Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Сравнительное протеомное исследование белков человека, участвующих в обеспечении двигательных функций

ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Сравнительное протеомное исследование белков человека, участвующих в обеспечении двигательных функций"

На правах рукописи

Иванов Алексей Викторович

СРАВНИТЕЛЬНОЕ ПРОТЕОМНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ БЕЛКОВ ЧЕЛОВЕКА, УЧАСТВУЮЩИХ В ОБЕСПЕЧЕНИИ ДВИГАТЕЛЬНЫХ ФУНКЦИЙ.

специальность 03.01.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 2 МДР ®

Москва 2012

005015266

Работа выполнена в лаборатории биомедицинских исследований Федерального государственного бюджетного учреждение науки Института биохимии им. А.Н.Баха Российской академии наук.

Научный руководитель: Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Л.И. Ковалев

доктор биологических наук, профессор Д.Б. Зоров, доктор биологических наук, профессор Б.Я. Гурвиц

Ведущая организация: ФГБУ Научно-исследовательский институт

биомедицинской химии им. В.Н. Ореховича Российской академии медицинских наук

Защита состоится «22» марта 2012 г. в «12» час на заседании диссертационного совета Д 002.247.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора и кандидата наук при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте биохимии им. А.Н. Баха РАН Российской академии наук по адресу: 119071, Москва, Ленинский проспект, д.ЗЗ, стр.2.

С диссертацией можно ознакомиться в Библиотеке биологической литературы РАН су: 119071, Москва, Ленинский проспект, д.ЗЗ, стр.1.

Автореферат разослан «21» марта 2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук

А.Ф. Орловский

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Обеспечение различных видов движений у живых организмов, включая человека, является одной из наиболее важных белковых функций - двигательной. Эта функция ярко проявляется сокращением различных видов мышц, а также способностями у подавляющего большинства клеток к изменениям своей формы и движению в различных средах, окружающих эти клетки [Зенгбуш П. 1982; Поглазов Б.Ф., Левицкий Д.И. 1982; Schiaffino S., Reggiani, С. 1996; Шишкин С.С. с соавт 2004; Murphy D.A., Courtneidge S.A. 2011 и др.]. К настоящему времени, благодаря многолетним усилиям биохимиков, а также ученых смежных специальностей накоплен большой объем сведений о белках человека, как непосредственно участвующих в мышечном сокращении, так и о тех белках, которые обеспечивают клеточную подвижность. В частности, в ходе исследований по международному проекту «Геном человека» было установлено, что у человека имеется, как минимум, 376 так называемых моторных генов («motor»), непосредственно обеспечивающих двигательные функции, а также 1453 гена, кодирующих цитоскелетные белки и белки клеточной адгезии, которые имеют прямое отношение к клеточной подвижности [Venter C.J. et al. 2001]. Соответственно, для системного изучения белков указанных групп во многих странах ведутся работы по созданию и поддерживанию специальных информационных ресурсов, предназначенных для обеспечения разнообразных биомедицинских исследований. В этом отношении на фоне информационных ресурсов, созданных например, в Ирландии (UCD-2DPAGE, http://proteomics-portal.ucd.ie:8082/cgi-bin/2d/2d.cgi) и в Индии («Human Proteinpedia», www.humanproteinpedia.org), достижения отечественных исследователей выглядят пока весьма скромными.

С началом постгеномной эры в биохимии для изучения белков человека, непосредственно участвующих в мышечном сокращении, активно привлекаются протеомные технологии [Шишкин С.С. с соавт 2004; Urbonavicius S. et al. 2009; Gelfi С. et al. 2011 и др.]. Как объекты для протеомного изучения мышечные ткани и органы, содержащие по массе существенную часть белков организма человека, представляют значительный интерес по ряду причин. Известно, что при формировании и функционировании мышечных тканей и органов происходят закономерные изменения генной экспрессии, которые находят отражение в так называемых белковых профилях и протеомный анализ позволяет прецизионно характеризовать эти процессы [Торро S. et al. 2003; Urbich С. et al. 2011]. Существует достаточно много заболеваний мышечных тканей и органов, и протеомные исследования открывают путь к выяснению патогенеза этих заболеваний, а также способствуют выявлению диагностически значимых молекулярных маркеров [De Palma S. et al. 2006; Celegato B. et al. 2006; Polkinghome V.R. et al. 2009; Pilop C. et al. 2009]. В связи с различиями в дифференцировке мышечных клеток и особенностями морфологии мышечных органов, включая отдельные скелетные мышцы, с помощью протеомных технологий создаются условия для поиска ткане- и органо-специфичных белков, среди которых могут находиться новые белковые изоформы или новые белки [Schessl J et al. 2008; Jedrychowski M.P. et al. 2010; Hammer E. et al. 2011].

Протеомные технологии активно применяются также для изучения различных белков человека, обеспечивающих клеточную подвижность, в отношении клеток с различными ти-

пами дифференцировки, а также клеток злокачественных опухолей, в связи с тем, что в основе и инвазивности, и метастазирования лежат особые нарушения клеточной подвижности, в которых принимают участие ряд актин-связывающих белков (АСБ), а также цитоскелетные и мембранные белки [Weaver A.M. 2008; Albiges-Rizo С. et al. 2009; Shankar J. et al. 2010]. Выявление таких нарушений, с одной стороны, открывает пути к развитию представлений о молекулярных основах раковой трансформации клеток и роли в этом определенных представителей (изоформ) различных белковых семейств [Giubellino А. et al. 2007; Albiges-Rizo С. et al. 2009 и др.], а с другой, может расширить список потенциальных биомаркеров опухолевых заболеваний. Например, в качестве биомаркеров рака простаты изучаются некоторые изо-формы семейства ß-тимозинов, относящегося с АСБ, и семейства аннексинов, участвующих в обеспечении взаимодействий цитоскелетных и мембранных белков [Hutchinson L.M. et al. 2005; Schostak M. et al. 2009]. Интерес к последним (с учётом того, что простата рассматривается как мышечно-эпителиальный орган) обусловлен весьма интенсивным ростом заболеваемости раком простаты в России (2 место в структуре онкопатологии у мужчин) [Чиссов В.И. с соавт. 2011]. и в ряде стран Запада. На особую актуальность подобных исследований указывает целый ряд авторов, подчеркивая существующие потребности в надежных молекулярных маркерах рака простаты [Stamey Т.А. et al. 2004; Allioli N. et al. 2011 и др.].

Цель и задачи исследования. Основной целью данной диссертационной работы стало сравнительное протеомное изучение некоторых белков человека, участвующих в обеспечении двигательных функций, создание отечественного биоинформационного ресурса о белках скелетных мышц, а также поиск потенциальных биомаркеров миогенеза и малигнизации. В соответствии с целью исследования в работе решались следующие задачи:

1. Провести протеомное изучение мажорных белков в образцах скелетной мышцы человека и использовать полученные результаты для создания соответствующего биоинформационного ресурса, оформленного как отдельный модуль для отечественной базы данных «Про-теомика мышечных белков человека».

2. Провести сравнительное изучение отдельных групп белков в различных биоматериалах (биоптатах и аутоптатах некоторых мышечных тканей и органов, а также в культивируемых клетках) и оценить проявления полиморфизма этих белков.

3. Изучить средне- и низкокопийные ядерные белки в культивируемых нормальных мышечных клетках человека с использованием предварительного выделения ядер и с применением протеомных методов.

4. Построить ЗБ-модели протеомного распределения гистонов и провести сравнительных анализ их микрогетерогенности в культивируемых клетках, включая клетки злокачественных и доброкачественных опухолей простаты.

5. Провести с помощью протеомных методов поиск потенциальных белковых биомаркеров рака простаты в культивируемых клетках человека.

Научная новизна работы. Сформирован новый биоинформационный модуль в отечественную базу данных «Протеомика мышечных белков человека» на основе протеомного изучения 89 «мажорных» белков из биоптатов и аутоптатов т. vastus lateralis человека.

Установлено, что в культивируемых скелетномышечных миобластах человека присутствует новый белковый продукт гена кальдесмона (CALD1), который по результатам проте-омного анализа обладает меньшей молекулярной массой по сравнению с известными изо-формами кальдесмона человека.

При сравнительном протеомном анализе трех препаратов ядерных белков (суммарные ядерные белки, гистоны, постгистоновые ядерные белки) полученных из культивируемых мышечных клеток человека, а также из некоторых опухолевых клеток, удалось выявить ряд средне- и низкокопийных белков. Построены новые ЗО-модели протеомного распределения гистонов, которые свидетельствуют о микрогетерогенности этих белков, вероятно, связанной с изменениями пролиферативного потенциала изученных клеток.

Научно-практическая значимость работы. Созданная двумерная карта белков скелетной мышцы человека стала основой для формирования биоинформационного модуля «Белки скелетных мышц». Подготовлены методические рекомендации по применению компьютерных программ из пакета ImageMaster 2D Platinum, версий 6 и 7 («GE Healthcare») для решения задач, связанных с анализом распределения белковых фракций на двумерных электрофо-реграммах.

Показано, что серпин HI (белковый продукт гена SERPINH1) можно рассматривать как потенциальный биомаркер опухолей эпителиального генеза по результатам сравнительного протеомного анализа белков клеточных линий, моделирующих рак и гиперплазию простаты.

Апробация работы. Материалы данной работы докладывались на международных и российских конференциях, в том числе: Конференции молодых ученых с международным участием «Актуальные вопросы лучевой диагностики и онкологии» (Москва, 2008), IV Российском симпозиуме «Белки и пептиды» (Казань, 2009), I международной научно-практической конференции «Постгеномные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине» (Москва, 2010), V Российского симпозиума «Белки и пептиды». (Петрозаводск, 2011) и др.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 15 научных работ, включая 5 статей в профильных рецензируемых российских и международных журналах (из них 1 в зарубежной печати), 2 статьи в сборниках, 1 информационно-методическое письмо и 7 тезисов докладов.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 126 страницах, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, заключения, выводов, списка цитируемой литературы. Работа содержит 12 таблиц и 25 рисунков, а также приложение «Методические разработки по проведению компьютерного анализа изображений двумерных электрофореграмм с помощью специализированного пакета программ ImageMaster 2D Platinum версии 6 и 7 («GE Healthcare»)».

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

Материалами для протеомных исследований послужили биопсийные образцы скелетных мышц (п=23) которые были получены методом игольчатой биопсии под местной анестезией в ИМБП РАН от практически здоровых молодых добровольцев-спортсменов (20 - 24 лет), давших письменное согласие. Полученные пробы сразу же замораживали и сохраняли в жидком азоте. Аутопсийные препараты т. vastus lateralis (n = 34) от лиц, погибших в результате несчастного случая) были получены из Бюро судебно-медицинской экспертизы Департамента здравоохранения г. Москвы. Все эти пробы, кроме трех, характеризовались минимально возможным сроком аутолиза, который не превышал 12 часов. У трех образов срок аутолиза составлял около суток. До начала исследований все эти образцы хранились при температуре -70°С. Кроме того, в отдельных экспериментах использовали биоптаты простаты (п = 30) и аутопсийные образцы миометрия (п = 5).

В работе использовалось несколько культивируемых клеточных линий. Культивируемые клетки миобластов человека были выведены и любезно предоставлены авторами ранее [Кро-хина и др., 1996]. Клеточные линии рабдомиосаркомы (А-204 и RD) были закуплены в НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН. Для исследования ядерных белков и серпинов использовались культивируемые клетки рака простаты человека (РП): линии LNCaP-FGC, образец которых был получен от д.б.н. И.Г. Шемякина (ГНЦ прикладной микробиологии и биотехнологии, г. Оболенск), а также клеточные культуры РС-3 и DU-145, закупленные у German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (Германия). В качестве модели доброкачественной гиперплазии простаты анализировали клетки линии ВРН-1, которая была приобретена в той же немецкой коллекции. Клеточная линия OKP-GS (рак почки) была приобретена в Институте цитологии РАН.

Культивирование клеток производилось с использованием культурального пластика фирм Costar (США) и Nunc (Дания) в С02-инкубаторе фирмы Sanyo (Япония). Манипуляции, требующие стерильных условий, проводились в ламинарном шкафу второго класса защиты фирмы Jouan (Франция) и в специальных боксированных помещениях Института биохимии А.Н. Баха РАН. Скелетномышечные миобласты человека выращивали в стандартных условиях, используя ростовую среду F-12, содержащую Hepes (в качестве буфера рН), пируват натрия, гентамицин и 12,5% телячьей эмбриональной сыворотки («ПанЭко»,Россия). Диффе-ренцировка миобластов индуцировалась культивированием в среде, содержащей 2% лошадиной сыворотки, на сроках до 10 суток, со сменой среды каждые 2 сут. Клетки рабдомиосаркомы культивировали в среде DMEM, содержащей Hepes, пируват натрия, гентамицин и 12,5% ЭТС. Культивирование клеток РПЖ и ДГПЖ, а также линии OKP-GS (рак почки), проводилось в среде RPMI-1640 с добавлением Hepes, пирувата натрия, гентамицина и 12,5% ЭТС.

По окончании культивирования клетки механически снимали с поверхности матрасов, предварительно проинкубировав в бессывороточной среде в течение 1 ч при температуре 4°С, чтобы смыть с поверхности клеток адсорбированные белки сыворотки, использованной

при культивировании. Полученные препараты клеток до проведения протеомного анализа хранили при температуре - 70°С.

Для изучения ядерных белков различные культивируемые соматические клетки человека (нормальные недифференцированные и дифференцированные миобласты, а также клетки линий злокачественных и доброкачественных опухолей) разрушали в мягких условиях (добавление неионного детергента и проведение нескольких циклов «замораживания - оттаивания»), затем центрифугированием осаждали клеточные ядра. Далее часть препаратов клеточных ядер использовалась для получения суммарных ядерных белков. Из оставшейся части препаратов ядер экстрагировали гистоны добавлением 0,4 М H2SO4 [по Green G.R., Do D.P. 2008]. Оставшиеся в осадке после экстрагирования гистонов другие ядерные белки («постги-стоновые белки») растворяли в лизирующем растворе с высоким содержанием денатурирующих агентов: 9 М мочевины, 5% меркаптоэтанола, 2% тритона Х-100, 2% амфолинов pH 3,5-10. Таким образом, для каждого из изучавшихся видов клеток было получено три типа белковых препаратов («суммарные ядерные белки, «гистоны», «постгистоновые белки»).

Фракционирование белков проводили методом двумерного электрофореза по О'Фарреллу в модификации, детально описанной ранее [Kovalyov L.l et al. 1995]. Во всех случаях образцы (белковые экстракты) в объеме 100-150 мкл использовали для получения одной двумерной электрофореграммы. Полученные электрфореграммы окрашивали кумасси R-250 [Fairbanks G. et al. 1971] и азотнокислым серебром [Blum Н. et al. 1987]. Денситомет-рию двумерных электрофореграмм (и/или их фрагментов) проводили после сканирования (сканер Epson expression 1680) или съемки на цифровую фотокамеру Nikon 2500. Сканирование и фотографирование гелей проводилось во влажном состоянии. Далее полученные цифровые изображения предварительно редактировали в графическом редакторе Adobe Photoshop а затем при помощи специализированного пакета программ ImageMaster 2D Platinum версий 6 и 7 («Genebio», Швейцария).

Для идентификации белков обработку электрофореграмм, гидролиз трипсином и экстракцию пептидов проводили согласно протоколам «Центра протеомных исследований» при НИИ биомедицинской химии им. В.Н. Ореховича РАМН. Триптические пептиды анализировали методом MALDI-TOF MS, а в некоторых случаях и методом MS/MS. Полученные масс-спектры анализировали посредством программы Mascot и с использованием баз данных NCBI Protein, OMIM, UniProt.

Статистическую обработку результатов проводили с использованием пакетов программ Microsoft Office Excel 2003. Для сравнения количественных признаков в двух независимых группах применяли непараметрический критерий Уилкоксона-Манна-Уитни [по Гублер Е.В., Генкин A.A. 1973 и www.psychol-ok.ru/statistics/mann-whitney/]. Результаты с уровнем значимости менее 0,05 рассматривали как статистически значимые.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ОБСУЖДЕНИЕ

Результаты протеомного изучения белков из биоптатов и аутоптатов т. vastus lateralis человека; построение двумерной белковой карты.

В соответствии с общей стратегией протеомных исследований для изучения белков из биоптатов и аутоптатов т. vastus lateralis человека на первом этапе работ была собрана коллекция из нескольких десятков двумерных электрофореграмм (ДЭ), на которых удавалось зарегистрировать до 650 окрашенных белковых фракций (при окраске нитратом серебра). Типичная ДЭ белков скелетной мышцы человека представлена на Рис. 1.

Далее методом сканирования ДЭ (или съемки на цифровую фотокамеру) получали цифровые изображения в формате .tiff и эти данные использовали для создания с помощью пакета программ ImageMaster 2D Platinum обобщенного (синтетического) изображения -двумерной белковой карты.

Рис. 1. Типичная двумерная электрофореграмма (ДЭ) белков биоптата m.vastus lateralis человека (окраска нитратом серебра)

Построение обобщенного (синтетического) изображения осуществлялось в виде не- I скольких последовательных этапов. Сначала выполнялся программный анализ изображений с целью автоматического выявления окрашенных пятен (фракций) и установления их очертаний. Окрашенная площадь каждого пятна устанавливалась программой по результатам опре- I деления различий между «темными» и «светлыми» пикселями. На данном этапе компьютер- 1 ного анализа ImageMaster 2D Platinum использует математические алгоритмы, благодаря которым высчитывается разница между светлыми и темными пикселями. Поскольку пятна имеют разную степень окраски, и могут сливаться с фоном, в программе задаются три специальных параметра для выявления («identification») белковых фракций (пятен, «spots»). Один

из них - параметр «Сглаживание» («Smooth») с помощью алгоритма диффузного сглаживания обеспечивает идентификацию наиболее сильно выраженных пятен, а также четкость определения края пятна. Для того чтобы отделить слабо окрашенные пятна от фона и шума изменяется параметр «Выделение» («Saliency»). Третий параметр «Минимальная площадь» («Min Area») задает минимальную площадь пятна, все пятна обладающей площадью ниже этого значения не будут выявлены.

Промежуточный результат такого компьютерного анализа по одному из фрагментов ДЭ представлен на Рис. 2.

Р lmag«Miftt*r2D Platinum

File view tun Slew Select Aralyze Reports ^ocls Wlracrw H3l(j

^ialjsl

•Haf : -И

>J«li j S»ou О Лшюшюге }0

ktu HOIMWl

Рис. 2. Пример автоматического программного анализа изображения ДЭ, в результате которого обеспечивается нахождение окрашенных пятен и определяются очертания их площадей.

Далее на втором этапе обработки изображений осуществляется сбор сведений о пятнах и построение трехмерных моделей на их основе. Анализ пятен идет по трем основным параметрам: «интенсивность», «площадь» и «объем пятна». «Интенсивность» - показывает степень окрашивания пятна по сравнению с фоном; при этом берется значение наиболее сильно окрашенных пикселей самого пятна и наиболее светлой области ближайшего фона, окружающего пятно. «Площадь пятна» - данный параметр высчитывает по среднему значению интенсивности окрашивания. Поскольку точно определить границы пятна в автоматическом режиме часто затруднительно, то пятнам присваивается несколько большая площадь, и значение показателя берется из расчета 75% от интенсивности пятна. Площадь выражается в мм2. «Объем пятна» - вычисляется из показателя площадь пятна, рассчитываемого строго по линии обводки пятна.

Итоговые трехмерные модели представляют собой наборы пиков; при этом, чем больше интенсивность, тем выше пик, и тем больше концентрация белка в данной фракции. Высота пика берется из расчета 75% от интенсивности пятна.

Fltc view Edtt Show Sefcct Analyze Reporta Tools '/Ипсto*- He*

PfrMl l-l-M

—

-1РЩ

Id

0.75 * Intensity

intensity

intensttu

f I

' I Sp»t) ■ О Агя-йаик о

fflff

/

X ten

Y iii - ' •

Рис. 3. Основные шаги в решении задачи построения трехмерной модели (3D) исследуемого участка изображения. А - Стрелками указаны расчеты параметров интенсивности, площади и объема анализируемого пятна (указанного курсором). Б - Трехмерная модель пятна, представленная в виде пика, который отображает форму и объем пятна.

Практические результаты, достигнутые при решении подобных задач, для участков на которых расположены гистоновые белки (полученные при протеомном изучении средне- и низкокопийных ядерных белков в культивируемых клетках человека) будут представлены ниже.

Важным достоинством программы ImageMaster 2D Platinum является то, что она позволяет проводить сравнительный анализ нескольких изображений двумерных электрофоре-грамм. При решении подобных задач общие пятна, характерные для 2-х и более ДЭ, выделяются одним цветом. Далее для них можно задать среднеарифметические характеристики, а также рассчитать вариабельность этих пятен и получить иные данные. Если при анализе сравниваемых изображений выявляются пятна, присутствующие на одном изображении и отсутствующие на другом, либо отличающиеся количественно и качественно в значительной степени то они выделяются другим цветом. Таким образом, появляется очень удобный инструмент даже для визуального анализа ДЭ, особенно при большом количестве гелей.

В процессе такого анализа всем обнаруженным пятнам автоматически присваивается уникальный номер, а также рассчитываются величины интенсивности площади, объема и их процентных соотношений. Все эти характеристики отображаются в виде отчета, который затем можно экспортировать в различные приложения. Поскольку исследователей обычно

интересует объем пятна, который вычисляется строго по линии обводки пятна, соответствующие данные для сравнения пятен могут быть получены из колонки «Volume». Для того чтобы точно определить соответствие характеристик в компьютерном отчете определенному пятну на карте, в программе запускается функция отображения номера пятна на самой карте, а затем он сравнивается с номером («SpotlD») в отчете. Для улучшения точности сравнения гелей в программе имеется функция выставления опорных точек, благодаря которой в каждом геле можно выставить опорные (референсные) точки на пятнах, которые присутствуют на обоих электрофореграммах. Опорные точки включаются в анализ и точность возрастает. Поскольку положение пятен 2-х изображений может отличаться на несколько миллиметров, то в программном обеспечении предусмотрена функция автоматического смещения, «подгонки» пятен на изображениях. Величину подгонки можно задать, и пятна, имеющие большую величину по выбранным параметрам, будут выделены соответствующим цветом. Величину смещения и вектор смещения пятна можно в любой момент просмотреть и внести корректировки.

Таким образом, благодаря проведению сканирования и компьютерной обработки (с помощью специализированного пакета программ ImageMaster версий 6 и 7) полученных изображений ДЭ суммарных белковых экстрактов из биоптатов и аутоптатов m. vastus lateralis удалось построить обобщенное, стандартизированное синтетическое изображение ДЭ белков скелетной мышцы человека - соответствующую белковую карту. Эта карга (Рис. 4) стала затем основой для создания специального биоинформационного ресурса «Белки скелетных мышц человека».

При формировании этого биоинформационного ресурса использовались результаты изучения выявленных на ДЭ 89 «мажорных» белковых фракций (Рис. 5). Во-первых, для них были получены данные прецизионного определения электрофоретических характеристик (с расчетом величин Мм и р! по этим характеристикам и по белкам-стандартам). Во-вторых, для всех указанных фракций удалось провести идентификацию с помощью масс-спектрометрических методов.

В результате оказалось, что исследованные 89 фракций представляют собой продукты экспрессии 55 известных генов человека. Среди идентифицированных белков большинство составляют изоформы (включая электрофоретические варианты) саркомерных и митохонд-риальных белков, а также ряд цитоплазматических ферментов (Таблица 1).

Надо отметить, что среди идентифицированных белков оказались: несколько изоформ миозиновых тяжелых и легких цепей, а также al - актин (скелетномышечный), 4 изоформы тропомиозинов, 7 изоформ тропонина Т1 (скелетно-мышечный, медленного типа; продукты гена TNNT1), тропонин ТЗ (скелетномышечный, быстрого типа; продукт гена TNNT3), 2 изоформы тропонина I (скелетно-мышечный, быстрого типа; продукт гена TNNI2), две изоформы (Н- и L-) (3-енолазы, десмин, мышечная креатинфосфокиназа и ряд других, которые рассматриваются как тканеспецифичные мышечные белки.

Рис. 4. Двумерная карта (обобщенное, стандартизированное синтетическое изображение) белков из суммарных экстрактов биоптатов и аутоптатов m. vastus lateralis человека. Зелеными линиями показаны автоматически выявленные окрашенные фракции.

Таблица 1. Основные группы идентифицированных белков (по внутриклеточной локализации*)

Основные группы идентифицированных белков Количество фракций

Изоформы (включая электрофоретические варианты) миозинов, актинов и других саркомерных белков 26

Митохондриальные ферменты и другие белки митохондрий (включая электрофоретические варианты) 17

Цитоплазматические ферменты и другие белки (включая электрофоретические варианты) 26

* Кроме того, отдельные из идентифицированных белков считаются ядерными (МУОИ), другие - содержатся в ЭПР (ЖЛ45), а некоторые имеют двойную локализацию, например, ядро/цитозоль (продукты РКМ2).

Рис. 5. Результаты прецизионного анализа белков из биоптата m.vastus lateralis человека для ¡ формирования биоинформационного ресурса. Стрелками с номерами обозначены белки, [ идентифицированные с помощью масс-спектрометрии. А - ДЭ (70 мкг белка); окрашивание азотнокислым серебром. Б - Распределение белков-маркеров М (набор высокоочищенных рекомбинантных белков с М = 10-200 кДа).

Надо отметить, что среди идентифицированных белков оказались: несколько изоформ миозиновых тяжелых и легких цепей, а также а1 - актин (скелетномышечный), 4 изоформы тропомиозинов, 7 изоформ тропонина Т1 (скелетно-мышечный, медленного типа; продукты гена ШЫН), тропонин ТЗ (скелетномышечный, быстрого типа; продукт гена ШЫТЗ), 2 изоформы тропонина I (скелетно-мышечный, быстрого типа; продукт гена ШШ2), две изоформы (Н- и Ь-) р-енолазы, десмин, мышечная креатинфосфокиназа и ряд других, которые рассматриваются как тканеспецифичные мышечные белки. Очевидно, что такие белки (19 среди идентифицированных фракций) могут быть потенциальными биомаркерами миогенной клеточной дифференцировки. В Табл. 2 приведены общие характеристики некоторых из идентифицированных тканеспецифичных мышечных белков.

Таблица 2. Общие характеристики некоторых из идентифицированных тканеспецифичных мышечных белков.

Белки Экспериментальные значения Мм/р1 % покрытия** Номера*** в базах данных NCBI и UniProt (символы генов) Расчетные значения Мм/pi ****

1 Тяжелая цепь миозина, изо-форма р 200,0/5,00 15 115496169, NP 000248, 160760 (.MYH7) 223,0/5,63

14 Десмин 52,0/5,47 74 55749932, NP_001918, 125660. Р17661 (DES) 53,4/5,21

23 р енолаза. Н-нзофор.ма 45,2/7,04 37 16878083, ААН17249, 131370, PI3929 (EN03) 47,0/7,58

24 Р енолаза, L-изоформа 44,7/7,04 62 16878083, ААН17249, 131370, Р13929 (EN03) 47,0/7,58

25 а 1 — актин (скелетномышечный) 43,1/5,37 42 4501881, NP 001091, 102610, Р68133 UCTA1) 41,9/5,23

37 Тропомпознн 2 (Р, изоформа 1) 36,2/4,85 34 42476296, NP_003280, 190990, P07951 (TPM2) 32,8/4,66

39 ЭВ Тропонин Т1 скелетномышечный, медленного типа 35,5/5,95 22 15305458, XP 048167, 191041, P13805 (TNNT1) 32,9/5,86 (изоформа 1 no Swiss-Prot)

41 Тропонин Т1 скелетномышечный, медленного типа 35,5/5,85 25 15305458, XP 048167, 191041, P13S05 (TNNT1) 32,9/5,86 (изоформа 1 по Swisi-Prot)

45 Тропомпознн 1 (а, изоформа 1) 34.7/4.92 64 63252898. NP 001018005, 191010. P09493 (TPM1) 32,7/4,69

* Номера показаны на Рис. 5.

** Суммарная длина выявленных триптических пептидов по отношению к полной аминокислотной последовательности белка в %.

*** Номера записей в базах данных представлены в следующем порядке - NCBI: GenBank, Nucleotide или Protein, OMIM и UniProt

**** Расчетные значения Мм/pi даны с учетом удаления лидерных пептидов

Из полученных материалов видно, что для ряда идентифицированных белков характерен биохимический полиморфизм, выражающийся в присутствии нескольких фракций со сходными электрофоретическими и структурными свойствами. Для некоторых таких белков причины наблюдавшегося полиморфизма оказывались известными (полилокусность, полиалле-лизм, альтернативный сплайсинг), что отражено в соответствующих записях в базах данных NCBI и UniProt.

Особенностью использованной в данной работе модификация двумерного электрофореза стало то, что с её помощью удалось получить разделение ряда белковых фракций с pl > 8,7. Часть таких белков идентифицировали масс-спектрометрически. Так, белковая фракция 81 оказалась а-глобином, и это в сочетании с присутствующими фракциями 83 и 10, идентифицированными как ß-глобин и альбумин соответственно, отражает, по-видимому, нахождение следов крови в биопсийных материалах. Кроме а-глобина среди идентифицированных мышечных белков с высокими значениями р! были выявлены хорошо известные и функционально важные цитохром С, скелетномышечная изоформа тропонина I быстрого типа и ß-субъединица митохондриального трифункционального белка (гидроксиацилдегидрогеназа, субъединица В), а также три белковые фракции, содержавшие LIM- и PZD- домены. Последние три белковые фракции привлекли особое внимание, поскольку нам не удалось найти сообщений об обнаружении подобных белков в мышцах человека с помощью 2DE, а также потому, что две из них (53, 54) по результатам масс-спектрометрии содержали пептиды, кодируемые одним из выявленных ранее транскриптов человека. Вместе с тем эти пептиды соответствовали N-концевой последовательности известного PDZ- и LIM-домен 5-содержащего белка, имеющего, однако, значительно большую молекулярную массу и являющегося продуктом гена PDLIM5 (синоним - ENH) [по записи Q96HC4 в UniProt].

Кроме того, было обнаружено несколько так называемых «фрагментов» известных белков. В частности, фракции с номерами 34,42 и 60 (Мм = 38,0, 33,2 и 27,8 кДа соответственно) по результатам масс-спектрометрии были охарактеризованы как «фрагменты» актина (совпадения - 33, 31 и21%). Такое снижение Мм могло быть обусловлено укорочением полипептидных цепей «фрагментов» по сравнению с полноразмерными актинами на участки с суммарными размерами от 35 до 140 а.о. Сравнение результатов определения масс триптических пептидов фракции №55 и её электрофоретических свойств позволило сделать заключение, что она представляет собой «фрагмент» изоформы 3 тропонина Т1 скелетно-мышечного медленного типа (совпадение - 22%), поскольку в этом случае наблюдалось соответствие значений М/pI, полученных по результатам 2DE (29,0/5,00) и расчетных характеристик (29,2/5,16). Аналогичным способом фракция №46 была идентифицирована как «фрагмент» глицеральде-гид-3-фосфатдегидрогеназы: совпадение - 37%; М/pI - 34,2/8,65 (экспериментальные значения) и 34,1/8,31 (расчетные).

Если отмеченные выше «фрагменты» известных белков присутствовали практически на всех электрофореграммах экстрактов из биоптатов, то иная ситуация наблюдалась для двух «фрагментов» аВ-кристаллина (Рис. 6), один из которых (Ф1-кр) был выявлен у 10 обследованных (Рис. 6, II), а второй (Ф2-кр) - только у двух. Зато оба они обнаруживались при анализе большинства аутопсийных образцов скелетных мышц, причем количество «фрагмента»

Ф2-кр заметно увеличивалось в пробах со сроками аутолиза -1 сут. (Рис. 6, III). Таким образом, обнаруженные «фрагменты» аВ-кристаллина, по всей видимости, представляют собой продукты протеолиза данного белка и могут служить объективными признаками выраженности прошедшего аутолиза.

ЭВ'КР J3 | " 73 эв-кр 72 73

т т *■ т ЭВ-кр / ▼

т * ш т

1W \

I Ф1-КР II Ф2-КР <Р1-к^ III

Рис. 6. Фрагменты двумерных электрофореграмм, на которых идентифицирована основная фракция аВ-кристаллина (73), полученных при анализе биоптатов m. vastus lateralis (I) и аутотатов скелетной мышцы со сроком аутолиза < 12 ч (II) и > 12 ч (III). Стрелками показаны белки, идентифицированные с помощью масс-спектрометрии как электрофоретический вариант кристаллита (ЭВ-кр) и фрагменты кристаллина (Ф1-кр, Ф2-кр)

Использованная модификация двумерного электрофореза не только расширила возможности протеомного анализа мышечных белков, включив в него ряд фракций с р! 8,7-9,5, но и обеспечила выявление нескольких белковых фракций с М > 200 кДа. Одна из них (КФЦ на Рис. 1) по результатам идентификации с помощью масс-спектрометрического анализа содержала триптические пептиды, соответствующие тяжелым и легким цепям ферритина (гены FTH1 и FTL; покрытие 41 и 40% последовательностей соответственно). Поскольку у тяжелой и легкой цепей ферритина М = 26,2 и 16,4 кДа соответственно, можно считать, что данная белковая фракция представляет собой весьма прочный комплекс из ферритиновых цепей. Обнаруженные нами комплексы, очевидно, необычайно прочны, поскольку они не диссоциируют на мономеры даже под действием высоких концентраций мочевины и в присутствии детергентов, используемых при фракционировании белков методом 2DE. По-видимому, такая стабильность возможна лишь из-за возникновения между цепями ферритина ковалентных связей. Сходные по свойствам (включая результаты масс-спектрометрии) КФЦ удалось обнаружить в культивируемых миобластах, в образцах тканей простаты, в культивируемых эпителиальных клетках рака простаты (DU145). Следовательно, можно предположить, что обнаружение при протеомных исследованиях КФЦ, присутствующих в самых разных клетках человека, связано с особенностями метаболизма ферритина.

Сравнительные протеомные исследования кальдесмона - одного из белков, вовлеченных в обеспечение клеточной подвижности.

Среди белков, вовлеченных в обеспечение клеточной подвижности и обладающих характеристиками потенциального биомаркера, активно изучается кальдесмон 1 (в PubMed около 400 публикаций по запросу «caldesmon biomarker). Кальдесмон 1 рассматривается как биомаркер клеточной дифференцировки по гладкомышечному типу и анализируется при рабдо- и лейомиосаркомах, а также ряде других злокачественных опухолей. Известно, что кальдесмон 1 человека присутствует в гладких мышцах, а также в различных немышечных тканях и клетках: в эмбриональной почке, фетальной печени, при раке шейки матки, фиброб-

ластах, в эпителии молочной железы, в клетках кожи и HeLa, но не обнаруживался в поперечнополосатых мышцах в норме [по Q05682 UniProt].

В отдельной серии экспериментов, проведенные сравнительные протеомные исследования позволили выявить одну из обычных изо-форм кальдесмона 1 на ДЭ белков ткани простаты (содержащей до 30% гладкомышечных клеток) и ткани миометрия (состоящей из гладкомышечных клеток) (Рис. 7). Результаты MALDI-TOF MS анализа показали, что белок, отмеченный на Рис. 7, как кальдесмон соответствует изоформе h-кальдесмона с покрытием 43%, score 275, при значениях Mm/pl 95,0/5,60 (эксп.) и -93,3/5,62 (теор.)

Иной результат был получен при

протеомном анализе белков скелетномы- рис 7 резульхаты идентификации изофор-шечных миобластов человека (Рис.8). мы h-кальдесмона 1 на ДЭ белков ткани Одну из белковых фракций также иденти- простаты (А) и ткани миометрия (Б), фицировали как кальдесмон 1, но её Mm

оказалась не более 38 кДа (gi: 33878450, NCBI protein). По материалам базы данных UniProt при экспрессии гена CALD1 могут образовываться за счёт альтернативного сплайсинга несколько белковых продуктов, но для всех этих белков величины Mm оцениваются в 61-66 к Да.

Рис. 8А

I"

C§-

Mack to. р|ЖШ> Score: HSEspecl: 4.V012

CALD1 frorriii [Нмм apl«»]

Protein score greater than 64 are significant ¡pgQ.0.V|.

Koffliaat mass (Mr): Calculated p] \-al»j 5Ji

mi BLAST' stadi of it» aprst if Mmifcl styitwt straf tor ра.<% into oflitr цирНсайш

Рис. 8 Б

MSrtVlS FiüKuicaieiiu« аГ I I I l'NT<J\ ECDDE.\Af LER Found in С ALDI protein [Homo згдекга]

Match to Query 21: 2097 О&Э^М äroi»<i09S OS»lOO 1,1-1 From cUüv Я« DATA TXT

f- g ¿g

It

t ii £ s *

_Uj_L

Рис. 8B

Рис.8. Выявление новой изоформы кальдесмона 1 в скелетномышечных миобластах человека. А - Фрагменты ДЭ с идентифицированной изоформой кальдемона. Б - Масс-спектр полученных триптических пептидов при MALDI-TOF MS анализе и результат идентификациии (покрытие 21 %). В - результаты тандемной масс-спектрометрии с секвенированием одного из триптических пептидов кальдесмона.

Таким образом, выявленная в скелетномышечных миобластах изоформа кальдесмона 1 принципиально отличается от других известных изоформ. Однако, ранее сообщалось об обнаружении в ткани легких транскрипта гена CALD1, гипотетический белковый продукт которого мог обладать Мм 36,5 кДа (Genome Res. 2004, 14, 2121-27). Соответственно, возможно, что идентифицированная в скелетномышечных миобластах новая изоформа кальдесмона 1 представляет собой результат трансляции описанного укороченного транскрипта гена CALDI.

Протеомное изучение ядерных белков в культивируемых мышечных клетках человека.

Исследование ядерных белков протеомными технологиями представляет, с одной стороны, значительный интерес, поскольку эти белки вовлечены во многие важные клеточные процессы (включая внутриклеточную подвижность), а с другой, - сопряжены с существенными трудностями, так как большинство указанных белков характеризуются сравнительно низким

18

содержанием в клетках (т.е. могут рассматриваться как средне- или низкокопийные белки).

Одним из предлагаемых подходов к системному протеомному исследованию средне- и низкокопий-ных ядерных белков является проведение предварительного фракционирования клеточных лизатов. Общая схема системного анализа ядерных белков, включающая получение препаратов гистонов и по-стгистоновых белков, с целью последующего

протеомного исследования представлена на Рис. 9.

Как видно из данного

Выращивание необходимой биомассы и сбор клеток (1- 2x10* клеток)

Я

Лизис клеток (1°/о Тритон Х-100 и несколько циннии «аамораживание-оттаивание»)

Д-

Получение клеточных ядер и их очистка

Л

IKCTf

в (с,

JJ-

Суммарные белки ядер

Получение экстракта г исто новых белкой (С,4 М H2SO<)

bl*

Гистоны

Получение экстракта белков «ядерного матрикса» («лизис-раствор» для двумерного электрофореза)

1U.

Постг исто-новые белки

Рис. 9. Общая схема изучения ядерных белков, включающая получение препаратов суммарных ядерных белков, гистонов и постгистоновых белков.

рисунка, благодаря использованной методике было получено три вида препаратов: «Суммарные белки ядер» «Гистоны» и «Белки ядерного матрикса», которые параллель-но изучали

И

— ¡м»

Зона

ГИСТОНОВ

НЗ

И2В, ?

Рис.10. ДЭ препаратов «Суммарные ядерные белки» (А, пунктирными прямоугольниками обозначены участки расположения гистоновых и постгистоновых белков), а также фрагменты ДЭ «Гистоны» (Б) и «Постгистоновые белки» (В). Стрелками показаны белковые фракции, идентифицированные методом MALD1-T0F MS (гистоны - HI, Р2В, НЗ, Н4; изоформы виментина - Vim, актин - Act). Красными овалами обозначены некоторые низкокопийные белки.

При сравнении спектров гистоновых белков, полученных с помощью пакета программ ImageMaster 2D Platinum (Рис. 11) при анализе ДЭ соответствующих препаратов из нормальных соматических клеток - недифференцированных (и активно пролиферирующих) миобла-стов и дифференцированных миобластов с миотубами (практически утратившими способность к пролиферации) можно сделать заключение, что проведенный анализ позволил выявить существенные различия, выражающиеся, прежде всего, в изменениях взаиморасположения гистоновых белков (очевидно, за счет изменений их изоэлектрических точек).

Дифференцированные миобласты

Du-145

Рис. 11. Результаты сравнительного протеомного анализа гистоновых фракций, в различных культивируемых клеточных линиях. 30-модели и соответствующие фрагменты ДЭ препаратов «Гистоны»

Гистонм Н1 Гисгоны Н2А Гистоны М2В Гистоны ИЗ Гмстаны Н4

Например, если выбрать в качестве референсной фракции гистон Н1 (красный пик), то относительно этой фракции фракция НЗ (темно-голубой пик) в дифференцированных миоб-ластах явно смещена (область более кислых значений pl) по сравнению с соответствующей фракцией у недифференцированных миобластов. Фракция Н2В (желто-зеленый пик), которая в недифференцированных миобластах, по-видимому, состоит из двух близко расположенных и сливающихся субфракций, в дифференцированных миобластах остается в виде одной субфракции с более кислым значением pl. Существенно изменяется и фракция гистонов Н2А, в которой, вероятно, появляется дополнительная субфракция и, соответственно, резко уменьшается высота темно-синего пика. Наконец, фракция гистонов Н1, явно представленная двумя пиками разной величины у недифференцированных миобластов, в дифференцированных клетках остается в виде одного «острого» пика.

Предположив, что выявленные изменения в спектре гистонов могут быть вызваны постсинтетическими модификациями (т.к. все наблюдавшиеся перемещения гистоновых фракций происходили в соответствии с изменениями их изоэлектрических точек, которые могут возникать, например, за счет блокирования остатков лизина или присоединения остатков фосфорной кислоты) и иметь отношение к пролиферативной активности клеток, представлялось целесообразным провести сравнение гистоновых спектров нормальных клетках со спектрами этих белков в клетках различных опухолей.

В отличие от нормальных миобластов в быстро пролиферирующих клетках рабдомио-саркомы у фракции Н2В (желто-зеленый пик) явно доминировала субфракция с более щелочным значением pl. Кроме того, отличительной чертой рабдомиосаркомы было присутствие двух фракций гистонов Н4, значительно различающихся по pl.

Ещё более драматичные различия у фракции Н2В можно заметить, если провести сравнение между препаратами «Гистоны», полученными из дифференцированных миобластов (Рис. 13) и клеток рабдомиосаркомы (Рис. 14). В итоге можно предположить, что доминирование субфракции Н2В с более щелочным значением pl коррелирует со способностью клеток к активной пролиферации, а наличие субфракция Н2В с более кислым значением pl указывает на снижение пролиферативного потенциала.

В пользу этого предположения свидетельствуют попарные сравнения гистоновых белков из нормальных недифференцированных (и способных к пролиферации) миобластов и клеток с доброкачественной гиперплазией простаты, а также с раковыми клетками простаты. Как видно из представленных материалов в гистоновых спектрах всех быстро пролиферирующих раковых клеток наблюдалось доминирование субфракции Н2В с более щелочным значением pl над субфракцией с более кислым значением pl. Можно отметить также, что в доброкачественных клетках ВРН-1 это доминирование было существенно менее выраженным, чем в раковых клетках РС-3, а в раковых клетках Du-145 Н2В субфракцию с более кислым значением pl даже не удавалось зарегистрировать.

В целом, можно сделать заключение, что по результатам проведенного протеомного анализа белковых препаратов («Суммарные ядерные белки», «Гистоны», «Постгистоновые белки»), полученных из культивируемых мышечных клеток человека (недифференцированные и дифференцированные миобласты, а также клетки рабдомиосаркомы) удалось выявить

ряд средне- и низкокопийных белков, а также обнаружить микрогетерогенность гистоновых белков, вероятно связанную с изменениями пролиферативного потенциала изученных клеток.

Сравнительный протеомный анализ некоторых белков в линиях мышечных клеток, а также в некоторых эпителиоподобных клеточных линиях человека; ЗБ-модели и выявление потенциального биомаркёра - серпина HI.

При сравнительном анализе с помощью ImageMaster 2D Platinum фрагментов изображений ДЭ белков, экстрагированных из клеток мышечного происхождения и культивируемых линий эпителия аденомы (ВРН-1) и рака простаты (DU145, РСЗ и LNCaP), внимание привлекли две фракции, присутствовавшие со сходными позициями (электрофоретическими свойствами) практических во всех изучавшихся объектах. Эти фракции были идентифицированы масс-спектрометрическими методами, как эукариотический трансляционный фактор 1 (продукт гена EEF1A1) и серпин HI (продукт гена SERPINHI). При этом оказалось, что, сер-пин HI присутствует как в нормальных мышечных клетках, так и в клетках обеих линий раб-домиосаркомы, где содержание этого белка существенно не изменяется. Однако для различных опухолевых клеток простаты были получены совершенно иные результаты (Рис. 13).

Эукариотический трансляционный фактор 1 Ингибитор серниовых протеаз, серпин Н1,

элонгации альфа 1 (ЕЕР1А1) I-(синонимы - белок теплового шока 47,

5ЕНР1МН1), шмф

Рис.13. Результаты протеомного анализа, выполненного с помощью с помощью ImageMaster 2D Platinum, эукариотического трансляционного фактора 1 (EEF1A1) и серпина HI, (SERPINHI), в культивируемых клетках, моделирующих опухоли простаты. Верхний ряд -автоматическая регистрация и определение объема пятен; нижний ряд - 3D модели.

Наиболее высокое относительное содержание серпина HI (по сравнению с фракцией EEF1A1) регистрировалось в клетках линии ВРН-1 (доброкачественная гиперплазия), а наименьшее (практически отсутствие) - в клетках линии LNCaP (рак простаты). В двух других

раковых линиях фи 145, РСЗ) серпин Н1 хотя и присутствовал, но его относительное содержание было резко сниженным (Табл. 3).

Таблица 3. Соотношение БЕШМЫШ/ЕЕР!А1(М± ш)

ВРН-1 LNCaP DU-145 РС-3

1,13 ±0,05 менее 0,01 0,05 ± 0,01 0,09 ± 0,03

Как видно из представленных количественных данных, соотношение SERP1NH1 / EEF1A1 в раковых клетках простаты оказалось на два порядка меньшим, чем в клетках с доброкачественной гиперплазией. Маловероятно, чтобы такие значительные различия носили случайный характер. Иными словами, резкое снижение содержания серпина HI, который, хотя и относят к суперсемейству ингибиторов сериновых протеаз, обладает также функциями шаперона (синонимы - белок теплового шока 47), может быть связано с процессами злокачественной трансформации клеток простаты.

В целом, сравнительный протеомный анализ серпина HI в клеточных линиях рабдо-миосаркомы RD и А-204, а также в эпителиоподобных клеточных линиях простаты (ВРН-1 -доброкачественная гиперплазия, LNCaP, РСЗ и DU145 - рак) показал характерные изменения. Оказалось, что в клетках обеих линий рабдомиосаркомы этот белок присутствовал в количествах, сопоставимых с его содержанием в немалигнизированных клетках. Однако, в раковых клетках простаты содержание серпина HI было резко сниженным. Таким образом, из приведенных данных следует, что серпин HI можно рассматривать как потенциальный биомаркер опухолей эпителиального генеза, но не миогенного происхождения.

ВЫВОДЫ

1. На основе протеомного изучения «мажорных» белков из биоптатов и аутоптатов т. vastus lateralis человека сформирован специальный модуль в отечественную базу данных «Протео-мика мышечных белков человека», который включает результаты идентификации 89 белковых фракций, являющихся продуктами экспрессии 55 генов. Среди идентифицированных белков выявлены:

а) изоформы миозинов, актинов и других саркомерных белков, обеспечивающих двигательную функцию (26), ряд цитоплазматических ферментов и других цитоплазматических белков (26), а также некоторые митохондриальные белки (17) и белки с другой внутриклеточной локализацией;

б) изоформы тропонинов, Н- и L- р-енолазы и ряд других белков, специфичных для поперечнополосатых мышц, которые могут служить биомаркерами дифференцировки по мышечному типу (19);

в) несколько необычных для 20Е-анализа белковых фракций, в частности, белки, содержащие PDZ и LIM-домены (pi > 8,70), а также «фрагменты» известных белков и стабильный комплекс ферритиновых цепей.

2. По результатам протеомного анализа культивируемых скелетномышечных миоблаетов человека установлено, что в этих клетках присутствует новый белковый продукт гена каль-десмона (CALD1).

3. При протеомном анализе белковых препаратов (суммарные ядерные белки, гистоны, по-стгистоновые белки), полученных из культивируемых мышечных клеток человека выявлен ряд средне- и низкокопийных белков, а также обнаружена микрогетерогенность гистоновых белков, вероятно связанная с изменениями пролиферативного потенциала изученных клеток.

4. Сравнительный протеомный анализ серпина HI в линиях клеток рабдомиосаркомы RD и А-204, а также ряда эпителиоподобных клеточных линий человека простаты (ВРН-1 - доброкачественная гиперплазия, LNCaP, РСЗ и DU145 - рак) показал, что в клетках обеих линий рабдомиосаркомы этот белок присутствовал в количествах, сопоставимых с его содержанием в немалигнизированных клетках простаты, а в раковых клетках простаты содержание серпина HI было резко сниженным.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Статьи в рецензируемых журналах:

1. Ковалева М.А Ковалев Л.И., Торопыгин И.Ю., Шигеев C.B., Иванов A.B., Шишкин С.С. Протеомный анализ белков скелетной мышцы (m.vastus lateralis) человека, идентификация 89 белковых продуктов генной экспрессии. Биохимия, 2009, т.74 №11, 1524-1538.

2. Шишкин С.С., Ковалев Л.И.,Ковалева М.А., Крахмалева И.Н.', Лисицкая К.В., Еремина Л.С., Иванов A.B., Герасимов Е.В., Садыхов Е.Г., Уласова Н.Ю., Соколова О.С., Торопыгин И.Ю., Попов В.О. База данных «Протеомика рака простаты». Acta Naturae, т. 2, №4 (7). С.58-68.

3. Лисицкая К.В., Еремина Л.С., Иванов A.B., Ковалева М.А., Охриц В.Е., Торопыгин И Ю Ковалев Л.И., Шишкин С.С. Изучение белка DJ-1 при раке простаты в образцах тканей, в культивируемых клетках и в сыворотке крови больных. Биомедицинская химия 2011 т 57 вып. 4.С.392-401. ' ' '

4. Ковалев Л.И., Макаров A.A., Черкашин Е.А., Дулиньска Й„ Ковалева М.А., Лисицкая К.В Иванов A.B., Торопыгин И.Ю., Серебрякова М.В., Лайдлер П., Шишкин С.С. Новый аллель-ныи вариант триозофосфат изомеразы, выявленный в культивируемых клетках рака простаты человека. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2011, №1, с.14-19.

5. Shishkin S., Kovaleva M., Ivanov A., Eryomina L„ Lisitskaya К., To'ropu'gin I., Kovalev L„ Okhritz V., Loran 0. Comparative proteomic study of proteins in prostate cancer and benign hyperplasia cells. J. Cancer Sei. Ther. 2011. 14p. DOI: 10.4172/1948.S 1-003

Статьи в сборниках и информационно-методические письма:

1. Lisitskaya K.V., Eremina L.S., Sadikhov E.G., Ivanov A.V., Shishkin S.S., Kovalyov L.I., Toropygin I.Y. Prostate cancer proteomics. Proc. 1-st Intern. 3D Online Conference "Fundamental Medicine: from Scalpel toward Genome, Proteome and Lipidome (April 25-28, Russia) P.65-67

2. Шишкин C.C., Ковалева M.А., Иванов A.B., Ковалев Л.И., Крахмалева И.Н., Еремина Л.С Лисицкая К.В., Торопыгин И.Ю., Садыхов Э.Г. Постгеномные технологии в изучении мышечной системы человека и разработка некоторых проблем спортивной медицины. Материалы Всероссийского Конгресса «Медицина для спорта». М. 2011. с.521-526.

3. Шишкин С.С., Ковалев Л.И., Ковалева М.А., Крахмалева И.Н., Еремина Л.С., Лисицкая К.В., Иванов A.B., Лоран А.Б., Велиев Е.И., Охриц В.Е. Протеомные и другие постгеномные технологии в онкоурологии. Информационно-методическое письмо. М.:000 «Оригинальная компания», 2012, 31 с. Тезисы докладов:

1. Еремина Л.С., Макаров A.A., Буракова М.В., Иванов A.B., Хряпова Е.В., Охриц В.Е. Разработка новой мультикомплексной белковой системы диагностики рака простаты. Тезисы докладов конференции молодых ученых «Актуальные вопросы лучевой диагностики и онкологии», 2008, М„ с.6-8

2. Шишкин С.С., Ковалева М.А., Торопыгин И.Ю., Макаров A.A., Еремина Л.С., Иванов A.B., Герасимов Е.В. Протеомика мышечных органов, тканей и клеток человека. Тезисы докладов IV Российского симпозиума «Белки и пептиды». Казань.2009. с. 144.

3. Шишкин С.С.,Ковалев Л.И., Ковалева М.А., Иванов A.B., Лисицкая К.В., Еремина Л.С., Садыхов Э.Г., Торопыгин И.Ю., Мошковский С.А. Протеомные технологии и поиск новых маркеров для диагностики рака простаты. Тезисы докладов I международной научно-практической конференции «Постгеномные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине». М. ООО «Парк-медиа», 2010, с.61.

4. Иванов A.B., Ковалев Л.И., Черкашин Е.А., Ковалева М.А., Еремина Л.С., Хряпова Е.В., Шишкин С.С. Новый аллельный вариант триозофосфат изомеразы, выявленный в культивируемых клетках рака простаты человека. Тезисы докладов VI съезда Российского общества медицинских генетиков. Медицинская генетика, 2010, с 71.

5. Шишкин С.С., Ковалев Л.И., Ковалева М.А., Иванов A.B., Еремина Л.С., Садыхов Е.Г., Торопыгин И.Ю., Шигеев C.B. Компьютерная база данных «Протеомика мышц человека 2010» Тезисы докладов XXI съезда физиологического общества им. И.П. Павлова. Москва-Калуга, ООО "БЭСТ-принт", 2010, с.699.

6. Иванов A.B., Еремина Л.С., Лисицкая К.В., Хряпова Е.В., Торопыгин И.Ю., Ковалева М.А., Ковалев Л.И., Шишкин С.С. Серпин Н1, продукт гена SERPINH1,- потенциальный биомаркер раковой трансформации в эпителиоподобных клеточных линиях человека. Тезисы докладов V Российского симпозиума «Белки и пептиды». Петрозаводск, 2011, с.277.

7. Шишкин С.С., Ковалева М.А., Ковалев Л.И., Иванов A.B., Торопыгин И.Ю., Еремина Л.С., Лисицкая К.В., Садыхов Э.Г. Протеомика мышечных белков человека. Тезисы II международной научно-практической конференции "Постгеномные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине: геномика, протеомика, биоинформатика". Новосибирск, 2011, с.105.

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Иванов, Алексей Викторович, Москва

61 12-3/547

На правах рукописи УДК

Иванов Алексей Викторович

СРАВНИТЕЛЬНОЕ ПРОТЕОМНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ БЕЛКОВ ЧЕЛОВЕКА, УЧАСТВУЮЩИХ В ОБЕСПЕЧЕНИИ ДВИГАТЕЛЬНЫХ

ФУНКЦИЙ;

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальностям 03.01.04 - Биохимия

Научный руководитель:

доктор биологических наук Ковалев Л.И.

Москва 2012 г.

ОГЛАВЛЕНИЕ

Стр.

СПИСОК СОКРАЩЕНИИ 4

ВВЕДЕНИЕ 6

ГЛАВА 1. Общие характеристики и постгеномные исследования белков человека, обеспечивающих двигательную функцию; биомедицинские аспекты (обзор литературы). 11

1.1. Общие представления о «мажорных» белках человека с двигательными функциями. 11

1.1.1 Основные белки, участвующие в мышечном сокращении. 1.1.2. Основные белки, обеспечивающие клеточную подвижность. 12

1.2. Протеомные подходы к изучению белков, вовлечённых в обеспечении двигательных функций у человека. 1.2.1. Формирование и основные этапы в развитии протеомики человека 1.2.2. Протеомика мышечных белков человека в постгеномном периоде. 1.2.3. Протеомика белков, обеспечивающих клеточную подвижность. 27

1.3. Основные подходы к поиску белковых биомаркеров, связанных с нарушениями двигательных функций. 37

1.4. Рак простаты - актуальная проблема онкоурологии и поиски белковых биомаркеров рака простаты. 1.4.1. Общие характеристики рака простаты 1.4.2. Простат-специфический анатиген и некоторые потенциальные белковые биомаркеры рака простаты 42

ГЛАВА 2. Материалы и методы 50

2.1. Реактивы и биологические материалы. 50

2.2. Методы культивирования клеток человека и получения препаратов клеточной биомассы для дальнейших исследований. 51

2.3. Методы получения препаратов клеточных белков, составляющих ядерный протеом. 52

2.4. Подготовка белковых экстрактов из образцов тканей и культивируемых клеток. 53

2.5. Фракционирование белков двумерным электрофорезом. 2.5.1. Изоэлектрофокусирование и неравновесное фокусирование в полиакрила-мидном геле в градиенте рН, сформированном амфолинами. 2.5.2. Изоэлектрофокусирование в иммобилиновом градиенте рН. 2.5.3. БОБ-электрофорез в пластинах полиакрил амид ного геля. 2.5.4 Детекция белков на гелевых пластинах. 53

2.6. Денситометрия и компьютерный анализ результатов двумерного электрофо- 58

реза с использованием программ фирмы GE Healthcare.

2.7. Масс-спектрометрическая идентификация белков. 59

2.8. Определение концентрации белков. 60

2.9. Статистическая обработка результатов. 60

ГЛАВА 3. Полученные результаты и их обсуждение. 61

3.1. Протеомное изучение «мажорных» белков из биоптатов и аутоптатов т. vastus lateralis человека, формирование модуля «Белки скелетных мышц» для отечественной базы данных «Протеомика мышечных белков человека». 3.1.1. Результаты двумерного электрофореза белков из биоптатов и аутоптатов т. vastus lateralis человека и построение двумерной белковой карты (обобщенного синтетического изображения). 3.1.2. Результаты масс-спектрометрической идентификации белков скелетных мышц. 3.1.3. Встраивание модуля «Белки скелетных мышц» в отечественную базу данных «Протеомика мышечных белков человека». 61

3.2. Сравнительное изучение в культивируемых мышечных клетках человека отдельных групп белков, вовлеченных в обеспечение двигательных функций; проте-омная идентификация потенциального биомаркёра - нового белкового продукта гена кальдесмона (CALD1). $8

3.3. Разработка подхода к протеомному анализу средне- и низкокопийных белков человека, вовлеченных в обеспечение двигательной функции. 3.3.1. Протеомный анализ общих ядерных белков, полученных из культивируемых миобластов человека, клеток рабдомиосаркомы и некоторых других клеточных линий. 3.3.2. Протеомный анализ гистонов, полученных из культивируемых миобластов человека, клеток рабдомиосаркомы и некоторых других клеточных линий. 3.3.3. Протеомный анализ постгистоновых ядерных белков, полученных из культивируемых миобластов человека, клеток рабдомиосаркомы и некоторых других клеточных линий. 91

3.4. Сравнительный протеомный анализ потенциального биомаркёра - серпина Н1, в линиях клеток рабдомиосаркомы RD и А-204, а также ряда эпителиоподобных клеточных линий человека. 96

ЗАКЛЮЧЕНИЕ 99

ВЫВОДЫ 101

БЛАГОДАРНОСТИ 102

СПИСОК ЦИТИРОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 103

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

АА акриламид

а.о. аминокислотные остатки в белках

АСБ актин-связывающие белки

АТФ аденозинтрифосфат

ДГПЖ доброкачественная гиперплазия предстательной железы

ДНК дезоксирибонуклеиновая кислота

кДа килодальтон

МБА метиленбисакриламид

ЛЦМ легкая цепь миозина

Мм молекулярная масса

мРНК матричная рибонуклеиновая кислота

ПААГ полиакрил амид ный гель

ПЖ(Ч) предстательная железа (человека)

ПИН простатическая интраэпителиальная неоплазия

ПСА персульфат аммония

ПЦР полимеразная цепная реакция

РНК рибонуклеиновая кислота

РПЖ рак предстательной железы

ТЕМЕ Д N,N,N',N' -тетраметилэтилендиамин

ТМ тропомиозин

ТЦМ тяжелая цепь миозина

2D-DIGE двумерный дифференциальный электрофорез в геле

2D-PAGE двумерный электрофорез (в полиакриамидном геле)

ESI электроспрейная ионизация

ICAT метод изотопно меченных аффинных мишеней

IEF изоэлектрофокусирование

IEF-PAGE электрофорез в градиенте рН, созданном амфолитами

Ig иммуноглобулин

IPG-PAGE электрофорез в иммобилизованном градиенте рН

MALDI(-TOF) опосредованная матрицей (времяпролетная) лазерная десорбция/

ионизация

MS масс-спектрометрия

MS/MS тандемная масс-спектрометрия

Mud-LC многомерная жидкостная хроматография

NCBI национальный центр биотехнологической информации в США

(National Centre for Biotechnology Information)

NEPHGE неравновесный электрофорез в градиенте рН

OMIM компьютерная база данных о менделирующих признаках челове-

ка (On line Mendelian Inheritance of Man), входящая в банк данных NCBI

pi изоэлектрическая точка

PBS Na-фосфатный буфер

RT-PCR полимеразная цепная реакция в реальном времени

SDS додецилсульфат натрия

SELDI(-TOF) усиленная поверхностью (времяпролетная) лазерная десорбция/

ионизация

SILAC метод меченных стабильными изотопами аминокислот в клеточ-

ной культуре

SNP однонуклеотидный полиморфизм

TRIS трис {гидроксиметил} аминометан

ВВЕДЕНИЕ.

Актуальность темы. Обеспечение различных видов движений у живых организмов является одной из наиболее важных белковых функций - двигательной. Эта функция ярко проявляется сокращением различных видов мышц, а также способностями у подавляющего большинства клеток с другими типами дифференцировки к изменениям своей формы и движению в различных средах, окружающих эти клетки [Зенгбуш П. 1982; Поглазов Б.Ф., Левицкий Д.И. 1982; Schiaffino S„ Reggiani, С. 1996; Шишкин С.С. с соавт 2004; Murphy D.A., Courtneidge S.A. 2011 и др.]. К настоящему времени, благодаря многолетним усилиям биохимиков, а также ученых смежных специальностей накоплен большой объем сведений о белках человека, как непосредственно участвующих в мышечном сокращении, так и о тех белках, которые обеспечивают клеточную подвижность. В частности, в ходе исследований по международному проекту «Геном человека» было установлено, что у человека имеется, как минимум, 376 так называемых моторных генов («motor»), непосредственно обеспечивающих двигательные функции, а также 1453 гена, кодирующих цитоске-летные белки и белки клеточной адгезии, которые имеют прямое отношение к клеточной подвижности [Venter C.J. et al. 2001]. Соответственно, для системного изучения белков указанных групп во многих странах ведутся работы по созданию и поддерживанию специальных информационных ресурсов, предназначенных для обеспечения разнообразных биомедицинских исследований. В этом отношении на фоне информационных ресурсов, созданных, например, в Ирландии (UCD-2DPAGE, http://proteomics-portal.ucd.ie:8082/cgi-bin/2d/2d.cgi) и в Индии («Human Proteinpedia», www.humanproteinpedia.org), достижения отечественных исследователей выглядят пока весьма скромными.

С началом постгеномной эры в биохимии для изучения белков человека, непосредственно участвующих в мышечном сокращении, активно привлекаются протеомные технологии [Шишкин С.С. с соавт 2004; Urbonavicius S. et al. 2009; Gelfi С. et al. 2011 и др.]. Как объекты для протеомного изучения мышечные ткани и органы, содержащие по массе существенную часть белков организма человека, представляют значительный интерес по ряду причин. Известно, что при формировании и функционировании мышечных тканей и органов происходят закономерные изменения генной экспрессии, которые находят отражение в так называемых белковых профилях и протеомный анализ позволяет прецизионно характеризовать эти процессы [Торро S. et al. 2003; Urbich С. et al. 2011]. Существует достаточно много заболеваний мышечных тканей и органов, и протеомные исследования открывают пучь к выяснению патогенеза этих заболеваний, а также способствуют выявлению диагностически значимых молекулярных маркеров [De Palma S. et al. 2006; Celegato

В. et al. 2006; Polkinghorne V.R. et al. 2009; Pilop C. et al. 2009]. В связи с различиями в дифференцировке мышечных клеток и особенностями морфологии мышечных органов, включая отдельные скелетные мышцы, с помощью протеомных технологий создаются условия для поиска ткане- и органо-специфичных белков, среди которых могут находиться новые белковые изоформы или новые белки [Schessl J et al. 2008; Jedrychowski M.P. et al. 2010; Hammer E. et al. 2011].

Протеомные технологии активно применяются также для изучения различных белков человека, обеспечивающих клеточную подвижность, в отношении клеток с различными типами дифференцировки, а также клеток злокачественных опухолей, в связи с тем, что в основе и инвазивности, и метастазирования лежат особые нарушения клеточной подвижности, в которых принимают участие ряд актин-связывающих белков (АСБ), а также цитоскелетные и мембранные белки [Weaver A.M. 2008; Albiges-Rizo С. et al. 2009; Shankar J. et al. 2010]. Выявление таких нарушений, с одной стороны, открывает пути к развитию представлений о молекулярных основах раковой трансформации клеток и роли в этом определенных представителей (изоформ) различных белковых семейств [Giubellino

A. et al. 2007; Albiges-Rizo С. et al. 2009 и др.], а с другой, может расширить список потенциальных биомаркеров опухолевых заболеваний. Например, в качестве биомаркеров рака простаты изучаются некоторые изоформы семейства ß-тимозинов, относящегося с АСБ, и семейства аннексинов, участвующих в обеспечении взаимодействий цитоскелетных и мембранных белков [Hutchinson L.M. et al. 2005; Schostak M. et al. 2009]. Интерес к последним (с учётом того, что простата рассматривается как мышечно-эпителиальный орган) обусловлен весьма интенсивным ростом заболеваемости раком простаты в России (2 место в структуре онкопатологии), и в ряде стран Запада [Wolf A.M. et al. 2010; Чиссов

B.И. с соавт. 2011 и др.]. На особую актуальность подобных исследований указывает целый ряд авторов, подчеркивая существующие потребности в надежных молекулярных маркерах рака простаты [Stamey Т.А. et al. 2004; Lim L.S. et al. 2008; Allioli N. et al. 2011 и

др!

Цель и задачи исследования.

Основной целью данной диссертационной работы стало сравнительное протеомное изучение белков человека, учас твующих в обеспечении двигательных функций, создание предпосылок для формирования отечественной базы данных об этих белках и поиск потенциальных биомаркеров

В соответствии с целью исследования в работе решались следующие задачи: 1. Провести протеомное изучение мажорных белков в образцах скелетной мышцы человека и использовать полученные результаты для создания соответствующего биоинформа-

ционного ресурса, оформленного как отдельный модуль для отечественной базы данных «Протеомика мышечных белков человека».

2. Провести сравнительное изучение отдельных групп белков в различных биоматериалах (биоптатах и аутоптатах некоторых мышечных тканей и органов, а также в культивируемых клетках) и оценить проявления полиморфизма этих белков.

3. Изучить средне- и низкокопийные ядерные белки в культивируемых нормальных мышечных клетках человека с использованием предварительного выделения ядер и с применением протеомных методов.

4. Построить 3D-модели протеомного распределения гистонов и провести сравнительных анализ их микрогетерогенности в культивируемых клетках, включая клетки злокачественных и доброкачественных опухолей простаты.

5. Провести с помощью протеомных методов поиск потенциальных белковых биомаркеров рака простаты в культивируемых клетках человека.

Научная новизна работы.

Сформирован новый биоинформационный модуль в отечественную базу данных «Протеомика мышечных белков человека» на основе протеомного изучения 89 «мажорных» белков из биоптатов и аутоптатов т. vastus lateralis человека.

Установлено, что в культивируемых скелетномышечных миобластах человека присутствует новый белковый продукт гена кальдесмона (CALD1), который по результатам протеомного анализа обладает меньшей молекулярной массой по сравнению с известными изоформами кальдесмона человека.

При сравнительном протеомном анализе трех препаратов ядерных белков (суммарные ядерные белки, гистоны, постгистоновые ядерные белки) полученных из культивируемых мышечных клеток человека, а также из некоторых опухолевых клеток, удалось выявить ряд средне- и низкокопийных белков. Построены новые ЗО-модели протеомного распределения гистонов, которые свидетельствуют о микрогетерогенности этих белков, вероятно, связанной с изменениями пролиферативного потенциала изученных клеток.

Научно-практическая значимость работы.

Созданная двумерная карта белков скелетной мышцы человека стала основой для формирования биоинформационного модуля «Белки скелетных мышц». Подготовлены методические рекомендации по применению компьютерных программ из пакета ImageMaster 2D Platinum, версий 6 и 7 («GE Healthcare») для решения задач, связанных с анализом распределения белковых фракций на двумерных электрофореграммах.

Показано, что серпин HI (белковый продукт гена SERPINH1) можно рассматривать как потенциальный биомаркер опухолей эпителиального генеза по результатам сравнительного протеомного анализа белков клеточных линий, моделирующих рак и гиперплазию простаты.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту.

1. На основе протеомного изучения «мажорных» белков из биоптатов и аутоптатов т. vastus lateralis человека сформирован специальный модуль в отечественную базу данных «Протеомика мышечных белков человека», который включает результаты идентификации 89 белковых фракций, являющихся продуктами экспрессии 55 генов. Среди идентифицированных белков выявлены;

а) изоформы миозинов, актинов и других саркомерных белков, обеспечивающих двигательную функцию (26), ряд цитоплазматических ферментов и других цитоплазматических белков (26), а также некоторые митохондриальные белки (17) и белки с другой внутриклеточной локализацией;

б) изоформы тропонинов, Н- и L- р-енолазы и ряд других белков, специфичных для поперечнополосатых мышц, которые могут служить биомаркерами дифференцировки по мышечному типу (19);

в) несколько необычных для 20Е-аиализа белковых фракций, в частности, белки, содержащие PDZ и LIM-домены (pi > 8,70), а также «фрагменты» известных белков и стабильный комплекс ферритиновых цепей.

2. По результатам протеомного анализа культивируемых скелетномышечных миобластов человека установлено, что в этих клетках присутствует новый белковый продукт гена кальдесмона (CALD1).

3. При протеомном анализе белковых препаратов (суммарные ядерные белки, гистоны, постгистоновые белки), полученных из культивируемых мышечных клеток человека выявлен ряд средне- и низкокопийных белков, а также обнаружена микрогетерогенность гистоновых белков, вероятно связанная с изменениями пролиферативного потенциала изученных клеток.

4. Сравнительный протеомный анализ серпина HI в линиях клеток рабдомиосаркомы RD и А-204, а также ряда эпителиоподобных клеточных линий человека простаты (ВРН-1 -доброкачественная гиперплазия, LNCaP, РСЗ и DU145 - рак) показал, что в клетках обеих линий рабдомиосаркомы этот белок присутствовал в количествах, сопоставимых с его содержанием в немалигнизированных клетках простаты, а в раковых клетках содержание серпина HI было резко сниженным.

Апробация работы.

Материалы данной работы докладывались на международных и российских конференциях, в том числе: Конференции молодых ученых с международным участием «Актуальные вопросы лучевой диагностики и онкологии» (Москва, 2008), IV Российском симпозиуме «Белки и пептиды» (Казань, 2009), I международной научно практической конференции «Постгеномные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине» (Москва, 2010), V Российского симпозиума «Белки и пептиды». (Петрозаводск, 2011) и др.

Публикации по материалам работы.

По теме диссертации опубликовано 15 научных работ, включая 5 статей в профильных рецензируемых российских и международных журналах (из них 1 в зарубежной печати), 2 статьи в сборниках, 1 информационно-методическое письмо и 7 тезисов докладов.

Структура и объем диссертации.

Диссертация изложена на 129 страницах, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследов�