Повышение противоопухолевой активности цитокина TRAIL путем изменения аминокислотного состава белка

Яголович, Анна Валерьевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Повышение противоопухолевой активности цитокина TRAIL путем изменения аминокислотного состава белка
ВАК РФ 03.01.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Повышение противоопухолевой активности цитокина TRAIL путем изменения аминокислотного состава белка"

На правах рукописи

ЯГОЛОВИЧ АННА ВАЛЕРЬЕВНА

ПОВЫШЕНИЕ ПРОТИВООПУХОЛЕВОМ АКТИВНОСТИ ЦИТОКИНА TRAIL ПУТЕМ ИЗМЕНЕНИЯ АМИНОКИСЛОТНОГО СОСТАВА БЕЛКА

Специальность: 03.01.02 - Биофизика

О 3 ОЕЗ Z011

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва-2010

4843606

Работа выполнена на кафедре биоинженерии Биологического факультета Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова и в лаборатории инженерии белка Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова

Ведущая организация: Центр «Биоинженерия» РАН

Защита состоится 24 февраля 2011 г. в ... ч.... мин. на заседании диссертационного совета Д.501.001.96 при кафедре биофизики Биологического факультета Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова по адресу: 119991, Москва, Воробьевы Горы, МГУ, биологический факультет, кафедра биофизики, Новая аудитория

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета МГУ.

РАН.

Научные руководители:

профессор, д.б.н. Д.А.Долгих к.б.н. М.Э. Гаспарян

Официальные оппоненты:

д.б.н. Купраш Дмитрий Владимирович к.б.н. Дугина Вера Борисовна

Учёный секретарь диссертационного совета,

М.Г. Страховская

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Цитокин TRAIL (TNF-Related Apoptosis-Inducing Ligand) был обнаружен в 1995 году на основе гомологии последовательности с другими членами семейства TNF (Tumor Necrosis Factor). Он экспрессируется в клетках в виде трансмембранного белка II типа. В результате расщепления протеазами внеклеточный домен TRAIL высвобождается из клетки в свободном растворимом тримерном виде. Рекомбинантный растворимый TRAIL способен вызывать апоптоз в культурах клеток из широкого спектра человеческих опухолей, не затрагивая нормальные клетки. Благодаря этому свойству препарат рекомбинантного цитокина TRAIL рассматривается в качестве многообещающего потенциального терапевтического средства для лечения раковых заболеваний.

Изначально препарат рекомбинантного белка TRAIL был получен в бактериях и содержал гистидиновый таг на С-конце молекулы (His/TRAIL). Позднее было показано, что препарат TRAIL с гистидиновым тагом образует многомерные агрегаты и проявляет значительную токсичность на гепатоцитах. В дальнейшем был получен препарат TRAIL (а.о. 114-281) без тагов, который состоял только из активных тримерных молекул и практически не проявлял токсичности. Однако этот препарат был экспрессирован с добавлением инициаторного метионинового кодона и обладал потенциально высокой антигенностью, поскольку при экспрессии белков в бактериях Л'-концевой метионин расщепляется не полностью. Таким образом, получение качественного препарата рекомбинантного внеклеточного домена цитокина TRAIL (а.о. 114-281) без дополнительных искусственных последовательностей, без Л'-концевого метионина и с высоким выходом белка является важной задачей для успешного применения TRAIL в терапии раковых заболеваний.

индуцированный апоптоз, конкурируя с рецепторами смерти DR4 и DRS за связывание с TRAIL или препятствуя передаче сигнала апоптоза. Для выяснения роли каждого из рецепторов DR4 и DR5 в механизме TRAIL-индуцированного апоптоза ранее методом фагового дисплея были получены DR4 и DRS-селективные мутантные варианты TRAIL, содержащие по б аминокислотных замен. Другие DR4 и ВК5-селектнш1ые мутантные варианты TRAIL (D218H и D269H) были получены с помощью алгоритма автоматического дизайна FOLD-X. Все ранее охарактеризованные мутантные варианты в той или иной степени избирательно связывались с рецепторами DR4 или DR5, однако сохраняли высокое сродство к рецепторам-«ловушкам» DcRl и DcR2. Повышение селективности лиганда к рецептору DR5 наряду с повышением биологической активности позволит увеличить спектр потенциального применения цитокина TRAIL в терапии раковых заболеваний.

Цель исследования. Повышение селективности цитокина TRAIL к рецептору смерти DR5 путем введения комбинации DR5-cneuH(j>H4ecKHX мутаций в структуру белка и получения рецептор-специфичных мутантных вариантов DR5-A и DR5-B; определение их констант диссоциации при связывании с пятью рецепторами TRAIL и исследование биологической активности всех препаратов на различных линиях раковых клеток для создания эффективных средств терапии опухолевых заболеваний.

Основные задачи исследования.

1. Получить эффективную экспрессионную конструкцию для продукции рекомбинантного цитокина TRAIL в виде гибридного белка с тиоредоксином в Е. coli, разработать методику очистки и ренатурации гибридного белка тиоредоксин/TRAIL и очистки целевого белка TRAIL.

2. Охарактеризовать физико-химические свойства и исследовать биологическую активность полученного препарата TRAIL

3. Получить и очистить новые мутантные варианты TRAIL, специфичные к рецептору смерти DR5.

4. Определить константы связывания TRAIL дикого типа и его рецептор-специфичных мутантных вариантов с пятью рецепторами TRAIL методом поверхностного плазмонного резонанса.

5. Провести сравнительный анализ биологической активности TRAIL дикого типа и его мутантных вариантов в различных линиях раковых клеток.

Научная новизна и практическая значимость работы. В данной диссертационной работе были разработаны новые эффективные методы экспрессии и очистки рекомбинантных препаратов TRAIL и новых DRD-специфичных мутантных вариантов DR5-A и DR5-B. Разработанные методы позволяют очистить до 300 мг (300 мг из телец включения и 75-100 мг из цитоплазматической фракции белков) высокоактивного целевого белка TRAIL из 1 литра культуры клеток, что позволяет рассматривать препарат как потенциальное противоопухолевое средство, пригодное для клинических испытаний. Кроме того, в данной работе получены новые мутантные варианты TRAIL DR5-A и DR5-В. Показано, что они обладают наибольшей специфичностью к рецептору DR5 по сравнению с ранее описанными рецептор-специфичными мутантными вариантами. Наряду с высокой аффинностью к рецептору DR5, они практически не связывались с рецептором DR4 и с рецепторами-«ловушками» DcRl и DcR2. Кроме того, мутантные варианты TRAIL DR5-A и DR5-B в несколько раз эффективнее вызывали апоптоз в DR5-зависимых линиях раковых клеток, что делает их потенциальными кандидатами для терапии опухолей, резистентных к TRAIL дикого типа.

Апробация результатов работы. Результаты работы были представлены на следующих конференциях: 1) XIII Международная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2006», 12-15 апреля 2006 г., Москва, Россия; 2) Первый студенческий симпозиум по биоинженерии, 27-31 октября 2006 г., Москва, Россия; 3) XIV Международная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2007», 20-23 апреля 2007 г., Москва, Россия; 4) IV Международная конференция "Постгеномные технологии разработки противоопухолевых агентов с новыми механизмами действия", 3 декабря 2007 г., ЦВТ ХимРар, Химки, Московская обл., Россия; 5) XVI Евроконференция по апоптозу, 6-9 сентября 2008 г., Берн, Швейцария, 6) III Евразийский конгресс по медицинской физике и инженерии "Медицинская физика -2010", 21-25 июня 2010 г., Москва, Россия, 7) VII Конференция «Митохондриальная Физиология - 2010» 27 сентября - 1 октября 2010 г., Обергургль, Тироль, Австрия, 8) XIV Российский онкологический конгресс, 23-25 ноября 2010 г. Москва, Россия.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 12 печатных работ, в том числе 3 статьи, 8 тезисов конференций и 1 патент РФ.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов, обсуждения, заключения, выводов и списка литературы. Работы изложена на 162 страницах машинописного текста, содержит 27 рисунков, 5 таблиц. Список литературы включает 269 источников.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Экспрессия я очистка рекомбинантного цитокина TRAIL в Kcoli

Синтез гена TRAIL (114-281) и клонирование его в экспрессионный вектор.

Последовательность ДНК, кодирующая внеклеточную часть цитокина TRAIL (а.о. 114281), была синтезирована из 20 перекрывающихся олигонуклеотидов (длиной 37-43 н.) с помощью ПЦР. Полученный ген был клонирован в плазмидный вектор рЕТ-32а, предназначенный для продукции в Е. coli гибридных белков с тиоредоксином на Л'-конце, целевым белком на С-конце и соединяющим их линкером, содержащим сайт узнавания энтеропептидазы и последовательность из шести гистидиновых остатков для аффинной очистки (Рис. 1). Преимущество данной генетической конструкции заключается в том, что получаемый рекомбинантный белок не содержит дополнительных тагов. Результатом является очищенный цитокин TRAIL с природной третичной структурой и нативным N-концом.

nonnHis-таг \

N THIOREDOXIN |-| нннннн р| PDDOK |—f TRAIL

Сайт расщепления энтеропептидаэои

Рис. 1. Схематическое изображение гибридного белка Trx/TRAIL.

Экспрессия слитного белка Trx/TRAIL в ExolL Для экспрессии гибридного белка Trx/TRAIL был выбран штамм Е. coli BL21(DE3) (генотип F'OmpT hsdSß (гв' гпв") gal dcm(DE3)), предназначенный для работы с системами экспрессии, основанными на активности промотора бактериофага Т7. Штамм Е. coli BL21(DE3) трансформировали полученным экспрессирующим вектором pET-32a/TRAIL. Оптимальную концентрацию индуктора ИПТГ (изопропил-р-тиогапактопиранозид) подобрали в предварительных экспериментах (Рис. 2). Наибольший уровень экспрессии гибридного белка Trx/TRAIL (150 мг со 100 мл культуры Е. coli) был достигнут при индукции клеток с помощью 0.02 мМ ИПТГ при росте в богатой среде ТВ в течение 24 часов при 27°С (Рис.2, дорожка 2).

Ренатурация и очистка и гибридного белка Trx/TRAIL. В результате экспрессии был получен гибридный белок Trx/TRAIL молекулярной массой 36 кДа (19 кДа TRAIL и 17 кДа тиоредоксин с линкером), который на 90% находился в составе телец включения (данные не показаны). Получение целевого белка проводили с помощью ренатурации нерастворимого гибридного белка Trx/TRAIL в составе телец включения.

Концентрация ИПТГ (мМ)

кДа 0.01 0.02 0.05 0.1 0.2 0.5 0.75 1.0 1.5 0.0

•:;;:.;! У

щЛ ЯШ (§4 ч-Trx/TRAIL

Рис. 2. Подбор концентрации ИПТГ для индукции экспрессии гибридного белка Trx/TRAIL в штамме E.colu

mi щ

14 -

BL21(DE3). Пробы анализировали в 12% ДСН-ПААГ.

Процедура ренатурации включала растворение телец включения в растворе 6М гуанидина и дальнейший рефолдинг путем постепенного перевода белка в буфер, содержащий 0.7 М аргинина, 0.5 М хлорида натрия и 100 мМ трис-гидрохлорида (рН 8.0) и 1 мМ ДТТ, до конечной концентрации 0.8 - 1.0 мг/мл. Повышение концентрации белка способствовало ухудшению правильного сворачивания. После этого раствор белка инкубировали в течение 3-4 часов при комнатной температуре или в течение 16 часов при 4°С.

Вышеперечисленные условия (рН, концентрация солей, время инкубации) были оптимальными для рефолдинга и позволили получить выход до 60% белка после диализа против буфера, содержащего 300 мМ хлорида натрия, 20 мМ трис-гидрохлорида (рН 7.8), 1 мМ ДТТ и 0.02% азида натрия (Табл. 1). Гибридный белок Trx/TRAIL, полученный в результате ренатурации, был очищен методом металл-аффинной хроматографии на колонке с сорбентом Ni Sepharose High Performance (Рис. 3).

Расщепление гибридного белка Trx/TRAIL и очистка целевого белка TRAIL. Расщепление гибридного белка Trx/TRAIL проводили с помощью рекомбинантной легкой цепи энтеропептидазы человека (L-HEP) при концентрации белка 1.0 мг/мл. Энтеропептидаза расщепляла 98% гибридного белка Trx/TRAIL при молярном отношении фермент-субстрат 1:30000 в течение 16 часов при комнатной температуре. Оптимальный состав буфера для расщепления Trx/TRAIL энтеропептидазой включал 100 мМ хлорида натрия и 50 мМ трис-гидрохлорида (рН 8.0). Увеличение времени расщепления (более 16 часов) приводило к расщеплению тиоредоксина с 17 кДа до15.4 кДа (Рис. 3), что соответствует расщеплению после аминокислотного остатка 143 тиоредоксина. Для удалении остаточной активности L-HEP после расщепления раствор белка пропустили через колонку с СИТ-агарозой. TRAIL отделили от тиоредоксина методом металл-аффинной хроматографии на колонке с никелевой агарозой Ni-NTA.

Рис. 3. Очистка TRAIL после расщепления белка Trx/TRAIL энтеропетидазой. Пробы белковых препаратов анализировали в 12 %ДСН-ПАЛГ.

М—маркеры молекулярных масс; 1 - Trx/TRAIL после ренатурации и очистки на Ni Sepharose; 2 - препарат после расщепления белка Trx/TRAIL энтеропептидазой; 3 - фракция очищенного TRAIL после элюции с колонки Ni-NTA 35 мМ имидазолом, 4 - фракция белков после элюции 250 мМ имидазолом .

никелевой агарозой за счет наличия последовательности из шести гистидинов. TRAIL также способен связываться с никелевой агарозой, но с меньшей аффинностью, чем тиоредоксин. TRAIL элюировали буфером, содержащим 35 мМ имидазола, тогда как тиоредоксин начинал элюироваться при содержании имидазола более 100 мМ (Рис. 3).

Полученный раствор белка диализовали против буфера, содержащего 50 мМ фосфата натрия и 150 мМ хлорида натрия (рН 7.5), стерилизовали путем пропускания через стерильный фильтр и хранили при 4°С. Итоговый выход белка составил 41 мг из 100 мл культуры клеток (Табл. 1). Полученный препарат очищенного цитокина TRAIL сохранял стабильность и биологическую активность в течение не менее 3 лет при хранении как в растворенном, так и в лиофилизованном виде.

Таблица 1. Этапы очистки TRAIL из 100 мл клеточной культуры.

Этап очистки Целевой белок, мг Выход белка, %

Растворение телец включения3 Ренатурация Trx/TRAIL Очистка Trx/TRAIL на Ni-NTA High Performance Расщепление Td^RAIL энтеропептидазой Очистка TRAIL на Ni-NTA Superflow 150 90 85 80 (44 мг TRAIL) 41 100 60 95 90.5 93

"Тельца включения промыли ресуспендированием в 50 мл лизис-буфера, содержащего 20 мМ трис-гидрохлорида, (рН 7.5), 10 мМ ЭДТА, 1% Тритона Х-100 и центрифугированием при 30000g в течение 20 мин, 4°С. Отмытые тельца включения растворили в 25 мл буфера, содержащего 0.1М трис-гидрохлорид (рН 8.6), 30 мМ ДТТ и 6М гуанидин-гидрохлорид, и инкубировали в течение 3 часов при комнатной температуре, после чего удалили нерастворивишйся материал центрифугированием при 80000^, 4°С, 30 минут.

-Trx/TRAIL

kDa 200 •

66 = 45 31

_ 4—TRAIL

21 . ^^ «—Trx17kDa

14 — Щтш0 * Тгх 15 kDa

6 Щ

М 1 2 3 4

Тиоредоксин способен связываться с

После переноса полученного белка TRAIL на PVDF-мембрану с помощью ПААГ-электрофореза и электроблотгинга, определили его N-концевую аминокислотную последовательность (VRERGP). Полученная последовательность совпала с последовательностью аминокислотных остатков 114-119 человеческого цитокина TRAIL, что подтвердило идентичность рекомбинантного аналога.

Помимо получения белка TRAIL дикого типа путем ренатурации телец включения, мы также очистили TRAIL из растворимой фракции. Этот препарат имел аналогичную биологическую активность и коэффициент седиментации, что и полученный методом ренатурации. В связи с этим дальнейшие эксперименты проводили с препаратом, полученным из телец включения, поскольку его выход был примерно в 6 раз больше, чем у препарата, очищенного из цитоплазматической фракции (Табл. 3).

2. Исследование физико-химических свойств и биологической активности препарата рекомбинантного TRAIL

Исследование препарата рекомбинантного TRAIL методом аналитического ультрацентрифугирования. Для определения структуры и гомогенности полученного белка TRAIL был проведен седиментационный анализ на ультрацентрифуге Spinco Е (Beckman Coulter). Данные аналитического ультрацентрифугирования показали, что 98% полученного препарата рекомбинантного белка TRAIL состоит из тримерных молекул (Рис. 4). Это говорит о потенциальной эффективности препарата, так как TRAIL индуцирует апоптоз, находясь в тримерном состоянии. Препарат белка оставался гомогенным даже при высокой концентрации белка (1 мг/мл), фракция высокомолекулярных агрегатов не превышала 3%.

0.5 0.4 — 0.3

(Г

0.2 0.1 0

W к ь ^ Jr шГ w • ■'.'-в'

6 6.S 7

■ tui»' iii 1M , и ,1 ■ ahjta' I fofr'lf

0.3 tA 6.5 0.0 0.7 0.8 0.1

ft Mf-57.4 kDa 1

1 1 J \

1 2 3 4 5 6 7 Коэффициент седиментации 8 9 10

Рис. 4. Седиментограмма рекомбинантного белка TRAIL.

Анализ проводился при 60000 об/мин в стандартных кюветах объемом 0.4 мл. Кривые регистрировали на 1, 10, 20, 45, 54, 60, 74 и 86 минуте (кривые слева направо, соответственно) по поглощению при 280 нм. Радиус (по осиХ) вычисляли от верха до дна кюветы. Расчет распределения значений S производился по методу наименьших квадратов исходя из характера смещения средней точки седиментационных кривых, с использованием программы SEDFIT.

Вычисленный коэффициент седиментации 5,2о,и=4.49±0.04 соответствовал молекулярной массе 57439 Да в приближении сферической глобулы. Вычисленная масса находится в соответствии с теоретической молекулярной массой тримерного TRAIL 58577 Да. Это свидетельствует о том, что рекомбинантный TRAIL в растворимом виде представляет из себя глобулу.

Кристаллизация рекомбинантного TRAIL. Очищенный препарат TRAIL обладал способностью формировать кристаллы при концентрации выше 0.7 мг/мл при 4°С в буфере для хранения, содержащем 150 мМ хлорида натрия и 50 мМ фосфата натрия (рН 7.5). Кристаллы появлялись на второй неделе хранения при концентрации белка 1.5 мг/мл и имели вид правильной призмы с тройной симметрией размерами до 0.6x0.6x0.2 мм (Рис. 5 А). При концентрации белка 0.7 мг/мл в буфере, содержащем 50 мМ хлорида натрия и 50 мМ трис-гидрохлорида (рН 7.5), формировались кристаллы меньшего размера (данные не показаны). Анализ кристаллов методом рентгеновской спектроскопии показал разрешение дифракционной решетки -3.0 А (Рис. 5 Б). Кристаллы относятся к пространственной группе РЗ/ с параметрами единичной ячейки а=Ь=72.5 А, с= 141.5 А, а=р=90° и у=120°.

Биологическая активность рекомбинантного TRAIL. Препарат рекомбинантного тримерного TRAIL индуцировал частичную гибель клеток линии HeLa через 8 часов инкубации (Рис. 6). При более длительной инкубации (24 часа) TRAIL в концентрации 100 нг/мл вызывал 36% апоптоза (данные не показаны). Ингибитор синтеза белка эметин значительно усиливал действие TRAIL в клетках HeLa (Рис. 6). После 8-часовой инкубации полумаксимальная гибель клеток наблюдалась при концентрации TRAIL 10 нг/мл в присутствии эметина (0.3 мкг/мл). Максимальный эффект (90-100% клеточной гибели) наблюдали при концентрации TRAIL 100 нг/мл в присутствии эметина.

Рис. 5. Рентгеноструктурный анализ кристаллов TRAIL.

Кристаллы рекомбинантного TRAIL выращивали в буфере, содержащем 50 мМ фосфата натрия (рН 7.5) и 150 мМ хлорида натрия при концентрации белка 1.5 мг/мл и 4°С. Кристаллы достигали размеров 0.6x0.6x0.2 мм (А). Анализ кристаллов TRAIL методом рентгеновской спектроскопии с использованием Си Ка излучения на детекторе MAR-345 показал разрешение дифракционной решетки ~3.0 А (Б).

100 -

90 ' □ без эметина

Рис. 6. Индукция апоптоза рекомбинантным TRAIL в линии клеток HeLa.

Клетки инкубировали с серийными разведениями TRAIL в течение 8 часов. Для ингибирования синтеза белка вместе с TRAIL добавляли эметин (0.3 мкг/мл). Индукцию апоптоза определят методом подсчета клеток с

О 2.5 10 50 100

TRAIL, нг/мл

100 фрагментированными и

конденсированными ядрами.

Клеточная гибель имела характерные признаки апоптоза: уменьшение объема клеток, сморщивание цитоплазматической мембраны, конденсация и фрагментация ядер и др. (данные не показаны). Пан-каспазный ингибитор zVADfmk предотвращал клеточную гибель (данные не показаны). Уровень некроза (детектированный окрашиванием йодидом пропидия) не превышал 5% во всех экспериментах.

Цитотоксичность препарата TRAIL проверяли на клеточной культуре первичных фибробластов и на мышах. Препарат рекомбинантного цитокина TRAIL был нетоксичен для первичных фибробластов кожи в концентрации до 5000 нг/мл в присутствии и отсутствии эметина. Он также был нетоксичен для мышей при внутривенных инъекциях в дозе 30 мг/кг веса в день в течение 7 дней.

Апоптоз, вызванный TRAIL, полностью подавлялся при гиперэкспрессии онкобелка Bcl-2 в клетках HeLa-Bcl-2, как в присутствии, так и в отсутствие ингибитора синтеза белка эметина (Рис. 7). Ингибиторы микротрубочек таксол и колцемид, а также ингибитор актиновых микрофиламентов цитохалазин Д усиливали действие TRAIL и позволяли преодолеть защиту, связанную с гиперэкспрессией Bcl-2. В клетках HeLa-Bcl-2 в присутствии ингибиторов цитоскелета TRAIL вызывал апоптоз (около 40% клеточной гибели), уровень которого был сопоставим с уровнем апоптоза в исходной линии HeLa без ингибиторов (около 30% клеточной гибели). Усиление действия TRAIL ингибиторами цитоскелета сохранялось и в условиях подавления синтеза белка эметином (Рис. 7 Б).

Сигнальный путь при TRAIL-зависимом апоптозе включает образование лиганд-рецепторного комплекса, в который входит ряд белков цитоплазмы, включая каспазу-8. Далее следует протеолитическая самоактивация каспазы-8, расщепление белка Bid, его транслокация в митохондрии, выход цитохрома с (и других про-апоптозных белков) из митохондрий в цитоплазму, образование апоптосомы, в которой происходит активация каспазы-9 и других каспаз, осуществляющих финальные стадии апоптоза.

□ HeLa A

a HeLa Bcl-2

К |Цит.д| Колц-j Такс.

|Цит.Д| Колц.|Такс.

TRAIL

□ HeLa Б

В HeLa Bcl-2

Рис. 7. Апоптоз, вызванный TRAIL с цитоскелетными ингибиторами в клетках HeLa (светлые столбцы) и HeLa-Bcl-2 (штрихованные столбцы).

Клетки инкубировали с TRAIL (500нг/мл) без эметина в течение 24 ч (А) или в комбинации с ингибитором синтеза белка эметином (0,3 мкг/мл) в течение 8 ч (Б). Ингибиторы цитоскелета колцемид (0,5мкг/мл), таксол (ЮмкМ), и цитохалазин Д (1мкг/мл) добавляли одновременно с TRAIL. Апоптоз определяли методом подсчета клеточных ядер с конденсированным хроматином после окрашивания красителем Хёхст 33342 (1 мкг/мл). Данные представлены в виде среднего значения ± стандартное отклонение не менее трех независимых экспериментов.

В данной работе гиперэкспрессия Bcl-2 в клетках HeLa блокировала TRAIL-индуцированный выход цитохрома с из митохондрий. В этих клетках выход цитохрома с наблюдался лишь при обработке клеток HeLa Bcl-2 цитокином TRAIL в комбинации с ингибиторами цитоскелета (Рис. 8). Преодоление блокирующего действия Bcl-2 ингибиторами цитоскелета может быть связано с активацией более ранних этапов апоптоза, с инактивацией Bcl-2 или с изменением механизма выхода цитохрома с. Кроме того, каспаза-8 способна напрямую процессировать и активировать каспазу-3, которая,атакуя митохондрии, вызывает Вс1-2-независимый выход цитохрома с.

HeLa HeLa Bcl-2

Рис. 8. Выход цитохрома с из митохондрий в цитоплазму клеток HeLa и HeLa-Bcl-2 в процессе TRAIL-индуцированного апоптоза.

Клетки инкубировали с TRAIL (500нг/мл), эметином (0,3 мкг/мл) и таксолом (ЮмкМ) (в указанных экспериментах) в течение 24 часов. Цитохром с окрашивали с помощью специфических моноклональных антител. Стрелками показаны клетки, из которых цитохром с вышел в цитоплазму.

Однако в присутствии ингибиторов цитоскелета не наблюдалось усиления TRAIL-индуцированного процессинга прокаспазы-8, а также протеолиза ее субстрата Bid (данные не показаны). Это свидетельствует о том, что под действием ингибиторов цитоскелета не происходит активации ранних этапов TRAIL-индуцированного апоптоза. Ранее было показано, что ингибиторы микротрубочек (прежде всего таксол) способны инактивировать Вс1-2, вызывая его фосфорилирование. Для проверки этой возможности были исследованы способы индукции апоптоза в клетках HeLa, связанные с воздействием стауроспорина (неселективного ингибитора протеинкиназ) и кратковременного истощения АТФ. Однако защитный эффект Вс1-2 не ослаблялся ни при воздействии стауроспорина, ни при кратковременном истощением АТФ в присутствии ингибиторов цитоскелета (данные не показаны). По-видимому, стимулирующее действие ингибиторов цитоскелета на выход цитохрома с связано не с инактивацией Вс1-2, а с изменением механизма выхода цитохрома с из митохондрий в цитоплазму. Учитывая, что таксол и колцемид входят во многие современные схемы химиотерапии опухолей, их совместное применение с препаратом рекомбинантного TRAIL открывает широкие перспективы для лечения опухолей, резистентных к традиционной терапии.

3. Получение и исследование рецептор-специфических мутантных вариантов TRAIL

Для исследования механизмов TRAIL-индуцированного апоптоза в ряде лабораторий были получены DR4- и DRS-специфичные мутантные варианты TRAIL, имеющие в различной степени сниженную аффинность к рецепторам DcRl, DcR2 и OPG. В данной работе получены два новых DRS-специфичных мутантных варианта TRAIL DR5-A и DR5-B, обладающие повышенной селективностью к рецептору DR5 и высокой биологической активностью. Новые варианты DR5-A и DR5-B были разработаны на основе ранее описанного варианта DR5-8, полученного методом фагового дисплея, и D269H, полученного с помощью алгоритма автоматического дизайна FOLD-X (Табл. 2). Вариант DR5-8 обладал лучшей селективностью, чем D269H. Однако аффинность связывания варианта D269H с рецептором DR5 была в несколько раз выше по сравнению с вариантом DR5-8. Для повышения селективности без потери аффинности к рецептору DR5 мы разработали вариант DR5-A путем введения мутации D269H в аминокислотную последовательность варианта DR5-8, содержащего 6 других аминокислотных замен (Табл. 2). Анализ исходных данных показал, что аминокислотный остаток D267 не играет существенной роли в повышении селективности. Замена D267Q в варианте DR5-8 приводила к незначительному повышению аффинности и биологической активности.

Таблица 2. Аминокислотные замены в различных мутантных вариантах TRAIL.

Варианты TRAIL Аминокислотные замены Ссылки

wt TRAIL - - - - - - -

DR4-8 Y189A - Q193S N199V K201R Y213W S215D *

DR5-8 Y189N R191K Q193R H264R I266L D267Q - *

D269H - - - - - - D269H **

DR5-A Y189N R191K Q193R H264R 1266L D267Q D269H Данная работа

DR5-B Y189N R191K Q193R H264R I266L - D269H Данная работа

* Kelley, R. F., Totpal, K., Lindstrom, S. H. et al. (2005). Receptor-selective mutants of apoptosis-inducing ligand 2/tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand reveal a greater contribution of death receptor (DR)5 than DR4 to apoptosis signaling. J. Biol. Chem. 280:2205-2212.

** Van der Sloot, A.M., Tur, V., Szegezdi, E., et al. (2006). Designed tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand variants initiating apoptosis exclusively via the DR5 receptor. Proc Natl Acad Sei USA 103:86348639.

Для прояснения роли остатка D267 на основе варианта DR5-A был получен вариант DR5-В, содержащий обратную замену Q267D, как у TRAIL дикого типа (Табл. 2). Таким образом, в данной работе мы получили два новых мутантных варианта DR5-A и DR5-B, а также описанные ранее варианты DR4-8, DR5-8 и D269H для сравнения рецептор-специфичных свойств различных вариантов TRAIL. Все мутации вводили методом сайт-направленного мутагенеза.

Экспрессия и очистка мутантных вариантов TRAIL. Экспрессию рекомбинантных мутантных белков D269H, DR5-8, DR4-8, DR5-A и DR5-B проводили в виде гибридных белков с тиоредоксином аналогично TRAIL дикого типа. Однако в отличие от TRAIL дикого типа, который на 90% экспрессировался в нерастворимом виде, гибридные мутантные белки Trx/D269H, Trx/DR5-8, Trx/DR4-8, Trx/DR5-A и Trx/DR5-B на 60-70% экспрессировались в растворимом виде (данные не показаны). Введение мутаций в аминокислотную последовательность TRAIL привело к повышению растворимости белка в 3-5 раз. Возможно, повышение растворимости связано с тем, что все вводимые мутации расположены на поверхности молекулы TRAIL и являются более гидрофильными по сравнению с аминокислотными остатками дикого типа.

Гибридные мутантные белки Trx/D269H, Trx/DR5-8, Trx/DR4-8, Trx/DR5-A и Trx/DR5-B были очищены из растворимой фракции с помощью металл-аффинной хроматографии на колонке с сорбентом Ni Sepharose High Performance. Расщепление и очистку рекомбинантных мутантных белков D269H, DR5-8, DR4-8, DR5-A и DR5-B проводили аналогично TRAIL дикого типа. Итоговые выходы очищенных препаратов представлены в Табл.3.

Таблица 3. Итоговый выход очищенных препаратов вариантов TRAIL из цитоплазматической фракции белков (из 100 мл культуры клеток).

Варианты TRAIL Дикий тип DR4-8 DR5-8 D269H DR5-A DR5-B

Выход очищенного белка, мг 7.5 14 15 14.5 16 14

Данные седиментационного анализа показали, что рекомбинантные мутантные белки D269H, DR5-8, DR4-8, DR5-A и DR5-B на 98% состоят из тримеров и имеют относительную молекулярную массу 57-60 кДа. Седиментограммы мутантных вариантов TRAIL аналогичны TRAIL дикого типа (Рис.4).

4. Определение констант диссоциации при связывании различных вариантов TRAIL с пятью рецепторами.

Константы диссоциации для прямого связывания каждого из вариантов TRAIL с рецепторами определяли методом поверхностного плазменного резонанса. Рецепторы наносили на сенсорный чип с высокой плотностью (6000-8000 рез. ед.) для получения удовлетворительного сигнала от вариантов лиганда. Для предварительной оценки по 250 нМ высокоочшценных вариантов TRAIL (TRAIL дикого типа и его мутантные варианты DR5-8, D269H, DR5-A и DR5-B) одновременно наносили на бхб-канальный сенсорный чип с пятью иммобилизованными рецепторами DR4, DR5, DcRl, DcR2 и OPG (Рис. 9).

Рис. 9. Сенсограммы связывания вариантов TRAIL с пятью рецепторами, полученные методом поверхностного плазменного резонанса.

После регистрации сигналов чип регенерировали и сенсограммы регистрировали одновременно для пяти концентраций вариантов TRAIL в диапазоне от 15 до 250 нМ (с двукратным инкрементом). Сенсограммы анализировали методом нелинейного регрессионного анализа в соответствии с моделью связывания 1:1 программного обеспечения ProteOn Manager Version 2.0.1 (Bio-Rad) для определения скоростей диссоциации. Константы диссоциации Ко вычисляли из констант скоростей реакций по формуле Ко = kofl/kon для пяти различных концентраций.

Вычисленные значения Kd для TRAIL дикого типа находятся в соответствии с данными, полученными ранее. Анализ сенсограмм показал полное отсутствие связывания мутантных вариантов DR5-A и DR5-B, так же как и DR5-8, с рецепторами DR4 и DcRl, тогда как значение Ко варианта D269H для связывания с этими рецепторами лишь увеличилось в 18.5 и 8 раз, соответственно, по сравнению с TRAIL дикого типа (Табл. 4). В то же время, константа диссоциации варианта D269H для связывания с рецептором DR5 была в 4 и 9 раз ниже, чем Ко дикого типа и DR5-8, соответственно. Введение мутации D269H в вариант DR5-8 приводило к снижению Ко при связывании с рецептором DR5 полученного варианта DR5-A в 3.5 раза без потери селективности к другим рецепторам. Аффинность всех этих мутантных вариантов TRAIL по отношению к рецептору DcR2 была лишь немного ниже, чем TRAIL дикого типа. Однако введение обратной мутации Q267D в вариант DR5-A (вариант DR5-B) привело к значительному повышению селективности, практически не повлияв на аффинность к рецептору DR5 (Табл. 4). Аффинность мутантного варианта DR5-B к рецепторам DcR2 и OPG была в 280 и 223 раза ниже, соответственно, по сравнению с TRAIL дикого типа.

Таблица 4. Константы диссоциации при связывании различных вариантов TRAIL с пятью рецепторами, измеренные методом поверхностного плазмонного резонанса.

Варианты KD,W* м

TRAIL DR5 DR4 DcRl DcR2 OPG

Дикий тип 0.51 ±0.028 0.46 ±0.014 1.09 ±0.069 0.36 ± 0.009 0.99 ±0.017

D269H 0.13 ±0.003 8.47 ± 0.335 8.69 ±0.628 0.73 ±0.014 5.26 ±0.980

DR5-8 1.18 ±0.017 НС НС 3.32 ± 0.048 10.9 ±0.448

DR5-A 0.33 ± 0.005 НС НС 4.18 ±0.082 12.2 ±0.138

DR5-B 0.71 ±0.013 НС НС 101 ±7.0 143±13* 221±19*

DR4-8 НС 3.26 ±0.010 2.49 ±0.950 2.10 ±0.075 21.0± 0.140

НС, Нет связывания.

Стандартное отклонение вычисляли путем аппроксимации кривых сенсограмм с помощью программного обеспечения ProteOn Manager Version 2.0.1 software (Bio-Rad) по критерию хи-квадрат.

• Ко определяли по равновесным графикам (Рис. 10).

Рис. 10. Кривые связывания мутантного варианта DR5-B с рецепторами DcR2 и OPG (А) и графики зависимости равновесного связывания (Req) от концентрации мутантного варианта DR5-B (Б), полученные методом ППР. Цветными линиями показаны концентрации DRS-B от 62.5 нМ до 1 мкМи OPG от 125 до 2000 нМ.

Для этих случаев были характерны высокие значения скорости диссоциации комплексов рецептор-лиганд. Достоверное значение Ко при связывании с рецептором OPG вычисляли только путем измерения равновесного связывания. Значение Ко при связывании с рецептором DcR2 вычисляли как кинетическим, так и равновесным методом. Оба метода продемонстрировали приблизительно одинаковый результат (Рис. 10, Табл. 4).

Полученные данные свидетельствуют, что аминокислотный остаток D267 в комбинации с заменами мутантного варианта DR5-A играет важную роль во взаимодействиях TRAIL с рецепторами DcR2 и OPG. Таким образом, данные по связыванию вариантов TRAIL с рецепторами, полученные методом поверхностного плазмонного резонанса, свидетельствуют о том, что мутантный вариант DR5-B обладает наибольшей селективностью по отношению к рецептору DR5 по сравнению с остальными мутантными вариантами TRAIL.

5. Исследование индукции апоптоза рецептор-селективными мутантными вариантами TRAIL

Биологическую активность различных вариантов TRAIL определяли на нескольких линиях раковых клеток с различной селективностью и чувствительностью к TRAIL-индуцированному апоптозу. Это клетки линии карциномы матки человека HeLa, экспрессирующие рецепторы DR4 и DR5 приблизительно в равных количествах, и практически не экспрессирующие рецепторы DcRl и DcR2; клетки острой Т-лейкемии

человека Jurkat, экспрессирующие преимущественно рецептор DR5; клетки монобластической лейкемии человека U937, экспрессирующие преимущественно рецепторы DR5 и DcR2; клетки миелоидной лейкемии К562, экспрессирующие все четыре рецептора. Индукцию апоптоза вариантами TRAIL во всех линиях клеток определяли методом МТТ. Мутанты DR5-A и DR5-B сравнивали с TRAIL дикого типа и с ранее описанными мутантными вариантами DR5-8, DR4-8 и D269H.

В клетках HeLa варианты DR5-A и DR5-B индуцировали апоптоз в несколько раз эффективнее, чем TRAIL дикого типа, и их эффективность приблизительно совпадала с эффективностью варианта D269H (Рис. 11 А, Табл. 5). Значение эффективной концентрации ЕС;о для индукции апоптоза вариантом DR5-8 была сравнима с TRAIL дикого типа, однако максимальный эффект был ниже. DR4-cnem^H4Hbiß вариант DR4-8 индуцировал апоптоз лишь в небольшой (около 25%) фракции клеток, однако отличался высоким значением ЕС50 наравне с вариантом DR5-B (ECso= 1.6 нг/мл и ECso= 1.5 нг/мл, соответственно), хотя вариант DR5-B индуцировал апоптоз в 78% клеток.

Рис. 11. Биологическая активность TRAIL дикого типа и DRS-селективных мутантных вариантов в линиях клеток HeLa, Jurkat, К562 и U93 7.

Индукцию апоптоза вариантами TRAIL определяли методом МТТ. Для повышения чувствительности клеточных линий HeLa и U937 к TRAIL-индуцированному апоптозу в среду для культивирования добавляли эметин (0.05 и 0.25мкг/мл, соответственно).

Таблица 5. Значения ЕС50 для апоптоза, индуцированного вариантами TRAIL в различных линиях клеток.

Варианты TRAIL HeLa** К562 Jurkat U937**

ECS0, нг/мл апоптоз % ECSo, нг/мл апоптоз % ECjo, нг/мл апоптоз % ECjo, нг/мл апоптоз %

Дикий тип 6.2 ±0.5 93 ±6 0.22 ± 0.02 60 ±4 0.28 ± 0.03 37 ±3 0.27 ±0.03 22 ±2

D269H 2.1 ±0.2 91 ±6 0.23 ±0.03* 85 ± 7 0.17 ±0 02 43 ±3 0.27 ±0.03 25 ±2

DR5-8 6.0 ±0.6 45 ±3 0.27 ± 0.02 27 ±3 0.15 ±0.02 48 ±4 0.15 ±0.02 43 ±3

DR5-A 2.2 ±0.2 86 ±7 0.73 ±0,06 34 ±3 0.07 ±0.01 56 ±5 0.09 ±0.01 43 ±4

DR5-B 1.5 ± 0.1 78 ±6 1.И ±0.07 35 ±3 0.07 ± 0.01 53 ±5 0.08 ±0.01 50 ±3

DR4-8 1.6 ±0.2 25 ±3 0.23 ± 0.02 62 ±7 0.71 ±0.06 26 ±3 0.26 ±0.02 14±3

Результаты показаны в виде среднего значения ± среднеквадратичная ошибка не менее трех независимых экспериментов.

* Значение ЕС50 вычисляли для концентрации TRAIL до 25 нг/мл.

В клетках HeLa и U937 TRAIL-индуцированный апоптоз вызывали в присутствии 0.05 мкг/мл и 0.25 мкг/мл эметина, соответственно.

Полученные данные свидетельствуют о том, что TRAIL-индуцированный апоптоз в клетках HeLa протекает посредством рецептора DR4 наравне с рецептором DR5 лишь в части клеточной популяции, тогда как в большей части популяции ОЯ4-зависимый путь ингибирован.

В линии клеток Jurkat варианты DR5-A и DR5-B индуцировали апоптоз более эффективно, чем TRAIL дикого типа и варианты DR4-8, DR5-8 или D269H (Рис. 11 Б, Табл. 5). Как и в линии HeLa, мутантный вариант DR4-8 индуцировал апоптоз лишь в 26% клеток линии Jurkat. Эффективность варианта DR4-8 в наших экспериментах была в 2.5, 4.2 и 4.7 раз ниже по сравнению с TRAIL дикого типа и вариантами D269H и DR5-8, соответственно.

Действие вариантов TRAIL на линии клеток К562 было более сложным. Эти клетки экспрессируют все четыре рецептора, однако, в некоторых лабораториях клетки К562 проявляли резистентность к TRAIL-индуцированному апоптозу. В других лабораториях клетки К562 были достаточно чувствительны к TRAIL. Наши данные находятся в соответствии с этими наблюдениями. В наших экспериментах вариант DR4-8 продемонстрировал эффективность наравне с TRAIL дикого типа и вызывал до 60% клеточной гибели (Рис. 11 В). По данным ППР, вариант DR4-8 обладал сниженной аффинностью к рецепторам DR4 и DcRl в 7.0 и 2.5 раза, соответственно (Табл. 4). Возможно, высокая эффективность варианта DR4-8 в клетках К562 связана с преодолением защитного действия рецептора-«ловушки» DcRl, который ингибирует клеточную гибель, соревнуясь за связывание с лигандом TRAIL. DR5-cпeцифичныe

варианты DR5-8, DR5-A и DR5-B имели сниженную эффективность (Рис. 11 В). Полученные данные свидетельствуют о том, что в клетках К562, использованных в нашей работе, апоптоз протекает преимущественно посредством рецептора DR4.

Вариант D269H в высоких концентрациях (до 400 нг/мл) демонстрировал еще более высокую эффективность в клетках К562, чем TRAIL дикого типа (до 85% клеточной гибели) (Рис. 11 В). Индукция апоптоза DR5-cnem^H4HbiM вариантом D269H в клетках линии К562 была достаточно неожиданной. Возможно, причиной его эффективного действия является сниженная аффинность к рецепторам DR4 и DcRl (в 18.4 и 7.9 раз, соответственно) (Табл. 4). Кроме того, не стоит исключать возможность того, что вариант D269H преодолел внутренний блок DRS-индуцированного апоптоза в клетках К562 за счет чрезвычайно высокой аффинности к рецептору DR5.

Цитотоксическая активность вариантов DR5-8, DR5-A и DR5-B в линии клеток U937 была значительно выше, чем TRAIL дикого типа. Эти варианты демонстрировали повышенный максимальный ответ (почти вдвое) и сниженные значения ЕС5о(1.8, 3.0 and 3.4, соответственно). Цитотоксическая активность мутантного варианта D269H в клетках линии U937 была подобна TRAIL дикого типа (Рис. 11 Г). Так как вариант D269H обладает высокой аффинностью к рецептору DcR2, сопоставимой с TRAIL дикого типа, вероятно, он может обеспечивать связывание рецептора DcR2 наряду с рецептором DR5 в составе комплекса DISC, в результате чего происходит ингибирование активации инициаторных каспаз. Новые мутантные варианты DR5-A и DR5-B обладают сниженной аффинностью к рецептору DcR2. Вероятно, это является причиной их повышенной эффективности в клетках линии U937 по сравнению с TRAIL дикого типа и вариантами DR5-8 или D269H. Для подтверждения этого предположения требуется исследование процесса формирования комплекса DISC с различными вариантами TRAIL.

Цитотоксическая активность мутантных вариантов TRAIL также была исследована на линии клеток HeLa с гиперэкспрессией Вс1-2. Так же, как и TRAIL дикого типа, ни один из полученных вариантов не преодолевал Bcl-2-индуцированный блок апоптоза (Рис. 12). Кроме того, мы исследовали эффект вариантов TRAIL на линиях клеток HeLa и HeLa-Bcl-2 в комбинации с ингибиторами цитоскелета цитохалазином Д и таксолом и с ингибитором синтеза белка эметином. Все мутантные варианты TRAIL не утратили способности преодолевать блок Вс1-2 в комбинации с ингибиторами цитоскелета (Рис. 12). Следует отметить, что таксол, в отличие от цитохалазина Д, полностью заменял эметин, усиливая апоптоз в комбинации со всеми вариантами TRAIL. Более того, действие таксола не суммировалось с действием эметина (Рис. 12).

контроль DR4-8 DR5-8 D269H DR5-A DR5-B Варианты TRAIL, 500 иг/мл

контроль Дикий DR4-8 DR5-8 D269H DR5-A DR5-B ТИП Варианты TRA!L, 500 иг/мл

Рис. 12. Индукция апоптоза вариантами TRAIL в линии клеток HeLa-Bcl-2 в комбинации с ингибиторами цитоскелета цитохалазином Д и таксолом.

Клетки инкубировали с различными вариантами TRAIL в присутствии эметина (0.3 мкг/мл) в течение 8 часов или в отсутствие эметина в течение 24 часов. Ингибитор роста микротрубочек таксол (10 мкМ) и ингибитор актиновых микрофиламентов цитохалазин Д (1 мкг/мл) добавляли одновременно с вариантами TRAIL. Апоптоз определяли методом подсчета клеточных ядер с конденсированным хроматином. Данные представлены в виде среднего значения ± стандартное отклонение не менее трех независимых экспериментов.

Ранее усиление апоптоза при совместном действии TRAIL и эметина объясняли ингибированием NF-кВ-зависимой экспрессии антиапоптотических белков. Однако природа полученного нами эффекта требует дополнительного исследования.

Вышеперечисленные данные свидетельствуют об исключительной сложности экспрессии и функционирования рецепторов TRAIL в различных типах клеток.

Результаты, полученные в настоящей диссертационной работе, свидетельствуют о том, что мутантные варианты DR5-A и DR5-B более специфичны по отношению к рецептору DR5 и демонстрируют повышенную биологическую активность по сравнению с мутантными вариантами DR5-8 и D269H. Новые DR5-cnew^H4Hbie мутантные варианты TRAIL могут служить удобным инструментом для изучения роли различных рецепторов в механизме TRAIL-индуцированного апоптоза в линиях раковых клеток и являются потенциальными средствами для терапии опухолей, не чувствительных к TRAIL дикого типа.

выводы

1. Разработаны методы экспрессии и очистки белка TRAIL и его рецептор-специфичных мутантных вариантов.

2. Методом аналитического ультрацентрифугирования показано, что полученные препараты TRAIL и его мутантных вариантов высоко гомогенны и на 98% состоят из тримерных молекул.

3. Методом поверхностного плазмонного резонанса определены константы диссоциации при связывании TRAIL дикого типа и его рецептор-специфичных мутантных вариантов с рецепторами смерти DR4 и DR5 и с рецепторами-«ловушками» DcRI, DcR2 и OPG.

4. Показано, что полученные мутантные варианты TRAIL DR5-A и DR5-B обладают высокой аффинностью к рецептору смерти DR5, практически не связываются с рецепторами DR4 и DcRI, а их сродство к рецепторам DcR2 и OPG в 20 и 100 раз ниже, соответственно, по сравнению с TRAIL дикого типа.

5. Показано, что введение мутации Asp269His в вариант DR5-8 усиливает сродство к рецептору DR5 в 3.5 раза без потери селективности к другим рецепторам, а аминокислотный остаток Asp267 ухудшает взаимодействие TRAIL с рецепторами-«ловушками» DcR2 и OPG.

6. Показано, что DRS-специфичные мутантные варианты TRAIL DR5-A и DR5-B в несколько раз эффективнее вызывают апогтгоз в 1Ж5-чувствитсльных линиях раковых клеток по сравнению с TRAIL дикого типа.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи в научных журналах:

1. Gasparian, М.Е., Ostapchenko, V. G., Yagolovich. A. V.. Tsygannik, I. N., Chernyak, В. V., Dolgikh, D. А., Kirpichnikov, M. P. (2007). Overexpression and refolding of thioredoxin/TRAIL fusion from inclusion bodies and further purification of TRAIL after cleavage by enteropeptidase. Biotechnol. Lett. 10:1567-1573.

2. Гаспарян M. Э., Домнина Jl. В., Иванова О. Ю., Изюмов Д. С., Ломакин А. Ю., Попова Е. Н., Яголович А. В.. Плетюшкина О. Ю., Долгих Д. А., Черняк Б. В. (2008). Ингибиторы цитоскелета в комбинации с TRAIL индуцируют апоптоз в резистентных клетках карциномы HeLa с гиперэкспрессией белка Вс1-2. Биохимия 73:440-445.

3. Gasparian, М. Е„ Chernyak, В. V., Dolgikh, D. A., Yagolovich. А. V.. Popova, Е. N., Sycheva, А. М., Moshkovskii, S. A., Kirpichnikov, М. Р. (2009). Generation of new TRAIL mutants DR5-A and DR5-B with improved selectivity to death receptor 5. Apoptosis 6:778-787.

Тезисы конференций:

1. Горожанина А.В. (2006). Экспрессия и очистка рекомбинантного белка Apo2L/TRAIL в E.coli и исследование его биологической активности на культуре клеток HeLa. XIII Международная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов -2006», Москва. Тезисы докладов, с.62-63.

2. Яголович А.В. (2006). Увеличение аффинности рекомбинантного человеческого цитокина Apo2L/TRAIL по отношению к рецептору DR5/TRAIL-R2 путем внесения мутаций в генетическую последовательность лиганда. Первый студенческий симпозиум по биоинженерии, Москва. Тезисы докладов, с. 41-42.

3. Яголович А.В. (2007). Экспрессия в E.coli и очистка мутантного варианта рекомбинантного человеческого цитокина DR5-Apo2L/TRAIL. XIV Международная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов - 2007», Москва. Тезисы докладов, с. 75.

4. Яголович А.В.. Долгих Д А., Гаспарян М.Э. (2007). Высокий уровень экспрессии и очистка мутантного варианта TRAIL-DR5 человеческого цитокина TRAIL с повышенной специфичностью к рецептору DR5/TRAIL-R2. IV Международная конференция "Постгеномные технологии разработки противоопухолевых агентов с новыми механизмами действия". ЦВТ ХимРар, Московская обл., г.Химки, Тезисы докладов, с. 45.

5. Yagolovich. А.У.. Chernyak, B.V., Dolgikh, D.A., Gasparian, М.Е. (2008). Receptor-

selective mutants of TRAIL to DR5. 16 Euroconference on Apoptosis. Bern, Switzerland. Abstracts, p. 60.

6. Яголович A.B.. Долгих Д.А., Гаспарян М.Э. (2010). Исследование селективности и биологической активности мутантных вариантов противоопухолевого цитокина TRAIL DR5-A и DR5-B с повышенной специфичностью к рецептору DR5. III Евразийский конгресс по медицинской физике и инженерии "Медицинская физика - 2010", Москва. Сборник материалов, т. 3, с. 370.

7. Gasparian, М.Е., Yagolovich. A.V., Popova, E.N., Dolgikh, D.A., Chernyak, B.V. (2010). Cytoskeleton inhibitors stimulate apoptosis induced by TRAIL or TNFa in HeLa cells overexpressing Bcl-2. FEBS workshop Mitochondrial physiology, Innsbruck, Austria. Abstracts, p. 109-110.

8. Яголович A.B.. Гаспарян М.Э. (2010) Разработка противоопухолевых препаратов на основе рекомбинантного цитокина TRAIL и его мутантов DR5-A и DR5-B с повышенной специфичностью к рецептору смерти DR5. XIV Российский онкологический конгресс, Москва. Материалы конгресса, с.347-348.

Патент:

Гаспарян М.Э., Яголович А.В.. Долгих Д.А., Кирпичников М.П. Способ получения мутантного белка TRAIL человека. Роспатент № 2405038, Патентная заявка № 2009129087 от 29.07.2009.

Подписано в печать 28.12.2010 Формат 60x88 1/16. Объем 1.0 п.л. Тираж 100 экз. Заказ № 1069 Отпечатано в ООО «Соцветие красок» 119991 г.Москва, Ленинские горы, д.1 Главное здание МГУ, к. А-102

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Яголович, Анна Валерьевна

Список используемых сокращений.

1. ВВЕДЕНИЕ, ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

2.1. Апоптоз и терапия рака.

2.2. Семейства белков TNF и TNFR.

2.3. Apo2L/TRAIL- цитокин из семейства TNF.

2.4. Структура TRAIL.

2.5. Механизм TRAIL-индуцированного апоптоза.

2.6. Рецепторы TRAIL.

2.6.1. Рецепторы смерти DR4 и DR5.

2.6.2. Рецепторы-«ловушки» DcRl, DcR2 и OPG.

2.6.3. Рецептор-специфичные мутантные варианты TRAIL.

2.7. Физиологические функции TRAIL и его рецепторов.

2.7.1. Формирование и регуляция иммунной системы.

2.7.2. Иммунный контроль организма над первичным развитием опухоли и метастазированием.

2.7.3. TRAIL и антивирусный ответ.

2.7.4. Действие TRAIL на Т-клетки.

2.7.5. Регуляция аутоиммунных процессов.

2.7.6. Роль TRAIL в аллергических заболеваниях.

2.7.7. Физиологическая роль TRAIL-R.

2.7.8. Не-цитотоксические сигнальные пути TRAIL.

2.8. Чувствительность клеток к TRAIL.

2.8.1. Резистентность на уровне рецепторов TRAIL.

2.8.2. Сборка комплекса DISC и резистентность к TRAIL.

2.8.3. Повышенная экспрессия cFLIP.

2.8.4. Инактивация каспазы-8.

2.8.5. Изменения в митохондриальном пути апоптоза.

2.8.6. Белки-ингибиторы апоптоза IAPs, Smac/DIABLO и резистентность к TRAIL.

2.8.7. NF-кВ и резистентность к TRAIL.

2.8.8. МАР-киназы и резистентность к TRAIL.

2.8.9. Комбинация TRAIL и химиотерапии для преодоления резистентности.

2.9. TRAIL и токсичность.

2.9.1. Рекомбинантные варианты и токсичность.

2.9.2. Токсичность на гепатоцитах.

2.10. Доклинические и клинические испытания TRAIL.

2.10.1. Доклинические исследования TRAIL.

2.10.2. Клинические исследования TRAIL.

2.11. Экспрессия рекомбинантных гибридных белков и их ренатурация.

2.11.1. Экспрессия рекомбинантных белков.

2.11.2. Гибридные белки.

2.11.3. Проблемы, возникающие при экспрессии гибридных белков.

2.11.4. Расщепление гибридных белков.

2.11.5. Тиоредоксин в качестве белка-носителя в составе гибридных белков.

2.11.6. Ренатурация рекомбинантных белков.

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

3.1 Материалы.

3.1.1. Реактивы и ферментные препараты.

3.1.2. Штаммы и плазмидные вектора.

3.1.3. Синтетические олигонуклеотиды.

3.1.4. Клеточные линии и питательные среды для роста клеток.

3.2. Методы.

3.2.1. Конструирование плазмидной ДНК pET-32/TRAIL.

3.2.2. Сайт-направленный мутагенез.

3.2.3. Получение компетентных клеток E.coli BL21(DE3).

3.2.4. Трансформация клеток E.coli плазмидной ДНК.

3.2.5. Выделение плазмидной ДНК.

3.2.6. Электрофоретический анализ ДНК в агарозном геле.

3.2.7. Определение концентрации белка в растворе.

3.2.8. Электрофоретический анализ белка в полиакриламидном геле.

3.2.9. Экспрессия TRAIL и его мутантных вариантов.

3.2.10. Ренатурация гибридного белка с тиоредоксином в качестве белка-носителя.

3.2.11. Очистка и расщепление белка.

3.2.12. Идентификация белков по N-концевой последовательности.

3.2.13. Кристаллизация и рентгеноструктурный анализ рекомбинантного TRAIL.

3.2.14. Определение гомогенности белковых препаратов методом аналитического ультрацентрифугирования.

3.2.15. Определение индукции апоптоза в линиях раковых клеток.

3.2.16. Определение констант диссоциации для связывания белка с рецептором методом поверхностного плазмонного резонанса.

3.2.17. Определение выхода цитохрома с из митохондрий.

3.2.18. Вестерн-блот.

4. РЕЗУЛЬТАТЫ.

4.1. Получение рекомбинантного цитокина TRAIL.

4.1.1. Синтез гена TRAIL (114-281) и клонирование его в экспрессионный вектор.

4.1.2. Экспрессия гибридного белка Trx/TRAIL в E.coli.

4.1.3. Ренатурация и очистка гибридного белка Trx/TRAIL.

4.1.4. Расщепление гибридного белка Trx/TRAIL и очистка целевого белка TRAIL.

4.1.5. Исследование препарата рекомбинантного TRAIL методом аналитического ультрацентрифугирования.

4.1.6. Кристаллизация и рентгеноструктурный анализ рекомбинантного TRAIL.

4.1.7. Биологическая активность рекомбинантного TRAIL.

4.2. Получение и исследование мутантных вариантов TRAIL.

4.2.1. Получение мутантных вариантов TRAIL методом сайт-направленного мутагенеза.

4.2.2. Экспрессия и очистка рекомбинантных мутантных вариантов TRAIL.

4.2.3. Определение констант диссоциации при связывании различных вариантов TRAIL с пятью рецепторами.

4.2.4. Индукция апоптоза рецептор-селективными мутантными вариантами TRAIL.

5. ОБСУЖДЕНИЕ.

5.1. Получение и исследование рекомбинантного цитокина TRAIL.

5.2. Исследование биологической активности рекомбинантного цитокина TRAIL.

5.3. Исследование мутантных вариантов цитокина TRAIL.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Повышение противоопухолевой активности цитокина TRAIL путем изменения аминокислотного состава белка"

Цитокин TRAIL (TNF-Related Apoptosis-Inducing Ligand) был обнаружен в 1995 году на основе гомологии последовательности с другими членами семейства TNF (Tumor Necrosis Factor) [1]. Он экспрессируется в клетках в виде трансмембранного белка II типа. В результате расщепления цистеиновыми протеазами внеклеточный домен TRAIL высвобождается из клетки в свободном растворимом тримерном виде [2,3]. Рекомбинантный растворимый TRAIL способен вызывать апоптоз в культурах клеток из широкого спектра человеческих опухолей, не затрагивая нормальные клетки [4]. Благодаря этому свойству рекомбинантный препарат TRAIL рассматривается в качестве многообещающего потенциального терапевтического средства для лечения раковых заболеваний. В настоящее время рекомбинантный TRAIL проходит I стадию клинических исследований (в компаниях Genentech и Amgen, начиная с 2006 года) как отдельно, так и в комбинации с другими химиотерапевтическими средствами [5-7].

Изначально рекомбинантный препарат TRAIL был получен в, бактериях и содержал гистидиновый таг на С-конце молекулы (His/TRAIL). Позднее было показано, что препарат TRAIL с гистидиновым тагом образует многомерные агрегаты и проявляет значительную токсичность на гепатоцитах [8, 9]. В дальнейшем был получен препарат TRAIL (а.о. 114-281) без тагов, который состоял только из активных тримерных молекул и практически не проявлял токсичности [4]. Однако этот препарат был экспрессирован с добавлением инициаторного метионинового кодона и потенциально обладал высокой антигенностью, поскольку при экспрессии белков в бактериях TV-концевой метионин расщепляется не полностью. Таким образом, получение качественного препарата рекомбинантного внеклеточного домена цитокина TRAIL (a.o.l 14-281) без дополнительных искусственных последовательностей и без TV-концевого метионина и с высоким выходом белка является важной задачей для успешного применения TRAIL в доклинических и клинических исследованиях.

Терапевтический потенциал TRAIL оказался ограничен в связи с тем, что многие первичные опухоли резистентны к TRAIL. Несмотря на интенсивные исследования, механизмы, лежащие в основе эффективности и селективности действия TRAIL, окончательно не выяснены. Одной из причин является сложный механизм взаимодействия TRAIL с его пятью рецепторами, из которых лишь два, DR4 и DR5 (рецепторы смерти), способны проводить сигнал апоптоза. Связывание TRAIL с рецепторами-«ловушками» DcRl и DcR2 или растворимым рецептором остеопротегерином (OPG) не приводит к апоптозу. Рецепторы DcRl и DcR2 ингибируют TRAIL-индуцированный апоптоз, конкурируя с рецепторами смерти DR4 и DR5 за связывание с TRAIL или препятствуя передаче сигнала апоптоза. Также было показано, что уровень экспрессии рецепторов DR4 и DR5 на поверхности клеток не всегда определяет чувствительность клеток к TRAIL-индуцированному апоптозу [1012]. Многие линии раковых клеток экспрессируют оба рецептора смерти, DR4 и DR5, причем каждый из них способен инициировать апоптоз независимо друг от друга. Кроме того, последние данные свидетельствуют о том, что и раковые, и нормальные клетки могут приобретать устойчивость к TRAIL-индуцированному апоптозу путем изменения экспрессии рецепторов DcRl и DcR2. Таким образом, все рецепторы TRAIL играют значительную роль в регуляции TRAIL-индуцированного апоптоза [13-15].

Для выяснения роли каждого из рецепторов DR4 и DR5 в механизме TRAIL-индуцированного апоптоза ранее методом фагового дисплея были получены DR4 и DR5-ceлeктивныe мутантные варианты TRAIL, содержащие по 6 аминокислотных замен [15]. Другие DR4 и DR5-ceлeктивныe мутантные варианты TRAIL (D218H и D269H) были получены с помощью алгоритма автоматического дизайна FOLD-X [16]. Все ранее охарактеризованные мутантные варианты в той или иной степени избирательно связывались с рецепторами DR4 или DR5, однако сохраняли высокое сродство к рецепторам-«ловушкам» DcRl и DcR2.

В данной диссертационной работе были разработаны новые эффективные методы экспрессии и очистки рекомбинантных препаратов TRAIL и новых DRS-специфичных мутантных вариантов DR5-A и DR-B в Escherichia coli. Разработанные методы позволяют очистить до 300 мг (300 мг из телец включения и 75-100 мг из цитоплазматической фракции белков) высокоактивного целевого белка TRAIL из 1 литра культуры клеток, что позволяет рассматривать препарат как потенциальное противораковое средство, пригодное для клинических испытаний. Кроме того, в данной работе получены новые мутантные варианты TRAIL DR5-A и DR5-B. Показано, что они обладают наибольшей специфичностью к рецептору DR5 по сравнению с ранее описанными рецептор-специфичными мутантными вариантами. Наряду с высокой аффинностью к рецептору DR5, они практически не связывались не только с рецептором DR4, но и с рецепторами-ловушками» DcRl и DcR2. Кроме того, мутантные варианты TRAIL DR5-A и DR-B в несколько раз эффективнее вызывали апоптоз в DR5-3aBHCHMbix линиях раковых клеток, что делает их потенциальными кандидатами для терапии опухолей, резистентных к TRAIL дикого типа.

Целью данной диссертационной работы являлось повышение селективности цитокина TRAIL к рецептору смерти DR5 путем введения комбинации DRS-специфических мутаций в структуру белка и получения рецептор-специфичных мутантных вариантов DR5-A и DR5-B; определение их констант диссоциации при связывании с пятью рецепторами TRAIL и исследование биологической активности всех препаратов на различных линиях раковых клеток для создания эффективных средств терапии опухолевых заболеваний.

Задачи исследования:

3. Получить и очистить новые мутантные варианты TRAIL, специфичные к рецептору смерти DR5.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Яголович, Анна Валерьевна

7. ВЫВОДЫ

1. Разработаны методы экспрессии и очистки белка TRAIL и его рецептор-специфичных мутантных вариантов.

4. Показано, что полученные мутантные варианты TRAIL DR5-A и DR5-В обладают высокой аффинностью к рецептору смерти DR5, практически не связываются с рецепторами DR4 и DcRl, а их сродство к рецепторам DcR2 и OPG в 20 и 100 раз ниже, соответственно, по сравнению с TRAIL дикого типа.

6. Показано, что DR5-cпeцифичныe мутантные варианты TRAIL DR5-A и DR5-B в несколько раз эффективнее вызывают апоптоз в DR5-чувствительных линиях раковых клеток по сравнению с TRAIL дикого типа.

6. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В настоящей диссертационной работе разработана методика получения рекомбинантного внеклеточного домена цитокина TRAIL (аминокислотные остатки 114-281) без тагов и без TV-концевого метионина. Синтетический ген человеческого цитокина TRAIL был клонирован в плазмидный вектор рЕТ-32а и был получен высокий уровень экспрессии (1.2 г/л) гибридного белка тиоредоксин/TRAIL в бактериальном штамме Escherichia coli BL21(DE3) в виде телец включения. Целевой белок TRAIL был очищен путем растворения и рефолдинга телец включения* и дальнейшего расщепления гибридного белка тиоредоксин/TRAIL легкой цепью энтеропептидазы человека (L-HEP). Было показано, что полученный препарат TRAIL на 98% состоит из тримеров и формирует кристаллы в в-фосфатном буфере с разрешение дифракционной^ решетки ~3.0 А. Препараты TRAIL демонстрировали высокую биологическую активность на различных линиях раковых клеток. Разработанная методика позволяет получить до 400 мг рекомбинантного целевого белка TRAIL и его мутантных вариантов из 1 литра культуры клеток. Высокие выходы и относительно низкая стоимость полученного высокоактивного препарата TRAIL делают его хорошим кандидатом для терапии рака различного происхождения.

Было показано, что агенты, повреждающие цитоскелет (таксол и. колцемид и цитохалазин Д), усиливают действие TRAIL и позволяют преодолеть защиту, связанную с гиперэкспрессией' Вс1-2. Учитывая, что-таксол и колцемид входят во многие современные схемы химиотерапии опухолей, их совместное применение с препаратами рекомбинантного TRAIL открывает широкие перспективы- для лечения опухолей, резистентных к традиционной терапии.

Кроме того, в данной работе разработаны и получены новые DR5-селективные мутантные варианты TRAIL DR5-A и DR5-B. Измерение констант диссоциации этих мутантных вариантов при связывании с каждым из пяти рецепторов подтвердило, что они практически не взаимодействуют с рецепторами DR4 и DcRl и имеют значительно сниженную аффинность к рецепторам DcR2 и OPG. Новые мутантные варианты более эффективно индуцируют апоптоз по сравнению с TRAIL дикого типа в DR5-чyвcтвитeльныx линиях раковых клеток. Кроме того, они, как и TRAIL дикого типа, способны индуцировать апоптоз в линии клеток HeLa с гиперэкспрессией Вс1-2 в комбинации с ингибиторами цитоскелета таксолом и цитохалазином Д.

Подводя итог, следует сказать, что новые DR5-cпeцифичныe варианты TRAIL DR5-A и DR5-B могут служить полезным инструментом для изучения роли различных рецепторов в механизме TRAIL-индуцированного апоптоза в различных типах раковых клеток. Благодаря высокой специфичности и биологической активности мутантные варианты TRAIL DR5-A и DR5-B могут быть использованы для терапии опухолей, резистентных к TRAIL дикого типа.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Яголович, Анна Валерьевна, Москва

1. Wiley, S. R., Schooley, K., Smolak, P. J. et al. (1995). Identification and characterization of a new member of the TNF family that induces apoptosis. Immunity 3:673-682.

2. Wajant, H., Moosmayer, D., Wuest, T. et al. (2001). Differential activation of TRAIL-R1 and -2 by soluble and membrane TRAIL allows selective surface antigen-directed activation of TRAIL-R2 by a soluble TRAIL derivative. Oncogene 20:4101-4106.

3. Pitti, R. M., Marsters, S. A., Ruppert, S. et al. (1996). Induction of apoptosis by Apo-2 ligand, a new member of the tumor necrosis factor receptor family. J". Biol. Chem. 271:12687-12690.

4. Ashkenazi, A., Pai, R.C., Fong, S. et al. (1999). Safety and antitumor activity of recombinant soluble Apo2 ligand. J. Clin. Invest. 104:155-162.

5. Yee, L., Fanale, M., Dimick, K. et al. (2007). A Phase lb safety and pharmacokinetic study of recombinant human Apo2L/TRAIL in combination with rituximab in patients with low-grade non-Hodgkin's lymphoma. J. Clin. Oncol. 25:8078.

6. Jo, M., Kim, T.H., Seol; D.W. et al. (2000). Apoptosis induced in normal human hepatocytes by tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand. Retroviral membrane display of apoptotic effector molecules. Nat. Med. 6:564567.

7. Lawrence, D., Shahrokh, Z., Marsters, S. et al. (2001). Differential hepatocyte toxicity of recombinant Apo2L/TRAIL versions. Nat. Med. 7:383385.

8. Griffith, T.S., Chin, W.A., Jackson, G.C., et al. (1998). Intracellular regulation of TRAIL-induced apoptosis in human melanoma cells. J Immunol. 161:2833-2840.

9. Sadarangani, A., Kato, S., Espinoza, N. et al. (2007). TRAIL mediates apoptosis in cancerous but not normal primary cultured cells of the human reproductive tract. Apoptosis 12:73-85.

10. Dyer, M.J., MacFarlane, M., Cohen, G.M. (2007). Barriers to effective TRAIL-targeted therapy of malignancy. J. Clin. Oncol. 25:4505-4506.

11. Clancy, L., Mruk, K., Archer, K. et al. (2005). Preligand assembly domain-mediated ligand-independent association between TRAIL receptor 4 (TR4) and TR2 regulates TRAIL-induced apoptosis. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 102: 18099-18104.

12. Merino, D., Lalaoui, N., Morizot, A. et al. (2006). Differential inhibition of TRAIL-mediated DR5-DISC formation by decoy receptors 1 and 2. Mol. Cell. Biol. 26: 7046-7055.

13. Van der Sloot, A.M., Tur, V., Szegezdi, E., et al. (2006). Designed tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand variants initiating apoptosis exclusively via the DR5 receptor. Proc Natl Acad Sci USA 103:86348639.

14. Gerl, R., Vaux, D. (2005). Apoptosis in the development and treatment of cancer. Carcinogenesis 26(2): 263-270.

15. Peter, M.E. (2005). Taming TRAIL: the winding path to a novel form of cancer therapy. Cell Death Differ. 7:693-694.

16. Locksley, R. M., Killeen, N., Lenardo, M. J. (2001). The TNF and TNF receptor superfamily: integrating mammalian biology. Cell 104: 487-501.

17. Wajant, H. (2003). Death receptors. Essays Biochem. 39: 53-71.

18. Aggarwal, B. B. S., Kohr, W. J., Hass, P. E. et al. (1985). Human Tumor Necrosis Factor: production, purification, and characterization. J. Biol. Chem. 260:2345-2354.

19. Schneider, P., Holler, N., Bodmer, J. L. et al. (1998). Conversion of membrane-bound Fas(CD95) ligand to its soluble form is associated with downregulation of its proapoptotic activity and loss of liver toxicity. J. Exp. Med. 187: 1205-1213.

20. Kagawa, S., He, C., Gu, J. et al. (2001). Antitumor activity and bystander effects of the tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL). Gene Cancer Research 61: 3330-3338.

21. Wang, Q., Ji, Y., Wang, X. et al: (2000). Isolation and molecular characterization of the 5-upstream region of the human TRAIL gene. Biochem. Biophys. Res. Commun. 276:466-471.

22. Manzo, F., Nebbioso, A., Miceli, M. et al. (2008). TNF-related apoptosis-inducing ligand: Signalling of a 'smart' molecule. Int. J. Biochem. Cell Biol. 41(3):460-466.

23. Mariani, S.M., Krammer, P.H. (1998). Differential regulation of TRAIL and CD95 ligand in transformed cells of the T and B lymphocyte lineage. Eur. J. Immunol. 28: 973-982.

24. Bodmer, J.L., Meier, P., Tschopp, J. et al. (2000). Cysteine 230 is essential for the structure and activity of the cytotoxic ligand TRAIL. J. Biol. Chem. 275: 20632-20637.

25. Smyth, M. J., Takeda, K., Hayakawa, Y. et al. (2003). Nature's TRAIL on a path to cancer immunotherapy. Immunity 18:1-6.

26. Sheikh, M.S., Burns, T.F., Huang, Y., et al. (1998). P53-dependent and -independent regulation of the death receptor KILLER/DR5 gene expression in response to genotoxic stress and tumor necrosis factor alpha. Cancer Res. 58:1593-1598.

27. Guicciardi, M.E., Gores, G.J. (2009). Life and death by death receptors The FASEB Journal 23:1625-1637.

28. Cha, S. S., Kim, M. S., Choi, Y. H. et al. (1999). 2.8 A resolution crystal structure of human TRAIL, a cytokine with selective antitumor activity. Immunity 11: 253-261.

29. Hymowitz, S. G., Christinger, H. W., Fuh, G. et al. (1999). Triggering cell death: the crystal structure of Apo2L/TRAIL in a complex with death receptor 5. Mol. Cell. 4:563-71.

30. Kim, S. H., Kim, K., Kwagh, J. G. et al. (2004). Death induction by recombinant native TRAIL and its prevention by a caspase 9 inhibitor in primary human esophageal epithelial cells. J. Biol: Chem. 279:40044-40052.

31. Hymowitz, S. G., O'Connell, M. P., Ultsch, M. H. et al. (2000). A unique zinc-binding site revealed by a high-resolution X-ray structure of homotrimeric Apo2L/TRAIL. Biochemistry 39:633-640.

32. Boldin, M. P., Mett, I. L., Varfolomeev, E. E. et al. (1995). Self-association of the "death. domains" of the p55 tumor necrosis factor (TNF) receptor and Fas/APOl prompts signaling for TNF and Fas/APOl effects. J. Biol. Chem. 270:387-391.

33. Kimberley, F. C., Screaton G. R. (2004). Following a TRAIL: Update on a ligand and it's five receptors. Cell Research 14:359-372.

34. Kischkel, F. C, Lawrence, D. A., Chuntharapai, A. et al. (2000). Apo2L/TRAIL-dependent recruitment of endogenous FADD and caspase-8 to death receptors 4 and 5. Immunity 12:611-620.

35. Salvesen, G. S., Dixit, V. M. (1999). Caspase activation: the induced-proximity model. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 96:10964-10967.

36. Shi, Y. (2004). Caspase activation: revisiting the induced proximity model. Cell 117:855-858.

37. Chao, Y., Shiozaki, E. N., Srinivasula, S. M. et al. (2005). Engineering a dimeric caspase-9: a re-evaluation of the induced proximity model for caspase activation. PLoS Biol. 6:1079-1087.

38. Lazebnik, Y. A, Kaufmann, S. H., Desnoyers, S. et al. (1994). Cleavage of poly(ADP-ribose) polymerase by a proteinase with properties like ICE. Nature 371:346-347.

39. Youle, R.J., Strasser, A. (2008). The Bcl-2 protein family: opposing activities that mediate cell death. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9: 47-59.

40. Danial, N. N., Korsmeyer, S. J. (2004). Cell death: critical control points. Cell 116:205-219.

41. Oldenhuis, C., Stegehuis, J., Walenkamp, A. et al. (2008). Targeting TRAIL death receptors. Curr. Opin. Pharmacol. 8:433-439.

42. Zou, H., Li, Y., Liu, X. et al. (1999). An APAF-l/cytochrome c multimeric complex is a functional apoptosome that activates procaspase-9. J. Biol. Chem. 274:11549-11556.

43. Jin, Z., El-Deiry, W.S. (2005). Overview of cell death signaling pathways, Cancer Biol. Ther. 4:139-163.

44. Spierings, D.C., de Vries, E. G., Vellenga, E. et al. (2004). Tissue distribution of the death ligand TRAIL and its receptors. J. Histochem. Cytochem. 52:821-831.

45. Pan, G., O'Rourke, K., Chinnaiyan, A. M. et al. (1997). The receptor for the cytotoxic ligand TRAIL. Science 276(5309):111-113.

46. Huang, Y., Sheikh, M. S. (2007). TRAIL death receptors and cancer therapeutics. Toxicol. Appl. Pharmacol. 224(3):284-289.

47. Lahm, A., Paradisi, A., Green, D. R. et al. (2003). Death fold domain interaction in apoptosis. Cell Death Differ. 10:10-12.

48. Wu, G.S, Burns ,T. F., McDonald 3rd, E. R. et al. (1997). KILLER/DR5 is a DNA damage-inducible p53-regulated death receptor gene. Nat. Genet. 17:141-143.

49. Sheridan, J. P., Marsters, S. A., Pitti, R. M. et al. (1997). Control of TRAIL-induced apoptosis by a family of signaling and decoy receptors. Science 277:818-821.

50. Kischkel, F. C, Lawrence, D.A., Chuntharapai, A. et al. (2000). Apo2L/TRAIL-dependent recruitment of endogenous FADD and caspase-8 to death receptors 4 and 5. Immunity 12:611-620.

51. Ashkenazi, A. (2002). Targeting death and decoy receptors of the tumor-necrosis factor superfamily. Nat. Rev. Cancer 2:420-430.

52. MacFarlane, M., Inoue, S., Kohlhaas, S. L., et al. (2005). Chronic lymphocytic leukemic cells exhibit apoptotic signaling via TRAIL-R1. Cell Death Differ. 12:773-782.

53. Kurbanov, B. M., Geilen, C.C., Fecker, L.F. et al. (2005). Efficient TRAIL-Rl/DR4-Mediated Apoptosis in Melanoma Cells by Tumor Necrosis Factor-Related Apoptosis-Inducing Ligand (TRAIL). J. Invest. Dermatol. 125:1010-019.

54. MacFarlane, M., Kohlhaas, S. L., Sutcliffe, M. J. et al. (2005). TRAIL receptor-selective mutants signal to apoptosis via TRAIL-R1 in primary lymphoid malignancies. Cancer Res. 65:11265-11270.

55. Horak, P., Pils, D., Haller, G. et al. (2005). Contribution of epigenetic silencing of tumor necrosis factor-related apoptosis inducing ligand receptor 1 (DR4) to TRAIL resistance and-ovarian cancer. Mol. Cancer Res. 3:335-343.

56. Zhang, X. D., Franco, A. V., Nguyen, T. et al. (2000). Differential localization and regulation of death and decoy receptors for TNF-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL) in human melanoma cells. J. Immunol. 164:3961-3970.

57. Younes, M., Georgakis, G. V., Rahmani, M. et al. (2006). Functional expression of TRAIL receptors TRAIL-R1 and TRAIL-R2 in esophageal adenocarcinoma. Eur. J. Cancer 42:542-547.

58. Melloni, E., Secchiero, P., Celeghini, C. et al. (2005). Functional expression of TRAIL and TRAIL-R2 during human megakaryocytic development. J. Cell Physiol. 204:975-982.

59. Degli-Esposti,' M. A., Dougall, W. C., Smolak, P. J. et al. (1997). The novel receptor TRAIL-R4 induces NF-kappaB and. protects against TRAIL-mediated apoptosis, yet retains an incomplete death domain. Immunity 7:813820.

60. Degli-Esposti, M. (1999). To die or not to die the quest of the TRAIL receptors. J. Leukoc. Biol. 65:535-542.

61. Emery, J. G., McDonnell, P., Burke, M.B. et al. (1998). Osteoprotegerin is a receptor for the cytotoxic ligand TRAIL. J.' Biol. Chem. 273:14363-14367.

62. Hesry, V., Piquet-Pellorce, C., Travert, Ml et al. (2006). Sensitivity of prostate cells to TRAIL-induced apoptosis increases with tumor progression: DR5 and Caspase 8 are key players. The Prostate 66:987-995.

63. Zauli, G., Rimondi, E., Nicolin, V. et al. (2004). TNF-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL) blocks osteoclastic differentiation induced by RANKL plus MCSF. Blood 104:2044-2050.

64. Duiker, E. W., de Vries, E. G., Mahalingam, D. et al. (2009). Enhanced antitumor efficacy of a DR5-specific TRAIL variant over recombinant human TRAIL in' a bioluminescent ovarian cancer xenograft model. Clin. Cancer Res. 15:2048-2057.

65. Tur, V., van der Sloot, A. M., Reis, C. R. et al. (2008). DR4-selective tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL) variants obtained by structure-based design. J. Biol. Chem. 283:20560-20568.

66. Chuntharapai, A., Dodge, K., Grimmer, K. et al. (2001). Isotype-dependent inhibition of tumor growth in vivo by monoclonal antibodies to death receptor 4. J. Immunol. 166:4891-4898.

67. Newsom-Davis, T., Prieske, S., Walczak, H. (2009). Is TRAIL the holy grail of cancer therapy? Apoptosis 14:607-623.

68. Walczak, H., Miller, R. E., Ariail, K. et al. (1999). Tumoricidal activity of tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand in vivo. Nat. Med. 5:157-163.

69. Kelley, S. K., Ashkenazi, A. (2004). Targeting death receptors in cancer with Apo2L/TRAIL. Curr. Opin. Pharmacol. 4:333-339.

70. Almasan, A., Ashkenazi, A. (2003). Apo2L/TRAIL: apoptosis signaling, biology, and potential for cancer therapy. Cytokine Growth Factor Rev. 14:337-348.

71. Wang, S. (2008). The promise of cancer therapeutics targeting the TNF-related apoptosis-inducing ligand and TRAIL receptor pathway. Oncogene 27:6207-6215.

72. Abdollahi, T., Robertson, N. M., Abdollahi, A. et al. (2005). Inhibition of TRAIL-induced apoptosis by IL-8 is mediated by the p38-MAPK pathway in OVCAR3 cells. Apoptosis 10:1383-1393.

73. Wajant, H., Pfizenmaier, K., Scheurich, P. (2002). TNF-related apoptosis inducing ligand (TRAIL) and its receptors in tumor surveillance and cancer therapy. Apoptosis 7:449-459.

74. Takeda, K., Hayakawa, Y., Smyth, M. J. et al. (2001). Involvement of tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand in surveillance of tumor metastasis by liver natural killer cells. Nat. Med. 7: 94-100.

75. Fanger, N. A., Maliszewski, C. R., Schooley, K. et al. (1999). Human dendritic cells mediate cellular apoptosis via tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL). J. Exp. Med. 190:1155-1164.

76. Griffith, T. S., Wiley, S. R., Kubin, M. Z. et al. (1999). Monocyte-mediated tumoricidal activity via the tumor necrosis factor-related cytokine, TRAIL. J. Exp. Med. 189:1343-1354.

77. Liu, S., Yu, Y., Zhang, M. et al. (2001). The involvement of TNF-alpha-related apoptosis-inducing ligand in the enhanced cytotoxicity of IFN-beta-stimulated human dendritic cells to tumor cells. J. Immunol. 166: 5407-5415.

78. Lee, H.O., Herndon, J. M., Barreiro, R. et al. (2002). TRAIL: a mechanism of tumor surveillance in an immune privileged site. J. Immunol. 169:4739-4485.

79. Phillips, T. A., Ni, J., Pan, G. et al. (1999). TRAIL (Apo-2L) and TRAIL receptors in human placentas: implications for immune privilege. J. Immunol. 162:6053-6059.

80. Zamai, L., Secchiero, P., Pierpaoli, S. et al. (2000). TNF-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL) as a negative regulator of normal human erythropoiesis. Blood 95: 3716-3724.

81. Li, J. H., Kirkiles-Smith, N. C., McNiff, J. M. et al. (2003). TRAIL induces apoptosis and inflammatory gene expression in human endothelial cells. J. Immunol. 171:1526-1533.

82. Clarke, P., Meintzer, S. M., Gibson, S. et al. (2000). Reovirus-induced apoptosis is mediated by TRAIL. J. Virol. 74:8135-8139.

83. Secchiero, P., Gonelli, A., Carnevale, E. et al. (2004). Evidence for a proangiogenic activity of TNF-related apoptosis-inducing ligand. Neoplasia 6:364-373.

84. Grosse-Wilde, A., Voloshanenko, O., Bailey, S. L. et al. (2008). TRAIL-R deficiency in mice enhances lymph node metastasis without affecting primary tumor development. J. Clin. Invest. 118:100-110.

85. Cretney, E., Takeda, K., Yagita, H. et al. (2002). Increased susceptibility to tumor initiation and metastasis in TNF-related apoptosis-inducing ligand-deficient mice. J. Immunol. 168:1356-1361.

86. Finnberg, N., Klein-Szanto, A. J., El-Deiry, W. S. (2008). TRAIL-R deficiency in mice promotes susceptibility to chronic inflammation and tumorigenesis. J. Clin. Invest. 118: 111-123.

87. Takeda, K., Smyth, M. J., Cretney, E. et al. (2002). Critical role for tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand in immune surveillance against tumor development. J. Exp. Med. 195:161-169.

88. Trauzold, A., Siegmund, D., Schniewind, B. et al. (2006). TRAIL promotes metastasis of human pancreatic ductal adenocarcinoma. Oncogene 25:7434-7439.

89. Blankenstein, T. (2005). The role of tumor stroma in the interaction between tumor and immune system. Curr. Opin. Immunol. 17:180-186.

90. Mace, T. A., Yamane, N., Cheng, J. et al. (2006). The potential of the tumor microenvironment to influence Apo2L/TRAIL induced apoptosis. Immunol. Invest. 35: 279-296.

91. Kim, M., Park, S. Y., Pai, H. S. et al. (2004). Hypoxia inhibits tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand-induced apoptosis by blocking Bax translocation. Cancer Res. 64: 4078-4081.

92. Sedger, L. M., Shows, D. M., Blanton, R. A. et al. (1999). IFN-gamma mediates a novel antiviral activity through dynamic modulation of TRAIL and TRAIL receptor expression. J. Immunol. 163:920-926.

93. Miura, Y., Misawa, N., Maeda, N. et al. (2001). Critical contribution of tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL) to apoptosis of human CD4+ T cells in HIV-1-infected hu-PBL-NOD-SCID mice. J. Exp. Med. 193:651-660.

94. Ishikawa, E., Nakazawa, M., Yoshinari, M. et al. (2005). Role of tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand in immune response to influenza virus infection in mice. J. Virol. 79:7658-7663.

95. Brincks, E. L., Katewa, A., Kucaba, T. A. et al. (2008). CD8 T cells utilize TRAIL to control influenza virus infection. J. Immunol. 181:4918-4925.

96. Herold, S., Steinmueller, M., von Wulffen, W. et al. (2008). Lung epithelial apoptosis in influenza virus pneumonia: the role of macrophage-expressed TNF-related apoptosis-inducing ligand. J. Exp. Med. 205:3065-3077.

97. Mirandola, P., Ponti, C., Gobbi, G. et al. (2004). Activated human NK and CD8+ T cells express both TNF-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL) and TRAIL receptors but are resistant to TRAIL-mediated cytotoxicity. 104:2418-2424.

98. Janssen, E. M., Droin, N. M., Lemmens, E. E. et al. (2005). CD4+ T-cell help controls CD8+ T-cell memory via TRAIL-mediated activation-induced cell death. Nature 434:88-93.

99. Zhang, Y., Boado, R. J., Pardridge, W. M. (2003). In vivo knockdown of gene expression in brain cancer with intravenous RNAi in adult rats. J. Gene Med. 5:1039-1045.

100. Cretney, E., Shanker, A., Yagita, H. et al. (2006). TNF-related apoptosis inducing ligand as a therapeutic agent in autoimmunity and cancer. Immunology and Cell Biology 84:87-98.

101. Lub-de Hooge, M. N., de Vries, E. G., de Jong, S. et al. (2005). Soluble TRAIL concentrations are raised in patients with systemic lupus erythematosus. Ann. Rheum. Dis. 64: 854-858.

102. Wandinger, K. P., Lunemann, J. D., Wengert, O. et al. (2003). TNF-related apoptosis inducing ligand (TRAIL) as a potential response marker for interferon-beta treatment in multiple sclerosis. Lancet 361:2036-2043.

103. Lamhamedi-Cherradi, S. E., Zheng, S. J., Maguschak, K. A. et al. (2003). Defective thymocyte apoptosis and accelerated autoimmune diseases in TRAIL-/- mice. Nat. Immunol. 4:255-260.

104. Corazza, N., Brumatti, G., Jakob, S. et al. (2004). TRAIL and thymocyte apoptosis: not so deadly? Cell Death Differ. 11: 213-215.

105. Cretney, E., Uldrich, A. P., Berzins, S. P. et al. (2003). Normal thymocyte negative selection in-TRAIL-deficient mice. J. Exp. Med. 198:491496.

106. Jacobsen, E. A., Ochkur, S. L, Pero, R. S. et al. (2008). Allergic pulmonary inflammation in mice is dependent on eosinophil-induced recruitment of effector T cells. J. Exp. Med. 205:699-710.

107. Lee, J. J., Dimina, D., Macias, M. P. et al. (2004). Defining a link with asthma in mice congenitally deficient in eosinophils. Science 305:1773-1776.

108. Sumi, T., Ishida, W., Okumura, K. et al. (2009). Activation of tumour necrosis, factor-related apoptosis-inducing ligand receptor enhances the severity of murine allergic conjunctivitis. Br. J. Ophthalmol! 93:140-115.

109. Pai, S. I., Wu, G. S., Ozo" ren, N. et al. (1998). Rare loss-of-function mutation of a death'receptor gene in head and neck cancer. Cancer Res. 58: 3513-3518.

110. Wang, S., El-Deiry, W. S. (2004). Inducible silencing of KILLER/DR5 in vivo promotes bioluminescent colon tumor xenograft growth and confers resistance to chemotherapeutic agent 5-fluorouracil. Cancer Res. 64: 6666-6672.

111. Finnberg, N., Gruber, J. J., Fei, P. et al. (2005). DR5 knockout mice are compromised in radiation-induced apoptosis. Mol. Cell Biol. 25: 2000-2013.

112. Laguinge, L. M., Samara, R. N., Wang, W. et al. (2008). DR5 receptor mediates anoikis in human colorectal carcinoma cell lines. Cancer Res. 68: 909917.

113. Diehl, G. E., Yue, H. H., Hsieh, K. et al. (2004). TRAIL-R as a negative regulator of innate immune cell responses. Immunity 21:877-889.

114. Falschlehner, C., Emmerich, C. H., Gerlach, B. et al. (2007). TRAIL signalling: decisions between life and death. Int. J. Biochem. Cell Biol. 39:14621475.

115. Mercurio, F., Zhu, H., Murray, B.W. et al. (1997). IKK-1 and IKK-2: cytokine-activated IkappaB kinases essential for NF-kappaB activation. Science 278:860-866.

116. Lin, Y., Devin, A., Cook, A. et al. (2000): The death domain kinase RIP is essential for TRAIL (Apo2L)-induced activation of IkappaB kinase and c-Jun N-terminal kinase. Mol. Cell Biol. 20:6638-6645.

117. Malinin, N. L., Boldin, M. P., Kovalenko, A. V. et al. (1997). MAP3K-related kinase involved in NF-kappaB induction by TNF, CD95 and IL-1. Nature 385:540-544.

118. Ehrhardt, H., Fulda, S., Schmid, I. et al. (2003). TRAIL-induced survival and proliferation in cancer cells resistant towards TRAIL-induced apoptosis mediated by NF-kappaB. Oncogene 22:3842-3852.

119. Kumar-Sinha, C., Varambally, S., Sreekumar, A. et al. (2002). Molecular crosstalk between the TRAIL and interferon signaling pathways. J. Biol. Chem. 277:575-585.

120. Hu, W. H., Johnson, H., Shu, H. B. (1999). Tumor- necrosis factor-related apoptosis -inducing ligand receptors signal NF-kB and JNK activation and apoptosis through distinct pathways. J. Biol. Chem. 274:30603-30610.

121. Varfolomeev, E., Maecker, H., Sharp, D. et al. (2005). Molecular determinants of kinase pathway activation by Apo2 ligand/tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand. J. Biol. Chem. 280:40599-40608.

122. Petersen, S. L., Wang, L., Yalcin-Chin, A. et al. (2007). Autocrine TNFalpha signaling renders human cancer cells susceptible to Smac-mimetic-induced apoptosis. Cancer Cell 12:445-456.

123. Lee, T. J., Lee, J. T., Park, J. W. et al. (2006). Acquired TRAIL resistance in human breast cancer cells are caused by the sustained cFLIP(L) and XIAP protein levels and ERK activation. Biochem. Biophys. Res. Commun. 351:1024-1030.

124. Ishimura, N., Isomoto, H., Bronk, S. F. et al. (2006). Trail induces cell migration and invasion in apoptosis-resistant cholangiocarcinoma cells. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 290:G129-G136.

125. Inoue, H., Shiraki, K., Yamanaka, T. et al. (2002). Functional expression of tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand in human colonic adenocarcinoma cells. Lab. Invest. 82:1111-1119.

126. Hinz, S., Trauzold, A., Boenicke, L. et al. (2000). Bcl-XL protects pancreatic adenocarcinoma cells against CD95- and TRAIL-receptor-mediated apoptosis. Oncogene 19: 5477-5486.

127. Fulda, S., Kufer, M. U., Meyer, E. et al. (2001). Sensitization for death receptor- or drug-induced apoptosis by re-expression of caspase-8 through demethylation or gene transfer. Oncogene 20:5865-5877.

128. Eggert, A., Grotzer, M. A., Zuzak, T.J. et al. (2001). Resistance to tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL)- induced apoptosis in neuroblastoma cells correlates with a loss of caspase-8 expression. Cancer Res. 61:1314-1319.

129. Zhang, L., Gii, J., Lin, T. cl al. (2002). Mechanisms involved in development of resistance to adenovirus-mediated proapoptotic gene therapy in DLD1 human colon cancer cell line. Gene Therapy 9:1262-1270;

130. Shivapurkar, N., Toyooka, S., Toyooka, K. O. et al. (2004). Aberrant methylation of trail decoy receptor genes is frequent in multiple tumor types. Int. J. Cancer. 109:786-792.

131. Vigneswaran, N., Baucum, D. G., Wu, J. et al. (2007); Repression of tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL) but not its receptors during oral cancer progression. BMC Cancer 7:108.

132. Zhang, X. D., Franco, A., Myers, K. et alt (1999). Relation of TNF related? apoptosis-inducing ligand (TRAIL) receptor and FLICE-inhibitory protein expression to TRAIL-induced apoptosis of melanoma; Cancer Res. 59:2747-2753.

133. Fisher, M. J., Virmani, A. K., Wu, L. et al:. (2001): Nucleotide substitution in the ectodomain of trail! receptor DR4 is associated with lung cancer and head and neck cancer. Clin. Cancer Res. 7:1688-1697.

134. Shin, M. S., Kim, H; S., Lee, S. H. et al. (2001). Mutations of tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand receptor 1 (TRAIL-R1) and receptor 2 (TRAIL-R2) genes in metastatic breast cancers. Cancer Res. 61:49424946.

135. Lee, S. H., Shin, M. S., Kim, H. S. et al. (2001). Somatic mutations of TRAIL-receptor 1 and TRAIL-receptor 2 genes in non-Hodgkin's lymphoma. Oncogene 20:399-403.

136. Lee, S. H., Shin, M. S., Kim, H. S. et al. (1999). Alterations of the DR5/TRA1L receptor 2 gene in non-small cell lung cancers. Cancer Res. 59:5683-5686.

137. Jeng, Y. M., Hsu, H. C. (2002). Mutation of the DR5/TRAIL receptor 2 gene is infrequent in hepatocellular carcinoma. Cancer Lett. 181:205-208.

138. Wagner, K. W., Punnoose, E. A., Januario, T. et al. (2007). Death-receptor O-glycosylation controls tumor-cell sensitivity to the proapoptotic ligand Apo2L/TRAIL. Nat. Med. 13:1070-1077.

139. Daniel, P. T., Wieder, T., Sturm, I. et al. (2001). The kiss ol death: promises and failures of death receptors and ligands in cancer therapy. Leukemia 15:1022-1032.

140. Siegmund, D. et al. (2002). Selective inhibition of FLICE-like inhibitory protein expression with small interfering RNA oligonucleotides is sufficient to sensitize tumor cells for TRAIL-induced apoptosis. Mol. Med. 8:725-732.

141. Micheau, O. (2003). Cellular FLICE-inhibitory protein: an attractive therapeutic target? Expert Opin. Ther. Targets 7:559-573.

142. Kim, H: S., Lee, J. W., Soung, Y. H: et al. (2003). Inactivating mutations of caspase-8 gene in colorectal carcinomas. Gastroenterology 125:708-715.

143. Mandruzzato, S., Brasseur, F., Andry, G. (1997). A CASP-8 mutation recognized by cytolytic T lymphocytes on a human head and neck carcinoma. J. Exp. Med. 186:785-793. '

144. Teitz, T., Wei, T., Valentine, M. B. (2000). Caspase 8 is deleted or silenced preferentially in childhood neuroblastomas with amplification of MYCN. Nat. Med. 6:529-535.

145. Miller, M. A., Karacay, B., Zhu, X. et al. (2006). Caspase 8L, a novel inhibitory isoform of caspase 8, is associated with undifferentiated neuroblastoma. Apoptosis 11:15-24.

146. Fulda, S. Tumor resistance to apoptosis. (2009). Int. J. Cancer 124:511-515.

147. Cursi, S., Rufini, A., Stagni, V. et al. (2006). Src kinase phosphorylates Caspase-8 on Tyr380: a novel mechanism of apoptosis suppression. Embo J. 25:1895-1905.

148. Adams, J. M., Cory, S.'(2007). The Bcl-2 apoptotic switch in cancer development and therapy. Oncogene 26:1324-1337.

149. Tsujimoto, Y., Finger, L. R., Yunis, J. et al. (1984). Cloning of the chromosome breakpoint of neoplastic B cells with the t(14;18) chromosome translocation. Science 226:1097-1099.

150. Pepper, C., Lin, T. T., Pratt, G. et al. (2008). Mcl-1 expression has in vitro and in vivo significance in chronic lymphocytic leukemia and is associated with other poor prognostic markers. Blood 112:3807-3817.

151. Kitada, S., Pedersen, I. M., Schimmer, A. D. et al. (2002). Dysregulation of apoptosis genes in hematopoietic malignancies. Oncogene 21:3459-3474.

152. Rampino, N., Yamamoto, H., lonov, Y. et al. (1997). Somatic frameshift mutations in the BAX gene in colon cancers of the microsatellite mutator phenotype. Science 275:967-969.

153. Egle, A., Harris, A.W., Bouillet, P. et al. (2004). Bim is a suppressor of Myc-induced mouse B cell leukemia. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101:61646169.

154. Zinkel, S. S., Ong, C. C., Ferguson, D. O. et al. (2003). Proapoptotic BID is required for myeloid homeostasis and; tumor suppression. Genes Dev. 17:229-239.

155. Tagawa, H., Karnan, S., Suzuki, R. et al; (2005). Genome-wide array-based CGH for mantle cell lymphoma: identification of homozygous deletions of the proapoptotic gene BIM. Oncogene 24:1348-1358.

156. Mestre-Escorihuela, C., Rubio-Moscardo, F., Richter, J. A. et al. (2007). Homozygous deletions localize novel tumor suppressor genes in B-cell lymphomas. Blood 109:271-280.

157. Hunter, A. M., LaCassc, E. C., Korneluk, R. G. (2007). The inhibitors of apoptosis (IAPs) as cancer targets. Apoptosis 12:1543-1568:

158. Eckelman, B. P., Salvesen, G. S., Scott, F. L. (2006). Human inhibitor of apoptosis proteins: why XIAP is the black, sheep of the family. EMBO Rep. 7:988-994.

159. Survivin, mapped to 17q25, is significantly associated with poor prognostic factors and promotes cell survival in human neuroblastoma. Oncogene 19:617623.

160. Tamm, I., Kornblau, S. M., Segall, H. et al. (2000); Expression and prognostic significance of IAP-family genes in human cancers and myeloid leukemias. Clin. Cancer Res. 6:1796-1803.

161. De Graaf, A. O., van Krieken, J. H., Tonnissen, E. et al. (2005). Expression of C-IAP1, C-IAP2 and SURVIVIN discriminates different types of lymphoid malignancies. Br. J. Haematol. 130:852-859.

162. Du, C., Fang, M., Li, Y. et al. (2000). Smac, a mitochondrial protein that promotes cytochrome c-dependent caspase activation by eliminating IAP inhibition. Cell 102:33-42.

163. Verhagen, A. M., Ekert, P. G., Pakusch, M. et al. (2000). Identification of DIABLO, a mammalian protein that promotes apoptosis by binding to and antagonizing IAP proteins. Cell 102: 43-53.

164. Zhang, X. D., Zhang, X. Y., Gray, C. P. et al. (2001). Tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand-induced apoptosis of human melanoma is regulated by Smac/DIABLO release from mitochondria. Cancer Res. 61:73397348.

165. Shetty, S., Gladden, J. B., Henson, E. S. et al. (2002). Tumor necrosis factor-related apoptosis inducing ligand (TRAIL) upregulates death receptor 5 (DR5) mediated by NFkappaB activation in epithelial derived cell lines. Apoptosis 7:413-420.

166. Chen, X., Kandasamy, K., Srivastava, R. K. (2003). Differential roles of RelA (p65) and c-Rel subunits of nuclear factor kappa B in tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand signaling. Cancer Res. 63:1059-1066.

167. Ichijo, H. (1999). From receptors to stress-activated MAP kinases. Oncogene 18:6087-6093.

168. Zhang, X. D., Borrow, J. M., Zhang, X. Y. et al. (2003). Activation of ERK1/2 protects melanoma cells from TRAIL-induced apoptosis by inhibiting Smac/DIABLO release from mitochondria. Oncogene 22:2869-2881.

169. Frese, S., Pirnia, F., Miescher, D. et al. (2003). PG490-mediated sensitization of lung cancer cells to Apo2L/TRAIL-induced apoptosis requires activation of ERK2. Oncogene 22:5427-5435.

170. Ohtsuka, T., Buchsbaum, D., Oliver, P. et al. (2003). Synergistic induction of tumor/cell apoptosis by death receptor antibody and chemotherapy agent through JNK/p38 and mitochondrial death pathway. Oncogene 22:20342044.

171. Ono, K., Han, J. (2000). The p38< signal transduction pathway: activation and function. Cell Signal. 12:1-13.

172. Wajant, H. (2004). TRAIL and NFkappaB signaling a complex relationship. Vitam. Horm. 67:101-132.

173. Wang, S., El-Deiry, W. S. (2003b). TRAIL and apoptosis induction by TNF-family death-receptors. Oncogene 22: 8628-8633.

174. Jin, X., Wu, X. X., Abdel-Muneem Nouh, M. A. et al. (2007). Enhancement of death receptor 4 mediated apoptosis and cytotoxicity in renal cell carcinoma cells by subtoxic concentrations of doxorubicin. J. Urol. 177:1894-1899.

175. Guan, B., Yue, P., Clayman, G. L., et al. (2001). Evidence that the death receptor DR4 is a DNA damage-inducible, p53-regulated gene, J. Cell. Physiol. 188:98-105.

176. Kerbauy, D. M., Lesnikov, V., Abbasi, N. et al. (2005). NF-kappaB and FLIP in arsenic trioxide (ATO)-induced apoptosis in myelodysplastic syndromes (MDSs). Blood 106:3917-3925.

177. Sayers, T. J., Brooks, A.D., Koh, C.Y. et al. (2003). The proteasome inhibitor PS-341 sensitizes neoplastic cells to TRAIL-mediated apoptosis by reducing levels of c-FLIP. Blood 102:303-310.

178. Panner, A., James, C. D., Berger, M. S., Pieper, R. O. (2005). mTOR controls FLIPS translation and TRAIL sensitivity in glioblastoma multiforme cells. Mol. Cell Biol. 25: 8809-8823.

179. Kang, J., Kisenge, R. R., Toyoda, H. et al. (2003). Chemical sensitization and regulation of TRAIL-induced apoptosis in a panel of B-lymphocytic leukaemia cell lines. British J. Haematol. 123:921-932.

180. Hougardy, B. M., Maduro, J. H., van der Zee, A. G. et al. (2006). Proteasome inhibitor MG132 sensitizes HPV-positive human cervical cancer cells to rhTRAIL-induced apoptosis. Internat. J. Cancer 118:1892-1900.

181. Karikari, C. A., Roy, I., Tryggestad, E. et al. (2007). Targeting the apoptotic machinery in pancreatic cancers using small-molecule antagonists of the X-linked inhibitor of apoptosis protein. Mol. Cancer Ther. 6:957-966.

182. Mirandola, P., Sponzilli, I., Gobbi, G. et al. (2006). Anticancer agents sensitize osteosarcoma cells to TNF-related apoptosis-inducing ligand downmodulating IAP family proteins. Int. J. Oncol. 28:127-133.

183. Hao, J. H., Yu, M., Liu, F. T. et al. (2004). Bcl-2 inhibitors sensitize tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand-induced apoptosis by uncoupling of mitochondrial respiration in human leukemic CEM cells. Cancer Res. 64:3607-3616.

184. Fulda, S., Wick, W., Weller, M. et al. (2002). Smac agonists sensitize for Apo2L/TRAIL- or anticancer drug-induced apoptosis and induce regression of malignant glioma in vivo. Nat. Med. 8:808-815.

185. Ray, S., Bucur, O., Almasan, A. (2005). Sensitization of prostate carcinoma cells to Apo2L/TRAIL by a Bcl-2 family protein inhibitor. Apoptosis 10:1411-1418.

186. Rosato, R. R., Almenara, J. A., Coe, S. et al. (2007). The multikinase inhibitor sorafenib potentiates TRAIL lethality in human leukemia cells in association with Mcl-1 and cFLIPL down-regulation. Cancer Res. 67:94909500.

187. Ricci, M. S., Kim, S. H., Ogi, K. et al. (2007). Reduction of TRAIL-induced Mcl-1 and cIAP2 by c-Myc or sorafenib sensitizes resistant human cancer cells to TRAIL-induced death. Cancer Cell 12:66-80.

188. Voortman, J., Resende, T. P., Abou, El. et al. (2007). TRAIL therapy in non-small cell lung cancer cells: sensitization to death receptor-mediated apoptosis by proteasome inhibitor bortezomib. Mol.Cancer Ther. 6:2103-2112.

189. Ravi, R., Jain, A. J., Schulick, R. D. et al. (2004). Elimination of hepaticmetastases of colon cancer cells via p53-independent cross-talk between irinotecan and Apo2 ligand/TRAIL. Cancer Res. 64:9105-9114.

190. Romagnoli, M., Desplanques, G., Mafga, S. et al. (2007). Canonical nuclear factor kappaB pathway inhibition blocks myeloma cell growth and induces apoptosis in strong synergy with TRAIL. Clin. Cancer Res. 13: 60106018.

191. Kim, M., Liao, J;, Bowling, M. L. et al. (2008). TRAIL inactivates the mitotic checkpoint and potentiates death; induced by microtubule-targeting agents in human cancer cells. Cancer Res. 68:3440-3449.

192. Xia, S:, Li, Y., Rosen, E. M. et al. (2007). Ribotoxic stress sensitizes glioblastoma cells to death receptor induced apoptosis: requirements for c-Jun NH2-terminal kinase and Bim. Mol. Cancer Res. 5:783-792.

193. Leung, K.T. et al. (2008). Activation of the JNK pathway promotes phosphorylation and degradation of BimEL a novel mechanism of chemoresistance in Tcell acute lymphoblastic leukemia. Carcinogenesis 3: 544551.

194. Koschny, R., Walczak, H., Ganten, T. M. (2007). The promise of TRAIL-potential and risks of a novel anticancer therapy. J. Mol. Med. 85:923935.

195. Gong, B., Almasan, A. (2000). Apo2 ligand/TNF-related apoptosis-inducing ligand and death receptor 5 mediate the apoptotic signaling induced by ionizing radiation in leukemic cells. Cancer Res. 60:5754-5760.

196. Hao, C., Song, J.H., His, B. et al. (2004). TRAIL Inhibits Tumor Growth but Is Nontoxic to Human Hepatocytes in Chimeric Mice. Cancer Res. 64: 8502-8506.

197. Mundt, B., Wirth, T., Zender, L. et al. (2005). Tumour necrosis factor related apoptosis inducing ligand (TRAIL) induces hepatic steatosis in viral hepatitis and after alcohol intake. Gut. 54:1590-1596.

198. Corazza, N., Kassahn, D., Jakob, S. et al. (2009). TRAIL-Induced Apoptosis Between Tumor- Therapy and Immunopathology. Natural Compounds and Their Role in Apoptotic Cell Signaling Pathways: Ann. N.Y. Acad. Sci. 1171:50-58.

199. Naka, T., Sugamura, K., Hylander, B. L. et al. (2002). Effects of tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand alone and in combination with chemotherapeutic agents on patients' colon tumors grown in SCID mice. Cancer Res 62:5800-5806.

200. Shankar, S., Singh, T. R., Chen, X. et al. (2004). The sequential treatment with ionizing radiation»followed by TRAIL/Apo-2L reduces tumor growth and induces apoptosis of breast tumor xenografts in nude mice. Int. J. Oncol. 24:1133-1140.

201. Shankar, S., Singh, T. R., Srivastava, R. K. (2004). Ionizing- radiation enhances the therapeutic potential of TRAIL in prostate cancer in vitro and in vivo: Intracellular mechanisms. Prostate 61:35-49.

202. Wu, X. X., Ogawa, O., Kakehi, Y. (2004). TRAIL and chemotherapeutic drugs in cancer therapy. Vitam. Horm. 67:365-383.

203. Mirandola, P., Sponzilli, I., Gobbi, G. et al. (2006). Anticancer agents sensitize osteosarcoma cells to TNF-related apoptosis-inducing ligand downmodulating IAP family proteins. Int. J. Oncol. Jan. 28:127-133.

204. Odoux, C., Albers, A. (2004). Additive effects of TRAIL and paclitaxel on cancer cells: implications for advances in cancer therapy Vitam. Horm. 67:385-407.

205. Daniel, D., Yang, B., Lawrence, D. A. et al. (2007). Cooperation of the pro-apoptotic receptor agonist rhApo2L/TRAIL with the CD20 antibody rituximab against non-Hodgkin's lymphoma xenografts. Blood 110:4037-4046.

206. Koschny, R., Ganten, T. M., Sykora, J. et al. (2007). TRAIL/bortezomib cotreatment is potentially hepatotoxic but induces cancer-specific apoptosis within a therapeutic window. Hepatology 45:649-658.

207. Leverkus, M., Sprick, M. R., Wachter, T. et al. (2003). Proleasome inhibition results in TRAIL sensitization of primary keratinocytes by removing the resistance-mediating block of effector caspase maturation. Mol. Cell Biol. 23:777-790.

208. Pan, Y., Xu, R., Peach, M. et all (2007). Application of pharmacodynamic assays in a phase la trial of Apo2L/TRAIL in patients with advanced tumors. J. Clin. Oncol. 25:3535.

209. Stormo, G. D., Schneider, T. D., Gold, L. (1982). Characterization of translation initiation sites in E. coli. Nucl. Acids Res. 10:2971-2996.

210. Casadaban, M. J., Martinez-Arias, A., Shapira, S. K. et al. (1983). p-galactosidase gene fusion for analyzing gene expression in Escherichia coli and yeast. Methods Enzymol. 100: 293-308.

211. Maina, C. V., Riggs, P. D., Grandea, A. G. et al. (1988). An Escherichia coli vector to express and purify foreign proteins by fusion to and separation from maltose-binding protein. Gene 74:365-373.

212. Smith, D. B., Johnson, K. S. (1988). Single-step purification of polypeptides expressed in Escherichia coli as fusions with glutathione S-transferase. Gene 67:31-40.

213. LaVallie, E. R., DiBlasio, E. A., Kovacic, S. et al. (1993). A thioredoxin gene fusion expression system that circumvents inclusion body formation in the E. coli cytoplasm. Biotechnology (N Y). 11:187-193.

214. Lunn. C. A., Pigiet, V. P. (1982). Localization of thioredoxin from Escherichia coli in an osmotically sensitive compartment. J. Biol. Chem. 257:11424-11430.

215. Schein, C. H. (1989). Production of soluble recombinant proteins in bacteria. Biotechnology 7:1141-1149.

216. Mitraki, A., King, J. (1989). Protein folding intermediates and inclusion body formation. Biotechnology 7:690-697.

217. Lunn, C. A., Kathju, S., Wallace, B. J. et al. (1984). Amplification and purification of plasmid-encoded thioredoxin from Escherichia coli K12. J. Biol. Chem. 259:10469-10474.

218. Katti, S. K., LeMaster, D. M., Eklund, H. (1990). Crystal structure of thioredoxin from Escherichia coli at 1.68 angstroms resolution. J. Mol. Biol. 212:167-184.

219. Stader, J. A., Silhavy, T. J. (1990). Engineering Escherichia coli to secrete heterologous gene products. Methods in Enzymol. 165:166-187.

220. Ohnishi, S., Takano, K. (2003). Amyloid fibrils from the viewpoint of protein folding. Cell Mol. Life Sei. 61(5):511-524.

221. Gasparian, M. E., Ostapchenko, V. G., Schulga, A. A. et al. (2003). Expression, purification, and characterization of human enteropeptidase catalytic subunit in Escherichia coli. Protein Expr. Purif. Sep. 31(1):133-139.

222. Gasparian, M. E., Ostapchenko, V. G., Dolgikh, D. A. et al. (2006). Biochemical characterization of human enteropeptidase light chain. Biochemistry (Mosc). 71:113-119.

223. Agol, V. I., Belov, G. A., Bienz, K. et al. (2000). Competing death programs in poliovirus-infected-cells: commitment switch in the middle of the infectious cycle. J. Virol. 74:5534-5541.

224. Bradford, M.M. (1976). A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal.* Biochem. 72:248-254.

225. Gill, S. C., von Hippel, P. H. (1989). Calculation of protein extinction coefficients from amino acid sequence data. Anal. Biochem. 182:319-326.

226. Schagger, H., von Jagow, G. (1987). Tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis for the separation- of proteins in the range from 1 to 100 kDa. Anal. Biochem. 166:368-379.

227. Otwinowski, Z., Minor, W. (1997). Processing of X-ray diffraction data collected in oscillation mode. Methods in Enzymol. 276:307-326:

228. Schuck, P. (2000). Size-distribution analysis of macromolecules by sedimentation velocity ultracentrifugation and Lamm equation modeling. Biophys. J. 78:1606-1619.

229. Liew, O. W., Ching Chong, J. P., Yandle, T. G. et al. (2005). Preparation of recombinant thioredoxin fused N-terminal proCNP: analysis of enterokinase cleavage products reveals new enterokinase cleavage sites. Protein Expr. Purif. 41:332-340.

230. Haldar, S., Jena, N., Croce, C. M. (1995). Inactivation of Bcl-2 by phosphorylation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 92:4507-4511.

231. Wen, J., Ramadevi, N., Nguyen, D. et al. (2000). Antileukemic drugs increase death receptor 5 levels and enhance Apo-2L-induced apoptosis of human acute leukemia cells. Blood 96:3900-3906.

232. Mirandola, P., Gobbi, G., Ponti, C. et al. (2006). PKCe control protection against TRAIL in erythroid progenitors. Blood 107:508-513.

233. Shen, Y. L., Xia, X. X., Zhang, Y. et al. (2003). Refolding and purification of Apo2L/TRAIL produced as inclusion bodies in high-cell-density cultures of recombinant Escherichia coli. Biotechnol. Lett. 25:2097-2101.

234. Frottin, F., Martinez, A., Peynot, P. et al. (2006). The proteomics of N-terminal methionine cleavage. Mol. Cell Proteomics 5:2336-2349.

235. Cha, S. S., Shin, H. C., Choi, K. Y. et al. (1999). Expression, purification and crystallization of recombinant human TRAIL. Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 55:1101-1104.

236. Щепина, JI. А., Попова, E. H., Плетюшкина, О. Ю. и др. (2002). Апоптоз клеток HeLa и антиапоптозное действие онкобелка Вс1-2 не зависят от дыхания и мембранного потенциала митохондрий. Биохимия 67:240-253.

237. Izyumov, D. S., Avetisyan, А. V., Pletjushkina, О. Y. et al. (2004). "Wages of fear": transient threefold decrease in intracellular ATP level imposes apoptosis. Biochim. Biophys. Acta 1658:141-147.

238. Ashkenazi, A., Dixit, V. M. (1999). Apoptosis control by death and decoy receptors. Curr. Opin. Cell Biol. 11:255-260.

239. Griffith, T. S., Rauch, S. Т., Smolak, P. J. et al. (1999). Functional analysis of TRAIL receptors using monoclonal antibodies. J. Immunol. 162:2597-2605.

240. Ashkenazi, A., Herbst, R. S. (2008). To kill a tumor cell: the potential of proapoptotic receptor agonists. J. Clin. Invest. 118:1979-1990.

241. Inoue, S., MacFarlane, M., Harper, N. et al. (2004). Histone deacetylase inhibitors potentiate TNFrelated apoptosis-inducing ligand1 (TRAIL)-induced apoptosis in lymphoid malignancies. Cell Death Differ. 11:193-206.

242. Perez-Cruz, I., Carcamo, J. M., David, W. et al. (2007). Caspase-8 dependent trail-induced apoptosis in cancer cell lines is inhibited by vitamin C and catalase. Apoptosis 12:225-234.

243. Gregorini, A., Tomasetti, M., Cinti, C. et al. (2006). CD38 expression enhances sensitivity of lymphoma T and B cell lines to biochemical and receptor-mediated apoptosis. Cell Biol. Int. 30:727-732.

244. Kim, K., Fisher, M. J., Xu, S. Q. et al. (2000). Molecular determinants of response to TRAIL in killing of normal and cancer cells. Clin. Cancer Res. 6:335-346.1. БЛАГОДАРНОСТИ

Информация о работе

Яголович, Анна Валерьевна
кандидата биологических наук
Москва, 2010
ВАК 03.01.02

Диссертация

Повышение противоопухолевой активности цитокина TRAIL путем изменения аминокислотного состава белка - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы