Цикл оксида азота и его регуляция в околоплодных водах и плодных оболочках при физиологической и осложненной беременности

Никашина, Анастасия Александровна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Цикл оксида азота и его регуляция в околоплодных водах и плодных оболочках при физиологической и осложненной беременности
ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Цикл оксида азота и его регуляция в околоплодных водах и плодных оболочках при физиологической и осложненной беременности"

На правах рукописи

НИКАШИНА АНАСТАСИЯ АЛЕКСАНДРОВНА

ЦИКЛ ОКСИДА АЗОТА И ЕГО РЕГУЛЯЦИЯ В ОКОЛОПЛОДНЫХ ВОДАХ И ПЛОДНЫХ ОБОЛОЧКАХ ПРИ ФИЗИОЛОГИЧЕСКОЙ И ОСЛОЖНЕННОЙ БЕРЕМЕННОСТИ

03.01.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 « ИЮЛ 2014

Ростов-на-Дону 2014

005550725

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Ростовский научно-исследовательский институт акушерства и педиатрии» Министерства здравоохранения России (г. Ростов-на-Дону)

Научный руководитель: доктор биологических наук

Крукиер Ирина Ивановна

Официальные оппоненты: Микашинович Зоя Ивановна, доктор

биологических наук, профессор, заведующая кафедрой общей и клинической биохимии №1 с курсом органической и неорганической химии ГБОУ ВПО «Ростовский государственный медицинский университет» (г. Ростов-на-Дону) Франциянц Елена Михайловна, доктор биологических наук, профессор, заведующая гормональной лабораторией Ростовского НИИ онкологии (г. Ростов-на-Дону)

Ведущая организация: ГБОУ ВПО «Кубанский государственный

медицинский университет» (г.Краснодар)

Защита диссертации состоится «24» сентября 2014 года в II00 часов на заседании диссертационного совета Д 212.208.07 по биологическим наукам в ФГАОУ ВПО «Южный федеральный университет» (344090. г. Ростов-на-Дону, пр. Стачки 194/1, актовый зал).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГАОУ ВПО «Южный федеральный университет» по адресу: г. Ростов-на-Дону, ул. Зорге 21ж.

Автореферат разослан « » 2014 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

:Л9(& (

Е.В. Асланян

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Околоплодные воды являются сложной, биологически активной средой, обеспечивающей, наряду с другими факторами, нормальную жизнедеятельность плода. В последнее десятилетие очевидность важной роли околоплодных вод и плодных оболочек в течение внутриутробного развития эмбриона и плода не вызывает сомнения, однако представление о многих обменных процессах в этих биологических средах нуждаются в дальнейшем исследовании. Данных о роли околоплодных вод и плодных оболочек как посредников передачи информации от материнского организма к плоду и от плода к матери, а также о динамике регуляторных процессов в указанных биологических объектах при физиологической и осложненной беременности крайне мало.

Осложненная беременность обычно протекает на фоне глубоких метаболических изменений и сопровождается внутриутробной гипоксией. В этих условиях имеет место чрезмерная продукция оксида азота, свободнорадикальная природа которого общеизвестна. Согласно концепции, выдвинутой Реутовым В.П. с соавторами (1992; 1994; 1998), превращение оксида азота в другие азотсодержащие соединения (NO2, NO3, NO+, NO' и т.д.) осуществляется в ходе окислительно-восстановительных реакций, протекающих в виде метаболического цикла. Этот метаболический цикл может активироваться при различных состояниях, в том числе и на фоне гипоксии. Зависимость цикла оксида азота (N0) от концентрации кислорода связана с тем, что активация процессов восстановления нитритов в N0 происходит при участии гемсодержащих белков, способных связывать кислород. В отсутствии последнего или при его дефиците восстановленные гемсодержащие белки начинают переносить электроны на ионы N02 , которые, в свою очередь, восстанавливаются в NO. Такая множественность эффектов NO в цикле оксида азота объясняется большим количеством продуктов его метаболизма, которые приводят к различным биологическим эффектам, что позволило называть его «дву- или даже многоликим Янусом» (Snyder S.H., 1993). Поэтому до сих пор возникают многочисленные вопросы о причине «многоликости» оксида азота, на которые до сих пор нет определенного ответа.

Кроме указанных свойств, NO обладает выраженным вазодилататорным эффектом, что объясняет широкий спектр биорегуляторного действия этой

молекулы, а когда его физиологические функции изменяются на цитотоксические образуется пероксинитрит (ONOO"). Поскольку образование NO в организме лимитируется активностью NO-синтазы (NOS) (КФ 1.14.13.39), важным представляется изучение этого фермента в околоплодных водах и плодных оболочках.

Несмотря на многочисленные биохимические исследования последних лет, посвященные механизмам формирования различных осложнений беременности (в том числе преждевременных родов), ряд ключевых реакций регуляции прежде всего белкового обмена в плодных оболочках и околоплодных водах остаются практически не изученными. К их числу относится аминокислотный состав указанных биологических сред. Известно, что основной путь обмена аминокислот между матерью и плодом происходит через плаценту, однако возможен параплацентарный транспорт через плодные оболочки и поглощение аминокислот плодом с околоплодными водами (Орлов В.И. и др., 1998; 2009).

Наиболее важной аминокислотой, связанной с NO, является L-аргинин, который, как известно, способен окисляться в организме с образованием одного из ключевых регуляторов клеточного метаболизма - оксида азота (Марков Х.М., 1996; 2000; Ignaro L. et al., 1999). Однако пути метаболизма L-аргинина не ограничиваются продукцией N0. Наибольшая скорость синтеза аргинина наблюдается в цикле мочевины (орнитиновый цикл). От мощности работы цикла (орнитин-цитруллин-аргинин) зависит способность организма очищаться от белковых шлаков (Реутов В.П. и др., 1998). Следует отметить, что цитруллин, являющийся сопродуктом оксида азота при окислении аргинина, способен вновь превращаться в аргинин и в настоящее время этот путь трактуется как цитруллин/ЫО-цикл или аргинин/цитруллин-цикл (Morris S. et al., 1994). Аргинин является одним из самых эффективных стимуляторов продукции соматотропного гормона гипофиза и позволяет поддерживать его концентрацию на верхних границах нормы, а недостаток его приводит к замедлению роста детей (Чернобровкин М.Г. и др., 2004). Концентрация аргинина зависит от активности аргиназы, которая превращает его в орнитин и мочевину. Аргиназа (КФ 3.5.3.1.) -регуляторный фермент, определяющий доступность аргинина для синтеза оксида азота, пролина и глутамата, а также полиаминов. Аргиназа в процессе сложных

ферментативных реакций обеспечивает также и синтез пролина, который в большом количестве содержится в коллагене - основном белке соединительной ткани.

В связи с вышеизложенным, целью исследования явилось изучение особенностей становления цикла оксида азота и компонентов его регуляции в околоплодных водах и плодных оболочках при физиологической и осложненной беременности.

Для достижения поставленной цели были сформулированы и решены следующие задачи:

1. Оценить продукцию оксида азота и активность NOS в околоплодных водах и плодных оболочках в разные сроки физиологической и осложненной беременности.

2. Изучить и сопоставить динамику содержания аминокислотного состава околоплодных вод и плодных оболочек в разные периоды физиологической и осложненной беременности.

3. Определить в разные периоды физиологической и осложненной беременности интенсивность свободнорадикальных процессов в околоплодных водах и плодных оболочках.

4. Оценить активность аргиназы в околоплодных водах и плодных оболочках в разные сроки физиологической и осложненной гестации.

5. Разработать объективные критерии для оценки состояния плода и прогноза состояния новорожденного.

Научная новизна. В процессе исследования впервые:

- получены новые сведения о содержании оксида азота, активности NOS и аргиназы в околоплодных водах и плодных оболочках в процессе формирования физиологической гестации и их дисбалансе при развитии различных осложнений беременности;

- проведено сравнительное изучение динамики содержания аргинина и его производных (пролина и цитруллина), участвующих в регуляции клеточных процессов в околоплодных водах и плодных оболочках в разные периоды физиологической и осложненной гестации;

- установлены соотношения между изученными аминокислотами в околоплодных водах при различных осложнениях беременности, что позволило разработать способ прогнозирования задержки роста плода (патент № 2425379, 2010);

- показано, что плацентарная недостаточность, лежащая в основе многих осложнений беременности, развивается на фоне усиления свободнорадикальных процессов в околоплодных водах и плодных оболочках.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Физиологическое течение беременности сопровождается значительными изменениями продукции N0, активности NOS и аргиназы, а также ряда аминокислот (аргинина, пролина, цитруллина) в околоплодных водах. Степень этих изменений, направленных на создание оптимальных условий для развития плода, различна в разные периоды гестации.

2. Осложненная беременность (ПН, ЗРП, преждевременные роды) развивается на фоне дисбаланса в околоплодных водах уровня аминокислот (аргинина, пролина, цитруллина), оксида азота и активности NOS и аргиназы. Наиболее выраженные изменения имеют место при ЗРП и преждевременных родах.

3. Увеличение продукции производных оксида азота (ONOO", NO-глутатиона и NO-тирозина) в околоплодных водах, сопровождающееся усилением свободнорадикальных реакций, является одним из механизмов негативного влияния данных процессов, приводящих к ухудшению течения гестации.

4. Модификация продукции NO, изученных аминокислот, а также активности ферментов их обмена и свободнорадикальных реакций в плодных оболочках свидетельствует об их участии в координации процессов параплацентарного обмена между матерью и плодом.

Теоретическое и практическое значение работы. Выполненные биохимические исследования расширяют существующие представления о роли оксида азота и продуктов его метаболизма - некоторых аминокислот (аргинина, пролина, цитруллина) и других биоактивных компонентов в процессе нормального развития беременности и формировании плацентарной недостаточности, являющейся одним из наиболее распространенных осложнений гестации.

Полученные в работе данные создают теоретические предпосылки для коррекции метаболических нарушений в фетоплацентарном комплексе, особенно в те периоды гестаиии, в которые установлены наиболее значительные биохимические нарушения в околоплодных водах и плодных оболочках.

В результате проведенных исследований разработан информативный критерий для диагностики задержки роста плода (патент № 2425379, 2010). который внедрен в практику (в родильном отделении ФГБУ «Ростовский НИИ акушерства и педиатрии» Минздрава России).

Материалы диссертации используются в лекционных курсах на кафедре акушерства, а также на семинарах по повышению квалификации врачей Учебного центра РНИИАП.

Апробация диссертационной работы. Материалы диссертации изложены и обсуждены на следующих научных форумах: V Международной конференции по новым технологиям и приложениям современных физико-химических методов для изучения окружающей среды (Ростов-на-Дону. 2009): III, V. VI Региональных научных форумах «Мать и дитя» (Саратов. 2009: Геленджик, 2011: Ростов-на-Дону,

2012); XI, XII, XIII. XIV Всероссийских научных форумах «Мать и дитя» (Москва. 2010. 2011, 2012, 2013); VI, VII национальных научно-практических конференциях с международным участием «Reactive oxygen species, nitric oxide, antioxidants and human health» (Smolensk, 2009, 2011); IX. X, XI, XII межвузовской конференции с международным участием «Обмен веществ при адаптации и повреждении (дни медицинской лабораторной диагностики)» (Ростов-на-Дону, 2010, 2011, 2012,

2013): III научно-практическом симпозиуме с международным участием «Свободно-радикальная медицина и антиоксидантная терапия», «Кислород и антиоксиданты» (Волгоград, 2010); Российском конгрессе с международным участием «Молекулярные основы клинической медицины — возможное и реальное» (Санкт-Петербург. 2010); V, VI международных конгрессах по репродуктивной медицине (Москва. 2011, 2012); конференции «Бнохимия-биофизика-информатика - три кита лабораторной медицины XXI века» (Санкт-Петербург, 2010): Международной научно-практической конференции "Актуальные вопросы акушерства, гинекологии и перинатологии" (Судак, 2012).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 26 работ, в том числе в изданиях, рекомендованных Перечнем ВАК МОН РФ - 7 статей, получен 1 патент. Личный вклад автора составляет 75%. Общий объем публикаций 3,16 печатного листа.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 141 странице машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов исследования и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы, включающего 143 отечественных и 135 иностранных источников. Работа иллюстрирована 22 таблицами и 18 рисунками.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследования проведены на базе клинических и научных подразделений ФГБУ «Ростовский НИИ акушерства и педиатрии» Минздрава России (РНИИАП).

Обследовано 150 беременных в возрасте 20-35 лет, находившихся под наблюдением в клинических подразделениях РНИИАП и давших информированное согласие на расширенный алгоритм обследования в соответствии с юридическим договором.

Контрольную группу составили 55 здоровых женщин с неосложненной гестацией: 10 беременных - в 15-19 недель, 12 - 20-23 нед., 13 - 24-27 нед. и 20 -39-40 недель беременности. В основные группы вошли 95 женщин с различными осложнениями гестации: с плацентарной недостаточностью - 25 беременных в 1527 недель и 20 - в 39-40 недель гестации: с задержкой роста плода - 16 женщин в 15-27 недель и 15 - в 39-40 недель беременности. У 19 женщин имели место преждевременные роды.

Диагнозы плацентарная недостаточность и задержка роста плода были поставлены на основании комплексного динамического обследования.

В исследование у вышеуказанных женщин брали околоплодные воды и плодные оболочки. Околоплодные воды получали при их отхождении или амниотомии в I периоде родов (35-37 нед.. 39-40 нед.), а также путем проведения амниоцентеза (15-27 нед.). Для исследования брали 10-15 мл околоплодных вод. Непригодными считали пробы, загрязненные кровью или меконием.

Плодные оболочки получали путем отделения их от последа в процессе родов и затем промывали от крови и мекония физиологическим раствором.

Перед исследованием проводили пробоподготовку материала.

Околоплодные воды центрифугировали в течение 10 минут при 3000 об./мин. Плодные оболочки гомогенизировали в ступке с кварцевым песком, затем центрифугировали 15 минут при 3000 об./мин.. в анализ брали экстракт.

Определение содержания оксида азота (его метаболитов N02~, NO/'). Эндогенный уровень оксида азота определяли с помощью классической реакции Грисса после энзиматического восстановления нитратов в нитриты (Green L. et al., 1982). обозначаемых в литературе NOx. Регистрацию результатов проводили на спектрофотометре Varían «Сагу-50» (США) при длине волны 520 нм. Значение концентрации определяли в мкмоль/л.

Определение активности NO-синтазы. Активность NOS (КФ 1.14.13.39) оценивали по увеличению продукции оксида азота по уровню его метаболитов из L-аргинина в присутствии NADPH (Di Julio J.L. et al., 1994). Уровень образовавшегося оксида азота в форме его метаболитов (NO:". NOj") определяли с помощью классической реакции Грисса (Green L. et al.. 1982) и обозначали как NOx.

Определение активности аргиназы. Активность аргиназы (КФ 3.5.3.1.) определяли колориметрическим методом (Тиц Н.У., 2003) по увеличению продукции мочевины из L-аргишша (Меньшиков В.В.. 1987).

Определение содержания аминокислот (L-аргинина, L-пролина, L-цитруллина). Идентификацию и количественное определение свободных форм аргинина, пролина и цитруллина выполняли методом капиллярного электрофореза с использованием немодифицированного кварцевого капилляра («Капель-105», «Люмэкс», С.-Петербург, Россия). Обработку данных проводили при помощи IBM PC с программным обеспечением «Мультихром» (АО «Амперсенд»).

Определение содержания ОХОО', NO-глутатиона, NO-тирозина. Содержание ONOO", NO-глутатиона и NO-тирозина определяли спектрофотометрически (Лобышева И.И. и др.. 1999) против физиологического раствора при длинах волн 302 нм. 338 нм и 438 нм соответственно и рассчитывали на 1 мг белка (Lowry О.H. et al.. 1951).

Статистическая обработка данных. Статистическую обработку данных осуществляли с использованием лицензионного пакета программ Statistica (версия 5.1, фирмы StatSoft. Inc.) и Excel. Достоверность различий между сравниваемыми

показателями определяли по критерию Стьюдента и его аналогу для непараметрических распределений - критерию Манна-Уитни (U-критерий). Однородность дисперсий проверяли по критерию Фишера. Корреляционный анализ выполнен методом Спирмена с расчетом коэффициента ранговой корреляции (г) и вычислением его средней ошибки.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Оксид азота и активность NO-синтазы и аргиназы в околоплодных водах в разные периоды физиологической и осложненной беременности.

Результаты собственных исследований показали, что в норме продукция

вазоактивного NO и активность NOS в околоплодных водах существенно возрастают по мере развития физиологической беременности (рис. 1 ) и достигают своих максимальных величин к 38-40 неделям гестации.

К концу беременности уровень указанных показателей в амниотической жидкости возрастает, в среднем, в 3 раза, по сравнению с 15-19 неделями гестации. что. по-видимому, необходимо для обеспечения возрастающей трофики плода. Что касается аргиназы (рис. I ). то пик её активности в околоплодных водах приходится на 20-23 неделю беременности и совпадает с пиком содержания аргинина при физиологической беременности.

15-19 20-23 24-27 38-40 нед. нед. нед. нед. NOx -^-активность NOS

15-19 20-23 24-27 38-40

нед. нед. нед. нед. Активность аргиназы

Рис. I. Изменение содержания NOx и активности NOS и аргиназы в околоплодных водах женщин в разные сроки физиологической беременности.

По-видимому, именно в этот период наиболее усиливаются пролиферативные

и ангиогенные процессы, сходные с наблюдаемыми в плаценте и обеспечивающие

нормальное развитие сосудистой сети и формирование данного органа (Praff A.W.,

et al., 2005). Известно также, что в процессе формирования плаценты происходят

изменения метаболического обеспечения пролиферации на уровне аргиназного пути метаболизма, характеризующиеся максимальной активностью аргиназы и высоким уровнем аргинина (Шестопалов А.Ю.. 2007). Очевидно, в околоплодных водах наблюдается аналогичная ситуация.

В амниотической жидкости, взятой у женщин с осложненной беременностью в сроке 15-27 недель (рис. 2). продукция N0 была наиболее повышена при ЗРП - в 4 раза, и при плацентарной недостаточности - в 3 раза, активность NOS увеличивалась в меньшей степени: на 71% - при ЗРП. и на 65% - при ПН по, сравнению с контролем.

Активность аргиназы, напротив, была снижена при указанных осложнениях беременности, но особенно при ЗРП (на 41.6%). относительно контрольных величин. Было показано, что местная доступность аргинина в качестве субстрата для NOS может быть снижена вследствие изменения активности аргиназы (Граник В.Г.. 2003). Так как в нашем случае активность аргиназы уменьшалась, то можно предположить, что это связано с высоким уровнем NOx и NOS.

Содержание NOx, активность NOS и аргиназы при доношенной беременности и преждевременных родах представлены на рисунке 2.

зось

ПН (15-27 ЗРП (15-27

нед.) нед.)

□ NOx ' '

□ активность NOS

■ активность аргиназы

ПН (39-40 ЗРП (39-40 Пр. роды нед.) нед.) (35-37 нед.)

□ NOx

□ активность NOS

■ активность аргиназы

Рис. 2. Изменение содержания NOx, активности NOS и аргиназы (в % к контролю) в околоплодных водах женщин (15-27 нед., 35-37 нед., 39-40 нед.) с осложненной беременностью (ПН, ЗРП и преждевременные роды).

Обозначения: * - достоверные различия показателей по сравнению с контрольной группой (здесь и далее на других рисунках).

При ПН уровень NOx был увеличен на 13%. а активность NOS достоверно не

изменялась. При ЗРП и особенно преждевременных родах, напротив, содержание

N0X снижалось на 31% и 46%. соответственно. Активность NOS также достоверно снижалась при ЗРП - на 19.7% и при преждевременных родах - на 48.9%. Активность аргиназы при всех осложнениях беременности была повышена: при ПН и ЗРП. в среднем, на 50%, а при преждевременных родах - в 2,3 раза.

Очевидно, что снижение уровня NOx и активности NOS при таких тяжелых осложнениях беременности, как ЗРП и преждевременные роды, приводит к таким явлениям, как спазм сосудов пуповины, уменьшение транспорта кислорода и питательных веществ, поступающих к плоду, усиление отрицательных последствий кислородной недостаточности и, в конечном итоге, к срыву беременности (в случае с преждевременными родами).

Одной из причин разнонаправленных изменений активности NOS и аргиназы в околоплодных водах женщин с указанными осложнениями беременности может быть динамика экспрессии трансформирующего фактора роста (ТФР-(3). Известно ингибирующее влияние ТФР-(3 на активность NOS. и, напротив, его индуцирующий эффект на аргиназную активность (Shearer J.D. et al.. 1997). что в определенной мере может объяснить возможные регуляторные механизмы выявленных нами нарушений активности ферментов аргининового обмена.

Что касается незначительного увеличения продукции оксида азота у женщин с ПН. то оно. по-видимому, носило компенсаторный характер и в комплексе с другими регуляторными молекулярно-клеточными механизмами позволило создать условия для донашивания беременности, хотя и протекающей с угрозой прерывания.

Уровень аргинина, пролина и цитруллина околоплодных вод в разные сроки физиологической и осложненной беременности.

Имеющиеся данные о функциональной взаимозависимости между состоянием

плода и составом амниотической жидкости свидетельствуют о важной диагностической ценности изучения этой биологической среды.

Среди азотистых компонентов амниотической жидкости одно из важных мест

занимают свободные аминокислоты. Они служат предшественниками биоактивных

соединений, включаются в энергетический обмен. Некоторые из аминокислот

выполняют самостоятельные функции, в частности, являясь индукторами синтеза

стероидных гормонов и пролиферативных процессов, а также активными

нейромедиаторами. Изменение соотношения аминокислот в околоплодных водах,

очевидно, может отражаться на состоянии плода, что позволяет рассматривать их в качестве потенциальных маркеров перинатальных повреждений и прогностических показателей состояния новорожденного.

Пример электрофореграммы уровня Ь-аргинина. Ь-пролина и Ь-цитруллина представлен на рисунке 3.

12.3 тА1> а

4 5 6 7 8 мин

Рис. 3. Электрофореграмма определения свободных форм аминокислот в амниотической жидкости.

Полученные данные свидетельствуют о том. что по мере развития физиологической беременности содержание L-аргинина в амниотической жидкости увеличивается в 2 раза относительно начальных сроков (15-19 нед.) и достигает своих максимальных концентраций к середине гестации (20-23 нед.).

Известно, что аргинин является важным регулятором многих физиологических и биохимических процессов (Hanaoka С. et al., 1989). а также участвует в коммуникации между нервными клетками (Дмитриенко Н.П. и др.. 2008). Что касается продукции пролина и цитруллина. то наиболее высокое содержание этих аминокислот в амниотической жидкости наблюдается в сроках 15-19 недель беременности.

Согласно данным ВОЗ, в мире ежегодно рождается около 21 млн. детей, имеющих низкую массу тела. При этом, если в развитых странах только 25-33% из них отстают в развитии, то в развивающихся странах таких детей большинство (Benson W.E. etal., 1978).

Результаты наших исследований (рис. 4) свидетельствуют о существенных изменениях в уровне свободных аминокислот (аргинина, пролина и цитруллина) в околоплодных водах, полученных у женщин с ПН и задержкой роста плода в 15-27 недель беременности, по сравнению с нормально протекающей беременностью.

□ Ьаргинин ШЬпролин СИ-цитруллин ШЬ-аргинин РЦ-пролин 1И1--цитруллин

Рис. 4. Изменение содержания аминокислот (в % к контролю) в околоплодных водах женщин (15-27 нед., 35-37 нед., 39-40 нед.) с осложненной беременностью (ПН. ЗРП и преждевременные роды).

Так, уровень аргинина в эти сроки был повышен на 31.5% и 45,3% при ПН и ЗРП. соответственно. Содержание пролина и иитруллина. напротив, уменьшалось при указанных осложнениях беременности: при ПН и ЗРП уровень пролина

снижался на 50% и 58%. а цитруллина - на 32% и 41%, соответственно. Одной из причин такого дисбаланса в содержании изученных аминокислот может быть нарушение плацентарной продукции и/или модификация их трансплацентарного перехода в околоплодную среду. С другой стороны, снижение уровня пролина и цитруллина. очевидно, является проявлением дезадаптации и одной из причин развития этой патологии.

Характер изменения продукции изученных аминокислот в 39-40 нед. осложненной беременности (ПН. ЗРП). а также при преждевременных родах (36-37 нед.) имел свои особенности. Уровень аргинина увеличен на 64% при ПН и на 72% — при ЗРП. а цитруллина. напротив, снижен в среднем на 14% при указанных осложнениях беременности, и лишь продукция пролина отличается по своей динамике: при ЗРП она снижена, также как и в предыдущие сроки осложненной беременности (на 32%). а при ПН. наоборот, повышена (на 29%).

Что касается динамики аминокислот в амниотической жидкости у женщин с преждевременными родами, то у них достоверно изменялся уровень аргинина и цитруллина. Так. продукция аргинина была повышена на 71%, а цитруллина

снижена на 45%, уровень же пролина практически не отличался от контрольных величин при физиологической гестации.

Определенную информацию о состоянии новорожденного при осложненной беременности даёт расчет коэффициентов аргинин/пролин, аргинин/цитруллин и пролин/цитруллин.

По результатам изучения аминокислотного состава в околоплодных водах, расчета соответствующих коэффициентов (рис. 5) и сопоставления с состоянием новорожденных разработан «Способ диагностики задержки роста плода», в основу которого легло определение отношения концентраций аргинина к пролину, наиболее увеличивающееся при ЗРП (в 3,5 раза). Нами был предложен информативный тест для ранней диагностики ЗРП. на который получен патент № 2425379.

ПН (15-27 нед.) ЗРП (15-27 нед.) □ arg/pro Eiarg/cit Dpro/cit

ПН (39-40 ЗРП (39-40 Пр. роды нед.) нед.) (35-37 нед.)

□ arg/pro m arg/cit □ pro/cit

Рис. 5. О тношения содержания аргинин/пролин. аргинин/цитруллин. пролин/цитруллин в околоплодных водах женщин (15-27 нед., 35-37 нед., 39-40 нед.) с осложненной беременностью (ПН, ЗРП и преждевременные роды).

Проанализировав все соотношения содержания указанных аминокислот при ПН. ЗРП и преждевременных родах, можно сделать вывод, что существенные изменения в 3 триместре, также как и во 2. наблюдались при ЗРП. Наибольшие изменения к концу беременности были отмечены для соотношения аргинина к цитруллину (в 3 раза), что указывает на существенную роль указанных нарушений в возникновении такого серьезного осложнения беременности, каким являются преждевременные роды. Очевидно, что использование предлагаемого коэффициента при диагностике позволит начать терапию этого осложнения беременности ещё до появления клинических признаков.

Обнаруженный нами дисбаланс в системе «аргинин-цитруллин» может быть обусловлен нарушением активности основных ферментов их обмена (аргиназы и NO-синтазы). что подтверждается полученными нами ранее данными о значительных изменениях активности указанных ферментов при осложненной беременности.

Свободнорадикальные процессы в околоплодных водах в разные сроки физиологической и осложненной беременности.

Известно, что воздействие оксида азота может значительно видоизменяться в

результате реакций с активными формами кислорода (АФК). Чрезмерная продукция оксида азота, являющегося в определенных условиях, в том числе и гипоксии, мощным свободным радикалом, может привести к образованию цитотоксического ONOO". Большую роль в патологии клетки играет также инактивация ион-транспортных ферментов, в активный центр которых входят тиоловые группы. (Марков Х.М.. 2001). Известно, что продуктом нитрования тирозина с участием АФК является NO-тирозин. который считается маркёром N0-зависимого оксидативного стресса (Mohiuddin I. et al., 2006).

В процессе развития физиологической беременности продукция ONOO" в околоплодных водах нарастает (рис. 6), максимально увеличиваясь к концу гестации (на 68%).

га 300 g 250

200 5 150 1 100 ® 50

I 0

Рис. 6. Изменение содержания ONOO". NO-глутатиона и NO-тирозина в околоплодных водах женщин в разные сроки физиологической беременности.

Пик уровня NO-глутатиона и NO-тирозина наблюдался к середине гестации (20-23 нед.). Содержание NO-тирозина к концу гестации снижалось на 31% по сравнению с началом второго триместра (15-19 нед.).

15-19 20-23 24-27 38-40 нед. нед. нед. нед. ЧОО- "^NO-глутатион

1-г

15-19 20-23 24-27 38-40 нед. нед. нед. нед.

•^NO-тирозин

Развитие осложненной беременности сопровождалось усилением продукции ОЫОО" и МО-глутатиона в околоплодных водах, взятых в сроке 15-27 нед. (рис. 7).

ПН (15-27

□ ОМОО«еД)

□ ЬЮ-глутатион ■ 1ЧО-тирозин

ЗРП (15-27 нед.)

ПН (39-40 ЗРП (39-40 Пр. роды

□ ойЗЙ- НеД° (35-37 нед.)

□ ЫО-глутатион ■ КЮ-тирозин

Рис. 7. Изменение содержания ОШО", ЫО-глутатиона и МО-тирозина (в % к контролю) в околоплодных водах женщин (15-27 нед., 35-37 нед.. 39-40 нед.) с осложненной беременностью (ПН. ЗРП и преждевременные роды).

Наибольшие изменения отмечались при ПН: продукция 01М0(Х и ЫО-

глутатиона увеличивалась на 56% и 30%, соответственно, уровень Ш-тирозина достоверно не отличался от контрольных значений. Что касается ОМОО\ участвующего в регуляции кислородсвязывающих свойств гемоглобина, то его высокий уровень, по-видимому, обусловлен гипоксией, имеющей место у женщин с ПН. При ЗРП модификации подверглись все нитропроизводные оксида азота, но эти изменения были менее выражены. Так. уровень ОТМОО" увеличился на 28%, МО-глутатиона и МО-тирозина - на 27% относительно контрольных величин.

В конце осложненной, но доношенной беременности наблюдалась аналогичная динамика, как и во 2 триместре, но наибольшие изменения отмечались при ЗРП: продукция ОМОО' повышалась на 45%. МО-глутатиона - на 57%. а МО-тирозина - на 41%. При ПН изменения были менее выражены: содержание ОМОО" увеличивалось лишь на 24%, а ЫО-глутатиона и МО-тирозина - на 35% и 28%, соответственно. Наибольшие изменения отмечались при преждевременных родах. Особенно сильно увеличивалось содержание МО-глутатиона (на 61%), содержание ОМОО'и N0- тирозина в среднем было повышено на 46%.

Следует отметить, что нитрозилирование тиолов и. прежде всего, глутатиона.

а также тирозиннитрирование - важные проявления клеточного действия МО.

Различная по интенсивности степень модификации продукции производных оксида

азота при доношенной и недоношенной беременности, по-видимому, вносит

определенный вклад в характер регуляторных процессов и компенсаторных механизмов, определяющих исход гестации.

Таким образом, полученные результаты позволяют заключить, что увеличение продукции указанных компонентов околоплодных вод. сопровождающееся усилением свободнорадикальных реакций, по-видимому, является одним из механизмов негативного влияния данных процессов, приводящих к ухудшению течения гестации.

Плодные оболочки и их роль в параплацентарном обмене между организмами

матери и плода.

Более полное представление о взаимосвязи между организмами матери и плода может дать изучение плодных оболочек, участвующих в параплацентарном обмене. Среди нарушений беременности одно из ведущих мест занимают преждевременные роды, обусловленные ПН и являющиеся основной причиной перинатальной заболеваемости и смертности. Частота этой патологии, по данным различных авторов, колеблется в широких пределах (4-12%) и не имеет тенденции к снижению (Савельева Г.М. и др., 1991: 2006; Сидельникова В.М.. 2002).

Уровень аргинина, пролина и цитруллина в плодных оболочках при физиологической и осложненной беременности.

Результаты наших исследований показали, что в процессе развития

физиологической беременности содержание аминокислот в плодных оболочках к концу гестации было, в среднем, в 2 раза выше, чем в околоплодных водах.

Осложненная беременность сопровождалась (рис. 8) падением уровня аргинина в плодных оболочках при всех указанных патологиях, особенно это было характерно для ЗРП.

□ (.-аргинин

□ Ь-пролин

□ Ьцитруллин

ЗРП

Пр. роды

Рис. 8. Изменение содержания аминокислот (в % к контролю) в плодных оболочках при осложненной беременности: ПН (39-40 нед.), ЗРП (39-40 нед.), преждевременные роды(35-37 нед.).

Продукция аргинина в плодных оболочках также уменьшалась при ПН на 82%, при ЗРП - на 87% и при преждевременных родах - на 81% относительно нормы. Содержание пролина и цитруллина при ПН имеет аналогичную, но менее выраженную динамику: содержание пролина снижается на 23%. а цитруллина - на 61% относительно контрольных величин.

При ЗРП и преждевременных родах уровень пролина также был снижен (на 35% и 37%. соответственно). Противоположная динамика наблюдалась для цитруллина, содержание которого было увеличено в плодных оболочках при данных осложнениях беременности (при ЗРП - на 81%, а при преждевременных родах - в 2,7 раза).

Нами, также как и для околоплодных вод, было рассчитано соотношение изученных аминокислот в плодных оболочках. Полученные данные свидетельствуют о том, что наибольшие изменения наблюдались (так же, как и в околоплодных водах) для отношения аргинин/пролин - при ЗРП и аргини/цитруллин - при преждевременных родах. Однако если в околоплодных водах это отношение повышалось в несколько раз, то в плодных оболочках наблюдалась противоположная ситуация: отношение аргинин/пролин снижалось почти в 6 раз (при ЗРП), а аргинин/иитруллин - в 14 раз (при преждевременных родах). Имеющиеся в литературе данные о синтезе белков, аминокислот, активности некоторых ферментов их обмена (Погорелова Т.Н., 1984; Хлыбова C.B. и др.. 2006) и других биоактивных веществ в плодных оболочках свидетельствуют об их регуляторных возможностях в координации процессов параплацентарного обмена между матерью и плодом.

Содержание оксида азота, активность NO-синтазы и аргиназы в нлодных оболочках при физиологической и осложненной беременности.

Уровень изученных вазоактивных соединений в плодных оболочках имеет

свои особенности. Известно, что в плодных оболочках продукция вазоактивных веществ возможна только в их децидуальной части, в которой обнаруживаются капилляры-синусоиды, являющиеся самыми дистальными отделами кровеносной системы матки, а также в амниальном эпителии (Tigconi G. et al., 1996).

При задержке роста плода и преждевременных родах в плодных оболочках наблюдалась аналогичная динамика модификации вазоактивных веществ, как и в

околоплодных водах. Уровень метаболитов оксида азота был снижен на 26% при ЗРП и на 19% - при преждевременных родах. Активность NOS также понижалась относительно контрольных величин при указанных осложнениях беременности в среднем на 27% (рис. 9).

Противоположная динамика выявлена для продукции N0 и активности фермента его обмена - NOS при плацентарной недостаточности: было обнаружено повышение содержания NOx (на 20%) и активности NOS (на 27%) относительно соответствующих показателей при нормальной беременности.

Что касается активности аргиназы в плодных оболочках при плацентарной недостаточности, то она снижена на 28%. а при других осложнениях беременности, напротив, повышена: при ЗРП - на 65% и при преждевременных родах - в 2 раза. 160п

✓-dD-

□ NOx

□ активность NOS ■ активность аргиназы

ПН ЗРП Пр. роды

Рис. 9. Изменение содержания NOx, активности NOS и аргиназы (в % к контролю) в плодных оболочках при осложненной беременности: ПН (39-40 нед.). ЗРП (39-40 нед.). преждевременные роды (35-37 нед.).

Следует отметить, что изменение продукции вазотоников в плодных оболочках и околоплодных водах при некоторых осложнениях беременности (ЗРП. преждевременные роды) имеет одинаковую направленность, хотя степень этих изменений различна в этих биологических средах.

Свободнорадикалыше процессы в плодных оболочках при физиологической и осложненной беременности.

Широкий диапазон физиологических эффектов N0 реализуется через

различные механизмы, в том числе, и через участие в процессах свободнорадикального окисления. Взаимодействие N0 с активными формами кислорода имеет сложный характер, он может быть как источником радикалов, так и их гасителем (Зинчук В.В. и др., 2006).

В результате исследований было показано (рис. 10), что содержание ONOO" в плодных оболочках достоверно повышено при всех указанных осложнениях

беременности по сравнению с контролем. Так, содержание СЖОО" при ПН было увеличено на 67.5%, при ЗРП - на 86%. а при преждевременных родах - в 2 раза.

Можно предположить также, что (УЫОО" является не только цитотоксичным окислителем, но и фактором регуляции кислородсвязывающих свойств гемоглобина, потому, очевидно, что при его высокой продукции будет наблюдаться снижение кислородного насыщения, приводящее к гипоксии.

% 20С

□ окюо-

□ ЫО-глутатион ■ МО-тирозин

ПН ЗРП Пр. роды

Рис. 10. Изменение содержания ОЫОО", Ш-глутатиона и (МО-тирозина (в % к контролю) в плодных оболочках при осложненной беременности: ПИ (39-40 нед.), ЗРП (39-40 нед.), преждевременные роды (35-37 нед.).

Наряду с изменением вышеназванных компонентов, имело место снижение уровня тиольных производных оксида азота. При всех осложнениях беременности было обнаружено снижение содержания >Ю-глутатиона: при ПН - на 40%. при ЗРП - на 50% и при преждевременных родах - на 61%. Следует отметить, что все осложнения гестации также сопровождались усилением образования нитропроизводного оксида азота - ТМО-тирозина: при ЗРП - на 32%, при преждевременных родах - на 53%.

В условиях выявленного нарушения генерации оксида азота и его производных создаются предпосылки для развития нитрозирующего и оксидативного стресса. Известно. что оксидативный стресс обычно сопровождается эндотелиальной дисфункцией, в результате чего запускается сложная цепь патологических реакций (гиперпродукция АФК. ОЫОО" и нитропроизводных N0). В конечном итоге данная ситуация заканчивается генерализованным спазмом мелких сосудов в организме беременной, энергодефицитом и усилением гипоксических явлений. Экспрессия индуцирующих апоптоз факторов, усиливающих оксидативный стресс, приводит, по-видимому, к снижению эластичности и прочности плодных оболочек, что является причиной их спонтанного разрыва, особенно выраженного при преждевременных родах.

выводы

1. Продукция N0, активность NOS и аргиназы в околоплодных водах существенно возрастают по мере развития физиологической беременности. Для осложненного течения беременности, прервавшейся в разные сроки, характерны разнонаправленные изменения в содержании NOx, активности NOS и аргиназы в околоплодных водах: при ПН и ЗРП во втором триместре показатели N0X и NOS повышены, а активность аргиназы - снижена. В третьем триместре при доношенной беременности (ЗРП). а также при преждевременных родах уровень NOx, активность NOS напротив снижается, а активность аргиназы повышается.

2. В процессе физиологической беременности происходят значительные изменения в содержании изученных аминокислот околоплодных вод. Наиболее высокое содержание пролина и цитруллина наблюдается к 15-ой неделе гестации, а аргинина - к 20-23 неделям.

При осложненном течении беременности содержание аминокислот существенно изменяется относительно контрольных показателей. Концентрация аргинина повышается, а цитруллина снижается при всех изученных вариантах развития осложненной гестации и на всем её протяжении, что свидетельствует о неспецифичности данных изменений. Динамика содержания пролина имеет некоторые особенности: при ЗРП (в 15-27 нед. и 39-40 нед.), ПН (15-27нед.) и преждевременных родах (35-37 нед.) уровень пролина снижается, а у женщин с ПН, доносивших беременность (39-40 нед.) - повышается.

3. Содержание ONOO" в амниотической жидкости при физиологической беременности наиболее высоко в третьем триместре, тогда как содержание N0-тирозина в этот период гестации снижено.

Осложненная беременность сопровождается значительными изменениями содержания ONOO", NO-глутатиона и NO-тирозина в околоплодных водах. Наибольшее увеличение продукции отмечалось для ONOO" при ПН в сроки 15-27 недель. При осложненной, но доношенной беременности (39-40 нед.). а также при преждевременных родах наблюдается аналогичная динамика, но максимальные изменения отмечалются для NO-глутатиона (при ЗРП и преждевременных родах).

4. В плодных оболочках в процессе развития физиологической беременности содержание аминокислот увеличивается и к концу гестации превышает их концентрацию в околоплодных водах в среднем в 2 раза.

При осложненной беременности имеет место снижение содержания аргинина и пролина в плодных оболочках при всех указанных патологиях и повышение содержания цитруллина.

5. При ЗРП и преждевременных родах в плодных оболочках наблюдается уменьшение уровня NOx и активности NOS, а также повышение активности аргиназы. Противоположная динамика обнаружена для указанных показателей при ПН: содержание NOx и активность NOS повышены, а активность аргиназы -снижена относительно соответствующих контрольных величин.

6. В плодных оболочках продукция ONOO" и NO-тирозина повышена при всех

указанных осложнениях беременности, особенно при преждевременных родах

(содержание ONOO" увеличено в 2 раза, а NO-тирозина - в 1,5 раза). Обратная

динамика наблюдается для NO-глутатиона: его уровень снижен при всех

осложнениях беременности.

Список работ, опубликованных по теме диссертации в изданиях, рекомендованных ВАК РФ

1. Никашина A.A. Определение содержания L-аргинина в амниотической

жидкости методом капиллярного электрофореза / Нарежная Е.В., Аскалепова О.И., Никашина A.A., Крукиер И.И., Погорелова Т.Н. // Аналитическая химия, 2010, Т. 65, № 12. С.1309-1312 (0,16 пл., лич. вкл. 75%).

2. Никашина A.A. Прогностическое значение определения содержания аргинина и пролина в околоплодных водах при задержке роста плода / Крукиер И.И., Нарежная Е.В., Авруцкая В.В., Никашина A.A. // Известия ВУЗов, СевероКавказский регион. Естественные науки, 2011, № 3. С.95-98 (0,16 пл., лич. вкл. 75%).

3. Никашина A.A. Определение свободных форм L-аргинина и L-пролина в амниотической жидкости / Нарежная Е.В., Аскалепова О.И., Крукиер И.И., Погорелова Т.Н., Никашина A.A. // Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии, 2011, №1. С.48-50 (0,12 п.л., лич. вкл. 65%).

4. Никашина A.A. Количественное определение L-пролина в биологическом материале методом капиллярного зонного электрофореза / Нарежная Е.В.,

Аскалепова О.И., Крукиер И.И., Авруцкая В.В., Никашина A.A. // Клиническая лабораторная диагностика, 2011, № 1. С.7-9 (0,12 п.л., лич. вкл. 60%).

5. Никашина A.A. Нарушение метаболизма аминокислот в околоплодных водах при акушерской патологии / Крукиер И.И., Нарежная Е.В., Авруцкая В.В., Никашина A.A., Леонова A.B. // Проблемы репродукции, специальный выпуск, Москва, 2012. С.38-39 (0,04 п.л., лич. вкл. 80%).

6. Никашина A.A. Активность свободнорадикальных процессов в сыворотке крови женщин с беременностью высокого риска / Никашина A.A., Крукиер И.И., Кудаев А.Е., Ходарева Н.К., Круглова C.B. // Медицинский вестник Юга России, 2013, № 4. С. 115-118 (0,16 п.л., лич. вкл. 90%).

7. Никашина A.A. Определение уровня L-цитруллина в амниотической жидкости у женщин с физиологической беременностью методом капиллярного электрофореза / Нарежная Е.В., Крукиер И.И., Авруцкая В.В., Никашина A.A., Серкова C.B. // Клиническая лабораторная диагностика, 2013, №11. С.39-41 (0,12 п.л., лич. вкл. 75%).

8. Никашина A.A. «Способ диагностики задержки роста плода» / Крукиер И.И., Погорелова Т.Н., Авруцкая В.В., Нарежная Е.В., Никашина A.A., Друккер H.A. // Патент№2425379, от 26.03.2010г.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

9. Никашина A.A. Применение метода капиллярного зонального электрофореза для определения L-аргинина в биологических жидкостях / Нарежная Е.В., Никашина A.A., Крукиер И.И., Погорелова Т.Н. //Материалы V Международной конференции по новым технологиям и приложениям современных физико-химических методов для изучения окружающей среды. Ростов-на-Дону, 2009. С. 95 (0,04 п.л., лич. вкл. 70%).

10. Nikashina A.A. Strengthening of the peroxynitrite placental production in the process of gestosis development / Pogorelova T.N., Gunko V.O., Drukker N.A., Krukier I.I., Nikashina A.A. // «Reactive oxygen species, nitric oxide, antioxidants and human health», Smolensk, 2009. P.143-144 (0,04 п.л., лич. вкл. 65%).

11. Никашина A.A. Динамика продукции пероксинитрита в околоплодных водах при задержке роста плода / Крукиер И.И., Погорелова Т.Н., Авруцкая В.В., Никашина A.A., Зайцева Н.Г. // Материалы IV Ежегодного конгресса специалистов

перинатальной медицины «Современная перинатология: организация, технологии и качество», Москва, 2009. С.33-34 (0,04 пл., лич. вкл. 60%).

12. Никашина А.А. Окислительная модификация биомолекул в сыворотке крови и околоплодных водах женщин - показатель метаболомных нарушений в системе мать-плод / Крукиер И.И., Никашина А.А., Лигидова А.С., Рожков А.В. // Материалы IX межвузовской конференции с международным участием «Обмен веществ при адаптации и повреждении», Ростов-на-Дону, 2010. С.68-69 (0,04 п.л., лич. вкл. 75%).

13. Никашина А.А. Интенсивность свободнорадикального окисления в сыворотке крови и околоплодных водах при невынашивании беременности / Никашина А.А., Крукиер И.И., Дубровина С.О., Маюпок A.M. // Материалы 3-го научно-практического симпозиума с международным участием «Свободно-радикальная медицина и антиоксидантная терапия», «Кислород и антиоксиданты», Волгоград, 2010, № 2. С.59-60 (0,04 п.л., лич. вкл. 85%).

14. Никашина А.А. Новые критерии диагностики задержки роста плода / Крукиер И.И., Авруцкая В.В., Никашина А.А., Нарежная Е.В. //Материалы XI Всероссийского научного форума «Мать и дитя», Москва, 2010. С.111-112 (0,04 п.л., лич. вкл. 85%).

15. Никашина А.А. Клинико-диагностическое значение определения активности свободно-радикальных процессов в оценке беременности высокого риска / Крукиер И.И., Авруцкая В.В., Никашина А.А., Рожков А.В. //Материалы VII Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Молекулярная диагностика-2010», Москва, 2010, Т. 3. С. 312-314 (0,12 п.л., лич. вкл. 65%).

16. Nikashina А.А. Determination of L-arginine in amniotic fluid by capillary zone electrophoresis / Narezhnaya E.V., Askalepova O.I., Nikashina A.A., Krukier I.I., Pogorelova T.N. // Journal of Analytical Chemistry, 2010, Vol.65, №12. P.1280-1283 (0,16 пл., лич. вкл. 65%).

17. Nikashina А.А. Free radical processes of membranes placenta and fetal membranes in placental insufficiency / Krukier I.I., Nikashina A.A., Degtyareva A.S., Rozhkov A.V. // «Reactive oxygen species, nitric oxide, antioxidants and human health», Smolensk, 2011. P. 105-106 (0,04 пл., лич. вкл. 85%).

18. Никашина A.A. Продукция ангиогенных факторов роста в плодных оболочках и ее роль в формировании осложненной беременности / Крукиер И.И., Авруцкая В.В., Нарежная Е.В., Никашина A.A. // Материалы конференции «Биохимия-биофизика-информатика - три кита лабораторной медицины XXI века», научно-практический журнал «Клинико-лабораторный консилиум», Санкт-Петербург, 2011, №3(39). С.65-66 (0,04 пл., лич. вкл. 70%).

19. Никашина A.A. Динамика системы аргинип-МО-пероксинитрит в плаценте и околоплодных водах при осложненной беременности / Крукиер И.И., Авруцкая В.В., Нарежная Е.В, Никашина A.A., Дегтярева A.C., Норец С.Н. // Материалы V Регионального Научного Форума «Мать и дитя», Геленджик, 2011. С.74-75 (0,16 пл., лич. вкл. 85%).

20. Никашина A.A. Особенности продукции вазоактивных веществ и компонентов их регуляции в околоплодных водах, плодных оболочках при преждевременных родах / Крукиер И.И., Авруцкая В.В., Нарежная Е.В., Никашина A.A. // Материалы XII Научного Форума «Мать и дитя», Москва, 2011. С.104 (0,04 пл., лич. вкл. 85%).

21. Никашина A.A. Факторы роста в плаценте и плодных оболочках и их значение в формировании осложненной беременности / Дегтярева A.C., Крукиер И.И., Авруцкая В.В., Никашина A.A. //Материалы XIII Всероссийского научного форума «Мать и дитя», Москва, 2012. С.40-41 (0,04 пл., лич. вкл. 65%).

22. Никашина A.A. Предотвращение инвалидизации детей путем диагностики внутриутробного поражения ЦНС плода и новорожденного / Некрасова М.Г., Боброва С.Г., Никашина A.A. // Молодежный инновационный конвент Ростовской Области 2012 (I место в номинации «лучший инновационный проект»).

23. Никашина A.A. Диагностическая ценность определения уровня аминокислот при осложненной гестации / Авруцкая В.В., Крукиер И.И., Дегтярева A.C., Рожков A.B., Никашина A.A. // Материалы II Всероссийского междисциплинарного образовательного конгресса «Осложненная беременность и преждевременные роды: от вершин науки к повседневной практике», Москва, 2013. С. 35-36 (0,08 пл., лич. вкл. 75%).

24. Никашина A.A. Оценка эффективности определения аргинина и пролина в диагностике осложненной беременности / Никашина A.A., Дегтярева A.C., Крукиер

И.И., Нарежная E.B. // Материалы XII региональной научно-практической конференции с международным участием «Обмен веществ при адаптации и повреждении», Ростов-на-Дону, 2013. С.50-51(0,04 пл., лич. вкл. 90%).

25. Никашина A.A. Соотношение аргинина и его производных в плаценте и околоплодных водах при беременности с высокой степенью перинатального риска / Крукиер И.И., Нарежная Е.В., Авруцкая В.В., Дегтярева A.C., Никашина A.A., Михайлова Е.А. // Материалы XIV Всероссийского научного форума «Мать и дитя», Москва, 2013. С.97-98 (0,08 пл., лич. вкл. 75%).

26. Никашина A.A. Роль свободнорадикальных процессов в диагностике угрозы прерывания беременности / Крукиер И.И., Кудаев А.Е., Ходарева Н.К., Дегтярева A.C., Никашина A.A., Круглова C.B. //Материалы международной научно-практической конференции «Свободные радикалы и антиоксиданты в химии, биологии и медицине», Новосибирск, 2013. С. 144-145 (0,08 пл., лич. вкл. 75%).

Подписано в печать 7.07.2014 г. Заказ № 3686. Тираж 100 экз. Формат 60x84 '/,6. Печ. лист 1,0. Уч.изд.л.1,0.

Отпечатано в отделе полиграфической, корпоративной и сувенирной продукции Издательско-полиграфического комплекса КИБИ МЕДИА ЦЕНТРА ЮФУ 344090, г. Ростов-на-Дону, пр. Стачки, 200/1, тел (863) 247-80-51.

Список использованных сокращений:

NO, - Метаболиты оксида азота N02\ N03"' Arg - L-аргинин

NOS - NO-синтаза ПН — Плацентарная недостаточность ЗРП - Задержка роста плода ONOO" - Пероксинитрит

Pro - L-пролин Cit - L-цитруллин

ТФР-р - Трансформирующий фактор роста Р

АФК - Активные формы кислорода

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Никашина, Анастасия Александровна, Ростов-на-Дону

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ «РОСТОВСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ АКУШЕРСТВА И ПЕДИАТРИИ» МИНИСТЕРСТВА ЗДРАВООХРАНЕНИЯ

РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

04-2014609|р

На правах рукописи

Никашина Анастасия Александровна

Цикл оксида азота и его регуляция в околоплодных водах и плодных оболочках при физиологической и осложненной беременности

03.01.04 - биохимия

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: д.б.н. И.И. Крукиер

Ростов-на-Дону 2014

ОГЛАВЛЕНИЕ

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ 4

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 11

1.1 Околоплодные воды и их роль в обменных процессах, 11 происходящих в системе «матъ-плацента-плод»

1.1.1. Аминокислотный состав околоплодных вод 14

1.1.2. Вазоактивные компоненты околоплодных вод и их 21 роль в процессах репродукции

1.1.3. Производные оксида азота и их роль в 26 репродуктивных процессах

1.2 Плодные оболочки: краткая характеристика основных 31 свойств и их роль в процессах репродукции

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 35

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ 45

И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3.1.Оксид азота, активность ЫО-синтазы и аргиназы в 45

околоплодных водах в разные периоды физиологической и осложненной беременности

3.2. Уровень аргинина, пролина и цитруллина околоплодных 55

вод в разные сроки физиологической и осложненной беременности

3.3 Свободнорадикальные процессы околоплодных вод в 72 разные сроки физиологической и осложненной беременности

3.4. Плодные оболочки и их роль в параплацентарном обмене 81

между организмами матери и плода

3.4.1. Уровень аргинина, пролина и цитруллина в плодных 82 оболочках при физиологической и осложненной беременности

3.4.2. Содержание оксида азота, активность ЫО-синтазы и 87 аргиназы в плодных оболочках при физиологической и

осложненной беременности

3.4.3 Свободнорадикальные процессы в плодных оболочках 90

при физиологической и осложненной беременности

ЗАКЛЮЧЕНИЕ 95

ВЫВОДЫ 111

УКАЗАТЕЛЬ ЛИТЕРАТУРЫ 113

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АФК Активные формы кислорода

ЗРП Задержка роста плода

ИЛ Интерлейкины

ПН Плацентарная недостаточность

ПОЛ Перикисное окисление липидов

ТФР-ß Трансформирующий фактор роста ß

ФНО- а Фактор некроза опухоли а

ЭОП Электроосмотический поток

arg L-Аргинин

pro L-Пролин

cit L-Цитруллин

NOx Метаболиты оксида азота

NOS NO-синтазы

ONOO" Пероксинитрит

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Околоплодные воды являются сложной, биологически активной средой, обеспечивающей наряду с другими факторами нормальную жизнедеятельность плода.

Известно, что плодные оболочки — это не просто резервуар для околоплодных вод, а ткань, которая вместе с ними обеспечивает дополнительный параплацентарный обмен между матерью и плодом (Радзинский В.Е. и др., 2001; Орлов В.И. и др., 1998).

Немногочисленны данные о роли околоплодных вод и плодных оболочек в динамике регуляторных процессов и как посредников передачи информации от материнского организма к плоду и от плода к матери при физиологической и осложненной беременности.

Очевидность важной роли околоплодных вод и плодных оболочек при внутриутробном развитии эмбриона и плода не вызывает сомнения, однако представление о многих метаболических процессах в этих биологических средах нуждаются в дальнейшем исследовании.

осуществляется при участии гемсодержащих белков, способных связывать кислород. При отсутствии последнего или его дефиците восстановленные гемсодержащие белки начинают переносить электроны на ионы NO2, восстанавливающиеся в свою очередь в оксид азота.

Такая множественность эффектов N0 в цикле оксида азота объясняется большим количеством продуктов его метаболизма, которые приводят к различным биологическим эффектам, что позволило называть его «дву- или даже многоликим Янусом» (Snyder S.H., 1993; Thippeswamy Т. et al., 2006). Поэтому до сих пор возникают многочисленные вопросы о причине «многоликости» оксида азота, на которые до сих пор нет определенного ответа.

Кроме указанных свойств, NO обладает выраженным вазодилататорным эффектом, что объясняет, как указывалось выше, широкий спектр биорегуляторного действия этой молекулы, а когда его физиологические функции изменяются на цитотоксические (при взаимодействии N0 с супероксиданионом) образуется пероксинитрит.

Поскольку образование NO в организме лимитируется активностью NO-синтазы (КФ 1.14.13.39), важным представляется изучение этого фермента в околоплодных водах и плодных оболочках.

Несмотря на многочисленные биохимические исследования последних лет, посвященные механизмам формирования различных осложнений беременности (в том числе преждевременных родов), ряд ключевых реакций регуляции, прежде всего, белкового обмена в плодных оболочках и околоплодных водах остаются практически не изученными. К их числу относится аминокислотный состав указанных биологических сред. Известно, что основной путь обмена аминокислот между матерью и плодом происходит через плаценту (Погорелова Т.Н., 1984), однако возможен параплацентарный транспорт через плодные оболочки и поглощение аминокислот плодом с околоплодными водами (Орлов В.И. и др., 1998; 2009).

Важная роль аминокислот, в значительной степени определяется интенсивностью обмена белков, подвергаясь многочисленным реакциям дезаминирования, переаминирования, декарбоксилирования и др. превращениям, они участвуют в поддержании и изменении функционального состояния органов при физиологических и патологических состояниях.

В настоящее время часто упоминаемой в литературе аминокислотой является L-аргинин, который, как известно, способен окисляться в организме с образованием одного из ключевых регуляторов клеточного метаболизма - оксида азота (Марков Х.М., 1996; 2000; Ignaro L. et al., 1999). Однако пути метаболизма L-аргинина не ограничиваются продукцией NO. Наибольшая скорость синтеза аргинина наблюдается в цикле мочевины (орнитинового цикла). От мощности работы цикла (орнитин-цитруллин-аргинин) зависит способность организма очищаться от белковых шлаков (Реутов В.П., Сорокина Е.Г. и др. 1998). Следует отметить, что цитруллин, являющийся сопродуктом оксида азота при окислении аргинина, способен вновь превращаться в аргинин и в настоящее время этот путь трактуется как цитруллинШО-цикл или аргинин/цитруллин-цикл (Morris S. et al., 1994).

Аргинин является одним из самых эффективных стимуляторов продукции соматотропного гормона гипофиза (гормона роста) и позволяет поддерживать его концентрацию на верхних границах нормы, а недостаток его приводит к замедлению роста детей (Чернобровкин М.Г. и др., 2004).

Концентрация аргинина зависит от активности аргиназы, которая превращает его в орнитин и мочевину. Аргиназа (КФ 3.5.3.1.) -регуляторный фермент, определяющий доступность аргинина для синтеза оксида азота, пролина и глутамата, а также полиаминов (спермина, спермидина и др.). Аргиназа в процессе сложных ферментативных реакций обеспечивает также и синтез пролина, который в большом количестве содержится в коллагене - основном белке соединительной ткани.

В связи с вышеизложенным целью исследования явилось: изучение особенностей становления цикла оксида азота и компонентов его регуляции в околоплодных водах и плодных оболочках при физиологической и осложненной беременности.

Задачи исследования:

1. Оценить продукцию оксида азота и активность ЫО-синтазы в околоплодных водах и плодных оболочках в разные сроки физиологической и осложненной беременности.

4. Оценить активность аргиназы в плодных оболочках и околоплодных водах в разные сроки физиологической и осложненной гестации.

5. Разработать объективные критерии для оценки состояния плода и прогноза состояния новорожденного.

Научная новизна

Впервые:

- получены новые сведения о содержании оксида азота, активности N0-синтазы и аргиназы в околоплодных водах и плодных оболочках в процессе формирования физиологической гестации и их дисбалансе при развитии различных осложнений беременности;

- проведено сравнительное изучение динамики содержания аргинина и его производных (пролина и цитруллина), участвующих в регуляции клеточных процессов в плодных оболочках и околоплодных водах в разные периоды физиологической и осложненной гестации;

- установлены коэффициенты между изученными аминокислотами в околоплодных водах при различных осложнениях беременности, что позволило разработать способ прогнозирования задержки роста плода (патент № 2425379, 2010);

- показано, что плацентарная недостаточность, обусловливающая многие осложнения беременности, развивается на фоне усиления свободнорадикальных процессов в околоплодных водах и плодных оболочках.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Физиологическое течение беременности сопровождается значительными изменениями продукции оксида азота, активности N0-синтазы и аргиназы, а также изученных аминокислот (аргинина, пролина, цитруллина), в околоплодных водах. В разные периоды гестации, степень этих изменений, направленных на создание оптимальных условий для развития плода, различна.

2. Осложненная беременность (ПН, ЗРП, преждевременные роды) развивается на фоне дисбаланса в околоплодных водах уровня аминокислот

(аргинина, пролина, цитруллина), оксида азота и активности ЫО-синтазы и аргиназы. Наиболее выраженные изменения имеют место при преждевременных родах.

3. Увеличение продукции производных оксида азота (пероксинитрита, 1\Ю-глутатиона и ЫО-тирозина) околоплодных вод, сопровождающееся усилением свободнорадикальных реакций, является одним из механизмов негативного влияния данных процессов, приводящих к ухудшению течения гестации.

4. Модификация продукции оксида азота, изученных аминокислот, а также активности ферментов их обмена и свободнорадикальных реакций в плодных оболочках свидетельствует об их участии в координации процессов параплацентарного обмена между матерью и плодом.

Теоретическое и практическое значение работы

Выполненные биохимические исследования расширяют существующие представления о роли оксида азота и продуктов его метаболизма - некоторых аминокислот (аргинина, пролина, цитруллина) и других биоактивных компонентов в процессе нормального развития беременности и формировании плацентарной недостаточности, являющейся одним из наиболее распространенных осложнений гестации.

Полученные в работе данные создают теоретические предпосылки для коррекции метаболических нарушений в системе «мать-плацента-плод», особенно в те периоды гестации, в которые установлены наиболее значительные биохимические нарушения в плодных оболочках и околоплодных водах.

В результате проведенных исследований разработан информативный критерий для диагностики задержки роста плода (по отношению аргинин/пролин в околоплодных водах, патент № 2425379, 2010), который

внедрен в практику (в родильном отделении ФГБУ «Ростовский НИИ акушерства и педиатрии» Минздрава России).

Материалы диссертации используются в лекционных курсах на кафедре акушерства, а также на семинарах по повышению квалификации врачей Учебного центра ФГБУ «РНИИАП» Минздрава РФ.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 142 странице машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов исследования и их обсуждения, выводов и списка литературы, включающего 145 отечественных и 135 иностранных источников. Работа иллюстрирована 22 таблицами и 19 рисунками.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Околоплодные воды и их роль в обменных процессах,

происходящих в системе «мать-плацента-плод»

Околоплодные воды, или амниотическая жидкость - биологически активная среда, выполняющая самые разнообразные функции и обеспечивающая нормальное функционирование системы «мать-плацента-плод» (Орлов В.И. и др., 1998; 2009; Радзинский В.Е. и др., 2004).

В основном околоплодные воды являются сложной и динамичной биологической жидкостью, которая в ходе эмбриогенеза первоначально формируется из материнской плазмы и представляет собой секрет амниотического эпителия, продукты обмена, выделяемые почками и легочной тканью плода и собственно фильтрат плазмы крови матери (Dawn C.S., 2007). Одним из источников образования околоплодных вод считается пассивная транссудация из крови матери, так и транссудация, происходящая под влиянием биологических механизмов в соответствии с осмотическим и гидростатическим градиентом и разностью потенциалов (Радзинский В.Е. и др., 1993).

Околоплодные воды характеризуются высокой скоростью обмена, совершаемого через амнион и хорион (в течение часа обменивается третья часть вод, полный их обмен происходит в течение 3 часов, а всех растворенных в них веществ - за 5 суток) (Айламазян Э.К., 2003).

Удельный вес околоплодных вод варьирует от 1,006 (ранние сроки) до 1,081 (поздние сроки), вязкость - 1,10-1,26, поверхностное натяжение 46,350,6 дин/см. Анализ поверхностного натяжения околоплодных вод в родах показал, что повышение этого показателя может быть использовано для прогнозирования у новорожденного респираторных расстройств (Рудик Н.М., 1986).

В процессе развития беременности меняется и объем околоплодных вод. В нормальных условиях он возрастает по мере увеличения срока гестации. Так, объем околоплодных вод при 6-недельной беременности составляет всего 5 мл, в сроке 10 недель - 30 мл; к концу 20-й недели - 300 мл; к концу 30-й недели - 600 мл; к 38-й неделе - 1000 мл. Регуляция объема амниотической жидкости до сих пор не вполне ясна, предполагают, что в ней определенное значение имеет пролактин матери. Кроме того, важную роль играет сам плод, обеспечивая поступление амниотической жидкости за счет диуреза и деятельности его желудочно-кишечного тракта (Анастасьева В.Г., 1996).

В диагностике состояния внутриутробного плода особое значение приобретает измерение объема околоплодных вод. По данным литературы, измененное количество околоплодных вод наиболее характерно для плацентарной недостаточности (Савельева Г.М. и др., 1991). Определенная зависимоть выявлена между патологией беременности (перенашиванием, гестозом, гипотрофией плода, врожденными аномалиями развития) и вышеуказанным параметром.

Важная роль в обмене амниотической жидкости принадлежит так называемому параплацентарному пути, т.е. происходящему через внеплацентарную часть плодных оболочек (Савельева Г.М., 2000).

Околоплодные воды с биохимической точки зрения представляют собой коллоидный раствор сложного химического состава. В околоплодных водах представлены практически все вещества, которые присутствуют в крови матери и плода: электролитный состав, белки, липиды, углеводы, гормоны, ферменты, разнообразные биологически активные вещества, витамины (Айламазян Э.К., 2003).

Минеральные вещества околоплодных вод представлены ионами натрия, калия, кальция, магния, хлора, фосфора, железа, меди. Осмотическую концентрацию околоплодных вод, кроме минеральных веществ, обусловливают глюкоза и мочевина.

Околоплодные воды обладают способностью ускорять свертываемость крови, в них обнаружены специфические ферменты, катализирующие этот процесс, тромбопластин, факторы активации тромбоцитов и в то же время отсутствуют фибриноген, тромбин, протромбин, фибринолитическая активность.

Амниотическая жидкость укорачивает время рекальцификации плазмы, уменьшает ингибиторный эффект гепарина на процесс свертывания, обладает противокоагулянтной активностью, которая связана с содержанием в ней тромбопластина, коллагена и других, пока не идентифицированных фактор�

Информация о работе

Никашина, Анастасия Александровна
кандидата биологических наук
Ростов-на-Дону, 2014
ВАК 03.01.04

Диссертация

Цикл оксида азота и его регуляция в околоплодных водах и плодных оболочках при физиологической и осложненной беременности - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы