Изучение белков предстательной железы человека при раке и доброкачественной гиперплазии с помощью постгеномных технологий

ЕРЕМИНА, ЛИДИЯ СЕРГЕЕВНА

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Изучение белков предстательной железы человека при раке и доброкачественной гиперплазии с помощью постгеномных технологий
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Изучение белков предстательной железы человека при раке и доброкачественной гиперплазии с помощью постгеномных технологий"

На правах рукописи

ЕРЕМИНА ЛИДИЯ СЕРГЕЕВНА

ИЗУЧЕНИЕ БЕЛКОВ ПРЕДСТАТЕЛЬНОЙ ЖЕЛЕЗЫ ЧЕЛОВЕКА ПРИ РАКЕ И ДОБРОКАЧЕСТВЕННОЙ ГИПЕРПЛАЗИИ С ПОМОЩЬЮ ПОСТГЕНОМНЫХ ТЕХНОЛОГИЙ

03.00.04-биохимия 03.00.15 - генетика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва 2008

003448134

Работа выполнена на кафедре биологической химии медицинского факультета ГОУ ВПО «Российский Университет дружбы народов» и в лаборатории биомедицинских исследований Института биохимии имени А.Н Баха Российской академии наук.

Научные руководители:

доктор биологических наук, профессор Чернов Николай Николаевич

доктор биологических наук Ковалев Леонид Иванович

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор доктор биологических наук, профессор

Козельцев Владислав Львович Лнмборская Светлана Андреевна

Ведущая организация: ГУ Научно-исследовательский институт биомедицинской химии имени В Н Ореховича Российской академии медицинских наук

Защита состоится «//» ОкГУЬ^ЛА 2008 г. в «//» ч. на заседании диссертационного совета Д 212.203.13 при Российском университете дружбы народов по адресу: 117198, г. Москва, ул Миклухо-Маклая, д.8, медицинский факультет.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Российского университета дружбы народов по адресу. 117198, Москва, ул. Миклухо-Маклая, д.6.

Автореферат разослан « 17» 2008 г.

Ученый секретарь ^су/^Л^г^-^

диссертационного совета // \

доктор биол. наук, профессор Лукашев'аЕленаВасильевна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы.

Одной из важнейших проблем современной медицины является широкая распространенность онкологических заболеваний, среди которых особое место принадлежит раку предстательной железы (РПЖ). В последние годы в России РПЖ занимает четвертое место в структуре онкологической заболеваемости мужчин [Давыдов М.И., Аксель Е.М. 2006]. В странах с более эффективной системой выявления опухолей показатель заболеваемости РПЖ еще выше. Так, в ряде стран Запада РПЖ находится на втором-третьем месте после рака легких и желудка, а в США в 2007 г. РПЖ вышел на первое место в структуре онкологической заболеваемости мужчин [Jemal A. et al. 2007].

Высокий показатель заболеваемости и отсутствие эффективных молекулярных маркеров РПЖ определяют актуальность работ по изучению молекулярных основ патогенеза этого заболевания и созданию эффективных методов его диагностики.

Молекулярные процессы, лежащие в основе возникновения и развития РПЖ, в настоящее время изучаются на уровне ДНК, мРНК и белковых продуктов генной экспрессии с помощью различных высокоэффективных постгеномных технологий.

К постгеномным технологиям относят многочисленные методы, применяемые в геномике, протеомике, транскриптомике и других новых дисциплинах, сформировавшихся после завершения международного проекта «Геном человека» [International Human Genome Sequencing Consortium 2001; Venter CJ. 2001].

Важное место в поисках молекулярных нарушений при РПЖ занимают работы, проводимые с помощью протеомных технологий [Jiang Z. et al. 2004; Hutchinson L.M. et al. 2005; Kristiansen G. et al. 2005].

Стратегию протеомных исследований для какого-либо объекта можно представить в виде ряда последовательно реализуемых шагов [Cells J.E. et al. 1991; Abst. II Siena 2D-Electrophoresis Meeting 1996, Wilkins M.R. et al. 1997; Громов П.С., Целис Х.Э. 2000]. сбор и приготовление образцов; разделение белков изучаемого объекта; идентификация белков; формирование компьютерного банка данных о белках изучаемого объекта и построение протеома изучаемого объекта.

При единой стратегии протеомных исследований для достижения разных целей применяются различные методологические тактики, различные подходы, основанные на элехтрофоретических или хроматографических методах в комбинации с методами масс-спектрометрии.

Традиционный протеомный подход включает разделение белков путем двумерного гель-электрофореза (two-dimensional gel electrophoresis, 2D-PAGE) и после-, дующую идентификацию белков путем масс-спектрометрии (mass spectrometry, MS)

или тандемной масс-спектрометрии (tandem mass spectrometry, MS/MS) с времяпро-летной лазерной десорбцией/ионизацией (matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight, MALDI-TOF). Метод двумерного электрофореза по О'Фарреллу и по сей день является основным в протеомике благодаря его высокой разрешающей способности [Kiose J. 1989; Говорун В.М., Арчаков А.И. 2002; Hanash S 2003].

Применение протеомных и других постгеномных технологий является перспективным для поиска потенциальных маркеров РПЖ, для определения состояния ключевых белков сигнальных каскадов в нормальном и малигнизированном эпителии предстательной железы, для исследования молекулярных основ андрогеннезависи-мости и метастазирования, а также для изучения полиморфизма белков предстательной железы, обусловленного различными причинами (полилокусность, полиал-лелизм, альтернативный сплайсинг и/или постсинтетические модификации).

Цель и задачи исследования.

Основной целью данной диссертационной работы было системное изучение белков предстательной железы человека при раке и доброкачественной гиперплазии с помощью постгеномных технологий.

В соответствии с целью исследования в работе решались следующие задачи:

1) изучить комплекс белковых продуктов генной экспрессии в тканях предстательной железы человека с помощью двумерного электрофореза и по результатам фракционирования суммарных экстрактов белков построить синтетическую двумерную карту белков предстательной железы;

2) провести сравнительный анализ белков предстательной железы при раке и доброкачественной гиперплазии для обнаружения потенциальных белковых маркеров РПЖ;

3) провести масс-спектрометрическую идентификацию предполагаемых белковых маркеров РПЖ и рада наиболее представленных белков на двумерных картах анализируемых тканей;

4) проверить диагностическую значимость выявленных белковых маркеров РПЖ в «двойном слепом исследовании»;

5) изучить биохимический и генетический полиморфизм ряда белков в тканях предстательной железы человека;

6) использовать полученные данные для создания компьютерной базы данных об идентифицированных белках предстательной железы человека.

Научная новизна работы.

Впервые построена обобщенная двумерная карта белков предстательной железы человека, на которой суммированы результаты двумерного электрофоретическо-го анализа образцов тканей простаты с гиперплазией и раком. На карте представлено 558 белков, среди которых идентифицировано 107, включая 3 новых. Выявлено 10 белков, которые можно рассматривать как потенциальные маркеры рака простаты. По результатам MALDI-TOF масс-спектрометрической идентификации выявлены 2 изоформы простат-специфического антигена. Проведено уточнение 59 «конфликтных» определений аминокислот в последовательностях 16 белков предстательной железы. На основе построенной синтетической карты создана макетная вер-

сия трехуровневой компьютерной базы данных о «мажорных» белках предстательной железы, включающая 64 белковые фракции и пригодная к дальнейшему расширению.

Научно-практическая значимость работы.

Получены обобщенные данные о 558 белковых продуктах генной экспрессии, представленных в тканях предстательной железы человека в норме и при патологии (ДГПЖ, РПЖ). На этой основе построена двумерная карта белков предстательной железы, которая может рассматриваться как характерный, генетически детерминированный «белковый портрет» исследованных тканей, и макетная версия компьютерной базы данных о «мажорных» белках предстательной железы. Созданная база данных может быть использована для решения широкого круга задач, в число которых входит изучение молекулярных механизмов этиологии и патогенеза заболеваний простаты, поиск новых диагностических маркеров и т.д.

Проведено сравнительное изучение белкового состава предстательной железы человека при доброкачественной гиперплазии и раке, что позволило выбрать кан-дидатные белки для разработки специфических тестов на РПЖ. Сформирована панель из десяти потенциальных белков-маркеров РПЖ (прообраз мультипараметри-ческого диагностикума), включающая три новых белка. В ходе клинических исследований на ограниченной выборке пациентов с раком и доброкачественной гиперплазией проведена предварительная проверка диагностической значимости выявленных белковых маркеров РПЖ.

Подготовлена заявка на изобретение способа диагностики рака простаты по определению продукта гена РЯ02675 - алькарцина 1 (альбумин-родственного карци-номного протеина) в диагностических биопсиях протеомными технологиями. Предложенный способ диагностики основан на том, что при раковой трансформации в тканях простаты выявляется ранее не использовавшийся маркер рака - белковый продукт гена РЯ02675.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту.

1. По результатам протеомного изучения белков предстательной железы человека при раке и доброкачественной гиперплазии построена синтетическая двумерная карта белков простаты, включающая 558 белковых фракций с Мм 6,5 -450 кДа и р1 4,3 - 13,7; идентифицировано 107 из 558 белковых фракций и обнаружено три новых белка предстательной железы.

3. Впервые выявлена в тканях предстательной железы человека множественность изоформ трансгелинов, обусловленная в основном биохимическим полиморфизмом белковых продуктов гена трансгелина (TAGL.N1).

4. Создана макетная версия трехуровневой компьютерной базы данных, содержащей обобщенную информацию о 64 «мажорных» белках предстательной железы человека.

Апробация работы.

Материалы диссертации докладывались на следующих российских и международных конференциях- III Всероссийская конференция «Мужское здоровье» (Москва, 2006), I Международная Пироговская студенческая научная конференция (Москва, 2006); Конференция «Фундаментальные науки - медицине» (Москва, 2006); Конференция «Фундаментальные науки - медицине» (Москва, 2007); 22-ой Ежегодный съезд Европейской ассоциации урологов (EUA Congress, Berlin, 2007); IY съезд Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008).

Публикации.

По теме диссертации опубликовано 11 работ в отечественной и зарубежной печати, включая 4 статьи в профильных рецензируемых журналах и главу в коллективной монографии.

Структура и объем работы.

Диссертация выполнена на 136 страницах, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы (более 300 наименований). Диссертация содержит 16 таблиц и 27 рисунков.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Материалами для протеомных исследований служили образцы тканей предстательной железы человека, полученные при диагностических биопсиях и хирургических операциях, которые проводились сотрудниками НИН урологии Росздрава РФ и сотрудниками кафедры урологии РМАПО (Городская клиническая больница им. С.П. Боткина) больным с диагнозами ДГПЖ (п=50) и РПЖ (п=100). Диагностика заболеваний осуществлялась в указанных специализированных урологических учреждениях с использованием клинических, гистологических и иммунохимических (определение уровня простат-специфического антигена) методов Во всех случаях РПЖ определялась аденокарцинома в стадиях 6-7 по Gleason. Образцы нормальных тканей предстательной железы (п=3) от лиц в возрасте до 25 лет, погибших в результате несчастного случая, были предоставлены Бюро судебно-медицинской экспертизы Департамента здравоохранения г. Москвы. Образцы, использованные в «двойном слепом исследовании» (п=20), были взяты во время хирургических операций по поводу РПЖ или ДГПЖ сотрудниками НИИ урологии Росздрава РФ; эти образцы исходно были маркированы только специальными трехбуквенными кодами без указаний диагноза. Параллельно образцы материалов от тех же больных под теми же кодовыми обозначениями анализировались морфологически в НИИ урологии Росздрава РФ. Кроме того, в работе в ряде экспериментов использовались культивируемые клетки РПЖ линии LNCaP-FGC, клетки рабдомиосаркомы линий RD и А-204, культивируемые миобласты и фибробласты человека.

Для фракционирования использовались несколько модификаций двумерного электрофореза по О'Фарреллу. Главным образом различия касались фракционирования белков в первом направлении. В основном в этой части анализа проводилось

изоэлектрофокусирование с использованием амфолинового градиента pH (IEF-PAGE) и фокусирование в неравновесном pH градиенте (NEPHGE) в модификации [Kovalyov L.I. et al. 1995]. Однако в ряде экспериментов использовалась также система с иммобилиновым градиентом pH (IPG-PAGE).

Детекция белков на гелевых пластинах осуществлялась с использованием ку-масси голубого R-250, азотнокислого серебра, коллоидного кумасси G-250 и люми-нисцентного красителя Sypro Ruby.

Для идентификации белков с помощью масс-спектрометрии обработку гелей, гидролиз трипсином и экстракцию пептидов проводили согласно протоколам «Центра протеомных исследований» при Институте биомедицинской химии РАМН [Говорун В.М. 2003]. Идентификация белков с помощью MALDI-TOF MS проводилась в НИИ биомедицинской химии им. В.Н. Ореховича РАМН. В отдельных случаях аминокислотную последовательность специально отобранных пептидов определяли с помощью методов MALDI-TOF MS/MS.

При проведении иммуноблоттинга использовались моноклональные антитела кролика к альбумину человека RAH Alb в разведении 1:2000 и конъюгат против иммуноглобулинов кролика P-GAR Iss в разведении 1:1000.

Материалами для ДНК-исследований служили образцы венозной крови здоровых мужчин (п=253) и женщин (п=182) (контроль) и мужчин, больных РПЖ (п=24). Препараты ДНК выделяли фенол-хлороформной экстракцией по Lindblom В., Holmlung G. (1988) с небольшими модификациями [Крахмалева И.Н. и др. 1999].

Полимеразную цепную реакцию в режиме реального времени в модификации метода выщепления 5' концевой метки проводили в приборе фирмы «Applera» (США), модель 7300, используя наборы реактивов SNP Genotyping Assay Mix (С__25618766 10, С_25618771_10, С_2841422_10), которые содержали специфичные праймеры и ДНК-зонды с конъюгированными флуоресцентными красителями, а также набор TaqMan Universal PCR Master Mix, No AmpEraseUNG, содержащий все другие необходимые компоненты для реакции амплификации и детекции ее продуктов.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Исследование белкового состава тканей простаты человека с помощью протеомных технологий.

Стратегия протеомных исследований предусматривает построение синтетической двумерной карты белков изучаемого объекта (Anderson N.G, Anderson N.L 1982, 1984, 1996; Celis J.E. 1984), которая характеризует особенности генной экспрессии в данном объекте.

Стабильность белкового состава операционных образцов ткани предстательной железы (ПЖ) при ДГПЖ и РПЖ была предварительно исследована одномерным электрофорезом по методу Лэммли, который показал соответствие белковых профилей в изучавшихся пробах (Рис. 1), что позволило перейти к их изучению протеом-ными технологиями.

кДа

Г" ю-

тя

Рис. 1. Результаты электрофоретическо-го анализа по Лэммли белков простаты. 1 - препарат маркерных белков; 2, 4 -биоптаты РПЖ; 3, 5-9 - биоптаты ДГПЖ.

Основой для построения синтетической двумерной карты белков простаты стала коллекция двумерных электрофореграмм образцов с ДГПЖ (п=50) и РПЖ (п=100), а также образцов нормальной ПЖ (п=3).

IEF-PAGE был проверен для ткани простаты в разных сочетаниях условий изо-фокусирования (800 В/ч, 1400 В/ч, 2400 В/ч и 4000 В/ч), и лучший результат дал вариант неравновесного IEF-PAGE (NEPGHE) при диаметре трубок 2,4 мм и длине геля 13 см (при наборе 2400 В/ч), который позволил анализировать до 600 белков в диапазоне Мм 6,0 - 450 кДа и pi 4,0 - 15,0. Использование IPG-PAGE в диапазоне рН 3-10 при длине стрипов 13 см показало ограничение возможности детекции изменений экспрессии белков при pi 5,0 - 9,0 и Мм выше 100 кДа (при равной белковой нагрузке на уровне 500 мкг на трубку/стрип). Поэтому в дальнейшем, при наборе статистического материала, использовался вариант IEF-PAGE 2400 В/ч [по Kovalyov et al. 1995] (Рис. 2.).

Рис. 2. Типичная двумерная электрофоре-грамма белков ПЖ, окрашивание азотнокислым серебром.

Распределение белковых фракций на каждой из полученных электрофореграмм документировали в виде соответствующего изображения, которое регистрировалось и сохранялось как графический файл в формате .tif. Каждое изображение стандартизировали с помощью программы Melanie по 15 выбранным реперным точкам, соответствовавшим четко идентифицируемым «мажорным» белковым фракциям, и разделяли на 49 условных прямоугольных участков. (В ходе последующей работы все выбранные реперные фракции были идентифицированы). Разделение каждого изображения осуществлялось в соответствии с модифицированным методом Камингса [Comings D.E. 1982; Kovalyov L.I. et al. 1995; Шишкин С.С. и соавт. 2004] по одному и тому же принципу - границы участков образовывали стандартным образом проведенные 6 горизонтальных и 6 вертикальных линий, а также края самой электро-фореграммы. Как следствие, каждое анализируемое изображение оказалось фраг-ментированным на 49 прямоугольных участков.

Вышеописанная работа была проведена с 60 электрофореграммами, полученными при анализе образцов тканей с ДГПЖ, и с 50 электрофореграммами, полученными при анализе образцов тканей с РПЖ.

Результаты сравнения стандартизованных двумерных электрофореграмм в норме, при ДГПЖ и РПЖ показали стабильность координат пятен исследуемого объекта с количественными/качественными вариациями, затрагивающими не более 1% белковых пятен и обусловленными, очевидно, генетическими вариантами, дифференцированным уровнем экспрессии, особенностями тканевого состава, а также наличием патологического процесса.

Вывод о стабильности координат пятен позволил приступить к формированию двумерной карты белков ткани с ДГПЖ и РПЖ. Сформированные двумерные карты были подвергнуты сравнительному пофрагментному анализу. Паттерны распределения белковых фракций, представленных на двумерных картах с ДГПЖ и РПЖ, оказались весьма схожими. Различие состояло в том, что на карте РПЖ присутствовали 10 белковых фракций, которые не выявлялись вовсе или присутствовали в значительно меньшем количестве на соответствующих участках карты ДГПЖ. В качестве примера на Рис. 3 приведены результаты сравнительного анализа для белка AGR2.

А Б

Рис. 3. Количественные различия в содержании белка AGR2 при ДГПЖ (А) и РПЖ (Б).

В целом, проведенный анализ позволил сформировать первую отечественную синтетическую двумерную карту белков предстательной железы человека, содержащую 558 белковых фракций с параметрами Мм 6,5 - 450 кДа и р1 4,3 - 13,7 (Рис.

kDa — 150

я - 45- .,„. . I*' - «¡j ' *" ; т и • 1 -• «

33 и • > *

* 22 1 ф * • • 4 т • № * •

т 0 • » ш " * I* в

Г 525 » «Р т 6,20 * « в 6.80 т Jfjgjfr 7.15 9.0 0 V <т ш 10.0 р|

Рис. 4. Синтетическая двумерная карта белков простаты человека. Синим цветом выделены белковые фракции, специфичные для образцов раковых тканей.

Для единообразного обозначения нанесенных на синтетическую двумерную карту белковых фракций была использована система универсальной семизначной нумерации [Kovalyov L.I. et al., 1995]. В этой системе номер каждой фракции является функцией от ее электрофоретических характеристик - первые четыре цифры соответствуют десятичному логарифму от Мм, представленному в виде простого числа, а три последних - значению pi, также представленному в виде простого числа. Например, белок AGR2, обладающий Мм 19,0 кДа и pi 9,00, в данной системе получил номер — 4279900. Такие объективные обозначения всех белковых фракций, включенных в обобщенную синтетическую двумерную карту белков тканей простаты, позволяют адекватно сопоставлять результаты, получаемые при протеомном анализе разных объектов.

Фактически основанием для изменения подобных номеров может стать только уточнение значений Мм или pi у соответствующего пятна полипептида.

Параллельно с построением синтетической двумерной карты также в соответствии со стратегией протеомных исследований была начата идентификация белковых фракций, которые наносили на эту карту.

Для идентификации использовали в основном технологию MALD1-TOF MS, которую в ряде случаев сочетали с MALDI-TOF MS/MS. Анализ полученных масс-

спектров выполняли с помощью программы Mascot по доступным через сеть Интернет компьютерным базам данных.

В целом, с помощью масс-спектрометрии удалось идентифицировать 107 из 558 белков, нанесенных на двумерную карту.

При проведении идентификации особое внимание было уделено 10 белкам, по которым наблюдались различия между электрофореграммами образцов тканей с раком и доброкачественной гиперплазией простаты и которые можно рассматривать как потенциальные молекулярные маркеры рака простаты.

Один из указанных потенциальных молекулярных маркеров - белок с Мм 28,5 кДа и pi 6,92 (который соответственно получил номер 4454692) - был идентифицирован методом MALDI-TOF MS с покрытием 36% как продукт гена PR02675, содержащий альбуминовый домен (Рис. 5).

Наблюдаемая Mr Расчетная Mr

Последовательность пептида

1706.77 1705.76 1705.82 MPADLPSLAADFVESK + Oxidation (М)

1639.82 1638.81 1638.79 dvflgmflyeyar + Oxidation (М)

2045.05 2044.04 2044.09 VFDEFKPLVEEPQNLIK

960.52 959.51 959.56 FQNALLVR

1511.74 1510.73 1510.84 VPQVSTPTLVEVSR

1763.73 1762.72 1762.77 AVMDDFAAFVEKCCK + Oxidation (М)

1 MPADLPSLM J)FVESCTVCK_OTj^ 61 ,ekccaamph_ecyakvfdef kplveepqnl ikqncelfeq lgeykfqhal lvrytkkvpq 121 VSTPTLVEVS KNLGKVGSKC CKHPEAKRMP CAEDYLSWL NQLCVLHEKT PVSDRVTKCC 181 TESLVNRRPC FSALEVDETY VPKEFNAETF TFHADICTLS EKERQIKKQT ALVELVKHKP 241 KATKEQLKAV MDDFAAFVEK CCKADDKETC FAEEGKKLVA ASQAALGL

Рис. 5. Результаты MALDI-TOF масс-спектрометрического анализа триптических пептидов белка 4454692. А - определение структуры пептидов, выявленных по масс-спектрам, с помощью опции "Peptide Fingerprint" программы Mascot (Matnxscience, США). Б - распределение последовательностей выявленных пептидов (показаны красным цветом) в предсказанной структуре белкового продукта гена PR02675. Пунктирной и сплошной линиями подчеркнуты аминокислотные последовательности двух альбуминоподобных доменов.

Для большей доказательности белок 4454692 исследовали дополнительно методом MALDI-TOF MS до 100% покрытия, технологией MALDI-TOF MS/MS, позволившей установить аминокислотную последовательность одного из пептидов (15 а.о.), а также методом иммунноблоттинга. В результате идентификация белка 4454692 как продукта гена PR02675 была полностью подтверждена. Таким образом, полученные данные дают основание считать, что в тканях РПЖ впервые обнаружен гипотетический белковый продукт транскрипта PR02675, выявленного Zhang С. et al. (1999) в клетках фетальной печени человека и зарегистрированного в компьютерной базе данных GenBank под номером gi:7770217. Учитывая то, что данный белок не имеет собственного названия и присутствует в тканях карциномы ПЖ, предлагается назвать его - альбумин-родственный карциномный протеин 1, или аль-карцин1.

Белок под номером 4161675 по результатам масс-спектрометрического анализа был охарактеризован как еще один представитель семейства белков, содержащих альбуминовый домен. Выявленные пептиды покрывали участки N-концевой и С-концевой областей гипотетического продукта гена PR02044 (gi:6650826). Подобно гену PR02675, ген PR02044 был охарактеризован в 1999 г. той же группой китайских авторов по соответствующей информационной РНК, выявленной в клетках фе-тальной печени человека. Белковый продукт PR02044 был ранее обнаружен в моче больных злокачественными и доброкачественными опухолями простаты [Rehman I. et al. 2004], в гепатокарциноме [Kawakami T. et al. 2005] и спинномозговой жидкости больных некоторыми видами патологии мозга [Jin T. et al. 2007]. Однако белок 4161675 по молекулярной массе почти в два раза уступал продукту гена PR02044 (14,5 кДа и 29,3 кДа, соответственно). Можно предположить, что белок 4161675 либо образуется за счет альтернативного сплайсинга при экспрессии гена PR02044, либо является продуктом пока еще не идентифицированного гена. Соответственно, описанный в данной работе белок 4161675 представляется новым содержащим альбуминовый домен белком, родственным продукту гена PR02044.

Результаты анализа данных масс-спектрометрии триптических пептидов белка 4217670 выявили высокую степень гомологии белка 4217670 с последовательностью одной из изоформ актиновых белков - актина у2 (ген gi:49168516). Однако величина Мм актина у2 (42,0 кДа) существенно отличались от соответствующего показателя белка 4217670 (16,5 кДа). С помощью MALDI-TOF MS исследования было установлено также достаточно высокое сходство белка 4217670 с гипотетическим белком - продуктом гена, зарегистрированного в Genbank'e под номером gi: 16306948. Указанный ген был охарактеризован по соответствующему транскрипту, выявленному в клетках эпителиальной карциномы поджелудочной железы Dickson M. et al. (2001) (NCBI Protein AAH09544). При сравнении полных аминокислотных последовательностей актина у2 и гипотетического белкового продукта гена gi: 16306948 оказалось, что С-концевая область последовательности актина у2 (а.о. 218-376) и последовательность гипотетического белка чрезвычайно похожи - различие между ними состоит только в девяти аминокислотных заменах. Три участка с аминокислотными заменами, по которым различаются гипотетический белок - продукта гена gi: 16306948 и С-концевая область последовательности актина у2, оказались в структурах идентифицированных пептидов белка 4217670. Таким образом, можно полагать, что белок 4217670 не является продуктом деградации актина у2 или результатом альтернативного сплайсинга соответствующего гена, а, по всей вероятности, образуется при экспрессии гена gi: 16306948 или сходного с ним неизвестного гена. Суммируя данные проведенного анализа структурных особенностей белка 4217670, по-видимому, можно рассматривать его как новый у-актин-родственный белок, впервые выявленный в тканях предстательной железы человека.

Таким образом, три вышеописанных белка, обнаруженных в образцах тканей ПЖ, можно расценивать как новые.

Общие характеристики, полученные для всех выявленных десяти белков - потенциальных молекулярных маркеров рака простаты, суммированы в Таблице 1.

Таблица 1. Результаты идентификации и общие характеристики белков, рассматриваемых как потенциальные маркеры РПЖ.

№ Наименование соответствующего белка в базах данных N081 № GeneBank (gO Фрагмент на карте Мм/pi экспериментальные значения № на карте

1 АСШ 37183136 F7 19,0/9,0 4279900

2 "Комплекс легких цепей ферритина 47125326 182516 В1 450,0/5,8 5653580

3 Новый белок — продукт Р1Ю2675, содержащий альбуминовый домен 7770217 D5 28,5/6,92 4454692

4 Новый белок, родственный продукту РИ02044, содержащий альбуминовый домен 6650826 С7 14,5/6,75 4161675

5 Новый белок, имеющий участки гомологии с актином 16306948 С7 16,5/6,70 4217670

6 Белок, связывающий жирные кислоты, изоформа 5 (РАВР5) 30583737 С7 16,0/6,30 4204630

7 НЗ гистон семейства ЗА 55665435 G7 15,2/11,30 4181130

8 Простатический связывающий белок (семейство фосфатидилэтаноламин связывающих белков) 21410340 D6 21,7/7,12 4336712

9 Дисульфидизочераза белков ЕЯ60 7437388 ВЗ 52,0/6,15 4716615

10 1У-ацетшшейраминат-фосфат-синтаза 12652539 D4 34,0/6,85 4531685

** Данная белковая фракция, очевидно, представляет собой весьма устойчивые олиго-мерные комплексы, которые возможно стабилизированы поперечными ковалентными связями.

Необходимо отметить, что среди публикаций последних лет имеются сообщения об обнаружении многих из перечисленных в табл. 1 белков (или транскриптов соответствующих генов) при РПЖ или других формах злокачественных новообразований. В частности, имеются работы, подтверждающие участие в возникновении и прогрессировании онкологических заболеваний ферригина [Maresca V. et al. 2006; Ricolleau G. et al. 2006], белка FABP5 [Masouye I. et al. 1996; Celis A. et al. 1999; Vaarala M et al. 2000, 2006; Das R. et al. 2001; Adamson J. et al. 2003; Brouard M.C. et al. 2002; Rauch J. et al. 2004], гистона H3 [Seligson D.B. et al. 2005; Dong Z., Bode A.M 2006; Xiang Y. et al. 2007], простатического связывающего белка [Fu Z. et al. 2003, 2006; Keller E.T 2004; Keller E.T. et al. 2004], протеиндисульфидизомеразы [Prasad S.C. et al. 1999; Lexander H. et al. 2005; Ren H. et al. 2006; Wu M. et al. 2007, Chahed K. et al 2008], N-ацетилнейраминат-фосфат-синтазы [Ou K. et al. 2001]). Особый интерес, по-видимому, представляет белок AGR2, который активно изучается в настоящее время в качестве потенциального маркера РПЖ [Thompson D А, Weigel R.J. 1998; Liu D et al 2005; Fritzsche F.R. et al. 2006; Zhang J.S. et al. 2005; Smirnov D.A. et al. 2005, Henshall S.M. et al. 2003; Knstiansen G. et al. 2005; Ковалев Л.И. и др 2006].

Изучение изменчивости белков в тканях предстательной железы человека.

Накопленные к настоящему времени материалы исследований изменчивости белков в различных клетках и тканях человеческого организма свидетельствуют о существовании многочисленных причин этого разнообразия. К образованию разных изоформ белков могут приводить и генетические факторы (полилокусность, полиал-

лелизм, альтернативный сплайсинг и др.), и биохимические механизмы, в частности, пострансляционные модификации. В конечном счете, такая изменчивость, формирующая белковый биохимический полиморфизм, оказывает существенное влияние на метаболические процессы в тканях и может быть отражением особенностей протекания различных патологических процессов, включая опухолевую трансформацию. В связи с этим в данной работе особое внимание было уделено изучению изменчивости белков в тканях предстательной железы человека.

Полиморфизм актин-связывающих белков в тканях предстательной железы.

К настоящему времени обнаружено уже более сотни актин-связывающих белков (АСБ), которые обладают выраженным биохимическим полиморфизмом и составляют несколько белковых семейств и даже суперсемейств. Значительный интерес вызывает суперсемейство АСБ, содержащих кальпоновый домен, и входящие в него трансгелины. Из материалов баз данных следует, что в геноме человека имеются три гена, способные кодировать трансгелиновые белки (ТА&Л!, ТАОШ2,

При проведении пофрагментного анализа двумерных электрофореграмм и масс-спектрометрической идентификации белков, выполнявшихся при построении синтетической двумерной карты, удалось показать, что присутствующие в четырех центральных фрагментах (С5, С6, Б5, Б6) одиннадцать белковых фракций являются изоформами трансгелина - продуктами экспрессии одного гена - TAGL.N1 (Рис. 6).

Рис. 6. А - Фрагмент двумерной электрофореграммы белков из образца с ДГПЖ, цифрами 1 -12 обозначены белковые фракции, идентифицированные как трансгелины по результатам М5. Б - Соответствующий фрагмент двумерной электрофореграммы белков из образца с РПЖ, стрелками показаны те же белковые фракции. В - Фрагмент двумерной электрофореграммы белков из одноядерных миобластов, стрелкой показана единственная изоформа трансгелина.

При этом четыре белка - 4342715, 4342686, 4342705 и 4342676 (№№ 1-4 на рис. 6) - являются полноразмерными продуктами гена ТАйЬЫ!, имеют одинаковую молекулярную массу и различаются только значениями изоэлектрических точек. Различия между этими изоформами, вероятно, обусловлены какими-либо посттрансляционными модификациями, например - фосфорилированием. Электрофоретические характеристики белков 4311690, 4307680, 4299685, 4290682, 4272691, 4269675 (фракции 5-11 на рис. 6) позволяют предположить, что они являются белковыми продуктами, образовавшимися при считывании информации с укороченного («вариантного») трансгелинового транскрипта. Показано, что этот транкрипт, который зарегистрирован в базе данных ОепЬапк под номером gi:62897565, кодирует первые 184 а.о. трансгелиновой последовательности. Можно предположить, что образова-

ТАЫШ).

А Б

12ц* 7_Ч

ю/

ние указанного транскрипта происходит за счет альтернативного сплайсинга при экспрессии гена ТАСЬЫ!. В результате из транскрипта удаляется участок, кодирующий 17 С-концевых а.о. В целом, полученные данные свидетельствуют о том, что выявленное разнообразие изоформ продуктов гена ТАйЬЫ! может быть обусловлено как генетическими, так и биохимическими механизмами. Кроме белковых продуктов гена ТАОЬЫ1 в тканях предстательной железы человека был идентифицирован и нанесен на карту продукт гена ТАСЬШ - белок 4330620 (№ 12 на рис. 6). Следовательно, в формирование изоформ трансгелинов в ПЖ определенный вклад вносит и такой генетический механизм, как полилокусность.

У обследованных больных РПЖ и ДГПЖ не удалось выявить качественных различий в наборах изоформ трансгелинов, наблюдались только количественные различия (рис.6).

В результате проведенных исследований в образцах тканей ПЖ удалось идентифицировать 21 белок как изоформы АСБ, принадлежащих к различным семействам. Общие характеристики идентифицированных АСБ представлены в Таблице 2.

Таблица 2. Изоформы актин-связывающих белков, идентифицированные с помощью МА1_01 ТОР МБ на двумерной карте тканей простаты.

№ № на карте Наименование белка № по Ое-пеВапк % совпадения с аминокислотной последовательностью Мт/р1 эксп. Мт/р1 теор

1 4342715 Трансгелин 49168456 90 22,0/7,15 22,6/8,87

2 4342705 Трапсгелин 49168456 80 22,0/7,05 22,6/8,87

3 4342686 Трансгелин 49168456 72 22,0/6,86 22,6/8,87

4 4342676 Трансгелин 49168456 66 22,0/6,76 22,6/8,87

5 4311690 Трансгелин, вариант 62897565 60 21,0/6,90 20,9/8,69

6 4307680 Трансгелин, вариант 62897565 73 20,0/6,80 20,9/8,69

7 4269675 Трансгелин, вариант 62897565 54 18,6/6,75 20,9/8,69

8 4272691 Трансгелин, вариант 62897565 63 18,7/6,91 20,9/8,69

9 4299685 Трансгелин, вариант 62897565 22 19,9/6,85 20,9/8,69

10 4265677 Трапсгелин, вариант 62897565 54 18,4/6,77 20,9/8,69

11 3322672 Трансгелин, вариант 62897565 22 21,0/6,72 20,9/8,69

12 4330620 Трансгелин, изоформа 2 55960374 43 21,4/6,20 21,1/7,63

13 4491730 Кальпонин 1 щелочной, гладкомышечный 21361120 60 31,0/7,30 33,2/9,14

14 4518460 Тропомиозин 2 (Р) изоформа 2 47519616 56 33,0/4,60 33,0/4,63

15 3455475 Тропомиозин 1 (а) вариант 6 89954539 29 28,5/4,75 28,5/4,75

16 3458475 Тропомиозин 3 12653955 31 28,7/4,75 29,0/4,75

17 3462473 Тропомиозин 3 12653955 19 29,0/4,73 29,0/4,75

18 274700 Кофилин1 15126676 35 18,8/6,85 18,5/8,22

19 4167695 Профилин1 4826898 45 14,7/6,95 15,1/8,44

20 4297480 Миозин легкая цепь 9 29568111 80 17,0/4,50 19,8/4,80

21 4146520 Галектин 1 цепь Л 42542977 47 14,0/5,20 14,6/5,34

Полиморфизм ПСА в тканях предстательной железы.

Простат-специфический антиген (ПСА) относится к группе внеклеточных нейтральных сериновых протеаз, обладающих ограниченной химотрипсин-подобной и трипсин-подобной активностью, и кодируется геном KLK3. В настоящее время имеются данные об образовании как минимум пятнадцати транскриптов за счет альтернативного сплайсинга, происходящего при функционировании гена KLK3 [Heuze-Vourc'h N. 2003]. Stenman U. и соавт. (1991) показали, что для больных РПЖ, по сравнению с больными ДГПЖ, характерно усиление образования комплекса ПСА с al-антихимотрипсином на тканевом уровне.

Проведенное протеомное изучение белков ПЖ позволило идентифицировать на двумерных электрофореграммах две изоформы ПСА. Так, на типичных двумерных электрофореграммах небольшая по количеству белковая фракция с Мм 21,4 кДа и pi 7,12 (номер на карте 4336712) в результате масс-спектрометрического анализа была определена как одна из изоформ ПСА. По существующим представлениям эта изо-форма не является основным продуктом экспрессии гена KLK3 - она образуется в результате альтернативного сплайсинга Эта изоформа присутствовала в небольшом количестве на электрофореграммах тканей ПЖ как при раке, так и при доброкачественной гиперплазии. Основную изоформу ПСА в комплексе с ингибитором протеаз SPAAT (N-terminal of short peptide alpha 1-antitrypsin) удалось идентифицировать только на двумерных электрофореграммах белковых экстрактов тканей простаты, полученных без использования мочевины (белок 4550730). Количество этой изоформы в раковых тканях было значительно меньше, чем в здоровых.

Полиморфизм енолазы 1 в тканях предстательной железы.

Белок 4674658 на фрагменте СЗ двумерной карты был идентифицирован с помощью MALDI-TOF MS и MALDI-TOF MS/MS как изоформа хорошо изученного гликолитического фермента енолазы 1. При сопоставлении результатов протеомно-го анализа 150 образцов тканей ПЖ в одном случае был выявлен редкий вариант енолазы 1, который имел ту же молекулярную массу, что и основная изоформа (белок 4674658), но обладал более щелочной изоэлектрической точкой. По результатам MALDI-TOF MS дополнительный белок был также идентифицирован как енолаза 1. Появление этого белка характеризовалось 50%-ным снижением в количестве основной изоформы енолазы 1, что может быть расценено как следствие эффекта дозы гена (появление аллельной изоформы белка в компенсирующем количестве). Пятикратно повторенные параллельные MALDI-TOF MS исследования этих двух ал-лельных вариантов енолазы 1 (обычного и редкого) не привели к установлению молекулярной природы различий между ними.

Уточнение «конфликтных» определений аминокислотных последовательностей идентифицированных белков предстательной железы.

В наиболее часто используемых биохимиками международных компьютерных базах данных (Swiss-Prot/TrEMBL, Protein NCBI и др.) приводятся многочисленные указания на различные «единичные конфликты при определении аминокислотной последовательности» (single amino acid conflicts, SAAC's). Обычно SAAC представляют как альтернативное присутствие одной или другой аминокислоты в какой-либо

позиции. Иногда БААС бывает следствием белкового полиморфизма, обусловленного соответствующей единичной аминокислотной заменой. Однако подавляющее большинство случаев «конфликтных» определений аминокислотных последовательностей связано с тем, что сведения о первичных структурах белков являются результатами перерасчетов данных секвенирования соответствующих нуклеиновых кислот, сделанных двумя группами авторов Разрешению указанных «аминокислотных конфликтов» может способствовать широкое привлечение к исследованиям БААС протеомных технологий, включающих прецизионное фракционирование белков и их детальную идентификацию методами масс-спектрометрии.

В данной работе с использованием протеомных технологий было проведено уточнение ряда «конфликтных» определений аминокислот в последовательностях шестнадцати идентифицированных белков и подтверждено существование по одному из вариантов для 59 расчетных «аминокислотных конфликтов». Результаты этих исследований были объединены в таблицу, фрагмент которой с данными уточнения первичной структуры фермента енолазы 1 приведен ниже (Таблица 3).

Таблица 3. Результаты протеомного анализа двух «аминокислотных конфликтов», зарегистрированных при определении аминокислотной последовательности енолазы 1

Название белка Номера в Swiss-Prot/ TrEMBL; Protein/ NCBI Символ гена % совпадения масс выявленных трипти-ческих пептидов с последовательностью белка Значения M/z идентифицированных пептидов Аминокислотные последовательности триптических пептидов, соответствующих найденным значениям M/z (позиции) Подчеркнуты обнаруженные «конфликтные» а о. Некоторые зарегистрированные «конфликты» Подчеркнуты а о, обнаруженные приМЗ

Енолаза 1 P06733, 4503571, 4503572, 13325287 ENOA 22, 59, 86, 56 1143 60 IGAEVYHNLK (184 - 193) 187 Е /в

1556 67 VVIGMDVAASEFFR (240-253) 252 Е/8

Полученные материалы показывают, что применение протеомных технологий помогает разрешать «единичные конфликты при определении аминокислотной последовательности» на уровне конечного продукта.

Пилотное исследование однонуклеотидных полиморфизмов в некоторых генах, экспрессирующихся в тканях предстательной железы.

Известно, что биохимический полиморфизм белков может быть обусловлен разными генетическими причинами, в том числе несинонимичными однонуклео-тидными заменами (single nucleotide polymorphisms, SNP's), которые приводят к появлению единичных аминокислотных замен. В связи с выявленным в данной работе биохимическим полиморфизмом трансгелинов было предпринято изучение встречаемости аллелей двух известных несинонимичных SNP's (A/G (rs 12284316) и C/G (rs36112166)) в гене TAGLN1 у здоровых и больных раком простаты индивидов. Для этой цели была использована специальная модификация полимеразной цепной реакции в режиме реального времени, которая позволяет проводить дискриминационный анализ гомо- и гетерозигот по определенным SNP's. Однако в обследованной

группе славян (92 мужнины) не было выявлено ни гомозигот по редкому аллелю, ни гетерозигот по выбранным SNP's в гене TAGLN1.

Вместе с тем, поскольку развитие РПЖ ассоциировано с нарушением регуляции сигнальных каскадов специфических факторов роста и внимание многих исследователей обращено на изучение SNP's в генах, кодирующих различные ростовые факторы и белки, участвующие в обеспечении их функций (например, IGFl, KLF6, GHR и др.), то в рамках данной работы было предпринято пилотное исследование встречаемости аллелей однонуклеотидного полиморфизма А/С (rs6180) в гене рецептора гормона роста (GHR) на достаточно представительной контрольной выборке мужчин (п=253) и женщин (п=182), а также небольшой группе пациентов с РПЖ (п=24). Как видно из Рис. 7, встречаемости гомозигот по аллелям С и А у мужчин и женщин контрольной выборки были заметно различными, а распределение аллелей в группе пациентов с РПЖ оказалось промежуточным между мужским и женским вариантами.

Рис. 7. Распределение аллелей А/С гена СНЯ (в процентах). Диаграмма 1 - мужчины контрольной выборки. Диаграмма 2 - женщины контрольной выборки. Диаграмма 3 -больные раком простаты. Ряд 1 - гомозиготы по аллелю С. Ряд 2 - гетерозиготы. Ряд 3 -гомозиготы по аллелю А.

Полученные данные показывают необходимость сочетанного использования многих ЗОТ'в и подбора адекватных групп сравнения при общей перспективности такого подхода для получения сведений об ассоциации отдельных ДНК-полиморфизмов с риском РПЖ.

Изучение специфичности и возможностей клинического использования потенциальных белковых маркеров рака предстательной железы человека.

Для того, чтобы охарактеризовать специфичность белка АСЯ2 для малигнизи-рованного эпителия, было предпринято сравнительное изучение присутствия этого потенциального маркера в различных культивируемых клетках и образцах тканей ПЖ с помощью протеомных методов. Присутствие белка АСЯ2 было отмечено в раковых образцах простаты и в культивируемых клетках рака простаты линии ГЛчГСаР, тогда как во всех других изучавшихся объектах (образцы простаты с гиперплазией, клетки рабдомиосаркомы линий ЮЗ и А-204, культивируемые миобласты и фибробласты человека) указанный белок отсутствовал. Полученные результаты свидетельствуют о том, что присутствие белка АС112 специфично для злокачественных эпителиальных опухолей ПЖ.

Для проверки диагностической значимости сформированной панели из 10 потенциальных белковых маркеров РПЖ совместно с сотрудниками НИИ урологии было организовано «двойное слепое исследование» на случайной выборке пациен-

тов с клиническими диагнозами РПЖ или ДШЖ. При «двойном слепом исследовании» образцы тканей просташ от 20 пациентов направлялись параллельно на гистологический и протеомный анализ. При протеомном анализе проводили полуколиче-ственнуго оценку белков и рассчитывали суммарную оценку белков каждого образца. В результате в 75% случаев диагноз по белковым маркерам полностью совпал с диагнозом по клинико-морфологическим критериям. С помощью нротеомного анализа удалось распознать 79% случаев РПЖ. Причиной отдельных случаев ложноот-рицательной диагностики могло быть низкое содержание раковых клеток в поступивших на протеомный анализ образцах. Проведенная нротеомная диагностика с использованием панели потенциальных маркеров дала 33% ложноположительных результатов, что лучше, чем при традиционном использовании ПСА (по разным оценкам от 40 до 60% ложноположительных результатов). Исходя из результатов представленного независимого анализа биоматериалов, можно сделать вывод о том, что предложенная панель потенциальных маркеров может быть полезна для дальнейших исследований по улучшению качества диагностики РПЖ.

Формирование макетной версии компьютерной базы данных о «мажорных» белках предстательной железы человека.

Построение макетной версии компьютерной базы данных о «мажорных» белках ПЖ осуществлялось на основании нескольких общих принципов. Во-первых, учитывая то, что информационным наполнением такой базы данных должны стать собственные результаты в сочетании с соответствующими литературными материалами, был применен принцип многоуровневого формирования Во-вторых, исходно предусматривались возможности расширения и модернизации базы В-третьих, для обеспечения обращений к международным базам данных была применена система гиперссылок для входа через Интернет в базы данных NCBI и SWISS-PROT.

Первый уровень макетной версии компьютерной базы данных представляет собой интерактивную карту, созданную на основе построенной ранее синтетической карты белков тканей простаты (Рис. 4), на которой после пофрагментного анализа выделили 64 белковые фракции, соответствующие некоторым идентифицированным «мажорным» белкам с важными биомедицинскими свойствами. Позиции каждого из «мажорных» белков на интерактивной карте с помощью соответствующего программного обеспечения трансформировали в «кнопки» (гинерссылки), позволяющие переходить на второй уровень. Второй уровень базы данных содержит полученные в ходе собственных исследований данные о соответствующем белке: экспериментальные Мм и pl белка, сведения о результатах его масс-спектро-мегрической идентификации. В документе второго уровня предусмотрена гиперссылка для перехода на третий уровень. Разработанная структура документа второго уровня представлена на Рис 8А. Третий уровень базы данных представляет собой краткий обзор сведений о данном белке: индексы в базах данных (GeneBank, OMIM, SWISS-PROT), расчетные Мм и pl белка, аминокислотная последовательность белка, характеристики белка и гена и ссылки на избранные публикации об этом белке. Разработанный формат документа третьего уровня представлен на Рис. 8Б.

Макетная версия компьютерной базы данных, которая содержит сведения о 64

«мажорных» белках ПЖ, может стать основой для создания соответствующей электронной версии с последующим ее размещением в сети Интернет. Двумерная база данных белков ПЖ, доступная через компьютерную сеть, может быть полезна для дальнейших молекулярных исследований ПЖ.

Номер фракции на карте -Локализация на электрофореграмме (фрагмент') -Мм (наблюдаемая величина) -р] (наблюдаемая величина*) -Идентификация - Название белка Метод идентификации - MALDI-TOF MS (MS/MS) Процент совпадения масс выявленных триптиче-ских пептидов с последовательностью белка -Результаты анализа выявленных триптических пептидов с помощью опции Peptide Fingerprint программы Mascot (Matrix Science) -Дополнительная информация -

Название белка Б

Номер фракции на карте -

Индексы в базах данных: GeneBank —; ОШМ —,

SWISSPROT-.

Мм (расчетная величина) -

р! (расчетная величина) -

Аминокислотная последовательность -

Характеристики белка —

Характеристики гена' Сгшвол(ы) -; Хромосомная локализация —, Строение —; Модель (NCBI Entrez Cene) -

Особенности генной экспрессии -Полиморфизм Генный уровень —, Транскрипционный уровень —, Белковый уровень — Избранные публикации -

Рис. 8. Формат документов макетной версии компьютерной базы данных о «мажорных» белках ПЖ А - Уровень 2; Б - Уровень 3.

ВЫВОДЫ

а) построена синтетическая двумерная карта белков предстательной железы человека, включающая 558 белковых фракций, обладающих Мм 6,5 - 450 кДа и р1 4,3 -13,7;

б) идентифицировано 107 из 558 белковых фракций, нанесенных на двумерную карту; при этом обнаружено три новых белка предстательной железы.

2. При сравнительном анализе белков предстательной железы при раке и доброкачественной гиперплазии определены и использованы как специальная панель 10 потенциальных белковых маркеров РПЖ, среди которых - АОЯ2, комплекс легких и тяжелых цепей ферритина, белок, связывающий жирные кислоты (изоформа 5), НЗ гистон семейства ЗА, простатический связывающий белок, дисульфидизомераза белков ЕЯ60, М-ацетилнейраминат-фосфат-синтаза, а также впервые выявленные белок Р1Ю2675 и белковые продукты генов §к6650826 и 2^:16306948.

3. При исследовании изменчивости актин-связывающих белков в тканях предстательной железы человека впервые выявлена множественность изоформ трансге-линов, обусловленная в основном биохимическим полиморфизмом белковых продуктов гена трансгелина (TAGL.N1).

4. С помощью протеомных методов в тканях предстательной железы обнаружены две изоформы проетат-специфического антигена и редкий вариант енолазы 1 и подтверждено существование по одному из вариантов для 59 расчетных «конфликтных» определений аминокислотной последовательности 16 белков.

5. Проведенное пилотное исследование встречаемоаи аллелей однонуклеотид-ного полиморфизма А/С (rs6180) гена GHR у больных раком простаты показало перспективность такого подхода для получения сведений об ассоциации отдельных ДНК-полиморфизмов с риском РПЖ.

6. Получены данные о специфичности белка AGR2 для злокачественных эпителиальных опухолей предстательной железы и в «двойном слепом исследовании» на ограниченной выборке пациентов показана диагностическая значимость сформированной панели из потенциальных 10 белковых маркеров РПЖ

7. По результатам протеомных исследований создана макетная версия трехуровневой компьютерной базы данных, содержащей обобщенную информацию о 64 «мажорных» белках предстательной железы.

ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Ковалев Л И , Еремина JI С . Шишкин С С , Торопыгин И.Ю., Дзеранов Н.К., Ка-заченко A.B., Хасигов П 3 , Ковалева М.А., Тотров К И., Лоран О.Б , Колбасов Д Н. Исследование белков простаты с использованием протеомных технологий для разработки подходов к молекулярной диагностике рака Тез. III конф. «Мужское здоровье», Москва, 2006. С. 141-142.

2. Еремина Л С Поиск новых диагностических маркеров рака предстательной железы. Тез. докл I международной Пироговской студенческой научной конф, Вестник РГМУ, №2,2006. С. 336.

3. Попов В О., Шишкин С.С., Ковалев Л И , Торопыгин И Ю , Дзеранов Н.К , Каза-ченко A.B., Ковалева M А, Еремина Л.С, Тотров К.И., Лоран O.E., Колбасов Д.Н. Идентификация семи изоформ трансгелинов и некоторых других актин-связывающих белков в образцах раковых тканей простаты Тез. конф. «Фундаментальные науки - медицине», Москва, 2006. С 169-170

4. Ковалев Л И, Шишкин С.С., Хасигов II.3, Дзеранов H К., Казаченко А.В , Ковалева M А , Торопыгин И Ю , Еремина Л.С , Грачев C.B. Новые подходы к молекулярной диагностике рака простаты. // Урология, №5,2006. С.16-19.

5. Kovalyov L.I, Loran O.B , Shishkin S.S., Kovalyova M.A, Eryomina L S„ Toropygm I.Y., Dzeranov N K., Kazachenko A. V., Kononkov I.V., Senogin Jr A. Analysis of qualitative and quantitative changes of proteins in prostate cancer tissue with the application of proteomics technologies. Eur .Urology Suppl, 2007. V 6. Is 2. P. 151.

6. Шишкин C.C., Ковалев Л.И., Крахмалева И.Н., Ковалева М.А., Еремина Л С., Попов В.О. Биомедицинские аспекты в исследованиях биохимического полиморфизма актинов и некоторых актин-связывающих белков. / Молекулярный полиморфизм человека (под ред. С.Д. Варфоломеева), 2007. Т.2. С.483 - 539.

7. Еремина Л.С , Ковалев Л И., Шишкин С.С., Торопыгин И.Ю., Буракова М.В., Ковалева М.А., Макаров А А., Дзеранов Н.К., Казаченко A.B., Тотров К.И., Конон-ков И.В., Лоран О.Б. Биохимический полиморфизм трансгелинов в простате человека при гиперплазии и раке. // Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии, №3, 2007. С.49 -52

8. Еремина Л.С., Ковалев Л.И , Ковалева M А., Макаров A.A., Шишкин С.С., Буракова М.В , Чернов Н.Н , Торопыгин И Ю , Кононков И.В. Сравнительное изуче-

ние белка AGR2 в некоторых культивируемых клетках и образцах тканей простаты. // Вестник РУДН, серия «Медицина», №6,2007. С.257-261. 9. Еремина Л.С., Ковалев Л.И., Ковалева М.А., Торопыгин И.Ю., Охриц В.Е., Лоран О.Б., Шишкин С.С., Чернов Н.Н. Новый актин-родственный белок (продукт гена gi:16306948) у больных раком предстательной железы. Тез. IY съезда Российского общества биохимиков и молекулярных биологов, Новосибирск, 2008. С. 216. Ю.Лисицкая К.В., Крахмалева И.Н., Еремина Л.С.. Тотров К.Й., Шишкин С.С. Изучение однонуклеотидных полиморфизмов (SNP's) в генах GHR и FMN1 у здоровых россиян, а также у больных раком предстательной железы. Тез. IY съезда Российского общества биохимиков и молекулярных биологов, Новосибирск, 2008. С. 218.

И.Ковалева М.А., Ковалев Л.И., Еремина Л.С . Макаров А.А., Буракова М.В., Торопыгин И.Ю., Серебрякова М В., Шишкин С.С., Арчаков А.И. Определение «аминокислотных конфликтов» и аминокислотных замен в первичных структурах 41 белка человека протеомными технологиями. // Биомедицинская химия. Т.54, №4, 2008. С. 420-434.

ЕРЕМИНА ЛИДИЯ СЕРГЕЕВНА (РОССИЯ)

ИЗУЧЕНИЕ БЕЛКОВ ПРЕДСТАТЕЛЬНОЙ ЖЕЛЕЗЫ ЧЕЛОВЕКА ПРИ РАКЕ И ДОБРОКАЧЕСТВЕННОЙ ГИПЕРПЛАЗИИ С ПОМОЩЬЮ ПОСТГЕНОМНЫХ

ТЕХНОЛОГИЙ

В работе обобщены результаты системного изучения белков предстательной железы человека при раке и доброкачественной гиперплазии с помощью двумерного электрофореза, MALDI-TOF масс-спектрометрии, иммуноблоттипга и полимеразной цепной реакции в режиме реального времени. Впервые построена синтетическая двумерная карта белков предстательной железы человека, включающая 558 белковых фракций; 107 белковых фракций идентифицировано, обнаружено 3 новых белка предстательной железы. Выявлено 10 белков, которые можно рассматривать как потенциальные маркеры рака простаты. Найдены две изоформы простат-специфического антигена и редкий вариант енолазы 1. Проведено уточнение 59 «конфликтных» определений аминокислот в последовательностях 16 белков предстательной железы. На основе построенной синтетической карты создана макетная версия трехуровневой компьютерной базы данных о «мажорных» белках предстательной железы человека, включающая 64 белковые фракции и пригодная к дальнейшему расширению.

LIDIA S. EREMINA (RUSSIA)

STUDY OF PROTEINS IN PROSTATE CANCER AND BENIGN PROSTATE HYPERPLASIA TISSUES BY POSTGENOMIC TECHNOLOGIES

The results of systematic analysis of proteins in human prostate carcinoma and benign hyperplasia tissues by 2D-PAGE, MALDI-TOF MS, Western-blot and real time-PCR were summarized. The first version of the synthetic two-dimensional map of human prostate proteins (containing 558 spots) was designed. 107 proteins were identified, including three new proteins. Ten proteins were found to be overexpressed in most of carcinoma specimens and therefore considered as potential biomarkcrs of prostate canccr. 59 registered «conflicts» in ammo acids sequences of 16 identified proteins were specified. Two PSA isoforms formed due to alternative splicing and a rare variant of enolasc 1 were found. Several SNP's in genes TAGLN and GHR were studied An initial version of computer database of 'major' human prostate proteins (including 64 protein fractions) was created

Подписано в печать 12.09 2008 г

Печать трафаретная

Заказ № 733 Тираж 100 экз

Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш, 36 (499) 788-78-56 \vwvv аиШгеГега! ги

Содержание диссертации, кандидата медицинских наук, ЕРЕМИНА, ЛИДИЯ СЕРГЕЕВНА

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. Изучение молекулярных нарушений в тканях предстательной железы человека при опухолевой трансформации (обзор литературы)

1.1 Общие характеристики злокачественных опухолей предстательной железы и основные тенденции в их биохимических исследованиях.

1.2. Протеомные исследования тканей и клеток предстательной железы человека в норме и при опухолевой трансформации.

1.2.1. Возникновение системного анализа белков как продуктов генной экпрес-сии. Исследования белков предстательной железы человека в догеномный период до 1989 г.)

1.2.2. Исследования белков предстательной железы человека в геномный период (1989 - 2001 гг.).

1.2.3. Исследования белков предстательной железы человека в постгеномную эру (с 2001 г.)

1.3. Молекулярно-генетические исследования предстательной железы человека при опухолевой трансформации.

1.4. Поиски молекулярных маркеров рака предстательной железы с использованием постгеномных технологий.

1.5. Исследования полиморфизма некоторых актин-связывающих белков при раке предстательной железы человека.

ГЛАВА 2. Материалы и методы.

2.1. Реактивы и биологические материалы.

2.1.1. Реактивы.

2.1.2. Биологические материалы.

2.2. Подготовка образцов для проведения электрофоретических исследований

2.3. Фракционирование белков одномерным электрофорезом по Лэммли.

2.4. Фракционирование белков двумерным электрофорезом.

2.4.1. Изоэлектрофокусирование и неравновесное фокусирование в полиакри-ламидном геле в градиенте рН, сформированном амфолинами.

2.4.2. Изоэлектрофокусирование в иммобилиновом градиенте рН.

2.4.3. SDS-электрофорез в пластинах полиакриламидного геля.

2.5. Детекция белков на гелевых пластинах. Дениситометрия одномерных и двумерных электрофореграмм. Компьютерный анализ результатов. Хранение гелевых пластин.

2.6. Иммуноблоттинг.

2.7. Масс-спектрометрическая идентификация белков.

2.8. Определение концентрации белков.

2.9. Методы получения препаратов ДНК и формирования ДНК-коллекций.

2.10. Метод дискриминации аллелей с помощью полимеразной цепной реакции в режиме реального времени для исследования однонуклеотидных полиморфизмов ДНК.

2.11. Статистическая обработка результатов.

ГЛАВА 3. Полученные результаты и их обсуждение.

3.1. Исследование белкового состава тканей предстательной железы человека с помощью протеомных технологий.

3.1.1. Формирование обобщенной двумерной карты белков простаты.

3.1.2. Масс-спектрометрическая идентификация белков предстательной железы на двумерной карте. Различия белковых паттернов образцов с раком и доброкачественной гиперплазией.

3.2. Изучение изменчивости белков в тканях предстательной железы человека

3.2.1. Изоформы актин-связывающих белков в тканях предстательной железы

3.2.2. Полиморфизм ПСА в тканях предстательной железы

3.2.3. Полиморфизм енолазы 1 в тканях предстательной железы

3.2.4. Уточнение «конфликтных» определений аминокислотных последовательностей идентифицированных белков предстательной железы.

3.2.5. Пилотное исследование однонуклеотидных полиморфизмов в некоторых генах, экспрессирующихся в тканях предстательной железы.

3.3. Изучение специфичности и возможностей клинического использования потенциальных белковых маркеров рака предстательной железы человека.

3.4. Формирование макетной версии компьютерной базы данных о «мажорных» белках предстательной железы человека.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Изучение белков предстательной железы человека при раке и доброкачественной гиперплазии с помощью постгеномных технологий"

Актуальность темы

Успешная реализация международного проекта "Геном человека" [International Human Genome Sequencing Consortium 2001; Venter C.J. et al. 2001] привела к формированию в начале XXI века нескольких новых научных дисциплин (геномики, протео-мики, транскриптомики, биоинформатики и др.), а также к внедрению в различные молекулярные исследования новых высокоэффективных технологий, предназначенных для изучения генов человека и кодируемых ими белковых продуктов [Baxevanis А., Ouellette B.F.F. 1998; Jungblut P.R. et al. 1999; Арчаков А.И. 2000; Шишкин C.C. 2002; Примроуз С,, Тваймен Р. 2008 и др.]. Все это позволяет говорить о переходе биохимии и генетики человека в постгеномную эру развития. К постгеномным технологиям относят многочисленные методы, применяемые в геномике, протеомике, транскриптомике и других новых дисциплинах, несмотря на то, что некоторые из этих методов первоначально были предложены еще в догеномный период развития [Арчаков А.И. 2000; Шишкин С.С. 2002; Serruto D., Rappuoli R. 2006; Hughes С. et a!. 2006; Примроуз С., Тваймен P. 2008 и др.]. Вполне естественно, что новые исследовательские возможности постгеномных технологий в значительной степени ориентированы на решение актуальных биомедицинских проблем [Anderson N.G., Anderson N.L. 1996; Celis J. et al. 1996; Арчаков А.И. 2000; Шишкин C.C. 2002; Jiang Z. et al. 2005; Zhang J.S. et al. 2005; Kris-tiansen G. et al. 2005; Devaney J.M. et al. 2007 и др.].

Одной из важнейших проблем современной медицины является широкая распространенность онкологических заболеваний, среди которых особое место принадлежит раку предстательной железы (РПЖ). За период 1994-2004 гг. в России при незначительном общем снижении заболеваемости злокачественными новообразованиями (на 4,3%) заболеваемость РПЖ увеличилась более чем на 70% со средним годовым ростом на 6,1% [Чиссов В.И. и др. 2004]. В последние годы в России РПЖ занимает 4-е место в структуре онкологической заболеваемости мужчин [Давыдов М.И., Аксель Е.М. 2006]. В странах с более эффективной системой выявления РПЖ показатель заболеваемости этой формой рака еще выше. В структуре онкологических заболеваний в ряде стран Запада РПЖ находится на 2-3 месте после рака легких и желудка, а в США в 2007 г. РПЖ вышел на 1-е место [Jemal A. et а!. 2007].

Высокие темпы роста РПЖ (первое место среди других онкологических заболеваний) и обширный контингент в группе риска (фактически, все мужчины старше 50 лет) делают проблемы РПЖ не только медицинскими, но в значительной степени и медико-социальными. Это определяет высокую актуальность исследований, направленных на изучение молекулярных основ патогенеза РПЖ и использование новых данных о молекулярных нарушениях при этой патологии для создания эффективных методов ее диагностики и лечения.

До недавнего времени считалось, что проблему точной диагностики РПЖ решает анализ уровня так называемого простат-специфического антигена (ПСА), однако существуют убедительные данные о недостаточной диагностической значимости этого маркера [Stamey Т.А. et al. 2004; Parekh D.J. et al. 2007; Thompson I.M., Ankerst D.P. 2007]. Показано, что около 40% пациентов с нормальным уровнем ПСА имеют клинически выраженный РПЖ [Lange Р.Н. et al. 1989; Hudson М.А. et al. 1989; Charrier J.P. et al. 2001], тогда как у 65% лиц с повышенным уровнем ПСА (выше 4,0 нг/мл) оказываются иные заболевания простаты, в частности, доброкачественные гиперплазии [Charrier J.P. et al. 2001; Catalona W.J. et al. 1998]. Как следствие, в США и других западных странах более 10 лет ведутся поиски новых, более эффективных маркеров РПЖ [Hudson М.А. et al. 1989; Catalona W.J. et al. 1993; Catalona W.J. et al. 1998; Charrier J.P. et al. 2001; Jiang Z. et al. 2004; Hutchinson L.M. et al. 2005b]. Одно из центральных мест в этих поисках занимают работы, проводимые с помощью различных постгеномных и, в частности, протеомных технологий [Jiang Z. et al. 2004; Jiang Z. et al. 2005; Zhang J.S. et al. 2005; Hutchinson L.M. et al. 2005a; Kristiansen G. et al. 2005].

Активное использование постгеномных технологий для поисков белков-потенци-альных маркеров уже привело к выявлению нескольких сотен потенциальных маркеров РПЖ. Диагностическая значимость этих белков продолжает интенсивно изучаться [Zhang J.S. et al. 2005; Kristiansen G. et al. 2005; Liu D. et al. 2005; Hutchinson L.M. et al. 2005b]. Некоторые из вновь обнаруженных белковых маркеров начали применяться в иммуногистологической диагностике РПЖ при анализе биоптатов. Тем не менее, удовлетворительной замены тестам на содержание ПСА в сыворотке крови пока не найдено.

Цель и задачи исследования

Основной целью данной диссертационной работы стало системное изучение белков предстательной железы человека при раке и доброкачественной гиперплазии с помощью постгеномных технологий.

В соответствии с целью исследования в работе решались следующие задачи:

1) изучить комплекс белковых продуктов генной экспрессии в тканях предстательной железы человека с помощью двумерного электрофореза. По результатам фракционирования суммарных экстрактов белков построить синтетическую двумерную карту белков предстательной железы;

2) провести сравнительный анализ белков предстательной железы человека при раке и доброкачественной гиперплазии для обнаружения потенциальных белковых маркеров РПЖ;

3) провести масс-спектрометрическую идентификацию предполагаемых белковых маркеров РПЖ и наиболее представленных белков на двумерных картах анализируемых тканей;

4) провести предварительную проверку диагностической значимости выявленных белковых маркеров РПЖ в «двойном слепом исследовании»;

5) изучить полиморфизм ряда белков в тканях предстательной железы человека; б) полученные данные использовать для создания компьютерной базы данных об идентифицированных белках тканей предстательной железы человека.

Научная новизна работы

Впервые построена обобщенная двумерная карта белков простаты человека, на которой суммированы результаты двумерного электрофоретического анализа образцов тканей простаты с гиперплазией и раком. На карте представлено 558 белков, среди которых идентифицировано 107, включая 3 новых. Выявлено 10 белков, которые можно рассматривать как потенциальные маркеры рака простаты. В тканях предстательной железы впервые обнаружено 12 изоформ трансгелинов, выявлены 2 изоформы простат-специфического антигена и редкий вариант енолазы 1. Проведено уточнение 59 «конфликтных» определений аминокислотных последовательностей 16 белков предстательной железы. На основе построенной синтетической карты создана макетная версия трехуровневой компьютерной базы данных о «мажорных» белках простаты человека, включающая 64 белковые фракции и пригодная к дальнейшему расширению.

Научно-практическая значимость работы

Получены обобщенные данные о 558 белковых продуктах генной экспрессии, которые представлены в тканях предстательной железы человека в норме и при патологии (ДГПЖ, РПЖ). На этой основе построена двумерная карта белков предстательной железы, которая может рассматриваться как характерный, генетически детерминированный «белковый портрет» исследованных тканей, и макетная версия компьютерной базы данных о «мажорных» белках предстательной железы. Созданная база данных может быть использована для решения широкого круга задач, в число которых входит изучение молекулярных механизмов этиологии и патогенеза заболеваний предстательной железы, поиск новых диагностических маркеров и т.д.

Проведено сравнительное изучение белкового состава предстательной железы при доброкачественной гиперплазии и раке, что позволило выбрать кандидатные белки для разработки специфических тестов на РПЖ. Сформирована панель из десяти потенциальных белков-маркеров РПЖ (прообраз мультипараметрического диагностику-ма), включающая три новых белка. В ходе клинических исследований на ограниченной выборке пациентов с раком и доброкачественной гиперплазией проверена диагностическая значимость выявленных белковых маркеров РПЖ.

Подготовлена заявка на изобретение способа диагностики рака простаты по определению продукта гена PR02675 - алькарцина 1 (альбумин-родственного карциномного протеина) в диагностических биопсиях протеомными технологиями. Предложенный способ диагностики основан на том, что при раковой трансформации в тканях простаты выявляется ранее не использовавшийся маркер рака - белковый продукт гена PR02675.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту

1. По результатам протеомного изучения белков предстательной железы человека при раке и доброкачественной гиперплазии построена синтетическая двумерная карта белков предстательной железы, включающая 558 белковых фракций с Мм 6,5 - 450 кДа и pi 4,3 - 13,7; идентифицировано 107 из 558 белковых фракций, нанесенных на двумерную карту, и обнаружено три новых белка предстательной железы.

4. Создана макетная версия 3-х уровневой компьютерной базы данных, содержащей обобщенную информацию о 64 «мажорных» белках предстательной железы человека.

Апробация работы

Материалы диссертации докладывались на следующих конференциях:

1. III Всероссийская конференция «Мужское здоровье» (Москва, 2006).

2. I Международная Пироговская студенческая научная конференция (Москва, 2006).

3. Конференция «Фундаментальные науки - медицине» (Москва, 2006).

4. Конференция «Фундаментальные науки - медицине» (Москва, 2007).

5. 22-ой Ежегодный съезд Европейской ассоциации урологов (EUA Congress, Berlin, 2007).

6. IY съезд Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008).

Публикации по материалам работы

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", ЕРЕМИНА, ЛИДИЯ СЕРГЕЕВНА

выводы

1. В результате изучения белков предстательной железы человека при раке и доброкачественной гиперплазии, проведенного с помощью протеомных технологий (двумерный электрофорез, масс-спектрометрия, иммуноблоттинг и др.): а) построена синтетическая двумерная карта белков предстательной железы человека, включающая 558 белковых фракций с Мм 6,5 - 450 кДа и pi 4,3 - 13,7; б) идентифицировано 107 из 558 белковых фракций, нанесенных на двумерную карту; при этом обнаружено три новых белка предстательной железы человека.

2. При сравнительном анализе белков предстательной железы человека при раке и доброкачественной гиперплазии определены и использованы как специальная панель 10 потенциальных белковых маркеров РПЖ, среди которых - AGR2, комплекс легких и тяжелых цепей ферритина, белок, связывающий жирные кислоты (изоформа 5), НЗ гистон семейства ЗА, простатический связывающий белок, дисульфидизомераза белков ER60, N-ацетилнейраминат-фосфат-синтаза, а также впервые выявленные белок PR02675 и белковые продукты генов gi:6650826 и gi:16306948.

3. При исследовании изменчивости актин-связывающих белков в тканях предстательной железы человека впервые выявлена множественность изоформ трансгелинов, обусловленная в основном биохимическим полиморфизмом белковых продуктов гена трансгелина (TAGLN1).

4. С помощью протеомных методов в тканях предстательной железы человека обнаружены две изоформы простат-специфического антигена и редкий вариант енолазы 1 и подтверждено существование по одному из вариантов для 59 расчетных «конфликтных» определений аминокислотных последовательностей 16 белков.

5. Проведенное пилотное исследование встречаемости аллелей однонуклеотидно-го полиморфизма А/С (rs6180) в гене GHR у больных раком простаты показало перспективность такого подхода для получения сведений об ассоциациях отдельных ДНК-полиморфизмов с риском РПЖ.

6. Получены данные о специфичности белка AGR2 для злокачественных эпителиальных опухолей предстательной железы, и в «двойном слепом исследовании» на ограниченной выборке пациентов показана диагностическая значимость сформированной панели из 10 потенциальных белковых маркеров РПЖ.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

С завершением международного проекта «Геном человека» и с началом так называемой постгеномной эры в развитии биомедицинских исследований появились широкие возможности для поиска новых биомаркеров различных видов патологии и, в частности, РПЖ. В подобных исследованиях активно применяются протеомные технологии. Ключевыми задачами в стратегии протеомных исследований считаются построение обобщенных синтетических двумерных белковых карт и компьютерных баз данных о белках исследуемых объектов. Указанная стратегия была применена в данной работе.

В ходе проведенных исследований с помощью масс-спектрометрического анализа было идентифицировано 107 белков в тканях простаты, среди которых оказалось как минимум три новых продукта генной экспрессии: гамма-актин родственный белок (возможный продукт гена gi: 16306948), алькарцин 1 (продукт гена PR02675) и возможный продукт гена PR02044.

По результатам сравнительных протеомных исследований белков тканей простаты (операционные материалы и биоптаты) построена первая версия отечественной синтетической двумерной карты белков простаты (558 белковых фракций) и создана начальная версия компьютерной базы данных о 64 «мажорных» белках тканей простаты человека, представленных в норме, при ДГПЖ и при РПЖ, пригодная к дальнейшему расширению.

Проведенный протеомный анализ белков в образцах тканей простаты с доброкачественной гиперплазией и раком позволил сформировать панель из десяти потенциальных белков - маркеров РПЖ, включающую три новых белка (прообраз мультипара-метрического диагностикума).

В ходе «двойного слепого исследования» на ограниченной выборке (20 пациентов с ДГПЖ или РПЖ) была проведена предварительная проверка диагностической значимости сформированной панели из десяти потенциальных белков - маркеров РПЖ. Исходя из результатов «двойного слепого исследования» можно сделать вывод о том, что предложенная панель потенциальных маркеров может быть полезна для дальнейших исследований по улучшению качества диагностики РПЖ.

Несмотря на успехи в расшифровке молекулярных механизмов канцерогенеза до настоящего времени в этой области остается немало непознанного. В частности, большое внимание привлекают характерные изменения в опухолевых клетках цитоскелет-ных структур и особенно актиновых микрофиламентов, в составе которых обнаруживаются различные изоформы актин-связывающих белков. В связи с этим особые биомедицинские перспективы имеют исследования биохимического полиморфизма актин-связывающих белков при опухолевой трансформации.

Биохимический полиморфизм может быть следствием генетического полиморфизма, обусловленного полилокусносгью и полиаллелизмом (в том числе наличием SNP's), а также следствием альтернативного сплайсинга и постсинтетических модификаций белков (фосфорилирование, гликозилирование и т.д.). Поэтому для всестороннего изучения полиморфизма белков применяются как протеомные, так и ДНК-технологии.

При сравнительном протеомном исследовании актин-связывающих белков в образцах тканей ПЖЧ с доброкачественными и злокачественными опухолями на двумерных электрофореграммах с помощью масс-спектрометрии было идентифицировано 12 трансгелиновых белков - продуктов генов TAGLN1 и TAGLN2. Анализ результатов MALDI-TOF MS в сопоставлении с величинами Мм показал, что четыре белка с высокой степенью достоверности являются полноразмерными продуктами экспрессии гена TAGLN1. Небольшие различия в pi у этих изоформ трансгелина указывают на то, что они, возможно, являются продуктами какой-либо посттрансляционной модификации, например - фосфорилирования. Еще шесть белков, очевидно, являются белковыми продуктами, образовавшимися при считывании информации с укороченного («вариантного») трансгелинового транскрипта, который кодирует первые 184 а.о. трансгелино-вой последовательности. Обнаруженные укороченные изоформы трансгелина могли образоваться как благодаря синтезу с укороченного транскрипта, так и благодаря посттрансляционному отщеплению С-концевой последовательности, но возможно также участие других посттрансляционных модификаций.

Применение ДНК-технологий позволяет исследовать ассоциации различных SIMP's с риском развития тех или иных заболеваний. Результаты проведенного пилотного исследования распределения аллелей однонуклеотидного полиморфизма А/С в позиции 1630 гена GHR у больных раком простаты показали перспективность такого подхода для получения сведений об ассоциациях отдельных ДНК-полиморфизмов с риском РПЖ.

Использование различных постгеномных технологий в биомедицинских исследованиях открывает новые возможности для решения насущных задач медицинской практики. В то же время подход, основанный на использовании комплекса постгеномных технологий, без сомнения, имеет широкие перспективы применения в фундаментальных исследованиях белков.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата медицинских наук, ЕРЕМИНА, ЛИДИЯ СЕРГЕЕВНА, Москва

1. Александров В.П., Карелин М.И. Рак предстательной железы. СПб.: СПбМАПО, 2004; 148 с.

2. Арчаков А.И. Что после геномики? Протеомика. // Вопр. мед. химии, 2000; 46(4):335-343.

3. Баев А.А. Программа «Геном человека»: ее возникновение, содержание и развитие. // Итоги науки и техники. Сер. Геном человека, 1990; 1:4-33.

4. Брызгунова О.Е., Власов В.В., Лактионов И.И. Современные методы диагностики рака предстательной железы. // Биомедицинская химия, 2007; 53(5): 128-139.

5. Гланц С. Медико-биологическая статистика. / Пер. с англ. под ред. Н. Е. Бузика-швили и Д. В. Самойлова. М.: Практика, 1999; 460 с.

6. Говорун В.М., Арчаков А.И. Протеомные технологии в современной биомедицинской науке. // Биохимия, 2002; 67(10):1341-1359.

7. Громов П.С., Целис Х.Э. От геномики к протеомике. // Мол. биол., 2000; 34:597611.

8. Давыдов М.И., Аксель Е.М. (ред.). Статистика злокачественных новообразований в России и странах СНГ в 2004 г. // Вестник Российского онкологического научного центра имени Н.Н.Блохина РАМН, 17(3 (прил. 1)). М., 2006; 132 с.

9. Зенгбуш П. Молекулярная и клеточная биология. / Пер. с нем. под ред. В.А. Эн-гельгардта. Т. 1-3. М.: Мир, 1982.

10. Ивахно С., Корнелюк А. Количественная протеомика и ее применение в системной биологии. // Биохимия, 2006; 71(10):1312-1327.

11. Ковалев Л.И., Шишкин С.С., Иволгина Г.Л., Громов П.С., Шандала A.M. Выявление межлинейного полиморфизма белков сердечной мышцы мышей методом двумерного электрофореза. // Биохимия, 1986; 51(б):896-908.

12. Крахмалева И.Н., Липатова Н.А., Шишкин С.С., Шаховская Н.И. Структура дистро-финового гена у больных миодистрофией Дюшенна. // Журнал неврологии и психиатрии, 1999; 99(3):41-43.

13. Кушлинский Н.Е, Соловьев Ю.Н., Трапезникова М.Ф. Рак предстательной железы. М.: РАМН, 2002; 432 с.

14. Марри Р., Греннер Д., Мейес П., Родуэлл В. Биохимия человека. / Пер. с англ. Т. 12. М.: Мир, 1993.

15. Остерман Л.О. Исследование биологических макромолекул электрофокусированием, иммуноэлектрофорезом и радиоизотопными методами. М.: Наука, 1983; с. 45260.

16. Примроуз С., Тваймен Р. Геномика. Роль в медицине. М.: БИНОМ. Лаборатория знаний, 2008; 277 с.

17. Ригетти П. Изоэлектрическое фокусирование. Теория, методы и применение. М.: Мир, 1986; 398 с.

18. Чиссов В.И., Старинский В.В., Петрова Г.В. (ред.) Злокачественные новообразования в России в 2002 году. Заболеваемость и смертность. М.: МЕДпресс-информ, 2004; с.5-22.

19. Шишкин С.С. Молекулярно-анатомическое направление в биохимической генетике. // Вестник АМН СССР, 1985; 1:78-84.

20. Шишкин С.С. От структурной геномики к функциональной: теоретические и прикладные аспекты. // Вест. РАМН, 2002; 4:11-16.

21. Шишкин С.С., Ильинский Р.В., Ковалев Л.И., Борисенко В.И., Громов П.С., Чеса-лин Л.С. Анализ результатов двумерного электрофоретического фракционирования на комплексе цифровой обработки видеоинформации (СВИТ). // Вопр. мед. химии, 1988; 2:131-135.

22. Шишкин С.С,, Калинин В.Н. Медицинские аспекты биохимической и молекулярной генетики. М.: ВИНИТИ, 1992; 216 с.

23. Шишкин С.С., Ковалев Л.И., Громов П.С. Функциональная геномика человека и протеомика, как раздел функциональной геномики. / Шишкин С.С. (ред.) "Много-ликость современной генетики человека". М.-Уфа: Гилем, 2000а; с. 17-50.

24. Шишкин С.С., Ковалев Л.И., Ковалева М.А. Протеомные исследования мышечных белков человека и некоторых других позвоночных. // Биохимия, 2004; 69(11): 1574 1591.

25. Шубникова Е.А., Юрина Н.А., Гусев Н.Б., Балезина О.П., Большакова Г.Б. Мышечные ткани. М.: Медицина, 2001; 235 с.

26. Ablin R.J., Bronson P., Soanes W.A., Witebeky E. Tissue- and species-specific antigens of normal human prostatic tissue. // J Immunol, 1970; 104:1329-1339.

27. Ablin R.J. Immunologic studies of normal, benign, and malignant human prostatic tissue. // Cancer, 1972; 29:1570-1574.

28. Abst. II Siena 2D-Electrophoresis Meeting «From Genome to Proteome», Siena, Italy, 16-18 Sept. 1996.

29. Abst. Human Genome Meeting '99, Brisbane, Australia, 27-30 March 1999.

30. Ahituv N., Sobe Т., Robertson N.G., Morton C.C., Taggart R.T., Avraham K.B. Genomic structure of the human unconventional myosin VI gene. // Gene, 2000; 261:269-275.

31. Alaiya A., Roblick U., Egevad L., Carlsson A., Franzen В., Volz D., Huwendiek S., Under S., Auer G. Polypeptide expression in prostate hyperplasia and prostate adenocarcinoma. // Anal Cell Pathol, 2000; 21(1): 1-9.

32. Anderson N.G., Anderson N.L. The human protein index. // Clin Chem, 1982; 28:739748.

33. Anderson N.G., Anderson N.L. Twenty years of two-dimensional electrophoresis: past, present and future. // Electrophoresis, 1996; 17(3):443-453.

34. Anderson N.G., Matheson A., Anderson N.L. Back to the future: the human protein index (HPI) and the agenda for post-proteomic biology. // Proteomics, 2001; 1(1):3-12.

35. Anderson N.L., Anderson N.G. A two-dimensional gel database of human plasma proteins.// Electrophoresis, 1991; 12(ll):883-906.

36. Anderson N.L., Anderson N.G. Proteome and proteomics: new technologies, new concepts, and new words. // Electrophoresis, 1998; 19:1853-1861.

37. Anderson N.L., Hofmann J.P., Gemmel A., Taylor S. Global approaches to the quantitative analysis of gene expression patterns observed by two-dimensional gel electrophoresis.// Clin. Chem. 1984; 30:2031-2036.

38. Appel R., Hochstrasser D., Roch C., Funk M., Muller A. F,, Pellegrini C. Automatic classification of twodimensional gel electrophoresis pictures by heuristic clustering analysis: a step toward machine learning.// Electrophoresis, 1988; 9:136-142

39. Asatiani E., Huang W.X, Wang A., Rodriguez Ortner E., Cavalli L.R., Haddad B.R., Gel-mann E.P. Deletion, methylation, and expression of the NKX3.1 suppressor gene in primary human prostate cancer. // Cancer Res, 2005; 65(4):1164-1173.

40. Banez L.L., Prasanna P., Sun L., Ali A., Zou Z., Adam B.L., McLeod D.G., Moul J.W., Srivastava S. Diagnostic potential of serum proteomic patterns in prostate cancer. // J Urol, 2003; 170(2 Pt l):442-446.

41. Bao L., Loda M,, Janmey P.A., Stewart R., Anand-Apte В., Zetter B.R. Thymosin beta-15: a novel regulator of tumor cell motility upregulated in metastatic prostate cancer. // Nature Med, 1996; 2:1322-1328.

42. Bao L., Loda M., Zetter B.R. Thymosin betal5 expression in tumor cell lines with varying metastatic potential. // Clin Exp Metastasis, 1998; 16(3):227-233.

43. Barak M., Mecz Y., Lurie A., Gruener N. Evaluation of prostate-specific antigen as a marker for adenocarcinoma of the prostate. // J Lab Clin Med, 1989; 113(5):598-603.

44. Baxevanis A., Ouellette B.F.F. Bioinformatics: A Practical Guide to analysis of genes and proteins. N.Y.: Johon Wieley and Sons Inc., 1998; 370 p.

45. Bensmail H., Haoudi A. Postgenomics: Proteomics and Bioinformatics in Cancer Research. // Journal of Biomedicine and Biotechnology, 2003; 4:217-230.

46. Birchmeier W., Behrens J. Cadherin expression in carcinomas: role in the formation of cell junctions and the prevention of invasiveness. // Biochim Biophys Acta, 1994; 1198(l):ll-26.

47. Bladou F., Gleave M.E., Penault-Llorca F., Serment G., Lange P.H., Vessella R.L. In vitro and in vivo models developed from human prostatic cancer. // Prog Urol, 1997; 7(3):384-396.

48. Blennerhassett J.В., Vickery A.L. Carcinoma of the prostate gland. An anatomical study of tumor location.//Cancer, 1966; 19(7):980-984.

49. Blum H., Beir H., Cross H.G. Improved silver staining of plant proteins, RNA and DNA in polyacrylamide gels. // Electrophoresis, 1987; 8(2): 126-129.

50. Boersma H.H., Kietselaer B.L., Stolk L.M., Bennaghmouch A., Hofstra L., Narula J., Heidendal G.A., Reutelingsperger C.P. Past, present, and future of annexin A5: from protein discovery to clinical applications. // J Nucl Med, 2005; 46(12):2035-2050.

51. Bookstein R., Allred D.C. Recessive oncogenes. I I Cancer, 1993; 71(3 Suppl):1179-1186.

52. Bostwick D.G. Staging prostate cancer 1997: current methods and limitations. // Eur Urol, 1997; 32 (Suppl 3):2-14.

53. Bradford M.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. // Anal Biochem, 1976; 72:248-254.

54. Brouard M.C., Saurat J.H., Ghanem G., Siegenthaler G. Urinary excretion of epidermal-type fatty acid-binding protein and S100A7 protein in patients with cutaneous melanoma. // Melanoma Res, 2002; 12(6):627-631.

55. Bruce A.W., Mahan D.E., Sullivan L.D., Goldenberg L. The significance of prostatic acid phosphatase in adenocarcinoma of the prostate. // J Urol, 1981; 125(3):357-360.

56. Buss F., Luzio J.P., Kendrick-Jones J. Myosin VI, an actin motor for membrane traffic and cell migration. // Traffic, 2002; 3:851-858

57. Calvo A., Gonzalez-Moreno O., Yoon C.-Y., Huh J.I., Desai K., Nguyen Q.T., Green J.E. Prostate cancer and the genomic revolution: Advances using microarray analyses. // Mutat Res, 2005; 576:66-79.

58. Carter D.B., Resnick M.I. High resolution analysis of human prostatic fluid by two-dimensional electrophoresis. // Prostate, 1982; 3:27-33.

59. Catalona W.J., Smith D.S., Ratliff T.L., Basler J.W. Detection of organ-confined prostate cancer is increased through prostate-specific antigen-based screening. // JAMA, 1993; 270:948-954.

60. Celis J., Gromov P., Ostergaard M., Madsen P., Honore В., Voram H., Rasmussen H. The impact of emerging biotechnology on medicine. // Proc. Int. Conf. «From genome to proteome». Italy, Siena, 1996; p.29-30.

61. Celis J., Honore В., Bauw G., Vandekerckhove J. Comprehensive computerized 2D gel protein databases offer a global approach to the study of the mammalian cell. // Bio-Essays, 1990a; 12(2):93-98.

62. Celis J.E., Bravo R. (ed.) Two-Dimensional Gel Electrophoresis of Proteins: Methods and Applications. N.Y.: Academic Press, 1984; 478 p.

63. Chakravatri A., Zehr E.M., Zietman A.L., Shipley W.U. et al. Thymosin beta-15 predicts for distant failure in patients with clinically localized prostate cancer-results from a pilot study. // Urology, 2000; 55(5): 635-638.

64. Charrier J.P., Tournel C., Michel S., Dalbon P., Jolivet M. Two-dimensional electrophoresis of prostate-specific antigen in sera of men with prostate cancer or benign prostate hyperplasia. // Electrophoresis, 1999; 20(4-5): 1075-1081.

65. Chen C., Hyytinen E.R., Sun X., Helin H.J., Koivisto P.A., Frierson H.F.Jr., Vessella R.L., Dong J.T. Deletion, mutation, and loss of expression of KLF6 in human prostate cancer. // Am J Pathol, 2003; 162(4): 1349-1354.

66. Chernyshov V.P. Immunochemical properties of acid phosphatase of the human prostate gland and its adenoma. // Vopr Med Khim, 1969; 15(3):243-247.

67. Chopin L.K., Veveris-Lowe T.L., Philipps A.F., Herington A.C. Co-expression of GH and GHR isoforms in prostate cancer cell lines. // Growth Horm IGF Res, 2002; 12(2): 126136.

68. Christmas P., Callaway J., Fallon J., Jones J., Haiglert H.T. Selective Secretion of An-nexin 1, a Protein without a Signal Sequence, by the Human Prostate Gland. // J. Biol. Chem, 1991; 266(4):2499-2507.

69. Chu T.M., Wang M.C., Kuciel R., Valenzuela L., Murphy G.P. Enzyme markers in human prostatic carcinoma. // Cancer Treat Rep, 1977; 61(2): 193-200.

70. Clements J., Mukhtar A. Glandular kallikreins and prostate-specific antigen are expressed in the human endometrium. // J Clin Endocrinol Metab, 1994; 78(6): 15361539.

71. Comings D.E. Two-dimensional gel electrophoresis of human brain proteins. // Clin. Chem, 1982; 28:782-789.

72. Corsten M.F., Hofstra L., Narula J., Reutelingsperger C.P. Counting heads in the war against cancer: defining the role of annexin A5 imaging in cancer treatment and surveillance. // Cancer Res, 2006; 66(3): 1255-1260.

73. Craven R.A., Totty N., Harnden P., Selby P.J., Banks R.E. Laser capture microdissection and two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis: evaluation of tissue preparation and sample limitations. // Am. J. Pathol, 2002; 160(3):815-822.

74. Das R., Hammamieh R., Neill R., Melhem M., Jett M. Expression pattern of fatty acid-binding proteins in human normal and cancer prostate cells and tissues. // Clin Cancer Res, 2001; 7(6): 1706-1715.

75. De Wever O., Derycke L., Hendrix A., De Meerleer G., Godeau F., Depypere H., Bracke M. Soluble cadherins as cancer biomarkers. // Clin Exp Metastasis, 2007; 24(8):685-697.

76. Dermer G.B., Silverman L.M., Chapman J.F. Enhancement techniques for detecting trace and fluid-specific components in two-dimensional electrophoresis patterns. // Clin Chem, 1982; 28(4 Pt 2):759-765.

77. Devaney J.M., Hoffman E.P., Gordish-Dressman H., «earns A., Zambraski E., Clarkson P.M. IGF-II gene region polymorphisms related to exertional muscle damage. // J. Appl. Physiol, 2007; 102(5):1815-1823.

78. Dhanasekaran S.M., Barrette T.R., Ghosh D., Shah R., Varambally S., Kurachi K., Pi-enta K.J., Rubin M.A., Chinnaiyan A.M. Delineation of prognostic biomarkers in prostate cancer. // Nature, 2001; 412(6849):822-826.

79. Diamandis E.P., Yu H., Sutherland D.J. Detection of prostate-specific antigen immuno-reactivity in breast tumors. // Breast Cancer Res Treat, 1994; 32(3):301-310.

80. Dickson M., Schmutz J., Grimwood J., Rodriquez A., Myers R. M. Direct Submission, 2001 (NCBI Protein AAH09544).

81. Dong Z,, Bode A.M. The role of histone H3 phosphorylation (SerlO and Ser28) in cell growth and cell transformation. // Mol Carcinog, 2006; 45(6):416-421.

82. Dos Remedios C.G., Chhabra D,, Kekic M., Dedova I.V., Tsubakihara M., Berry D.A., Nosworthy N.J. Actin binding proteins: regulation of cytoskeleta! microfilaments. // Physiol Rev, 2003; 83(2):433-473.

83. Dunn M.J., Hochstrasser D., Pallini V., Bini L. Editoral. // Electrophoresis, 1995; 16(7).

84. Dunn T.A., Chen S., Faith D.A., Hicks J.L., Platz E.A., Chen Y., Ewing C.M., Sauvageot J., Isaacs W.B., De Marzo A.M., Luo J. A Novel Role of Myosin VI in Human Prostate Cancer. // A J P, 2006; 169(5):1843-1854.

85. Eaton C.L., Coleman R.E. Pathophysiology of bone metastases from prostate cancer and the role of bisphosphonates in treatment. // Cancer Treat Rev, 2003; 29:189-198.

86. Eckfeldt J., Kershaw M. Increased circulating creatine kinase isoenzyme BB in a patient with metastatic prostatic carcinoma gave spuriously high isoenzyme MB values with the Harleco UltraZyme kit. // Clin Chem, 1980; 26(2):348-349.

87. Edwards J.J., Anderson N.G., Tollaksen S.L., von Eschenbach A.C., Guevara J.Jr. Proteins of human urine. II. Identification by two-dimensional electrophoresis of a new candidate marker for prostatic cancer. // Clin Chem, 1982; 28(1): 160-163.

88. Edwards J.J., Tollaksen S.L., Anderson N.G. Proteins of human semen. I. Two-dimensional mapping of human seminal fluid. // Clin Chem, 1981; 27:1335-1340.

89. Elhilali M.M., Oliver J.A., Sherwin A.L., Mackinnon K.J. Lactate dehydrogenase isoenzymes in hyperplasia and carcinoma of the prostate: a clinical study. // J Urol, 1967; 98(6):686-692.

90. Ellinger J., Bastian P.J., Jurgan Т., Biermann K., Kahl P., Heukamp L.C., Wernert N., MOlIer S.C., von Ruecker A. CpG island hypermethyiation at multiple gene sites in diagnosis and prognosis of prostate cancer. // Urology, 2008; 71(1): 161-167.

91. Elo J.P., Kvist L, Leinonen K., Isomaa V., Henttu P., Lukkarinen O., Vihko P. Mutated human androgen receptor gene detected in a prostatic cancer patient is also activated by estradiol. //J Clin Endocrinol Metab, 1995; 80(12):3494-3500.

92. Emmert-Buck M.R., Bonner R.F., Smith P.D., Chuaqui R.F., Zhuang Z., Goldstain S.R., Weiss R.A., Liotta L.A. Laser capture microdissection. // Science, 1996; 274:998-1001.

93. Epner D.E., Coffey D.S. There are multiple forms of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase in prostate cancer cells and normal prostate tissue. // Prostate, 1996; 28(6):372-378.

94. Eun J.P., Ma T.Z., Lee W.J., Kim M.G., Yoo M.J., Koh E.J., Choi H.Y., Kwak^Y.G. Comparative analysis of serum proteomes to discover biomarkers for ossification of the posterior longitudinal ligament. // Spine, 2007; 32(7):728-734.

95. Everley P.A., Krijgsveld J., Zetter B.R., Gygi S.P. Quantitative cancer proteomics: stable isotope labeling with amino acids in cell culture (SILAC) as a tool for prostate cancer research. // Mol Cell Proteomics, 2004; 3:729-735.

96. Fabris P., Mori G., Ingrami A. Electrophoretic studies of normal prostate homogenate and of adenoma, with special reference to the prostate homogenate of patients treated with Raveron. // Arch Ital Urol, 1966; 38(5):391-404.

97. Fairbanks G., Steck T.L., Wallach D.F.H. Electroforetic analysis of the major peptides of the erytrocyte membrane. // Biochemistry, 1971; 10:2607-2617.

98. Fawcett J.S., Vicchio D., Chrambach A. The adsorbtion of large proteins in electrofo-cusing on immobilized pH gradients: II. Dependence of the oligomeric state of Immo-biline. // Electrophoresis, 1988; 9:469-474.

99. Feld P.D., Witte D.L. Presence of creatine kinase BB isoenzymes in some patients with prostatic carcinoma. // Clin Chem, 1977; 23:1930-1932.

100. Fields S., Kohara Y., Lockhart D.J. Functional genomics. // Proc Natl Acad Sci USA, 1999; 96:8825-8826.

101. Flocks R.H., Urich V.C., Patel C.A., Opitz J.M. Studies on the antigenic properties of prostatic tissue. // J Urol, I960; 84:134-143.

102. Foty R.A., Steinberg M.S. Cadherin-mediated cell-cell adhesion and tissue segregation in relation to malignancy. // Int J Dev Biol, 2004; 48(5-6):397-409.

103. Frazier H.A., Humphrey P.A., Burchette J.L., Paulson D.F. Immunoreactive prostatic specific antigen in male periurethral glands. // J Urol, 1992; 147(l):246-248.

104. Fritzsche F.R., Dahl E., Pahl S., Burkhardt M., Luo J., Mayordomo E., Gansukh Т., Dankof A., Knuechel R., Denkert C. et al. Prognostic relevance of AGR2 expression in breast cancer. // Clin Cancer Res, 2006; 12(6): 1728-1734.

105. Fu Z., Smith P.C., Zhang L., Rubin M.A., Dunn R.L., Yao Z., Keller E.T. Effects of raf kinase inhibitor protein expression on suppression of prostate cancer metastasis. // J Natl Cancer Inst, 2003; 95(12):878-889.

106. Fukuoka S., Kern H., Kazuki-Sugino R., Ikeda Y. Cloning and characterization of ZAP36, an annexin-like, zymogen granule membrane associated protein, in exocrine pancreas. // Biochim Biophys Acta, 2002; 1575(1-3): 148-152.

107. Funakoshi Т., Heimark R.L., Hendrickson L.E., McMullen B.A., Fujikawa K. Human placental anticoagulant protein: isolation and characterization. // Biochemistry, 1987; 26:5572-5578.

108. Fung K.Y., Glode L.M., Green S., Duncan M.W. A comprehensive characterization of the peptide and protein constituents of human seminal fluid. // Prostate, 2004; 61:171-181.

109. Geisbrecht E.R., Montell D.J. Myosin VI is required for E-cadherinmediated border cell migration. // Nat Cell Biol, 2002; 4:616-620.

110. Gerke V., Moss S.E. Annexins: from structure to function. // Physiol Rev, 2002; 82(2):331-371.

111. Giometti C.S., Williams K., Tollaksen S.L. A two-dimensional electrophoresis database of human breast epithelial cell proteins. // Electrophoresis, 1997; 18(3-4):573-581.

112. Giroldi LA., Shimazui Т., Schalken J.A., Yamasaki H., Bringuier P.P. Classical cadherins in urological cancers. // Morphologie, 2000; 84(265):31-38.

113. Gleason D.F. Classification of prostatic carcinomas. // Cancer Chemother Rep, 1966; 50(3):125-128.

114. Glinsky G.V., Glinskii A.B., Stephenson A.J., Hoffman R.M., Gerald W.L. Gene expression profiling predicts clinical outcome of prostate cancer. // J Clin Invest, 2004; 113:913-923.

115. Golaz O. Plasma and red blood cell protein map: Update 1993. // Electrophoresis, 1993; 14:1223-1231.

116. Gold J.S., Bao L., Ghoussoub R.A., Zetter B.R., Rimm D.L. Localization and quantitation of expression of the cell motility-related protein thymosin betal5 in human breast tissue. // Mod Pathol, 1997; 10(11):1106-1112.

117. Gorg A., Postel W., Gunther S. The current state of two-dimensional electrophoresis with immobilized pH gradients. // Electrophoresis, 1988; 9:531-546.

118. Grayhack J.T., Wendel E.F., Oliver L., Lee C. Analysis of specific proteins in prostatic fluid for detecting prostatic malignancy. // J Urol, 1979; 121(3):295-299.

119. Griffiths J.C. Prostate-specific acid phosphatase: re-evaluation of radioimmunoassay in diagnosing prostatic disease. // Clin Chem, 1980; 26(3):433-436.

120. Guevara J.Jr., Herbert B.H., Raymond A.K., Batsakis J.G. Distinctive protein pattern in two-dimensional electrophoretograms of cancerous prostatic tissues. // Cancer Res, 1986; 46(7).'3599-3604.

121. Gumbiner B.M. Cell adhesion: the molecular basis of tissue architecture and morphogenesis. // Cell, 1996; 84(3):345-357.

122. Gutman E.B., Sproul E.E., Gutman A.B. The significance of increased phosphatase activity of bone at the site of oxteoplastic metastases secondary to carcinoma of the prostate. // Amer J Cancer, 1936; 28:485.

123. Haller K., Rambaldi I., Daniels E., Featherstone M. Subcellular localization of multiple PREP2 isoforms is regulated by actin, tubulin, and nuclear export. // J Biol Chem, 2004; 279:49384-49394.

124. Hanash S. Disease proteomics. // Nature, 2003; 422(6928):226-232.

125. Hanash S. HUPO initiatives relevant to clinical proteomics. // Mol Cell Proteomics, 2004; 3(4):298-301.

126. Нага M., Koyanagi Y., Inoue Т., Fukuyama T. Some physicochemical characteristics of gamma-seminoprotein; an antigenic component specific for human seminal plasma. // Jpn J Legal Med, 1971; 25:322-324.

127. Hardy D.O., Scher H.I., Bogenreider Т., Sabbatini P., Zhang Z.F., Nanus D.M., Catter-all J.F. Androgen receptor CAG repeat lengths in prostate cancer: correlation with age of onset, // J Clin Endocrinol Metab, 1996; 81(12):4400-4405.

128. Hayes M.J., Rescher U., Gerke V., Moss S.E. Annexin-Actin Interactions. // Traffic, 2004; 5:571-576.

129. Hein R.C., Grayhack J.T., Goldberg E. Prostatic fluid lactic dehydrogenase isoenzyme patterns of prostatic cancer and hyperplasia. // J Urol, 1975; 113(4):511-516.

130. Hernandez W., Grenade C., Santos E.R., Bonilla C., Ahaghotu C., Kittles R.A. IGF-1 and IGFBP-3 gene variants influence on serum levels and prostate cancer risk in African-Americans.// Carcinogenesis, 2007; 28(10):2154~2159.

131. Heuze-Vourc'h N., Leblond V., Courty Y. Complex alternative splicing of the hKLK3 gene coding for the tumor marker PSA (prostate-specific-antigen). // Eur J Biochem, 2003; 270(4):706-714.

132. Homburger H.A., Miller S.A., Jacob G.L. Radioimmunoassay of creatine kinase B-isoenzymes in serum of patients with azotemia, obstructive uropathy, or carcinoma of the prostate or bladder. // Clin Chem, 1980; 26(13):1821-1824.

133. Honn K.V., Tang D.G. Adhesion molecules and tumor cell interaction with endothelium and subendothelial matrix. // Cancer Metastasis Rev, 1992; ll(3-4):353-375.

134. Horoszewicz J.S., Kawinski E., Murphy G.P. Monoclonal antibodies to a new antigenic marker in epithelial prostatic cells and serum of prostatic cancer patients. // Anticancer Res, 1987; 7(5B):927-935.

135. Ни C.K., McCall S., Madden J., Huang H., Clough R., Jirtle R.L., Anscher M.S. Loss of heterozygosity of M6P/IGF2R gene is an early event in the development of prostate cancer. // Prostate Cancer Prostatic Dis, 2006; 9(l):62-67.

136. Hudson M.A., Bahnson R.R., Catalona W.J. Clinical use of prostate specific antigen in patients with prostate cancer. // J Urol, 1989; 142:1011-1017.

137. Huff Т., Muller C.S., Otto A.M., Netzker R., Hannappel E. beta-Thymosins, small acidic peptides with multiple functions. // Int J Biochem Cell Biol, 2001; 33(3):205-220.

138. Hughes C., Elgasim M., Layfield R., Atiomo W. Genomic and post-genomic approaches to polycystic ovary syndrome—progress so far: Mini Review. // Hum Reprod, 2006; 21(11): 2766-2775.

139. Hughes C., Murphy A., Martin C., Sheils O., O'Leary J. Molecular pathology of prostate cancer. // J Clin Pathol, 2005; 58:673-684.

140. HUPO (Human Proteome Organization) 1st World Congress. 21-24 November 2002. // Mol Cell Proteomics, 2002; l(9):651-752.

141. Hutchinson L.M., Chang E.L., Becker C.M., Shih M.C., Brice M., DeWolf W.C., Gaston S.M., Zetter B.R. Use of thymosin betal5 as a urinary biomarker in human prostate cancer. // Prostate, 2005a; 64(2):116-127.

142. International Human Genome Sequencing Consortium. Initial sequencing and analysis of the human genome. // Nature, 2001; 409:860-921.

143. Ishibe T. Alterations in serum lactate dehydrogenase activity and its isoenzyme pattern after massage of the prostate. Value in differentiating carcinoma from benign hyperplasia of the prostate. // Invest Urol, 1971; 9(2): 104-108.

144. Jackowski G., Liew C.C. Fluorescamine staining of nongistone chromatine proteins as revealed by two-dimensional polyacrylamid gel electrophoresis. // Anal Biochim, 1980; 102:321-325.

145. Jemal A., Siegel R., Ward E., Murray Т., Xu J., Smigal C., Thun M.J. Cancer statistics, 2007. // CA Cancer J Clin, 2007; 57(l):43-66.

146. Jiang W.G. E-cadherin and its associated protein catenins, cancer invasion and metastasis. // Br J Surg, 1996; 83(4):437-446.

147. Jiang Z., Li C., Fischer A., Dresser K., Woda B.A. Using an AMACR (P504S)/34betaE12/ p63 cocktail for the detection of small focal prostate carcinoma in needle biopsy specimens. // Am J Clin Pathol, 2005; 123:231-236.

148. Jiang Z., Woda B.A., Wu C.L., Yang X.J. Discovery and clinical application of a novel prostate cancer marker: alpha-methylacyl CoA racemase (P504S). // Am J Clin Pathol, 2004; 122:275-289.

149. Jin Т., Hu L.S., Chang M., Wu J., Winblad В., Zhu J. Proteomic identification of potential protein markers in cerebrospinal fluid of GBS patients. // Eur J Neurol, 2007; 14(5):563-568.

150. Kataoka T.R., Ito A., Asada H., Watabe K., Nishiyama K., Nakamoto K., Itami S., Yo-shikawa K., Ito M., Nojima H., Kitamura Y. Annexin VII as a novel marker for invasive phenotype of malignant melanoma. // Jpn J Cancer Res, 2000; 91(l):75-83.

151. Kawada M., Inoue H,, Arakawa M., Ikeda D. Transforming growth factor-betal modulates tumor-stromal cell interactions of prostate cancer through insulin-like growth fac-tor-I. // Anticancer Res, 2008; 28(2A):721-730.

152. Keller E.T., Fu Z., Yeung K., Brennan M. Raf kinase inhibitor protein: a prostate cancer metastasis suppressor gene. // Cancer Lett, 2004; 207(2): 131-137.

153. Klerk H., Jespers A. GELANAL, a personal computer-program to compare protein patterns on two-dimensional polyacrylamide gels. // Electrophoresis, 1990; 11(5):420-424.

154. Klezovitch O., Chevillet J., Mirosevich J., Roberts R.L., Matusik R.J., Vasioukhin V. Hepsin promotes prostate cancer progression and metastasis. // Cancer Cell, 2004; 6(2):185-195.

155. Klose J. Protein mapping by combined isoelectric focusing and electrophoresis of mouse tissue. A novel approach to testing for induced point mutations in mammals. // Hum Genet, 1975; 26(3):231-243.

156. Klose J. Systematic analysis of the total proteins of a mammalian organism: principles, problems and implications for sequencing the human genome. // Electrophoresis, 1989; 10:140-152.

157. Klose J., Kobalz U. Two-dimensional electrophoresis of proteins: an updated protocol and implications for a functional analyses of the genome. // Electrophoresis, 1995; 16(6): 1034-1059.

158. Kohn E.C., Liotta L.A. Molecular insights into cancer invasion: strategies for prevention and intervention. // Cancer Res, 1995; 55:1856-1862.

159. Kopper L., Tfmar J. Genomics of prostate cancer: is there anything to «translate»? // Pathol Oncol Res, 2005; 11(4): 197-203.

160. Kovacs P., Stumvoll M., Bogardus C., Hanson R.L., Baier L.J. A functional Tyrl306Cys variant in LARG is associated with increased insulin action in vivo. // Diabetes, 2006; 55(5):1497-1503.

161. Kovalyov L.I., Shishkin S.S., Efimochkin A.S., Kovalyova M.A., Ershova E.S., Egorov T.A., Musalyamov A.K. The mayor protein expression profile and two-dimensional protein database of human heart. // Electrophoresis, 1995; 16(7): 1160-1169.

162. Krauss M.R., Collins P.J., Blose S.H. A two-dimensional acrylamide gel electrophore-sis/computer software approach to decoding the human genome. // Biotechniques, 1990; v8, p.218-223.

163. Krendel M., Mooseker M.S. Myosins: tails (and heads) of functional diversity, // Physiology, 2005; 20:239-251.

164. Kucera E., Kainz C., Tempfer C., Zeillinger R., Koelbl H., Sliutz G. Prostate specific antigen (PSA) in breast and ovarian cancer. // Anticancer Res, 1997; 17(6D):4735-4737.

165. Labugger R., McDonough G.L., Neverova I., van Eyk J.E. Solubilization, two-dimensional separation and detection of the cardiac myofilament protein troponin T. // Proteomics, 2002; 2:673-678.

166. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. // Nature, 1970; 227(5259):680-685.

167. Lange P.H., Ercole C.J., Lightner D.J., Fraley E.E., Vessella R. The value of serum prostate specific antigen determinations before and after radical prostatectomy. // J Urol, 1989; 141:873-879.

168. Lam Y.W., Mobley J.A., Evans J.E., Carmody J.F., Ho S.M. Mass profiling-directed isolation and identification of a stage-specific serologic protein biomarker of advanced prostate cancer. // Proteomics, 2005; 5(11):2927-2938.

169. Le L., Chi K., Tyldesley S., Flibotte S., Diamond D.L., Kuzyk M.A., Sadar M.D. Identification of serum amyloid A as a biomarker to distinguish prostate cancer patients with bone lesions. // Clin Chem, 2005; 51:695-707.

170. Lee С., Tsai Y., Sensibar J., Oliver L., Grayhack J.T. Two-dimensional characterization of prostatic acid phosphatase, prostatic specific antigen and prostate binding protein in expressed prostatic fluid. // Prostate, 1986; 9(2): 135-146.

171. Leitenberger A., Altwein J.E. Efficacy and discriminative ability of prostate-specific antigen as a tumor marker. // Eur Urol, 1990; 17(1):12-16.

172. Lemkin P.F., Lester E.P. Database and search techniques for two-dimensional gel protein data: a comparison of paradigms for exploratory data analysis and prospects for biological modeling. // Electrophoresis, 1989; 10:122-140.

173. Levesque M.A., Clark G.M., Yu H., Diamandis E.P. Immunofluorometric analysis of p53 protein and prostate-specific antigen in breast tumours and their association with other prognostic indicators. // Br J Cancer, 1995; 72(3):720-727.

174. Lexander H., Palmberg C., Auer G., Hellstrom M., Franzen В., Jornvall H., Egevad L. Proteomic analysis of protein expression in prostate cancer. // Anal Quant Cytol Histol, 2005; 27(5):263-272.

175. Lindblom В., Holmlung G. Rapid DNA purification for restriction fragment length polymorphism analysis. // Gene Anal Techn, 1988; 5(5):97-101.

176. Liu A.Y., Zhang H., Sorensen C.M., Diamond D.L. Analysis of prostate cancer by proteomics using tissue specimens. // J Urol, 2005; 173(l):73-78.

177. Liu D., Rudland P.S., Sibson D.R., Platt-Higgins A., Barraclough R. Human homoiogue of cement gland protein, a novel metastasis inducer associated with breast carcinomas. // Cancer Res, 2005; 65:3796-3805.

178. Liu X., Wu Y., Zehner Z.E., Jackson-Cook C., Ware J.L. Proteomic analysis of the tu-morigenic human prostate cell line M12 after microcell-mediated transfer of chromosome 19 demonstrates reduction of vimentin. // Electrophoresis, 2003; 24:34453453.

179. Lopez M.F. Nonequilibrium pH gel electrophoresis (NEPHGE). // Methods Mol Biol, 1999; 112:129-131.

180. Luo J., Zha S., Gage W.R., Dunn T.A., Hicks J.L., Bennett C.J., Ewing C.M., Platz E.A., Ferdinandusse S., Wanders R.J. et al. Alpha-methylacyl-CoA racemase: a new molecular marker for prostate cancer. // Cancer Res, 2002; 62(8):2220-2226.

181. MacLennan G.T., Resnik M.I., Bostwick D.G. Pathology for Urologists. Philadelphia: W.B. Saunders Company, 2003; 207 p.

182. Madri J.A. The evolving roles of cell surface proteases in health and disease: implications for developmental, adaptive, inflammatory, and neoplastic processes. // Curr Top Dev Biol, 2003; 54:391-410.

183. Magendzo K., Shirvan A., Cultraro C., Srivastava M., Pollard H.B., Burns A.L. Alternative splicing of human synexin mRNA in brain, cardiac, and skeletal muscle alters the unique N-terminal domain. // J Biol Chem, 1991; 266:3228-3232.

184. Mainwaring W.I., Irving R. The partial purification of a soluble androgen receptor. // Biochem J, 1970; 118(2):12-13.

185. Martin D.B., Gifford D.R., Wright M.E., Keller A., Yi E., Goodlett D.R., Aebersold R., Nelson P.S. Quantitative proteomic analysis of proteins released by neoplastic prostate epithelium. // Cancer Res, 2004; 64(l):347-355.

186. Maruvada P., Wang W., Wagner P.D., Srivastava S. Biomarkers in molecular medicine: cancer detection and diagnosis. // Biotechniques, 2005; Suppl:9-15.

187. Masouye I., Saurat J.H., Siegenthaler G. Epidermal fatty-acid-binding protein in psoriasis, basal and squamous cell carcinomas: an immunohistological study. // Dermatology, 1996; 192(3):208-213.

188. Mattila S.P., Raunio V.K., Larmi Т.К. An immunoelectrophoretic study of the soluble antigens of the human prostate. //J Urol, 1967; 97(1):117-121.

189. Meehan K.L., Holland J.W., Dawkins HJ. Proteomic analysis of normal and malignant prostate tissue to identify novel proteins lost in cancer. // Prostate, 2002; 50(1):54-63.

190. Meehan K.L., Sadar M.D. Quantitative profiling of LNCaP prostate cancer cells using isotope-coded affinity tags and mass spectrometry. // Proteomics, 2004; 4(4): 11161134.

191. Merril С., Creed G. Human CSF and brain two-dimensional gel electrophoresis protein maps. // Proc Int Conf «2D electrophoresis: from protein map to genome». Italy, Siena, 1994; p.154.

192. Merril C., Harrington M.G. Two-dimensional electrophoresis and ultrasensitive silver staining of cerebrospinal fluid proteins in neurological disease. // Clin Chem, 1984; 30(12)': 1933-1937.

193. Mizutani M., Nakamoto Т., Nishi N., Matuo Y., Kadohama N., Sandberg A.A., Nihira H., Wada F. Protein profiles of benign hypertrophic prostate: stroma-abundant distribution of BPH-associated nonhistone proteins. //Arch Androl, 1987; 19(l):43-57.

194. Mobley J.A., Lam Y.W., Lau K.M., Pais V.M., L'Esperance J.O., Steadman В., Fuster L.M., Blute R.D., Taplin M.E., Ho S.M. Monitoring the serological proteome: the latest modality in prostate cancer detection. //J Urol, 2004; 172(l):331-337.

195. Moncure C.W., Johnston C.L., Koonta W.W., Smith M.J.V. Investigation of specific antigens in proetatic cancer. // Cancer Chemother Rep, 1975; 59:105-110.

196. Monteoliva L., Albar J.P. Differential proteomics: an overview of gel and nongel based approaches. // Brief Funct Genomic Proteomic, 2004; 3(3):220-239.

197. Morgan K.G., Gangopadhyay S.S. Invited review: cross-bridge regulation by thin filament-associated proteins. // J Appl Physiol, 2001; 91(2):953-962.

198. Muller-Esterl W. Biochemie. Eine Einfurung fur Mediziner und Naturwissenschaftler. N.Y.: Springer, 2004; 620 p.

199. Nadji M., Tabei S.Z., Castro A., Chu T.M., Murphy G.P., Wang M.C., Morales A.R. Prostatic-specific antigen: an immunohistologic marker for prostatic neoplasms. // Cancer, 1981; 48:1229-1232.

200. Narla G., Heath K.E., Reeves H.L., Li D., Giono L.E., Kimmelman A.C., Glucksman M.J., Narla J., Eng F.J., Chan A.M. et al. KLF6, a candidate tumor suppressor gene mutated in prostate cancer. // Science, 2001; 294(555l):2563-2566.

201. Neves A.F., Araujo T.G., Biase W.K., Meola J., Alcantara T.M., Freitas D.G., Goulart L.R. Combined analysis of multiple mRNA markers by RT-PCR assay for prostate cancer diagnosis. // Clin Biochem, 2008 Epub ahead of print.

202. Niemann M.A., Baggott J.E., Miller E.J. Inhibition of human serine proteases by SPAAT, the C-terminal 44-residue peptide from alphal-antitrypsin. // Biochim Biophys Acta, 1997; 1340(1): 123-130.

203. Oesterling J.E. Prostate-specific antigen: a valuable clinical tool. // Oncology (Williston Park), 1991; 5(4): 107-122.

204. O'Farrell P.H. Hight resolution two-dimensional electrophoresis of proteins. // J Biol Chem, 1975; 250(10):4007-4021.

205. O'Farrell P.H., Goodman H.M., O'Farrell P.Z. Hight resolution two-dimensional electrophoresis of basic as well as acidic proteins. // Cell, 1977; 12:1133-1142.

206. Oliver J.A., el-Hilali M.M., Belitsky P., MacKinnon K.J. LDH isoenzymes in benign and malignant prostate tissue. The LDH V-I ratio as an index of malignancy. // Cancer, 1970; 25(4):863-866.

207. Orchard S., Martens L., Tasman J., Binz P.A., Albar J.P., Hermjakob H. 6(th) HUPO Annual World Congress Proteomics Standards Initiative Workshop 6-10 October 2007, Seoul, Korea. // Proteomics, 2008 Epub ahead of print.,

208. Ou K., Seow Т.К., Liang R.C., Ong S.E., Chung M.C. Proteome analysis of a human heptocellular carcinoma cell line, HCC-M: an update. // Electrophoresis, 2001; 22(13): 2804-2811.

209. Parekh D.J., Ankerst D.P., Troyer D., Srivastava S., Thompson I.M. Biomarkers for prostate cancer detection. // J Urol, 2007; 178(6):2252-2259.

210. Patterson S.D., Aebersold R. Mass spectrometric approaches for the identification of gel-separated proteins. // Electrophoresis, 1995; 16(10):1791-1814.

211. Peltonen L., McKusick V.A. Genomics and medicine. Dissecting human disease in the postgenomic era. // Science, 2001; 291:1224-1229.

212. Petricoin E.F., Liotta L.A. SELDI-TOF-based serum proteomic pattern diagnostics for early detection of cancer. // Curr Opin Biotechnol, 2004; 15(l):24-30.

213. Petricoin E.F. Ill, Ornstein D.K., Paweietz C.P., Ardekani A., Hackett P.S., Hitt B.A., Velassco A., Trucco C., Wiegand L., Wood K. et al. Serum proteomic patterns for detection of prostate cancer. // J Natl Cancer Inst, 2002; 94:1576-1578.

214. Pleissner K.P., Soding P., SanderS., Oswald H., Neuss M., Regitz-Zagrosek V., Fleck E. Dilated cardiomyopathy-associated proteins and their presentation in a WWW-accessible two-dimensional gel protein database. // Electrophoresis, 1997; 18(5):802-808.

215. Pohler E., Craig A.L., Cotton J., Lawrie L., Dillon J.F., Ross P., Kernohan N., Hupp T.R. The Barrett's antigen anterior gradient-2 silences the p53 transcriptional response to DNA damage. // Mol Cell Proteomics, 2004; 3(6):534-547.

216. Pollard T.D., Cooper J.A. Actin and actin-binding proteins. A critical evaluation of mechanisms and functions. //Annu Rev Biochem, 1986; 55:987-1035.

217. Potter D.J. A review of the CLIP system for the quantitative analysis of two-dimensional electrophoresis gels. // Electrophoresis, 1990; 11(5):415-419.

218. Prasad S.C,, Soidatenkov V.A., Kuettel M.R., Thraves P.J., Zou X., Dritschilo A. Protein changes associated with ionizing radiation-induced apoptosis in human prostate epithelial tumor cells. // Electrophoresis, 1999; 20(4-5): 1065-1074.

219. Prasad S.C., Thraves P.J., Dritschilo A., Kuettel M.R. Protein expression changes associated with radiation-induced neoplastic progression of human prostate epithelial cells. // Electrophoresis, 1997; 18(3-4):629-637.

220. Qin S., Ferdinand A.S., Richie J.P., O'Leary M.P., Мок S.C., Liu B.C. Chromatofocusing fractionation and two-dimensional difference gel electrophoresis for low abundance serum proteins. // Proteomics, 2005; 5(12):3183-3192.

221. Raz A., Geiger B. Altered organization of cell-substrate contacts and membrane-associated cytoskeleton in tumor cell variants exhibiting different metastatic capabilities. // Cancer Res, 1982; 42(12):5183-5190.

222. Rauch J., Ahlemann M., Schaffrik M., Mack В., Ertongur S., Andratschke M., Zeidler R., Lang S., Gires O. Allogenic antibody-mediated identification of head and neck cancer antigens. // Biochem Biophys Res Commun, 2004; 323(1): 156-162.

223. Raynor R.H., Hazra T.A., Moncure C.W., Mohonakumar T. Biochemical nature of the prostate-associated antigen identified by the monoclonal antibody, KR-P8. // Prostate, 1986; 9:21-31.

224. Rehman I., Azzouzi A.R., Catto J.W., Allen S., Cross S.S., Feeley K., Meuth M., Hamdy F.C. Proteomic analysis of voided urine after prostatic massage from patients with prostate cancer: a pilot study. // Urology, 2004; 64:1238-1243.

225. Reif A.E., Schlesinger R.M., Fish C.A., Robinson C.M. Acid Phosphatase Isoenzyms in Cancer of the Prostate. // Cancer, 1973; 31:689-699.

226. Ren H., Du N., Liu G., Ни H.T., Tian W., Deng Z.P., Shi J.S. Analysis of variabilities of serum proteomic spectra in patients with gastric cancer before and after operation. // World J Gastroenterol, 2006; 12(17):2789-2792.

227. Ren W.Z., Ng G.Y., Wang R.X., Wu P.H., O'Dowd B.F., Osmond D.H., George S.R., Liew C.C. The identification of NP25: a novel protein that is differentially expressed by neuronal subpopulations. // Brain Res Mol Brain Res, 1994; 22(1-4): 173-185.

228. Rock R.S., Rice S.E., Wells A.L., Purceli T.J., Spudich J.A., Sweeney H.L. Myosin VI is a processive motor with a large step size. // Proc Natl Acad Sci USA, 2001; 98(24): 13655-13659.

229. Ross R.K., Coetzee G.A., Reichardt J., Skinner E., Henderson B.E. Does the racial-ethnic variation in prostate cancer risk have a hormonal basis? // Cancer (Phila.), 1995; 75:1778-1782.

230. Rozenszajn L., Epstein Y., Shoham D., Arber I. The acid phosphatase isoenzymes in normal and pathological sera and in tissue homogenates. // J Lab Clin Med, 1968; 72(5):786-793.

231. Safer D., Nachmias V.T. Beta thymosins as actin binding peptides. // Bioessays, 1994; 16(7):473-479.

232. Sanchez J., Hughes G., Frutiger S., Paquet N., Pasquali C., Golaz O., Bairoch., Appel R., Moshstrasser D. Human liver 2D PAGE database. // Proc Int Conf «2D electrophoresis: from protein map to genome». Italy, Siena, 1994; p. 156.

233. Schaid D.J. The complex genetic epidemiology of prostate cancer. // Hum Mol Genet, 2004;13 (1):R103-R121.

234. Scheele G.A. Two-dimensional gel analysis of soluble proteins. Characterization of guinea pig exorcine pancreatic proteins. // J Biol Chem, 1975; 250:5375-5385.

235. Seligson D.B., Horvath S., Shi Т., Yu H., Tze S., Grunstein M., Kurdistani S.K. Global histone modification patterns predict risk of prostate cancer recurrence. // Nature, 2005; 435(7046): 1262-1266.

236. Serruto D., Rappuoli R. Post-genomic vaccine development. // FEBS Lett, 2006; 580:2985-2992.

237. Sjovall К., Rubin S., Muntzing J. Creatine phosphokinase in prostatic tissue. // Scand J Urol Nephrol, 1975; 9(3): 181-184.

238. Sherwood E.R., Berg L.A., McEwan R.N., Pasciak R.M., Kozlowski J.M., Lee C. Two-dimensional protein profiles of cultured stromal and epithelial cells from hyperplastic human prostate. // J Ceil Biochem, 1989; 40(2):201-214.

239. Sherwood E.R., Berg L.A., Mitchell N.J., McNeal J.E., Kozlowski J.M., Lee C. Differential cytokeratin expression in normal, hyperplastic and malignant epithelial cells from human prostate. //J Urol, 1990; 143(1):167-171.

240. Shields J.M., Rogers-Graham K., Der C.J. Loss of transgelin in breast and colon tumors and in RIE-1 cells by Ras deregulation of gene expression through Raf-independent pathways. //J Biol Chem, 2002; 277(12):9790-9799.

241. Shiozaki H., Oka H., Inoue M., Tamura S., Monden M. E-cadherin mediated adhesion system in cancer cells. // Cancer, 1996; 77(8 Suppl): 1605-1613.

242. Smirnov D.A., Zweitzig D.R., Foulk B.W., Miller M.C., Doyle G.V., Pienta K.J., Meropol N.J., Weiner L.M., Cohen S.J., Moreno J.G. et al. Global gene expression profiling of circulating tumor cells. // Cancer Res, 2005; 65(12):4993-4997.

243. Smith A.F. Separation of tissue and serum creatine kinase isoenzymes on polyacryla-mide gel slabs. // Clin Chim Acta, 1972; 39(2):351-359.

244. Smith P.D., Davies A., Crumpton M.J., Moss S.E. Structure of the human annexin VI gene. // Proc Natl Acad Sci USA, 1994; 91:2713-2717.

245. Srivastava M., Bubendorf L., Srikantan V., Fossom L., Nolan L., Glasman M., Leighton X., Fehrle W., Pittaluga S., Raffeld M. et al. ANX7, a candidate tumor suppressor gene for prostate cancer. // Proc Natl Acad Sci USA, 2001; 98(8):4575-4580.

246. Stamey T.A., Caldwell M., McNeal J.E., Nolley R., Hemenez M., Downs J. The prostate specific antigen era in the United States is over for prostate cancer: what happened in the last 20 years? // J Urol, 2004; 172:1297-1301.

247. Stamey T.A., Yang N., Hay A.R., McNeal J.E., Freiha F.S., Redwine E. Prostate-specific antigen as a serum marker for adenocarcinoma of the prostate. // N Engl J Med, 1987; 317(15):909-916.

248. Stanciute D., Didziapetriene J., Kadziauskas J. Expression of matrix metalloproteinases in patients with malignant tumors. // Medicina (Kaunas), 2004; 40:1143-1150.

249. Suzuki H., Freije D., Nusskern D.R., Okami K., Cairns P., Sidransky D., Isaacs W.B., Bova G.S. Interfocal heterogeneity of PTEN/MMAC1 gene alterations in multiple metastatic prostate cancer tissues. // Cancer Res, 1998; 58(2):204-209.

250. Tait J.F., Smith C., Xu L., Cookson B.T. Structure and polymorphisms of the human annexin III (ANX3) gene. // Genomics, 1993; 18(l):79-86.

251. Taylor J., Anderson N.L., Scandora A., Willard K., Anderson N.G. Design and implementation of a prototype human protein index. // Clin Chem, 1982; 28:861-866.

252. Terao N. Urological studies on aldolase. With special regard to aldolase isozymes in human tissues. // Nippon Hinyokika Gakkai Zasshi, 1968; 59(10):865-872.

253. Thompson D.A., Weigel R.J. hAG-2, the human homologue of the Xenopus laevis cement gland gene XAG-2, is coexpressed with estrogen receptor in breast cancer cell lines. // Biochem Biophys Res Commun, 1998; 251(1): 111-116.

254. Thompson I.M., Ankerst D.P. Prostate-specific antigen in the early detection of prostate cancer. // CMAJ, 2007; 176(13): 1853-1858.

255. Towbin H., Gordon J. Immunoblotting and dot immunobinding current status and outlook. // J Immunol Methods, 1984; 72(2):313-340.

256. Towbin H., Staehelin Т., Gordon J. Electrophoretic transfer of proteins from poly-acrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. // Proc Natl Acad Sci USA, 1979; 76(9):4350-4354.

257. Troyer J.K., Beckett M.L., Wright G.L.Jr. Detection and characterization of the prostate-specific membrane antigen (PSMA) in tissue extracts and body fluids. // Int J Cancer, 1995; 62(5):552-558.

258. Tsai Y.C., Harrison H.H., Lee C., Daufeldt J.A., Oliver L., Grayhack J.T. Systematic characterization of human prostatic fluid proteins with two-dimensional electrophoresis. // Clin Chem, 1984; 30(12 Pt l):2026-2030.

259. Unlu M., Morgan M.E., Minden J.S. Difference gel electrophoresis: a single gel method for detecting changes in protein extracts. // Electrophoresis, 1997; 18:2071-2077.

260. Untergasser G,, Gander R., Lilg C., Lepperdinger G., Plas E., Berger P. Profiling molecular targets of TGF-betal in prostate fibroblast-to-myofibroblast transdifferentia-tion. // Mech Ageing Dev, 2005; 126(l):59-69.

261. Vaarala M.H., Porvari K., Kyllonen A., Vihko P. Differentially expressed genes in two LNCaP prostate cancer cell lines reflecting changes during prostate cancer progression. // Lab Invest, 2000; 80(8): 1259-1268.

262. Van den Bergh G., Arckens L. Fluorescent two-dimensional difference gel electrophoresis unveils the potential of gelbased proteomics. // Curr Opin Biotechnol, 2004; 15:3843.

263. Van Krieken J.H. Prostate marker immunoreactivity in salivary gland neoplasms. A rare pitfall in immunohistochemistry. // Am J Surg Pathol, 1993; 17(4):410-414.

264. Venter C.J., Adams M.D., Myers E.W., Li P.W., Mural R.J., Sutton G.G., Smith H.O., Yandell M., Evans C.A., Holt R.A. et al. The Sequence of the Human Genome. // Science, 2001; 291:1304-1351.

265. Vincens P., Tarroux P. Two-dimensional electrophoresis computerized processing. // Int J Biochem, 1988; 20(5):499-509.

266. Wallace A., Saluz H. Detection of subpicogram quantities of protein in polyacrylamide gels. / In: Cell biology (Ed. J.Celis). Acad. Press, N.Y., 1994; 3:288-298.

267. Wang M.C., Papsidero L.D., Kuriyama M., Valenzuela L.A., Murphy G.P., Chu T.M. Prostate antigen: a new potential marker for prostatic cancer. // Prostate, 1981; 2(1) :89-96.

268. Wang M.C., Valenzuela L.A., Murphy G.P., Chu T.M. Purification of a human prostate specific antigen. // Invest Urol, 1979; 17(2): 159-163.

269. Weber G.F. Molecular mechanisms of cancer. Dordrecht: Springer, 2007; 645 p.

270. Wells A.L., Lin A.W., Chen L.Q., Safer D., Cain S.M., Hasson Т., Carragher B.O., Milligan R.A., Sweeney H.L. Myosin VI is an actin-based motor that moves backwards. // Nature, 1999; 401:505-508.

271. Wilkins M.R., Williams K.L., Appel R.D., Hochstrasser D.F. Proteomic research: new frontiers in functional genomics (principle and practice). Berlin: Springer, 1997; 464 p.

272. Wright M.E., Eng J., Sherman J., Hockenbery D.M., Nelson P.S., Galitski Т., Aebersold R. Identification of androgen-coregulated protein networks from the microsomes of human prostate cancer cells. // Genome Biol, 2003; 5(1):R4.

273. Wright M.E., Han D.K., Aebersold R. Mass Spectrometry-based Expression Profiling of Clinical Prostate Cancer. 11 Mol Cell Proteom, 1995; 4(4): 545-554.

274. Wulfkuhle J.D., Liotta L.A., Petricoin E.F. Proteomic applications for the early detection of cancer. // Nat Rev Cancer, 2003; 3(4):267-275.

275. Xiang Y., Zhu Z., Han G., Ye X., Xu В., Peng Z., Ma Y., Yu Y., Lin H., Chen A.P., Chen C.D. JARID1B is a histone H3 lysine 4 demethylase up-regulated in prostate cancer. // Proc Natl Acad Sci USA, 2007; 104(49): 19226-19231.

276. Xiao Z., Prieto D., Conrads T.P., Veenstra T.D., Issaq H.J. Proteomic patterns: their potential for disease diagnosis. // Mol Cell Endocrinol, 2005; 230(l-2):95-106.

277. Xin W., Rhodes D.R., Ingold C., Chinnaiyan A.M., Rubin M.A. Dysregulation of annexin family is associated with prostate cancer progression. // Am J Pathol, 2003; 162:255261.

278. Yan G.R., He Q.Y. Functional proteomics to identify critical proteins in signal transduction pathways. // Amino Acids, 2008; 35(2):267-274.

279. Yee D.S., Narula N., Ramzy I., Boker J., Ahlering Т.Е., Skarecky D.W., Ornstein D.K. Reduced annexin II protein expression in high-grade prostatic intraepithelial neoplasia and prostate cancer. // Arch Pathol Lab Med, 2007; 131(6):902-908.

280. Yu H., Diamandis E.P., Sutherland D.J. Immunoreactive prostate-specific antigen levels in female and male breast tumors and its association with steroid hormone receptors and patient age. Ц Clin Biochem, 1994; 27(2):75-79.

281. Zakharov S., Kwok S., Sokoloff H., Chang H., Radko S., Chrambach A. The band areas of proteins determined by fluorescent scanning in the commercial automated gel electrophoresis apparatus.//Electrophoresis, 1998; 19:1625-1630.

282. Zhang С., Yu Y., Zhang S., Wei H., Zhang Y., Zhou G., Bi J., Liu M., He F. Direct Submission, 1999 (NCBI Protein AAF22034, AAF69644).

283. Zhang J.S., Gong A., Cheville J.C., Smith D.I., Young C.Y. // Genes Chromosomes Cancer, 2005; 43(3):249-259.

Информация о работе

ЕРЕМИНА, ЛИДИЯ СЕРГЕЕВНА
кандидата медицинских наук
Москва, 2008
ВАК 03.00.04

Диссертация

Изучение белков предстательной железы человека при раке и доброкачественной гиперплазии с помощью постгеномных технологий - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Изучение белков предстательной железы человека при раке и доброкачественной гиперплазии с помощью постгеномных технологий - тема автореферата по биологии, скачайте бесплатно автореферат диссертации

Похожие работы