Изучение свойств белков Survivin, Smac/Diablo, J-chain человека и возможности их использования в качестве диагностических и терапевтических средств

Антипова, Надежда Викторовна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Изучение свойств белков Survivin, Smac/Diablo, J-chain человека и возможности их использования в качестве диагностических и терапевтических средств
ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Изучение свойств белков Survivin, Smac/Diablo, J-chain человека и возможности их использования в качестве диагностических и терапевтических средств"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК

Институт биоорганической химии им. академиков М.М, Шемякина и Ю.А. Овчинникова

На правах рукописи

АНТИПОВА НАДЕЖДА ВИКТОРОВНА

ИЗУЧЕНИЕ СВОЙСТВ БЕЛКОВ БШУШМ, ЯМАС/ШАВШ, .1-С1Ш\ ЧЕЛОВЕКА И ВОЗМОЖНОСТИ ИХ ИСПОЛ ЬЗОВАIII1Я В КАЧЕСТВЕ ДИАГНОСТИЧЕСКИХ И ТЕРАПЕВТИЧЕСКИХ СРЕДСТВ

03.01.03 - Молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

.1 7 НОЯ 2011

Москва-2011

005002590

Работа выполнена в группе мембранных биоэнергетических систем Учреждения Российской академии наук Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Научный руководитель:

доктор хим иче ских наук Шахпаронов Михаил Иванович

Официальные оппоненты:

Завриев Сергей Кириакович - д.б.н., профессор.

Бабаков Алексей Владимирович - д.б.н., профессор.

Ведущая научная организация - Государственное учреждение здравоохранения Московский научно-исследовательский институт медицинской экологии Департамента здравоохранения г Москвы.

СС

Защита диссертации состоится « 30 » ноября 2011 г. Вчасов на заседании диссертационного Совета Д 002.019.01 при Учреждении Российской академии наук Институте биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

по адресу: 117997, г. Москва, ул. Миклухо-Маклая д. 16/10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке

Учреждения Российской академии наук Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Автореферат разослан « » октября 2011 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета, доктор физ.-мат. наук

В.А.Олейников

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Онкологические заболевания являются одной из главных причин смертности. Проблема борьбы с раком, несмотря на мобилизацию всех достижений современной биологической науки и медицинской техники, остается далекой от решения. Прогнозируется, что к 2020 году число раковых больных возрастет до 16 млн. человек. Смертность от рака непрерывно увеличивается и приближается к 10 млн. человек в год, что составляет 15% всех смертных случаев. Приоритетное значение в области онкологии имеют исследования, направленные на раскрытие молехулярных механизмов злокачественного роста и разработку чувствительных методов диагностики, позволяющих обнаружить опухоль на ранних стадиях развития. В связи с недостаточной эффективностью традиционных методов лечения раковых заболеваний (химйо- и радиотерапия, хирургия и др.) необходимо развитие универсальной технологии, позволяющей выявлять экспрессируемые гены, кодируемые ими транскрипты и белки, представленные в одном типе клеток, но отсутствующие в другом, а именно в нормальных клетках и клетках, измененных вследствие различного рода наследственных и приобретенных патологий, включая опухолевую трансформацию.

Применение технологии полногеномной вычитающей гибридизации для получения дифференциальных транскриптов в сочетании с возможностями генной инженерии, бесклеточного синтеза белка и химического синтеза белков и пептидов позволяет трансформировать получаемую информацию о дифференциальных транскриптах в информацию о дифференциальных белках, создавая, таким образом, технологию дифференциальной протеомики, на базе которой возможно эффективное осуществление протеомного анализа, по результатам которого возможна разработка так называемых таргетных препаратов (от англ. target - мишень) - препаратов направленного действия, а также создание генотерапевтических препаратов и разработка сопутствующих диагностических систем.

Важным информативным показателем наличия опухолевого процесса является уровень опухолевых маркеров в сыворотке крови (Е.Р. Diamandis, 2002; Белохвостов A.C., 2003; Nakamura R.M., 2004).

В клинической онкологии онкомаркеры широко применяются для оценки эффективности терапии раковых больных, а некоторые из них играют важную роль в ранней диагностике злокачественных новообразований.

Описанные в данной работе исследования можно разделить на несколько этапов. Первый этап посвящен фундаментальным исследованиям изучения особенностей взаимодействия онкомаркера сурвивина с антиапоптозным белком Smac/Diablo.

Во второй части работы с использованием ранее полученных данных о диагностической значимости в онкологическом перерождении белков апоптоза, проведено получение рекомбинантного белка сурвивина и моноклональных антител к нему,

формирование и оценка значимости диагностической системы для определения этого белка в биологических образцах.

Третий этап описывает анализ содержания белка .Ьпептцаа в нормальных и опухолевых образцах различных тканей человека.

Представленные исследования являются частью работы в рамках проекта «Создание технологии дифференциальной протеомики и ее использование для получения новых противораковых препаратов». Номер контракта: 02.467.11.3006.

Цель и задачи работы

Целью диссертационной работы была оценка изменения уровня синтеза ряда белков, присущих опухолевым трансформациям, оценка их диагностического и терапевтического потенциала для выявления опухолей на ранних стадиях и прогноза течения опухолевого процесса.

В ходе работы были поставлены следующие задачи:

1. Изучить молекулярные основы взаимодействия сурвивина с ЗтасЛМаЫо, для этого:

- получить и очистить рекомбинантные белки сурвивин и 8тасЯ)1аЫо;

- получить моноклональные антитела к рекомбинантным белкам сурвивин и ЗтасЛМаЫо.

2. Использовать полученные моноклональные антитела для определения содержания дифференциальных белковых продуктов (сурвивин и 8шас/Б1аЫо) в клеточных линиях и опухолевых образованиях различных тканей больных и здоровых индивидуумов.

3. Изучить аналитические характеристики полученной тест-системы для определения белка сурвивин в биологических образцах в варианте двустадийного иммунофлуоресцентного анализа, как наиболее простого и технологически приемлемого для клинического использования. Оценить диагностическую перспективность полученной тест-системы.

4. Оценить уровень белка 1-пептида в образцах из различных тканей здоровых индивидуумов, при этом, используя полученные ранее поликлональные антитела, оценить так же содержание белка .Г-пептида в образцах из опухолевых образований различных тканей больных индивидуумов.

Научная новизна и практическая значимость работы

Универсальная технология дифференциальной протеомики является мощным инструментом для выявления различий в составе экспрессируемых генов, кодируемых ими транскриптов и белков, представленных в нормальных клетках и клетках, измененных вследствие различного рода наследственных и приобретенных патологий, включая опухолевую трансформацию. Полученные ранее библиотеки генов, дифференциально экспрессирующихся в нормальных и опухолевых тканях в виде набора упорядоченных дифференциальных клонов кДНК (более 2500 клонов), идентифицируют 179 генов с пониженной (примером может служить ген, кодирующий белок ^пептид, распределение которого изучается в данной работе) и 109 генов - с повышенной экспрессией в опухолях (к

ним относятся кодируемые дифференциально экспрессирующимися генами белки сурвивин и Smac/Diablo).

В данной работе нами были исследованы свойства белков-маркеров, относящихся к совершенно разным группам. Однако их объединяет один очень важный с нашей точки зрения факт - моментальный отклик при перерождении здоровой ткани в злокачественную опухоль. Совершенно очевидно, при диагностике какого-либо заболевания данная статистика увеличивается при выявлении как можно большего количества подобных факторов. Для этого в современной медицинской практике выявляются характерные изменения в структуре, свойствах и жизненном цикле белков-маркеров и кодирующих их генов. Особенно чувствителен к таким изменениям ключевой момент в жизни клетки, называемый апоптозом - запрограммированной гибелью клетки. В рамках данной работы проведен анализ уровня синтеза сурвивина и Smac/Diablo в различных биологических образцах, их функции и роль в опухолеобразовании. Доказано, что эти белки могут служить маркерами раковой трансформации и мишенями для противораковой терапии. Эти белки служат основой для разработки протеомных диагностикумов опухолей и выработки индивидуальных терапевтических рекомендаций, а также для прогноза течения опухолевого процесса.

Разработана методика иммуиохимической диагностики присутствия прогностических белков в тканевых образцах, пригодная для анализа большого объема данных по онкологическим больным, что позволяет создавать прогностические диагностикумы. Получен набор антител для определения уровня терапевтически значимых белков сурвивина и Smac/Diablo.

В данной работе было также исследовано взаимодействие сурвивина с проапоптозным белком Smac/Diablo. Ранее было показано, что в отличие от BIR домена XIAP, BIR домен сурвивина, экспресированный отдельно, неспособен связываться с белком Smac.

В рамках данной работы впервые продемонстрировано, что у Smac/Diablo с открытым IBM мотивом на N-концевой области возможна совместная активность с мономером сурвивина. Мы получили результаты, свидетельствующие о способности мономера сурвивина взаимодействовать с белком Smac/Diablo и отметили, что важен «участок димеризации» сурвивина. Исследование взаимодействия этих белков может в будущем оказаться полезным для создания противоопухолевых' препаратов, основанных на блокировании областей связывания между этими двумя белками.

Апробация работы

По теме диссертационной работы опубликованы 3 статьи в отечественных научных журналах, 1 статья в зарубежном журнале. Результаты работы представлены на российских и международных конференциях: XIII, XIV Международная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2006, 2007» (Москва, 2006, 2007); Зимняя молодежная научная школа «Перспективные направления физико-химической биологии» (Москва, 2007, 2008, 2010гг); FEBS congress(BeHa, 2007); Conference for young scientists, PhD students and students on molecular biology and genetics, Dedicated to 120th anniversary of

M.I.Vavilov (Киев, 2007); Десятая Всероссийская медико-биологическая конференция молодых исследователей "Человек и его здоровье" (С.-Петербург, 2007); 1-ая международная научная школа "Наноматериалы и нанотехнологии в живых системах" (Московская область -

2009); Международная конференция ИБХ, посвященная 75-летию Ю.А.Овчинникова (Москва, ИБХ, 2009), 14-ая Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология - Наука XXI века» ( Пущино, 2010); XVI Российский национальный конгресс «Человек и лекарство» ( г. Москва 2010 г); Всероссийская школа-семинар студентов, аспирантов и молодых ученых по направлению «Нанобиотехнология» (Белгород,

2010); VI Международная (XV Всероссийская) Пироговская научная медицинская конференция студентов и молодых учёных (Москва, 2011).

Структура диссертации

Диссертационная работа изложена wsJff? страницах и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, результатов и их обсуждения, основных выводов и списка цитируемой литературы, включающего//.-! ссылки. Диссертация содержит .if таблиц и Л рисунков.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Результаты исследования и их обсуждение Создание диагностикума для определения сурвивина в биологических образцах. кДНК гена, кодирующего сурвивин, полученную по ранее описанной методике Zhu Y.Y. и соавторов (2001) клонировали в экспрессионный вектор рЕТ28а с помощью эндонуклеаз рестрикции Sal 1 и Not I (Fermentas) в соответствии с рекомендациями производителя. На основе полученной экспрессионной конструкции из клеток E.coli BL21DE3 выделен и очищен рекомбинантный полноразмерный человеческий белок сурвивин. Уровень экспрессии целевого гена после индукции транскрипции, а также чистоту выделенного белка оценивали с помощью электрофореза в полиакриламидном геле в денатурирующих условиях (рис.1).

^•-г Рис. 1 Электрофорез по Лэммли в 15% ПААГ в

денатурирующих условиях. — А: лизат клеток E.coli, содержащих конструкцию

н^В 18,6 кДз рЕТ28а -сурвивин, без индукции транскрипции,

Б: лизат клеток E.coli, содержащих конструкцию рЕТ28а -сурвивин, с индукцией транскрипции; В: Очищенный рекомбинантный полноразмерный сурвивин.

В М М: Маркёры молекулярных масс белков.

Далее получали гибридные линии, продуцирующие моноклональные антитела против рекомбинантного сурвивина. Отбор гибридом проводили по двум критериям. Сначала отбирали линии клеток, продуцирующие моноклональные антитела с наибольшей аффинностью к рекомбинантному и эндогенному белкам. Аффинность оценивали методом

твердофазного иммуноферментного анализа по величине титра антител в культуральной жидкости. Для дальнейшей работы отбирали клеточные линии, в культуральных жидкостях которых титр антител был 1:100. С помощью иммуноблотгинга была отобрана гибридная линия клеток, продуцирующая антитела, узнающие различные природные изоформы сурвивина, которые образуются в клетке в результате альтернативного сплайсинга (рис.2).

. «__. ЧВЯЯ* .

А431 Н358 Н1299 Н460 Н566 Н293 HELA НТ1080 Рис. 2. Результат иммунодетекции образцов лизатов клеточных линий, полученный с помощью выбранных моноклональных антител. Электрофорез в 15%ном ПААГ проводит по Леммли.

Полученные моноклональные антитела относятся к классу IgG 1 и взаимодействуют с эпитопом общим для нескольких изоформ сурвивина (рис.2). Определение сурвивина в лизатах клеточных линий человека было использовано для стандартизации диагностической системы, подбора условий проведения эксперимента с образцами тканей и оценки воспроизводимости результатов внутри одного анализа и между анализами.

Образец для определения белков готовили следующим образом: на первой стадии эксперимента исследуемый образец обрабатывали лизирующим буфером с NP40 с 5-ти кратным замораживанием и оттаиванием, в результате чего происходило разрушение клеточных структур. Фракцию, содержащую белки, отделяли центрифугированием. Вторая стадия заключалась в сорбции белков лизата, а также контрольного образца рекомбинантного белка сурвивина на поверхность лунок полистирольного планшета. Далее проводилась детекция иммобилизованного езрвивина по методу ИФА. Содержание сурвивина в исследуемых препаратах определяли по калибровочной зависимости оптической плотности раствора от содержания белка и, соответственно, антител к нему.

По аналогичному принципу создавалась и тест-система для определения в образцах тканей белка Smac/Diablo. Интерес к нему вызван обнаруженным цитотоксическим и противоопухолевым эффектом белка Smac/Diablo, в том числе и посредством воздействия его на активность сурвивина(Агп1 C.R., 2002; Checinska А., 2007; Pctrucci Е., 2007; Мао H.L., 2007). Исходя из этого, представлялось интересным создание тандемной тест-системы на основе моноклональных антител к сурвивину и белку Smac/Diablo.

Вектор, несущий ген белка Smac, был любезно предоставлен Н.А.Вайшлей (ЛСФГЧ, УРАН ИБХ). Далее ген был клонирован в экспрессионный вектор рЕТ28а. На основе полученной экспрессионной конструкции из клеток E.coli BL21DE3 выделен и очищен методом металлоаффинной хроматографии рекомбинантный полноразмерный человеческий белок Smac/Diablo. Уровень экспрессии целевого гена после индукции транскрипции оценивали с помощью электрофореза в ПААГ в денатурирующих условиях (рис.3).

В полиакриламидном геле по указанной методике Smac имеет массу 21 кДа, что соответствует мономерной форме этого белка (эндогенный Smae/Diablo крайне редко существует в виде мономера, чаще всего в виде димера или олигомера (Chai J, 2000)).

Рис.3. Электрофореграмма, демонстрирующая рекомбинантный Smac/Diablo в составе лизата клеток Е.соН BL21DE3 в ПЛАТ в денатурирующих условиях.

А: лизат клеток, не содержащих конструкцию рЕТ 28а- Smac, с индукцией ИПТГ;

Б: лизат клеток, содержащих конструкцию рЕТ28 a- Smac/Diablo, без индукции ИПТГ; В: лизат клеток Е. coli, содержащих конструкцию рЕТ28а - Smac/Diablo с индукцией ИПТГ.

М: Маркёры молекулярных масс белков. Далее были получены гибридные линии, продуцирующие моноклональные антитела против рекомбинантного белка. Аффинность оценивали методом твердофазного иммуноферментного анализа по величине титра антител в культуральной жидкости.

Методом твердофазного иммуноферментного анализа были исследованы лизаты клеточных линий. Различий в содержании Smac/Diablo в клеточных линиях не обнаружено, отсутствует также корреляция между содержанием данного белка и сурвивина (рис.4).

Рис 4. Гистограмма, отражающая результаты

определения белков сурвивина и Smac/Diablo в лизатах клеточных линий u Smac/Diablo в лизатах клеточных линий с помощью полученных тест-систем. По оси ординат - оптическая плотность при 492нм.

Тем не менее, Smac/Diablo является прямым ингибитором сурвивина в живых системах. Поэтому полученные рекомбинантные белки Smac/Diablo и сурвивин, а также антитела к ним, могут быть применены в качестве терапевтических инструментов именно в тандеме и легли в основу тест-системы «Пептосурвим». Результаты проведенной работы показали, что созданная диагностическая система «Пептосурвим» имеет клинический потенциал, характеризует исследуемые образцы с большой точностью и воспроизводимостью и проста в проведении анализа. Пробный вариант тест-системы «Пептосурвим» выпущен в виде набора.

С помощью набора «Пептосурвим» были исследованы соскобы эндометрия, полученные в результате раздельного диагностического или лечебно-диагностического выскабливания матки у 80 женщин, поступивших в гинекологическое отделение ГКБ№33 им. А.А. Остроумова: I группа - 15 пациенток, у которых, по данным гистологического исследования, патологии эндометрия не выявлено, I) группа - 20 женщин с гиперплазией эндометрия (простая и сложная без атипии), III группа - 15 человек с простой и сложной гиперплазией эндометрия с атипией, IV группа - 20 пациенток с высокодифференцированной аденокарциномой эндометрия, V группа - 10 больных с полипами эндометрия. Результаты представлены в виде таблицы I.

Таблица 1. Результаты определения относительного количества белка сурвивина и белка 8тас в исследуемых образцах эндометрия.

Группа Суммар Титр антител к Отношение Титр антител Отношение

НЫЙ сурвивину кол-ва к 8тас/01аЫо кол-ва

белок в сурвивина 8тасЛЭ1аЫ

образце, * 10"6 на мг о * 106 на

мг/мл суммарного белка мг суммарног о белка

I 2.5 0.400 ±0.006 20+0.5 1.107+0.05 75±4

и 2.5 0.80±0.02 30±2 0.90 ±0.04 68±2

III 2.5 0.760±0.046 30+4 1.00±0.03 72.0±2.6

IV 2.5 1.2+0.1 60±3.2 1.16+0.04 77.00+3.45

V 2.5 0.700+0.008 40.0+1.8 1.05±0.02 74.00 ±2.43

Выявлено присутствие сурвивина в незначительном количестве в нормальном неизмененном эндометрии. Существенной разницы в изменении уровня сурвивина между патологическими состояниями не выявлено. Однако в образцах с аденокарциномой эндометрия наблюдается наиболее значительное увеличение количества этого белка относительно нормы, что еще раз подтверждает его возможное участие в онкологическом перерождении.

Важное клиническое значение гиперплазии заключается в том, что она может предшествовать развитию аденокарциономы эндометрия или сопутствовать этой патологии. Это отчетливо прослеживается по повышению онкомаркера сурвивина в группе IV, по сравнению с остальными. Дополнительные факторы, в сочетании с которыми гиперплазия эндометрия трансформируется в рак эндометрия, до сих пор полностью не изучены (СЬсстэка А, 2007). По-видимому, одним из таких факторов является повышенный синтез белка сурвивина, и, как следствие, устойчивость патологических очагов эндометрия к апоптозу. Нарушение процесса апоптоза может быть связано также с изменением синтеза природных антагонистов сурвивина, участвующих в регуляции этого процесса (Н. А. Вайшля, 2007).

Особенности взаимодействия онкомаркера сурвивина с белком Smac/Diablo.

Следующим этапом представленной работы было исследование роли мономерной молекулы сурвивина в регуляции апоптоза. Для этого нами был выбран описанный ранее мутант сурвивина с заменой 101 ой и 102ой аминокислот - сурвивин?101АЛЛ02Л Работы Dieuwke Engelesma, 2007, показали, что 101 и 102 аминокислоты необходимы для димеризации сурвивина, но при этом они находятся вне последовательности ядерного экспорта (NES) и их замена не ухудшает экспорт сурвивина из ядра. Более того, мономер сурвивина подвергается даже более активному транспорту из ядра, так как он значительно лучше взаимодействует с экспортным рецептором CRM1. Важно отметить, что 101 и 102 аминокислотные остатки находятся вне высоко консервативного BIR домена. Ранее Jeyaprakash A.A. и соавторы в 2007г. установили: димеризация сурвивина происходит благодаря тому, что Leu98 одной молекулы входит в гидрофобный карман образованный Leu6, TrplO, Phe93, PhelOl и Leul02 другой молекулы. Как показано Dieuwke Engelesma замена PhelOl и Leul02 на Ala приводит к разрушению этого гидрофобного кармана. Чтобы окончательно убедиться в том, чл» сурвивин™|А/1*|02А в растворе действительно существует в виде мономера, мы экспрессировали в E.coli рекомбинантный сурвивин дикого типа (WT) и сурвивинр""А/и02А и определяли их молярную массу с помощью гель-фильтрации (рис.5). Для сурвивина WT и сурвивинаР1°'Аи02А измеренная нами молекулярная масса лежит в диапазоне 30-40 кДа и 10-20 кДа соответственно. Полученные значения близки к расчётной массе димера и мономера сурвивина (37 и 18кДа, соответственно).

Рис. 5. Гель - фильтрационный профиль рекомбинантного

сурвивина дикого типа (синий) или cypeueuHaF""A/L,02A (зелёный), а также маркёров молекулярных масс (красный): BSA (ббкДа) и RNaseA (14кДа).

Эти результаты полностью подтверждают данные, полученные В1еи\уке Егщекэта вместе с тем убедительно доказывают, что сурвивинр""А/и02А не может образовывать гомодимерные молекулы. Необходимо отметить, что хотя при гель-фильтрации сурвивина дикого типа было обнаружено, что одновременно с димером сурвивина небольшая (около 5%) часть белка находится в растворе в виде мономера, это соответствует выводам МисЬтоге Э.Ш, 2000. Ещё более важным мы считаем то, что до сих пор неизвестно, какой процент сурвивина дикого типа внутри живой клетки находится в виде димера, а какой в виде мономера.

Мономер сурвивина in vitro и in vivo способен взаимодействовать с белком Smac/Diablo.

Как упоминалось выше, сурвивин может защищать клетку от апоптоза по нескольким механизмам. В первую очередь мы решили исследовать участие мономера сурвивина в наиболее изученном из этих механизмов, а именно, в ингибировании им проапоптозного белка Smac/Diablo. Зрелый Smac/Diablo (с отщепленной последовательностью митохондриальной локализации 1-55 а.к.) способен взаимодействовать с сурвивином благодаря тому, что в его N-концевой области находится IBM (LAP Binding Motif)-терминальный тетрапептид AVPI-, поэтому некоторые проапоптозные белки способны связываться с BIR доменом IAP и ингибировать их активность (Srinivasula S.M с соавторами, 2008). Сурвивин может конкурировать с другими белками семейства IAP (Inhibitor of Apoptosis Protein) за связывание со Smac/Diablo и таким образом затруднять ингибирование этих белков белком Smac/Diablo (McNeish I.A., 2005). Удаление IBM приводит к отсутствию взаимодействия между сурвивином и Smac/Diablo (McNeish I.A., 2005; Song Z., 2003). Для того чтобы определить, способен ли мономер сурвивина связываться с белком Smac/Diablo in vitro, в E.coli экспрессировали рекомбинантный зрелый 'Smac/Diablo и A63Smac/Diablo (зрелый Smac/Diablo без первых 8 аминокислот, то есть не имеющий IBM) и использовали эти белки для «pull-down assay» с рекомбинантным сурвивином дикого типа или сурвивиномр10|АУи02л, иммобилизованными на протеин-G сефарозе с помощью антител к сурвивину. Как видно из рисунка 6А, зрелый Smac/Diablo, но не Д63Smac/Diablo, способен связываться как с сурвивином дикого типа, так и с сурвивиномр|0|А/и02Л. Чтобы подтвердить полученные результаты, мы трансфицировали клетки фиброкарциномы человека НТ1080 плазмидой, кодирующей CFP-сурвнвин или СРР-сурБивинР10,л/и02А Иммунопреципитация эндогенного Smac/Diablo демонстрирует, что этот белок способен взаимодействовать как с сурвивином дикого типа, так исега мутантом, не способным к димеризации (рис.6). Чтобы убедиться в том, что такое взаимодействие возможно не только в искусственно созданной системе, но и в живой клетке, мы исследовали эти белки in vivo с помощью метода регистрации FRET совместно с техникой фотообесцвечивания акцептора. Для этого клетки НТ1080 были котрансфецированы двумя плазмидами, одна из которых кодирует зрелый Smac/Diablo или A63Smac/Diablo с белком CFP на С-конце, а другая сурвивин или сурвивинр,0,А/ш2А с YFP на N-конце (рис.б). Как видно из рисунка 6Г в контроле: в клетках коэкспрессирующих белки CFP- и YFP-сурвивин, при фотообесцвечивании акцептора (YFP) интенсивность флуоресценции YFP резко снижается, а интенсивность флуоресценции донора (CFP) и FRET остаются почти постоянными. Такой результат соответствует отсутствию взаимодействия между CFP- и YFP-сурвивином. На рисунке 6Д приведены графики зависимости интенсивности флуоресценции CFP от времени фотообесцвечивания акцептора в клетках коэкспрессирующих YFP-сурвивин или УРР-сурвивинр10|АЛЛ02А и Smac/Diablo-CFP или A63Smac/Diablo-CFP. Повышение интенсивности флуресценции донора при обесцвечивании акцептора говорит о взаимодействии исследуемой пары белков

fgO

ll^nt ~

г bain

Сурви вин Сурвивй H Fl01A'LMW

Smac à<53Smac Smac A63Smac

штщт

IP:antí-Smac W: anti-Smac

IP:ant¡-Smac

W: anti-Survivin i

Г 120

С too

- Unprocessed Smac/DIABLO

' Mature Smac/DIABLO

l »

• CfP Y1P

• fM.1

s (sec.)

Pue. 6: Взаимодействие сурвивина и Smac/Diablo. (A) Результат иммуно детекции образцов,

полученных для определения взаимодействия Survivin и SurvivinF""A/L")2A с различными фрагментами Smac. (Б) Ко-иммунопреципитация белков из клеток, экспрессирующих CFP-сурвивин или CFP- cypeueuHF""J'LI"2A. Клетки HTI080 были трансфицированы плазмидой pTagCFP-C-Survivin или pTagCFP-C-SurvivinF""A/L",2J. Клетки лизировали и эндогенный Smac/Diablo был иммунопрецепетирован (IP) антителами на Smac/Diablo. Прег^ипетированные белки определяли с помощью иммуноблота (W) с первичными антителами на Smac/Diablo или на сурвивин. (В) Фотографии эмиссии CFP, YFP и FRET в клетках HTI080 котрансфицированных плазмидами pTagCFP-N-Smac/Diablo и pEYFP-C-Survivin. (Г) Графики зависимости интенсивности флуоресценции в CFP при возбуждении лазером 458нм (CFP), в жёлтом канале при возбуждении лазером 488нм (YFP) и в жёлтом канале при возбуждении лазером 458нм (FRET) в клетках HT1080 коэкспрессирующих CFP и YFP-сурвивин. (Д) Графики зависимости интенсивности флуоресценции CFP от времени фотообесцвечивания акцептора в клеках HTI080, коэкспрессирующих YFP-сурвивин или YFP- сурвивинГ""А/1'02л и CFP, Smac/Diablo-CFP или A63Smac/Diablo-CFP. (Е) Графики зависимости флуоресценции CFP от времени фотообесцвечивания акцептора в клетках HTI080, коэкспрессирующих фрагменты сурвивина YFP-сурвивин 1-109 или YFP-сурвивин 84-109 и Smac/Diablo-CFP. Приведены данные трех независимых экспериментов.

Результаты этого эксперимента свидетельствуют в пользу того, что сурвивинп01А1л02А, как и сурвивин дикого типа способен in vivo взаимодействовать с зрелым Smac/Diablo, но не с ДбЗSmac/Diablo, что полностью согласуется с результатами, полученными in vitro.

Далее представлялось интересным изучить, насколько участок димеризации сурвивина важен для связывания с белком Smac/Diablo. Ранее Song Z., 2003, было показано, что для взаимодействия этих белков необходим BIR домен сурвивина, однако BIR домен сурвивина в отдельности (1-97 а.к.), экспрессированный без участка димеризации, не способен связывать Smac/Diablo. Поэтому аналогично исследованию взаимодействия сурвивина и Smac/Diablo in vivo мы исследовали взаимодействие фрагмента сурвивина 1-109 а.к., в состав которого входит и BIR домен, и участок димеризации, а также фрагмента 84-109 а.к., состоящего только из участка димеризации, с белком Smac/Diablo. Полученные результаты свидетельствуют в пользу того, что участок димеризации сурвивина необходим для взаимодействия со Smac/Diablo, однако в отдельности, без BIR домена, он не способен связывать Smac/Diablo.

Сурвивинр""А/ы02А более эффективно защищает клетки фнбросаркомы человека НТ1080 от каспаз-зависимого апоптоза. вызванного цисплатином. чем сурвивин дикого типа

Для исследования роли мономера сурвивина в регуляции апоптоза нами были созданы клеточные линии, стабильно экспрессирующие сурвивин -дикого типа или один из его мутантов: сурвивин™Ш1Л02А, сурвивин°53А или сурвивинС53АГ'0,Аи02А, несущие CFP на своем N-конце. Сурвивин ШЗА - один из наиболее хорошо охарактеризованных доминантно -негативных мутантов, способный образовывать как гомодимеры, так и гетеродимеры с эндогенным сурвивином (подтверждено Song Z., 2004). СурвивинШЗАТ|01Аи°2Л -мутант сурвивина, созданный в нашей лаборатории, содержащий не только замену 53й аминокислоты, нарушающую структуру B1R домена, но и замены 101 й и 102й аминокислот,

FIO 1 АЛЛ (РА

которые, как мы предполагаем, по аналогии с сурвивином " , не позволяют этому

белку образовывать димеры. Для создания стабильных клеточных линий клетки фнбросаркомы НТ1080 заражали лентивирусными векторами, кодирующими сурвивин дикого типа или один из его мутантов. Чтобы исключить возможные неспецифические эффекты, вызванные проникновением в клетки вирусных частиц или экспрессией CFP, нами также была создана клеточная линия, стабильно экспрессирующая только CFP. Как показано на рисунке 7А, все полученные нами клеточные линии экспрессируют целевые белки на примерно одинаковом уровне. Исключение составляет только клеточная линия, экспрессирующая CFP, в которой экзогенный белок присутствует в значительно большем количестве. Это, вероятно, связано с тем, что в отличие от CFP, сурвивин в клетках имеет достаточно короткое время жизни и подвергается быстрой деградации (McNeish I.A., 2005).

Чтобы определить, каким образом различные мутанты сурвивина влияют на апоптоз опухолевых клеток, полученные нами клеточные линии обрабатывались цисплатином. Цисплатин (цис-диаминдихлорплатина II; [РЦЫ-НзЪСЬ])- широко используемый препарат для химиотерапии различных типов опухолей. Попадая в ядро, цисплатин образует сшивки

между молекулами ДНК, что приводит к остановке репликации и запускает апоптоз по внутреннему пути через активацию каспаз и фрагментацию ДНК белком А1Р. Для оценки уровня спонтанного апоптоза, а также апоптоза, вызванного цисплатином, мы использовали антитела на активированную каспазу-3. После фиксации и окраски антителами клетки анализировали на проточном цитометре (рис.7).

Сурвивин-CFP

0|tMCP;4Sh п 50 ЦМ СП; 43 h

Рис. 7: Влияние различных мутантов сурвивина на каспаз-зависимый апоптоз клеток HTI080. (А) Клетки HTI080 заражали лентивирусными векторами, кодирующими сурвивин дикого типа (WT). cypeueuHF""A/u02A (F10IA/L102A), сурвивин05" (D53A), cypeueuHDÍ3A/F""A/u02A (D5ЗА/FIO 1A/L102A) или CFP. После отбора на селективной среде клетки, стабильно экспрессирующие сурвивин, его мутанты или CFP лизировали; лизаты анализировали с помощью иммуноблота с первичными антителами против СРР.Для обеспечения эквивалентного количества белков в анализируемых лизатах проводили таю/се контрольный блоттинг с первичными антителами к актину. (Б) Клетки НТ1080, не заражённые лентивирусными частицами (HT1080) или стабильно экспрессирующие сурвивин дикого типа (WT), сурвивинг""А/и02А (F101A/L102A), сурвивинD"A (D53A), cypeueutPsu'F">u'u02A (D53A/F101A/L102A) или CFP (CFP), были обработаны (красные столбики) или не обработаны (синие столбики) цисплатином (CP) в концентрации 50 /хМ. Через 48 часов после добавления цисплатина прикреплённые и открепившиеся клетки были фиксированы и пермиабилизированы. Для оценки уровня апоптоза пермиабилизированные клетки окрашивались первичными антителами на активированную каспазу-3 и вторичными антителами, коньюгированными с Alexa Fluor 488, после чего клетки анализировали на проточном цитометре. На рисунке приведены данные, являющиеся средним из трёх независимых экспериментов ± С. О.

Видно, что экспрессия сурвивина дикого типа (WT) и cypBHBHHaFI01A/L102A (F101A/L102A) незначительно повышают уровень спонтанного апоптоза (синие столбики),

что может быть объяснено нарушениями в процессе деления клеток, вызванными сверхэкспрессией этих белков. Наибольший уровень спонтанного апоптоза, более чем в 4 раза превышающий апоптоз в контрольных клетках, наблюдается в клеточных линиях, стабильно экспрессирующих сурвивинш,А (D53A) и сурвивинШ1АН01Аи0"'А (D53A/F101A/L102А). При этом в клетках, экспрессирующих сурвивинС53АЛ:101А1л02А, уровень спонтанного апоптоза даже выше, чем при экспрессии описанного ранее доминантно негативного мутанта сурвивина, имеющего только одну аминокислотную замену. Кроме этого, из рисунка 7Б видно, что в клетках, обработанных цисплатином (красные столбики), наименьший уровень апоптоза наблюдается при экспрессии сурвивина дикого типа (WT) и его мутанта, неспособного к димеризации (F101A/L102A). Причём процент апоптоза в клетках экспрессирующих сурвивинИ0|ллл°2А ниже, чем в клетках, экспрессирующих нормальный сурвивин. Напротив, наибольший уровень апоптоза, вызванного цисплатином, наблюдается в клетках, которые приводят к экспрессии мутанты сурвивина с заменой 53ей аминокислоты. Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о том, что сурвивинр101А'и02А более эффективно, чем сурвивин дикого типа, защищает клетки фибросаркомы человека от каспаз-зависимого апоптоза, вызванного цисплатином.

Сурвивинг""АЛЛ'|гА более эффективно ингибирует Smac/Diablo. чем сурвивин дикого типа

Для выяснения причин различий во влиянии сурвивна и его мутантов на способность клеток к апоптозу мы исследовали ингибирование ими белка Smac/Diablo. Клетки, экспрессирующие различные мутанты сурвивина, были трансфицированы siRNA против последовательности Smac/Diablo человека для «knockdown» белка Smac/Diablo. Эффективность «knockdown» контролировали с помощью иммуноблота (рис.8).Через 24 часа после трансфекции к клеткам добавляли цисплатин и еще через 48 часов определяли уровень активации каспазы-3 на проточном цитометре (рис.8Б).

Ожидалось, что уменьшение активации каспазы-3 при «knockdown" Smac/Diablo будет пропорционально эффективности ингибировния Smac/Diablo сурвивином или его мутантами. Обнаружилось, что в клетках, экспрессирующих сурвивинр101АД'"12А, не наблюдается статистически значимого уменьшения активации каспазы-3. В противоположность этому в клетках, экспрессирующих сурвивин дикого типа или CFP, было замечено сильное уменьшение количества активированной каспазы-3 в сравнении с клетками, трансфицированными контрольной siRNA. Такой результат говорит в пользу того, что в условиях эксперимента на исследуемых клеточных линиях сурвивинр101А/и02А способен почти полностью ингибировать Smac/Diablo, в то время как сурвивин дикого типа ингибирует Smac/Diablo в значительно меньшей степени. Кроме этого, из рисунка 8Б видно, что ингибирование белка Smac/Diablo не оказывает статистически достоверного влияния на апоптоз клеток, экспрессирующих сурвивинЮЗА и сурвивинп53АР|ША1'",2Л.

WT FIA/LIA OB D53/F101A/L102A CFP Luc Smac lue Smac lue Smac lue Smac Luc Srac

Pue. 8: Влияние «knockdown» Smac/Diablo на уровень каспаз-зависимого апоптоза, вызванного цисплатином, в клетках HT1080, экспрессирующих различные мутанты сурвивина. (А) «Knockdown» Smac/Diablo с помощью siRNA. Клетки HTI080, стабильно экспрессирующие сурвивин дикого типа (WT), cypeueutFlouluou (F101A/L102A), сурвивин°53А (D53A), сурвивиншлт°,А/иш (D53A/F10IA/L102A) или CFP (CFP), были трансфицированы контрольной siRNA (Luc) или siRNA против Smac/Diablo (Smac). Через 72 часа после трансфекции клетки были лизированы и исследованы методом иммуноблотинга с первичными антителами на Smac/Diablo и на актин. (Б) Клетки НТ1080, стабильно экспрессирующие сурвивин дикого типа (WT), cypeueuHF""MUOU (F101A/L102A), сурвивин°5>А (D53A), cypeueuHD"A/F'°IA/u02A (D53A/FWIA/L102A) или CFP (CFP), были трансфиуированы контрольной siRNA (синие столбики) или siRNA против Smac/Diablo (красные столбики). Через 24 часа после трансфекции к клеткам был добавлен цисплатин (CP) в концентрации 50 цМ. Через 48 часов после добавления цисплатина уровень каспаз-зависмиого апоптоза в клетках был определён так же, как описано выше. На рисунке приведены средние значение для двух независимых экспериментов ± С. О.

Мономер сурвивина защищает клетки как от каспаз-зависимого, так и от каспаз-независимого апоптоза, вызванного цисплатином.

Tong Liu и соавторы показали, что кроме классического каспаз-зависимого пути апоптоза сурвивин может ингибировать и каспаз-независимый апоптоз, снижая количество AIF, перемещающегося в ядро. Для того чтобы определить, влияет ли мономер сурвивина на каспаз-независимый апоптоз, ответ клеточных линий фибросаркомы на цисплатин оценивали в присутствии z-Val-Ala-Asp(oMe)-fluomethyl ketone (zVAD-fmk) -панкаспазного ингибитора, блокирующего как инициаторные, так и эффекторные каспазы и таким образом ингибирующего каспаз-зависимый путь апоптоза. Уровень апоптоза в исследуемых клетках определялся с помощью окраски Аппехщ-РЕ и последующего анализа на проточном цитометре (Рисунок 9А). Добавления zVAD-fmk в концентрации 20 цМ было достаточно для значительного понижения уровня апоптоза во всех исследуемых клеточных линиях. Однако даже в присутствии ингибитора каспаз уровень апоптоза в клетках, обработанных цисплатином, был существенно выше, чем в контроле (рис.ЭБ, зеленые столбики). Такой результат свидетельствует о том, что клетки НТ1080 способны к апоптозу как по каспаз-зависимому, так и по каспаз-независимому пути.

СР+ zVAD-fmk CP

Рис. 9: Влияние различных мутантов сурвивина на каспаз-независимый апоптоз, вызванный цистатином, в клетках НТ1080. (А) К клеткам НТ1080, стабильно экспрессирующиы сурвивин дикого mima (Surv WT), был добавлен цисплатин (CP) в концентрации 50 цМ в отсутствии или присутствии 20 рМ zVAD-fm?k. Через 48 часов после добавления цисплатина клетки окрашивали Annexin-PE и анализировали на проточном цитометре. Увеличение уровня флуоресцен1(ии клеток (FL2) соответствует повышению количества апоптотирующих клеток. (Б) К клеткам НТ1080, стабильно экспрессирующим сурвивин дикого типа (WT), сурвиви/'ш,и02А (F101A/L102A), сурвивинD53J (D53A), сурвивии0Ш'птА'Ш2л (D53A/F101A/L102А) или CFP (CFP), был добавлен цисплатин (CP) в концентрации 50 ¡лМ в отсутствии (красные столбики) или присутствии (синие столбики) 20 рМ zVAD-fmk. в качестве контроля использовали клетки.в среду к которым было добавлено 20 /лМ zVAD-fmk без цисплатина (зелёные столбики). Через 48 часов после добавления цисплатина уровень апоптоза определялся окрашиванием клеток Annexin-PE с последующим анализом на проточном цитометре. На рисунке приведены данные, являющиеся средним двух независимых экспериментов ± С.О..(В) К клеткам НТ1080, описанным в пункте (Б), добавляли стауроспорин (STS) в концентрации 0,5 /íM в отсутствии (красные столбики) или присутствии (синие столбики) 20 /лМ zVAD-fmk, в качестве контроля использовали клетки, в среду которых было добавлено 20 ¡xM zVAD-fnk без стауроспорина (зелёные столбики). Через 12 часов после добавления стауроспорина уровень апоптоза определяли окрашиванием клеток Annexin-PE с последующим анализом на проточном цитометре. На рисунке приведены данные, являющиеся средним из двух независимых экспериментов ± С. О.

Из рисунка 9Б следует, что даже в присутствии ингибитора каспаз клетки, экспрессирующие сурвивинр101А/и02А (F101A/L102A), менее подвержены апоптозу, чем контрольные клетки (CFP). Это свидетельствует о том, что мономер сурвивина, помимо каспаз-зависимого апоптоза, способен ингибировать и каспаз-независимый апоптоз. Важно отметить, что в наших экспериментальных условиях не наблюдалось статистически достоверных различий между уровнем апоптоза, вызванного цисплатином в присутствии zVAD-fmk в клетках, экспрессирующих сурвивин дикого типа (WT), и уровнем апоптоза в контрольных клетках (CFP). Более того, даже при добавлении zVAD-fmk уровень апоптоза в клетках, экспрессирующих мутанты сурвивина с заменой 53й аминокислоты, более чем в 2 раза превышает апоптоз в клетках других созданных нами клеточных линий. В сочетании с данными о том, что ингибирование Smac/Diablo в этих клеточных линиях не оказывает заметного влияния на уровень апоптоза, это говорит в пользу того, что сурвивинШЗА и сурвивинШЗА/р101А,ио2А в клетках НТ1080 усиливают апоптоз, вызванный цисплатином, преимущественно по каспаз-независимому пути. Такой результат является крайне интересным, так как ранее предполагалось (Song Z., 2004), что проапоптозное действие сурвивинаЮЗА основано исключительно на образовании нефункциональных гетеродимеров с эндогенным сурвивином, не способных ингибировать белок Smac/Diablo.

Для того чтобы убедиться в том, что результаты, полученные в этом опыте, справедливы не только для цисплатина, но и для других стимулов, активирующих митохондриальный путь апоптоза, аналогичный эксперимент был проведён с использованием в качестве индуктора апоптоза стауроспорина — алколоида, продуцируемого бактериями рода Streptomyces и являющегося ингибитором широкого спектра киназ. Как видно из рисунка 9В, использование стауроспорина в качестве индуктора апоптоза приводит к тем же результатам, что и использование цисплатина.

Долгое время считалось, что в клетке весь сурвивин находится только в виде димера, а мономер не имеет биологических функций (Muchmore S.W., 2000; а так же Song, 2004). Однако постепенно накапливаются данные, подтверждающие тот факт, что в некоторых процессах участвует мономер, а не димер сурвивина. Так, например, Jeyaprakash A.A., 2007 показано, что именно мономер сурвивина входит в состав СРС и именно мономер взаимодействует с экспортным рецептором CRM1 (Engelsma D., 2007). Наконец, недавно полученные Wang H. и коллегами данные говорят о том, что в клетках существует специальный механизм регуляции равновесия между димерной и мономерной формой сурвивина посредством ацетилирования сурвивина по различным остаткам лизина

Исследование содержания J-nenmuda в нормальных и опухолевых образцах.

Отдельное место в данной работе занимает исследование содержания белка J-пептида в нормальных тканях человека с использованием широкой панели образцов тканей. Полученные данные предлагается использовать в качестве базовых при исследованиях, связанных с изменением содержания J-пептида при различных патологиях, отражающих нарушения в адаптивной иммунной системе.

Полученную ранее (Снежков, ЛСФГЧ) генно-инженерную конструкцию, кодирующую полноразмерный Д-пептид, использовали для получения рекомбинантного /-пептида, который, в свою очередь, после очистки применяли для иммунизации кроликов и выработки поликлональных моноспецифических антител и в качестве контрольного образца для иммунохимического анализа. С помощью очищенных поликлональных антител нами были исследованы сыворотка крови и образцы нормальных тканей здоровых, клинически охарактеризованных людей. Анализ образцов сыворотки крови методом ИФА показал, что доля /-пептида в суммарном белке сыворотки составляет 512 нг/мг (таблица 2).

Таблица 2. Содержанке У-пептида в нормальных тканях человека

№ Источник образца ткани Содержание /-пептида, нг/мг суммарного бежа экстракта ткани или сыворотки крови

2 Центральная область легких 320 ± 80

3 Периферическая область легких 40 ±16

4 Эмбриональные легкие (24 недели развития) 13 ± 0.1

5 Сыворотка крови 512 ±64

6 Тонкий кишечник 14.0 ±0.1

7 Толстый кишечник 28.0 ±2.3

8 Мышцы 16.0 ± 1.6

Эти результаты были подтверждены методом иммуноблотинга (рис. 10). Определенное нами содержание .1-пептида в суммарном белке сыворотки крови соответствует данным литературных источников (540 нг/мг суммарного белка; 81аупегег I, 1996), рассчитанным по содержанию полимерных иммуноглобулинов в сыворотке крови человека, а также учитывающим долю секреторных форм антител в крови человека и содержание .1-пептида в этих антителах.

1234567 8912 3456789

Рис. 10. Слева - электрофореграмма исследуемых образцов различных тканей здоровых людей по стандартной методике, справа - анализ тех же образцов методом иммуноблотинга. Содержание /-пептида в нормальных тканях человека: центральной области легких (2), периферической области легких (3), эмбриональных легких (4), сыворотке крови (5), тонком кишечнике (6) толстом кишечнике (7), мышцах (8), мозге (9); 1- рекомбинантный Лпептид, положительный контроль.

Анализ содержания J-пептида в суммарном белке сыворотки крови даёт возможность судить об изменениях суммарного уровня секреторных иммуноглобулинов.

Исследуемые нами образцы легочной ткани и ткани кишечника были взяты случайным образом с обширной территории соответствующих органов и включают в себя все разнообразие представленных в этих органах клеточных структур. Особенностью В-

лимфоцитов слизистых ЖКТ является преобладание так называемых несущих IgA В-клеток, для которых предопределена функция биосинтеза IgA. Кроме очаговых скоплений лимфоидной ткани имеется также диффузная сеть этой ткани, пронизывающая слизистую оболочку всего желудочно-кишечного тракта (Беляков ИМ, 1997). Именно в них и содержится основная доля определяемого нами J-пептида, который обнаруживается в различных отделах ЖКТ и наиболее представлен в отделах толстого кишечника, и меньше -в отделах тонкого кишечника (рис. 10).

Исходя из специфического диффузного распределения В-клеток, мы решили сгруппировать все данные по ЖКТ в две исследуемые группы - ткани тонкого и толстого кишечника (рис, 11). В системе местного иммунитета ЖКТ особую роль играет секреторный IgA (slgA) (Беляков И М, 1997), в составе которого, возможно, и определяется основное количество выявленного J-пептида.

Мы определили, что содержание J-пептида в суммарном белке экстрактов тонкого кишечника составило 14 ± 0.1, толстого кишечника - 28 ± 2.3 и мышечной ткани - 16 ± 1.6 нг/мг). Повышенный уровень J-пептида в толстом отделе кишечника также может быть объяснён большим содержанием в нём лимфоидной ткани (Беляков И.М, 1997).

Рис.11 .Иммуногистохимическое исследование фиксированных ледяньш метанолом образцов тканей тонкого кишечника с окрашиванием их поликлональными антителами к J-пептиду, вторичные антитела А/еха anti-rabbit 555 (А) и (Б) аналогичное окрашивание, но с выявленными при помощи красителя (SybrGreen) клеточных ядер. (В)- окрашивание антителами к Ыа.К-АТР-азе и (Г) -аналогичное окрашивание с выявленными при помощи красителя SybrGreen ядрами. Линейка - 15.0 мкм

Видимо, именно в составе так называемых, несущих IgA В-клеток J-пептид детектируется при иммуногистохимическом окрашивании препарата толстого кишечника (рис. 11).

В легочной ткани эмбриона на 24-ой неделе развития организма были обнаружены следовые количества J-пептида - 13 нг/мг белка экстракта, что составляет около 3% от его среднего содержания в центральной области легких взрослых людей и соответствует

выводам ученых о времени появления этого белка в развивающихся легких человека (Gurevich Р и соавт., 2003)

Впервые нами показано высокое содержание J-пептида в образцах центральной и периферической области легких человека (рис. 12), причем основное его количество - 320 нг/мг - сосредоточено в центральной области легких (таблица 2), которая характеризуется высоким содержанием В-клеток.

К-ь 12 3 А5678 9 ПО IX 12

Рис.12. Анализ экстрактов центральной (1-6) и периферической области (7-12) нормальных легких человека методом иммуноблоттинга. Окрашивание с использованием поликлональных антител крекомбинантному J-nenmudy.

Проведенный анализ показал также, что J-пептид не обнаруживается использованными методами в исследованных образцах ткани мозга (рис. 10). Незначительное количество J-пептида присутствует в образцах мышечной ткани (рис. 10, 11), что можно объяснить присутствием в них остаточных количеств компонентов крови.

Результаты данной работы можно рассматривать в качестве базовых при различных исследованиях, связанных с изменением содержания J-пептида при легочных и кишечных патологиях.

Кроме того, на образцах нормальной и опухолевой тканей при плоскоклеточном раке легких человека обнаружено снижение уровня транскрипции гена J-пепгида в опухоли. При этом в качестве контроля использовали рекомбинантный J-пептид. Методом иммуноблоттинга с использованием поликлональных антител к J-пептиду исследовали пары образцов (норма-N и опухоль-Т- пары образцов) от 26 пациентов. Показано, что в случае наиболее представленных групп норма-N и опухоль-Т как с центральной, так и с периферической локализацией опухоли наблюдалась преимущественное подавление регуляции. Исключение составила группа с центральной локализацией и ороговением опухоли, в которой для половины рассматриваемых пар не наблюдали изменений в содержании J-пептида, а оставшиеся образцы поровну распределились между вариантами регуляции. На основании этих результатов можно предположить, что неороговевающая форма опухоли на 1-2 стадии развития является более регулируемой, т.е. трансформированные клетки в этом случае легче воспринимают внешние метаболические сигналы. В то время как форма опухоли, содержащая ороговевшие клетки, находится в изолированном, более стабильном состоянии.

Таким образом, по результатам проведенной работы предложено дополнить панель онкологических диагностических наборов белком J-пептидом.

Заключение

Получены в клетках Е. coli и очищены рекомбинантные белки сурвивин, Smac/Diablo и J-пептид . Эти белки использованы для иммунизации мышей BALB/C. С помощью гибридомной технологии получены и отобраны гибридомы, продуцирующие моноклональные антитела,

взаимодействующие с соответствующими белками в иммунологических реакциях (ИФА и иммуноблотг). Показано, что моноклональные антитела к белку сурвивину распознают различные изоформы эндогенного клеточного белка. На основе полученных моноклональных антител создан диагностический набор «Пептосурвим» для определения уровня белка сурвивина в различных биологических образцах, основанный на методе ИФА и тест-система для определения уровня Smac/Diablo в различных биологических образцах, также основанная на методе ИФА. С помощью полученных тест-систем были определены белки сурвивин и Smac/Diablo в лизатах клеточных линий, сыворотке крови и соскобах эндометрия.

Проведены исследования по количественной оценке содержания J-пептида. На основании полученных результатов, а также литературных данных Vaerman J.P, 1995 и Gurevich Р, 2003, подобного рода анализ предлагается использовать для характеристики и лечения различного рода легочных заболеваний и заболеваний ЖКТ. Примером тому служат фармакологические препараты National Jewish Center for Immunology and Respiratory Medicine (Denver, CO). United States Patent 5698679, имеющие J-пептид в составе секреторных полимерных иммуноглобулинов.

В рамках данной работы была исследована способность мономера сурвивина защищать клетки от апоптоза через ингибирование проапоптозного белка Smac/Diablo. С помощью «pull-down assay», коиммунопреципитации и метода регистрации FRET мы показали, что in vitro и in vivo мутант сурвивина, не способный к димеризации, может взаимодействовать с белком Smac/Diablo. Кроме того, нами было показано, что для взаимодействия этих белков необходим участок димеризации сурвивина. Используя клеточные линии, стабильно экспрессирующие различные мутанты сурвивина, а также с помощью РНК интерференции мы получили данные, говорящие в пользу того, что cypBHBHHF'01A/LI0:!A более эффективно ингибирует Smac/Diablo, чем сурвивин дикош типа. Исследуя участие мономера сурвивина в защите от апоптоза через увеличение стабильности антиапоптозного белка XIAP, мы установили, в частности, что с XIAP способен взаимодействовать не только сурвивин дикого типа, но и его мутант, не образующий димеров.

В процессе исследования определено: сурвивинП01АЛЛ02л лучше, чем сурвивин дикого типа, ингибирует каспаз-независимый путь апоптоза в клетках фибросаркомы человека НТ1080, то есть мономер сурвивина более эффективно защищает клетки от апоптоза, идущего по митохондриальному пути. Поскольку в клетке сурвивин дикого типа существует как в виде димера, так и в виде мономера, на основании полученных результатов мы можем предположить, что в защите от апоптоза в живой клетке участвует именно мономер сурвивина.

Предложенная нами модель антиапоптозного действия сурвивина также даёт возможность объяснить, каким образом сурвивин способен выполнять разные, во многом противоположные, функции в одном и том же процессе в клетке. Так, например, можно предположить, что при делении часть сурвивина, находясь в виде мономера, входит в состав

СРС и участвует в дестабилизации неправильно прикреплённых к кинетохорам микротрубочек (Delacour-Larosw М., 2007), а димерная фракция сурвивина взаимодействует с микротрубочками веретена деления и, напротив, повышает их стабильность. Такая гипотеза кажется нам крайне вероятной, так как доказано, что в состав СРС входит именно мономер сурвивина.

В рамках данной работы наблюдалось также, что только сурвивин в виде димерной молекулы влияет на стабильность микротрубочек и, вероятно, только он способен связываться с полимеризованным тубулином, играя роль адаптора между микротрубочками и другими белками (Grass O.J., 2004). Таким образом, если предположить, что часть своих функций сурвивин выполняет в виде димера, а часть - в виде мономера, регуляция равновесия димер-мономер может служить «переключателем» между различными функциями сурвивина.

ВЫВОДЫ

1. Получены и очищены рекомбинантные белки сурвивин и Smac/Diablo. Получены моноклональные антитела к рекомбинантным белкам сурвивин и Smac/Diablo.

2. Изучив особенности взаимодействия сурвивина с белком Smac/Diablo, показано, что:

- сурвивинР10|А'и02А в растворе существует в виде мономера.

-Мономер сурвивина in vitro и in vivo способен взаимодействовать с белком Smac/Diablo.

-СурвивинР101Аис2А более эффективно защищает клетки фибросаркомы человека НТ1080 от каспаз-зависимого апоптоза, вызванного цисплатином, чем сурвивин дикого типа

-CypBHBHHF10IALI02A более эффективно ингибирует Smac/Diablo, чем сурвивин дикого типа.

-Мономер сурвивина защищает клетки как от каспаз-зависимого, так и от каспаз-независимого апоптоза, вызванного цисплатином.

3. Определено содержание дифференциальных белковых продуктов (сурвивин и Smac/Diablo) в клеточных линиях и опухолевых образованиях различных тканей больных и здоровых индивидуумов. Оценена диагностическая перспективность дифференциальных белков сурвивина и Smac/Diablo.

4. Результат изучения образцов эндометрия 80 пациентов позволяет считать тест-систему для определения белка сурвивин в биологических образцах в варианте двустадийного иммунофлуоресцентного анализа наиболее простой и технологически приемлемой для клинического использования.

5. Определен уровень синтеза белка J-пептида в образцах из различных тканей здоровых индивидуумов, а также содержание J-пептида в образцах нормальных и опухолевых тканей 26 пациентов при плоскоклеточном раке и аденокарциноме легкого, в результате чего определено снижение уровня синтеза J-пептида в опухоли у 61% пациентов.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Pavlukov M.S., Antipova N.V.. Balashova M.V., Vinogradova T.V., Kopantzev E.P., Shakhparonov M.I.. Survivin monomer plays an essential role in apoptosis regulation. J. Biol. Chem. 2011 jbc.Mll 1.237586. First Published on May 2, 2011, doi: 10.1074/jbc.M 111.237586

2. Макаров И.О., Овсянникова Т. В., Шешукова Н. А., Федотова А. С., Боровкова Е. И., Шахпаронов М. И., Антипова И. В. . Онкологические аспекты гиперпластических процессов в эндометрии. -Российский вестник акушера-гинеколога, 2011. №1.14-16.

3. Слижикова Д.К., Зиновьева М.В., Кузьмин Д.В., Снежков ЕВ, Шахпаронов М.И., Дмитриев Р.И., Антипова Н. В.. Завалова Л.Л., Свердлов Е.Д.. Снижение экспрессии J-пептида человека при плоскоклеточном раке и аденокарциноме легкого. - Молекулярная биология, 2007, т.41, № 4, 659-665.

4. Антипова И. В... Снежков Е. В., Завалова Л. Л., Шахпаронов М. И.. Иммунологическое исследование тканевой специфичности J-пегггида секреторных полимерных иммуноглобулинов человека. - Биоорг.химия, 2010, 36 (6): 774-778.

5. Антипова Н. В.. Диагностическая система «Пептосурвим» для определения белка сурвивина в биологических образцах. - Вестник Российского Государственного Медицинского Университета, 2011. - Спец. Выпуск №1. -Стр.233-234.

Тезисы докладов:

1. Антипова Н.В.. Завалова Л.Л., Копанцев Е.П., Свердлов Е.Д.

J-пептид секреторных полимерных иммуноглобулинов человека при плоско клеточном раке и аденокарциноме легких. - XIX зимняя молодежная научная школа «Перспективные направления физико-химической биологии», -М., 2007. -Стр.58.

2. Антипова Н.В. Some oncoproteins as cancer marcers associated with non-small cell lung cancer. Conference for young scientists, PhD students and students on molecular biology and genetics, Dedicated to 120th anniversary of M.I. Vavilov, Киев, 2007, p.156.

3. .Антипова Н.В. Regulation of human immunoglobulin J-peptide expression in non-small cell lung cancer (NSCLC). Conference for young scientists, PhD students and students on molecular biology and genetics Dedicated to 120th anniversary of M.I. Vavilov, Киев, 2007, pp. 157

4. Антипова H.B.. Дмитриев Р.И., Шахпаронов М.И., Копанцев Е.П., Завалова Л.Л, Свердлов Е.Д. Regulation of human immunoglobulin J-peptide expression in non-small cell lung cancer (NSCLC). FEBS2007, Вена, pp.158,

5. Антипова HB. Регуляция экспрессии j-пептида иммуноглобулинов человека при плоскоклеточном раке и аденокарциноме легких. - "Фундаментальная наука и клиническая медицина". Десятая Всероссийская медико-биологическая конференция молодых исследователей "Человек и его здоровье", С.-Петербург, 2007, стр. 11-12.

6.Антипова Н.В.. Копанцев Е.П., Завалова Л.Л., Свердлов Е.Д. Онкобелки: TCF-4, Smac, STAT-3, Survivin, cyclin D1 при немелкоклеточном раке легких человека. - XX зимняя международная молодежная научная школа "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии", Москва, 2008г. -Стр.9.

7. Антипова Н.В . Завапова Л.Л., Шахпаронов М.И. Разработка диагностической системы для определения наличия белка сурвивина в биологических образцах. Международная конференция ИБХ, посвященная 75-летию Ю.А.Овчинникова, Москва, ИБХ, 2009, тезисы докладов, стр. 117.

8. Павлюков М.С., Антипова НВ.. Завалова Л.Л., Шахпаронов М.И. Изучение взаимодействия рекомбинантных белков survivin и SMAC/DIABLO in vitro. Международная конференция ИБХ, посвященная 75-летию Ю.А.Овчинникова, Москва, ИБХ, 2009, тезисы докладов, стр.314.

9. Антипова Н.В.. Завалова Л.Л., Шахпаронов М.И. «Набор для качественного определения белка сурвивин в биологических образцах методом твердофазного HOA(ELISA). 1-ая международная научная школа "Наноматериалы и нанотехнологии в живых системах" Моск. Обл., 2009, стр.157.

10. Антипова Н.В.. А.С.Федотова, Л.Л.Завалова, М.И. Шахпаронов. Определение белка сувивина в нормальных и патологических образцах с помощью диагностического набора «Пептосурвим». 14-ая Международная Пущинская школа - конференция молодых ученых «Биология-Наука XXI века». 2010, сб. тезисов, стр. 117.

11. Антипова Н В.. Шахпаронов М.И.. ДИАГНОСТИЧЕСКАЯ СИСТЕМА «ПЕПТОСУРВИМ». Школа-конференция молодых ученых "Фундаментальная наука для биотехнологии и медицины- 2010 ". - стр4-6.

12. Павлюков М.С, Антипова Н.В.. Шахпаронов М.И СОЗДАНИЕ НОВЫХ ПРОТИВООПУХОЛЕВЫХ ПРЕПАРАТОВ НА ОСНОВЕ БЕЛКА СУРВИВИН. Школа-конференция молодых ученых "Фундаментальная наука для биотехнологии и медицины-2010.-стр67.

13. Павлюков М.С., Антипова Н.В .. Завалова Л. Л., Шахпаронов М.И. Изучение механизмов ингибирования апоптоза белком Сурвивин. 14-ая Международная Пущинская школа -конференция молодых ученых «Биология-Наука XXI века». 19-23 апреля 2010, тезисы, стр.314.

14. Антипова Н.В.. А.С.Федотова, Л.Л.Завалова, М.И. Шахпаронов. Диагностический набор «Пептосурвим». - Всероссийская школа-семинар студентов, аспирантов и молодых ученых по направлению «Нанобиотехнология». 2010, стр.14.

15. Антипова Н.В.. Федотова А.С.., Шахпаронов М.И. Определение белка сурвивина в эндометрии с помощью диагностического набора «Петосурвим». 12 зимняя молодежная научная школа, Москва, ИБХ, 2010, стр.67.

16. Павлюков М.С., Антипова Н.В.. Шахпаронов М.И Участие мономера сурвивина в регуляции апоптоза .12 зимняя молодежная научная школа, Москва, ИБХ, 2010, стр.47.

17. Антипова Н В.. А.С.Федотова. Онкологические аспекты гиперпластических процессов эндометрия. -XVI Российский национальный конгресс «Человек и лекарство». -М., 2010.

Подписано в печать:

18.10.2011

Заказ № 6060 Тираж - 100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Антипова, Надежда Викторовна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

1. ВВЕДЕНИЕ.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1 Характеристика белка сурвивина.

2.1.1. Локализация сурвивина в клетке.

2.1.2. Изоформы сурвивина.

2.1.3. Посттрансляционные модификации сурвивина.

2.1.4. Регуляция экспрессии сурвивина.

2.2. Сурвивин в терапии и диагностике.

2.3. Механизм апоптоза в клетке.

2.3.1. Роль белков 1АР и белка БМАС в апоптозе.

2.3.2. Роль сурвивина в апоптозе.

2.4. Механизмы взаимодействия сурвивина с белком БМАС.

2.5. Роль сурвивина в регуляции клеточного цикла.

2.6. Комплекс белков пассажиров хромосом.

2.7. Роль сурвивина в регуляции роста микротрубочек.

2.7.1. Участие сурвивина в системе «чекпоинта» веретена деления.„

2.7. 2. Участие сурвивина в регуляции стабильности микротрубочек

2.8. Стратегии лечения опухолей основанные на ингибированиисурвивина.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Изучение свойств белков Survivin, Smac/Diablo, J-chain человека и возможности их использования в качестве диагностических и терапевтических средств"

Универсальная технология дифференциальной протеомики является мощным инструментом для выявления различий в составе экспрессируемых генов, кодируемых ими транскриптов и белков, представленных в нормальных клетках и клетках, измененных вследствие различного рода наследственных и приобретенных патологий, включая опухолевую трансформацию. Полученные ранее библиотеки генов, дифференциально экспрессирующихся в нормальных и опухолевых тканях в виде набора упорядоченных дифференциальных клонов кДНК (более 2500 клонов), идентифицируют 179 генов с пониженной (примером может служить продукт экспрессии такого гена, белок 1-пептид, распределение которого изучается в данной работе) и 109 генов с повышенной экспрессией в опухолях, представителями которых являются кодируемые дифференциально экспрессирующимися генами белки сурвивин и 8тас/ТМаЫо[1].

Цель работы.

В ходе работы были поставлены следующие задачи:

1. Изучить молекулярные основы взаимодействия сурвивина с Зтас/ТНаЫо, для этого:

- получить и очистить рекомбинантные белки сурвивин и 8тасЛ31аЫо;

- получить моноклональные антитела к рекомбинантным белкам сурвивин и 8тас/ТМаЫо.

2. Использовать полученные моноклональные антитела для определения содержания дифференциальных белковых продуктов (сурвивин и БтасЯМаЫо) в клеточных линиях и опухолевых образованиях различных тканей больных и здоровых индивидуумов.

4. Оценить уровень белка 1-пептида в образцах из различных тканей здоровых индивидуумов, при этом, используя полученные ранее поликлональные антитела, оценить так же содержание белка 1-пептида в образцах из опухолевых образований различных тканей больных индивидуумов.

В данной работе нами были исследованы свойства белков-маркёров относящихся к совершенно разным группам. Однако их объединяет один очень важный с нашей точки зрения факт - моментальный отклик при перерождении здоровой ткани в злокачественную опухоль. Совершенно очевидно, при диагностике какого-либо заболевания достоверность самого факта увеличивается при выявлении как можно большего количества его признаков. Таковыми в современной медицинской практике являются характерные изменения в структуре, свойствах и жизненном цикле белков - маркёров и кодирующих их генов. Особенно чувствителен к таким изменениям ключевой момент в жизни клетки, называемый апоптозом-запрограмированной гибелью клетки.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Онкологические заболевания являются одними из главных причин смертности. Проблема борьбы с раком, несмотря на мобилизацию всех достижений современной биологической науки и медицинской техники, остается далекой от решения. В связи с недостаточной эффективностью традиционных методов лечения раковых заболеваний (химио- и радиотерапия, хирургия) необходима разработка т.н. таргетных препаратов (от англ. target - мишень) - препаратов целенаправленного действия, а так же создание генотерапевтических препаратов, и разработка сопутствующих диагностических систем.

Нарушение апоптоза, приводящее к накоплению клеток, содержащих поврежденную ДНК, а также дефекты митотического аппарата ведут к возникновению раковой опухоли и ее прогрессии [2]. В балансе между пролиферацией и программируемой смертью клетки большую роль играют белки семейства IAP (IAP - inhibitors of apoptosis) - белки - ингибиторы апоптоза [3]. Белок сурвивин - член семейства IAP белков, участвует в контроле клеточного деления, регуляции апоптоза, ангиогенезе [4]. Антиапоптотическая функция заключается в прямом или опосредованном ингибировании каспаз, например за счет связывания сурвивина с белком SMAC (Second Mitohondria-derived Activator of Caspase). SMAC= Smac/Diablo - митохондриальный белок, который выходит из митохондрий в цитозоль во время апоптоза, связываясь с белками семейства IAP, предотвращает их ингибирующее действие по отношению к каспазам, обеспечивая тем самым активацию каспаз и развитие апоптоза [5]. Сурвивин селективно образовывается в наиболее распространённых опухолях человека и вовлечён в резистентность опухолевых клеток к противоопухолевым агентам и ионизирующим излучениям [4]. Преклинические исследования показали, что выключение синтеза сурвивина с использованием антисенс-олигонуклеотидов, доминант-негативных мутаций, рибозимов и ингибиторов циклинзависимых киназ увеличивает уровень апоптоза, уменьшает потенциал роста опухоли и восстанавливает чувствительность опухолевых клеток к химиотерапии с разными механизмами действия и гамма-излучению в различных типах опухолей человека. Высокий уровень синтеза сурвивина в опухолях коррелирует с их прогрессией и считается негативным прогностическим фактором для некоторых опухолей [6].

Например, было показано, что высокое содержание этого белка ассоциировано с более агрессивным фенотипическим проявлением различных опухолей и с меньшей вероятностью выживания пациента [7-11]. Клинические исследования выявили, что пациенты, раковые клетки которых имели повышенный уровень экспрессии гена BIRC5, были значительно устойчивее к химиотерапии [12]. В связи с этим снижение уровня экспрессии этого белка в раковых опухолях приводит к увеличению апоптоза и остановке роста опухоли. В силу ярко выраженного дифференциального образования сурвивина между нормой и опухолью, этот белок служит опухолевым маркером. Сурвивин можно детектировать в опухолевых тканях иммуногистохимическими методами, что служит быстрым и удобным методом диагностики характера развивающейся опухоли.

Существует несколько форм локализации белка сурвивина в клетке, эти формы локализации независимо регулируются, обладают различными пострансляционными модификациями. Подробно изучены 2 формы локализации белка сурвивина - ядерная и цитоплазматическая, но их иммуногистохимическая характеристика не дает необходимой и достаточной информации для диагностической характеристики клеток, определяющей их онкологическое перерождение. Существует так же еще мало изученная митохондриальная форма локализации сурвивина. Механизм перемещения сурвивина в митохондрию пока не изучен, но предположительно, что такое перемещение связано с участием шаперона Hsp90. Показано, что в опухолевых клетках наблюдается стократное увеличение аффинности этого шаперона к переносимым им белкам, в том числе и сурвивину[13]. Митохондриальный сурвивин под действием различных апоптозных стимулов быстро высвобождается из митохондрий и выходит в цитозоль[14]. Он подавляет активацию каспаз и усиливает образование опухолей in vivo. Сурвивин образуется не только в опухолевых, но и в некоторых нормальных клетках, однако ни в одной из нормальных тканей, сурвивин не был обнаружен в митохондриях [15]. Митохондриальный белок сурвивин локализуется вместе с белком Smac/Diablo в межмембранном пространстве митохондрий[16]. В ответ на стрессовые воздействия (гипоксию или обработку ДНК повреждающими агентами в концентрации не вызывающей апоптоз) увеличивается содержание митохондриальной формы локализации белка сурвивина, в то время как количество белка сурвивина в цитозоле остаётся примерно постоянным [17]. Возможно, таким образом клетка в ответ на стрессовые воздействия готовится противостоять апоптозу, усиливая свою защиту повышением количества митохондриального белка сурвивина [18].

Отмечено, что синтез изоформы сурвивина, участвующей в митотическом делении клетки не только не усиливает, но и наоборот в значительной мере замедляет образование опухолей, что может быть объяснено чрезмерной активностью сурвивина в митозе и образования таким образом большого количества ошибок при делении клеток [17].

Таким образом для наиболее корректной характеристики онкологических клеточных и тканевых образцов необходимо исследовать именно митохондриальную форму локализации белка сурвивина. А также для понимания процессов, происходящих с различными изоформами этого белка и их роли в клеточных нарушениях необходимо подробное изучение процесса димеризации белка сурвивина и его взаимодействия с природным антагонистом - белком 8тас/ТНаЬ1о.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Антипова, Надежда Викторовна

выводы.

2. Изучив особенности взаимодействия сурвивина с белком Smac/Diablo, показано, что:

- сурвивинП01А/и02А в растворе существует в виде мономера.

-Мономер сурвивина in vitro и in vivo способен взаимодействовать с белком Smac/Diablo.

-Сурвивинр|0|А/и02А более эффективно защищает клетки фибросаркомы человека НТ1080 от каспаз-зависимого апоптоза, вызванного цисплатином, чем сурвивин дикого типа.

-Сурвивинп01А/и°2А более эффективно ингибирует Smac/Diablo, чем сурвивин дикого типа.

5. Определен уровень синтеза белка J-пептида в образцах из различных тканей здоровых индивидуумов, а также содержание J-пептида в образцах нормальных и опухолевых тканей 26 пациентов при плоскоклеточиом раке и аденокарциноме легкого, в результате чего определено снижение уровня синтеза J-пептида в опухоли у 61% пациентов.

5. ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

Получены в клетках Е. coli и очищены рекомбинантные белки сурвивин и Smac/Diablo. Эти белки были использованы для иммунизации мышей BALB/C. С помощью гибридомной технологии получены и отобраны гибридомы, продуцирующие моноклональные антитела, взаимодействующие с соответствующими белками в иммунологических реакциях (ИФА и иммуноблот). Показано, что моноклональные антитела к белку сурвивину распознают различные изоформы эндогенного клеточного белка. На основе полученных моноклональных антител создан диагностический набор «Пептосурвим» для определения уровня белка сурвивина в различных биологических образцах, основанный на методе ИФА и тест-система для определения уровня Smac/Diablo в различных биологических образцах, так же основанная на методе ИФА. С помощью полученных тест-систем были определены белки сурвивин и Smac/Diablo в лизатах клеточных линий, сыворотке крови и соскобах эндометрия.

Проведены исследования по количественной оценке содержания J-пептида. На основании полученных результатов, а также на литературных данных Vaerman J.P и соавт., 1995 и Gurevich Р и соавт., 2003 [112,114], мы предполагаем, что подобного рода анализ можно было бы использовать для характеристики и лечения различного рода легочных заболеваний и заболеваний ЖКТ. Примером тому служат фармакологические препараты National Jewish Center for Immunology and Respiratory Medicine (Denver, CO). United States Patent 5698679 с использованием J-пептида в составе секреторных полимерных иммуноглобулинов.

В рамках данной работы была исследована способность мономера сурвивина защищать клетки от апоптоза, через ингибирование проапоптозного белка Smac/Diablo. С помощью «pull-down assay», коиммунопреципитации и метода регистрации FRET мы показали, что in vitro и in vivo мутант сурвивина, не способный к димеризации, может взаимодействовать с белком Smac/Diablo. Кроме того, нами было показано, что для взаимодействия этих белков необходим участок димеризации сурвивина. Благодаря использованию клеточных линий, стабильно экспрессирующих различные мутанты сурвивина, а также с помощью РНК интерференции мы получили данные, говорящие в пользу того, что сурвивинп01А/и02А более эффективно ингибирует Smac/Diablo, чем сурвивин дикого типа. Исследуя участие мономера сурвивина в защите от апоптоза через увеличение стабильности антиапоптозного белка Х1АР, нами было показано, что с Х1АР способен взаимодействовать не только сурвивин дикого типа, но и его мутант, не образующий димеров.

Наконец, мы показали, что сурвивинр101А/Ы02А лучше, чем сурвивин дикого типа ингибирует каспазнезависимый путь апоптоза в клетках фибросаркомы человека НТ1080. Таким образом, по нашим данным, мономер сурвивина более эффективно защищает клетки от апоптоза идущего по митохондриальному пути. Поскольку в клетке сурвивин дикого типа существует как в виде димера так и в виде мономера, то на основании полученных результатов мы можем предположить, что в защите от апоптоза в живой клетке участвует именно мономер сурвивина.

Предложенная нами модель антиапоптозного действия сурвивина также даёт возможность объяснить каким образом сурвивин способен выполнять разные, во многом противоположные, функции в одном и том же процессе в клетке. Так например, можно предположить, что при делении часть сурвивина, находясь в виде мономера, входит в состав СРС и участвует в дестабилизировании неправильно прикреплённых к кинетохорам микротрубочек (Бе1асоиг-Ьагозш М. И соавторы, 2007), а димерная фракция сурвивина, взаимодействуя с микротрубочками веретена деления и, напротив, повышает их стабильность. Такая гипотеза кажется нам крайне вероятной, так как доказано, что в состав СРС входит именно мономер сурвивина.

В рамках данной работы показано, что только димер сурвивина влияет на стабильность микротрубочек, и вероятно только он, способен связыватся с полимеризованным тубулином, играя роль адаптора между микротрубочками и другими белками виш О.1., 2004. Таким образом, если предположить что часть своих функций сурвивин выполняет в виде димера, а часть в виде мономера, то регуляция равновесия димер-мономер может служить для «переключения» между различными функциями сурвивина.

Часть работы выполнена в рамках проекта 05-04-48954-а «.1-пептид секреторных полимерных иммуноглобулинов человека при плоскоклеточном раке легкого», поддержанного РФФИ

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Антипова, Надежда Викторовна, Москва

1. Свердлов Е.Д. Проект «Создание технологии дифференциальной протеомики и ее использование для получения новых противораковых препаратов». Номер контракта: 02.467.11.3006.2. .Van Cruchten S, Van Den Broeck W//. Anat Histol Embryol, 2002. 31:p.214-223.

2. Schimmer AD. // Cancer Res., 2004. 64:p.7183-7190.

3. Altieri DC. И Nat Rev Cancer, 2008. 8:p.61-70.

4. Du C, Fang M, Li Y, Li L, Wang X. // Cell, 2000. 102:p.33-42.

5. Altura R.A. II Br J Cancer, 2003. 89: p. 1743-9.

6. Kajiwara Y. // Cancer, 2003. 97: p. 1077-83.

7. Kleinschmidt DeMasters B.K. // Arch Pathol Lab Med, 2003, 127: p. 826-33.

8. Span P.N. // Clin Chem, 2004. 50: p. 1986-93.

9. Shariat S.F. // Cancer, 2004. 100: p. 751-7. 11. Krieg A.// Br J Cancer, 2002. 86: p. 737-43.

10. McNeish I.A., Lopes R., Bell S.J., McKay T.R., Fernandez M., Lockley M., Wheatley S.P., Lemoine N.R. // Experimental Cell Research, 2005. 302: p. 69- 82.

11. Dohi Т., Beltrami E., Wall N. R., Plescia J., Altieri D. С. II J. Clin. Invest, 2004. 114: p.l 117-1127.

12. Chiou SK, Jones MK, Tarnawski AS. // MedSci Monit 2003,9:p.25-29.

13. Li H, Zhu H, Xu CJ, Yuan J. // Cell 1998. 94:p.491-501

14. Marioni G, D'Alessandro E, Bertolin A, Staffieri A. // Acta Otolaryngol 2009:1-6.

15. Kang B.H, Altieri D.C. // The journal of biological chem. 2006. 281: p. 24721-24727.

16. Altieri, D.C. II Oncogene, 2003. 22: p. 85816.

17. Dipartimento di Oncologia Sperimentale, Fondazione IRCCS Istituto Nazionale dei Tumori, Via Venezian 1, 20133 Milan, Italy.

18. Zimmermann, K.C., C. Bonzon, and D.R. Green // Pharmacol Ther, 2001. 92: p. 57-70.

19. Jeyaprakash A.A., Klein U.R., Lindner D., Ebert J., Nigg E.A , Conti E. // Cell, 2007. 131 :p. 271-285.

20. O'Connor D.S., Schechner J.S., Adida C., Mesri M., Rothermel A.L., Li F. Am J Pathol, 2000, 156:p.393-398.

21. Duffy MJ, O'Donovan N, Brennan DJ, Gallagher WM, Ryan BM. // Cancer Lett, 2007, 249 p:49-60.

22. Caldas H, Honsey LE, Altura RA. // Mol Cance, 2005, 4: p 11.

23. Dieuwke Engelsma, Jose A. Rodriguez, Alexander Fish, Giuseppe Giaccone, Maarten Fornerod. // Traffic, 2007. 8, p:1495-1502.

24. Muchmore S.W.,Chen J., Jakob C., Zakula D., Matayoshi E. D., Wu W., Zhang H., Li F., Shi-Chung Ng, Altieri D.C. II Molecular Cell, 2000. 6: p.173-182.

25. Mahotka C., Liebmann J., Wenzel M., Suschek C.V., Schmitt M., Gabbert H.E., Gerharz C.D. II Cell Death and Differentiation, 2002. 9:p.l334-1342.

26. Stauber R. H., Mann W., Knauer S. K. // Cancer Res, 2007. 67: p. 59996002.

27. Fortugno. P, Wall N.R., Giodini A., O'Connor D. S., Plescia J., Padgett K.M., Tognin S., Marchisio P.C., Altieri D.C. II Journal of Cell Science, 2002. 115:p. 575-585.

28. Cell Signaling Technology, Inc. (2007) #2807. INCENP (P240) Antibody.

29. Noton E.A., Colnaghi R., Tate S., Starck C., Carvalho A., Ferrigno P. K, Wheatley S. P. // The journal of biological ehem.,2006. 281:p. 12861295.

30. Beauchamp L., Batten D.M., Magdaleno S., Krebs J.,Cheng A., Ford L. // TechNote, 2007.3(4).

31. Ogura A., WatanabeY., IizukaD., Yasui H., Amitani H., Kobayashi S., Kuwabara H. // Cancer Letters, 2008. 259, 71-81.

32. Marlene Delacour-Larose, My-Nhung Hoang Thi, Stefan Dimitrov, Annie Molla. // Cell Cycle,2007. 6, 1878-1885.

33. Fortugno P., Beltrami E.,Plescia Y., FontanY., Pradhan D., Marchisio

34. Р.С., Sessa S. // PNAS,2003. 100, 13791-13796.

35. Zhiyin Song, Shixin Liu, He He, Naser Hoti, Yi Wang, Shanshan Feng, Mian Wu. A II Molecular Biology of the Cell, 2004. 15:p.7-1296.37. .Sah N.K,.Khan Z, Bisen P.S. // Cancer Letters, 2006. 244: p. 164.

36. Fortugno, P.J/JCellSci, 2002. 115:p.575-85. 39. Dohi Т. II J. Clin. Invest.,200АЛ 14:p. 1117-1127

37. Zimmermann КС, Bonzon C, Green DR. // Pharmacol Ther.,2001. 92:p. 57-70.

38. Lorenzo H.K., Susin S.A., Penninger J., Kroemer G„ // Cell Death and

39. Differentiation, 1999. 6:p. 516-524. 42. Ченцов IO. С. «Введение в клеточную биологию». 2004, Академкнига, Москва, стр. 494.

40. Peter, М.Е. and Р.Н. Krammer. Т// Cell Death Differ, 2003. 10(1): p. 2635.

41. Tong Liu, Brook Brouha, Douglas Grossman. 11 Oncogene, 2004. 23: p. 39-48.

42. Budihardjo I. И Annu Rev CellDev Biol, 1999. 15: p. 269-90.

43. Scaffidi C. // EmboJ, 1998. 17(6): p. 1675-87.

44. Douglas J. Kominsky,l Ryan J. Bickel,l and Kenneth L. Tyler. // Journal of virology, 2002. 76: p.l 1414-11424.

45. Silke J, David L. Vaux. II Journal of Cell Science, 2000. 114: p. 1821-1827.

46. Shi-Ting Bao, Shui-Qing Gui and Mu-Sheng Lin. // Hepatobiliary PancreatDis Int. 2006.5: p 580-583.

47. Fu J, Jin Y, Arend LJ. IIJ Biol Chem. 2003.278:p. 52660-52672.

48. Zhiyin Song, Xuebiao Yao, Mian Wu. // The journal of biological chem.,2003. 278: p. 23130-23140

49. Июль-Август 2008, С. 652-661.

50. Obiol-Pardo С, Manuel Granadino-Rolda'n J., Rubio-Martinez J. II J. Mol. Recognit.2008. 21:p. 190-204.

51. Sun C., Nettesheim D., Liu Z., Olejniczak E.T. // Biochemistry, 2005. 44: p. 11-17.

52. Atsushi Suzuki, Midori Hayashida, Takeshi Ito, Iiirokazu Kawano, Takeshi Nakano, Masayuki Miura, Kouchi Akahane, Katsuya Shiraki. // Oncogene. 2000. 19: p. 3225-3234.

53. Margaret A. Bolton, Weijie Lan, Shannon E. Powers, Mark L. McCleland, Jian Kuang, P. Todd Stukenberg. // Molecular Biology of the Cell. 2002. 13, p 3064-3077.

54. Xiaomei Yan, Lihuan Cao, Qiang Li, Yanhua Wu, Haoxing Zhang, Hexige Saiyin, Xianghua Liu, Xuqing Zhang, Qinghua Shi, Long Yu. // Genes to Cells 2005.10: p 617-626.

55. Susanne M.A. Lens. Rene H. Medema. // Cell Cycle.2003. 2: p 507-510.

56. Keen N., Taylor S. II Nat Rev Cancer .200A. 4: p 927-936.

57. Jack Rosa, Pedro Canovas, Ashraful Islam, Dario C. Altieri, Stephen J. Doxsey. II Molecular Biology of the Cell 2006. 17: p 1483-1493.

58. Chun Hei Antonio Cheung, Huang-Hui Chen, Ching-Chuan Kuo, Chi-Yen Chang, Mohane S Coumar, Hsing-Pang Hsieh, Jang-Yang Chang. Molecular Cancer. 2009. 8: p 43.

59. Oliver J. Gruss, Isabelle Vernos. // The Journal of Cell Biology, 2004.V.166. 7:p 949-955.

60. Fang Xia, Pedro M. Canovas, Thomas M. Guadagno, Dario C. Altieri. A // Molecular and cellular biology. 2008. p. 5299-5311.

61. Altieri D.C. Current Opinion in Cell Biology. 2006. 18:609-615.

62. Srinivasa M. II Mol Cell. 2008. 25; 30(2): 123-135.

63. Altieri D.C. Oncogene. 2008. October 20; 27(48): 6276-6284.

64. Aki Ogura, Yasuko Watanabe, Daisuke Iizuka, Hironobu Yasui, Makoto Amitani, Saori Kobayashi, Mikinori Kuwabara, Osamu Inanami. Cancer Letters. 2008.259,71-81.

65. Grossman D, McNiff JM, Li F, Altieri D.C. II J Invest Dermatol. 1999. 113(6): 1076-81.

66. Ling X, Li F. // Biotechniques. 2004. 36(3):450-4, 456-60.

67. Marzia Pennati, Mara Binda, Michelandrea De Cesare, Graziella Pratesi, Marco Folini, Lorenzo Citti, Maria Grazia Daidone, Franco Zunino, Nadia Zaffaroni. // Carcinogenesis 2004.V. 25. 7: p.l 129-1136.

68. Mesri M, Wall NR, Li J, Kim RW, Altieri D.C. // J Clin Invest. 2001. 108(7):p 981-90.

69. Janet Plescia, Whitney Salz, Fang Xia, Marzia Pennati, Nadia Zaffaroni, Maria Grazia Daidone, Massimiliano Meli, Takehiko Dohi, Paola Fortugno, Yulia Nefedova, Dmitry I. Gabrilovich, Giorgio Colombo, D.C. Altieri. // Cancer cell. 2005. 7: 457-467.

70. Cristian Obiol-Pardo, Jose Manuel Granadino-Rolda'n, Jaime Rubio-Martinez. II J. Mol. Recognit.2008. 21, 190-204.

71. Laemmli U. K.//Nature. 1970. 227: p.680-685.

72. Bradford M. M.// Anal Biochem. 1976. 72: p 248-254.

73. Harlow E., Lane D. Antibodies: A laboratory manual. New York: Cold Spring Harbor Laboratory. 1988.

74. Sali A., and Blundell T. L. J Mol Biol. 1993.234: p 779-815.

75. Hwang C. Y., Ryu Y. S., Chung M. S., Kim K. D., Park S. S., Chae S. K., Chae H. Z., and Kwon K. S. // Oncogene. 2004.23: p 8868-8875.

76. Pei Y., Xing D., Gao X., Liu L., and Chen // Apoptosis.2007. 12: p 16811690.

77. Rajalingam K., Oswald M„ Gottschalk K., and Rudel T. Apoptosis. 2007. 12:p 1503-1510

78. Zhu YY, Machleder EM, Chenchik A, Li R, Siebert PD. II Biotechniques. 2001. 30: p 892-897.

79. Amt CR, Chiorean MV, Heldebrant MP, Gores GJ, Kaufmann SH. II J Biol Chem. 2002. 277: p 44236-44243.

80. Checinska A, Hoogeland BS, Rodriguez JA, Giaccone G, Kruyt FA. II Exp Cell Res. 2007. 313: p 1215-1224.

81. Petrucci E, Pasquini L, Petronelli A, Saulle E, Mariani G, Riccioni R, et alJ/. Gynecol Oncol. 2007.105: p .481-492.

82. Mao H.L. Mao HL, Liu PS, Zheng JF, Zhang PH, Zhou LG, Xin G, Liu C.II Pharmacol Res. 2007. 56:483-492.

83. Chai J, Du C, Wu JW, Kyin S, Wang X, Shi Y. II Nature. 2000.406: p 855-862.

84. Asra Mirza, Marnie McGuirk, Tish N Hockenberry, QunWu, Hena Ashar, Stuart Black, Shu Fen Wen, Luquan Wang, Paul Kirschmeier, W Robert Bishop, Loretta L Nielsen, Cecil B Pickett, Suxing Liu. // Oncogene.2002. 21, 2613 2622.

85. Jian Zhao, Tencho Tenevl, Luis M. Martins, Julian Downward, Nicholas R. Lemoine. II Journal of Cell Science. 2000.113, 4363-4371.

86. Alan H. Lau. II Kidney International. 1999. 56. p. 1295-1298.

87. Karen M. Henkels, John J. Turchi. II Cancer research. 1999 59, 30773083.

88. X Yang, M Fräser, MR Abedini, T Bai, BK Tsang. // British Journal of Cancer. 2008. 98, 803-808.

89. Jin-Tang Chen, Chih-Yang Huang, Yung-Yen Chiang, Wen-Heng Chen, Shiow-Her Chiou,Chih-Yi Chen, Kuan-Chih Chow. Am J Respir II Cell Mol Biol. 2008. 38: p 559-565.

90. Song Z., Liu S., He H., Hoti N., Wang Y„ Feng S., and Wu M. II Mol Biol Cell. 2004. 15: p 1287-1296.

91. Wang H., Holloway M. P., Ma L., Cooper Z. A., Riolo M., Samkari A., Elenitoba-Johnson K. S., Chin Y. E., and Altura R. A. II JBiol Chem. 2010. 285: p 36129-36137.

92. Stavnezer J. II Curr. Opin. Immunol. 1996. 8: p. 199 -205.

93. Norderhaug I.N. Johansen F.E., Schjerven H., Brandtzaeg P.// Crit. Rev. Immunol. 1999. V19. P.481-508.

94. Brandtzaeg PЛ Nature. 1974. 252: p. 418-420.

95. Brandtzaeg ?.//Mol. Immunol. 1983. 20: p. 941-966.

96. Wycoff K.L. // Current Science Publishers. 2005. 11, 19: p 2429-2437(9).

97. Kirchner Т., Steininger H., Faller G.//Digestion.\991. 58 (Suppl 1): p 14-26.

98. Watanabe Т., Goto H., Arisawa T.II. J. Gastroenterol Hepatol. 1997. 12.: p 660-665.

99. Dail D.H., Hammar S.P.// Pulmonary pathology. 1993: p 1640 .

100. Stavnezer J.//. Curr. Opin. Immunol.1996. 8. p 199 -205.

101. Беляков И.М. II Иммунология. 1997. 4. p 7-12.

102. B.T. Иванов. Белки иммунной системы. М.:Полиграфический участок ИБХ РАН, 1997.

103. Jerry L.M., Kunkel H.G., Adams L Л J Immunol. 1972. 109. p 275.

104. Natvig I.B., Johansen F.-E., Nordeng T.W., Haraldsen G., Brandtzaeg P. II J. Immunol. 1997. 159: p 4330.

105. Song W., Vaerman J.P., Mostov K.E.IIJ Immunol. 1995.155 :p715.

106. Altamirano G.A., Barranco-Acosta C., Van Roost E., Vaerman S.?.II Mol Immunol. 1980. 17: p 1525.

107. Gurevich P. // International Journal of Molecular Medicine. 2003. 12: p 289-297.

108. Д.К.Слижикова, М.В.Зиновьева, Д.В.Кузьмин, Е.В.Снежков, М.И.Шахпаронов, Р.И.Дмитриев, Н.В.Антипова, Л.Л.Завалова, Е.Д.Свердлов Л Молекулярная биология. 2007. 41(4): р 659-665.

109. Vaerman J.P., Langendries A., Vander Maelen О.J ¡Immunol Invest. 1995. 24: p 631.

110. National Jewish Center for Immunology and Respiratory Medicine (Denver, CO). United States Patent 5698679.1. БЛАГОДАРНОСТИ.

111. Особенную благодарность автор приносит академику Евгению Давидовичу Свердлову, за участие в проекте и заданное направление в исследовании, а так же за ценные дополнения и примечания к выполненной работе.

112. Автор глубоко признателен Заваловой Людмиле Львовне за ценные советы, предоставляемые в процессе работы, за постоянное внимание и помощь в творческом осмыслении результатов на всех этапах работы.

113. Автор выражает благодарность своему научному руководителю Шахпаронову Михаилу Ивановичу за возможность работать в ГМБС, за незаменимые советы и поддержку во всех начинаниях.

114. Автор благодарен Галине Сергеевне Монастырской за организацию благоприятной рабочей обстановки и подаренную заботу, и хорошее настроение.

115. Погосяну Рудольфу Андреевичу за поддержку и заботу о диссертации.

116. Огромное спасибо моим студентам Павлюкову Марату, Михайловой Лиде и Фадеевой Юлии за замечательные часы, проведенные с ними в компании, идеи и свершения.

117. Благодарю сотрудников лаборатории Химии липидов за литры выпитого чая, незаменимые советы, внимание, терпение и плодотворное обсуждение полученных результатов.

118. Моим дорогим друзьям Болдыреву Ивану, Алексеевой Анечке, Кузнецовой Наталье, Алексею Богданову, Саше Мишину, Наташе Мишиной, Кате Серебровской, Дмитрию Дидычу, Леониду Асееву, Инне Курковой.

119. Благодарю Коваленко Елену Ивановну и Каневскому Леониду Михайловичу за разрешение поработать на проточном цитометре.

120. Также спасибо всем сострудникам Института за участие в обсуждении различных аспектов данной работы и прекрасную дружескую атмосферу, которая помогает и в работе, и в жизни.

121. ИБХ ДЛЯ АВТОРА ЭТО И ДОМ, И ДРУЗЬЯ, И СЕМЬЯ.

122. СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

123. И. О. Макаров Т. В. Овсянникова Н. А. Шешукова А. С. Федотова Е. И. Боровкова М. И. Шахпаронов, Н. В. Антипова. Онкологические аспекты гиперпластических процессов в эндометрии. Российский вестник акушера-гинеколога, 2011. №1.14-16.

124. Н. В. Антипова, Е. В. Снежков, Л. Л. Завалова, М. И. Шахпаронов. Иммунологическое исследование тканевой специфичности J-пептида секреторных полимерных иммуноглобулинов человека. Биоорг.химия 2010, 36 (6): 774-778.

125. Н. В. Антипова. Диагностическая система «Пептосурвим» для определения белка сурвивина в биологических образцах. Вестник Российского Государственного Медицинского Университета. Спец. Выпуск №1. 2011. Стр.233234.1. Тезисы докладов:

126. Антипова Н.В., Завалова JI.JL, Копанцев Е.П., Свердлов Е.Д.

127. J-пептид секреторных полимерных иммуноглобулинов человека при плоскоклеточном раке и аденокарциноме легких. XIX зимняя молодежная научная школа «Перспективные направления физико-химической биологии», 2007. Москва. Стр.58.

128. Антипова H.B., Дмитриев Р.И., Шахпаронов М.И., Копанцев Е.П., Завалова JI.JI, Свердлов Е.Д. Regulation of human immunoglobulin J-peptide expression in non-small cell lung cancer (NSCLC). FEBS 2007, Вена, pp.158,

129. Павлюков М.С., Антипова Н.В., Завалова Л.Л., Шахпаронов М.И. Изучение взаимодействия рекомбинантных белков survivin и SMAC/DIABLO in vitro. Международная конференция ИБХ, посвященная 75-летию Ю.А.Овчинникова, Москва, ИБХ, 2009, тезисы докладов, стр.314.

130. Антипова Н.В., Шахпаронов М.И. ДИАГНОСТИЧЕСКАЯ СИСТЕМА «ПЕПТОСУРВИМ». Школа-конференция молодых ученых "Фундаментальная наука для биотехнологии и медицины- 2010 ". стр4-6.

131. Павлюков М.С., Антипова Н.В., Шахпаронов М.И. СОЗДАНИЕ НОВЫХ ПРОТИВООПУХОЛЕВЫХ ПРЕПАРАТОВ НА ОСНОВЕ БЕЖА СУРВИВИН. Школа-конференция молодых ученых "Фундаментальная наука для биотехнологии и медицины- 2010. стр 67.

132. Павлюков М.С., Антипова Н.В., Завалова Л.Л., Шахпаронов М.И. Изучение механизмов ингибирования апоптоза белком Сурвивин. 14-ая Международная Пущинская школа конференция молодых ученых «Биология-Наука XXI века». 19-23 апреля 2010, тезисы, стр.314.

133. Антипова Н.В., А.С.Федотова, Л.Л.Завалова, М.И. Шахпаронов. Диагностический набор «Пептосурвим». Всероссийская школа-семинар студентов, аспирантов и молодых ученых по направлению «Нанобиотехнология». 2010, стр.14.

134. Антипова Н.В., Федотова A.C., Шахпаронов М.И. Определение белка сурвивина в эндометрии с помощью диагностического набора «Петосурвим». 12 зимняя молодежная научная школа, Москва, ИБХ, 2010, стр.67

135. Павлюков М.С., Антипова Н.В., Шахпаронов М.И. Участие мономера сурвивина в регуляции апоптоза .12 зимняя молодежная научная школа, Москва, ИБХ, 2010, стр.47.

136. Антипова Н.В., А.С.Федотова. Онкологические аспекты гиперпластических процессов эндометрия. XVI Российский национальний конгресса «Человек и лекарство». 2010. Москва

Информация о работе

Антипова, Надежда Викторовна
кандидата биологических наук
Москва, 2011
ВАК 03.01.03

Диссертация

Изучение свойств белков Survivin, Smac/Diablo, J-chain человека и возможности их использования в качестве диагностических и терапевтических средств - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы