополнительных критерия отбора потенциальных белковых маркеров:

1. Локализация белка в клеточной мембране (интегральные и ассоциированные с мембраной поверхностные белки).

2. Максимальный уровень синтеза в опухолях толстой кишки при минимальном уровне

синтеза в других тканях.

3. Присутствие белка в экзосомах, секретируемых клетками толстой кишки, но не в кровяном протеоме (на основе анализа базы данных ExoCarta).

В результате дальнейшего анализа отобрано пять белков, присутствие которых в экзосомах, секретируемых опухолями толстой кишки, было подтверждено по результатам поиска в базе данных PubMed: ММР14, CLDN3, ЕРСАМ, СЕАСАМ5 и TSPAN8. Белок ММР14 был удален из списка, поскольку согласно базе данных The Human Protein Atlas повышение уровня синтеза этого белка происходит в целом ряде карцином, гораздо чаще, чем опухолях толстой кишки. По результатам анализа литературных данных к списку белковых маркеров опухолевых экзосом был добавлен белок CDH17, специфически синтезируемый в клетках желудочно-кишечного тракта, поскольку: 1) уровень синтеза этого белка заметно повышается в опухолях толстой кишки; 2) показано присутствие этого белка в составе секретируемых опухолями экзосом.

Анализ литературных данных показал, что отобранные белки обладают следующими свойствами:

1. CDH17 - трансмембранный белок, играющий важную роль в клеточной адгезии, специфически синтезируемый в клетках желудочно-кишечного тракта.

2. TSPAN8 - гликопротеин клеточной поверхности, который участвует в регуляции клеточного развития, роста и движения (этот белок синтезируется в различных карциномах).

3. СЕАСАМ5 - гликопротеин клеточной поверхности, участвующий в клеточной адгезии и передаче внутриклеточных сигналов.

4. CLDN3 - белок плотных межклеточных соединений.

5. ЕРСАМ - белок, специфически синтезируемый в эпителиальных тканях и большинстве карцином, включая опухоли толстой кишки, участвующий в адгезии эпителиальных клеток.

Первоначально для проведения экспериментов были закуплены коммерческие поликлональные антитела ко всем пяти отобранным белкам, которые использовались для Вестери-блот анализа белковых экстрактов нормальных и опухолевых тканей. Анализ показал, что пределы детекции антигенов коммерческими антителами недостаточны для эффективного иммуноанализа, что, по-видимому, является результатом низкой аффинности антител. Как известно, антисыворотки, полученные после иммунизации лабораторных животных антигеном, содержат как высокоаффинные антитела к антигену (константа аффинности, Ка>109 л/моль), так и антитела со средней и низкой аффинностью. Последние могут составлять до 90% антител антисыворотки (Notkins A.L. et al, 2004) (Рис. 2). Поскольку используемые коммерческими компаниями методы очистки поликлональных антител не позволяют полностью удалить низко- и средне-аффинные антитела антисыворотки, присутствие последних приводит к резкому снижению чувствительности и специфичности большинства иммунологических тестов. Поэтому для очистки высокоаффинных

поликлональных антител к фрагментам отобранных белков из антисыворотки был использован новый, разработанный нами ранее протокол очистки антител.

Рисунок 2. Распределение констант аффинности антител в антисыворотке. 2. Получение рекомбинантных фрагментов отобранных белков.

С использованием стандартного программного обеспечения были идентифицированы наиболее иммуногенные внеклеточные участки полипептидной цепи отобранных белков, не имеющие гомологий с другими белками человека. Первоначально все отобранные фрагменты экспрессировали в рЕТ29Ь векторе. При этом была получена высокая экспрессия фрагментов кДНК, кодирующих белки СОН 17 и ЕРСАМ (Рис. 3).

1 2 3 4 5 6 7

7255 -

3628 -

17 -

Рисунок 3. Результаты Вестерн-блот анализа клеточных лизатов рекомбинантных штаммов бактерий с использованием антител к гексагистидиновой метке (вектор рЕТ29Ь, в дорожки нанесено по 0,005 ОЕ<;оо клеток Е. соН, электрофорез в 12% ПААГ, трис-глициновая система). Дорожки: 1 - лизат рекомбинантного штамма до индукции экспрессии белков 1РТО (контроль; лизат штамма после индукции нанесён в дорожку 2), 2-6 - лизаты рекомбинантных штаммов после индукции фрагментов кДНК кодирующих фрагменты белков СОН1724-п2 (2), СОН1758,-б78 (3), ТвРАШл-эт/ш-а» (4), СЕАСАМ533мбо (5), СЬОЫ346-8о (6) и ЕРСАМ24-265 (7). Слева - молекулярные массы полипептидов белкового стандарта (кДа).

Фрагменты кДНК, кодирующие белки, уровень экспрессии которых оказался низким, экспрессировали с использованием вектора рЕТ32Ь в составе гибридных белков, содержащих тиоредоксин (ТИХ, мол. масса 10 кДа) (Рис. 4).

12 3 4

7255-

3628-

17-

11 -

Рисунок 4. Результаты Вестерн-блот анализа клеточных лизатов с использованием антител к гексагистидиновой метке. Дорожки: 1 - лизат до индукции экспрессии белков IPTG. 2-4 -лизаты после индукции синтеза TSPAN83i.57/no209. СЕАСАМ5.чзц«1 и CLDN346-so. соответственно (вектор рЕТ32Ь. разделение белков электрофорезом в 12% ПААГ. трис-глициновая система, в дорожки нанесено по 0.006 ОЕб<ю клеток Е. coli). Слева указаны молекулярные массы полипептидов белкового стандарта (кДа).

Рекомбинантные белки очищали на никель-хелатирующей колонке по стандартному протоколу. Гомогенность препаратов, синтезированных в составе гибридных белков, составила более 95% (Рис. 5). Результаты экспрессии фрагментов кДНК отобранных белков приведены в Таблице 1. Полученные фрагменты использовали для иммунизации лабораторных животных, а также для очистки и отбора антител.

М 1 2 3 4 5 6

М

95 -' -

72- тт

55- •

36-

28-

Рисунок 5. Результаты электрофореза рекомбинантных фрагментов отобранных белков после очистки на никель-хелатирующей колонке (окраска гелей Кумасси). Дорожки: 1 - СОН 1724 ,32, 2 - СОШ758ь678. 3 - ТЭРАтзютпо-гю. 4 - СЕАСАМ533ибо, 5 - ЕРСАМ^ж, 6 - С1Х>ГО46-8о. Слева указаны молекулярные массы белков стандарта (кДа).

Таблица 1. Результаты экспрессии фрагментов кДНК отобранных белков.

Трансмембранный белок Синтезируемый фрагмент белка (а.о.) Уровень экспрессии (мг/литр, рЕТ2% вектор) Уровень экспрессии (мг/литр, рЕТ32Ь вектор)

СОН 17 24-132 10 мг 0

СОН17 581-678 9,5 мг 0

ТБРАШ гибрид (31-57/110-209) 0 18.5 мг

СЕАСАМ5 331 -460 0 20 мг

СТЛЖЗ 46-80 0 18 мг

ЕРСАМ 24-265 15 г 0

3. Получение высокоаффинных антител к фрагментам рекомбинантных белков.

Использовавшийся способ очистки поликлональных антител был основан на конкуренции антител разной аффинности за связывание с иммобилизованным на носителе антигеном в процессе нанесения антисыворотки (Рис. 6). Для этого нанесение антисыворотки к рекомбинантным белкам на аффинный носитель осуществляли при молярном соотношении антиген-специфичных антител к антигену не менее 50:1, что в среднем соответствует 50 мл антисывортки на 2-4 нмоль иммобилизованного антигена (Ке<Му Б.Т. е! а1. 2010). Использование ещё более высоких соотношений антитела к антигену понижает выход высокоспецифичных антител, поскольку они начинают конкурировать друг с другом. Нанесение избытка антител к иммобилизованному на носителе антигену позволяет минимизировать связывание низко- и средне-аффинных антител с антигенсвязывающим сорбентом в результате конкуренции этих антител с высоко-аффинными антителами. При снижении соотношения антител к антигену, в соответствии со стандартным протоколом, с сорбентом связываются средне- и низкоспецифичные антитела, а последующее удаление таких антител умеренно хаотропными агентами неэффективно.

Иммунная сыворотка

Иммобилизованный на носителе рекоыбинантеый белок — (примерно 1% в молях от иммунных иммуноглобулинов)

| 1М ЫС1 (промывка)

Антитела с константой 5М 1лС1 Антитела с константой аффинности менее 10®) (-шющ[я) аффинности более 10*

Рисунок 6. Схема очистки высокоаффинных антител из антисыворотки.

Ниже приводятся результаты получения высокоаффинных поликлональных антител

к белковым фрагментам СОНПамзз, СОН17581-б78 и ЕРСАМм-265- Очистка антител из антисывороток включала четыре стадии:

1. Иммобилизацию фрагмента рекомбинантного белка на ВгСЫ-сефарозе в результате взаимодействия аминогрупп антигена с активированными цианидными группами сефарозы.

2. Нанесение антисыворотки и удаление неспецифически связавшихся с носителем белков и низко- и средне-аффинных антител промывкой раствором 1М 1лС1.

3. Элюцию высокоаффинных антител сильным хаотропным агентом (5М ЫС1), позволяющим получать практически интактные ренатурированные антитела с нативной трёхмерной структурой.

4. Элюцию частично денатурированных высокоаффинных антител уксусной кислотой (1М СНяСООН) с последующей нейтрализацией кислоты и рефолдингом антител.

5. Удаление элюирующих агентов и агрегатов частично денатурированных антител гель-фильтрацией. Концентрирование препаратов антител, определение их концентрации, гомогенности, средней константы аффинности, а также предела детекции антигена и специфичности методами дот-блоттинга и Вестерн-блоттинга, соответственно.

Оценка гомогенности полученных образцов антител электрофорезом в денатурирующем полиакриламидном геле показала полное отсутствие примесных белков в обоих элюатах. полученных на стадиях 3 и 4 (Рис. 7). В отсутствие ДТТ в буфере для нанесения образцов наблюдается высокомолекулярная полоса, соответствующая по молекулярной массе интактным антителам, тогда как в присутствии ДТТ. разрушающего Б-в-мостики. наблюдаются два полипептида, соответствующие по мол. массе тяжёлой и лёгкой цепям иммуноглобулинов класса в.

Рисунок 7. Результаты разделения препаратов антител к белку СОН 1724-т электрофорезом в 10% денатурирующем полиакриламидном геле (10 мкг антител на дорожку, окраска геля Кумасси). Дорожки: I - препарат, полученный после элюции антител 5М 1лС1 (кипячение без БТТ перед нанесением на гель): 2 - препарат, полученный после элюции антител \М СНЗСООН (без ОТТ): 3 - препарат 1, обработанный ДТТ. Слева приведены молекулярные массы белков стандарта (кДа).

Результаты определения константы аффинности антител по методу Фриге (Friguet В. е1 а1 1985) показали, что средняя аффинность антител обеих фракций находится в диапазоне 108-10ю л/моль, а суммарный выход (в обеих фракциях) составляет 50-70 мкг на 50 мл

антисыворотки. При этом аффинность антител антисыворотки составляет 1-2x107 л/моль, а коммерческих антител - 3x10 л/моль соответственно (Таблица 2).

Таблица 2. Характеристики полученных антител.

Антиген Ка (л/моль) ПДА*

CDH 1724-132 10" 1

CDH 17581-678 10х 10

ЕРСАМ24-265 5x10" 0,1

*- предел детекции антигена (фемтомоль) по результатам дот-блотгинга.

Оценка специфичности полученных антител по результатам Вестерн-блот анализа показала, что каждое из трёх антител выявляет только полосу ожидаемого размера (Рис. 8).

В

1 2

130-

95-Ф*

725536281711 -

Рисунок 8. Результаты Вестерн-блот анализа содержания белков EPCAM24-26S (A). CDH1724-132 (Б) и CDH17581-618 (В) в тотальных белковых экстрактах опухолевых и нормальных тканей толстой кишки (дорожки 1 и 2. соответственно). Слева указаны молекулярные массы белков стандарта (кДа).

4. Получение моноклональных антител.

Для получения моноклональных антител использовали фрагменты белков CDH17, TSPAN8. СЕАСАМ5 и CLDN3. экспрессированные в векторе рЕТ32Ь в составе гибридных белков с тиоредоксином (в сотрудничестве с Всесоюзным научным центром медицинской диагностики и лечения). Антитела получали по стандартному протоколу. Дот-блот анализ полученных антител показал, что высокоаффинные антитела удалось получить только к двум фрагментам кадгерина. При этом предел детекции антигена обоими антителами составил 10 пикограмм; оба антитела выявляли только одну полосу ожидаемого размера при Вестерн-блоттинге. Свойства полученных моно- и поликлональных антител суммированы в Таблице 3. Для дальнейших экспериментов по разработке высокочувствительного метода иммуно-ПЦР были использованы поликлональные антитела к фрагменту белка CDH1724-i32 и коктейль моноклональных антител к фрагменту белка CDH1758i.678.

1 2

13095725536 * 281711 -

1307255362817-II -

Таблица 3. Свойства полученных моно- и поликлональных антител.

Антиген Фрагмент Моноклональные антитела Поликлональные антитела

Предел чувствительности (моль) Вестерн-блот анализ на тканях Предел чувствительности (моль) Вестерн-блот анализ на тканях

ЕрСАМ 24-265 а.о. - 0.1 фемтомоль Единственный полипептид ожидаемого размера

CDH17 24-132 а.о. 10 фемтомоль Единственный полипептид ожидаемого размера 1 фемтомоль Единственный полипептид ожидаемого размера

581-678 а.о. 0,1 фемтомоль антитела каждого клона Единственный полипептид ожидаемого размера 10 фемтомоль Единственный полипептид ожидаемого размера

5. Разработка нового формата иммуно-ПЦР для обнаружения рака толстой кишки.

5.1. Очистка экзосом из образцов сыворотки крови. Для разработки эффективного протокола очистки экзосом был проведен сравнительный анализ двух способов обработки сыворотки:

1. Удаление мультивезикулярных частиц (МВЧ. размер 0.2-1 мкм) центрифугированием

при 12 тыс. g. с последующим осаждением экзосом из супернатанта ультрацентрифугированием при 100 тыс. g.

2. Добавление в образец сыворотки препарата ExoQuick (компания System Biosciences) с

последующей преципитацией экзосом и МВЧ низкоскоростным центрифугированием (1.5 тыс. g, 30 мин.).

Разделение белков обоих препаратов в денатурирующем полиакриламидном геле показало, что оба препарата в основном содержат мажорные белки сыворотки: сывороточный альбумин и иммуноглобулины (Рис. 9А). При этом суммарное количество белка в препарате, полученном с использованием препарата ExoQuick. оказалось в два раза больше, чем в препарате, полученном в результате ультрацентрифугирования, поэтому в дальнейших экспериментах использовался последний метод.

Вестерн-блот анализ полученных препаратов показал, что поли- и моноклональные антитела к фрагментам белка CDH17 выявляют немного деградированный полипептид ожидаемого размера (Рис. 9Б и 9Г), тогда как поликлональные антитела к белку ЕрСАМ связывались с полипептидом, размер которого был в три раза меньше ожидаемого (Рис. 9 В), хотя в тотальных белковых экстрактах опухолевых и нормальных тканей толстой кишки эти антитела выявляли полипептид ожидаемого размера (Рис. 8А). Анализ литературных данных показал, что заметное укорочение белка ЕрСАМ в препаратах экзосом может быть результатом отщепления его внеклеточного участка (эктодомена) металлопептидазами сыворотки крови (Rupp А.К. et al, 2011). Такое объяснение подтверждается тем. что согласно базе данных ExoCarta в сывороточных экзосомах онкопациентов с диагнозом рак толстой кишки белок ЕрСАМ не содержится. Таким образом, в отличие от антител к белку CDH17, антитела к белку ЕрСАМ не могут использоваться для иммуно-ПЦР препаратов сывороточных экзосом.

Рисунок 9. Результаты анализа препаратов экзосом с использованием полученных антител (в дорожки нанесены белки препаратов, осажденных из 0.5 мл сыворотки).

А. Результаты электрофореза препаратов экзосом в полиакриламидном геле (окраска геля Кумасси). Дорожки: М - белковый стандарт. 1 - препарат, полученный после ультрацентрифугирования. 2 - препарат, полученный с использованием препарата Ехо<Зшск. 3 - образец исходной сыворотки крови (1 мкл).

Б и В. Результаты Вестерн-блот анализа препаратов экзосом. полученных с использованием антител к белковым фрагментам СОН17г4-132 и ЕРСАМ24-265, соответственно. Дорожки -аналогично А.

Г. Результаты Вестерн-блот анализа препаратов экзосом. полученных с использованием препарата Ехо(2шск с последующей инкубацией мембраны с коктейлем моноклональных антител к фрагменту белка СОН 17581-678- Дорожки: 1—4 - образцы сыворотки здоровых доноров, 5—8 - сыворотки пациентов с диагнозом рак толстой кишки.

5.2. Обнаружение рака толстой кишки на основе анализа белков опухолевых экзосом сыворотки крови. Для увеличения чувствительности определения белковых маркеров был разработан новый формат иммуно-ПЦР. основанный на анализе белкового состава сывороточных экзосом. Протокол включает следующие стадии (Рис. 10):

1. Синтез бинарного конъюгата детектирующих антител и ДНК-репортера с магнитными микрошариками.

2. Связывание экзосом, осажденных из образца сыворотки крови, с иммобилизованными на нитроцеллюлозной мембране захватывающими антителами.

3. Образование и отмывка сэндвич-комплекса.

4. Удлинение и амплификация ДНК-репортера и детекция ПЦР-продукта.

Основной принцип формата состоит в сборке сэндвич-комплекса на нитроцеллюлозной мембране, что упрощает процедуру его отмывки и понижает влияние неспецифического связывания конъюгата с поверхностью пробирки (фон), поскольку мембрана легко переносится в новую пробирку.

А

Рисунок 10. Схема процедур, входящих в разработанный метод иммуно-ПЦР. А. Синтез бинарного конъюгата. Б. Захват опухолевых экзосом антителами, иммобилизованными на нитроцеллюлозной мембране. В. Сборка сэндвич-комплекса. Г. Амплификация ДНК-репортера.

5.2.1. Синтез бинарного конъюгата детектирующих антител и ДНК-репортера с магнитными микрошариками. При разработке формата в протокол были введены дополнительные технические усовершенствования, позволяющие упростить и ускорить проведение процедур и повысить чувствительность и специфичность теста. На первой стадии был разработан новый метод одновременной конъюгации детектирующих антител и одноцепочечного ДНК-репортера (длина 48 осн.) с активированной поверхностью микрошариков. В качестве детектирующих антител для конъюгации с микрошариками использовался коктейль из трех моноклональных антител к фрагменту белка CDH17sgi^78 (предел детекции антигена - 0.1 фемтомоль). Конъюгация осуществлялась в результате присоединения окисленных периодатом олигосахаридных остатков антител и глицерильной группы ДНК-репортера (введённой на З'-конец в процессе химического синтеза) к гидразидным группам микрошариков. Такая схема позволяет предотвратить заметное понижение аффинности антител, происходящее в стандартных протоколах, основанных на модификации аминокислотных остатков антител, а также конъюгировать антитела в оптимальной ориентации. Хотя такой способ конъюгации давно разработан компанией BioRad (Affi-Gel Hz Hydrazide Gel), в базе данных PubMed нет статей, описывающих его использование для проведения иммуно-ПЦР.

Выход бинарного конъюгата оценивали по результатам гель-электрофореза конъюгата в ПААГ (для оценки количества присоединившихся антител) и по результатам электрофореза продуктов ПЦР в агарозном геле (для оценки присоединившегося ДНК-репортера). При этом для улучшения качества гель-электрофореграмм при анализе продукта ПЦР перед началом амплификации проводилось удлинение ДНК-репортера по схеме, приведённой на Рисунке 11. Результаты оценки показали, что эффективность конъюгации антител и ДНК-репортера с микрошариками составляет более 95%.

ДНК-репортер JW (48 осп.)

пряймер RW (48 осн.)

3'-5'

Удлиненный ДНК-репортер (72 и.о.)

пряймер RJ (48 осн.)

Удлиненный ДНК-репортер (96 п.о.)

Гомоираймср I R (24 осн.)

НЦР

Рисунок 11. Схема удлинения ДНК-репортера перед ПЦР (последовательность гомопраймера выделена жирным шрифтом).

5.2.2. Оценка предела детекции антигена в модельном эксперименте. Предел детекции антигена, достигаемого при использовании протокола, оценивали по результатам модельного эксперимента, основанного на модифицированном методе дот-блот анализа. Для этого, разведения С-концевого фрагмента белка СЭН17 (СОН 17581-678) иммобилизовали на двух мембранах, которые инкубировали с бинарным конъюгатом (Рис. 12). Одну мембрану разрезали на фрагменты, которые помещали в пробирки с ПЦР-смесью, а затем, после амплификации ДНК-репортера, анализировали количество ПЦР-продукта в агарозном геле (рис. 12А). Вторую мембрану инкубировали с коктейлем неконъюгированных моноклонапьных антител; связавшиеся первичные антитела детектировали с использованием конъюгата вторичных антител с пероксидазой хрена (рис. 12Б). Модельный эксперимент показал, что предел детекции антигена составляет 10 амоль фрагмента белка и превышает чувствительность стандартного дот-блотинга в десять раз. Сравнимый предел детекции антигена с использованием иммунологических методов ранее был достигнут лишь в двух работах, посвященных детекции раковоэмбрионапьного антигена в образцах сыворотки крови и бета-амилоида в нейронах при болезни Альцгеймера.

А

(ШШк _

Ш •

V ♦ •

Рисунок 12. Сравнительный анализ чувствительности иммуно-ПЦР и дот-блоттинга. А. Результат гель-электрофореза ПЦР-продуктов в агарозном геле. Б. Результат дот-блоттинга с использованием конъюгата вторичных антител: верхняя полоса - обработка мембраны бинарным конъюгатом, нижняя - первичными антителами к фрагменту белка СОН17581 -678*

Дорожки: 1 - 1 фмоль фрагмента белка СОН17581-678, 2-5 - 100, 30, 10 и 3 амоля фрагмента; 6 -буфер без фрагмента белка (контроль).

5.2.3. Иммуно-ПЦР сывороточных экзосом. Разработанный протокол был применен для сравнительного анализа содержания белка СОН 17 в составе экзосом сыворотки крови здоровых доноров и больных аденокарциномой толстой кишки. На первой стадии эксперимента, на нитроцеллюлозной мембране иммобилизовали захватывающие поликлональные антитела к фрагменту СОН1724-132 (предел детекции антигена - 1 фемтамоль). Затем фрагмент мембраны с антителами инкубировали с препаратом экзосом и отмывали мембрану буфером для отмывки. Такой подход позволяет аффинно очистить опухолевые экзосомы, удалив нормальные экзосомы сыворотки и сывороточные белки. После отмывки фрагменты мембраны переносили в новую пробирку, инкубировали с суспензией бинарного конъюгата, отмывали буфером и проводили амплификацию ДНК-репортера и электрофорез ПЦР-продукта. Результаты эксперимента, приведенные на Рис. 13,

показали, что при иммуно-ПЦР анализе препаратов сывороточных экзосом онкопациентов образуется ПЦР-продукт, соответствующий по подвижности амплифицированному ДНК-репортеру (96 п.н.), тогда как при анализе препаратов экзосом здоровых доноров интенсивность полосы значительно меньше. Результат объясняется резким увеличением секреции экзосом в кровоток опухолями толстой кишки по сравнению с нормальным эпителием. Таким образом, результаты эксперимента показали эффективность разработанного протокола иммуно-ПЦР для обнаружения опухолей толстой кишки.

М 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 1718 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30

т 3 4 3 3 3 3 3 4 4 4 3 3 4 4 4 3 3 4 3 4

N 0 0 X 2 2 1 0 0 0 0 0 0 0 1 2 0 1 1 X 0

М 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0

Рисунок 13. Результаты иммуно-ПЦР препаратов сывороточных экзосом, полученных из 100 мкл сыворотки. Дорожки: 1-7 - препараты из образцов сыворотки крови здоровых доноров, 8-27 - из образцов больных раком толстой кишки, 28 - опыт с образцом 27 без использования захватывающих антител; 29 - без добавления сыворотки; 30 - амплификация ПЦР-смеси без предварительных процедур. Внизу приведена классификация опухолей онкопациентов доноров образцов крови, слева — длина основных фрагментов ДНК-стандарта (п.о.).

Чувствительность и специфичность разработанного протокола обнаружения опухолей толстой кишки сравнивали с аналогичными параметрами разработанного нами ранее метода, основанного на Вестерн-блоттинге иммунопреципитатов кишечного альфа-дефензина 5 ОЕБАб (Никитина И.Г. и др., 2013). Количество этого белка, синтезируемого исключительно клетками Панета кишечных крипт, резко возрастает в сыворотке крови онкопациентов в результате его массовой секреции в кровоток аденокарциномами толстой кишки. При использовании этого метода процессированная пептидазами сыворотки форма белка обнаруживалась лишь в двух из пяти образцов сыворотки онкопациентов (объем образца сыворотки 4 мл; работа выполнена совместно с Букуровой Ю.А.). Таким образом, разработанный в настоящей работе иммуно-ПЦР протокол обнаружения опухолей толстой кишки гораздо более воспроизводим и чувствителен, чем метод, основанный на анализе содержания ОЕРА5, поскольку сильный сигнал наблюдался при анализе всех 20 препаратов экзосом онкопациентов при использовании в 40 раз меньшего количества образца.

выводы

1. Разработан алгоритм биоинформатического поиска мембранных белков, секретируемых в кровоток в составе опухолевых экзосом. С использованием алгоритма отобраны для последующего анализа белки ММР14, СЬБШ, СОН17, ЕРСАМ, СЕАСАМ5 и Т8РАЫ8. Получены гомогенные препараты внеклеточных фрагментов отобранных белков.

2. Получены моно- и поликлональные антитела к отобранным фрагментам. Показано, что наиболее специфичными и высокоаффинными оказались антитела к фрагментам белка кадгерина 17: поликлональные антитела к фрагменту СОН 1724.132 и моноклональные антитела к фрагменту СВН17581-б78-

3. Разработан высокочувствительный протокол иммуно-ПЦР для обнаружения рака толстой кишки, основанный на анализе присутствия в образцах сыворотки крови опухолевых экзосом, содержащих белок кадгерин 17. Протокол включает новый метод конъюгации детектирующих моноклонапьных антител и ДНК-репортера и новую модификацию метода аффинной очистки опухолевых экзосом с использованием иммобилизованных на мембране захватывающих антител.

4. Показано, что использование формата позволяет надёжно различать образцы сыворотки крови здоровых доноров и пациентов с диагнозом рак толстой кишки. Продемонстрировано, что разработанный протокол гораздо более воспроизводим и чувствителен, чем метод, основанный на Вестерн-блот анализе иммунопреципитатов альфа-дефензина 5.

Сппсок работ, опубликованных по теме диссертации

1. Букурова Ю.А., Никитина И.Г., Ханкин С.Л., Краснов Г.С., Лисицын H.A., Карпов В.Л., Берестень С.Ф. 2011. Поиск белковых маркеров для сывороточной диагностики рака на основе анализа профилей экспрессии микроРНК. Молекуляр. биология. 45, 376-81.

2. Lisitsyn N.A., Bukurova Yu.A., Krasnov G.S., Nikitina I.G., Karpov V.L., Beresten S.F. 2011. Enteric alpha defensins in norm and pathology. 2012. Annals of Clinical Microbiology and Antimicrobials, BioMed, 11:1.

3. Никитина Н.Г., Букурова Ю.А., Краснов Г.С., Гринева E.H., Карпов В.Л., Лисицын Н.А, Берестень С.Ф. 2012. Структура и функция кишечных дефензинов человека и мыши. Молекуляр. биология. 46, 31-36.

4. Никитина И.Г., Букурова Ю.А., Краснов Г.С., Гринева E.H., Карпов В.Л., Лисицын H.A., Берестень С.Ф. 2012. Новая конструкция ДНК-репортера для иммуно-ПЦР. Молекуляр. биология. 46, 594-97.

5. Букурова Ю.А., Краснов Г.С., Никитина И.Г., Карпов В.Л., Лисицын H.A., Берестень С.Ф. 2013. Методы поиска маркеров для сывороточной диагностики опухолей. Молекуляр. биология. 47, 3-11.

6. Никитина И.Г., Букурова Ю.А., Ханкин С.Л., Карпов В.Л., Лисицын H.A., Берестень С.Ф. 2013. Кишечный альфа-дефензин 5 секретируется в кровоток опухолями толстой кишки. Молекуляр. биология. 47, 133-136.

7. Никитина И.Г., Сабирова Е.Ю., Карпов В.Л., Лисицын H.A., Берестень С.Ф. 2013. Роль экзосом и микровезикул в процессе канцерогенеза. Молекуляр. биология. 47, 767-73.

8. Никитина И.Г., Сабирова Е.Ю., Солопова О.Н, Суржиков С.А., Гринева E.H., Карпов В.Л., Лисицын H.A., Берестень С.Ф. 2014. Новый формат иммуно-ПЦР для сывороточной диагностики рака толстой кишки. Молекуляр. биология. 48, 117-23.

Подписано в печать 05.05.2014г.

Усл.п.л. -1.0 Заказ № 20638 Тираж: 100 экз.

Копицентр «ЧЕРТЕЖ.ру» ИНН 7701723201 107023, Москва, ул.Б.Семеновская 11, стр.12 (495) 542-7389 www.chertez.ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Никитина, Инна Геннадьевна, Москва

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук

04201458116

На правах рукописи

Никитина Инна Геннадьевна

ОБНАРУЖЕНИЕ ОПУХОЛЕЙ НА ОСНОВЕ ИДЕНТИФИКАЦИИ ЭКЗОСОМАЛЬНЫХ БЕЛКОВ В СЫВОРОТКЕ КРОВИ

Специальность - 03.01.03 - молекулярная биология

Диссертация

на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: д.б.н., профессор Берестень С.Ф.

Москва, 2014

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.............................................................6

ВВЕДЕНИЕ....................................................................................8

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ...................................................11

1.1. Роль экзосом в процессе канцерогенеза.......................................11

1.1.1. Общая характеристика эукариотических микропузырьков.............11

1.1.2. Роль экзосом в процессах опухолевой

прогрессии и метастазирования.............................................13

1.1.3. Подавление систем наследственного

и приобретенного иммунитета...............................................18

1.1.4. Активация процессов васкуляризации и ангиогенеза...................19

1.1.5. Анализ протеома опухолевых экзосом.....................................21

1.2. Методы иммуноанализа белков................................................24

1.2.1. Общий обзор.....................................................................24

1.2.2. Радиоиммуноанализ (РИА)...................................................29

1.2.3. Иммуно-ферментный анализ (ИФА).......................................30

1.2.4. Иммуно-ПЦР......................................................................33

1.2.5. Электрохимический анализ...................................................37

1.2.6. Коиммунопреципитация хроматина (СЫР)................................38

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ..................41

2.1. Антисыворотки......................................................................41

2.2. Коммерческие антитела и их конъюгаты.....................................42

2.3. Коллекция образцов................................................................42

2.4. Биоинформатический поиск мембранных белков эпителия толстой кишки, секретируемых в кровоток в составе опухолевых экзосом и

микровезикул......................................................................43

2.5. Экстракция белков.................................................................44

2.6. Электрофорез белков в ПААГ..................................................44

2.6.1. Трис-глициновая система......................................................44

2.6.2. Трис-трициновая система......................................................44

2.7. Окрашивание гелей................................................................45

2.7.1.Окрашивание гелей Кумасси..................................................45

2.7.2.0крашивание гелей солями серебра.........................................45

2.8. Вестерн-блот анализ................................................................46

2.9. Дот-блот анализ...................................................................46

2.10. Разделение продуктов ПЦР.................................................47

2.11. Выделение сывороточных экзосом........................................47

2.11.1. Выделение экзосом ультрацентрифугированием.......................47

2.11.2.Выделение экзосом с использованием препарата Exoquick..........47

2.12. Иммунопреципитация............................................................48

2.12.1.Иммунопреципитация дефензина 5 из образцов

сыворотки крови.........................................................................48

2.12.2.Иммунопреципитация экзосом из образцов сыворотки крови........48

1

2.13. Получение рекомбинантных фрагментов белков.........................48

2.14. Масс-спектрометрический анализ...........................................49

3

2.15. Получение моноклональных антител.......................................50

2.16. Очистка моноклональных антител..........................................51

2.17. Получение высокоаффинных поликлональных антител.............52

2.18. Очистка поликлональных антител..........................................52

2.19. Иммуно-ПЦР.......................................................................53

2.19.1. Синтез праймеров..............................................................53

2.19.2.Конъюгация антител и ДНК-репортера с

магнитными микрошариками.........................................................54

2.19.3. Иммуно-ПЦР в прямом формате...........................................54

2.19.4. Иммуно-ПЦР в сэндвич формате...........................................55

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ....................................57

3.1. Сбор коллекции образцов.........................................................57

3.2. Биоинформатический поиск мембранных белков эпителия толстой кишки, секретируемых в кровоток в составе опухолевых экзосом...............................................................................57

3.3. Получение рекомбинантных фрагментов отобранных белков.......61

3.4. Получение высокоаффинных поликлональных антител к фрагментам рекомбинантных белков.......................................64

3.5. Получение моноклональных антител........................................70

3.6. Разработка нового формата иммуно-ПЦР для обнаружения рака толстой кишки......................................................................72

3.6.1. Очистка экзосом из образцов сыворотки крови...........................72

3.6.2. Обнаружение рака толстой кишки на основе анализа белков

опухолевых экзосом сыворотки крови.....................................75

3.6.2.1.Синтез бинарного конъюгата детектирующих антител и ДНК-репортера с магнитными микрошариками..............................78

3.6.2.2. Амплификация ДНК-репортера............................................78

3.6.2.3.Оценка чувствительности протокола в модельном эксперименте...................................................................79

3.6.2.4. Иммуно-ПЦР сывороточных экзосом.....................................80

ВЫВОДЫ...................................................................................84

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.............................................................85

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

DTT (dithiothreitol) - дитиотреитол

EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) - этилендиаминтетрауксусная кислота

FPLC (fast performance liquid chromatography) - высокоэффективная

жидкостная хроматография

IP (immunoprecipitation) - иммунопреципитация

IPTG (isopropyl P-D-l-thiogalactopyranoside) - изопропил-p-D-1 -

тиогалактопиранозид

MALDI-TOF-MS (matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass

spectrometry) - матрично-активированная лазерная десорбция/ионизация

времяпролетная масс-спектрометрия

PBS (phosphate buffered saline) - фосфатный буфер

PC (Paneth cells) - клетки Панета

PSA (ammonium persulfate) - персульфат аммония

SDS (sodium dodecyl sulfate) - додецилсульфат натрия

TEMED (tetramethylethylenediamine) - тетраметилэтилендиамин

a.o. - аминокислотный остаток

БД - база данных

ПААГ - полиакриламидный гель

т.п.о. - тысяча пар оснований

РТК - рак толстой кишки

РНК - рибонуклеиновая кислота

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

ПЦР - полимеразная цепная реакция

TGF-P (transforming growth factor (3) - трансформирующий фактор роста бета

АСТА2 - а-актин 2

FGF2 (fibroblast growth factor 2) - фактор роста фибробластов 2

ATP (adenosine triphosphate) - аденозинтрифосфат

6

VEGF (vascular endothelial growth factor) - фактор роста сосудистого эндотелия

ANGPTL (angiopoietin-like protein) - ангиопоэтин-подобный белок HB-EGF (heparin-binding epidermal growth factor) - гепарин-связывающий фактор роста эпидермиса DEFA (defensin) - дефензин

EpCAM (epithelial cell adhesion molecule) - молекула эпителиальной

клеточной адгезии

CDH17 (cadherin 17) - кадгерин 17

СЕАСАМ 5 (carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 5) -раково-эмбриональный антиген

MMP14 (matrix metallopeptidase 14, membrane-inserted) - металлопептидаза матрикса 14

PCNA (proliferating cell nuclear antigen) - ядерный антиген пролиферирующих клеток

ИФА - иммуно-ферментный анализ

СТА - стрептавидин

ILPCR - иммуно-липосомный ПЦР-тест

ChIP - коиммунопреципитация хроматина

ChlP-seq - коиммунопреципитация хроматина с последующим

секвенированием

ChIP-on-Chip - коиммунопреципитация хроматина с последующей гибридизацией к микрочипам

ВВЕДЕНИЕ

Одной из актуальных проблем современной молекулярной биологии является разработка новых способов молекулярной диагностики заболеваний, одним из наиболее распространённых типов которых является рак толстой кишки (РТК). Современные методы сывороточной диагностики рака основаны на количественном анализе содержания проникающих в кровоток биомаркеров (белков, ДНК и некодирующих РНК), содержание которых заметно возрастает в сыворотке крови при развитии опухоли. Однако идентифицированные до настоящего времени потенциальные белковые маркеры РТК пока недостаточно надежны, а имеющиеся методы их детекции недостаточно чувствительны для диагностики рака в образцах сыворотки крови населения из групп повышенного риска [1]. На протяжении многих лет прилагались значительные усилия для разработки клинических тестов для диагностики, прогнозирования и послеоперационного мониторинга повторного роста опухолей толстой кишки и их метастазирования. Тем не менее, разработанные тесты почти не используются в клинической практике вследствие их низкой чувствительности и специфичности.

Одним из наиболее перспективных подходов к созданию клинических тестов для диагностики и прогнозирования заболеваний является анализ молекулярного состава опухолевых экзосом. Экзосомы (т.е. покрытые липидной мембраной микропузырьки) экспортируются в кровоток большинством типов клеток в процессе межклеточной коммуникации [2, 3]. Молекулярный состав и количество экзосом заметно изменяются при возникновении целого ряда заболеваний. Многочисленные исследования показали, что количество экзосом в крови (в норме составляющее 100-400 миллионов частиц на мл) резко возрастает в процессе канцерогенеза. На последних стадиях развития опухолей различных типов (в отсутствие

метастазирования) количество опухолевых экзосом может составлять до 30% от общего количества экзосом сыворотки крови [4].

Поскольку количество опухолевых экзосом в кровотоке и некоторых других биологических жидкостях (лимфе, слюне, моче, молоке, желчи и.т.д.) резко увеличивается в процессе злокачественной трансформации, вследствие их массового экспорта раковыми клетками, анализ биомаркеров экзосом открывает возможность эффективной диагностики раковых заболеваний [5]. Анализ биомаркеров опухолевых экзосом, циркулирующих в кровотоке, обладает рядом преимуществ по сравнению с традиционными методами детекции биомаркеров сыворотки. Поскольку опухолевые экзосомы формируются из эндоплазматической мембраны клетки [6], репертуар имеющихся на их поверхности мембранных белков хорошо коррелирует с репертуаром мембранных белков экспортирующих их опухолевых клеток. Это открывает возможность очистки опухолевых экзосом из биологического образца с использованием иммуно-аффинной хроматографии. Аффинная очистка опухолевых экзосом с использованием иммобилизованных антител к опухолеспецифичным или тканеспецифичньш поверхностным белкам позволяет полностью удалить компоненты сыворотки (или другой биологической жидкости), а также нормальные экзосомы неопухолевой природы и тем самым резко повысить специфичность диагностического теста. Дополнительным преимуществом анализа экзосом является то, что число копий индивидуального белка в их мембране обычно весьма велико. В результате, вследствие амплификации сигнала, тесты, основанные на детекции присутствия индивидуального белка или другого биомаркера в препарате опухолевых экзосом, аффинно очищенных из сыворотки, заметно более чувствительны, чем при использовании традиционных методов иммуноанализа.

Детекция тканеспецифичных или опухолеспецифичных биомаркеров

опухолевых экзосом открывает возможность диагностики рака. При этом в

качестве диагностических маркеров могут использоваться белки и мРНК

9

экзосом [7, 8], а также некодирующие РНК, т.е. микроРНК [9] и пока почти не используемые в диагностике длинные некодирующие РНК [5]. Полученные в последние годы результаты показывают, что анализ состава сывороточных экзосом позволяет заметно увеличить чувствительность методов диагностики, прогнозирования и послеоперационного мониторинга различных видов опухолей, а также к расширению арсенала методов персонализированной медицины.

Основной целью данной работы являлась разработка нового способа обнаружения опухолей толстой кишки, основанного на сывороточной детекции белков опухолевых экзосом с использованием иммуно-ПЦР. Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Сбор коллекции образцов нормальных и опухолевых тканей толстой кишки, а также сывороток здоровых доноров и сывороток крови пациентов с диагнозом аденокарцинома толстой кишки.

2. Биоинформатический поиск мембранных белков эпителия толстой кишки, секретируемых в кровоток в составе опухолевых экзосом и микровезикул.

3. Получение высокоаффинных антител к идентифицированным белкам.

4. Разработка новой модификации метода очистки опухолевых экзосом из образцов сыворотки пациентов с диагнозом аденокарцинома толстой кишки.

5. Разработка нового формата иммуно-ПЦР, основанного на использовании бинарных конъюгатов ДНК-репортера и антител к активированной поверхности микрошариков. Определение предела чувствительности детекции нового формата в модельном эксперименте.

6. Сравнительный анализ содержания идентифицированных в п. 2 мембранных белков в составе опухолевых экзосом, аффинно очищенных из сыворотки крови пациентов с диагнозом рак толстой кишки и здоровых доноров, с использованием нового формата иммуно-ПЦР.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. РОЛЬ ЭКЗОСОМ В ПРОЦЕССЕ КАНЦЕРОГЕНЕЗА

1.1.1. Общая характеристика эукариотических микропузырьков.

Значительное повышение чувствительности и специфичности

иммуноанализа может быть достигнуто в результате предварительного

удаления из образца большинства посторонних белков. Одним из наиболее

часто используемых методов такого рода является аффинная очистка из

образцов биологических жидкостей экзосом, т.е. покрытых мембраной

микропузырьков секретируемых в окружающее пространство

прокариотическими и эукариотическим клетками в процессе межклеточной

коммуникации [2, 3]. Первоначально секретируемые во внеклеточный

матрикс, микропузырьки в дальнейшем попадают в кровь, лимфу и другие

биологические жидкости и переносятся на значительное расстояние от

клетки-донора. Слияние микропузырьков с клеткой-реципиентом приводит к

проникновению в ее цитоплазму белков, липидов, мРНК, а также

некодирующих РНК клетки-донора, что приводит к

«перепрограммированию» клетки-реципиента [10]. Этим действие

микропузырьков не ограничивается, поскольку содержащиеся в них

металлопептидазы участвуют в деградации внеклеточного матрикса при

перестройке и регенерации тканей [11]. Многолетние исследования показали,

что микропузырьки играют важную роль в функционировании

приобретённого иммунитета [12, 13], воспалительных процессах [14. 15] и

эмбриогенезе [16]. В норме уровень секреции микропузырьков и их состав

меняются в ответ на различные стимулы, например, при изменении

концентрации кальция в клетках крови [17], деполяризации нейронов [18], а

также сразу после потери клетками способности к адгезии к поверхности

чашки Петри в процессе культивирования [19]. Кроме того, уровень секреции

и состав микропузырьков заметно изменяются при целом ряде патологий [20,

И

21]. Выявление тканеспецифичных маркеров микропузырьков, секретируемых в кровоток пораженными клетками, может найти применение в клинической практике для диагностики и мониторинга целого ряда заболеваний, включая вирусные инфекции [22], нейродегенеративные и сердечнососудистые заболевания [23, 24], болезни печени и почек [25], а также различных видов рака [26].

Эукариотические микропузырьки подразделяются на экзосомы (диаметром 40-100 нм), более крупные микровезикулы (100-1000 нм) и апоптотические тельца (1-5 мкм) [27, 28]. Наиболее изученным классом микропузырьков являются экзосомы, которые образуются из интралюминальных мультивезикулярных частиц, в свою очередь формирующихся в результате отпочкования частей мембраны поздних эндосом. В процессе отпочкования мембраны происходит захват мембранных, цитоплазматических и ядерных белков клетки, а также цитоплазматических мРНК, микроРНК и длинных некодирующих РНК, содержащихся в эндосомах.

Возникает вопрос, каким образом клетка-реципиент узнает микропузырьки,

адресованные ей клеткой-донором для последующего слияния?

Исследования последних лет показали, что в процессе узнавания участвуют

трансмембранные рецепторы межклеточной адгезии, относящиеся к

семействам интегринов, кадгеринов и селектинов [29]. При этом

взаимодействующие друг с другом рецепторы, расположенные на

поверхности микропузырька и клетки-реципиента, не только принадлежат к

одному и тому же семейству, но и имеют одинаковую первичную структуру.

Таким образом, процесс узнавания микропузырьков, адресованных клеткой-

реципиентом, основан на образовании димеров или олигомеров идентичных

молекул (так называемом гомофильном связывании). На следующей стадии

происходит слияние микропузырька с клеткой-реципиентом и частичное

перепрограммирование ее метаболизма [30], обусловленное действием трёх

процессов: 1) прямого влияния содержащихся в микропузырьках молекул

белков, а также транслируемых в белки мРНК [31, 32]; 2) регуляции уровня

12

трансляции клеточных мРНК экзосомальными микроРНК [10]; 3) эпигенетических изменений структуры и функции хроматина в ядре клетки-реципиента содержащимися в экзосомах ядерными белками и длинными некодирующими РНК [33].

1.1.2. Роль экзосом в процессах опухолевой прогрессии и метастазирования. Радикальное повышение уровня секреции опухолевых экзосом происходит при возникновении рака. При этом опухолевые экзосомы приобретают способность к связыванию и перепрограммированию трех основных типов клеток-ре�