Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Протеомный анализ околоплодных вод при физиологической и осложненной беременности

ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Протеомный анализ околоплодных вод при физиологической и осложненной беременности"

На правах рукописи

005043744

Гунько Виктория Олеговна

ПРОТЕОМНЫЙ АНАЛИЗ ОКОЛОПЛОДНЫХ ВОД ПРИ ФИЗИОЛОГИЧЕСКОЙ И ОСЛОЖНЕННОЙ БЕРЕМЕННОСТИ

03.01.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 7 идя 2012

Ростов-на-Дону 2012

005043744

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Ростовский научно-исследовательский институт акушерства и педиатрии» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации (г. Ростов-на-Дону)

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

Погорелова Татьяна Николаевна

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Менджерицкий Александр Маркович (г. Ростов-на-Дону)

доктор медицинских наук Шестопалов Александр Вячеславович

(г. Ростов-на-Дону)

Ведущая организация: Государственное образовательное учреждение

высшего профессионального образования «Кубанский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации (г. Краснодар)

Защита диссертации состоится «28» мая 2012 г. в «15ш» часов на заседании диссертационного совета Д 212.208.07 по биологическим наукам в ФГАОУ ВПО «Южный федеральный университет» (г. Ростов-на-Дону, пр. Стачки 194/1, акт. зал).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Южного федерального университета (г. Ростов-на-Дону, ул. Пушкинская, 148).

Автореферат разослан » 2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук, с.н.с. Цки.^ Е.В. Асланян

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования.

В настоящее время не вызывает сомнения, что для наиболее успешного решения биомедицинских проблем необходимо привлечение современных методических подходов молекулярной биологии, в частности постгеномных технологий. К их числу относятся протеомные исследования, представляющие собой качественно новый этап в развитии системного анализа белковых молекул. Эти исследования дают представление о совокупности белков, экспрессируемых геномом - протеоме исследуемого объекта (Арчаков А.И., 2004; Говорун В.М. и др., 2002; Шишкин С.С., 2002; Kalia A. et al., 2005).

Применение протеомных технологий является весьма перспективным для выяснения ранее неизвестных механизмов нарушения молекулярных процессов на протяжении внутриутробного развития организма, во многом определяющего последующие этапы постнатального онтогенеза. Нормальное течение внутриутробного периода зависит от сбалансированного функционирования системы мать-плацента-плод, важную роль в которой играют околоплодные воды. Способность околоплодных вод быстро реагировать модификацией своего состава на все изменения, возникающие в указанной системе, позволяет использовать изучение протеомного спектра этой биологической жидкости для получения объективной информации о характере течения гестации и состоянии плода.

Белки, реализуя информационную программу клеток, играют ключевую роль в многочисленных процессах, происходящих на молекулярном уровне в фетоплацентарной системе. Физиологическое развитие беременности характеризуется определенной динамикой белкового состава, необходимой для поддержания нормального обеспечения функций всех звеньев данной системы. При срыве гомеостатических механизмов и развитии осложненной беременности наступают вначале обратимые, а затем и необратимые нарушения, которые во многих случаях проявляются в изменении спектра и структурно-функционального состояния белков. Эти отклонения могут выражаться в появлении или исчезновении отдельных белковых фракций (белков отличия), что обусловлено модификацией их продукции в организмах матери и плода, а также в плаценте.

На протяжении последних десятилетий среди осложнений гестации, приводящих к перинатальной заболеваемости и смертности, важное место занимают задержка роста плода (ЗРП) и гестоз (Сидорова И.С., 2003; Макаров О.В. 2006). Однако, несмотря на большое число проведенных исследований, в настоящее время отсутствуют достаточные знания о биохимических и, особенно, молекулярных механизмах их развития, что ограничивает возможности проведения научно-

обоснованных терапевтических мероприятий и реальную профилактику данных заболеваний. В этой связи чрезвычайно актуальным остается выявление объективных маркеров для своевременной диагностики и мониторинга ЗРП и гестоза.

Цель исследования. Установление взаимосвязи между особенностями динамики протеомного спектра околоплодных вод и характером течения гестации.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

1. Провести протеомный анализ околоплодных вод в разные сроки физиологической гестации.

2. Охарактеризовать динамику протеомного профиля околоплодных вод при гестации, осложненной ЗРП на фоне плацентарной недостаточности, выявить и идентифицировать белки отличия, появляющиеся или отсутствующие при данной патологии.

3. Изучить протеомный профиль околоплодных вод при гестозе и провести идентификацию белков отличия.

4. Сопоставить результаты протеомного анализа околоплодных вод при ЗРП и гестозе, выявить специфические белки отличия между их протеомными спектрами.

5. Провести количественную оценку информативных белков-маркеров в околоплодных водах методом иммуноферментного анализа при различных вариантах течения гестации.

Научная новизна работы. С помощью протеомного анализа получены новые данные об особенностях белкового состава околоплодных вод в разные сроки (23-24 и 39-40 недель) физиологической и осложненной (ЗРП и гестоз) беременности. Впервые выявлены и проанализированы в сравнительном аспекте общие закономерности и специфические изменения протеомного спектра околоплодных вод при различных вариантах течения гестации. Методом времяпролетной масс-спектрометрии идентифицированы обнаруженные белки отличия. Впервые в качестве информативных маркеров ЗРП и гестоза предложены, соответственно, цинк-а-2-гликопротеин и супрессор метастазирования рака молочной железы 1.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Динамика протеомного профиля околоплодных вод при физиологическом течении беременности характеризуется появлением в III триместре белков, функционально связанных с регуляцией родовой деятельности и процессами адаптации плода к внеутробному существованию.

2. В протеомном спектре околоплодных вод при ЗРП и гестозе имеют место значительные изменения, характеризующиеся как отсутствием ряда белков, так и появлением дополнительных белков по сравнению с физиологической беременностью. Белки отличия, характерные для ЗРП, участвуют в регуляции процессов трофики, роста и развития плода, про- и антиоксидантных процессах,

транспортных механизмах. Основные функции белков отличия при гестозе связаны с регуляцией процессов апоптоза, ангиогенеза, функционированием эндотелия сосудов, защитой от окислительного и карбонильного стрессов.

3. Отклонения в протеомных профилях околоплодных вод при ЗРП и гестозе имеют как неспецифический, так и специфический характер, проявляющийся особенностями динамики спектра белков отличия.

4. Модификация протеомного спектра при изученных осложнениях беременности, наряду с негативными последствиями, в ряде случаев может носить компенсаторный характер, направленный на пролонгирование гестации.

Теоретическое и практическое значение работы. Результаты работы имеют большое значение для понимания молекулярных механизмов развития осложненной гестации. Проведенные исследования свидетельствуют о том, что модификация продукции белков может служить одним из инициирующих факторов в сложной цепи специфических нарушений, приводящих к формированию ЗРП и гестоза

Полученные результаты создают предпосылки для использования в практическом здравоохранении белков отличия в качестве специфических маркеров осложненной беременности с целью ее диагностики, что позволит оптимизировать комплекс терапевтических мероприятий, направленных на улучшение перинатальных исходов.

По результатам исследования разработан информативный способ диагностики плацентарной недостаточности (заявка на изобретение № 2011133109 от 05.08.2011 г.), а также найдены протеомные маркеры прогнозирования церебральных поражений у новорожденных (патент № 2414715 от 11.11.2009 г.). Разработанные способы внедрены в работу отделения патологии беременности и родильного отделения ФГБУ «РНИИАП» Минздравсоцразвития России.

Материалы диссертации используются в лекциях и семинарах по повышению квалификации врачей ЮФО и СКФО, а также при проведении занятий с клиническими ординаторами и аспирантами ФГБУ «РНИИАП» Минздравсоцразвития России.

Апробация работы. Основные положения работы доложены и обсуждены на следующих научных форумах: III и IV международных научно-практических конференциях «Актуальные проблемы биологии, нанотехнологии и медицины» (г. Ростов-на-Дону, 2009, 2011), Всероссийском конгрессе «Современные технологии в эндокринологии» (г. Москва, 2009), X и XI Всероссийских научных форумах «Мать и дитя» (г. Москва, 2009, 2010), IV Международной конференции по акушерству, перинатологии и неонатологии «Здоровая женщина - здоровый новорожденный» (г. Санкт-Петербург, 2009), IX межвузовской конференции с международным участием «Обмен веществ при адаптации и повреждении» (г. Ростов-на-Дону, 2010),

Российском конгрессе с международным участием «Молекулярные основы клинической медицины - возможное и реальное» (г. Санкт-Петербург, 2010), Региональном научном форуме «Мать и дитя» (г. Екатеринбург, 2010), Международном конгрессе по репродуктивной медицине (г. Москва, 2010).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 15 научных работ, в том числе 5 статей в изданиях, рекомендованных ВАК. Общий объем публикаций составляет 1,8 п.л., личный вклад - 82,6%.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 157 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов исследования и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы, включающего 72 отечественных и 370 зарубежных источников. Работа иллюстрирована 3 таблицами и 11 рисунками.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследования проведены на базе клинических и научных подразделений РНИИАП, а также на базе отдела молекулярной биологии ЮНЦ РАН.

В проспективное исследование были включены 88 беременных в возрасте 23-33 лет (средний возраст 25,7+0,4 года), давших информированное согласие на расширенный алгоритм обследования. Контрольную группу составили 40 практически здоровых женщин с неосложненным течением беременности, закончившейся своевременными родами. Основные группы составили 48 женщин с осложненной беременностью. У 24 из этого числа пациенток беременность осложнилась ассиметричной формой ЗРП на фоне субкомпенсированной плацентарной недостаточности (1-я группа). У 24 беременных имел место поздний гестоз легкой и средней степени тяжести (2-я группа). Тяжесть гестоза оценивалась по шкале Goeke в модификации Г.М. Савельевой (1998).

Материалом для исследования служили околоплодные воды, полученные акушерами-гинекологами во П триместре (23-24 недели) путем трансабдоминального амниоцентеза по медицинским показаниям и при вскрытии плодного пузыря в I периоде родов (39-40 недель).

Фракционирование белков проводили методом двумерного электрофореза (2Д-ЭФ) в полиакриламидном геле (Gorg А., 1995). Для получения аналитических гелей использовали загрузку белка - 200 мкг/гель. Первое направление 2Д-ЭФ — изоэлектрофокусирование осуществляли с использованием иммобилиновых стрипов с градиентом рН=3-10 (Ready Strip IPG Strips, «Bio-Rad», США) на приборе Protein IEF Cell («Bio-Rad», США). Второе направление 2Д-ЭФ - вертикальный электрофорез в градиенте полиакриламидного геля 8-16% в присутствии

додецилсульфата натрия проводили в камере Protean II xi Multi-Cell («Bio-Rad», США) при силе тока 10 тА на гель в течение 18 часов.

Для визуализации белковых пятен в гелях электрофореграммы окрашивали азотнокислым серебром с предварительной обработкой тиосульфатом, сканировали и сохраняли как графический файл в формате JPG. Полученные материалы анализировали с использованием пакета программ PDQuest («Bio-Rad», США). После вырезания белкового пятна из геля и процедуры трипсинолиза идентификацию белков проводили методом MALDI-TOF-масс-спектрометрии (Shevchenko А., 1996). Масс-спектры триптических пептидов получали на масс-спектрометре Autoflex II («Bruker Daltonics», Германия) и анализировали с использованием опции Peptide Fingerprint программы Mascot MS Search (Matrix Science, США) и баз данных Swiss-Prot и Национального центра биотехнологической информации США, принимая точность определения массы ионов равной 0,01 %. Результаты идентификации белков принимались как достоверные при уровне значимости не менее 95% и показателе сиквенс-покрытия не менее 60%. Сравнительный анализ протеомных карт осуществляли по виртуальным интегрированным «мастер-гелям» двумерных электрофореграмм амниотической жидкости (программа PDQuest, «Bio-Rad», США).

Содержание цинк-а-2-гликопротеина и супрессора метастазирования рака молочной железы 1 в околоплодных водах определяли методом иммуноферментного анализа, соответственно используя наборы фирм «BioVendor» (Чехия) и «Uscn, Life Diagnostics Inc.» (США) на микропланшетном фотометре Sunrise («Тесап», Швейцария). ДНК-связывающую активность субъединицы р65 транскрипционного фактора NF-kB в околоплодных водах оценивали с помощью иммуноферментного набора фирмы «Cayman Chemical» (США). Определение содержания цинка и меди в околоплодных водах проводили, используя наборы реагентов «Цинк-Витал» и «Медь-Витал» фирмы «Витал Девелопмент Корпорэйшн» (Россия), на спектрофотометре UV-Visible Spectrophotometer Evolution 300 (США).

Статистическую обработку данных осуществляли с помощью лицензионного пакета программ Statistica (фирмы StatSoft. Inc., версия 5.1.). Для оценки статистической значимости различий между сравниваемыми группами использовали критерий Стьюдента (t-критерий). Отклонения между рядами считали достоверными при вероятности различий, превышающих 95% (р<0,05).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

На типичных двумерных электрофореграммах белков околоплодных вод при окраске азотнокислым серебром регистрируется от 96 до 103 белковых фракций с

диапазоном молекулярных масс (Mm) от 12 до 80 кДа и изоэлектрических точек (pi) от 3,0 до 10,0, что свидетельствует о значительной гетерогенности протеомного профиля этой биологической жидкости.

Сопоставление обзорных двумерных протеомных карт околоплодных вод беременных всех групп показало отсутствие белков отличия в области Мш=40-80 кДа, причиной которого могло явиться избыточное количество идентифицированных мажорных белков (серотрансферрина, сывороточного альбумина, альфа-1-антитрипсина) на электрофореграммах, что затрудняло анализ в данном диапазоне молекулярных масс. Дальнейшее сравнение двумерных белковых профилей околоплодных вод проводили в области Мт=12-40 кДа и диапазоне pl=5,0-8,0. Известно, что соотношение именно минорных компонентов представляет наибольший интерес для протеомных исследований, поскольку низкомолекулярная часть протеомного профиля наиболее подвержена модификациям в ответ на изменения физиологического состояния организма.

Большинство белков обнаруживается во всех образцах околоплодных вод, взятых в разные сроки физиологической и осложненной гестации, некоторые из этих «постоянных» белков идентифицированы (у-цепь антигена II гистосовместимости, фрагмент а-1(П)-цепи коллагена, изоформы аполипопротеина A-I, р-субъединица гемоглобина). Однако ряд белков (белки отличия) выявляются лишь в определенный период беременности, их присутствие или отсутствие зависит от характера ее течения.

Содержание не идентифицированных белков было ниже порога чувствительности MALDI-TOF-масс-спектрометра, в связи с чем их Mm и pi вычислялись расчетным путем с помощью программы PDQuest («Bio-Rad», США).

Анализ протеомного спектра околоплодных вод в разные периоды физиологически протекающей беременности.

Сопоставление белкового состава околоплодных вод в разные периоды физиологической беременности показало, что представленность некоторых белковых фракций зависит от срока гестации. Так, к ее концу появляются три белка отличия, не обнаруженные во II триместре (Рис.1 А, 2 А, Табл.): транстиретин, кальгранулин А (белок S100-A8) и кальгранулин В (белок S100-A9).

Учитывая роль транстиретина (transthyretin) в транспорте тироксина от матери к плоду, можно полагать, что его появление в конце физиологической беременности связано с необходимостью обеспечения организма плода тиреоидными гормонами для его адаптации к внеутробному существованию.

Секреция в амниотическую жидкость в конце физиологической беременности кальгранулинов (calgranulins) А и В, регулирующих каскад арахидоновой кислоты, и,

следовательно, синтез простагландинов, очевидно, объясняется их участием в процессах инициации и развития родовой деятельности (КегкЫ^ С. е1 а1., 1999).

Сравнительный анализ протеомного спектра околоплодных вод при физиологической беременности и ЗРП.

При сравнительном анализе протеомного профиля околоплодных вод при физиологической беременности и ЗРП выявлено отсутствие 6 белков при данной акушерской патологии независимо от срока гестации относительно нормального спектра: эпидермального белка, связывающего жирные кислоты, ретинол-связывающего белка 4, плацентарного лактогена, белка-1, связывающего инсулиноподобные факторы роста (ИПФР), гаптоглобина и пероксиредоксина-2 (Рис. 1, Табл.). _

Л Б

Рис.1. Протеомные карты («мастер-гели») околоплодных вод, взятых во II триместре при физиологической беременности (А) и ЗРП (Б). Нумерация белков соответствует таковой в Таблице.

Отсутствие в околоплодных водах эпидермального белка, связывающего жирные кислоты (fatty acid-binding protein, epidermal), участвующего в депонировании и освобождении жирных кислот, может способствовать нарушению трофики плода, что служит основным патогенетическим звеном в развитии ЗРП (Masouye I. et al., 1997). Отсутствие белка-1, связывающего ИПФР (ИПФРСБ-1, insulin-like growth factor-binding protein-1), модулирующего биологическую активность ИПФР и являющегося одним из ключевых регуляторов роста и развития плода (Dolcini L. et al., 2009), очевидно, объясняется усилением его протеолиза, о чем

Таблица

Белки околоплодных вод, идентифицированные при физиологической и осложненной беременности

№ Название белка Mm, кДа Pi Физ. берем. ЗРП Гес-тоз

триместр

II Ill II III III

1 Serotransferrin 77,0 6,24 + + + + +

2 Serum albumin 69,3 5,90 + + + + +

3 Alpha-1 -antitrypsin 46,7 5,30 + + + + +

4 HLA class II histocompatibility antigen gamma chain 32,3 6,83 + + + + +

5 Carbonyl reductase [NADPH] 3 32,3 5,57 + + + + -

б Collagen alpha-1 (II) chain fragment 31,7 6,40 + + + + +

7 Apolipoprotein A-I 30,8 5,50 + + + + +

8 Hemoglobin subunit beta 15,9 6,90 + + + + +

9 Zinc-a-2-glycoprotein 33,3 6,02 - - + + -

10 NKG2D ligand 2 31,9 6,03 - - + + -

11 Alpha-1 -microglobulin/bikunin precursor 31,9 5,93 - - + - -

12 Fibrinogen beta chain 31,8 7,60 - - + + -

13 Insulin-like growth factor-binding protein-l(IGFBP-l) 29,7 5,75 + + - - -

14 Peroxiredoxin-2 28,9 5,30 + + - - +

15 Chorionic somatomammotropin hormone 28,0 5,74 + + - - -

16 Plasma retinol-binding protein 4 25,8 6,50 + + - - -

17 Putative CDC37-like protein LOC390688 21,9 5,93 - - + + -

18 Hippocalcin-like protein 1 21,5 6,15 - - + - -

19 Haptoglobin alpha chain 18,6 5,84 + + - - -

20 Transthyretin 17,0 5,38 - + - - +

21 Fatty acid-binding protein epidermal 14,7 6,18 + + - - -

22 Calgranulin В (protein S100-A9) 13,2 5,20 - + - - -

23 Calgranulin A (protein SI00-A8) 12,9 6,61 - + - - -

24 Breast cancer metastasis-suppressor 1 31,8 6,13 - - - - +

25 y-glutamylaminecyclotransferase 16,1 5,83 - - - - +

26 Ig kappa chain С region 14,0 6,62 - - - - +

27 IGFBP-1 fragments 16,0 5,93 - - + + -

Обозначения: «+» - присутствие белка, «-» - отсутствие белка.

свидетельствует появление в этой биологической жидкости фрагментов ИПФРСБ-1 с молекулярной массой 16 кДа. Протеолиз ИПФРСБ-1, по-видимому, представляет собой компенсаторный механизм, направленный на увеличение биодоступности ИПФР, в условиях развития данной патологии (Tisi D.K. et al., 2004). Нарушение секреции плацентарного лактогена (chorionic somatomammotropin hormone) гестационными тканями в амниотическую жидкость, может расцениваться как показатель неблагополучия плода (Kishi К. et al., 1991).

Антиоксидантные функции пероксиредоксина-2 (peroxiredoxin-2) и гаптоглобина (haptoglobin alpha chain), позволяют полагать, что их отсутствие в околоплодных водах при ЗРП, вносит определенный вклад в развитие окислительного стресса, имеющего место при ЗРП (Biri A. et al., 2007; Ни R. et al., 2007). Жизнедеятельность плода зависит от доставки материнского ретинола ретинол-связывающим белком 4 (plasma retinol-binding protein 4), поэтому отсутствие этого белка при ЗРП, сопровождающееся ухудшением снабжения плода витамином А, приводит к нарушению его нормального развития (Sapin V. et al., 2000; Marceau G. et al., 2007).

По мере течения беременности изменения в протеомном спектре околоплодных вод в целом сохраняются, хотя к моменту родов появляются определенные отличия (Рис.2, Табл.). В амниотической жидкости в III триместре беременности при ЗРП, количество не обнаруженных белков относительно нормального спектра превышает таковое во II триместре, кроме ранее указанных белков отличия, к их числу относятся: транстиретин, кальгранулины А и В. Описанные ранее регуляторные функции этих белков позволяют оценить негативные последствия их отсутствия.

Не менее значимую роль играет и появление в околоплодных водах при ЗРП белков, которые отсутствуют при нормальной беременности: р-цепи фибриногена, цинк-а-2-гликопротеина, фрагмента ИПФРСБ-1, СБС37-подобного белка и NKG2D лиганда 2.

Появление в околоплодных водах при ЗРП CDC37-подобного белка (CDC37-like protein LOC390688), являющегося молекулярным ко-шапероном для белка теплового шока 90, по-видимому, можно рассматривать как компенсаторный процесс, направленный на поддержание стабильности, корректного фолдинга и сигнальных функций различных протеинкиназ в условиях окислительного стресса, развивающегося при ЗРП (Terasawa К. et al., 2005; Mandal А.К. et al., 2007). Появление в этих условиях стресс-индуцируемого NKG2D лиганда 2 (NKG2D ligand 2), активирующего NKG2 D-рецепторы на натуральных киллерах, очевидно, в результате экзосомной секреции плацентой (Apps R. et al., 2008; Hedlund M. et al., 2009), является иммуносупрессивным механизмом, обеспечивающим выживание плода в неблагоприятных условиях. Усиление продукции и, как следствие, секреции в

околоплодные воды при ЗРП цинк-а-2-гликопротеина (zinc-a-2-glycoprotein), в значительной степени ответственного за регуляцию массы тела (Bing С. et al., 2010), имеет большое значение в механизмах развития данной патологии.

А Б

Рис. 2. Протеомные карты («мастер-гели») околоплодных вод, взятых в III триместре при физиологической беременности (А) и ЗРП (Б). Нумерация белков соответствует таковой в Таблице.

Помимо вышеуказанных дополнительных (т.е. не обнаруженных или отсутствующих при физиологической беременности) белков, выявлены и идентифицированы еще два белка, появляющиеся в околоплодных водах в 23-24 недели беременности, осложненной ЗРП, которые отсутствуют в 39-40 недель при этой акушерской патологии: гипокальцин-подобный белок 1 и белок-предшественник альфа-1 -микроглобулина/бикунина.

Усиление продукции гипокалъцин-подобного белка 1 (hippocalcin-like protein 1) при ЗРП (в условиях внутриутробной гипоксии) защищает нейроны от кальций-индуцированого апоптоза, что особенно необходимо во II триместре гестации, в течение которого продолжается интенсивное развитие головного мозга плода. Причины появления предшественника ши^фа-J-микроглобулина/бикунина (alpha-1-microglobulin/bikunin precursor) в околоплодных водах при ЗРП без предварительного расщепления недостаточно понятны и их выяснение требует дополнительных исследований.

Сравнительный анализ протеомного спектра околоплодных вод при физиологической беременности и гестозе.

Протеомный анализ околоплодных вод женщин при беременности, осложнившейся гестозом, выявил отсутствие десяти белков, из которых идентифицировано восемь: НАДФН-зависимая карбонилредуктаза 3, белок-1, связывающий ИПФР, эпидермальный белок, связывающий жирные кислоты, гаптоглобин, плацентарный лактоген, ретинол-связывающий белок 4, кальгранулины А и В (Рис. 3, Табл.).

Г*

Ч 2

1 ■ ¡4» *

/

ЪяЩв,

»4-

I It...

2 Г 20-

25 —

S 26

А Б

Рис. 3. Протеомные карты («мастер-гели») околоплодных вод, взятых в III триместре при физиологической беременности (А) и гестозе (Б). Нумерация белков соответствует таковой в Таблице.

Наряду с наблюдаемыми при ЗРП и описанными выше изменениями в спектре белков при гестозе также наблюдалось отсутствие в околоплодных водах НАДФН-зависимой карбонилредуктазы 3 (NADPH-carbonyl reductase 3) - фермента катаболизма карбонильных продуктов свободнорадикального окисления, который играет важную роль в защите от окислительного и карбонильного стрессов, являющихся неизменными спутниками развития гестоза (Сидорова И.С. и др., 2007; Ванько JI.B. и др., 2010). В этой связи, его отсутствие в околоплодных водах, отражающее нарушение продукции данного фермента в плаценте и тканях плода, ведет к накоплению цитотоксических карбонильных продуктов, что может иметь большое значение в развитии ряда функциональных проявлений данного осложнения беременности.

Помимо отсутствия в околоплодных водах в III триместре при гестозе вышеуказанных белков, было выявлено появление 7 дополнительных белков, не обнаруженных при физиологической беременности, из которых идентифицированы три: С-участок каппа цепи иммуноглобулина, супрессор метастазирования рака молочной железы 1 и у-глутамилциклотрансфераза.

Появление в околоплодных водах при гестозе у-глутамилциклотрансферазы (y-glutamylaminecyclotransferase), по-видимому, отражающее увеличение содержания этого белка в гестационных тканях, продуцирующих его, может приводить к повышению количества глутатиона, оптимальные концентрации которого в значительной степени необходимы для нормального развития плода (Кулинский В.И., 2010). Очевидно, это является компенсаторным механизмом в условиях патологической беременности, поскольку глутатион принимает участие в детоксикации ксенобиотиков и антиоксидантной защите (Pompella A. et al., 2003).

Регуляторные возможности появляющегося в околоплодных водах при гестозе супрессора метастазирования рака молочной железы 1 (breast cancer metastasis-suppressor 1) определяются, прежде всего, его способностью подавлять активность субъединицы р65 транскрипционного фактора NF-kB за счет ее деацетилирования (Liu Y. et al., 2006). Супрессия NF-kB, ответственного за экспрессию антиапоптозных факторов, цитокинов, их рецепторов, ангиогенных факторов роста, сопровождается существенным изменением метаболических процессов в системе мать-плацента-плод, что играет важную роль в механизмах развития гестоза.

Сравнительный анализ протеомного профиля околоплодных вод при ЗРП и гестозе.

При сравнении результатов исследования протеомного спектра околоплодных вод при ЗРП и гестозе в конце 1П триместра была обнаружена сходная динамика протеомного спектра при обеих акушерских патологиях (относительно таковой при физиологической беременности), заключающаяся в отсутствии следующих белков: эпидермального белка, связывающего жирные кислоты, гаптоглобнна, плацентарного лактогена, белка 1, связывающего ИПФР, ретинол-связывающего белка 4, кальгранулинов А и В.

Неспецифический характер этих изменений может отражать ряд общих нарушений в работе системы мать-плацента-плод в неблагоприятных условиях, а именно, снижение фетоплацентарной гемоциркуляции, избыточная продукция свободных радикалов, развитие окислительного стресса (Kaufmann P. et al., 2003; Ness R.B. et al., 2006). Однако, реализация данных эффектов, очевидно, оказывает свое первоочередное влияние на разные компоненты этой системы: при гестозе - на плаценту, а при ЗРП — на организм плода.

Несмотря на некоторую общность механизмов, лежащих в основе развития данных осложнений, их клиническая манифестация характеризуется значительными различиями. Гестоз - симптомокомплекс, ведущий к развитию преимущественно «материнского синдрома» (Sibai В. et al., 2005). ЗРП проявляется в основном отклонениями в росте плода без видимого участия организма матери (Bashat A.A., 2004, Vaisbuch Е. et al., 2010). Если в первом случае реальная опасность для жизни и здоровья, представленная полиорганной недостаточностью, касается организма женщины, то во втором - она грозит здоровью и жизни плода и также представлена полиорганной недостаточностью, но уже со стороны последнего.

Эти особенности развития конкретной акушерской патологии находят свое отражение и на молекулярном уровне, в частности проявляясь специфичным изменением протеомного профиля околоплодных вод. Так, при ЗРП в околоплодных водах не обнаруживаются пероксиредоксин 2 и транстиретин, которые выявляются при гестозе, и присутствуют цинк-а-2-гликопротеин, NKG2D лиганд 2, CDC37-подобный белок, не выявленные при гестозе.

Отрицательные последствия отсутствия пероксиредоксина-2 можно оценить исходя из важной функции этого белка в поддержании физиологического баланса про- и антиоксидантов в фетоплацентарной системе, в связи с чем его отсутствие может усиливать уже имеющую место при ЗРП гипоксию. Нарушению развития плода способствует и отсутствие при данной патологии белка транстиретина, обеспечивающего транспорт не только ретинола, но и тироксина. Появление в околоплодных водах при ЗРП цинк-а-2-гликопротеина может отрицательно сказываться на динамике роста плода, в связи с его негативным влиянием на энергообеспечение плода и процессы пролиферации (Hassan M.I. et al., 2008).

В то же время появление в околоплодных водах NKG2D лиганда 2, который экспрессируется плацентой в ответ на различные стрессовые сигналы, в том числе, и внутриутробную гипоксию, по-видимому, является компенсаторным процессом, благодаря которому происходит «предохранение» плода от иммунологической атаки матери. Аналогичную роль может играть появление при ЗРП гипокальцин-подобного белка 1, подавляющего кальций-зависимый апоптоз нейронов, что, очевидно, является таким же компенсаторным механизмом защиты, как и централизация кровообращения плода при указанной акушерской патологии (Орлов В.И., 2007).

В околоплодных водах при гестозе присутствуют белки, не выявленные при ЗРП: супрессор метастазирования рака молочной железы 1 и у-глутамилциклотрансфераза и, в отличие от ЗРП, не обнаруживается НАДФН-зависимая карбонилредукггаза 3.

Особое значение при гестозе имеет появление в околоплодных водах супрессора метастазирования рака молочной железы 1, который, подавляя активность транскрипционного фактора NF-kB, приводит к угнетению синтеза антиапоптозных факторов, молекул адгезии, индуцибельной нитрооксидсинтазы, и, как следствие, к уменьшению продукции оксида азота (Cicek М. et al., 2005). Одним из последствий повышения экспрессии супрессора метастазирования рака молочной железы 1 является снижение при гестозе регуляторных функций плацентарных макрофагов, в том числе их ангиогенной, иммуномодулирующей, антиапоптозной активности (Шестопалов A.B., 2007). Сочетанное действие последствий апоптоза, дисбаланса про- и антиоксидантных процессов, нарушения ангиогенеза, по-видимому, способствует развитию эндотелиальной дисфункции, характерной для гестоза.

Количественная оценка белков-маркеров осложненной беременности методом иммуноферментного анализа.

Целью данного раздела работы являлось изучение с помощью иммуноферментного анализа содержания некоторых белков отличия в околоплодных водах, наиболее перспективных для использования их в качестве маркеров: для ЗРП -цинк-а-2-гликопротеина и для гестоза - супрессора метастазирования рака молочной железы 1.

По полученным данным (Рис. 4), содержание цинк-а-2-гликопротеина, равное во II триместре физиологической беременности 25,05±1,20 мкг/мл, уменьшалось к ее концу на 15% и составляло 21,35± 1,01 мкг/мл. Подобная динамика характерна для этого белка и при беременности, осложненной ЗРП: его уровень, составлявший в 2324 недели 60,38±3,11 мкг/мл, в 39-40 недель снижался на 15% до 51,25±2,21 мкг/мл. В

'i'I i i f и.."1 ■>! II' ИЧ ЭЯД^ржКЯрОСП! 1 Vi '11.1

SfptftlfHHOOb плодп

Рис. 4. Содержание цинк-а-2-гликопротеина в околоплодных водах при физиологической и осложненной беременности.

Обозначения. Достоверные отличия между: » - II и III триместрами физиологической беременности, ♦ - II и III триместрами осложненной беременности, * - физиологической и осложненной беременностью.

амниотической жидкости при ЗРП содержание цинк-а-2-гликопротеина было повышено во П и III триместрах в среднем в 2,4 раза, по сравнению с аналогичными величинами при нормальной гестации. При сопоставлении уровня данного белка при физиологической беременности и гестозе достоверных отличий не обнаружено (21,35±1,01 мкг/мл и 20,30±0,91 мкг/мл соответственно).

Поскольку цинк-а-2-гликопротеин связывает цинк, имеющий большое значение для развития плода, было изучено содержание этого микроэлемента в амниотической жидкости при физиологической беременности и ЗРП.

Результаты исследований показали, что содержание цинка в околоплодных водах возрастало по мере развития физиологической беременности (Рис. 5). Если в 23-24 недели гестации уровень Zn2+ составлял в среднем 8,36±0,51 мг/мл, то в 39-40 недель - 9,88±0,52 мг/мл, что на 18% превышало соответствующие показатели во II триместре. Повышение содержания этого микроэлемента в околоплодных водах по мере прогрессирования беременности, очевидно, отражает увеличивающиеся потребности в нем для обеспечения процессов роста и развития плода (Ruz М., 2006; King J.C., 2011). Уровень Zn2+ в околоплодных водах во II и III триместрах беременности, осложненной ЗРП, составлял 5,25±0,39 мг/мл и 6,16±0,42 мг/мл соответственно. Сравнение этих данных с аналогичными показателями при физиологической беременности выявило снижение содержания Zn2+ на 37% во II триместре и на 38% в III триместре.

МГ/МЛ ...................................................................^^^........................................................................................—..................................—

10 .............-.............................-..............■■ ................................-.........~gr.................................................-......................

t| " f-g

L ,„ | ЙЯ «¡1 —

1 ■1 II I

О '..........................!----------------■---------------------T----------------1

H триместр Ш триместр П триместр Ш триместр Физиологическая Задержка роста

■ Zn 2+ шС«2 +

Рис. 5. Содержание цинка и меди в околоплодных водах при физиологической и осложненной беременности. Обозначения как на Рис. 4.

В научной литературе накоплено достаточно фактов, свидетельствующих о том, что значительное увеличение количества цинка в организме может вызывать снижение содержания меди и, напротив, высокие уровни меди усиливают тератогенный эффект дефицита цинка (Reinstein N.H. et al., 1984, Fukada Т. et al.,

2011). В связи с этим, было изучено содержание Си2+ в околоплодных водах при физиологической и осложненной беременности.

В течение нормальной беременности динамика уровня Си2+ имела одинаковую направленность с динамикой 2п2+ (Рис. 5). Так, уровень Си2+ в околоплодных водах, составлявший в сроке 23-24 недели гестации 2,04±0,12 мг/мл, к моменту родоразрешения был равен 2,31±0,27 мг/мл. При беременности, осложненной ЗРП, концентрация Сб2+ в амниотической жидкости превышала аналогичные величины при физиологической беременности в 4,2 раза во II триместре и 1,9 раза - в конце III триместра и составляла 8,53±0,75 мг/мл и 4,45±0,33 мг/мл соответственно. Высокая концентрация меди вызывает снижение активности ряда ферментов, в том числе цитохромоксидазы, что, в свою очередь, ведет к энергетическому дисбалансу в фетоплацентарной системе.

Одним из важных регуляторных белков, появляющихся в амниотической жидкости при гестозе, является супрессор метастазирования рака молочной железы 1. В проведенных исследованиях было показано увеличение количества этого белка в околоплодных водах при гестозе в 6,9 раза (Рис. 6). Если при физиологической беременности данный показатель составлял 0,19±0,02 нг/мл, то при гестозе -1,31±0,08 нг/мл. В то же время, содержание супрессора метастазирования рака молочной железы 1 в амниотической жидкости при беременности, осложненной ЗРП, достоверно не отличалось от аналогичной величины при нормальной беременности (0,23±0,03 нг/мл и 0,19±0,02 нг/мл соответственно).

'I11t uiojKjи 14t-CKVi-л Гесгаз Задержка роста

беременность плода

Рис. 6. Содержание белка супрессора метастазирования рака молочной железы 1 в околоплодных водах при физиологической и осложненной беременности. Обозначения как на Рис. 4.

В связи с тем, что супрессор метастазирования рака молочной железы 1, как указывалось выше, является ко-репрессором, который непосредственно взаимодействует с субъединицей р65 транскрипционного фактора NF-kB и деацитилирует ее, уменьшая ДНК-связывающую активность (Phadke P.A. et al., 2008),

было проведено определение активности р65-субъединицы этого фактора в околоплодных водах при физиологической и осложненной гестации.

Полученные результаты показали (Рис.7), что ДНК-связывающая активность субъединицы р65 NF-kB возрастала в околоплодных водах по мере физиологического течения беременности на 29% (3,81±0,27 о.е./мг белка в 23-24 недели и 4,90±0,32 о.е./мг белка в 39-40 недель). Активность субъединицы р65 NF-kB при ЗРП во II и III триместрах была равна, соответственно, 2,01±0,42 о.е./мг и 2,28±0,29 о.е./мг. При сопоставлении этих данных с полученными при физиологической беременности выявлено уменьшение ДНК-связывающей активности субъединицы р65 NF-kB в околоплодных водах во II и III триместрах, соответственно, на 47% и 54%. Активность субъединицы р65 NF-kB в околоплодных водах при гестозе в конце III триместра по сравнению с аналогичным показателем при физиологической гестации снижалась на 37% и составляла 3,11±0,57 о.е./мг белка.

о . е мг бе

б 4,5 л 3ß 3 2.5 2 1.5 1

0.5

О

Рис. 7. Активность субъединицы р65 транскрипционного фактора ОТ-кВ в околоплодных водах при физиологической и осложненной беременности.

Обозначения как на Рис. 4.

В отличие от фактора №-кВ, изменения содержания таких белков, как цинк-а-2-гликопротеин и супрессор метастазирования рака молочной железы 1, являются специфическими для конкретного осложнения гестации, и оценка их динамики в околоплодных водах может быть использована в клинической практике для прогнозирования и диагностики ЗРП (определение содержания щшк-а-2-гликопротеина) и гестоза (определение содержания супрессора метастазирования рака молочной железы 1).

Итоги проведенных исследований околоплодных вод представлены в виде схемы возможного участия белков отличия в развитии осложнений беременности (Рис. 8).

..........

|

_Р*

I

п ш п ш ш

триместр триместр, триместр триместр триместр

Филологическая б ер еменность

Задержка роста плода

Гестоз

Снижение фетсшлацентарной гемоциркуляции

Внутриутробная гипоксия Задержка роста плода

СПРОЛПФЕРАЦгТяП-^ дпфференци- \ ровка

Сэндотелиальная\ ДИСФУНКЦИЯ ./

Рис. 8. Влияние протеомного дисбаланса в околоплодных водах на развитие метаболических и функциональных нарушений при гестозе и ЗРП.

Резюмируя полученные данные, можно заключить, что модификация продукции белков в фетоплацентарной системе, которая находит отражение в протеомном спектре околоплодных вод является одним из начальных повреждений, приводящих к дальнейшим метаболическим и функциональным нарушениям в организмах матери и плода. Изменение протеомного спектра может иметь или неспецифический характер и обнаруживаться при различных вариантах течения беременности или служить специфическим механизмом для формирования и развития определенного осложнения гестации.

Выявленные изменения в протеомном профиле околоплодных вод при осложненной беременности являются теоретическим основанием для проведения дополнительных лечебных мероприятий, направленных на нормализацию обменных процессов в фетоплацентарной системе и своевременную реабилитацию плода.

ВЫВОДЫ

1. Динамика протеомного спектра околоплодных вод при физиологической гестации характеризуется появлением в П1 триместре 3 белков, а именно, транстиретина, кальгранулинов А и В, не обнаруживаемых во П триместре.

2. Протеомный профиль околоплодных вод при ЗРП независимо от срока беременности характеризуется отсутствием б белков (эпидермального белка, связывающего жирные кислоты, белка-1, связывающего ИПФР, плацентарного лактогена, гаптоглобина, ретинол-связывающего белка 4 и пероксиредоксина-2) и появлением 5 белков отличия (р-цепи фибриногена, цинк-а-2-гликопротеина, фрагмента ИПФРСБ-1, СОС37-подобног о белка и ЫК021) лиганда 2). Во II триместре беременности, осложненной ЗРП, идентифицированы специфические для него белки отличия: гипокальцин-подобный белок 1 и белок-предшественник альфа-1-микроглобулина/бикунина.

3. Протеомный спектр околоплодных вод при беременности, осложнившейся гестозом, по сравнению с физиологической беременностью, характеризуется отсутствием 8 белков (НАДФН-зависимой карбонилредуктазы 3, белка-1, связывающего ИПФР, эпидермального белка, связывающего жирные кислоты, гаптоглобина, плацентарного лактогена, ретинол-связывающего белка 4, кальгранулинов А и В) и появлением 3 белков (С-участка каппа цепи иммуноглобулина, супрессора метастазирования рака молочной железы 1, у-глутаминциклотрансферазы).

4. Независимо от характера течения осложненной беременности (как при ЗРП, так и при гестозе) имеет место ряд аналогичных изменений в протеомном спектре

околоплодных вод: отсутствие эпидермального белка, связывающего жирные кислоты, гаптоглобина, плацентарного лактогена, белка 1, связывающего ИПФР, ретинол-связывающего белка 4, кальгранулинов А и В. В то же время, между протеомными спектрами околоплодных вод при ЗРП и гестозе наблюдаются определенные отличия: при ЗРП отсутствуют пероксиредоксин 2, транстиретин и присутствуют цинк-а-2-гликопротеин, NKG2D лиганд 2, СОС37-подобный белок. В свою очередь, при гестозе, в отличие от ЗРП, не обнаруживается НАДФН-зависимая карбонилредуктаза 3 и появляются супрессор метастазирования рака молочной железы 1 и у-глутамилциклотрансфераза.

5. Повьппение содержания супрессора метастазирования рака молочной железы 1 в околоплодных водах при беременности, осложненной гестозом, и повышение содержания цинк-а-2-гликопротеина - при ЗРП являются специфическими критериями развития этих осложнений беременности и могут быть использованы для их диагностики.

Список работ, опубликованных по теме диссертации в изданиях, рекомендованных ВАК

1. Гунько В.О. Белки-маркеры плацентарной недостаточности / Погорелова Т.Н., Гунько В.О., Друккер H.A., Линде В.А. // Биомедицинская химия. 2010. № 5. С. 616620 (0,2 пл., личн. вк. 80%).

2. Гунько В.О. Динамика протеомного профиля околоплодных вод при физиологической и осложненной беременности / Погорелова Т.Н., Гунько В.О., Друккер H.A. // Вопросы биологической, медицинской, фармацевтической химии. 2010. № 11. С. 42-47 (0,25 пл., личн. вк. 85%).

3. Гунько В.О. Поиск белков-маркеров осложненной гестации с помощью протеомных исследований околоплодных вод / Орлов В.И., Погорелова Т.Н., Гунько В.О., Друккер H.A. // Проблемы репродукции. 2010. Спецвыпуск. С. 105-106 (0,08 пл., личн. вк. 80%).

4. Гунько В.О. Протеомный спектр амниотической жидкости при физиологической и осложненной беременности / Орлов В.И., Погорелова Т.Н., Гунько В.О., Крукиер И.И. // Российский вестник акушера-гинеколога. 2010. № 6. С. 4-8 (0,2 пл., личн. вк. 80%).

5. Гунько В.О. Новые подходы к молекулярной диагностике пренатальной патологии / Погорелова Т.Н., Орлов В.И., Гунько В.О. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2011. № 5. С. 500-503 (0,16 пл., личн. вк. 85%).

Список работ, опубликованных по теме диссертации

6. Гунько В.О. Протеомный анализ околоплодных вод при физиологической беременности и задержке роста плода / Орлов В.И., Матишов Д.Г., Погорелова Т.Н., Гунько В.О., Друккер H.A., Крукиер И.И., Авруцкая В.В. // Материалы X Всероссийского научного форума «Мать и дитя». Москва, 2009. С. 151 (0,04 п.л., личн. вк. 70%).

7. Гунько В.О. Динамика протеомного профиля околоплодных вод при эндокринной недостаточности яичников и фетоплацентарного комплекса / Гунько В.О., Погорелова Т.Н. // Материалы Всероссийского конгресса «Современные технологии в эндокринологии». Москва, 2009. С, 184 (0,04 п.л., личн. вк. 85%).

8. Гунько В.О. Протеомный спектр околоплодных вод при физиологической беременности и гестозе / Орлов В.И., Погорелова Т.Н., Гунько В.О., Друккер H.A. // Материалы IV Международной конференции по акушерству, перинатологии и неонатологии «Здоровая женщина - здоровый новорожденный». Санкт-Петербург, 2009. С. 102-103 (0,08 п.л., личн. вк. 80%).

9. Гунько В.О. Масс-спектрометрическая идентификация белков отличия в околоплодных водах при осложненной гестации / Гунько В.О., Погорелова Т.Н. // Материалы IX межвузовской конференции с международным участием «Обмен веществ при адаптации и повреждении». Ростов-на-Дону, 2010. С. 41-43 (0,125 п.л., личн. вк. 85%).

10. Гунько В.О. Информативность протеомного анализа в пренатальной диагностике / Погорелова Т.Н., Орлов В.И., Гунько В.О. // Материалы российского конгресса с международным участием «Молекулярные основы клинической медицины - возможное и реальное». Санкт-Петербург, 2010. С. 127 (0,04 пл., личн. вк. 85%).

11. Гунько В.О. Роль протеомного дисбаланса в развитии акушерской патологии / Погорелова Т.Н., Орлов В.И., Гунько В.О., Линде В.А // Материалы IV Регионального научного форума «Мать и дитя». Екатеринбург, 2010. С. 232-233 (0,08 п.л., личн. вк. 75%).

12. Гунько В.О. Постгеномные технологии в поиске маркеров осложненной гестации / Гунько В.О., Погорелова Т.Н., Линде В.А. // Материалы XII Всероссийского научного форума «Мать и дитя». Москва, 2010. С. 44-45 (0,08 п.л., личн. вк. 80%).

13. Гунько В.О. Протеомный анализ в идентификации маркеров плацентарной недостаточности И Материалы IV международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы биологии, нанотехнологии и медицины». Ростов-на-Дону, 2011. С. 50-51 (0,08 п.л., личн. вк. 100%).

14. Gunko V.O. Proteins-markers of placental insufficiency / Pogorelova T.N., Gunko V.O., Drukker N.A., Linde V.A. // Biochemistry (Moscow) Supplement Series B: Biomedical Chemistry. 2011. Vol. 5, N 2. P. 135-138 (0,16 пл., личн. вк. 80%).

15. Gunko V.O. New approaches to molecular diagnostics of prenatal pathology / Pogorelova T.N., Orlov V.I., Gunko V.O. // Bulletin of experimental biology and medicine. 2011. Vol. 151. P.567-570 (0,16 п.л., личн. вк. 85%).

Изобретения

16. Гунько В.О. Способ прогнозирования церебральных поражений у новорожденных / Погорелова Т.Н., Друккер Н.А., Гунько В.О., Крукиер И.И. // Патент № 2414715 от 11.11.2009.

17. Гунько В.О. Способ диагностики плацентарной недостаточности / Погорелова Т.Н., Гунько В.О., Линде В.А., Друккер Н.А., Крукиер И.И. // Приоритетная справка №2011133109 от 05.08.2011.

Список сокращений

2Д-ЭФ - двумерный электрофорез ЗРП — задержка роста плода И ПФР - инсулиноподобный фактор роста ИПФРСБ - белок, связывающий ИПФР

НАДФН - никотинамидадениндинуклеотидфосфат восстановленный MALDI-TOF-MS - matrix-assisted laser desorption/ ionization time-of-flight mass spectrometry - матрично-ассоциированная лазерная десорбция/ ионизация времяпролетная масс-спектрометрия Mm - молекулярная масса

NF-kB - nuclear factor kB - транскрипционный фактор кВ р! - изоэлектрическая точка

Подписано в печать 26.04.2012 г. Формат 60><84 716 . Бумага офсетная. Печать офсетная. Усл. печ. л. 1,0. Уч.-изд. л. 1,0. Тираж 100 экз. Заказ № 2282.

Отпечатано в типографии ЮФУ. 344090, г. Ростов-на-Дону, пр. Стачки, 200/1.Тел. (863) 247-80-51.

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Гунько, Виктория Олеговна, Ростов-на-Дону

61 12-3/1046

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ «РОСТОВСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ АКУШЕРСТВА И ПЕДИАТРИИ» МИНИСТЕРСТВА ЗДРАВООХРАНЕНИЯ И СОЦИАЛЬНОГО РАЗВИТИЯ РОССИЙСКОЙ

ФЕДЕРАЦИИ

ПРОТЕОМНЫЙ АНАЛИЗ ОКОЛОПЛОДНЫХ ВОД ПРИ ФИЗИОЛОГИЧЕСКОЙ И ОСЛОЖНЕННОЙ БЕРЕМЕННОСТИ

На правах рукописи

Гунько Виктория Олеговна

03.01.04. - биохимия

Диссертация на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Научный руководитель:

доктор биологических наук.

профессор Т.Н. Погорелова

Ростов-на-Дону

2012

ОГЛАВЛЕНИЕ

с.

ВВЕДЕНИЕ..............................................................................................................6

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ......................................................................12

1.1. Околоплодные воды: функции, источники поступления, белковый состав.........................................................................................................12

1.2. Протеомные технологии и их применение в биомедицинских исследованиях...........................................................................................25

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ............................37

2.1. Определение содержания белка по методу Брэдфорда........................38

2.2. Подготовка образцов околоплодных вод для проведения электрофоретических исследований......................................................39

2.3. Фракционирование белков двумерным электрофорезом.....................39

2.3.1. Изоэлектрофокусирование в иммобилизованном градиенте рН (Обг§ А. 1995)............................................................................................ 39

2.3.2. Электрофорез белков в градиенте полиакриламидного геля в присутствии ДДС-Иа...............................................................................40

2.4. Окраска белков в гелях азотнокислым серебром..................................42

2.5. Масс-спектрометрическая идентификация белков...............................43

2.6. Определение содержания цинк-а-2-гликопротеина в околоплодных водах..........................................................................................................44

2.7. Определение содержания супрессора метастазирования рака молочной железы-1 в околоплодных водах..........................................44

2.8. Определение ДНК-связывающей активности субъединицы р65 транскрипционного фактора ОТ-кВ в околоплодных водах...............45

2.9. Определение содержания цинка в околоплодных водах.....................46

2.10. Определение содержания меди в околоплодных водах.......................46

2.11. Статистическая обработка данных.........................................................47

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ...........48

ЗЛ. Анализ протеомного спектра околоплодных вод в разные периоды физиологически протекающей беременности.......................................51

3.2. Сравнительный анализ протеомного спектра околоплодных вод при физиологической беременности и осложненной задержкой роста плода..........................................................................................................55

3.3. Сравнительный анализ протеомного спектра околоплодных вод при физиологической беременности и осложненной гестозом..................77

3.4. Сравнительный анализ протеомного профиля околоплодных вод при разных акушерских патологиях..............................................................86

3.5. Количественная оценка белков-маркеров осложненной беременности методами иммуноферментного анализа................................................90

ЗАКЛЮЧЕНИЕ...................................................................................................102

ВЫВОДЫ.............................................................................................................110

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ...................................................................................112

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

2Д-ЭФ - двумерный электрофорез АА - акриламид

АФК - активные формы кислорода ДДС-Na - додецилсульфат натрия ДТТ - дитиотреитол ЖК - жирные кислоты ЗРП - задержка роста плода ИЛ - интерлейкин

ИПГ - иммобилизованный градиент рН ИПФР - инсулиноподобный фактор роста ИЭФ - изоэлектрическое фокусирование МАПК - митоген-активруемая протеинкиназа МБА - метиленбисакриламид

НАДФН - никотинамидадениндинуклеотидфосфат восстановленный

ПААГ - полиакриламидный гель

ПГ - простагландин

ПЛ - плацентарный лактоген

ПОЛ - перекисное окисление липидов

ТЕМЕД - N,N,N ' ,N' -тетраметилэтилендиамин

ТФР-(3 - трансформирующий фактор роста-[3

ФНО-а - фактор некроза опухоли-ос

ХАПС - (3-(3-Холамидопропил)диметиламмоний-)-1-пропансульфонат ЭФР - эндотелиальный фактор роста

CDK - cyclin-dependent kinases -циклин-зависимые киназы ESI- electrospray ionization - электроспрейная ионизация Hsp - heat shock protein - белок теплового шока MALDI - matrix-assisted laser desorption/ ionization-матрично-ассоциированная лазерная десорбция/ ионизация

Mm - молекулярная масса

MS - mass-spectrometry -масс-спектрометрия

MS/MS - тандемная масс-спектрометрия

NCBI - National Centre for Biotechnology Information - Национальный центр

биотехнологической информации США

NEPHGE - неравновесный электрофорез в градиенте рН

NF-kB - nuclear factor kB - транскрипционный фактор 1сВ

NK - natural killers - натуральные киллеры

pi - изоэлектрическая точка

PPAR - peroxisome proliferator-activated receptor- рецептор, активирующий

пролиферацию пероксисом

SP- surfactant protein - сурфактантный белок

TOF-MS - time-of-flight mass spectrometry - времяпролетная масс-

спектрометрия

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность исследования. В настоящее время не вызывает сомнения, что для наиболее успешного решения биомедицинских проблем необходимо привлечение современных методических подходов молекулярной биологии, в частности постгеномных технологий (Шишкин С.С., 2002, Арчаков А.И., 2004) . К таким технологиям относятся протеомные исследования, ознаменовавшие качественно новый этап в развитии системного анализа белковых молекул на рубеже XX и XXI веков. Эти исследования дают представление о совокупности белков, экспрессируемых геномом - протеоме исследуемого объекта (Говорун В.М. и др., 2002; Lottspeich F., 1999; Williams K.L., 1999, Dongre A.R. et al., 2001; Kalia A. et al., 2005).

Применение протеомных технологий является весьма перспективным для выяснения ранее неизвестных механизмов нарушения молекулярных процессов на протяжении внутриутробного развития организма, во многом определяющего последующие этапы постнатального онтогенеза. Нормальное течение внутриутробного периода зависит от сбалансированного функционирования системы мать-плацента-плод, важную роль в которой играют околоплодные воды. Способность околоплодных вод быстро реагировать модификацией своего состава на все изменения, возникающие в указанной системе, позволяет использовать изучение протеомного спектра этой биологической жидкости для получения объективной информации о характере течения гестации и состоянии плода.

Белки, реализуя информационную программу клеток, играют ключевую роль в многочисленных процессах, происходящих на молекулярном уровне в фетоплацентарной системе (трофика плода, активный фетоплацентарный транспорт, антигенные взаимодействия между организмами матери и плода, межклеточные контакты, рецепция сигнальных биомолекул, ферментативные процессы, антиоксидантная защита плода и

др.). Физиологическое развитие беременности характеризуется определенной динамикой белкового состава, необходимой для поддержания нормального обеспечения функций всех звеньев этой системы. При срыве гомеостатических механизмов и развитии акушерской патологии наступают вначале обратимые, а затем и необратимые нарушения, которые проявляются изменением спектра и структурно-функционального состояния белков. Эти отклонения могут выражаться в появлении или исчезновении отдельных белковых фракций (белков отличия), что обусловлено модификацией их продукции в организмах матери и плода, а также в плаценте.

На протяжении последних десятилетий среди осложнений гестации, приводящих к перинатальной заболеваемости и смертности, важное место занимают задержка роста плода (ЗРП) и гестоз.

ЗРП в структуре причин перинатальной заболеваемости занимает третье место. Частота этой патологии, по данным литературы, колеблется от 4,5% до 30% (Игнатко И.В. и др., 2006; Макаров О.В. и др., 2003; Стрижаков А.Н. и др., 2003). Патогенетически ЗРП чаще всего обусловлена плацентарной недостаточностью (Радзинский В.Е. и др., 2001; Сидорова И.С. и др., 2005)..

Гестоз относится к числу наиболее серьезных осложнений беременности и родов. Частота гестоза в последние годы не только не имеет тенденции к снижению, но и неуклонно растет и составляет, по данным разных авторов, от 7 до 40 % от числа родов. Высокая частота встречаемости гестоза выводит его на второе место в структуре причин материнской и перинатальной смертности (Макаров О.В. и др., 2006; Айламазян Э.К. и др., 2008, БЛшВ. е1а1., 2005).

Однако, несмотря на большое число проведенных исследований, в настоящее время отсутствуют достаточные знания о биохимических и, особенно, молекулярных механизмах развития ЗРП и гестоза, что ограничивает возможности проведения научно-обоснованных терапевтических мероприятий и реальную профилактику данных

заболеваний. В этой связи чрезвычайно актуальным остается поиск объективных маркеров для своевременной диагностики и мониторинга указанных акушерских патологий.

Цель исследования. Установление взаимосвязи между особенностями динамики протеомного спектра околоплодных вод и характером течения гестации.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

1. Провести протеомный анализ околоплодных вод в разные сроки физиологической гестации.

2. Охарактеризовать динамику протеомного профиля околоплодных вод при гестации, осложненной ЗРП на фоне плацентарной недостаточности, выявить и идентифицировать белки отличия, появляющиеся или отсутствующие при данной патологии.

3. Изучить протеомный профиль околоплодных вод при гестозе и провести идентификацию белков отличия.

4. Сопоставить результаты протеомного анализа околоплодных вод при ЗРП и гестозе, выявить специфические белки отличия между их протеомными спектрами.

5. Провести количественную оценку информативных белков-маркеров в околоплодных водах методом иммуноферментного анализа при различных вариантах течения гестации.

Научная новизна работы. С помощью протеомного анализа получены новые данные об особенностях белкового состава околоплодных вод в разные сроки (23-24 и 39-40 недель) физиологической и осложненной (ЗРП и гестоз) беременности. Впервые выявлены и проанализированы в сравнительном аспекте общие закономерности и специфические изменения протеомного спектра околоплодных вод при различных вариантах течения

гестации. Методом времяпролетной масс-спектрометрии идентифицированы обнаруженные белки отличия. Впервые в качестве информативных маркеров ЗРП и гестоза предложены, соответственно, цинк-а-2-гликопротеин и супрессор метастазирования рака молочной железы 1.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Динамика протеомного профиля околоплодных вод при физиологическом течении беременности характеризуется появлением в III триместре белков, функционально связанных с регуляцией родовой деятельности и процессами адаптации плода к внеутробному существованию.

2. В протеомном спектре околоплодных вод при ЗРП и гестозе имеют место значительные изменения, характеризующиеся как отсутствием ряда белков, так и появлением дополнительных белков по сравнению с физиологической беременностью. Белки отличия, характерные для ЗРП, участвуют в регуляции процессов трофики, роста и развития плода, про- и антиоксидантных процессах, транспортных механизмах. Основные функции белков отличия при гестозе связаны с регуляцией процессов апоптоза, ангиогенеза, функционированием эндотелия сосудов, защитой от окислительного и карбонильного стрессов.

3. Отклонения в протеомных профилях околоплодных вод при ЗРП и гестозе имеют как неспецифический, так и специфический характер, проявляющийся особенностями динамики спектра белков отличия.

4. Модификация протеомного спектра при изученных осложнениях беременности, наряду с негативными последствиями, в ряде случаев может носить компенсаторный характер, направленный на пролонгирование гестации.

Теоретическое и практическое значение работы. Результаты работы имеют большое значение для понимания молекулярных механизмов развития

осложненной гестации. Проведенные исследования свидетельствуют о том, что модификация продукции белков может служить одним из инициирующих факторов в сложной цепи специфических нарушений, приводящих к формированию ЗРП и гестоза.

Полученные результаты создают предпосылки для использования в практическом здравоохранении белков отличия в качестве специфических маркеров осложненной беременности с целью ее диагностики, что позволит оптимизировать комплекс терапевтических мероприятий, направленных на улучшение перинатальных исходов.

По результатам исследования разработан информативный способ диагностики плацентарной недостаточности (заявка на изобретение № 2011133109 от 05.08.2011 г.), а также найдены протеомные маркеры прогнозирования церебральных поражений у новорожденных (патент № 2414715 от 11.11.2009 г.). Разработанные способы внедрены в работу отделения патологии беременности и родильного отделения ФГБУ «РНИИАП» Минздравсоцразвития России.

Материалы диссертации используются в лекциях и семинарах по повышению квалификации врачей ЮФО и СКФО, а также при проведении занятий с клиническими ординаторами и аспирантами ФГБУ «РНИИАП» Минздравсоцразвития России.

Апробация работы. Основные положения работы доложены и обсуждены на следующих научных форумах: III и IV международных научно-практических конференциях «Актуальные проблемы биологии, нанотехнологии и медицины» (г. Ростов-на-Дону, 2009, 2011), Всероссийском конгрессе «Современные технологии в эндокринологии» (г. Москва, 2009), X и XI Всероссийских научных форумах «Мать и дитя» (г. Москва, 2009, 2010), IV Международной конференции по акушерству, перинатологии и неонатологии «Здоровая женщина - здоровый новорожденный» (г. Санкт-Петербург, 2009), IX межвузовской конференции

с международным участием «Обмен веществ при адаптации и повреждении» (г. Ростов-на-Дону, 2010), Российском конгрессе с международным участием «Молекулярные основы клинической медицины - возможное и реальное» (г. Санкт-Петербург, 2010), Региональном научном форуме «Мать и дитя» (г. Екатеринбург, 2010), Международном конгрессе по репродуктивной медицине (г. Москва, 2010).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 15 научных работ, в том числе 5 статей в изданиях, рекомендованных ВАК. Общий объем публикаций составляет 1,8 пл., личный вклад - 82,6%.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Околоплодные воды: функции, источники поступления, белковый

состав

Околоплодные воды (амниотическая жидкость) на протяжении всего внутриутробного развития являются средой обитания плода, играя при этом исключительную роль в функционировании системы мать-плацента-плод. Относительное постоянство и необходимый состав околоплодных вод при физиологически протекающей гестации создают оптимальные условия для развития плода (Милованов А.П. и др., 2004; Радзинский В.Е.и др., 2004).

Изучение биохимического состава этой биологической жидкости по мере совершенствования методов ее исследования позволило отказаться от устаревшего мнения, что околоплодные воды выполняют лишь функцию защиты плода от механических повреждений и препятствуют сращению поверхности его тела с плодными оболочками. В настоящее время известно, что они участвуют в обмене веществ, газообмене, терморегуляции, препятствуют сдавлению пуповины, обеспечивают пространство для свободных движений плода, являются необходимым компонентом для формирования дыхательной и мочевыделительной систем плода, предотвращают развитие инфекции благодаря бактериостатическим свойствам (Цапок П.И. и др., 1986, 1989; Радзинский В.Е. и др., 1993; Милованов А.П., 1999).

В зависимости от срока беременности околоплодные воды образуются из различных источников. В самые ранние сроки беременности (в эмбриотрофическом периоде) амниотическая жидкость представляет собой транссудат трофобласта, в период желточного питания - транссудат ворсин хориона. С момента установления маточно-плацентарного кровообращения околоплодные воды в значительной степени являются ультрафильтратом плазмы крови матери и поступающего в нее секрета ворсинчатого хориона.

Доказано, что со второй половины беременности и до ее конца, источником амниотической жидкости помимо фильтрата плазмы крови матери, является секрет амниотической оболочки и пуповины. Кроме того, после 20 недели околоплодные воды - также продукт деятельности почек и легких плода (Радзинский В.Е. и др., 1993; Милованов А.П., 1999; Цапок П.И. и др., 1986, 1989; Seeds А.Е., 1980).

В научной литературе выделено понятие функциональной системы мать - плацента - плод, как биологического содружества организмов, в котором гомологичные исполнительные механизмы одноименных гомеостатических систем матери и плода специфически интегрируются, обеспечивая достижение одного и того же полезного результата (Федорова М.В. и др., 1986; Милованов А.П., 1999).

Исходя из того, что околоплодные воды представляют собой сложную по составу и функциям среду, которая находится в постоянном обмене между организмами матери и плода и