Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Поиск и идентификация потенциальные биомаркеров рака яичников в сыворотке крови человека

ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Поиск и идентификация потенциальные биомаркеров рака яичников в сыворотке крови человека"

На правах рукописи

Арапиди Георгий Павлович

ПОИСК И ИДЕНТИФИКАЦИЯ ПОТЕНЦИАЛЬНЫХ БИОМАРКЕРОВ РАКА ЯИЧНИКОВ В СЫВОРОТКЕ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА

03.01.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени 21 ОКТ 2015

кандидата биологических наук

МОСКВА-2015

005563641

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.Л. Овчинникова Российской академии наук (ИБХ РАН)

Научный руководитель:

кандидат химических наук Зиганшин Рустам Хусманович

Официальные оппоненты:

Доненко Федор Витальевич

доктор медицинских наук, Федеральное государственное бюджетное учреждение «Российский онкологический научный центр им. Н. Н. Блохина» Министерства здравоохранения Российской Федерации, ведущий научный сотрудник

Копылов Артур Тигранович

кандидат биологических наук, Федеральное государственное бюджетное научное учреждении «Научно-

исследовательский институт биомедицинской химии имени В.Н. Ореховича», научный сотрудник

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Московский государственный университет имени М.ВЛомоносова», Биологический факультет

Защита состоится 10 декабря 2015 года в 13 часов на заседании диссертационного совета Д 001.010.01 в Федеральном государственном бюджетном научном учреждении «Научно-исследовательский институт биомедицинской химии имени В.Н. Ореховича» по адресу: 119121 Москва, улица Погодинская, дом 10, стр.8.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИБМХ и на сайте www.ibmc.iTisk.ru

Автореферат разослан « Я » октября 2015 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат химических наук

Карпова Е. А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы исследования. Рак яичников занимает седьмое место по заболеваемости и шестое место в списке причин смертности среди онкологических заболеваний в России. Рак яичников называют «тихим убийцей», поскольку на ранних стадиях он протекает бессимптомно. Клинически у многих больных первые проявления рака яичников связаны с распространением опухоли за пределы яичника, а иногда и за пределы малого таза. По данным Противоракового Общество России среди всех диагностированных случаев рака яичников в 2002 году 64,2% составили III-IV стадии. По данным Международной Федерации Акушерства и Гинекологии (FIGO) 5-летняя выживаемость среди пациентов, получивших лечение по поводу рака яичников I стадии, составляет 70%, II стадии - 46%, Ш стадии - 20%, а при IV стадии этот показатель снижается до 5%. На сегодняшний день злокачественную опухоль яичников на I-II стадии удается обнаружить либо при проведении периодического осмотра (к примеру, при генетической предрасположенности к раку яичников или при обнаружении доброкачественной опухоли в яичниках), либо случайно, при осмотре на какое-то другое заболевание органов брюшины, при операции в области малого таза. Поиск новых методов диагностики является важным направлением в современной онкологии.

Несмотря на высокую смертность, рак яичников достаточно редкое заболевание с частотой встречаемости около 40 случаев на 100 тысяч. Поэтому, помимо чувствительности диагностики, необходимо контролировать её специфичность, чтобы травмы или смерть, связанные с хирургическим вмешательством, в случае неверно диагностированного рака, не перекрывали случаи успешной диагностики и своевременного лечения. Большинство клиницистов высказывают мнение, что на каждый случай правильно диагностированного рака яичников допустимо ошибочно выносить подобный диагноз не более чем в 9 случаях. Таким образом, подсчет показывает, что минимально допустимая специфичность диагностики равна 99,6%.

Степень разработанности темы исследования. Основным методом диагностики рака яичников до сих пор остается гистологическое исследование биоптата, которое может дать точный ответ о характере и структуре опухоли. Однако, генетическая гетерогенность и неоднородность развития рака яичников приводит к многообразию морфологических форм, что затрудняет диагностирование стадии злокачественного процесса. Кроме того, любое гистологическое исследование внутренних органов инвазивно, поэтому данная диагностика не подходит для рутинного применения. Трансвагинальное, трансрекгальное или классическое ультразвуковое исследование (УЗ И) позволяет детально изучить структуру яичников, чтобы различить морфологические изменения, причиной которых могут быть злокачественные процессы. Преимуществом этих методов исследования является их неинвазивностъ, что позволяет использовать их для проведения периодического осмотра. Однако УЗИ имеет низкую специфичность по отношению к раку яичников, поэтому многие современные протоколы УЗИ учитывают несколько показателей, такие как объем яичников, их форма, образование папиллом, цист, структуру стенок, толщину перегородок и прочее, в том числе совместное использование УЗИ и биомаркерных тестов.

Большие надежды врачи и исследователи, работающие в области лечения рака яичников, связывают с разработкой новых методов диагностики, основанных на измерении уровня биомаркеров. К настоящему моменту одобрение FDA (Food and Drug Administration, управление по продовольствию и медикаментам) в США получили только два маркера: CA-125 (cancer antigen 125, раковый антиген 125) и НЕ4 (Human epididymis protein 4, Белок 4 эпидидимиса человека), а также два мультипараметрических теста: OVA1 и ROMA.

CA-125 является хорошо изученным и широко используемым в клинической диагностике сывороточным биомаркером рака яичников. Примерно у 83% пациентов с диагнозом рак яичников уровень CA-125 выше 35 Ед/мл. К сожалению, CA-125 демонстрирует недостаточную

специфичность, поскольку повышение уровня маркера в крови может сопутствовать некоторым другим заболеваниям, включая рак (поджелудочной железы, молочной железы, мочевого пузыря, печени, легких), доброкачественные новообразования (эндометриоз, миома матки), цирроз печени и даже при менструации и беременности. Маркер НЕ4 в 2009 году был одобрен FDA для мониторинга прогрессирования рака яичников или возможного рецидива. Показана явная корреляция НЕ4 с определенными подтипами рака яичников: 100% специфичности при эндометриоидной форме и 93% при серозной. Использование только НЕ4 позволяет достичь 95% чувствительности и 72,9% специфичности. В комбинации с CA-125 панель из двух маркеров показала 93,8% чувствительности и 74,9% специфичности. Для увеличения чувствительности и специфичности диагностического подхода предлагают использовать CA-125 и НЕ4 в сочетании с другими маркерами или с другими методами диагностики, к примеру, с УЗИ. Разработка мультипараметрических тестов является популярным и многообещающим трендом в области диагностики.

Тест OVA1 основан на измерении содержания СА-125, транстиретина, аполипопротеина AI, трансферрина и ß2 микроглобулина. Чувствительность теста, по разным оценкам, составляет более 91%, а вот специфичность для общей группы - 43%. Поэтому тест одобрен для использования в случаях, когда образование в яичниках уже выявлено, но не ясно является ли оно злокачественным. Специфичность при таком использовании может достигать 95,4%. Тест ROMA (The Risk of Ovarian Malignancy Algorithm; алгоритм диагностики риска развития злокачественной опухоли в яичниках) использует данные о содержании маркеров СА-125 и НЕ4 и о климактерическом статусе. Тест ROMA в 2011 году получил разрешение FDA на использование для диагностики рака яичников в случае, когда образование в яичниках выявлено. Чувствительность ROMA для таких случаев составляет 80%, а специфичность - 85,4%.

Дели и задачи исследования. Цель настоящей работы состояла в выявлении и идентификации в сыворотки крови пациенток с раком яичников диагностически значимых для этого заболевания пептидов. Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Разработать высокопроизводительный и воспроизводимый метод выделения пептидов из сыворотки крови человека.

2. Используя разработанный метод выделения пептидов, провести сравнительное профилирование сывороток крови практически здоровых доноров и пациенток с раком яичников времяпролетной МАЛДИ масс-спектрометрией (MALDI-TOF MS) с целью выявления пептидов - потенциальных маркеров рака яичников.

3. Провести выделение и идентификацию пептидов из пулированных образцов сыворотки крови практически здоровых доноров и пациенток с раком яичников методом тандемной масс-спектрометрии, сопряжённой с высокоэффективной жидкостной хроматографией.

4. Провести соотнесение значений m/z потенциальных маркеров рака яичников, выявленных в результате сравнительного MALDI-TOF MS профилирования образцов сывороток крови практически здоровых доноров и пациенток с раком яичников, с идентифицированными методом LC-MS/MS пептидами.

5. Используя количественный безметочный масс-спектрометрический метод анализа (SWATH) пептидных фракций пулированных образцов сыворотки крови практически здоровых доноров и пациенток с раком яичников, выявить пептиды, содержание которых в исследованных группах образцов различается в 2 или более раза.

6. Выявить корреляции между количественными данными, полученными в результате анализа пептидных фракций сывороток крови методом SWATH и MALDI-TOF MS профилирования для пептидов, с совпадающими значениями m/z.

Личный вклад автора. Все экспериментальные научные результаты, изложенные в диссертации, их анализ, обобщение литературных данных и оценка результатов выполнены лично автором под руководством Зиганшина Р.Х.

Научная новизна работы. В диссертации разработан и описан метод выделения пептидов из сыворотки крови человека. С использованием разработанного метода было проведено МАЛДИ масс-спекгрометрическое профилирование образцов сыворотки крови практически здоровых доноров, пациенток с подтвержденным диагнозом рак яичников, а также пациенток с доброкачественными гинекологическими заболеваниями. По результатам LC-MS/MS анализа удалось идентифицировать почти восемь тысяч уникальных пептидов. Большое количество идентифицированных пептидов позволило провести детальные маркерные сравнения на количественном уровне, с использованием количественного безметочного масс-спектрометрического метода анализа SWATH. По глубине анализа наши результаты превосходят результаты ведущих групп в области пептидомики.

Теоретическая и практическая значимость работы. Настоящей работой мы внесли вклад в развитие клинической протеомики в вопросах разработки перспективной диагностики рака яичников. Предложенный нами метод выделения пептидов из сыворотки крови позволяет разрушать комплексы пептидов с основными белками плазмы крови и осаждать высокомолекулярные белки. В работе показано, что при использовании разработанного метода выделения пептидов увеличивается количество регистрируемых МАЛДИ масс-спекгрометрических пиков, улучшается качество и воспроизводимость масс-спектрометрических профилей. На основе разработанного метода пробоподготовки нам удалось выявить отличия между группами пациентов как на уровне МАЛДИ масс-спектрометрического профиля, так и на уровне количественного анализа пептидов методом SWATH. Данные по идентификации 7996 уникальных пептидов, а также по их количественному анализу представляют практический интерес для возможных дальнейших работ по выявлению биомаркеров.

Методология и методы исследования. При помощи разработанного метода выделения пептидов из сыворотки крови человека с использованием магнитных микрочастиц с катионообменной поверхностью было проведено фракционирование образцов сыворотки крови практически здоровых доноров, пациенток с подтвержденным диагнозом рак яичников, а также пациенток с доброкачественными гинекологическими заболеваниями. Для выявления потенциальных пептидных маркеров было проведено МАЛДИ масс-спектрометрическое профилирование. Для идентификации пептидов, потенциальных маркеров рака яичников, был проведен LC-MS/MS анализ с использованием высокопроизводительных масс-спектрометров TripleTC)F5600+. Был проведен количественный безметочный анализ методом SWATH.

Апробация работы. Основные результаты исследования были представлены на российских и международных конференциях: "4ый съезд ВМСО Масс-спектрометрия и её прикладные проблемы" (Москва, 2009), "4ый российский симпозиум Белки и пептиды" (Новосибирск, 2009), "Школа-конференция Фундаментальная Наука для Биотехнологии и Медицины 2010" (Москва, 2010), "The 31st European Peptide Symposium (Copenhagen, Denmark, 2010), "The 13й1 World Congress on Controversies in Obstetrics» (Berlin, Germany, 2010), "The 10th HUPO World Congress" (Geneva, Switzerland, 2011) и "The 38th FEBS Congress" (Санкт-Петербург, 2013).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 16 печатных работ - 5 статей в реферируемых научных журналах и 11 в трудах конференций.

Объём и структура работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы (2 главы), описания материалов и методов исследования (4 главы), результатов (5 глав), обсуждения (5 глав), заключения, выводов, списка литературных источников, цитируемых в диссертационной работе и приложения. Работа изложена на 146 страницах печатного текста, содержит 16 таблиц, 15 рисунков и 1 приложение. Список цитируемой литературы включает 222 источника.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Образцы сыворотки крови

Сыворотки крови пациенток с диагнозом рак яичников получены из Российского Научного Центра Рентгенорадиологии Минздрава РФ, Москва. Всего в работе использованы образцы от 34 пациенток (далее, группа «рак яичников»). Данную коллекцию использовали в работе по МАЛДИ масс-спектрометрическому профилированию сыворотки крови. В работе по идентификации и количественному анализу потенциальных биомаркеров рака яичника была использована коллекция образцов сыворотки крови пациенток с диагнозом рак яичников из Российского онкологического научного центра им. Н. Н. Блохина РАМН, Москва. Всего для работы были взяты образцы от 60 пациенток (далее так же, группа «рак яичников»). Для нивелирования отличий, связанных с индивидуальной изменчивостью пациенток, образцы пулировали по 10 штук, и таким образом получили б пулов. Для обеих коллекций образцов заболевание определяли цитоморфологическими исследованиями биоптатов.

В качестве контроля были использованы образцы сыворотки крови 60 практически здоровых женщин (далее, группа «здоровые доноры»), полученные из клинико-диагностической лаборатории ООО НПФ «Литех», Москва. В работе по МАЛДИ масс-спектрометрическому профилированию сыворотки крови были использованы только 33 образца из данной коллекции, чтобы статистически уравновесить выборку образцов в двух сравниваемых группах. Для идентификации и количественного анализа потенциальных биомаркеров рака яичника все 60 образцов были пулированы по 10 штук, и таким образом было получено 6 пулов.

В качестве дополнительного контроля в работе по МАЛДИ масс-спектрометрическому профилированию были использованы образцы сыворотки крови пациенток с доброкачественными гинекологическими новообразованиями: 35 пациенток с аденомиозом (далее, группа «аденомиоз»), 20 пациенток больных одновременно аденомиозом и гистеромиомой (далее, группа «аденомиоз с гистеромиомой»), 13 пациенток с гиперпластическими процессами эндометрия (далее, группа «гиперпластические процессы эндометрия»), 12 пациенток с ректоцервикальным эндометриозом (далее, группа «ректоцервикальный эндометриоз»), 27 пациенток с эндометриоидными кистами яичников (далее, группа «эндометриоидные кисты яичников») и 29 пациенток с синдром поликистозных яичников (далее, группа «синдром поликистозных яичников») (Таблица 4). Все образцы были получены из клинической больницы Российского Университета Дружбы Народов. Поставленные диагнозы проверяли цитоморфологическими исследованиями биоптатов.

Фракционирование образцов сыворотки крови

Для фракционирования использовали стандартные наборы для профилирования, содержащие магнитные микрочастицы с функционализированной поверхностью MB-HIC 8, МВ-ШС 18, МВ-WCX и MB-IMAC Си производства компании Bruker Daltonics. Для МАЛДИ профилирования фракционирование образцов сыворотки крови проводили на автоматизированной платформе ClinProt Robot (Bruker Daltonics), а для LC-MS/MS анализа - вручную.

Протокол фракционирования с использованием MB-WCX

Перед использованием магнитные микрочастицы тщательно перемешать в течение 1 минуты. Затем, 200 мкл частиц смешать с 200 мкл раствора MB-WCX Binding Solution. После добавления 100 мкл сыворотки крови, раствор инкубировать в течение 5 минут при комнатной температуре. Микропробирку поместить в специальный магнитный держатель. При этом в течение 1 минуты магнитные частицы осядут на поверхности стенок пробирки, и раствор станет прозрачным. После этого 500 мкл раствора отобрать из пробирки. Для отмывки микрочастиц 1000 мкл раствора MB-WCX Washing Solution добавить к частицам. Микропробирку переставить в держателе 10 раз, меняя положение относительно магнита. После инкубации в держателе в течении 1 минуты, 1000 мкл раствора отобрать. Промывку магнитных частиц повторить дважды. Для элюции 200 мкл

раствора MB-WCX Elution Solution добавить к частицам. Смесь инкубировать в держателе в течение 2 минут. Затем, перенести в отдельную микропробирку 200 мкл раствора. 200 мкл раствора MB-WCX Stabilization Solution добавить к элюату.

Стадия прогревания элюатов образцов сыворотки крови

Полученные в результате фракционирования образцов сыворотки крови, элюаты прогревали в течение 15 мин при 98°С на водяном термостате, после чего элюаты охлаждали до комнатной температуры. При помощи центрифугирования осаждали образовавшийся конденсат и агрегировавшие белки (Eppendorf Centrifuge 5415 D, RCF 16100 g, 15 мин).

Протокол фракционирования на микроколонках с обращено фазовой поверхностью Обессоливание элюатов после прогревания проводили на микроколонках с обращено фазовой поверхностью. Микроколонки подготавливали самостоятельно по протоколам рекомендованных в статье Rappsilber с соавторами. Для фракционирования 400 мкл элюата подготовить 4 микроколонки по 3 слоя мембраны в каждой. Дальнейшие действия выполнять параллельно на 4 микроколонках. Для промывки микроколонки пропустить через неё последовательно 20 мкл метанола и 20 мкл 0,1% трифторуксусной кислоты. После этого пропустить через микроколонку 100 мкл элюата. Для промывки микроколонки от солей пропустить через неё 20 мкл 0,1% трифторуксусной кислоты. Для элюции пропустить через микроколонку 30 мкл 50% ацетонитрила в 0,1% трифторуксусной кислоте. После обессоливания элюаты концентрировали на вакуумном центрифужном концентраторе SpeedVac (SVC-100H, Savant) до объема 5 мкл, добавляли к элюату 10 мкл раствора 5% ацетонитрила в 0,1% муравьиной кислоте и анализировали методом LC-MS/MS. Для масс-спектрометрического анализа использовали по 5 мкл образца на каждый технический повтор.

МАЛДИмасс-спектрометрическое профилирование

После прогревания или после фракционирования (если прогревание не проводилось) элюаты смешивали с раствором матрицы (смесь 2,5-дигидроксибензойной кислоты (0,24 мг/мл) и альфа-циано-гидроксикоричной кислоты (0,3 мг/мл) в ацетонитрил/метанол 1:1) в соотношении 1:15 и наносили на масс-спектрометрическую мишень AnchorChip 600/384 (производства Bruker Daltonics) в четырех повторах по 0,8 мкл. Эти операции проводили с использованием автоматизированной системы пробоподготовки ClinProt Robot (Bruker Daltonics).

Масс-спектры получали с использованием времяпролетного масс-спектрометра Ultraflex™ TOF/TOF фирмы Bruker Daltonics. Десорбцию образцов осуществляли иррадиацией азотным лазером (длина волны 337 нм), работающим при частоте 25 Гц. Для удаления пиков матрицы использовали максимальный уровень подавления сигнала вплоть до 500 Да. Спектры регистрировали в линейном режиме положительно заряженных ионов в диапазоне масс от 0,6 до 12 кДа. Для калибровки использовали калибровочную смесь, содержащую пептиды и белки в диапазоне масс 1-17 кДа. Для увеличения чувствительности детекции избыток матрицы удаляли 8 импульсами лазера при мощности 60% с последующей аккумуляцией данных при мощности лазера 45%. Для каждого спектра суммировали результаты 720 лазерных импульсов (по 60 импульсов с 12 различных точек пятна). Суммировали спектры с отношением сигнал/шум > 5 и разрешением > 300.

Масс-спектрометрические данные анализировали с использованием компьютерной программы ClinProTools 2.1 (Bruker Daltonics). Для удаления базовой линии использовали алгоритм Top Hat Baseline с параметром минимальной ширины 50%. Для перекалибровки спектров допускали отклонение до 1000 ррт, если хотя бы 30% масс-спектрометрических пиков совпадало с реперными пиками. Математические модели для классификации масс-спектров, полученных после профилирования сыворотки крови, строили на основе Генетического Алгоритма (ГА) и алгоритма Обучаемой Нейронной Сети (ОНС). При построении классификационных моделей использовали следующие параметры. Для ГА: количество пиков, входящих в создаваемую

модель классификации - не более 7; число поколений - не более 500; начальное число комбинаций пиков выбиралось автоматически; уровень мутаций - 0.2; уровень кроссинговера — 0,5. Количество пиков, используемых для построения классификационной модели на основе ОНС, выбиралось алгоритмом автоматически (но не более 25); максимальное число итераций -99x100; число прототипов выбиралось автоматически. Для внутренней валидации использовали алгоритм Leave one out. Массивы спектров каждой из групп «рак яичников» и «здоровые доноры» разделяли пополам. На основании одной половины строили классификационные модели, а оставшиеся использовали для внешней валидации построенных моделей.

Идентификация пептидов и биоинформатический анализ

LC-MS/MS анализ проводили при помощи масс-спектрометров TripleTOF5600+ с источником ионизации NanoSpray Ш фирмы ABSciex, объединенном с nano-HPLC системой NanoLC Ultra 2D+ фирмы Eksigent. Для экспериментов по идентификации масс-спектрометр TripleTOF5600+ (ABSciex) функционировал в режиме ША. Обзорный спектр измеряли в диапазоне m/z 300-1250 при времени накопления сигнала 250 мс. Спектры дочерних ионов измеряли для 50 наиболее интенсивных родительских ионов с интенсивностью выше 400 сигналов в секунду и зарядовым состоянием от 2 до 5. Допустимая погрешность определения m/z родительского иона 20 ppm, а дочерних - 50 ррт. Динамическое исключение было настроено на добавление родительских ионов во временный лист исключений на 15 с после каждого их MS/MS анализа, чтобы измерить спектр фрагментации в точке максимально близкой к вершине пика (минимальная ширина пика была около 30 с).

Для идентификации пептидов и белков по MS/MS спектрам применили согласованный подход, основанный на использовании двух поисковых алгоритмов: Mascot и X!Tandem. Параметры для всех поисковых программ выставляли одинаковыми: неспецифический гидролиз, отсутствие постоянных или переменных модификаций, точность определения m/z иона прекурсора - 20 ррт, точность определения дочерних ионов - 50 ррт (0,04 Da для Mascot). При анализе была использована актуальная на тот момент база данных белковых последовательностей UniProtKB по таксону HUMAN, скачанная с официального сайта http://www.uniprot.org/14 Марта 2013 года. Результаты идентификации объединялись и валидировались при помощи программного продукта Scaffold (Proteome Software). Валидацию проводили только по пептидам, устанавливая допустимое пороговое значение FDR на уровне 95%.

Количественный анализ содержания пептидов в сыворотке крови методом SWATH Для SWATH LC-MS/MS анализ использовали следующие параметры масс-спектрометрической системы: диапазон m/z родительских ионов 300-1250, спектры дочерних ионов снимались для окон пропускания первого квадруполя в 27,9 а.е.т., время накопления сигнала для каждого окна 0,1 сек, суммарное время цикла на весь диапазон масс 3,36 сек, что в случае средней ширины пика в 30 секунд позволяет снимать около 9 точек на пик. Диапазон m/z измерения дочерних ионов 200-1800. Энергия столкновений в течение времени измерения дочерних спектров (0,1 с) линейно изменяется от 32,5 до 47,5 В.

Библиотека переходов была создана с помощью плагина MS/MS(ALL) with SWATH™ Acquisition MicroApp (версия 1.0.0.653) программы PeakView Software (версия 1.2.0.3, фирмы ABSciex) с использованием только наиболее достоверно идентифицированных пептидов. Для поиска соответствий между SWATH LC-MS/MS экспериментами и библиотекой переходов использовали окна времени удерживания в 5 мин и допустимую погрешность m/z в 50 ррт. Для количественного анализа для каждого из пептидов в библиотеке были использованы 10 его наиболее интенсивных фрагментов.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Разработка метода выделения пептидов из сыворотки крови человека

Усовершенствование стандартного протокола фракционирования образцов сыворотки крови с использованием магнитных микрочастиц с функционализированной поверхностью для последующего масс-спектрометрического анализа образцов было проведено по двум причинам. Во-первых, нами было показано, что масс-спектрометрические профили образцов сыворотки крови, получаемые по стандартному протоколу, имеют малое количество пиков и неудовлетворительную воспроизводимость (Рисунок 1, Таблица 1, Рисунок 3). Во-вторых, в последние годы появились как теоретические расчеты, так и экспериментальные подтверждения того, что большая часть низкомолекулярных белков и пептидов плазмы и сыворотки крови находятся в ассоциированном состоянии с основными белками плазмы крови. Одним из наиболее простых, на наш взгляд, способов разрушения межмолекулярных связей, удерживающих пептиды на поверхности высоко представленных белков крови, является нагревание.

Разрушение пептидно белковых комплексов проводили в элюатах, полученных после фракционирования образцов сыворотки крови на магнитных микрочастицах (Bruker Daltonics) по протоколам близким к протоколам производителя. Стадию прогревания проводили в течение 15 минут при 98°С на водяном термостате в герметичной пробирке. Затем элюат охлаждали до комнатной температуры. При помощи центрифугирования осаждали образовавшийся конденсат и агрегировавшие белки.

Для оценки преимуществ, которые дает предлагаемый нами метод выделения пептидов, было проведено фракционирование пяти образцов сыворотки крови на различных типах магнитных микрочастиц. МАЛДИ масс-спектры элюатов, измеренные после прогревания содержали большее число пиков и имели большую интенсивность по сравнению со спектрами, измеренными до прогревания (Рисунок 1, Таблица 1).

Intens, [a.u.] х104 1.5

1.0

0.5

0.0 1.5

1.0

0.5

0.0

1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000 9000 m/z

Рисунок 1: МАЛДИ масс-спектры фракционированного на магнитных микрочастицах MB-WCX образца сыворотки крови до (А) и после (Б) прогревания элюата. По оси ординат отложена интенсивность спектра, по оси абсцисс - отношение массы к заряду в Да.

. ____________ !.,; J. , ... J. А .1 1 . ,.....i 11 ... .1 ........1

; Jjjl uU I/UUUujJWA Б ■waI^jWAI-.A.,..... Д^Д^лА . 1.

Таблица 1: Количество детектируемых масс-спектрометрических пиков в элюатах сыворотки крови, полученных с использованием магнитных микрочастиц с функционализированной поверхностью с прогреванием элюатов и без (среднее значение ± стандартное отклонение).

Протокол фракционирования Тип использованных магнитных микрочастиц

МВ-\УСХ МВ-Н1С 8 МВ-1МАС Си

Без прогревания элюатов 23±6 30±7 22±5

С прогреванием элюатов 376±34 365±32 257±24

Увеличение количества детектируемых масс-спектрометрических пиков, вероятно, так же связано с уменьшением содержания высокомолекулярных белков в элюатах после прогревания (Рисунок 2). Падение концентрации высокомолекулярных белков после нагревания образцов происходит, вероятно, в результате их денатурации и последующей необратимой в условиях эксперимента агрегации и/или сорбции белков на стенках пробирок.

киУ 30

20,1

14,4

Рисунок 2: 12% Т образцов сыворотки крови практически здоровых доноров,

фракционированных на магнитных микрочастицах \1B-WCX (1), МВ-Н1С8 (2), МВ-ШАС Си (3) до (А) и после (Б) прогревания элюатов.

Разработанный метод выделения пептидов из сыворотки крови позволил улучшить воспроизводимость получаемых МАЛДИ масс-спектров (Рисунок 3). Мы предполагаем, что стабильность пептидного профиля прогретых образцов обусловлена, как уменьшением сродства пептидов к денатурированным белкам-носителям (особенно в присутствии органических растворителей, содержащихся в элюирующем растворе), так и уменьшением (в результате агрегации и/или сорбции белков) концентрации белков-носителей в растворе.

Брес^ # 4

Рисунок 3: Представленные в виде исевдо-геля МАЛДИ масс-сиектрометрнческие профили образца сыворотки крови, полученные после фракционирования на магнитных микрочастицах \IB-WCX с последующим прогреванием (А) и без (Б). Каждое измерение проводили в четырех повторах. По оси ординат отложены номера спектров, по оси абсцисс - отношение массы к заряду в Да. Интенсивность окрашивания полос соответствует интенсивности пика в спектре, нормированной по общему ионному току.

Еще одним достоинством разработанного метода выделения пептидов из сыворотки крови является то, что он позволяет нивелировать негативное влияние различных условий получения сыворотки крови на воспроизводимость её пептидного состава. При исследовании влияния длительности инкубации крови до получения сыворотки на последующий масс-спектрометрический профиль, были проанализированы образцы сыворотки крови, которые получали по протоколам, отличающимся длительностью инкубации крови при комнатной температуре (1,2, 4, 8 и 24 часа), а также наличием предварительной стадии инкубации крови на льду в течение 1, 2, 4 и 8 часов. Было показано, что прогревания элюатов приводит к значительному улучшению воспроизводимости между всеми рассмотренными протоколами получения сыворотки крови. Это свойство метода открывает возможности для использования в биомаркерных исследованиях образцов, накопленных в биобанках, создававшихся в течение многих десятков лет.

2. Построение классификационных моделей сравнения групп «рак яичников» и «здоровые доноры» на основе профилирования на магнитных микрочастицах с применением нового протокола выделения пептидов из сыворотки крови

Сравнение масс-спектрометрических профилей образцов сыворотки крови, полученных по модифицированному и стандартному протоколам, показало существенные преимущества первого. После стадии прогревания на порядок возрастает число детектируемых пиков, увеличивается общая интенсивность спектра (Таблица 1, Рисунок 1). Одновременно улучшается воспроизводимость масс-спектрометрических профилей образцов (Рисунок 3). Мы предположили, что эти улучшения положительным образом скажутся на выявлении наборов масс-спектрометрических пиков, характерных для конкретной патологии. Такое предположение основано на том, что разрушение пептидно белковых комплексов не просто увеличивает выборку, в которой можно производить поиск потенциальных маркеров, а увеличивает содержание именно тех пептидов, которые в течение относительно длительного времени накапливались в кровотоке на белках-носителях и могут отражать процессы, происходящие в организме.

Среди МАЛДИ масс-спектрометрические профилей элюатов, полученных после фракционирования на различных типах магнитных микрочастиц, наиболее однородную картину представлял спектр элюата, полученный после фракционирования на магнитных микрочастицах МВ-\УСХ (Рисунок 1). На основе Генетического Алгоритма (ГА) и алгоритма Обучаемой Нейронной Сети (ОНС) были построены классификационные модели для групп образцов сыворотки крови, полученной от пациенток больных раком яичников (далее группа «рак яичников») и от здоровых доноров (далее группа «здоровые доноры»). Математические модели «рак яичников / здоровые доноры», построенные на основе сравнения профилей образцов сыворотки крови после фракционирования на магнитных микрочастицах МВ-\УСХ, показали близкие в 100% значения чувствительности и специфичности (Таблица 2, Рисунок 4).

Таблица 2: Значения чувствительности и специфичности классификационных моделей, построенных на основе ГА и алгоритма ОНС для групп «рак яичников» и «здоровые доноры», фракционированных на всех использованных типах магнитных микрочастиц.

Тип магнитных микрочастиц Генетический Алгоритм Обучаемая Нейронная Сеть

Чувствительность Специфичность Чувствительность Специфичность

MB-HIC 8 88% 96% 88% 98%

MB-HIC 18 98% 83,3% 81,3% 100%

MB-IMAC Си 97,2% 88% 100% 90%

MB-WCX 100% 97,1% 93,3% 100%

т/г

Рисунок 4: Итоговый анализ масс-спекгромегрнческих профилей образцов сывороток крови групп «рак яичников» и «здоровые доноры», фракционированных с использованием магнитных микрочастиц \1II-\VCX. В виде псевдо-геля представлены масс-спектрометрические профили образцов групп «рак яичников» (снизу) и «здоровые доноры» (сверху). В верхней части рисунка показаны отдельные участки усредненных масс-спекгров групп «рак яичников» (красный цвет) и «здоровые доноры» (зеленый цвет).

Анализ вариации площадей масс-спектрометрических пиков между группами «рак яичников» и «здоровые доноры» позволил выявить 18 пиков статистически значимых для отличия этих групп. Кроме того, 7 масс-пиков были выбраны при построении модели на основе ГА, и еще 23 пика при построении модели на основе ОНС (Таблица 7).

3. Построение классификационных моделей сравнения групп «рак яичников» и «номинальный контроль» на основе профилирования на магнитных микрочастицах

Детальное изучение кросс-специфичности построенных математических моделей (Таблица 2) показало, что они обладают низкой специфичностью по отношению к образцам групп доброкачественных гинекологических патологий, которые не использовались при построении этих моделей (Таблица 3). Таким образом, модель, построенная на основании сравнения двух групп пациентов («рак яичников» и «здоровые доноры»), не позволяет проводить эффективную диагностику образцов из патофизиологически гетерогенных групп пациентов.

Таблица 3: Специфичность модели «рак яичников / здоровые доноры», построенной на основании ГА, относительно доброкачественных гинекологических заболеваний.

Группы пациенток Специфичность

Аденомиоз 26,1%

Аденомиоз с гистеромиомой 25,0%

Гиперпластические процессы эндометрия 46,2%

Ректоцервикальный эндометриоз 25,0%

Эндометриоидные кисты яичников 48,1%

Синдром поликистозных яичников 44,8%

На первый взгляд, полученные результаты ставят под вопрос использование МАЛДИ масс-спектрометрического профилирования для поиска биомаркеров, специфичных для заболевания. Однако в онкологии диагностик с абсолютной специфичностью не встречается. Важнее уметь отличать целевое заболевание от патологий, которые могут его скрывать. Типичным примером является рак и доброкачественные опухоли той же локализации. Так, к примеру, было показано, что эндометриоз имеет схожий с раком яичников патогенетический механизм и, возможно, общую этиологию. По статистике у 10-15% пациенток с раком яичников так же обнаруживается эндометриоз, а в 1-5% эндометриоз перерождается в раковую опухоль. Эти данные показывают необходимость разработки диагностики, способной отличать рак яичников от эндометриоза.

Для построения математических моделей классификации, которые способны отличить пациенток группы «рак яичников» от пациенток с доброкачественными гинекологическими заболеваниями, мы сформировали группы, состоящие из образцов группы «здоровые доноры», а также групп пациенток с доброкачественными гинекологическими заболеваниями. Группа «номинальный контроль 1» включала образцы групп «аденомиоз» и «эндометриоидные кисты яичников». Группа «номинальный контроль 2» состояла из образцов групп «аденомиоз», «эндометриоидные кисты яичников» и «ректоцервикальный эндометриоз». В группу «номинальный контроль 3» входили образцы групп «здоровые доноры», «аденомиоз», «эндометриоидные кисты яичников», «ректоцервикальный эндометриоз» и «гиперпластические процессы эндометрия». Классификационные модели, построенные для групп «рак яичников» и «номинальный контроль» показали высокие значения чувствительности и специфичности (Таблица 4), но низкие значения

кросс-специфичности по отношению к тем патологиям, которые не входили в группы сравнения (Таблица 5).

Таблица 4: Чувствительность и специфичность классификационных моделей, способных различать рак яичников от доброкачественных гинекологических заболеваний.

Классификационная модель Чувствительность Специфичность

рак яичников / номинальный контроль 1 93,3% 100%

рак яичников / номинальный контроль 2 81,3% 97,0%

рак яичников / номинальный контроль 3 87,5% 98,1%

Таблица 5: Специфичность классификационных моделей, способных различать рак яичников от доброкачественных гинекологических заболеваний, по отношению к различным группам пациенток. Курсивным начертанием обозначены значения специфичности по отношению к тем группам пациенток, образцы которых использовались при построении соответствующей модели.

Группы пациенток Специфичности классификационных моделей

рак яичников / номинальный контроль 1 рак яичников / номинальный контроль 2 рак яичников / номинальный контроль 3

Здоровые доноры 43,8% 56,3% 100%

Аденомиоз 100% 100% 100%

Аденомиоз с гистеромиомой 83,3% 66,7% 57,1%

Гиперпластические процессы эндометрия 100% 100% 100%

Рекгоцервикальный эндометриоз 91,7% 91,7% 100%

Эндометриоидные кисты яичников 100% 100% 96,3%

Синдром поликистозных яичников 78,6% 100% 100%

Улучшение специфичности диагностической модели, путем введения дополнительных патологий в группу «номинальный контроль», отрицательно сказывается на чувствительности модели. Таким образом, МАЛДИ масс-спектрометрическое профилирование подходит для сравнения ограниченной выборки патологий. К примеру, МАЛДИ профилирование способно отличить рака от доброкачественных опухолей той же локализации. Вероятно, по аналогичной причине единственные к настоящему моменту одобренные FDA в США мультипараметрические тесты, OVA1 и ROMA, применимы только в случаях, когда образование в яичниках уже выявлено, но не ясно является ли оно злокачественным и как срочно необходима операция.

4. Идентификация потенциальных биомаркеров рака яичников

Методами масс-спектрометрии была проведена идентификация пептидных биомаркеров, специфичных для образцов сывороток крови пациенток с раком яичников. На первом этапе работы образцы сыворотки крови практически здоровых доноров и пациенток с диагнозом рак яичников были проанализированы с точки зрения получения максимального числа идентифицируемых в них пептидов. Всего было идентифицировано 7996 уникальных пептидов, являющихся фрагментами 2068 уникальных белков (Рисунок 5). В пулах группы «рак яичников» было идентифицировано 2058 уникальных пептидов, не идентифицированных в пулах группы «здоровые доноры». Из них 790 пептидов относятся к белкам, фрагменты которых не были идентифицированы для группы «здоровые доноры». Количество пептидов, являющихся фрагментами одного белка, достигало 851 как в случае с белком Apolipoprotein A-I (Таблица 6).

Здоровые доноры (5938 пептидов)

Рак яичников (5495 пептидов)

Здоровые доноры (1364 белка)

Рак яичников (1154 белка)

Рисунок 5: Диаграммы распределения идентифицированных пептидов и их белков предшественников между экспериментальными группами. Синим указано количество пептидов, из числа идентифицированных только в данной экспериментальной группе, относящихся к уникальным для данной группы белкам.

Для идентификации пептидов мы использовали две поисковые программы (MASCOT и X!Tandem). Более того, идентифицированные пептиды дополнительно валидировали при помощи алгоритмов статистического анализа, заложенных в программе Scaffold. Такой многостадийный анализ необходим, поскольку в отличие от протеомных работ, в которых достоверность идентификации пептидов дополнительно подтверждается идентификацией белка предшественника, при пептидомном анализе нет каких-либо предположений о необходимости идентифицировать несколько пептидов на белок. Поскольку при пробоподготовке к пептидомному анализу стадия гидролиза не используется, идентификация пептидов, относящихся к какому-либо белку, не означает идентификацию белка предшественника. Таким образом, биоинформатический анализ пептидома требует большего количества стадий валидации и по возможности нескольких независимых алгоритмов идентификации.

Таблица б: 20 белков, представленных наибольшим количеством уникальных идентифицированных пептидов.

# Уникальный номер белка Название белка Молекулярная масса белка, кДа Количество уникальных пептидов, идентифицированных как фрагменты данного белка

для группы «здоровые доноры» для группы «рак яичников»

1 Р02647 Apolipoprotein A-I 31 851 819

2 Р06396 Gelsolin 86 258 202

3 Р02765 AIpha-2-HS-glycoprotem 39 232 222

4 Р02671 Fibrinogen alpha chain 95 176 248

5 Р02768 Serum albumin 69 197 184

6 Q14624 Inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain H4 103 202 169

7 Р01024 Complement C3 187 194 174

8 Р04004 Vitronectin 54 166 169

9 Р10909 Clusterin 52 126 114

10 Р06727 Apolipoprotein A-IV 45 123 74

11 Р01042 Kininogen-1 72 96 100

12 P0DJI8 Serum amyloid A-l protein 14 53 127

13 Р02656 Apolipoprotein С-Ш 11 77 85

14 P0C0L5 Complement C4-B 193 88 74

15 А8К008 cDNA FU78387 52 76 62

16 Р00734 Prothrombin 70 72 64

17 B4E1Z4 Complement factor В 141 67 58

18 Р04196 Histidine-rich glycoprotein 60 57 66

19 В4Е1В2 cDNA FLJ53691, highly similar to Serotransfemn 75 59 54

20 Р02652 Apolipoprotein А-П 11 63 44

5. Анализ потенциальных биомаркеров количественным безметочным масс-

спектрометрическим методом SWATH Образцы сыворотки крови практически здоровых доноров и пациенток с диагнозом рак яичников были проанализированы при помощи количественного безметочного масс-спектрометрического метода SWATH. Нам удалось определить относительное содержания 384 уникальных пептидов. В пулах группы «рак яичников» было обнаружено 36 уникальных пептидов, концентрация которых в 2 или более раз выше, чем в пулах группы «здоровые доноры», а в пулах группы «здоровые доноры» было обнаружено 28 уникальных пептидов, концентрация которых в 2 или более раз выше, чем в пулах группы «рак яичников» (Рисунок 6). Кроме того, в пулах группы «рак яичников» было обнаружено И уникальных пептидов, концентрация которых в 10 или более раз выше, чем в пулах группы «здоровые доноры», а в пулах группы оддоровые доноры» было обнаружено 2 уникальных пептида, концентрация которых в 10 или более раз выше, чем в пулах группы «рак яичников».

-4 -3 -2 -1 0 1 2 3 4 5 6

Логарифм по основанию два от отношения содержания пептида в образцах групп "рак яичников" и "здоровые доноры"

Рисунок 6: График распределения пептидов, измеренных количественным безметочным масс-спектрометрическнм методом SWATH, в зависимости от их содержания в образцах групп «рак яичников» и «контроль», а также в зависимости от значимости пептидов при сравнении групп. Красным выделены пептиды, содержание которых значимо отличается между группами.

6. Корреляция результатов МАЛДИ масс-спектрометрического профилирования и количественного анализа на основе метода SWATH

Соотнесение данных МАЛДИ масс-спектромегрического профилирования и результатов количественного анализа позволяет выявить потенциальные пептиды, масс-спектрометрический сигнал которых привел к появлению значимых отличий в интенсивности МАЛДИ MC пиков. В работах, посвященных построению классификационных моделей на основе МАЛДИ профилирования, отмечается, что вклад в выявленные пики отличия, скорее всего, вносят сразу несколько пептидных компонент. Нам удалось идентифицировать 16 уникальных пептидов, значение массы которых соотносится со значением m/z МАЛДИ масс-пиков, для 15 из них при переходе между группами «рак яичников» и «здоровые доноры» содержание по данным SWATH и МАЛДИ масс-спектрометрии меняется сонаправлено (Таблица 7).

Таблица 7: Идентифицированные пептиды, отобранные для количественного анализа методом SWATH, чьи массы перекрываются с МАЛДИ масс-спектрометрическими пиками, вошедших в модели, построенные на основании ГА и ОНС, а также для масс-пнков, являющихся статистически значимыми для отличия групп «рак яичников» и «здоровые доноры». Полутолстым шрифтом выделены сонаправленные корреляции результатов МАЛДИ профилирования и анализа методом SWATH.

# Аминокислотная последовательность пептида Масса пептида, Да Логарифм отношения содержания пептидов в группах «рак яичников» и «здоровые доноры», соответственно (по данным SWATH) m/z МАЛДИ МС Логарифм отношения площадей под МАЛДИ МС пиками между группами «рак яичников» и «здоровые доноры», соответственно

1 DAHKSEVAHRFKD 1539.67 0.87 1540.03 0.08

2 DEPPQSPWDRVKD 1568.66 0.83 1569.78 0.45

3 DAHKSEVAHRFKDLG 1709.88 1.57 1710.05 -0.05

4 GFDGIPDNVDAALALPAH 1792.97 0.84 1793.98 0.17

5 AATLHTSTAMAAQHGMDDD 1944.08 0.57 1945.11 1.43

6 GVYTLNNEKQWINKAVGD 2049.27 1.65 2050.35 0.41

7 APRIKKIVQKKLAGDESAD 2067.42 1.23 2068.19 0.00

8 GEQRISLPESLKRIPIED 2080.37 0.95 2082.05 0.99

9 GTGQKQIWRIEGSNKVPVD 2112.37 0.57 2113.51 0.06

10 DEPPQSPWDRVKDLATVYVD 2330.54 1.06 2331.10 0.39

11 DEPPQSPWDRVKDLATVYVDVLK 2671.00 1.81 2671.32 0.39

12 EPPQSPWDRVKDLATVYVDVLKD 2671.00 1.51 2671.32 0.39

13 SGRDYVSQFEGSALGKQLNLKLLDN 2753.06 1.24 2753.85 0.34

14 DEPPQSPWDRVKDLATVYVDVLKD 2786.09 0.89 2787.01 0.60

15 RVEPYGENFN KALVQQMEQLRQKLG РН AGD 3453.88 0.39 3455.06 0.42

16 KAKPALEDLRQGLLPVLESFKVSFLSALEE YTKKLNTQ 4306.03 0.36 4308.32 0.33

7. Кислотный гидролиз, сопутствующий стадии прогревания пептидно-белковых комплексов

Особенностью предложенного метода выделения пептидов из сыворотки крови является сопутствующий кислотный гидролиз при прогревании в буфере для элюции при рН = 2-КЗ. При изучении кинетики этой протеолитической химической реакции было показано, что катализируемый кислотой гидролиз проходит в 100 раз быстрее для остатка аспарагиновой кислоты, чем для любого другого остатка. Для механизма реакции на первой стадии необходимо наличие кислых условий (рН < 2,1), при этом не важно какая конкретно кислота используется. Было показано, что протеолиз существенно ускоряется при повышении температуры более 108°С.

При идентификации пептидов было обнаружено, что наибольшее количество фрагментов соответствует белку Apolipoprotein A-I - 851 пептидов. Прогревании Apolipoprotein A-I в буфере для элюциия MB-WCX привело к существенному изменению МАЛДИ масс-спектра. Для идентифицированных пептидов мы обнаружили большое количество С-концевых аспарагиновых кислот (Рисунок 7), что можно объяснить кислотным гидролизом. С другой стороны, в работах Kapp с соавторами показали, что при MS/MS наибольшей интенсивностью обладают фрагменты, образованные при фрагментации по С-концевой аспарагиновой кислоте, а также N-концевому пролину, глицину и серину. Эти данные объясняются как лабильностью аминокислотной связи при соответствующих группах, так и различной способностью удерживать протон. В наших данных, помимо С-концевых аспарагиновых кислот в составе идентифицированных пептидов, мы обнаружили большое количество N-концевых пролинов, серинов и глицинов (Рисунок 7).

Ala Cys Asp Glu Phe Gly His Ile Lys Leu Met Asn Pro Gin Arg Ser Thr Val Trp Tyr

Аминокислоты

Рисунок 7: График распределения С- и N-концевых аминокислот по частоте встречаемости на концах идентифицированных пептидов. Для расчетов использовались последовательности пептидов, а также аминокислоты, предшествующие и следующие за пептидами (всего 12325 сайтов гидролиза).

Для многих белков предшественников нам удалось идентифицировать значительное количество уникальных фрагментов (до 851 в случае Apolipoprotein A-I; Таблица 6). Существуют методы количественного анализа белков, применяемый в протеомике, основанные на сравнении числа идентифицированных пептидов. На двадцать наиболее представленных белков плазмы крови приходится 98% от общего количества белка по массе. Если бы основной вклад в формирование идентифицированного нами пептидома вносил кислотный гидролиз, мы бы наблюдали значительную часть этих белков в списке двадцати, представленных наибольшим количеством уникальных идентифицированных пептидов (Таблица 6). Однако в последний список входит только 7 белков из числа 20 мажорных белков плазмы крови.

Поскольку наблюдаемый нами паттерн гидролиза существенно шире гидролиза по аспарагиновой кислоте (количество пептидов, образованных в результате гидролиза по аспарагиновой кислоте не превышает 30%; см. Рисунок 7) мы считаем, что часть идентифицированных нами пептидов являются нативными.

Проведенная нами работа использует в качестве ключевой идеи сравнение образцов сыворотки крови от двух групп пациенток: практически здоровых доноров и больных раком яичников. Мы разработали системы рандомизации коллекций образцов и последующих элюатов, систему мониторинга качества масс-спектров, мы проводили все эксперименты параллельно с контрольной и целевой группой образцов. Таким образом, разработанный нами протокол пробоподготовки и последующего анализа позволяет выявлять значимые отличия между пептидными пулами сыворотки крови групп пациентов вне зависимости от происхождения этих пептидов.

В своих работах Petricoin и Liotta подчеркивали, что в ответ на экстенсивный рост и потерю дифференцировки опухолью организм, вероятно, продуцирует специальные белки, или же сама опухоль может продуцировать белки с измененной структурой. Уникальные фрагменты таких белков могут быть обнаружены в кровотоке и применяться в качестве биомаркеров. Обнаруженные нами уникальные для опухоли пептиды, могут являться фрагментами белков, экспрессия которых меняется при возникновении и/или развитии опухоли, образованными либо в результате гидролиза в самом организме, либо при кислотном гидролизе на стадии пробоподготовки.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В ходе данной работы разработан метод выделения пептидов из сыворотки крови человека. При помощи разработанного метода с использованием магнитных микрочастиц с катионообменной поверхностью проведено фракционирование образцов сыворотки крови практически здоровых доноров, пациенток с подтвержденным диагнозом рак яичников, а также пациенток с доброкачественными гинекологическими заболеваниями. МАЛДИ масс-спектрометрическое профилирование позволило построить классификационные модели со значениями чувствительности и специфичности близкими к 100%. Однако было показано, что МАЛДИ масс-спектрометрическое профилирование подходит для дифференцирования ограниченной выборки патологий и может быть использовано, к примеру, для отличия рака от доброкачественных опухолей той же локализации.

Для идентификации пептидов, потенциальных маркеров рака яичников, а также для их количественного анализа методом SWATH провели LC-MS/MS анализ с использованием высокопроизводительных масс-спектрометров TripleTOF5600+. Данные по идентификации 7996 уникальных пептидов, а также по их количественному анализу представляют практический интерес для возможных дальнейших работ по выявлению биомаркеров на существенно больших группах пациентов. При этом в пулах образцов сыворотки от пациенток больных раком яичников идентифицировано 2058 уникальных пептидов, не идентифицированных в пулах образцов от практически здоровых доноров.

Разработанные протоколы выделения из сыворотки крови человека пептидно-белковых фракций позволяют на порядок увеличить количество регистрируемых во фракциях сыворотки крови МАЛДИ масс-спектрометрических пиков в области значений m/z менее 6 кДа, а также обеспечивают значительное улучшение качества и воспроизводимости масс-спектрометрических профилей получаемых фракций, по сравнению со стандартными протоколами фракционирования. МАЛДИ масс-спектрометрическое профилирование сывороток крови практически здоровых доноров, пациенток с подтвержденным диагнозом рак яичников, а также пациенток с доброкачественными гинекологическими заболеваниями позволило построить классификационные модели со значениями чувствительности и специфичности близкими к 100%.

Показано, что МАЛДИ масс-спектрометрическое профилирование подходит для дифференцирования ограниченной выборки патологий и может быть использовано для отличия рака от доброкачественных опухолей той же локализации. На основании разработанного метода выделения пептидов, в пулах сыворотки крови практически здоровых доноров и пациенток с диагнозом рак яичников идентифицировано 7996 уникальных пептидов, являющихся фрагментами 2068 белков. В пулах образцов сыворотки от пациенток больных раком яичников идентифицировано 2058 уникальных пептидов, не идентифицированных в пулах образцов от практически здоровых доноров. Из них 790 пептидов относятся к белкам, фрагменты которых не идентифицированы в пулах сыворотки от практически здоровых доноров.

Количественным безметочным масс-спектрометрическим методом SWATH в пупах образцов сыворотки крови пациенток с подтвержденным диагнозом рак яичников обнаружено 36 пептидов, содержание которых в 2 или более раз выше, чем в пулах сыворотки крови практически здоровых доноров и 28 пептидов, содержание которых в 2 или более раз ниже, чем в пулах образцов от практически здоровых доноров. Среди пептидов, измеренных методом SWATH, выявлено 16 уникальных последовательностей, значение массы которых соответствует значениям m/z МАЛДИ масс-спектрометрических пиков. Для 15 пептидов при переходе между группами «рак яичников» и «здоровые доноры» содержание по данным SWATH меняется сонаправлено с данными МАЛДИ масс-спектрометрического профилирования.

ПУБЛИКАЦИИ

Статьи в рецензируемы» журналах:

1. Ziganshin R.H., Alexeev D.G., Arapidi G.P., Ivanov V.T., Moshkovskii S.A. and Govorun V.M. Serum Proteome Profiling for Diagnostics of Ovarian Cancer Using ClinProt Magnetic Technique and MALDI-TOF Mass Spectrometry. // Biochemistry (Moscow) Supplement Series B: Biomedical Chemistry. 2008. T. 4. № 2. P. 335-342.

2. Ziganshin R.H., Arapidi G.P., Azarkin I.V., Zaryadieva E.A, Alexeev D., Govorun V.M., Ivanov V.T. New method for peptide desoiption from abundant blood proteins for plasma-serum peptidome analyses by mass spectrometry. // Journal of Proteomics. 2011. T. 74. № 5. P. 595606.

3. Сорокина A.B., Радзинский B.E., Зиганшин P.X., Арапиди Г.П. Поиск пептидных маркеров гинекологических заболеваний в сыворотке крови с использованием МАЛДИ масс-спекгрометрии. // Вестник РУДН, Серия Медицина, Акушерство и гинекология. 2011. №6. С. 122-130.

4. Сорокина А.В., Радзинский В.Е., Сохова З.М., Косикова Т.А., Зиганшин Р.Х., Арапиди Г.П., Говорун В.М. Потенциальные протеомные маркеры доброкачественных заболеваний матки в сыворотке крови. // НПЖ Акушерство и Гинекология. 2011. № 3. С. 47-51.

5. Сорокина А.В., Зиганшин Р.Х., Арапиди Г.П., Иванова О.М., Радзинский В.Е., Говорун В.М. Поиск специфичных маркеров рака яичников в сыворотке крови женщин с использованием МАЛДИ масс-спектрометрии. // Врач. 2012. № 1. С. 39-42.

Материалы конференций:

6. Зиганшин Р.Х., Арапиди Г.П., Азаркин И.В., Говорун В.М. Идентификация пептидов, ассоциированных с основными белками крови человека. // 4ый съезд ВМСО «Масс-спектрометрия и её прикладные проблемы», Москва, 18-22 мая 2009 г. С. 26.

7. Азаркин И.В., Арапиди Г.П., Зиганшин Р.Х., Алексеев Д.Г., Говорун В.М., Иванов В.Т. Поиск потенциальных биомаркеров рака яичников в сыворотке крови человека методом пептидно-белкового профилирования. // IV российский симпозиум «Белки и пептиды», Казань, 23-27 июня 2009 г. С. 285.

8. Ziganshin R.H., Arapidi G., Azarkin I., Govorun V., Ivanov V. Peptidomic analysis of human blood serum for specific disease markers // Journal of Peptide Science. 2010. № 16. P. 107-107.

9. Арапиди Г.П., Зиганшин P.X., Азаркин И.В., Алексеев Д.Г., Говорун В.М. Поиск потенциальных биомаркеров социально-значимых заболеваний в сыворотке крови человека при помощи МАЛДИ-масс-спектрометрии // Школа-конференция «Фундаментальная Наука для Биотехнологии и Медицины 2010», Москва, 16-17 сентября 2010 г. С. 6-9.

10. Ziganshin R.H., Arapidi G.P., Azarkin I.V., Govorun V.M. and Ivanov V.T. Peptidomic Analysis of Human Blood Serum for Specific Disease Markers. //31st European Peptide Symposium on Peptides, Copenhagen, Denmark, September 5-9,2010. P. 276-277.

11. Sorokins A.V., Radzinsky V.E., Ziganshin R.H., Arapidi G.P. Peptidomic analysis of blood serum for specific adenomyosis markers. // The 13th World Congress on Controversies in Obstetrics, Gynecology and Infertility, Berlin, Germany, November 4-7,2011. P. A-21.

12. Зиганшин P.X, Арапиди Г.П., Азаркин И.В., Ковальчук С.И., Зарядьева Е.А., Иванова О.М., Говорун В.М., Иванов В.Т. Поиск пептидных биомаркеров социально-значимых заболеваний человека в сыворотке крови. // П международная научно-практическая конференция «Постгеномные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине: геномика, протеомика, биоинфоратика», Новосибирск, 14-17 ноября 2011 г. С. 172.

13. Arapidi G.P., Ziganshin R.H., Kovalchuk S.I., Azarkin I.V., Ivanova O.M., Anikanov N.A., Alekseev D.G., Govorun V.M., Ivanov V.T. Mass-spectrometry based analysis of human blood

sera peptidome for a search of socially significant disease biomarkers // 10th HUPO World Congress, Geneva, Switzerland, September 4-7,2011. P. 484.

14. Govorun V.M., Ziganshin R.H., Arapidi G.P., Azarkin I.V., Kovalchuk S.I., Alexeev D.G., Ivanov V.T. Investigation of potential biomarkers of socially-significant human diseases in serum peptidome, // 10th HUPO World Congress, Geneva, Switzerland, September 4-7,2011. P. 541.

15. Arapidi G.P., Ziganshin R.H., Kovalchuk S.I., Azarkin I.V., Ivanova O.M., Anikanov N.A., Kamaev D.K., Govorun V.M., Ivanov V.T. Human blood sera peptidome analysis for a search of cancer biomarkers. // FEBS JOURNAL. 2013. № 280. P. 479-479.

16. Kovalchuk S.I., Ziganshin R.H., Ivanova O.M., Azarkin I.V., Anikov N.A., Arapidi G.P., Govorun V.M., Ivanov V.T. Quantitative LC-MS/MSALL discovery of serum peptide biomarkers. // FEBS JOURNAL. 2013. № 280. P. 492-493.

Список сокращений:

МАЛДИ - матрично-активируемая лазерная десорбция, ионизация

SWATH - Sequential Window Acquisition of all Theoretical fragments (Последовательная периодическая регистрация всех теоретических фрагментов)

MB-WCX - Magnetic Beads bases on Immobilized Metal ion Affinity Chromatography on Cuprum (магнитные микрочастицы с иммобилизированными ионами медь на поверхности)

ГА - Генетический Алгоритм

ОНС - (алгоритм) Обучаемой Нейронной Сети

Подписано в печать 08.10.2015. Формат А5, печать офсетная. Тираж 100 экз.

Отпечатано с готового оригинал-макета

в типографии «Группа МФЦ» 107023, Москва, ул. Буженинова, д. 28/5 Тел.: (495) 963-55-81