Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение полиморфизма отдельных регуляторных белков, функционирующих в эпителиальных и мышечных клетках человека в норме и при раке простаты

ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Изучение полиморфизма отдельных регуляторных белков, функционирующих в эпителиальных и мышечных клетках человека в норме и при раке простаты"

№46

2026

На правах рукописи

Лисицкая Ксения Валерьевна

ИЗУЧЕНИЕ ПОЛИМОРФИЗМА ОТДЕЛЬНЫХ РЕГУЛЯТОРНЫХ БЕЛКОВ, ФУНКЦИОНИРУЮЩИХ В ЭПИТЕЛИАЛЬНЫХ И МЫШЕЧНЫХ КЛЕТКАХ ЧЕЛОВЕКА В НОРМЕ И ПРИ РАКЕ ПРОСТАТЫ

Специальность 03.01.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 1 НОЯ 2010

Москва 2010

004612026

Работа выполнена в лаборатории биомедицинских исследований Учреждения Российской академии наук Института биохимии им. А.Н. Баха РАН.

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор

С.С. Шишкин

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор доктор биологических наук, профессор

В.Л. Ижевская Н.Н. Чернов

Ведущая организация:

Научно-исследовательский институт биомедицинской химии им. В.Н.Ореховича Российской академии медицинских наук.

Защита состоится «11» ноября 2010 г. в «_» ч. на заседании

диссертационного совета (Д 002.247.01) при Учреждении Российской академии наук Институте биохимии им. А.Н. Баха РАН по адресу: 119071, Москва, Ленинский проспект, д.ЗЗ, стр.2.

С диссертацией можно ознакомиться в научной Библиотеке биологической литературы РАН по адресу: 119071, Москва, Ленинский проспект, д.ЗЗ, стр. 1.

Автореферат разослан «_»_2010 г.

Ученый секретарь ¿И7" ' е

диссертационного совета . - г^"4

кандидат биологических наук ' А.Ф. Орловский

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы.

В биохимических исследованиях белков традиционно в особые группы объединяют различные макромолекулы, выполняющие сложные регуляторные функции, связанные с клеточной пролиферацией, апоптозом, ростом и развитием [Culig et al., 1996; Zinkel et al., 2006]. Изучение свойств и особенностей функционирования таких белков-регуляторов, а также кодирующих их генов, часть из которых относят к онкогенам, значительно усилилось в постгеномную эру в связи необходимостью выяснения молекулярных основ возникновения различных злокачественных опухолей, в частности, рака предстательной железы (РПЖ) [Yu, Rohan, 2000; Peltonen, McKusick, 2001; Turner, Grose, 2010].

РПЖ является одним из наиболее часто встречающихся злокачественных новообразований у мужчин. Согласно статистике, в 2009 г. в США РПЖ занимал лидирующее значение по количеству выявленных случаев заболевания и второе место по количеству летальных случаев [Jemal et al., 2009]. В России РПЖ находится на 4-м месте в структуре онкологической заболеваемости мужчин [Чиссов и др., 2008]. Более того, за период с 1998 по 2008 гг. отмечается значительный рост заболеваемости РПЖ, составляющий в странах Запада в среднем 3% за год [Boyle et al., 1996], а по оценкам, сделанным в нашей стране - более 7% в год [Чиссов и др., 2008]. Широкая распространенность РПЖ, вариабельность клинических симптомов и высокий процент летальности больных во многом определяют пристальное внимание к этому заболеванию не только онкологов, но и биохимиков, молекулярных биологов, а также специалистов других биологических дисциплин.

Хотя к настоящему времени получен ряд данных, указывающих на участие в развитии РПЖ различных ростовых факторов и регуляторных белков [Russell et al., 1998; Reynolds, Kyprianou, 2006], однако остается много нерешенных вопросов, связанных с определением их непосредственного вклада в онкогенез. Среди них наиболее активно исследуемыми являются белки, входящие в так называемую ось «гормон роста/инсулиноподобный фактор роста-1» (axis GH/IGF-1) [Cohen et al., 2000]. В числе особенно актуальных и интенсивно изучаемых вопросов - перспективы использования белковых факторов, вовлеченных в патогенез РПЖ, для диагностики и определения риска возникновения заболевания. О важности поисков новых биомаркеров и разработок на этой основе молекулярных ди-агностикумов РПЖ говорят накапливающиеся сведения о недостатках традиционно используемого в клинике теста на простат-специфический антиген (ПСА) [Stamey et al., 2004].

Проблему осложняет то, что для многих белковых ростовых факторов и других регуляторных белков характерен выраженный биохимический полиморфизм,

проявляющийся их качественными и/или количественными изменениями. Эти изменения, в свою очередь, играют важные роли в процессах пролиферации клеток, приобретении ими способности к инвазии и метастазированию, что приводит, в конечном счете, к формированию злокачественного фенотипа клеток [Djavan et al., 2001; Weber, 2007; Bidosee et al., 2009].

Известно, что биохимический полиморфизм белков человека может быть обусловлен как генетическими, так и эпигенетическими причинами [Beaudet et al., 1989; Zhang et al., 2009]. К генетическим причинам относят множественность генов, или полилокусность, а также полиаллелизм и альтернативный сплайсинг. Среди эпигенетических причин наиболее распространены постсинтетические модификации белков [Вудс, 1983; Шишкин и др., 2007].

С началом постгеномного периода особое внимание исследователей привлекает полиморфизм белков, обусловленный однонуклеотидными заменами в соответствующих генах (так называемые single nucleotide polymorphisms, SNP's) [Zhang et al., 2009]. В частности, ведутся многочисленные работы, направленные на выяснение ассоциации отдельных полиморфных вариантов с риском различных онкологических заболеваний [Gsur et al., 2001; Chen et al., 2006; Pilato et al., 2010]. По мнению ряда авторов, результаты таких исследований представляют интерес для развития представлений о молекулярных предпосылках возникновения раковых опухолей и могут найти применение для формирования групп высокого риска этих заболеваний, в частности, РПЖ [Mononen, Schleutker, 2009].

Таким образом, ведущиеся в настоящее время исследования по поиску и изучению свойств регуляторных белков человека позволяют надеяться на получение важных результатов, которые расширят представления о молекулярных механизмах РПЖ и будут способствовать разработкам новых подходов к пресимптомати-ческой диагностике, профилактике и лечению этого заболевания.

Цель и задачи исследования.

Основной целью данной диссертационной работы стало изучение полиморфизма отдельных регуляторных белков, функционирующих в эпителиальных и мышечных клетках человека в норме и при раке предстательной железы с помощью постгеномных технологий.

В соответствии с целью были поставлены следующие задачи:

1. Разработать биотест-систему, использующую в качестве тестируемого объекта культивируемые эпителиальные и мышечные клетки, которая позволяла бы определять биологические эффекты различных регуляторных белков, присутствующих в сыворотке крови.

2. Провести иммуноферментное определение сывороточной концентрации отдельных регуляторных белков у пациентов с раком предстательной железы и

в группе контроля и оценить проявления количественного полиморфизма этих белков.

3. Провести посредством двумерного электрофореза сравнительный протеом-ный анализ белков в клеточных линиях, моделирующих рак и доброкачественную гиперплазию предстательной железы (ДГПЖ), для обнаружения качественного и количественного полиморфизма белков как потенциальных маркеров рака предстательной железы.

4. Изучить встречаемость отдельных регуляторных белков в образцах тканей простаты у больных раком и гиперплазией.

5. Исследовать возможность ассоциации различных полиморфных вариантов в некоторых генах, относящихся к системе гормон роста/инсулиноподобный фактор роста-1, а также в генах отдельных актин-связывающих белков с риском рака предстательной железы у этнических русских.

Научная новизна.

Оптимизирована клеточная биотест-система, использующая в качестве тестируемого объекта культивируемые клетки рака простаты (ЬЫСаР), и с помощью этой биотест-системы выявлен стимулирующий пролиферацию эффект сыворотки больных раком простаты на клетки.

В тканях простаты человека впервые обнаружены две электрофоретические изоформы белка различающиеся по р1 и, возможно, представляющие собой результат посттрансляционных модификаций. При иммуноферментном анализе сывороточного уровня ЦЬ1 у больных раком и гиперплазией предстательной железы получены новые данные, свидетельствующие о достоверном повышении уровня данного белка в сыворотке крови больных РПЖ по сравнению с группой ДГПЖ.

Впервые проведен сравнительный анализ полиморфизма восьми генов (От, ЮРВРЗ, ЮРШ, ШБ1, Л/57Ж РШ1, ANXA2, ТАЫЩ, вызванного десятью известными однонуклеотидными заменами (БОТ'з), у этнических русских и в представительной группе пациентов с раком простаты. Показано, что распределение частот аллелей и генотипов полиморфного сайта 1388Т/С (Ьеи463Рго) в гене РМЫ1 достоверно различалось в группе больных и в контрольной выборке, в частности, была выявлена ассоциация генотипа ТТ с повышенным риском развития рака простаты. Кроме того, при анализе полиморфного сайта 291Ю/А (С1и917А^) гена обнаружено достоверно значимое накопление аллеля А у больных раком по сравнению с контрольной группой. Таким образом, полученные данные свидетельствуют о возможном участии полиморфизма генов РМЫ1 и ШБ1 в формировании предрасположенности к раку предстательной железы.

Научно-практическая значимость.

Оптимизированная клеточная биотест-система может быть использована для изучения биологических эффектов ростовых факторов на культивируемые клетки рака предстательной железы и для исследований молекулярных нарушений клеточной пролиферации при данном заболевании.

При протеомном изучении белков в клеточных линиях РС-3 (модель рака простаты) и ВРН-1 (модель доброкачественной гиперплазии) идентифицировано 49 белковых фракций, что позволило сформировать два дополнительных модуля в многоуровневую информационную базу данных «Протеомика рака простаты-2009», созданную в Учреждении Российской академии наук Институте биохимии им. А.Н. Баха РАН совместно с ООО «Инновационные биотехнологии» (http://ef.inbi.ras.ru).

При сравнительном исследовании идентифицированного белка Ц]'-1 в четырех клеточных линиях показано его более низкое содержание в клетках, моделирующих доброкачественную гиперплазию (ВРН-1), по сравнению с клетками, моделирующими рак простаты (РС-3, Ои-145 и ЬИСаР).

Результаты проведенных протеомных и иммуноферментных исследований на образцах тканей простаты и сыворотках крови больных раком и гиперплазии простаты позволяют считать белок Ц)-1 перспективным маркером рака предстательной железы и дают основание поставить вопрос о расширении его исследований с целью валидации для последующего использования в диагностике заболевания.

Полученные данные о полиморфизме двух из десяти исследованных ДНК-локусов могут найти применение при урологических обследованиях мужчин для формирования групп высокого риска рака простаты.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту.

1. Оптимизирована клеточная биотест-система, использующая в качестве биотест-объекта культивируемые клетки рака простаты (ЬКСаР), и с помощью этой биотест-системы у обследованных пациентов с раком предстательной железы выявлен стимулирующий пролиферацию эффект сыворотки больных раком простаты на клетки.

2. При протеомном изучении белков в клеточных линиях РС-3 (модель рака) и ВРН-1 (модель доброкачественной гиперплазии) идентифицировано 49 белковых фракций, что позволило сформировать два дополнительных модуля в отечественный информационный ресурс «Протеомика рака простаты».

3. Изучение белка Ц)-1 в четырех клеточных линиях показало его более низкое содержание в клетках, моделирующих гиперплазию (ВРН-1), по сравнению с клетками, моделирующими рак предстательной железы (РС-3, Би-145 и ЬЫСаР).

4. Протеомные и иммуноферментные исследования образцов тканей проста-

ты и сыворотки крови у больных раком и гиперплазией позволяют считать белок Dj-1 перспективным биомаркером рака простаты.

5. Сравнительный анализ полиморфизма восьми генов (GHR, IGFBP3,1GFR1, 1RS1, MSTN, FMN1, ANXA2, TAGLN), вызванного десятью известными однонук-леотидными заменами (SNP's), у этнических русских и в представительной группе пациентов с раком простаты показал достоверно значимое различие рапреде-ления частот аллелей и генотипов по полиморфным сайтам 1388 Т/С (Leu463Pro) в гене FMN1 и 2911G/A (Glu917Arg) в гене 1RS/ (rsl801278) у больных РПЖ по сравнению с контрольной группой.

Апробация работы.

Материалы данной работы докладывались на международных и российских конференциях, в том числе: конференции молодых ученых с международным участием «Актуальные вопросы лучевой диагностики и онкологии» (Москва, 2008), IV Съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов, (Новосибирск, 2008), VII Съезде онкологов России (Москва, 2009), 25-ом Ежегодном съезде Европейской ассоциации урологов (25th Anniversary EAU Congress, Barcelona, 2010).

Публикации.

По теме диссертации опубликовано 15 научных работ (из них 2 в зарубежной печати), включая 4 статьи в профильных рецензируемых российских и международных журналах, 1 статью в сборнике, 2 информационно-методических письма и 8 тезисов докладов.

Структура и объем диссертации.

Диссертация изложена на 146 страницах, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, заключения, выводов, списка цитируемой литературы (386 наименований). Работа содержит 17 таблиц и 27 рисунков.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования.

Материалы исследования. В работе использовались три линии культивируемых клеток РПЖ (LNCaP, РС-3, DU-145) и линия ДГПЖ (ВРН-1). Линия LNCaP-FGC (АТСС, № CRL-10995) была получена от д.б.н. И.Г. Шемякина (ГНЦ прикладной микробиологии и биотехнологии, г. Оболенск). Клетки линий РС-3 (№ АСС 465), DU-145 (№ АСС 261) и ВРН-1 (№ АСС 143) были закуплены в German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (Германия). В ряде экспериментов также использовались две линии рабдомиосаркомы человека (А-204 и

RD), приобретенные в НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН, линия культивируемых миобластов человека, любезно предоставленная к.б.н. Т.Б. Кро-хиной и выведенная, как описано ранее [Крохина и др., 1996], и культивируемые фибробласты человека, которые были выведены и любезно предоставлены к.б.н. B.C. Ахуновым (МГНЦ РАМН).

Материалами для протеомных исследований послужили образцы тканей предстательной железы, полученные от больных РПЖ (п=107) и ДГПЖ (п=35), которым выполнялись диагностические биопсии и хирургические операции на кафедре урологии РМАПО (Городская клиническая больница им. С.П. Боткина) и в НИИ урологии Росмедтехнологий. Материалом для протеомных исследований также послужили культуры клеток РПЖ и ДГПЖ.

В работе также использовались образцы цельной крови и сыворотки, полученные методом венепункции, из указанных ранее медицинских учреждений, а также из Московской областной детской психоневрологической больницы и Московской областной детской ортопедохирургической больницы. Образцы цельной крови использовались для выделения геномной ДНК и последующего анализа од-нонуклеотидных замен, а образцы сыворотки крови - для иммуноферментного анализа (ИФА), а также для тестирования в клеточной тест-системе.

Все биометериалы сопровождались развернутым описанием в соответствии со специально разработанным «Паспортом биоматериала», включавшем сведения об обследованном пациенте (номер истории болезни, результаты диагностических исследований и др.). Диагностика заболеваний осуществлялась специалистами-урологами с использованием клинических, гистологических и иммунохимических (определение уровня ПСА) методов.

Препараты рекомбинантного механозависимого фактора роста (MGF), использовавшиеся для тестирования в клеточной биотест-системе, были любезно предоставлены д.б.н. А.Б. Шевелевым (ИНБИ им. А.Н. Баха РАН).

Методы исследования. Культивирование клеток проводили в средах RPMI-1640 (клетки РПЖ, ДГПЖ), F-12 (миобласты), DMEM (фибробласты, клетки раб-домиосаркомы) с добавлением Hepes, пирувата натрия, гентамицина и 12,5-20% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС). Оценку пролиферативной активности клеток проводили посредством окрашивания клеток генцианвиалетом с последующей элюацией красителя, как описано ранее [Шишкин и др., 2004], а также с помощью набора WST-1 фирмы «Millipore» (США) при длине волне 450 нм с фильтром сравнения 690 нм. Микрофотографирование клеток проводилось при помощи микроскопа Ломо Биолам П2-1 с фотонасадкой.

Фракционирование белков проводили методом двумерного электрофореза по O'Farrell в модификации Kovalyov et al. (1995). Детекция белков на гелевых пластинах осуществлялась с использованием азотнокислого серебра. Для проведения

идентификации из сравниваемых серий двумерных электрофореграмм (ДЭ) белков вырезали отдельные белковые фракции и подвергали ограниченному трипси-нолизу. Обработку гелей, гидролиз трипсином и экстракцию пептидов проводили согласно протоколам «Центра протеомных исследований» при НИИ биомедицинской химии им. В.Н. Ореховича РАМН [Говорун и др., 2003]. Образовавшиеся пептиды анализировали с помощью масс-спектрометрии методом MALDI-TOF MS, а в некоторых случаях и методом MS/MS. Полученные масс-спектры анализировали посредством программы Mascot и с использованием баз данных NCBI Protein, OMIM, UNI-PROT.

Посредством ИФА определяли сывороточную концентрацию белков Вс1-2, IGF-1, IGFBP-3 и Dj-1 с использованием наборов фирм Immunodiagnostic Systems и Abnova в образцах сыворотки крови больных РПЖ (п=56) и ДГПЖ (контрольная группа, п=28). Определение интенсивности окраски проводили с помощью планшетного ридера Multiscan ascent («ThermoElectron», США).

Для проведения генетических исследований геномную ДНК выделяли методом фенол-хлороформной экстракции из проб венозной крови больных РПЖ (п=121) и лиц, не имевших патологии предстательной железы (контрольная группа, п=201), русской этнической популяции. Анализ полиморфных ДНК-локусов (SNP's) осуществляли методом простой полимеразной цепной реакции (ПЦР) и рестрикционного анализа ДНК-ампликонов (RFLP) с использованием рестрикта-зы Apal с последующим фракционированием рестрикционных фрагментов электрофорезом в ПААГ. ПЦР в реальном времени (RT-PCR) проводили по методу выщепления 5'-концевой метки (TaqMan Assay). Генотипирование 10 SNP's в генах GHR, IGFBP3, IGFR1, IRS1, FMN1, ANXA2, TAGLN проводили с использованием наборов реагентов фирмы «Applera» и амплификатора «Applera» (модель 7300).

Статистическую обработку результатов ИФА проводили с использованием пакетов программ BIOSTAT и Microsoft Office Excel 2003. Для сравнения количественных признаков в двух независимых группах применяли непараметрический критерий Уилкоксона-Манна-Уитни (U-критерий). Результаты с уровнем значимости менее 0,05 рассматривали как статистически значимые.

Статистическую обработку результатов генотипирования проводили с использованием пакетов программ BIOSTAT и Microsoft Office Excel 2003, а также таблицы сопряженности 2x2 с поправкой Иэйтса [www.biometrica.tomsk.ru]. При попарном сравнении частот аллелей и генотипов в группах применяли критерий %2 (р). Силу ассоциаций генотипических характеристик с риском развития РПЖ оценивали по значениям показателя соотношения шансов (odds ratio, OR); рассчитывали показатель OR и 95% доверительный интервал (СГ) риска развития заболевания по точному тесту Фишера с двухсторонней оценкой достигнутого уровня

значимости (Р) или по критерию %2 Пирсона при принятом 5% уровне статистической значимости. Для оценки неравновесия по сцеплению пары полиморфных ло-кусов использовали показатель Б' (коэффициент Левонтина), для определения которого применяли пакеты программ ЬЭА [http://www.iop.kcl.ac.uk ЛоР/Оерайтег^Б/РзусИМсс!/ GEpiBSt/software.stш].

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Изучение биологической активности отдельных регуляторных белков в модельных клеточных биотест-системах.

Изучение роли регуляторных белков в патогенезе РПЖ, а также разработка технологий получения рекомбинатных белков предполагает наличие различных способов определения их биологического действия. К перспективным подходам, используемым для решения указанной проблемы, относят создание модельных биотест-систем на основе культивируемых клеток человека.

На начальном этапе исследований было проведено изучение возможностей определения биологической активности ряда ростовых факторов, потенциально вовлеченных в патогенез РПЖ, с помощью модифицированной созданной ранее клеточной биотест-системы на основе фибробластов и миобластов человека [Черников и др. 1998; 2001].

При тестировании ряда препаратов ОН, ЮР-1 и МОР с помощью модифицированной тест-системы удалось обнаружить усиление пролиферации нормальных клеток человека в ответ на действие различных рекомбинантных ростовых факторов. Этот подраздел исследований выполнялся совместно с А.А. Макаровым, которому выражаю свою большую благодарность.

В дальнейшем в работе была проведена оптимизация тест-системы; в качестве тест-объекта были выбраны культивируемые клетки линии ЬИСаР. Выбор этой клеточной линии определило то, что она была выведена из метастазов аденокар-циномы простаты человека и наиболее часто используется в биомедицинских исследованиях РПЖ [Horoszewicz е1 а1., 1983; Ыауопе, 2005]. Использование ранее разработанной методики с окраской клеток линии ЬЫСаР генцианвиолетом оказалось весьма затруднительным, поскольку данная линия характеризуется слабым прикреплением клеток к поверхности культурального пластика, что приводило к недостоверности и невоспроизводимости результатов измерения пролифе-ративной активности за счет потери значительной массы клеток при проведении отмывок и фиксации.

Чтобы обойти указанное ограничение, в разрабатываемой тест-системе предложили использовать метод окраски живых клеток \VST-1, основанный на способности митохондриальных ферментов живых клеток конвертировать соли тет-

разолия в формазан с изменением спектра поглощения и не предполагающий фиксации клеток.

При построении калибровочных кривых, отражающих зависимость между оптической плотностью при 450 нм и количеством клеток в лунках, была получена зависимость, близкая к прямо пропорциональной в диапазоне концентраций клеток 103-104 в лунке. Стандартное отклонение при этом составило не более 10% от абсолютной величины измерений.

Пригодность модифицированной тест-системы для определения пролифера-тивной активности клеток оценивали на основании получения дозо-зависимой кривой, которая была получена при добавлении к клеткам различных концентраций ЭТС, содержащей целый ряд ростовых факторов и питательных субстратов для клеток. Кроме того, было установлено, что часть сывороток, полученных от больных РПЖ, обладают ростстимулирующим эффектом (Рис. 1), вероятно, за счет присутствия факторов, стимулирующих клеточную пролиферацию.

О 5 10 15 20 Концентрация сыворотки, %

■ FCS — — FCS+ сыворотка больных РПЖ

Рис. 1. Результаты определения пролиферативной активности сыворотки больного «К» с РПЖ в сравнении с эмбриональной телячьей сывороткой (ЭТС). По оси абсцисс - концентрация сыворотки (%); по оси ординат - единицы оптической плотности в виде М±ш (п=6).

2. Определение концентрации IGF-1 и некоторых регуляторных белков в сыворотке крови пациентов с раком предстательной железы (иммунофер-ментный анализ).

На основании полученных результатов представлялось целесообразным про-

ведение сравнительных исследований содержания в сыворотке крови пациентов с РПЖ и контроле различных регуляторных белков, которые могут оказывать про-лиферативное или апоптотическое действие на клетки РПЖ. Так, ранее было описано, что изменение концентрации IGF-1 и других белков, участвующих в функционировании системы IGF-1, вносит вклад в патогенез РПЖ [Grimberg, Cohen, 2000; Baserga, 2000]. При проведении ИФА в качестве группы контроля были выбраны пациенты с ДГПЖ, поскольку наибольшие трудности обычно возникают именно при дифференциальной диагностике РПЖ и ДГПЖ. Средний возраст в

группе больных РПЖ составил 64 года (в диапазоне 55-73 лет), в группе контроля - 67 лет (в диапазоне 59-74 лет).

По данным ИФА средняя концентрация IGF-1 в сыворотке крови больных РПЖ (п=56) составила 97,4±48,0 нг/мл, тогда как в группе ДГПЖ (п=22) этот показатель составил 90,0±30,5 нг/мл. Таким образом, не было выявлено статистически достоверных различий в уровне белка в двух группах. Вместе с тем, в группе РПЖ у 15 пациентов с уровнем Глисона, равным или выше 7, сывороточная концентрация IGF-1 составила 135,2±33,7 нг/мл, что достоверно отличалось от общей выборки (р<0,01) и от пациентов с ДГПЖ (р<0,01). В целом, результаты определения концентрации IGF-I сопоставимы с литературными данными о диапазоне сывороточной концентрации IGF-I в пределах 100-200 нг/мл [Yu, Rohan, 2000]. По-видимому, для убедительного заключения об ассоциации IGF-I с РПЖ потребуется существенное увеличение объемов выборок.

Проведенный ИФА показал, что средняя концентрация IGFBP-3 у больных ДГПЖ несколько превысила уровень белка в крови больных РПЖ и составила 5425±1426 и 5292±1784 нг/мл, соответственно. Однако, эти различия были статистически недостоверными. Вместе с тем, у пациентов с РПЖ с уровнем Глисона, равным или превышающим 7, концентрация IGFBP-3 оказалась равной 6476±984 нг/мл, что достоверно отличалось и от общей выборки больных с РПЖ (р<0,05), и от группы лиц с ДГПЖ (р<0,05).

Ряд эпидемиологических исследований показал, что высокий сывороточный уровень IGF-I при низком уровне IGFBP-3 ассоциирован с повышенным риском развития многих опухолей, в том числе РПЖ [Stattin et al., 2000]. В связи с ведущейся в литературе дискуссией о ценности отношения IGF-1/IGFBP-3 для диагностики РПЖ, актуальным представлялся расчет данного соотношения в крови больных РПЖ и ДГПЖ.

Для этого в группе РПЖ были выделены две подгруппы: в одну включили мужчин с высоким (>95 нг/мл), а в другую с относительно низким (<95 нг/мл) уровнями IGF-1. Далее охарактеризовали данные подгруппы по содержанию IGFBP-3: с высоким уровнем (>5500 нг/мл) и с низким уровнем белка (<5500 нг/мл). Мы не выявили достоверных различий по распределению пациентов с РПЖ и ДГПЖ по этим группам (Рис. 2). Высокое соотношение IGF-1/IGFBP-3 в нашем исследовании не было ассоциировано с риском РПЖ.

Другим широко исследуемым в качестве потенциального маркера как рака молочной железы [Concato et al., 2009], так и РПЖ, является белок Вс1-2. Имеются данные о том, что белок Вс1-2 определяет способность опухоли к метастазирова-нию и развитию гормональной резистентности [Knillovä, Kolär, 2003]. По данным Hering (2001), повышенный уровень белка вносит вклад в прогрессирование РПЖ.

Проведенный ИФА показал, что в группе РПЖ (п=23) концентрация Вс1-2 в

сыворотке крови составила 2,91 ±0,90 нг/мл, а у лиц с ДГПЖ (п=11) этот показатель был равным 2,68±0,46 нг/мл. Таким образом, не было выявлено статистически достоверных различий в концентрации белка между группами ДГПЖ и РПЖ. Также не было обнаружено ассоциации сывороточной концентрации Вс1-2 с уровнем Глисона.

В целом, проведенный анализ с учетом литературных данных указывает на перспективность исследований содержания в крови ростовых факторов при РПЖ, включая и возможные применения в диагностических целях.

Рис. 2. Распределение пациентов с РПЖ по четырем группам на основании сывороточных концентраций ЮГ-1 и ЮРВР-З: 1 - ЮБ-1>95 нг/мл, ЮГВР-3<5500 нг/мл; 2 - ЮР-1>95 нг/мл, ЮРВРЗ>5500 нг/мл; 3 - ЮР-К95 нг/мл, ЮРВР-3<5500; 4 - ЮР-К95 нг/мл, ЮРВР-3 >5500 нг/мл

■ группа 1 ы группа 2 а группа 3 и группа 4

ДГПЖ

3. Сравнительное протеомное изучение белков в культивируемых клетках рака (РС-3) и доброкачественной гиперплазии простаты (ВРН-1).

Клетки линий РС-3 (модель РПЖ) и ВРН-1 (модель ДГПЖ) использовали для выявления качественного полиморфизма различных регуляторных белков протеомными методами. На типичных ДЭ белков линий РС-3 и ВРН-1 при окраске азотнокислым серебром регистрировалось более 200 фракций, которые обладали молекулярными массами в диапазоне от 8 до 200 кДа и изоэлектрическими точками в диапазоне от 4,5 до 11,0 (рис. 3).

С помощью масс-спектрометрии удалось идентифицировали 25 белков линии РС-3 и 24 белка линии ВРН-1. Среди исследованных белковых фракций оказались пептиды, соответствующие аминокислотной последовательности одного из известных регуляторных белков - продукта экспрессии онкогена Dj-1. При этом покрытие выявленными пептидами полной аминокислотной последовательности белка Dj-1 достигало 28% (Табл. 1). Таким образом, полученные результаты убедительно доказали, что белковая фракция 6 на двумерной электрофореграмме белков линий РС-3 представляет собой белок Dj-1. Аналогичные данные были получены для белковой фракции 5 на двумерной электрофореграмме белков линий ВРН-1; хотя покрытие выявленными пептидами аминокислотной последовательности белка Dj-1 в этом случае составило 24% (Табл. 1).

Рис. 3. Типичная ДЭ белков линии РС-3. Окраска азотнокислым серебром. Числами 1-25 обозначены белковые фракции, идентифицированные с помощью масс-спектрометрии.

р!

Табл. 1. Результаты идентификации MALDI-TOF масс-спектрометрией доми-

Линия Наименование белка в базах данных ЫСВ! Номер в NCB1 Protein database Вероятностный коэффициент достоверности/ количество выявленных масс пептидов % перекрытия* Mm/pi экспериментальные значения Mm/pi теоретические значения

РС-3 ЦИ цепь А 31543380 60/8 28 22,0/6,30 20,0/6,33

ВРН-1 Щ-1 цепь А 31543380 35/2 24 22,0/6,50 19,9/6,33

LNCaP ЦИ цепь А 31543380 103/13 40 20,5/6,30 19,9/6,33

LNCaP ЦИ, цепь А (электрофор, изоформа) 31543380 51/3 22 22,0/6,25 19,9/6,33

При сравнительной денситометрии и компьютерном анализе количественного содержания белка Dj-1 из четырех линий культивируемых клеток - LNCaP, РС-3, DU-145 и ВРН-1 - было выявлено, что минимальный уровень Dj-1 наблюдался в клетках линии ВРН-1, моделирующей доброкачественную гиперплазию (Рис. 4). В раковых клеточных линиях содержание белка Dj-1 оказалось в 3-5 раз выше.

Кроме белка Dj-1 идентифицировано несколько белков, которые выполняют в клетках различные регуляторные функции. В частности, в клетках РС-3 выявлен регуляторный белок AGR2, ранее охарактеризованный как потенциальный маркер РПЖ [Ковалев и др., 2006; Smimov et al., 2005; Zhang et al., 2005]. Вместе с тем, в

клетках ВРН-1, представляющих собой модель ДГПЖ, соответствующая белковая фракция не была обнаружена.

Dj-l \ Dj-1 SOD2 \ , __ V

А w шяшш ■ „ V \ Б •

Dj-1 PRDX1 Dj-1 , SOD2

4 в •ш 1 » é вииии

/ Тдп2 / Тдп2

Рис. 4. Участки ДЭ клеток линий DU-145 (A), LNCaP (Б), РС-3 (В) и ВРН-1 (Г), соответствующие зоне расположения белка Dj-1. Стрелками показаны белки: Dj-1, митохондриальная супероксиддисмутаза (SOD2), пероксиредоксин 1 (PRDX1) и трансгелин 2 (Tgn2).

Результаты протеомного изучения белков клеток РС-3 и ВРН-1 использовались для расширения построенной ранее компьютерной базы данных «Протеоми-ка рака простаты-2009». С этой целью серии ДЭ белков линий РС-3 и ВРН-1 сначала использовали для построения синтетических двумерных белковых карт (Рис. 5). В качестве первого шага отобранные электрофореграммы документривали в виде изображений в формате .tif. Для стандартизации изображений в качестве ре-перных точек использовали по 10 идентифицированных белковых фракций. После компьютерной обработки с применением пакета программ ImageMaster, версия 7, получали синтетические изображения распределения белков линий РС-3 и ВРН-1. Эти карты стали основой для формирования соответствующих модулей для многоуровневой базы данных (уровень 1).

Далее с использованием программы MapThis! Molly Pinguin Software и других программных средств синтетические карты были встроены в базу данных «Протеомика рака простаты-2009». На каждой из этих карт по позициям идентифицированных белков устанавливались «кнопки» для перехода в файлы, содержащие сведения об электрофоретических свойствах, результатах идентификации соответствующих белков и другую информацию.

Для единообразного обозначения нанесенных на карты идентифицированных белков использовалась система выбранных для них символов и универсальной семизначной нумерации, описанная ранее Kovalyov L.I. et al. (1995).

В каждом модуле все файлы (записи) для индивидуальных идентифициро-

ванных белков создавались по единому формату, который представлял собой систему полей для записей разных видов - текстовые, графики, рисунки.

В файлах выделяли поля уровней 2 и 3. Поля уровня 2 предназначались для записи информации, полученной в собственных исследованиях белковой фракции. Поля уровня 3 заполняли литературной информацией о свойствах каждого из идентифицированных белков, включая данные о кодирующем гене, особенностях его экспрессии, полиморфизме, ссылки на публикации общей и онкологической направленности. Каждое поле уровня 3 содержало интернет-ссылки на соответствующие записи в международных компьютерных базах данных, благодаря чему формировался четвертый уровень записей, позволяющих оперативно и эффективно искать материалы современных геномных баз данных (ЖЛ31, З^авв-Рго!, ОМ1М). Таким образом, созданные по результатам проведенной работы и включенные в базу данных «Протеомика рака простаты-2009» дополнительные модули обеспечивают более широкие возможности для использования протеомной информации в исследованиях проблем РПЖ.

Рис. 5. Синтетическая двумерная карта белков линии ВРН-1. Указаны идентифицированные белки (принятые сокращения по NCBI Protein).

4.1 Идентификация двух изоформ белка Р|'-1 в биопсийных образцах тканей рака предстательной железы.

С учетом выявленных различий в содержании белка ЦИ в культурах клеток, модулирующих РПЖ и ДГПЖ, а также информации о потенциальной значимости этого белка как маркера различных злокачественных новообразований, логичным продолжением работы стало протеомное исследование образцов тканей простаты при раке и гиперплазии для выявления качественных и количественных различий.

На типичных ДЭ белков, экстрагированных из биопсийных материалов тканей РПЖ и ДГПЖ, в центральной части можно было предположить присутствие белка среди белковых фракций, обладавших соответствующими электрофо-ретическими характеристиками. Такие фракции были вырезаны из гелевых пластин подвергнуты ограниченному трипсинолизу. Результаты, полученные при масс-спектрометрическом анализе триптических пептидов, показали, что две из трех фракций соответствуют белку Ц)-1, а третья представлена одним из известных актин-связывающих белков - трансгелином 2.

Среди полученных результатов особое внимание привлек тот факт, что при РПЖ белок Ц)-1 присутствовал в виде двух электрофоретических фракций, различающихся по интенсивности окраски и значениям р1 (на 0,13). Для большей фракции Ц|-1 покрытие аминокислотной последовательности выявленными трип-тическими пептидами составило 70,4%, а для меньшей - 39,0% (Табл. 2). Большую фракцию оценили как основную изоформу, а меньшую - как дополнительную электрофоретическую изоформу, которую обозначили как Ц)-1-еь

Табл. 2. Результаты идентификации МАЬБ1-ТОР масс-спектрометрией фракций изоформ белка РЬ1 из ДЭ белков биоптатов тканей РПЖ. __

Наименование белка в базах данных ЛСВ1 № по СепеВапк Ф) Вероятностный коэффициент достоверности/ количество выявленных масс пептидов % перекрытия Мт/р1 экспер. Мт/р1 теор.

ЦМ, цепь А 50513593 109/13 70 20,5/6,30 19,9/6,33

ЦИ, цепь А 50513593 44/5 39 20,5/6,25 19,9/6,33

В современной литературе имеется сообщение об обнаружении протеомны-ми методами нескольких изоформ белка при раке молочной железы [Ье №оиг е1 а1., 2001], но сведения о наличии изоформ белка Ц)-1 в клетках простаты отсутствуют. Вместе с тем, по информации в базе данных 8\у155-Рго1 (запись (399497), этот белок может подвергаться определенным посттрансляционным модификациям (фосфорилирование по Туг67, сульфинирование по СувЮб, ацетили-рование по Ьуз148). Указанные модификации могут приводить к образованию

электрофоретических изоформ с р1, меньшими, чем у основной изоформы. Таким образом, выявленная в данной работе изоформа возможно, представляет

собой продукт какой-либо пострансляционной модификации белка Ц)-1, происходящей в тканях при РПЖ.

При сравнительном изучении содержания белка Ц)-1 в образцах тканей РПЖ и ДГПЖ для нивелирования возможных межиндивидуальных различий анализировали образцы тканей простаты, полученные от одного и того же пациента, но из разных областей железы: из участка ткани с аденокарциномой и из участка гиперплазированной ткани. На рис.6 представлены фрагменты ДЭ с ЦЦ, полученные для четырех пациентов с РПЖ. Суммарно по результатам денситометрии и компьютерного анализа содержание Е^-1 в биоптатах с аденокарциономой в несколько раз превосходило уровни этого белка в образцах с гиперплазией (Рис.6).

Рис. 6. Фрагменты ДЭ белков ткани предстательной железы при РПЖ и ДГПЖ. Стрелками отмечено положение электрофоретических изоформ белка ЦИ.

4.2. Иммуноферментное определение содержания белка Di-1 в сыворотке крови у больных раком и гиперплазией предстательной железы.

Данные о повышенном содержании белка Dj-1 в культурах клеток и образцах тканей РПЖ послужили основанием для проведения сравнительного пилотного изучения этого потенциального онкомаркера в сыворотке крови пациентов с РПЖ.

К настоящему времени в работах ряда авторов показано, что белок Dj-1 может присутствовать в сыворотке крови и других биологических жидкостях людей при некоторых заболеваниях, включая рак различной локализации [Pardo et al., 2006; Arnouk et al., 2009]. Однако публикации, посвященные исследованию белка Dj-1 в сыворотке крови больных злокачественными и доброкачественными опухолями простаты, отсутствуют.

Как видно из представленных Табл.3 данных, концентрация белка Dj-1 в сыворотке крови больных РПЖ оказалась достоверно выше его уровня в группе ДГПЖ (р=0,004, U-критерий Уилкоксона-Манна-Уитни).

Табл. 3. Результаты иммуноферментного определения содержания белка Dj-1 в

Группы п, количество пациентов Концентрация белка Dj-1 в сыворотке крови, нг/мл

Среднее значение Диапазон значений Стандартное отклонение р,и- критерий

ДГПЖ 28 26,3 2,5-100,0 22,8 0,004

РПЖ 34 44,9 15,0-122,0 29,8

Важно отметить, что внутри каждой из изучаемых групп оказалось разное распределение пациентов по уровням Dj-l в сыворотке крови. Как видно из рис. 7, около 40% пациентов с ДГПЖ имели уровень белка Dj-l менее 15,0 нг/мл, более половины (53%) больных оказалось в подгруппе с уровнями в диапазоне 15,1-60 нг/мл, а уровень выше 60 нг/мл был выявлен только у двух пациентов (7%). При этом в группе больных РПЖ не оказалось ни одного человека с содержанием белка 0]-1 ниже 15,0 нг/мл, у более 70% обследованных данный показатель соответствовал содержанию 15,1-60 нг/мл и почти 30% характеризовались уровнями более 60 нг/мл.

Поскольку по литературным данным белок Dj-1 вносит вклад в прогрессию злокачественных новообразований за счет усиления клеточной пролиферации, представляло существенный интерес сравнить данные о концентрациях 0]-1 в сыворотке крови лиц с высоко- и низкодифференцированными опухолями. Для этой цели наша выборка больных РПЖ была разделена на две подгруппы: А) больные с опухолями с уровнем Глисона 4-6 (п=19) (высоко- и умеренно дифференциро-

ванные аденокарциномы с относительно низким уровнем пролиферации клеток) и Б) пациенты с опухолями с уровнем Глисона 7-10 (п=15) (низкодифференциро-ванные аденокарциномы с высоким пролиферативным уровнем клеток). Статистически достоверных различий в концентрации Ць1 в обследованных подгруппах не оказалось.

Рис. 7. Распределение пациентов (в %) с ДГПЖ и РПЖ по трем уровням содержания белка 03-1 в крови: менее 15 нг/мл, 15,1-60 нг/мл и более 60 нг/мл.

ДГПЖ

РПЖ

□ до 15,0 нг/мл в 15,1-60,0 нг/мл ■ более 60,0 нг/мл

В целом, полученные результаты протеомного и иммуноферментного исследований позволяют считать белок Dj-1 перспективным биомаркером РПЖ и дают основание поставить вопрос о расширении его исследований с целью вали-дации для последующего использования при диагностике этого заболевания.

5. Изучение одионуклеотидного полиморфизма восьми генов (GHR, IGFBP3, IGFR1. IRS1. MSTN. FMN1, ANXA2, TAGLN) у этнических русских и у пациентов с раком предстательной железы.

В настоящее время получен ряд данных о том, что наследственная предрасположенность к злокачественным новообразованиям, в том числе и к РПЖ, может быть обусловлена однонуклеотидными заменами (SNP's) в генах, кодирующих различные регуляторные белки [Gsur et al., 2001].

В связи с этим логичным продолжением работы стало изучение полиморфных локусов в кодирующих областях генов различных регуляторных белков и поиск ассоциаций полиморфных вариантов с повышенным риском развития РПЖ. С этой целью было проведено генотипирование методом дискриминации аллелей нескольких SNP's в генах, относящихся к системе GH/IGF-1 (GHR, IGFBP3, IGFR1, IRS1), и трех генов, которые участвуют в регуляции состояния цитоскеле-та (FMN1, ANXA2, TAGLN), и методом простой ПЦР - полиморфного сайта в гене MSTN.

В изучавшихся контрольных выборках проанализированные SNP's в генах GHR, IGFBP3, IRS1, FMN1, ANXA2 являются полиморфными и обнаруженные

частоты генотипов удовлетворяют равновесию Харди-Вайнберга. В отличие от этого, SNP's в генах IGFR1, MSTN и TAGLN в нашей выборке оказались относительно мономорфными, с частотами редких аллелей до 1,4 %.

Сравнительный анализ распределения частот аллелей и генотипов полиморфных вариантов 458A>G (rsl805086) гена MSTN, 1673 А/С (rs6180) гена GHR, 716 G/A (rsl 1072170) и 1388 A/G (rs2306277) гена FMN1, a также 428 G/T (rs 17845226) гена ANXA2 в русской этнической популяции не обнаружил популя-ционных отличий между русскими и европейцами (частоты по данным SNP NCBI и Applied Biosystems). Вместе с тем, выявлены достоверные популяционные отличия (р<0,001) в распределении генотипов по полиморфному локусу 227 C/G (rs2854746) гена IGFBP3 в нашей выборке русских и в выборке европейцев EGPCEPH-Panel NCBI SNP (п=44). Данные распределения частот и генотипов для полиморфных вариантов 747 G/C (Val77Leu) в гене TAGLN, 2911 G/A (rsl801278) в гене 1RS, 4062 G/A (rs34102392) и 1360 G/A (rs34516635) в гене IGFR1 в базе данных SNP NCBI отсутствовали.

Сравнительный анализ распределения частот генотипов и аллелей по полиморфному сайту 2911G/A (Gly971Arg) гена 1RS] у пациентов с РПЖ и в контрольной выборке выявил достоверно значимое накопление аллеля Т у больных РПЖ по сравнению с контролем (^2=4,03 8; р=0,044) (Рис. 8). Аллель Т ассоциирован с повышенным риском РПЖ (OR= 2,76; 95%С1 1,0220-7,6760).

100% 90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0%

1 ét=¡ _ 1

1 ! щ

- .......

|OR=2,76

та

сс ст

s Больные РПЖ

I Контроль

Рис. 8. Распределение частот аллелей и генотипов полиморфного локуса 291Ш/А (01у971Аге) гена в выборках РПЖ и контроля.

Известно, что ген IRS1 кодирует белок IRS1, так называемый субстрат ин-сулинового рецептора 1, который обеспечивает один из путей внутриклеточного сигналинга, запускаемого IGF-1 при участии его рецептора. Имеются данные о том, что IRS 1 влияет на прогрессию и метастатазирование РПЖ, вероятно, за счет ингибирования функции интегринов и Е-кадгеринов [Baserga, 2000]. В исследовании Neuhausen et al. (2005) также выявлена ассоциация отдельных SNP's в гене

(в частности, полиморфного варианта 097211) с повышенным риском РПЖ. Таким образом, результаты, полученные для полиморфного сайта 291Ю/А (01у971Аг§) гена /Л57, дают основания полагать, что полиморфизм белка 11181 может вносить вклад в патогенез заболевания.

При сравнительном анализе распределения частот аллелей и генотипов по сайту 716 в/А (С1у23901и) гена РМЫ1 в выборке РПЖ и контрольной группе была выявлена тенденция к увеличению частоты аллеля в у больных РПЖ - 69,1% по сравнению с 59,9% в контрольной группе (^2=3,398; р=0,065). Более того, анализ распределения частот аллелей и генотипов по сайту 1388АЛЗ (Ьеи463Рго) гена РМИ1 показал достоверно значимые различия между ними (р=0,019; "/2=7,884). Выявлено повышение частоты генотипа АА у больных РПЖ по сравнению с контролем (29,7% и 16,4%; %2=6,992; р=0,008). Генотип АА ассоциирован с повышенным риском развития РПЖ (СЖ= 2,16; 95%С1 1,2055-3,8726) (Рис. 9).

Исследованные полиморфные варианты гена БМШ находятся в сильном неравновесии по сцеплению (Э' соеГйс1еп1=0.98; /2= 168.20, р<0.00001), в связи с чем был проведен их гаплотипический анализ. В ходе этого анализа выявлено 8 гаплотипов, однако их частоты в выборке больных и контрольной группе статистически не различались (/2=4,75; р=0,1910).

0 Больные РПЖ

0 Контроль

Рис. 9. Распределение частот аллелей и генотипов полиморфного варианта Ьеи463Рго (1388 Т>С) гена РМЫ1 в выборках РПЖ и контроле.

В целом, результаты проведенных исследований указывают на возможную роль двух полиморфных сайтов в генах FMV^ и ШБ1 в патогенезе РПЖ и дают основание считать, что определение генотипов по полиморфным сайтам в генах РМЫ1 и ШБ! может найти применение при формировании групп риска РПЖ у этнических русских.

выводы

1. Разработана клеточная биотест-система, использующая в качестве биотест-объекта культивируемые клетки рака предстательной железы (LNCaP), с помощью которой выявлен стимулирующий пролиферацию клеток эффект сыворотки крови больных раком предстательной железы.

2. Иммуноферментный анализ сывороточной концентрации двух белков - регуляторов клеточной пролиферации - ростового фактора IGF-1 и его транспортного белка IGFBP-3, а также белка Вс1-2 - регулятора апоптоза - не показал статистически достоверных различий между группами пациентов с раком и гиперплазией предстательной железы.

3. При протеомном изучении белков в клеточных линиях РС-3 (модель рака простаты) и ВРН-1 (модель доброкачественной гиперплазии):

а) идентифицировано 49 белковых фракций, что позволило сформировать два дополнительных модуля в отечественный информационный ресурс «Протеомика рака простаты»;

б) показано, что идентифицированный белок Dj-1 характеризуется более низким содержанием в клетках, моделирующих гиперплазию (ВРН-1), по сравнению с клетками, моделирующими рак предстательной железы (РС-3, DU-145, LNCaP).

4. При протеомном исследовании биоптатов тканей простаты, полученных от пациентов с раком и гиперплазией предстательной железы, показано, что белок Dj-1 в большинстве случаев присутствовал в виде двух электрофоретических изоформ, при этом содержание белка Dj-1 было существенно выше при раке, чем при гиперплазии.

5. Иммуноферментный анализ сывороточной концентрации белка Dj-1 выявил статистически достоверные различия между группами больных раком и гиперплазией предстательной железы, что позволяет считать белок Dj-1 перспективным биомаркером рака простаты.

6. Методом дискриминации аллелей с помощью полимеразной цепной реакции в реальном времени обнаружено, что в обследованной группе пациентов с раком предстательной железы имеется достоверно значимое накопление аллеля А в полиморфном сайте 2911G/A (Glu917Arg) гена IRSJ (rs 1801278) по сравнению с контрольной группой. Распределение частот аллелей и генотипов полиморфного сайта 1388 Т/С (Leu463Pro) в гене FMN1 (rs2306277) также различалось в группе больных и в контрольной выборке, в частности, была выявлена ассоциация генотипа ТТ с повышенным риском развития рака простаты.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи в рецензируемых журналах:

1. Шишкин С.С., Ковалев Л.И., Крахмалева И.Н., Лисицкая К.В., Дзеранов Н.К., Тотров К.И., Казаченко A.B. Формирование информационных ресурсов и коллекций биоматериалов для разработки новых методов диагностики рака простаты. // Вестник РУДН, серия «Медицина», 2007, № 6, с. 494-497.

2. Kuznetsova T.V., Schulga A.A., Wulfson A.N., Keruchenko J.S., Ermolyuk Y.S., Keruchenko I.D., Tikhonov R.V., Lisitskaya K.V., Makarov A.A., Chobotova K., Khomenkov V.G., Khotchenkov V.P., Popov V.O., Kirpichnikov M.P., Shevelev A.B. Producing human mechano growth factor (MGF) in Escherichia coli. II Protein Expr Purif, 2008, Vol. 58, №1, p. 70-77.

3. Лисицкая K.B., Крахмалева И.Н., Шишкин C.C. Изучение однонуклеотидного полиморфизма семи генов (GHR, IGFBP3, IGFR1, IRS1, FMN1, ANXA2, TAGLN) у этнических русских и у пациентов с раком предстательной железы. // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология, 2010, № 2, с. 34-37.

4. Шишкин С.С., Лисицкая К.В., Крахмалева И.Н. Биохимический полиморфизм белков системы гормона роста и его проявления в клетках предстательной железы человека. // Успехи биологической химии, 2010, Т.50, с. 117-154.

Статьи в сборниках и информационно-методические письма:

1. Шишкин С.С., Макаров A.A., Ахунов B.C., Ковалев Л.И., Ковалева М.И., Князев А.И., Воронина A.C., Еремина Л.С., Лисицкая К.В. Создание и использование лабораторного регламента для определения биологической активности рекомбинантных ростовых факторов и некоторых других биологически активных веществ. / В сб. «Медико-биологические технологии повышения работоспособности в условиях напряженных физических нагрузок», М., 2006, вып. 2, с. 8-22.

2. Шишкин С.С., Ковалев Л.И., Ковалева М.А., Крахмалева И.Н., Еремина Л.С., Макаров A.A., Лисицкая К.В., Лоран А.Б., Велиев Е.И., Охриц В.Е. Проблемы ранней диагностики рака простаты и возможности применения новых потенциальных биомаркеров. / Информационно-методическое письмо. М.: ООО «Оригинальная компания», 2009,45 с.

3. Шишкин С.С., Ковалев Л.И., Ковалева М.А., Крахмалева И.Н., Еремина Л.С., Лисицкая К.В., Дзеранов Н.К., Ощепков В.Н., Кешишев Н.Г., Тотров К.И. Рак

простаты и современные протеомно-биотехнологические подходы к его молекулярной диагностике. / Информационно-методическое письмо. М.: ООО «Оригинальная компания», 2009, 36 с.

Тезисы докладов:

1. Макаров A.A., Лисицкая К.В. Разработка методики расчета изменения скорости роста культивируемых клеток под влиянием биологически активных веществ. / Материалы межрегиональной научно-практической конференции молодых ученых «Актуальные проблемы клинической и экспериментальной медицины», Иркутск, 2006, с. 270-272.

2. Попов В.О., Шишкин С.С., Ковалев Л.И., Ковалева М.А., Крахмалева И.Н., Еремина Л.С, Соколова О.С., Торопыгин И.Ю., Дзеранов Н.К., Тотров К.И., Кононков И.В., Лоран О.Б. Лисицкая К.В. Изучение биохимического поли-морфизмоа СН-домен содержащих и других актин-связывающих белков при раке простаты. Тезисы докладов конференции «Фундаментальны науки - медицине», М., 2007, с. 196-197.

3. Попов В.О., Шишкин С.С., Ковалев Л.И., Ковалева М.А., Макаров A.A., Крахмалева И.Н., Лисицкая К.В., Соколова О.С., Синицына Н.Ю., Торопыгин И.Ю., Охриц В.Е., Лоран О.Б. Изучение биохимического полиморфизма СА2+-связывающих и некоторых других актин-содержащих белков при раке простаты для разработки новых методов диагностики. Тезисы докладов конференции «Фундаментальные науки - медицине», М., 2008, с. 90-91.

4. Шишкин С.С., Ковалев Л.И., Крахмалева И.Н., Ковалева М.А., Лисицкая К.В., Воронина A.C., Торопыгин И.Ю., Дзеранов Н.К., Лоран О.Б., Попов В.О. Ранняя диагностика рака простаты - актуальная проблема молекулярной биомедицины. IV съезд Российского общества биохимиков и молекулярных биологов, Новосибирск, 2008, с. 248.

5. Лисицкая К.В., Крахмалева И.Н., Тотров К.И., Шишкин С.С. Изучение одно-нуклеотидных полиморфизмов (SNP's) в генах GHR и FMN1 у здоровых россиян, а также у больных раком предстательной железы. Тезисы IV съезда Российского общества биохимиков и молекулярных биологов, Новосибирск, 2008, с. 218.

6. Шишкин С.С., Ковалева М.А., Герасимов Е.В., Ковалев Л.И., Макаров A.A., Еремина Л.С., Лисицкая К.В. Торопыгин И.Ю., Охриц В.Е., Лоран А.Б., Дзеранов Н.К., Попов В.О. Системное изучение потенциальных биомаркеров рака

предстательной железы и формирование многоуровневой базы данных об этих белках для разработок методов биохимической диагностики. Тезисы докладов VII съезда онкологов России, М., 2009, Т.2, с.143.

7. Лисицкая К.В. Анализ ассоциаций полиморфизмов генов GHR и FMN1 с раком простаты человека. Материалы научной конференции «Актуальные вопросы лучевой диагностики и онкологии», М., 2008, с. 55.

8. Loran О.В., Veliev E.I., Okhrizts V.E., Lisitskaya K.V., Eremina L.S., Kovalyov L.I., Kovalyova M.A., Shishkin S.S. Potential clinical value of circulating Dj-1 in patients with prostate cancer. Eur. Urol. Suppl., 2010, V.9, №2, P. 309 (25th Anniversary the European Association of Urology's Congress, 2010, Barselona).

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Лисицкая, Ксения Валерьевна

Список сокращений

Введение

1. Исследования полиморфизма некоторых белков человека, регулирующих пролиферацию, апоптоз и клеточную подвижность, и отдельные биомедицинские аспекты изучения рака простаты (обзор литературы).

1.1. Общие характеристики белков, регулирующих клеточную пролиферацию, диф-ференцировку и рост; роль их полиморфизма при раке предстательной железы.

1.1.1. Некоторые биомедицинские аспекты изучения проблем рака предстательной железы в постгеномную эру.

1.1.2. Белки системы гормона роста и инсулиноподобного фактора роста-1.

1.1.3. Некоторые регуляторные белки, участвующие в контроле за апоптозом.

1.1.4. Полиморфизм некоторых актин-связывающих белков при раке предстательной железы.

1.2. Клеточные модели в биохимических исследованиях рака предстательной железы.

1.3. Протеомные технологии в изучении рака предстательной железы.^

1.4. Использование некоторых постгеномных технологий в исследовании роли одно-нуклеотидных замен в патогенезе рака предстательной железы.

2. Материалы и методы.

2.1. Биологические материалы и реактивы.

2.1.1. Клеточные культуры человека.

2.1.2. Образцы ткани простаты человека, цельной крови и сыворотки крови.

2.1.3. Реактивы.

2.2. Методы выращивания клеточных культур и методики определения пролифера-тивной активности.

2.3. Иммуноферментный анализ.

2.4. Протеомные методы исследования.

2.4.1. Подготовка проб.

2.4.2. Фракционирование белков двумерным электрофорезом по О'Фарреллу.

2.4.2.1. Изоэлектрофокусирование в полиакриламидном геле с градиентом рН, мированном амфолинами.

2.4.2.2. SDS-электрофорез в пластинах полиакриламидного геля.

2.4.3. Детекция белков на гелевых пластинах. Дениситометрия двумерных электрофо-реграмм. Компьютерный анализ результатов. Хранение гелевых пластин.

2.4.4. Масс-спектрометрическая идентификация белков.

2.5. Методы получения ДНК и формирование ДНК-коллекций.

2.6. Методы исследования ДНК-полиморфизмов.

2.6.1. Простая ПЦР и рестрикционный анализ.

2.6.2. Метод дискриминации аллелей с помощью ПЦР в реальном времени (RT-PCR).

2.7. Статистическая обработка результатов.

3. Результаты и обсуяадение.

3.1. Изучение биологической активности отдельных регуляторных белков в модельных клеточных биотест-системах.

3.2. Определение концентрации IGF-1 и некоторых регуляторных белков в сыворотке крови пациентов с раком предстательной железы (иммуноферментный анализ).

3.3. Сравнительное протеомное изучение белков в культивируемых клетках рака (РС

3) и доброкачественной гиперплазии простаты (ВРН-1).

3.4. Исследование регуляторного белка Dj-1 у больных злокачественными и доброкачественными опухолями предстательной железы.

3.4.1. Идентификация двух изоформ белка Dj-1 в биопсийных образцах тканей рака предстательной железы.

3.4.2. Иммуноферментное определение белка Dj-1 в сыворотке крови у больных с раком и гиперплазией предстательной железы.

3.5. Изучение однонуклеотидного полиморфизма восьми генов (GHR, IGFBP3, IGFR1, IRS1, MSTN, FMN1, ANXA2, TAGLN) у этнических русских и у пациентов с раком предстательной железы.

3.5.1. Изучение полиморфизма 458A>G (rsl805086, Lysl53Arg) в гене MSTN.

3.5.2. Изучение ассоциаций полиморфных вариантов в генах, относящихся к системе гормона роста и инсулиноподобного фактора роста-1, с раком предстательной железы.

3.5.3. Изучение ассоциаций полиморфных вариантов в генах, кодирующих синтез ак-тин-связывающих белков, с раком предстательной железы.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Изучение полиморфизма отдельных регуляторных белков, функционирующих в эпителиальных и мышечных клетках человека в норме и при раке простаты"

Актуальность темы

В биохимических исследованиях белков традиционно в особые группы объединяют различные макромолекулы, выполняющие сложные регуляторные функции, в том числе связанные с клеточной пролиферацией, апоптозом, ростом и развитием [Culig Z. et al., 1996; Zinkel S. et al., 2006]. Изучение свойств и особенностей функционирования таких белков-регуляторов, а также кодирующих их генов, часть из которых относится к онкогенам, усилилось в постгеномную эру в связи необходимостью выяснения молекулярных основ возникновения различных злокачественных опухолей, в частности, рака предстательной железы (РПЖ) [Yu Н., Rohan Т., 2000; Peltonen L., McKusick V.A., 2001; Bidosee М. et al., 2009; Turner N., Grose R., 2010].

РПЖ является одним из наиболее часто встречающихся злокачественных новообразований у мужчин. Согласно статистике, в 2009 г. в США РПЖ занимал лидирующее значение по количеству выявленных случаев заболевания и второе место по количеству летальных случаев [Jemal А. et al., 2009]. В России РПЖ находится на 4-м месте в структуре онкологической заболеваемости мужчин [Чиссов В.И. с соавт., 2008]. Более того, за период с 1998 по 2008 гг. отмечается значительный рост заболеваемости РПЖ, составляющий в странах Запада в среднем 3% за год [Boyle Р. et al. 1996], а по оценкам, сделанным в нашей стране - более 7% в год [Чиссов В.И. с соавт., 2008]. Широкая распространенность РПЖ, вариабельность клинических симптомов и высокий процент летальности больных РПЖ во многом определяют пристальное внимание к этому заболеванию не только онкологов, но и биохимиков, молекулярных биологов, а также специалистов других биологических дисциплин.

Хотя к настоящему времени получен ряд данных, указывающих на участие в развитии РПЖ различных ростовых факторов и регуляторных белков [Russell et al. 1998; Reynolds A.R., Kyprianou N., 2006], однако остается много нерешенных вопросов, связанных с определением их непосредственного вклада в онкогенез. Среди них наиболее активно исследуемыми являются белки, входящие -в так называемую ось «гормон рос-та/инсулиноподобный фактор роста-1» (axis GH/IGF-1) [Cohen Р. et al., 2000; Koyama S. et al., 2010]. В числе особенно актуальных и интенсивно изучаемых вопросов - перспективы использования белковых факторов, вовлеченных в патогенез РПЖ, для диагностики и определения риска возникновения заболевания. О важности поисков новых биомаркеров и разработок на этой основе молекулярных диагностикумов РПЖ говорят накапливающиеся сведения о недостатках традиционно используемого в клинике теста на простат-специфический антиген (ПСА) [Stamey Т.А. et al., 2004].

Проблему осложняет то, что для многих ростовых факторов и других регуляторных белков характерен выраженный биохимический полиморфизм, проявляющийся их качественными и/или количественными изменениями. Эти изменения, в свою очередь, играют важные роли в процессах пролиферации клеток, приобретении ими способности к инвазии и метастазированию, что приводит, в конечном счете, к формированию злокачественного фенотипа клеток [Djavan В. et al., 2001; Weber G.F., 2007; Bidosee M. et al., 2009].

Известно, что биохимический полиморфизм белков человека может быть обусловлен как генетическими, так и эпигенетическими причинами [Beaudet A.L. et al. 1989; Zhang F. et al. 2009]. К генетическим причинам относят множественность генов, или поли-локусность, а также полиаллелизм и альтернативный сплайсинг. Среди эпигенетических причин наиболее распространены постсинтетические модификации белков [Вудс Р., 1983; Beaudet A.L. et al., 1989; Шишкин C.C. и др., 2007].

С началом постгеномного периода особое внимание исследователей привлекает полиморфизм белков, обусловленный однонуклеотидными заменами в соответствующих генах (так называемые single nucleotide polymorphisms, SNP's) [Zhang F. et al., 2009]. В частности, ведутся многочисленные работы, направленные на выяснение ассоциации отдельных полиморфных вариантов с риском различных онкологических заболеваний [Gsur A. et al., 2001; Chen С. et al., 2006; Jain M. et al., 2007; Hirata H. et al., 20096; Pilato B. et al., 2010]. По мнению ряда авторов, результаты таких исследований представляют интерес для развития представлений о молекулярных предпосылках возникновения раковых опухолей и могут найти применение для формирования групп высокого риска этих заболеваний, в частности, РПЖ [MononenN., Schleutker J., 2009].

Таким образом, ведущиеся в настоящее время исследования по изучению свойств регуляторных белков человека позволяют надеяться на получение важных результатов, которые расширят представления о молекулярных механизмах РПЖ и будут способствовать разработкам новых подходов к пресимптоматической диагностике, профилактике и лечению этого заболевания.

Цель и задачи исследования.

Основной целью данной диссертационной работы стало изучение полиморфизма отдельных регуляторных белков, функционирующих в эпителиальных и мышечных клетках человека в норме и при раке предстательной железы, с помощью ряда традиционных и постгеномных технологий.

В соответствии с целью исследования были поставлены следующие задачи: 1. Разработать биотест-систему, использующую в качестве тестируемого объекта культивируемые эпителиальные и мышечные клетки, которая позволяла бы определять биологические эффекты различных регуляторных белков, присутствующих в сыворотке крови.

2. Провести иммуноферментное определение сывороточной концентрации отдельных регуляторных белков у пациентов с раком предстательной железы и в группе контроля и оценить проявления количественного полиморфизма этих белков.

3. Провести посредством двумерного электрофореза сравнительный протеомный анализ белков в клеточных линиях, моделирующих рак и доброкачественную гиперплазию предстательной железы, для обнаружения качественного и количественного полиморфизма белков как потенциальных маркеров рака предстательной железы.

4. Изучить встречаемость отдельных регуляторных белков в образах тканей простаты у больных раком и гиперплазией.

5. Исследовать возможность ассоциации различных полиморфных вариантов в некоторых генах, относящихся к системе гормона роста/инсулиноподобного фактора роста-1, а также в генах отдельных актин-связывающих белков с риском рака предстательной железы у этнических русских.

Научная новизна работы

Оптимизирована клеточная биотест-система, использующая в качестве тестируемого объекта культивируемые клетки рака простаты (ЬИСаР), и с помощью этой биотест-системы выявлен стимулирующий пролиферацию эффект сыворотки больных раком простаты на клетки.

В тканях простаты человека впервые обнаружены две электрофоретические изо-формы белка Ць1, различающиеся по р1, и, возможно, представляющие собой результат посттрансляционных модификаций. При иммуноферментном анализе сывороточного уровня Ць1 у больных раком и гиперплазией предстательной железы получены новые данные, свидетельствующие о достоверном повышении уровня данного белка в сыворотке крови больных РПЖ по сравнению с группой ДГПЖ.

Впервые проведен сравнительный анализ полиморфизма восьми генов (ОНЯ, ЮРВРЗ, ЮПИ, Ш1, МЭТИ, РШ1, АЫХА2, ТАЫЫ), вызванного десятью известными однонуклеотидными заменами (ЗЫР'э), у этнических русских и в представительной группе пациентов с раком простаты. Показано, что распределение частот аллелей и генотипов полиморфного сайта 1388Т/С (Ьеи463Рго) в гене РМЫ1 достоверно различалось в группе больных и в контрольной выборке, в частности, была выявлена ассоциация генотипа ТТ с повышенным риском развития рака простаты. Кроме того, при анализе полиморфного сайта 2911 О/А (01и917Агд) гена ШБ7 обнаружено достоверно значимое накопление алле-ля А у больных раком по сравнению с контрольной группой. Таким образом, полученные данные свидетельствуют о возможном участии полиморфизма генов БМШ и ГОШ в формировании предрасположенности к раку предстательной железы.

Научно-практическая значимость.

Оптимизированная клеточная биотест-система может быть использована для изучения биологических эффектов ростовых факторов на культивируемые клетки рака предстательной железы и для исследований молекулярных нарушений клеточной пролиферации при данном заболевании.

При протеомном изучении белков в клеточных линиях РС-3 (модель рака простаты) и ВРН-1 (модель доброкачественной гиперплазии) идентифицировано 49 белковых фракций, что позволило сформировать два дополнительных модуля в многоуровневую информационную базу данных «Протеомика рака простаты-2009», созданную в Учреждении Российской академии наук Институте биохимии им. А.Н. Баха РАН совместно с ООО «Инновационные биотехнологии» (http://ef.inbi.ras.ru).

При сравнительном исследовании идентифицированного белка Щ-1 в четырех клеточных линиях показано его более низкое содержание в клетках, моделирующих доброкачественную гиперплазию (ВРН-1), по сравнению с клетками, моделирующими рак простаты (РС-3, 01Ы45 и ЬИСаР).

Результаты проведенных протеомных и иммуноферментных исследований на образцах тканей простаты и сыворотках крови больных раком и гиперплазией простаты позволяют считать белок Ц)-1 перспективным маркером рака предстательной железы и дают основание поставить вопрос о расширении его исследований с целью валидации для последующего использования в диагностике заболевания.

Полученные данные о полиморфизме двух из десяти исследованных ДНК-локусов могут найти применение при урологических обследованиях мужчин для формирования групп высокого риска рака простаты.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту.

1. Оптимизирована клеточная биотест-система, использующая в качестве биотест-объекта культивируемые клетки рака простаты (ЬИСаР), и с помощью этой биотест-системы у обследованных пациентов с раком предстательной железы выявлен стимулирующий пролиферацию эффект сыворотки больных раком простаты на клетки:

2. При протеомном изучении белков* в клеточных линиях РС-3 (модель рака) и ВРН-1 (модель доброкачественной гиперплазии) идентифицировано 49 белковых фрак9 ций, что позволило сформировать два дополнительных модуля в отечественный информационный ресурс «Протеомика рака простаты-2009».

3. Изучение белка Dj-1 в четырех клеточных линиях показало его наименьшее содержание в клетках, моделирующих гиперплазию (ВРН-1) по сравнению с клетками, моделирующими рак предстательной железы (РС-3, DU-145 и LNCaP).

4. Протеомные и иммуноферментные исследования образцов тканей простаты и сыворотки крови у больных*раком и гиперплазией позволяют считать белок Dj-1 перспективным биомаркером рака простаты.

5. Сравнительный анализ полиморфизма восьми генов (GHR, IGFBP3, IGFR1, IRS1, MSTN, FMN1, ANXA2, TAGLN), вызванного десятью известными однонуклеотидными заменами (SNP's), у этнических русских и в представительной группе пациентов с раком простаты показал достоверно значимое различие рапределения частот аллелей и генотипов по полиморфным сайтам 1388 Т/С (Leu463Pro) в гене FMN1и2911G/A (Glu917Arg) в гене 7i?iSi (rsl801278) у больных РПЖ по,сравнению с контрольной группой.

Апробация работы

Материалы данной работы докладывались на международных и российских конференциях, в том числе: конференции молодых ученых с международным участием «Актуальные вопросы лучевой диагностики и онкологии» (Москва,' 2008),, IV Съезде Российског го общества биохимиков и молекулярных биологов,. (Новосибирску 2008), VII Съезде онкологов России (Москва, 2009), 25-ом;Ежегодном съезде, Европейской ассоциации урологов (25thAnniversary EAU Congress, Barcelona; 2010);.

Публикации

По теме диссертации опубликовано, 15 научных работ (из них 2 в зарубежной печати), включая 4 статьи в профильных рецензируемых российских ^ международных журналах, 1, статью в сборниках, 2 информационно-методических письма и 8 тезисов докладов. . .

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 146 страницах, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, заключения, выводов, списка цитируемой литературы (386 наименований). Работа содержит 17 таблиц и 27 рисунков;

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Лисицкая, Ксения Валерьевна

выводы

1. Разработана клеточная биотест-система, использующая в качестве биотест-объекта культивируемые клетки рака предстательной железы (ЬЫСаР), с помощью которой выявлен стимулирующий пролиферацию клеток эффект сыворотки крови больных раком предстательной железы.

2. Иммуноферментный анализ сывороточной концентрации двух белков - регуляторов клеточной пролиферации ростового фактора ГСЯМ и его транспортного белка ЮРВР-З, а также белка Вс1-2 - регулятора апоптоза - не показал статистически достоверных различий между группами пациентов с раком и гиперплазией предстательной железы.

3. При протеомном изучении белков в клеточных линиях РС-3 (модель рака простаты) и ВРН-1 (модель доброкачественной гиперплазии): а) идентифицировано 49 белковых фракций, что позволило сформировать два дополнительных модуля в отечественный информационный ресурс «Протеомика рака простаты»; б) показано, что идентифицированный белок Ц)-1 характеризуется наименьшим содержанием в клетках, моделирующих гиперплазию (ВРН-1) по сравнению с клетками, моделирующими рак предстательной железы (РС-3, 011-145 и ЫчГСаР).

4. При протеомном исследовании биоптатов тканей простаты, полученных от пациентов с раком и гиперплазией предстательной железы, показано, что белок Цн1 в большинстве случаев присутствовал в виде двух электрофоретических изоформ, при этом содержание белка Щ-1 было существенно выше при раке, чем при гиперплазии.

5. Иммуноферментный анализ сывороточной концентрации белка ЦИ выявил статистически достоверные различия между группами больных раком и гиперплазией предстательной железы, что позволяет считать белок Ц]'-1 перспективным биомаркером рака простаты.

6. Методом дискриминации аллелей с помощью полимеразной цепной реакции в реальном времени обнаружено, что в обследованной группе пациентов с раком предстательной железы имеется достоверно значимое накопление аллеля А в полиморфном сайте 291Ш/А (01и917А^) гена //?57 (ге 1801278) по сравнению с контрольной группой. Распределение частот аллелей и генотипов полиморфного сайта 1388 Т/С (Ьеи4бЗРго) в гене РМИ1 (гэ2306277) также различалось в группе больных и в контрольной выборке, в частности, была выявлена ассоциация генотипа ТТ с повышенным риском развития рака простаты.

4. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Белки человека, выполняющие сложные регуляторные функции, связанные с клеточной пролиферацией, апоптозом, ростом и развитием, представлены многочисленными семействами и суперсемействами [Le Roith D. et al., 1999; Blobe G.C. et al., 2000; Knillová J., Kolár Z., 2003; Reynolds A.R., Kyprianou N., 2006; Zinkel S. et al., 2006]. Как правило, их рассматривают в составе особых систем, включающих отдельные гормоны и/или ростовые факторы, соответствующие рецепторы и целые группы участников так называемых процессов сигналинга, которые обеспечивают целенаправленные изменения работы клеточного генома [Chang L. et al., 2004; Katz M. et al., 2007]. Одной из таких систем является система гормона роста/инсулиноподобного фактора роста-1 (GH/IGF-1) [Rodriguez S., et al., 2007; Baumann G.P., 2009; Rosenfeld R.G., Hwa V., 2009]. Функционирование этой системы представляется в виде целого ряда последовательных молекулярных процессов, в которых принимают участие десятки белков и пептидов. Система GH/IGF-1 распространяет свое действие на клетки с самыми разными типами дифференцировки [Thörey I.S. et al., 2004], в частности, на клетки ПЖ [Colao A. et al., 1998; 2000; Wang Z. et al., 2005]. Нарушения работы системы GH нередко становятся причинами тяжелой наследственной патологии [Phillips J.А., 1995; Le Roith D. et al., 1999], a также вовлекаются в патогенез онкологических заболеваний [Rodriguez S. et al., 2007; Creighton С J. et al., 2008].

Для многих белков - участников системы GH/IGF-1 характерен выраженный биохимический полиморфизм [Baumann G., 1991; Phillips J.A., 1995; Baumann G.P., 2009]. Это дало основание поставить в качестве одной из целей данной диссертационной работы изучение роли полиморфизма отдельных регуляторных белков, функционирующих в эпителиальных и мышечных клетках человека в норме и раке предстательной железы.

В 21 веке заболеваемость РПЖ оценивалась величиной 25,3 человека на 100 000 населения по всему миру, однако данный показатель сильно варьирует в разных странах [Ramon J., Denis L.J., 2007]. В России в начале 21 века заболеваемость РПЖ вышла на четвертое место в общей структуре онкологических заболеваний и характеризовалась весьма высокими темпами ежегодного прироста, занимая по этому показателю первое место среди онкопатологий [Чиссов В.И. и др., 2008].Таким образом, эпидемиологические данные свидетельствуют о том, что РПЖ можно рассматривать уже не просто как медицинскую проблему, а более широко - ряд авторов отмечают ее существенные социальные и экономические аспекты [Stephenson A.J. et al., 2007].

Одной из существенных проблем РПЖ является ранняя диагностика данного заболевания, поскольку на ранних стадиях существуют методы радикального и эффективного лечения [Кушлинский Н.Е. с соавт., 2002]. Решение проблемы ранней диагностики РПЖ в настоящее время связывают с внедрением в клиническую практику методов, основнанных на определении в крови или моче некоторых биомаркеров, которые могли бы позволить диагностировать наличие злокачественной опухоли ПЖ.

Для развития исследований в данном направлении и оценки места в нем многочисленных разработок принципиально важным представляется создание общепринятого определения для термина «биомаркер» [Ludwig J.A., Weinstein J.N., 2005].

Биологические маркеры (биомаркеры) - молекулы, которые могут служить индикаторами нормальных или патологических процессов в организме или фармакологических ответов организма на действие терапевтических агентов [Cummings J. et al., 2008]. По мнению Ludwig J.A., Weinstein J.N. (2005), при онкологических заболеваниях биомаркеры могут использоваться как индикаторы различных проявлений канцерогенеза и найти применение в диагностике, могут иметь прогностический характер, а также могут являться индикаторами терапевтического эффекта.

Спектр исследований биомаркеров разных типов обычно начинается с обнаружения потенциального биомаркера и развивается как три основных варианта многостадийного пути, включающих определение связей с самочувствием, функциями или выживаемостью пациентов к валидации биомаркера до решения о применении его в клинике (Рис. 4.1).

Спектр исследований биомаркеров

Научно-исследовательские технологии

Развернутые клинические исследования 1

Исследования (доклинический этап)

Определение вероятности валидации

Установление валидации

Выявление новых (потенциальных) биомарке

Оценка ранних фармако-динамических пока »а те - лей

Оценка поздних фарма-кодинамических показатвлей

Пилотные клинические исследования

Исследования биологии опухолей, поиск диагностических биомаркеров

Оценки прогностической значимости или влияния течения заболевания

Рис. 4.1. Схема основных вариантов в спектре исследований биомаркеров разных типов по Ситтищв J. й а1. (2008).

Хотя в ранней диагностике РПЖ в настоящее время фактически центральное место принадлежит определению в крови одного из наиболее изученных биомаркеров - простат-специфического антигена, однако известно, что этот тест сопровождается значительным количеством ложноположительных и ложноотрицательных результатов, которые помимо серьезных негативных медицинских последствий приводят и большим финансовым потерям [Stamey Т.А. et al., 2004]. Как следствие, в США и других западных странах, а также в нашей стране развернулись активные поиски новых, более эффективных биомаркеров РПЖ, для чего широко применяются постгеномные технологии [Примроуз С., Тваймен Р., 2008].

В связи с этим отдельные участники системы GH/IGF-1, а также целый ряд других регуляторных белков исследуются разными авторами как потенциальные биомаркеры РПЖ [Nam R.K. et al., 2003]. В частности, в данной работе было проведено изучение возможностей определения биологической активности отдельных регуляторных факторов, потенциально вовлеченных в патогенез РПЖ, с помощью созданной ранее [Черников и соавт., 1998; 2001] и оптимизированной в последующем клеточной биотест-системы. В результате оптимизированная клеточная биотест-система, использующая в качестве биотест-объекта культивируемые клетки рака простаты (LNCaP), дала возможность выявить стимулирующий пролиферацию клеток эффект сыворотки от обследованных пациентов с РПЖ. Однако, при исследовании методом ИФА содержания в образцах сыворотки крови двух белков - регуляторов клеточной пролиферации IGF-1 и его транспортного белка IGFBP-3, а также белка Вс1-2, регулирующего апоптоза, не было обнаружено статистически достоверных различий по изучавшимся показателям между группами пациентов с РПЖ и ДГПЖ.

В обзоре литературы данной работы отмечено, что в исследованиях биомаркеров РПЖ в настоящее время широко используются результаты успешного завершения международного проекта «Геном человека» (2000 - 2001 гг.) и целого комплекса других связанных с ним работ. По мнению многих авторов, выполнение геномных проектов привело к качественным изменениям в биологии и медицине 21-го века - в итоге фактически началась новая, так называемая постгеномная эра в развитии науки [Downes M.R. et al., 2006; Примроуз С., Тваймен Р., 2008]. Характерной чертой начала постгеномной эры стало возникновение ряда новых научных дисциплин, использующих в исследованиях системный подход и соответствующие технологии, в частности, протеомика.

В данной работе при протеомном изучении белков в клеточных линиях РС-3 (модель РПЖ) и ВРН-1 (модель ДГПЖ) было показано, что идентифицированный белок Dj-1 характеризуется наименьшим содержанием в клетках, моделирующих ДГПЖ (ВРН-1) по сравнению с клетками, моделирующими РПЖ (РС-3, DU-145 и LNCaP). Белок Dj-1 был ранее описан как продукт онкогена DJL Начиная с 2001 г., накапливаются сообщения об участии данного белка в патогенезе опухолевых заболеваний и его ценности как потенциf ального онкомаркера. Установлено, что белок Dj-1 присутствует в клетках многих злокаt 113 чественных опухолей и играет роль в повышении клеточной пролиферации и устойчивости опухолевых клеток к апоптозу. В частности, белок Dj-1 был обнаружен ранее и в клетках ПЖ.

При дальнейшем протеомном исследовании биоптатов тканей ПЖ, полученных от пациентов с РПЖ и ДГПЖ, было установлено, что содержание белка Dj-1 существенно выше при РПЖ, чем при ДГПЖ. Таким образом, указанные результаты давали основание для того, чтобы рассматривать белок в качестве потенциального биомаркера РПЖ.

Для проверки этой рабочей гипотезы было проведено с помощью ИФА пилотное исследование содержания белка Dj-1 в группах пациентов с РПЖ и ДГПЖ. Результаты выявили статистически достоверные различия между этими группами, что позволяет считать белок Dj-1 перспективным биомаркером РПЖ. При этом в доступной литературе не удалось найти публикаций об измерениях уровней белка Dj-1 в крови пациентов с РПЖ и ДГПЖ.

Основываясь на полученных результатах проведенных протеомных и иммунофер-ментных исследований, можно сделать заключение, что белок Dj-1 является перспективным биомаркером РПЖ, положительно зарекомендовавшим себя в ходе первых трех эта/ пов исследований. В целом, представленные данные дают основание поставить вопрос о продолжении изучения белка Dj-1 с целью его валидации как биомаркера РПЖ и, в случе успеха, для последующего использования при диагностике этого заболевания.

Продолжения изучения, очевидно, заслуживает и факт обнаружения в тканях простаты человека (в основном, при РПЖ) двух электрофоретических изоформ белка Dj-1, различающиеся по pl. Возможно, что эти изоформы представляют собой результат посттрансляционных модификаций общего белкового продукта онкогена DJ1.

К настоящему времени известно, что во многих случаях биохимический полиморфизм белков человека может быть обусловлен различными генетическими причинами. В частности, с развитием ДНК-технологий появился целый поток работ, направленных на изучение различных видов ДНК-полиморфизма в генах, включая однонуклеотидные замены (SNP's).

Соответственно, одной из задач данной работы стало изучение у этнических русских возможных ассоциаций отдельных полиморфных вариантов по 10 полиморфизмам в 8 генах, относящихся к системе GH/IGF-1 и актин-связывающим белкам, с риском РПЖ. В результате удалось обнаружить достоверно значимое накопление аллеля А в полиморфном сайте 2911G/A (Glu917Arg) гена IRS1 (rsl801278) у больных РПЖ по сравнению с контрольной группой. Также было показано, что распределение частот аллелей и генотипов полиморфного сайта 1388 Т/С (Leu463Pro) в гене FMN1 (rs2306277) достоверно различалось в группе больных и в контрольной выборке. В частности, была выявлена ассоциация генотипа ТТ с повышенным риском развития РПЖ. Таким образом, полученные данные свидетельствуют о возможном участии полиморфизма генов РМЫ1 и ШБ! в формировании предрасположенности к РПЖ.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Лисицкая, Ксения Валерьевна, Москва

1. Александров В.П., Карелин М.И. (2004) Рак предстательной железы. СПб.: СПбМА-ПО. 148 с.

2. Арчаков А.И. (2000) Что после геномики? Протеомика. Вопр Мед химии, 46, 335-343

3. Брызгунова O.E., Власов В.В., Лактионов И.И. (2007) Современные методы диагностики рака предстательной железы. Биомедицинская химия, 53, 128-139

4. Бялик В.В., Пинчук В.Г. (1977) Патологическая анатомия и ультраструктура гиперплазии и рака предстательной железы. Киев, Пауко-ва думка, 165 с.

5. Вудс Р. (1983) Биохимическая генетика. М.: Мир, 127 с.

6. Говорун В.М., Арчаков А.И. (2002) Протеомные технологии в современной биомедицинской науке. Биохимия, 67, 1341-1359

7. Ивахно С., Корнелюк А. (2006) Количественная протеомика и ее применение в системной биологии. Биохимия, 71,1312-1327

8. Краевский H.A., Смольянников A.B., Саркисов Д.С. (ред) Патологоанатомическая диагностика опухолей человека: Руководство для врачей: В 2 томах. М.: Медицина, 1993.

9. Крахмалева И.Н., Липатова H.A., Шишкин С.С., Шаховская Н.И. (1999) Структура дистрофинового гена у больных миодистрофией Дюшена. Журнал неврологии и психиатрии, 99,41-43

10. Кушлинский Н.Е, Соловьев Ю.Н., Трапезникова М.Ф. (2002) Рак предстательной железы. М.: РАМН, 432 с.14,15