Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Математическое моделирование динамики апоптоза, индуцированного гранзимом В, и исследование устойчивости фонового состояния системы апоптоза

ВАК РФ 03.01.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Математическое моделирование динамики апоптоза, индуцированного гранзимом В, и исследование устойчивости фонового состояния системы апоптоза"

На правах рукописи

Синцов Александр Владимирович

МАТЕМАТИЧЕСКОЕ МОДЕЛИРОВАНИЕ ДИНАМИКИ АП0ПТ03А, ИНДУЦИРОВАННОГО ГРАНЗИМОМ В, И ИССЛЕДОВАНИЕ УСТОЙЧИВОСТИ ФОНОВОГО СОСТОЯНИЯ СИСТЕМЫ АПОПТОЗА

Специальность 03.01.02 — биофизика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

ИИ4607104

Москва - 2010

004607104

Работа выполнена в учреждении Российской академии наук Центре теоретических проблем Физико-химической фармакологии РАН.

Научный руководитель: доктор технических наук, профессор

М.А.Ханин.

Официальные оппоненты: доктор физико-математических наук,

профессор И.А.Лубашевский;

кандидат физико-математических наук М.А.Пантелеев.

Ведущая организация: Научно-исследовательский институт

физико-химической биологии им. А.Н.Белозерского МГУ.

Защита диссертации состоится ( \А1/\Л9{ 2010 года в ({_ часов на заседании Диссертационного совета Д002.252.01 при ДТП ФХФ РАН по адресу: Москва, Ленинский пр-т, д.38А, корп.1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ДТП ФХФ РАН.

Автореферат разослан мая 2010 года.

Учёный секретарь Диссертационного совета Д002.252.01,

доктор медицинских наук И.С.Николаева

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. В последние время явление апоптоза, или запрограммированной клеточной смерти, привлекает растущее внимание исследователей. Это связано в первую очередь с возможностью использования индукции апоптоза в малигнизированных клетках как эффективного метода лечения онкологических заболеваний. Предлагаемая работа посвящена исследованию динамики активации апоптоза. В работе применён метод исследования, основанный на математическом моделировании. Полученные результаты вносят определённый вклад в понимание функционирования системы апоптотических белков и, следовательно, способствуют созданию новых методов лечения онкологических заболеваний путём индукции апоптоза в малигнизированных клетках.

Цель и задачи исследования. Целью работы является исследование методом математического моделирования динамического поведения системы апоптотических белков в ответ на действие естественного индуктора гранзима В, а также устойчивости этой системы в отсутствие гранзима В. Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

•разработать математическую модель динамики активации

апоптоза гранзимом В; •исследовать устойчивость фонового состояния системы апоптоза (т.е. состояния этой системы в отсутствие внешнего активирующего воздействия); •исследовать влияние дефицитов прокаспаз и концентрации ингибитора Х1АР на динамику апоптотической клеточной смерти;

•исследовать динамику ограниченного протеолиза апоптотических мишеней при активации апоптоза гранзимом В;

•выяснить условия, нарушение которых ведёт к потере злокачественной клеткой резистентности к активации апоптоза инициаторной каспазы-8.

Научная новизна работы. С помощью проведённого исследования удалось не только подтвердить ранее полученные экспериментальные результаты, но и установить новые. К последним можно отнести следующие результаты: •найдено условие, при выполнении которого обеспечивается

устойчивость фонового состояния системы апоптоза; •показано, что устойчивость фонового состояния системы апоптоза различных линий злокачественных клеток обеспечивается с существенным запасом;

•убиквитин-лигазная активность ингибитора XI АР, приводящая к необратимому ингибированию исполнительных каспаз, играет не менее важную роль в обеспечении устойчивости апоптотической системы по сравнению с осуществляемым тем же белком прямым ингибированием исполнительных каспаз, носящим обратимый характер; •ингибирование протеасомы также может привести к потере устойчивости фонового состояния апоптотической системы;

Практическая значимость полученных результатов заключается в том, что они позволяют предсказать наличие противоопухолевых свойств у широкого класса соединений, таких как ингибиторы протеасомы и ингибиторы убиквитин-лигазной активности белков семейства ТАР, до проведения экспериментальных проверок. Кроме того, полученные результаты будут способствовать развитию исследований, направленных на создание нового метода лечения онкологических заболеваний, основанных на индукции апоптоза гранзимом В в малигнизированных клетках.

Положения, выносимые на защиту. •Методом математического моделирования установлена высокая эффективность гранзима В в качестве индуктора апоптоза: практически полная фрагментация хроматина достигается уже при проникновении в клетку всего нескольких молекул гранзима В. •Показано, что появление резистентных к индукции апоптоза гранзимом В клонов маловероятно, т.к. отсутствие любой из прокаспаз не приводит к блокированию активации апоптоза.

•Установлено, что устойчивость фонового состояния апоптотической системы обеспечивается, в частности, необратимым ингибированием протеазной активности каспаз 3 и 6.

•Установлен механизм терапевтического действия таких противоопухолевых препаратов как бортезомиб, NPI-0052, карфилзомиб, проходящих или уже прошедших клинические испытания, связанный с понижением показателя устойчивости апоптотической системы опухолевой клетки. Этот эффект обусловлен ингибированием протеасомы.

Апробация_результатов_исследования. Материалы

диссертации докладывались:

•на научном семинаре в Институте общей генетики им. Н.И.Вавилова РАН;

•в отделе исследования рака, клиника Мэйо, (г. Рочестер,

штат Миннесота, США); •на межлабораторном семинаре ДТП ФХФ РАН.

Объём и структура диссертации. Диссертация изложена на 120 страницах машинописного текста и состоит из введения, четырёх глав, заключения, списка литературы, содержащего 141 источник, и приложения, в котором указано используемое программное обеспечение. Текст диссертации включает 23 рисунка и 8 таблиц.

Публикации. По теме диссертации опубликовано три работы.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Первая_глава диссертации посвящена анализу

литературных данных, освещающих путь проникновения гранзима В в атакуемую лимфоцитом клетку и вызванные этим проникновением внутриклеточные биохимические реакции с участием апоптотических протеаз, ядерной нуклеазы CAD, их ингибиторов, а также некоторых митохондриальных белков.

Рис. 1. Схема биохимических реакций апоптоза, индуцированного гранзимом В. Стрелками обозначена активация, отрезками — инактивация.

Вторая глава посвящена описанию предложенной математической модели динамики апоптоза, индуцированного гранзимом В. Схема биохимических реакций активации этого процесса представлена на рис. 1. Динамика активации апоптоза гранзимом В в клетках I типа (т.е. клетках, апоптоз в которых не сопровождается активацией прокаспазы-9 или сопровождается лишь незначительной её

активацией) описывается следующей системой

дифференциальных уравнений:

^ =

dt

= -^[рС8][СГв],

dt

^ = -^[Рс3][Сгв] - к39[Рс3][с8] - *1Ы[с6], сгь

%1 = -^[рс7][СГв]-^[РС7][С8|, = *вК][сгв]- Л8[с8],

сгс

Фв]

dt

= ^[Рс3][Сгв] + ^[РС3][С8] + ^[РС3][С6] -

dt

- Агз [XТАР][с3] + ^з [с3Х1АР] - к3[с2] ^ = фо6][Сз]~ кб[СеЬ

dt

^^ = к7 [Рс7 ] [Сгв ] + £7 [Рс7][с8] - ^7[Х1АР][С7] + ^ [СтXIАР] - к1[с1 dt

г

С^Х1АР] = -^+[х!АР][с3] + [С3Х1АР] - [ХГАР] [с7 ] + к^ХЫР], dt

Фз^ГАР] = ^[Х1АР][Сз] _ к-[Сзх1Ар] - к3[с3Х1Ар], dt

^ХХАР] = _ к-[с1Х1АР] _ ^7[с7^1Ар],

dt

^ = - *М[с3] - *М[С7],

dt

^ = *М[сгв] + + к]М[С7] - кп[САО],

а[шл] _ £ [ШЛ][СЛР] dt " саь к1 + [ша] ;

где [бгв] - концентрация гранзима В, [Рсд] и [Сд] -концентрации прокаспазы-1 и каспазы-1, где 1 = 3, 6, 7, 8, [с3Х1АР] и [с7Х1Ар] — концентрации комплексов каспаз 3 и

7 с ингибитором XIAP, [XIAP] — концентрация свободного XIAP, [dff] и [cad] - концентрации комплекса DFF и ядерной нуклеазы CAD, [dna] — удвоенная концентрация интактных нуклеосом в ядерном хроматине; кв — константа скорости деградации гранзима В, кх — константа скорости деградации каспазы-i, кп — константа скорости деградации ядерной

нуклеазы CAD; kf и kj — кинетические константы протеолиза прокаспазы-i гранзимом В и каспазой-j, соответственно, к*, kj и к]- — кинетические константы протеолиза ингибитора ICAD гранзимом В и каспазами 3 и 7, соответственно; IrJ и Jrj - константы скорости образования каспазами 3 и 7 комплексов с ингибитором XIAP, )г3" и Je," -

константы скорости распада этих комплексов; k^at и К^ — каталитическая константа и константа Михаелиса фрагментации хроматина нуклеазой CAD.

Далее во второй главе приведены величины внутриклеточных концентраций, составляющих начальные условия описанной математической модели, и численные значения всех используемых в предложенной системе уравнений кинетических констант, определённые

биохимическими методами.

Третья глава посвящена математическому моделированию фонового состояния апоптотической системы (т.е. состоянию этой системы в отсутствие индукторов апоптоза) с целью исследования устойчивости. В фоновом состоянии концентрации каспаз, комплексов каспаз с их ингибиторами, а также ядерной нуклеазы CAD равны нулю. Система апоптотических протеинов в фоновом состоянии представлена прокаспазами, ингибиторами каспаз и комплексом DFF. В норме система апоптотических протеинов должна быть устойчива, так как в противном случае оказалась бы возможной случайная индукция апоптоза, обусловленная флуктуациями концентраций активных апоптотических ферментов.

Считая концентрации прокаспаз, ингибитора каспаз XIАР и комплекса DFF в фоновом состоянии стационарными,

dx

получим линейную систему уравнений — = Ах, где вектор х

dt

и матрица А равны:

Ьгв]

Ы Ы [с6]

Ы '

[с3Х1Ар]| [С7Х1АР]\

I [САО] |

О

о

О

о о о

0 - к8 0 0

Фсз1 фс3\ - к+[х1АР1 -

0 0 Ф^Ъ

0

0 0 ф1АР]

0 0 0

0 Ф™1

"'- к7 [Х1АР]0 - к7 О

к* [Х1АР]0

^Ио

О О кз О

о

^з - кз О О

О О О О к 7" О

О О О О О О О

- кп

где фоновые (стационарные) концентрации обозначены добавлением индекса 0.

Необходимым и достаточным условием асимптотической устойчивости линейной системы дифференциальных уравнений первого порядка является отрицательность вещественной части всех корней характеристического уравнения |А - ЛЕ| =0, где Е — единичная матрица, А — корень

характеристического уравнения. Применяя критерий Рауса-Гурвица и учитывая положительность констант деградации и

неотрицательность концентраций и прочих кинетических констант, получаем необходимое и достаточное условие асимптотической устойчивости в виде:

В полученное условие асимптотической устойчивости входят параметры, относящиеся лишь к взаимодействию каспаз 3 и б, а также каспазы-3 с ингибитором XIАР. Такой вид условия устойчивости не является неожиданным, если учесть, что каспазы 3 и 6 составляют положительную обратную связь системы апоптотических протеинов (см. рис. 1). Следует также отметить, что этот результат не зависит от параметров, относящихся к гранзиму В. Он останется справедливым и в том случае, если возмущение системы апоптотических протеинов вызвано другими индукторами апоптоза.

Представляется целесообразным ввести понятие показателя устойчивости, который является количественной мерой асимптотической устойчивости фонового состояния системы апоптоза:

Величина показателя устойчивости говорит не только о наличии или отсутствии устойчивости, но и даёт информацию об имеющемся запасе устойчивости, что, как будет показано в ниже, имеет решающее значение для предварительной оценки эффективности терапии онкологических заболеваний некоторыми классами лекарственных средств.

Далее в третьей главе приводится оценка величины показателя устойчивости для шестидесяти линий злокачественных клеток, которые относятся к лейкемии, раку лёгких, раку стволовых клеток, раку мозга, раку простаты, меланоме, раку яичников, почечной карциноме и раку молочной железы. Как и следовало ожидать, во всех рассмотренных линиях злокачественных клеток фоновое состояние системы апоптоза является устойчивым (9 > 0). В группе с низким показателем устойчивости (9 < 1,5) оказались в основном почечные карциномы и большая часть рака лёгких. Наименее стабильной из них оказалась линия рака лёгких АГС1-Я226 со средним показателем устойчивости 0,6. В группе со средним показателем устойчивости (1,5 < 9 < 2,0) обосновались лейкемии и рак простаты. И,

наконец, группу с высоким показателем устойчивости (6 > 2,0) предпочитают клетки рака молочной железы. Наиболее апоптотически устойчивыми в этой группе оказались меланомы UACC-257 (9 = 2,6), MALME-3M (9 = 2,7) и М14 (9 = 2, 8) .

В четвёртой главе изложены результаты исследования влияния многих параметров (концентрации индуктора, дефицитов прокаспаз, концентрации ингибитора XIAP и др.) на динамику апоптоза, индуцированного как гранзимом В, так и спонтанной автоактивацией прокаспазы-8 в отсутствие гранзима В.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Исследование, результаты которого изложены в диссертации, проводилось методом математического моделирования. В частности вычисления в рамках разработанной математической модели динамики активации апоптоза гранзимом В, представленной системой нелинейных обыкновенных дифференциальных уравнений первого порядка, проводились методом Рунге-Кутты четвёртого порядка с адаптированным шагом. Исследование устойчивости фонового состояния системы апоптоза проводилось с применением критерия Рауса-Гурвица к характеристическому уравнению линеаризованной системы уравнений.

Вычисления и графическое оформление численных результатов были выполнены в среде Mathcad, version 14,0.0.163, © 2007 Parametric Technology Corporation.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Влияние концентрации гранзима В на динамику апоптотической клеточной смерти. На рисунках 2 и 3 представлены кривые, иллюстрирующие динамику активации апоптоза гранзимом В в типичной злокачественной клетке с усреднёнными начальными концентрациями белков. Фрагментация 90 % хроматина достигается примерно через час после проникновения в клетку гранзима В (см. рис. 2). Немного больше времени — от полутора до двух часов — требуется для протеосомной деградации 90 % активных апоптотических протеаз (каспаз и самого гранзима В) и активной нуклеазы CAD (см. рис. 2 и 3).

t, ч

Рис. 2. Динамика инактивации гранзима В, распада комплекса DFF, активации нуклеазы CAD и фрагментации хроматина в процессе апоптоза. Розовая кривая соответствует гранзиму В, серая — DFF, жёлтая — CAD, бирюзовая — ДНК. Все концентрации приведены в относительных единицах.

Типичная начальная концентрация гранзима В, используемая при построении кривых на рисунках 2 и 3, составляет 10 нМ. Тем не менее, апоптоз вполне эффективен и при эндоцитозе всего 10 пМ гранзима В. Такой концентрации индуктора вполне достаточно для практически полной фрагментации хроматина, а выживание клетки с разрушенным хроматином невозможно. Даже 5 пМ гранзима В в клетке-мишени приводят через 12 ч к фрагментации её ДНК более чем на 99 %, сопрвождаясь, однако, активацией всего лишь 2 % прокаспаз 3 и б (составляющих положительную обратную связь апоптотической системы), и совершенно незаметной (ещё на два порядка меньшей) активацией каспаз 7 и 8. И только при более низких концентрациях

токсический эффект гранзима В резко падает. Например, под действием 4 пМ гранзима В фрагментация ДНК после выхода апоптотической системы на стационар составляет только 15 %, а уровени активации каспаз 3 и 6 падают в пятьдесят раз по сравнению с апоптозом, индуцированным 5 пМ гранзима В. Такое резкое падение силы отклика системы при понижении величины сигнала ниже определённого значения, называемого пороговым, характерно для устойчивых систем с положительной обратной связью, какой и является рассматриваемая система. Таким образом, пороговое значение внутриклеточной концентрации гранзима В для рассматриваемого случая типичной злокачественной клетки составляет 5 пМ. Для клеток объёмом 1 т 3 пл такая концентрация соответствует всего лишь нескольким молекулам на клетку.

^ ч

Рис. 3. Динамика активации каспаэ при индукции апоптоза хранзимом В. Каспазе-8 соответствует зелёная кривая, каспазе-3 — красная, каспазе-6 — синяя, каспазе-7 — фиолетовая. Концентрации всех каспаз приведены в относительных единицах.

В отсутствие гранзима В активные каспазы значительно менее эффективны в качестве внутриклеточных индукторов апоптоза. Для инициаторной каспазы-8 пороговая концентрация составляет 0,6 нМ, что более чем на два порядка выше соответствующей величины для гранзима В, а для исполнительных каспаз 3 и 6 этот показатель находится в диапазоне от 20 до 200 нМ, причём сам пороговый эффект в последнем случае значительно менее выражен.

Влияние дефицита прокаспаз на динамику активации апоптоза гранзимом В. При дефиците любой из прокаспаз вплоть до её отсутствия не наблюдается заметного изменения динамики фрагментации хроматина по сравнению с нормой. Таким образом, появление резистентных к индукции апоптоза гранзимом В клонов маловероятно, т.к. отсутствие любой из прокаспаз не приводит к неэффективности гранзима В как индуктора апоптоза. Динамическая картина апоптоза радикально меняется при одновременном дефиците прокаспаз 3 и 7 (см. рис. 4). Комплекс DFF распадается теперь только на четверть, вследствие чего на порядок падает уровень активации CAD, количество которого хватает только на фрагментацию одной трети хроматина (ср. рис. 2 и 4 ) . В свете представленных на рисунке 4 данных становится понятной малая чувствительность апоптотической системы к дефицитам прокаспаз 3 и 7, взятым по отдельности: параллельная активация этих каспаз в апоптозе приводит к тому, что оставшаяся каспаза берёт на себя функции отсутствующей.

Необходимо также отметить, что в отсутствие прокаспаз 3 и 7, каспаза-8 не выполняет никаких функций в рассматриваемых здесь клетках I типа, а прокаспаза-6 не активируется (см. рис. 1} . Приняв эти соображения во внимание, данные рисунка 3 можно интерпретировать как исключительное действие физиологической концентрации гранзима В (без участия каспаз) на динамику фрагментации ДНК. Сравнение динамических кривых рисунков 2 и 4 позволяет придти к выводу, что каспазный каскад выполняет функцию повышения эффективности гранзима В в качестве индуктора апоптоза.

t,

Рис. 4. Динамика активации каспазы-8, распада комплекса DFF, активации CAD и фрагментации хроматина при полном отсутствии прокаспаз 3 и 7. Зелёная кривая соответствует каспазе-8, серая — DFF, жёлтая — CAD, бирюзовая — ДНК.

Влияние величины показателя устойчивости на резистентность злокачественной клетки к действию малой концентрации инициаторной каспазы-8. Вследствие того, что инициаторная прокаспаза-8 обладает способностью к спонтанной автоактивации, в качестве внутриклеточного индуктора апоптоза далее рассматривается одна молекула активной каспазы-8 (при отсутствии гранзима В). Так как внутриклеточная концентрация, формально соответствующая одной молекуле каспазы-8, в шестьсот раз ниже пороговой концентрации каспазы-8 для устойчивой раковой клетки (8 = 1,5) с усреднёнными параметрами, то не вызывает удивления, что в этом случае одна молекула каспазы-8 не производит никаких видимых изменений. В случае же потери клеткой устойчивости, независимо от приведшим к этой потере причинам, картина радикально меняется. Например, в

отсутствие обратимого ингибирования каспаз 3 и 7 (9 = -0,2), хроматин фрагментируется на 99 % через 18 ч после начала активации (см. рис. 5) . И это несмотря на то, что единственная молекула каспазы-8 через полчаса разрушается протеасомой. Как показывает расчёт, за это время молекула каспазы-8 успевает активировать около пятнадцати молекул прокаспазы-3. Этого количества достаточно для развития лавинообразного процесса взаимной активации каспаз 3 и 6, составляющих положительную обратную связь апоптотической системы (см. рис. б) . Каспаза-7 не достигает при этом заметного уровня.

t, ч

Рис. 5. Динамика распада комплекса DFF, активации нуклеазы CAD и фрагментации хроматина в отсутствие обратимого ингибирования каспаз 3 и 7 при индукции апоптоза молекулой каспазы-8. Серая кривая соответствует DFF, жёлтая — CAD, бирюзовая — ДНК.

t, ч

Рис. 6. Динамика активации исполнительных каспаз в отсутствие обратимого ингибирования каспаз 3 и 7 при индукции апоптоза молекулой каспазы-8. Каспазе-3 соответствует красная кривая, каспазе-6 — синяя, каспазе-7 — фиолетовая.

Другим способом понижения показателя устойчивости является увеличение начальных концентраций

протеолитически неактивных прокаспаз 3 и 6. Величина показателя устойчивости 9 = -0,2, соответствующая отсутствию обратимого ингибирования каспаз 3 и 7, достигается в случае семикратного профицита прокаспаз 3 и 7. На рисунке 7 приведены кривые, описывающие динамику активации апоптоза одной молекулой каспазы-8 при семикратном профиците прокаспаз 3 и 7. По сравнению со случаем отсутствия обратимого ингибирования каспаз 3 и 7 (см. рис. 5 и б) все кривые рисунка 1 имеют более чётко выраженную лаг-фазу. Максимальная концентрация нуклеазы CAD увеличилась при этом в семь раз, а максимальные концентрации каспаз 3 и 6 в двадцать-тридцать раз в абсолютных единицах, что заметно превосходит увеличение начального уровня соответствующих прокаспаз. Время же,

требуемое для фрагментации 99 % хроматина, практически не изменилось и составляет теперь 16 ч (см. рис. 7).

Ингибирование протеасомы также способствует понижению показателя устойчивости клетки за счёт уменьшения скоростей деградации прокаспаз 3 и 6. Величина показателя устойчивости 6 = -0,2 достигается в этом случае при восьмикратном понижения констант деградации. Рисунок 8 иллюстрирует динамику активации апоптоза молекулой каспазы-8 при восьмикратном увеличении времени жизни каспаз и нуклеазы CAD. Резким отличием от ранее рассмотренных случаев является то, что фрагментация 99 % хроматина достигается при этом на третьи сутки, а максимальные концентрации нуклеазы CAD, каспазы-3 и каспазы-6 достигаются ещё позже.

t, ч

Рис. 7. Динамика активации каспазы-3, каспазы-6, CAD, а также фрагментации хроматина в случае семикратного профицита прокаспаз 3 и 6 при индукции апоптоза молекулой каспазой-8. Красная кривая соответствует каспазе-3, синяя — каспазе-6, жёлтая — CAD, бирюзовая — ДНК.

t, ч

Рис. 8. Динамика активации каспазы-3, каспазы-6, CAD, а также фрагментации хроматина в случае восьмикратного увеличения времени жизни активных апоптотических протеинов при индукции апоптоза молекулой каспазы-8.

Красная кривая соответствует каспазе-3, синяя -каспазе-6, жёлтая — CAD, бирюзовая — ДНК.

Таким образом, в отсутствие устойчивости даже одна молекула каспазы-8 индуцируют апоптоз, причём не является принципиальным, каким способом достигнуто неустойчивое состояние. Отсюда, а также из того факта, что прокаспаза-8 обладает способностью к спонтанной автоактивации, следует, что ингибирование, казалось бы, не имеющей прямого отношения к апоптозу протеасомы индуцирует запрограммированную клеточную смерть. Этот вывод подтверждается многочисленными лабораторными экспериментами. Более того, некоторые ингибиторы протеасомы проходят или уже прошли клинические испытания в качестве противоопухолевых препаратов, несмотря на то, что механизм их терапевтического действия до сих пор оставался невыясненным. Всё это свидетельствует о ключевой роли устойчивости апоптотической системы в выживании злокачественных клеток.

ВЫВОДЫ

1. Пороговая внутриклеточная концентрация гранзима В составляет всего несколько молекул. Эти данные свидетельствуют о возможности использования гранзима В в качестве лечебного средства при терапии солидных опухолей.

2. Поскольку гранзим В не только активирует прокаспазы, но и непосредственно осуществляет ограниченный протеолиз апоптотических мишеней, чувствительность динамики апоптоза к дефицитам прокаспаз в случае апоптоза, индуцированного гранзимом В, существенно ниже по сравнению с той же характеристикой в случае апоптоза, индуцированного лигандами ФНО-а, FasL или TRAIL. Например, отсутствие одной из трёх прокаспаз практически не влияет на степень фрагментации хроматина — основного маркёра апоптоза.

3. Устойчивость фонового состояния системы апоптоза различных линий злокачественных клеток обеспечивается с существенным запасом.

4. Устойчивое состояние апоптотической системы способны нарушить как ингибиторы синтеза XIAP, так и ингибиторы протеасомы.

5. Механизм терапевтического действия таких противоопухолевых препаратов как бортезомиб, NPI-0052, карфилзомиб и ABG35156, проходящих или уже прошедших клинические испытания, связан с понижением показателя устойчивости апоптотической системы опухолевой клетки.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ, ОТРАЖАЮЩИХ ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ

Синцов A.B., Якобовский М.В., Кауфманн С.Г., Ханин М.А. Оптимизационная модель апоптоза: определение

кинетических констант // Мат. моделирование. - 2007. -Т. 19, № 3. - С. 59-73.*

Синцов A.B., Коваленко Е.И., Ханин М.А. Апоптоз, индуцированный гранзимом В // Биоорган, химия. - 2008. -Т. 34, № 6. - С. 725-733.*

Синцов A.B. Условия устойчивости фонового состояния системы апоптоза // Объед. науч. журн. - 2006. - № 21 (181) . - С. 74-76.

* Публикации в научных журналах, входящих в перечень ведущих

периодических изданий ВАК.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Синцов, Александр Владимирович

ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Гранзимы — протеазы, содержащиеся в гранулах цитотоксических лимфоцитов

1.2. Активация прокаспаз

1.3. Ингибиторы апоптоза

1.4. Разрушение апоптотических мишеней

2. МАТЕМАТИЧЕСКАЯ МОДЕЛЬ ДИНАМИКИ АКТИВАЦИИ

АПОПТОЗА ГРАНЗИМОМ В

2.1. Схема биохимических реакций апоптоза, индуцированного гранзимом В

2.2. Система уравнений, описывающих динамику активации апоптоза гранзимом В, и начальные условия

2.3. Начальные (фоновые) концентрации белков системы апоптоза

2.4. Кинетические константы биохимических реакций апоптоза

3. МАТЕМАТИЧЕСКАЯ МОДЕЛЬ ФОНОВОГО СОСТОЯНИЯ СИСТЕМЫ

АПОПТОЗА.

3.1. Система уравнений, описывающих устойчивость фонового состояния апоптотической системы

3.2. Условие устойчивости фонового состояния системы апоптоза

3.3. Показатель устойчивости

4. ИССЛЕДОВАНИЕ ДИНАМИКИ АПОПТОЗА, ИНДУЦИРОВАННОГО ГРАНЗИМОМ В И КАСПАЗОЙ

4.1. Влияние концентрации гранзима В на динамику апоптотической клеточной смерти

4.2. Влияние дефицита прокаспаз на динамику-активации апоптоза гранзимом В

4.3. Динамика ограниченного протеолиза некоторых апоптотических мишеней

4.4. Влияние концентрации ингибитора XIAP на динамику клеточной смерти

4.5. Влияние величины показателя устойчивости на резистентность злокачественной клетки к действию малой концентрации инициаторной каспазы

Введение Диссертация по биологии, на тему "Математическое моделирование динамики апоптоза, индуцированного гранзимом В, и исследование устойчивости фонового состояния системы апоптоза"

Термин апоптоз был предложен сравнительно недавно для обозначения процесса запрограммированной клеточной смерти [1] . Апоптоз сопровождается своеобразными морфологическими изменениями в клетке, которые существенно отличаются от картины, наблюдаемой при различных видах некроза. В последние годы явление апоптоза привлекает растущее внимание исследователей, что связано с возможностью использования индукции апоптоза в малигнизированных клетках как метода лечения онкологических заболеваний. В настоящее' время клиническое применение получили синтетические • и полусинтетические индукторы апоптоза, такие как этопозид, цисплатин, топотекан, бортезомиб, и др. Однако, в подавляющем большинстве случаев применение синтетических препаратов не приводит к полному уничтожению малигнизированных клеток. Кроме того, синтетические индукторы апоптоза . обладают лишь сравнительно небольшой селективностью в отношении опухолевых клеток, что приводит к тяжёлым побочным эффектам при их использовании в терапии онкологических заболеваний. В связи с этим,, большое теоретическое и практическое значение приобретают исследования естественных индукторов апоптоза.

В настоящее время в США проводятся клинические испытания эффективности системного введения естественного индуктора апоптоза — лиганда TRAIL, вызывающего гибель некоторых линий малигнизированных клеток. Эти испытания показали почти полную безопасность лиганда TRAIL. К сожалению, заметное число линий опухолевых клеток, имеющих большое клиническое значение, резистентно к индукции апоптоза этим белком. Существенного уменьшения размеров некоторых типов злокачественных опухолей удаётся достигнуть при применении TRAIL в сочетании с синтетическими препаратами, такими как иринотекан, карбоплатин, паклитаксель и др. [2]

Значительно более эффективным, чем TRAIL, естественным индуктором апоптоза является сериновая протеаза гранзим В,. содержащаяся в гранулах цитотоксических лимфоцитов. Уникальность гранзима В связана в первую очередь с его способностью непосредственно активировать прокаспазы, т.е. превращать эти неактивные внутриклеточные белки в активные протеазы широкого спектра действия, называемые каспазами. Весьма существенно, что гранзим В способен также самостоятельно осуществлять ограниченный t протеолиз ' большого числа " необходимых для жизнедеятельности клетки цитоплазматических и ядерных протеинов. Таким образом, гранзим В индуцирует апоптоз, преодолевая многие виды резистентности опухолевых клеток,, такие как низкая экспрессия рецепторов смерти (DR4 и DR5) , высокая экспрессия ловушек лигандов смерти (DcRl и DcR2) и др.

Анализ результатов биохимических исследований апоптоза, индуцированного гранзимом В, привёл к построению детальной схемы биохимических , реакций, принимающих участие в этом процессе. Итогом обобщения количественных экспериментальных данных явилось создание базы данных, в которую вошли: а) кинетические константы фементативных реакций; б) кинетические константы образования и распада белковых комплексов (в том числе — реакций ингибирования); в) константы скорости деградации белков и г) фоновые внутриклеточные концентрации некоторых белков системы апоптоза (прокаспаз, и ингибитора каспаз XIАР). С помощью этих данных была разработана математическая модель динамики активации апоптоза гранзимом В, представленная довольно сложной системой обыкновенных нелинейных дифференциальных уравнений первого порядка с известными параметрами.

Применение математического моделирования представляется весьма перспективным методом изучения динамики сложных биохимических систем, позволяющим исследовать особенности динамического поведения системы как целого. Целью работы является исследование методом математического моделирования динамики апоптоза, индуцированного гранзимом- В. Выполнение этой задачи оказалось тесно связанным с исследованием методом математического моделирования устойчивости фонового состояния системы апоптоза (т.е. состояния этой системы в отсутствие внешнего активирующего воздействия). Физиологическое значение устойчивости фонового состояния связано с необходимостью предотвращения неадекватной активации системы апоптоза в результате флуктуаций этой системы (например, флуктуаций концентраций апоптотических протеаз). Потеря устойчивости фонового состояния приводит к активации апоптотической системы с последующей гибелью клетки.

Результаты моделирования позволили установить особенности динамики активации каспаз и фрагментации хроматина при индукции апоптоза гранзимом В, найти условие, при выполнении которого обеспечивается устойчивость фонового состояния, а также создать теоретические основы применения ингибиторов синтеза XIAP и ингибиторов протеасомы в качестве индукторов апоптоза при лечении онкологических заболеваний. В частности, была получена оценка пороговой концентрации граызима В, выяснена роль отдельных каспаз, установлен механизм действия бортезомиба, NPI-0052, карфилзомиба и AEG3515 6 в качестве противоопухолевых препаратов, и др. Следует отметить, что некоторые из полученных результатов практически не могут быть получены без применения метода математического моделирования. .К таким результатам следует отнести в первую очередь выяснение механизмов резистентности злокачественной клетки к действию малой концентрации инициаторной каспазы-8.

Прикладное значение полученных результатов заключается, во-первых, в перспективах создания нового метода лечения солидных опухолей путём локального введения гранзима В и перфорина. В этом методе предотвращение повреждения нормальных клеток организма может быть достигнуто путём системного введения ингибитора гранзима В — PI9. Необходимость же ингибирования перфорина отсутствует, так как в сочетании с гранзимом В он может применяться в допороговых концентрациях, не приводящих к осмотическому лизису клеток. Во-вторых, полученные результаты позволяют наметить терапевтические стратегии, ведущие к нарушению условия устойчивости апоптотической системы опухолевых клеток. В частности, соединениями, понижающими показатель устойчивости, являются ингибиторы синтеза XIAP и ингибиторы протеасомы. Следует также отметить, что ингибитор протеасомы бортезомиб (Велкейд®) уже нашёл применение в клинической практике в качестве противоопухолевого препарата без чёткого понимания механизмов его терапевтического действия.

Первая глава диссертации посвящена анализу литературных данных, освещающих путь проникновения гранзима В в атакуемую лимфоцитом клетку и вызванные этим проникновением внутриклеточные биохимические реакции с участием апоптотических протеаз, ядерной нуклеазы CAD, их ингибиторов, а также некоторых митохондриальных белков.

Вторая глава посвящена описанию предложенной математической модели динамики апоптоза, индуцированного гранзимом В. В той же главе приведены численные значения всех используемых в модели кинетических констант и внутриклеточных концентраций, определённые биохимическими методами.

Третья глава посвящена математическому моделированию фонового состояния апоптотической системы с целью исследования устойчивости этой системы. Там же вводится понятие показателя устойчивости, являющегося количественной мерой асимптотической устойчивости фонового состояния системы апоптоза, и приводится оценка его величины для многих линий малигнизированных клеток. Величина показателя устойчивости имеет решающее значение для предварительной оценки эффективности терапии онкологических заболеваний некоторыми классами лекарственных средств.

В четвёртой главе изложены результаты исследования влияния многих параметров (концентрации индуктора, дефицитов прокаспаз, концентрации ингибитора XIAP и др.) на динамику апоптоза, индуцированного как гранзимом В, так и спонтанной автоактивацией прокаспазы-8 в отсутствие гранзима В.

Положения, выносимые на защиту

1. Методом математического моделирования установлена высокая эффективность гранзима В в качестве индуктора апоптоза: практически полная фрагментация хроматина достигается уже при проникновении в клетку всего нескольких молекул гранзима В.

2. Показано, что появление резистентных к индукции апоптоза гранзимом В клонов маловероятно, т.к. отсутствие любой из прокаспаз не приводит к блокированию активации апоптоза.

3. Установлено, что устойчивость фонового состояния апоптотической системы обеспечивается, в частности, необратимым ингибированием протеазной активности каспаз 3 и б.

4. Установлен механизм терапевтического действия таких противоопухолевых препаратов как бортезомиб, NPJ-0052, карфилзомиб, проходящих или уже прошедших клинические испытания, связанный с понижением показателя устойчивости апоптотической системы опухолевой клетки- Этот эффект обусловлен ингибированием протеасомы.

Работа проводилась в сотрудничестве с руководителем отдела исследований рака клиники Мэйо (Рочестер, Миннесота, США), профессором Скоттом Г. Кауфманном, который проводил биохимические исследования и, в частности, измерял концентрации прокаспаз в малигнизированных клетках. Выражаю глубокую благодарность научному руководителю проф., д.т.н., лауреату Ленинской премии М.А. Ханину и проф. С.Г. Кауфманну за плодотворные дискуссии и представление экспериментальных результатов до их публикации.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Синцов, Александр Владимирович

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

С целью исследования динамики активации апоптоза гранзимом В впервые была разработана математическая модель, представленная системой нелинейных обыкновенных дифференциальных уравнений первого порядка. Для исследования устойчивости фонового состояния системы апоптоза, т.е. состояния этой системы в отсутствие индукторов апоптоза, также была разработана соответствующая математическая модель, представляющая собой линеаризованный вариант первой модели. Далее, в рамках этих моделей была исследована динамика активации прокаспаз и фрагментации хроматина при индукции апоптоза гранзимом В и малой концентрацией каспазы-8, а также исследована устойчивость фонового состояния апоптотической системы. Полученные результаты позволяют сделать следующие выводы:

1. Поскольку гранзим В не только активирует прокаспазы, но и непосредственно осуществляет ограниченный протеолиз апоптотических мишеней, чувствительность динамики индуцированного этой протеазой апоптоза к дефицитам прокаспаз существенно ниже по сравнению с чувствительностью динамики апоптоза, индуцированного лигандами ФНО-а, FasL или TRAIL. Например, отсутствие одной из трёх прокаспаз практически не влияет на степень фрагментации хроматина — основного маркёра апоптоза.

2. Пороговая внутриклеточная концентрация гранзима В составляет всего несколько молекул. Эти данные свидетельствуют о возможности использования гранзима В в качестве лечебного средства при терапии солидных опухолей.

3. Убиквитин-лигазная активность ингибитора XIAP, приводящая к необратимому ингибированию исполнительных каспаз, играет не менее важную роль в обеспечении устойчивости апоптотической системы по сравнению с осуществляемым тем же белком прямым ингибированием исполнительных каспаз, носящим обратимый характер.

4. Устойчивое состояние апоптотической системы способны нарушить как ингибиторы синтеза XIAP, так и ингибиторы протеасомы. Заметим, что один из ингибиторов протеасомы, бортезомиб, был введён под торговым названием Велкейд® в клиническую практику в качестве противоопухолевого препарата, несмотря на то, что механизм его терапевтического действия оставался до сих пор невыясненным.

Таким образом, научно-практическое значение полученных результатов заключается в том, что они позволяют предсказать наличие противоопухолевых свойств у широкого класса соединений, таких как ингибиторы протеасомы и ингибиторы убиквитин-лигазной активности белков семейства IAP, до проведения экспериментальных проверок. Другой многообещающей перспективой является создание метода лечения солидных опухолей путём локального совместного введения гранзима В и перфорина в интерстициальное пространство опухоли. При этом локализация воздействия областью опухолевых клеток может быть достигнута посредством введения необратимого ингибитора гранзима В — PI9. С помощью разработанной математической модели динамики активации апоптоза гранзимом В могут быть получены ответы на многие вопросы, которые неизбежно возникнут как при дальнейших экспериментальных исследованиях, так и при медицинских применениях этой уникальной протеазы.

Апробация результатов работы состоялась на семинаре ЦТП ФХФ РАН.

Список публикаций, отражающих основное содержание диссертации

Синцов А. В., Якобовский М.В., Кауфманн С. Г., Ханин М.А. Оптимизационная модель апоптоза: определение кинетических констант // Мат. моделирование. - 2007. -Т. 19, № 3. - С. 59-73.* Синцов А.В., Коваленко Е.И., Ханин М.А. Апоптоз, индуцированный гранзимом В // Биоорган, химия. - 2008. - Т. 34, № б. - С. 725-733.*

Синцов А.В. Условия устойчивости фонового состояния системы апоптоза // Объед. науч. журн. - 2006. - № 21 (181). - С. 74-76. Публикации в научных журналах, входящих в перечень ведущих периодических изданий ВАК.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Синцов, Александр Владимирович, Москва

1. Kerr, J.F., Wyllie, А.Н. , Currie, A.R. Apoptosis: a basic biological phenomenon with wide-ranging implications in tissue kinetics // Br. J. Cancer. 1972. — Vol. 26. -P. 239-257.

2. Trambas, C.M., Griffiths, G.M. Delivering the kiss of death // Nature Immunol. 2003. - Vol. 4. - P. 399-403.

3. Russell, J.H., Ley, T.J. Lymphocyte-mediated cytotoxicity // Annu. Rev. Immunol. 2002. - Vol. 20. - P. 323-370.

4. Grossman, W.J., Verbsky, J.W., Tollefsen, B.L., Kemper, C. , Atkinson, J.P., Ley, T.J. Differential expression of granzymes A and В in human cytotoxic lymphocyte subsets and T regulatory cells // Blood. 2004. - Vol. 104. - P. 28402848.

5. Qin, H.Y., Mukherjee, R., Lee-Chan, E., Еыеп, C., Bleackley, R.C., Singh, B. A novel mechanism of regulatory T cell-mediated down-regulation of autoimmunity // Int. Immunol. 2006. - Vol. 18. - P. 1001-1015.

6. Sayers, T.J., Brooks, A.D., Ward, J.M., Hoshino, Т., Bere, W.E., Wiegand, G.W. , Kelly, J.M. , Smyth, M.J. The restricted expression of granzyme M in human lymphocytes // J. Immunol. 2001. - Vol. 166. - P. 765-771.

7. Sedelies, K.A. , Sayers, T.J., Edwards, K.M. , Chen, W., Pellicci, D.G., Godfrey, D.I., Trapani, J.A. Discordant regulation of granzyme H and granzyme В expression in human lymphocytes // J. Biol. Chem. 2004. - Vol. 279. - P. 2658126587.

8. Pham, C.T.N., Ley, T.J. Dipeptidyl peptidase I is required for the processing and activation of granzymes A and В in vivo // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1999. - Vol. 96. -P. 8627-8632.

9. Brown, G.R., McGuire, M.J. Thiele, D.L. Dipeptidyl peptidase I is enriched in granules of in vitro- and in vivo-activated cytotoxic T lymphocytes // J. Immunol. 1993. — Vol. 150. - P. 4733-4742.

10. Galvin, J.P., Spaeny-Dekking, E.H.A., Wang, В., Seth, P., Hack, C.E., Froelich, C.J. Apoptosis induced by granzyme B-glycosaminoglycan complexes: implications for granule-mediated apoptosis in vivo. J. Immunol. 1999. — Vol. 162. -P. 5345-5350.

11. Shi, L. , Mai, S. , Israels, S. , Browne, K.A., Trapani, J.A., Greenberg, А.Я. Granzyme В (GraB) autonomously crosses the cell membrane and perforin initiates apoptosis and GraB nuclear localization // J. Exp. Med. 1997. — Vol. 185. -P. 855-866.

12. Pinkoski, M.J. , Hobman, M. , Heibein, J.A., Tomaselli, K., Li, F., Seth, P., Froelich, C.J., Bleackley, R.C. Entry and trafficking of granzyme В in target cells during granzyme B-perforin-mediated apoptosis // Blood. 1998. — Vol. 92. -P. 1044-1054.

13. Dupuis, M. , Schaerer, E. , Krause, K.H. , Tschopp, J. The calcium-binding protein calreticulin is a major constituent of lytic granules in cytolytic T lymphocytes // J. Exp. Med. 1993. - Vol. 177. - P. 1-7.

14. Fraser, S.A., Karimi, R., Michalak, M. , Hudig, D. Perforin lytic activity is controlled by calreticulin // J. Immunol. -2000. Vol. 164. - P. 4150-4155.

15. Veugelers, K., Motyka, В., Frantz, C., Shostak, I., Sawchuk, Т., Bleackley, R.C. The granzyme B-serglycin complex from cytotoxic granules requires dynamin for endocytosis // Blood. 2004. - Vol. 103 - P. 3845-3853.

16. Shi, L. , Keefe, D. , Durand, E. , Feng, H. , Zhang, D., Lieberman, J. Granzyme В binds to target cells mostly by charge and must be added at the same time as perforin to trigger apoptosis // J. Immunol. 2005. — Vol. 174. -P. 5456-5461.

17. Beresford, P.J., Xia, Z., Greenberg, A.H., Lieberman, J. Granzyme A loading induces rapid cytolysis and a novel form of DNA damage independently of caspase activation // Immunity. 1999. - Vol. 10. - P. 585-594.

18. MacDonald, G. , Shi, L. , Vande Velde, C., Lieberman, J., Greenberg, A.H. Mitochondria-dependent and -independent regulation of granzyme B-induced apoptosis // J. Exp. Med. -1999. Vol. 189- - P. 131-144.

19. Kellyr J.M. , Waterhouse, N.J., Cretney, E. , Browne, K.A. , Ellis, S., Trapani, J.A., Smyth, M.J. Granzyme M mediates a novel form of perforin-dependent cell death // J. Biol. Chem. 2004. - Vol. 279. - P. 22236-22242.

20. Lieberman, J. The ABCs of granule-mediated cytotoxicity: new weapons in the arsenal of Nature // Rev. Immunol. 2003. — Vol. 3. - P. 361-370.

21. Earnshow, W.C., Martins, L.M., Kaufmann, S.H. Mammalian caspases: structure, activation, substrates and functions during apoptosis. // Annu. Rev. Biochem. 1999. — Vol. 68. -P. 383-424.

22. Donepudi, M., MacSweeney, A., Briand. C., Grutter, M.G. Insights into the regulatory mechanism for caspase-8 activation // Mol. Cell. 2003. - Vol. 11. - P. 543-549.

23. Launay, S.r Hermine, O. , Fontenay, M. , Kroemer, G. , Solaryr E. r Garrido, C. Vital functions for lethal caspases // Oncogene. 2005. - Vol. 24. - P. 5137-5148.

24. Bossi, G., Griffiths, G.M. Degranulation plays an essential part in regulating cell surface expression of Fas ligand in T cells and natural killer cells // Nature Med. 1999. — Vol. 5. -.P. 90-96.

25. Martinon, F., Tschopp, J. Inflammatory caspases: linking an intracellular innate immune system to autoinflammatory diseases // Cell. 2004. - Vol. 117. - P. 561-574.

26. Andrade, F., Roy, S., Nicholson, D., Thornberry, N., Rosen, A., Casciola-Rosen, L. Granzyme В directly and efficiently cleaves several downstream caspase substrates: implications for CTL-induced apoptosis // Immunity. 1998. — Vol. 8. -P. 451-460.

27. Stennicke, H.R., Salvesen, G.S. Caspases controlling intracellular signals by protease zymogen activation // Biochim. Biophys. Acta. - 2000. - Vol. 1477. - P. 299-306.

28. Allsopp, Т.Е., McLuckie, J., Kerr, L.E., Macleod, M. , Sharkey, J., Kelly, J.S. Caspase 6 activity initiates caspase 3 activation in cerebellar granule cell apoptosis // Cell Death Differ. 2000. - Vol. 7. - P. 984 - 993.

29. Mancini, M., Machamer, C.E., Roy, S. Nicholson, D.W., Thornberry, N.A., Casciola-Rosen, L.A., Rosen, A. Caspase-2 is localized at the Golgi complex and cleaves golgin-160 during apoptosis // J. Cell Biol. 2000. - Vol. 149. — P. 603-612.

30. Zhivotovsky, В., Orrenius, S. Caspase-2 function in response to DNA damage // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2005. — Vol. 331. - P. 859-867.

31. Bossy-Wetzel, E., Green, D.R. Caspases induce cytochrome с release from mitochondria by activating cytosolic factors // J. Biol. Chem. 1999. - Vol. 274. - P. 17484-17490.

32. Guo, Y. , Srinivasula, S.M., Druilhe, A., Fernandes-Alnemri, Т., Alnemri, E.S. Caspase-2 induces apoptosis by releasing proapoptotic proteins from mitochondria // J. Biol. Chem. 2002. — Vol. 277.1. P. 13430-13437.

33. Milhas, D. , Cuvillier, O., Therville, N., Clave, P., Thomsen, M., Levade, Т., Benoist, H., Segui, B. Caspase-10 triggers Bid cleavage and caspase cascade activation in FasL-induced apoptosis // J. Biol. Chem. 2005. — Vol. 280. -P. 19836-19842.

34. Willis, S.N., Chen, L. , Dewson, G., Wei, A., Naik, E., Fletcher, J.I., Adams, J.M. , Huang, D.C. Proapoptotic Bak is sequestered by Mcl-1 and Bcl-xL, but not Bcl-2, until displaced by ВНЗ-only proteins // Genes Dev. 2005. — Vol. 19. - P. 1294-1305.

35. Certo, M. , Del Gaizo Moore, V. , Nishino, M. , Wei, G. , Korsmeyer, S., Armstrong, S.A., Letai, A. Mitochondria primed by death signals determine cellular addiction to antiapoptotic BCL-2 family members.// Cancer Cell 2006. — Vol. 9. - P. 351-365.

36. Hill, M.M., Adrain, C. , Martin, S.J. Portrait of a killer: the mitochondrial apoptosome emerges from the shadows // Mol. Interv. 2003. - Vol. 3. - P. 19-26.

37. Vucic, D. , Stennicke, H.R., Pisabarro, M.T., Salvesen, G.S. Dixit, V.M. ML-IAP, a novel inhibitor of apoptosis that is preferentially expressed in human melanomas // Curr. Biol. -2000. Vol. 10. - P. 1359-1366.

38. Kasof, G.M., Gomes, B.C. Livin, a novel inhibitor of apoptosis protein family member // J. Biol. Chem. 2001. — Vol. 276. - P. 3238-3246.

39. Riedl, S.J., Renatus, M. , Schwarzenbacher, R. r Zhou, Q., Sun, C. , Fesik, S.W., Liddington, R.C., Salvesen, G.S. Structural basis for the inhibition of caspase-3 by XIAP // Cell. 2001. - Vol. 104. - P. 791-800.

40. Shin, S. , Sung, B.J., Cho, Y.S., Kim, H.J., Ha, N.C., Hwang, J.I., Chung, C.W., Jung, Y.K., Oh, B.H. An anti-apoptotic protein human survivin is a direct inhibitor of caspase-3 and -7 // Biochemistry. 2001. — Vol. 40. -P. 1117-1123.

41. Shin, H. , Renatus, M., Eckelman, В.P., Nunes, V.A., Sampaio, C.A., Salvesen, G.S. The BIR domain of IAP-like protein 2 is conformationally unstable: implications for caspase inhibition 11 Biochem. J. 2005. — Vol. 385. - P. 110.

42. Davoodi, J., Lin, L., Kelly, J., Liston, P., MacKenzie, A.E. Neuronal apoptosis-inhibitory protein does not interact with Smac and requires ATP to bind caspase-9 // J. Biol. Chem. -2004. Vol. 279. - P. 40622-40628.

43. Roy, N. , Deveraux, Q.L., Takahashi, R., Salvesen, G.S., Reed, J.C. The c-IAP-1 and c-IAP-2 proteins are direct inhibitors of specific caspases // EMBO J. 1997. — Vol. 16.- P. 6914-6925.

44. Eckelman, B.P., Salvesen, G.S. The human anti-apoptotic proteins cIAPl and cIAP2 bind but do not inhibit caspases // J. Biol. Chem. 2006. - Vol. 281. - P. 3254-3260.

45. Nandi, D., Tahiliani, P., Kumar, A., Chandu, D. The ubiquitin-proteasome system // J. Biosci. 2006. — Vol. 31.- P. 137-155.

46. Yang, Q.H., Church-Hajduk, R., Ren, <J. , Newton, M.L. , Du, C. Omi/HtrA2 catalytic cleavage of inhibitor of apoptosis (IAP) irreversibly inactivates IAPs and facilitates caspase activity in apoptosis // Genes Dev. 2003. — Vol. 17. -P. 1487-96.

47. Yang, Y., Fang, S., Jensen, J.P., Weissman, A.M., Ashwell, J.D. Ubiquitin protein ligase activity of IAPs and their degradation in proteasomes in response to apoptotic stimuli // Science. 2000. - Vol. 288. - P. 874-877.

48. Bartke, Т., Pohl, C. , Pyrowolakis, G. , Jentsch, S. Dual role of BRUCE as an antiapoptotic IAP and a chimeric E2/E3 ubiquitin ligase // Mol. Cell. 2004. - Vol. 14. - P. 801811.

49. Huang, Y., Rich, R.L., Myszka, D.G., Wu, H. Requirement of both the second and third BIR domains for the relief of X-linked inhibitor of apoptosis protein (XIAP)-mediated caspase inhibition by Smac // J. Biol. Chem. 2003. - Vol. 278. -P. 49517-49522.

50. MacFarlane, M., Merrison, W., Bratton, S.B., Cohen, G.M. Proteasome-mediated degradation of Smac during apoptosis: XIAP promotes Smac ubiquitination in vitro // J. Biol. Chem. 2002. - Vol. 277. - P. 36611-36616.

51. Colell, A., Garcia-Ruiz, C., Mari, M., Fernandez-Checa, J.C. Mitochondrial permeability transition induced by reactive oxygen species is independent of cholesterol-regulated membrane fluidity // FEBS Lett. 2004. - Vol. 560. - P. 6368.

52. Mcllroy, D., Sakahira, H., Talanian, R.V. , Nagata, S. Involvement of caspase 3-activated DNase in internucleosomal DNA cleavage induced by diverse apoptotic stimuli // Oncogene. 1999. - Vol. 18. - P. 4401-4408.

53. Wyllie, A.H. Glucocorticoid-induced thymocyte apoptosis is associated with endogenous endonuclease activation // Nature.- 1980. Vol. 284. - P. 555-556.

54. Casciola-Rosen, L. , Andrade, F. , Ulanet, D. , Wong, W.B., Rosen, A. Cleavage by granzyme В is strongly predictive of autoantigen status: implications for initiation of autoimmunity // J. Exp. Med. 1999. - Vol. 190. - P. 815826.

55. Gervaisr F.G., Thornberry, N.A., Ruffolo, S.C., Nicholson, D.W., Roy, S. Caspases cleave focal adhesion kinase during apoptosis to generate a FRNK-like polypeptide // J. Biol. Chem. 1998. - Vol. 273. - P. 17102-17108.

56. Fadeel, B. Plasma membrane alterations during apoptosis: role in corpse clearance // Antioxid. Redox Signal. 2004. — Vol. 6. - P. 269-275.

57. Fussenegger, M. , Bailey, J.E. , Varner J. A mathematical model of caspase function in apoptosis // Nat. Biotechnol. 2000.- Vol. 18. P. 768 - 774.

58. Benteler M., Lavrik, I., Ulrich, M. , Stosserr S., Heermann, D.W. , Kalthoff, H. , Krammer, P.H., Eils, R. Mathematical modeling reveals threshold mechanism in CD95-induced apoptosis // J. Cell Biol. 2004. - Vol. 166. - P. 839-851.

59. Eissing, Т., Conzelmann, H., Gilles, E.D., Allgower, F.r Bullinger r E., Scheurich, P. Bistability analyses of acaspase activation model for receptor-induced apoptosis // J. Biol. Chem. 2004. - Vol. 279. - P. 36892-36897.

60. Bagci, E.Z., Vodovotz, Y., Billiar, T.R., Ermentrout, G.B. , Bahar, I. Bistability in apoptosis: roles of bax, bcl-2, and mitochondrial permeability transition pores // Biophys. J. -2006. Vol. 90. - P. 1546-1559.

61. Albeck, J.G., Burke, J.M. , Aldridge, B.B., Zhang, M., Lauffenburger, D.A., Sorger, P.fT. Quantitative analysis of pathways controlling extrinsic apoptosis in single cells // Mol. Cell. 2008. - Vol. 30. - P. 11-25.

62. Albeck, J.G., Burke, J.M., Spencer, S.L., Lauffenburger, D.A., Sorger, P.K. Modeling a snap-action, variable-delay switch controlling extrinsic cell death // PLoS Biol. 2008.- Vol. 6. P. 2831-2852.

63. Han, L. , Zhao, Y. , Jia, X. Mathematical modeling identified c-FLIP as an apoptotic switch in death receptor induced apoptosis // Apoptosis. 2008. - Vol. 13. - P. 1198-1204.

64. Harrington, H.A., Ho, K.L., Ghosh, S., Tung, K.C. Construction and analysis of a modular model of caspase activation in apoptosis // Theor. Biol. Med. Model. 2008. — Vol. 5. - P. 26.

65. Pace, V., Bellizzi, D., Giordano, F. , Panno, M.L., De Benedictis, G. Experimental testing of a mathematical model relevant to the extrinsic pathway of apoptosis // Cell Stress Chaperones. 2010. - Vol. 15. - P. 13-23.

66. Golovchenko, E.N., Hanin, L.G., Kaufmann, S.H., Tyurin, K.V. , Khanin, M.A. Dynamics of granzyme B-induced apoptosis: mathematical modeling // Math. Biosci. 2008. — Vol. 212. — P. 54-68.

67. Scaffidi, C., Fulda, S., Srinivasan, A., Friesen, C., Tomaselli, K.J., Debatin, K.M. , Krammer, P.H., Peter, M.E. Two CD95 (APO-1 / Fas) signaling pathways // EMBO J. 1998.- Vol. 17. P. 1675-1687.

68. Kontnyr H.U., Hammerle, K. , Klein, R. , Shayan, P., Mackall, C.L., Niemeyer, C.M. Sensitivity of Ewing's sarcoma to TRAIL-induced apoptosis // Cell Death Differ. 2001. — Vol. 8. - P. 506-514.

69. Wang, J., Chun, H.J., Wong, W., Spencer, D.M., Lenardo, M.J. Caspase-10 is an initiator caspase in death receptor signaling // Proc. Natl Acad. Sci. USA. 2001. — Vol. 98. -P. 13884-13888.

70. Tozser, J., Bagossi, P., Zahuczky, G., Specht, S.I., Majerova, E. , Copeland, D. Effect of caspase cleavage-site phosphorylation on proteolysis // Biochem. J. 2003. — Vol. 372. - P. 137-143.

71. Chen, Z., Naito, M., Hori, SMashima, Т., Yamori, Т., Tsuruo, T. A human IAP-family gene, apollon, expressed in human brain cancer cells // Biochem. Biophys. Res. Commun. -1999. Vol. 264. - P. 847-854.

72. Tamm, I., Kornblau, S.M., Segall, H., Krajewski, S., Welsh, K., Kitada, S. , Scudiero, D.A., Tudor, G., Qui, Y.H.,

73. Monks, A., Andreef£, M., Reed., J.С. Expression and prognostic significance of IAP-family genes in human cancers and myeloid leukemias // Clin.' Cancer Res. 2000. - Vol. 6. - P. 17961803.

74. Yang, L., Cao, Z., Yan, H., Wood, W.C. Coexistence of high levels of apoptotic signaling and inhibitor of apoptosis proteins in human tumor cells: implication for cancer specific therapy // Cancer Res. 2003. — Vol. 63. - P. 68156824.

75. Zhang, L., Zhu, H., Teraishi, F. , Davis, J.J., Guo, W., Fan, Z., Fang, B. Accelerated degradation of caspase-8 protein correlates with TRAIL resistance in a DLD1 human colon cancer cell line // Neoplasia 2005. - Vol. 7. - P. 594-602.

76. Tanr M., Gallegos, J.R.f< Gu, Q. , Huang, Y., Li, J., Jin, Y., Lu, H., Sun Y. SAG/ROC-SCF beta-TrCP E3 ubiquitin ligase promotes pro-caspase-3 degradation as a mechanism of apoptosis protection // Neoplasia 2006. — Vol. 8. - P. 1042-1054.

77. Thorpe, J.A., Christian, P.A., Schwarze, S.R. Proteasome inhibition blocks caspase-8 degradation and sensitizes prostate cancer cells to death receptor-mediated apoptosis // Prostate 2008. - Vol. 68. - P. 200-209.

78. Liu, Q.L., Kishi, H., Ohtsuka, K., Muraguchi, A. Heat shock protein 70 binds caspase-activated DNase and enhances its activity in TCR-stimulated T cells // Blood. 2003. - Vol. 102. - P. 1788-1796.

79. Rehm, M. , Huber, H.J., Dussmann, H. , Prehn, J.H.M. Systems analysis of effector caspase activation and its control by X-linked inhibitor of apoptosis protein // EMBO J. 2006. — Vol. 25. - P. 4338-4349.

80. Ulanet, D.B., Flavahan, N.A. , Casciola-Rosen, L. , Rosen, A. Selective cleavage of nucleolar autoantigen B23 by granzyme В in differentiated vascular smooth muscle cells // Arthritis & Rheumatism. 2004. — Vol. 50. - P. 233-241.

81. Liu, D., Xu, L., Yang, F., Li, D., Gong, F., Xu, T. Rapid biogenesis and sensitization of secretory lysosomes in NK cells mediated by target-cell recognition // Proc. Natl Acad. Sci. USA 2005. - Vol. 102 - P. 123-127.

82. Liu, X., Zou, H., Slaughter, C., Wang, X. DFF, a heterodimeric protein that functions downstream of caspase-3 to trigger DNA fragmentation during apoptosis // Cell. -1997. Vol. 89. - P. 175-184.

83. Liu, X., Zou, H., Widlak, P., Garrard, W., Wang, X. Activation of the apoptotic endonuclease DFF40 (caspase-activated DNase or nuclease). Oligomerization and direct interaction with histone HI // J. Biol. Chem. 1999. — Vol. 274. - P. 13836-13840.

84. MacLellan, S.R., Forsberg C.W. Properties of the major nonspecific endonuclease from the strict anaerobe Fibrobactersuccinogenes and evidence for disulfide bond formation in vivo // Microbiol. 2001. - Vol. 147. - P. 315-323.

85. Boatright, K.M., Renatus, M., Scott, F.L., Sperandio, S., Shin, H., Pedersen, I.M., Ricci, J.E., Edris, W.A. , Sutherlin, D.P., Green, D.R., Salvesen, G.S. A unified model for apical caspase activation // Mol. Cell. 2003. - Vol. 11. - P. 529-541.

86. Wu, W. H., Wang, F.5., Chang M'.S. Dynamic sensitivity analysis of biological systems // BMC Bioinformatics. 2008. - Vol. 9 (Suppl. 12). - S17.

87. Sasaki, H. , Sheng, Y. , Kotsuji, F., Tsang, B.K. Down-regulation of X-linked inhibitor of apoptosis protein induces apoptosis " in chemoresistant human ovarian cancer cells // Cancer Res. 2000. - Vol. 60. - P. 5659-5666.

88. Amantana, A., London, C.A., Iversen, P.L., Devi, G.R. X-linked inhibitor of apoptosis protein inhibition induces apoptosis and enhances chemotherapy sensitivity in human prostate cancer cells // Mol. Cancer Ther. 2004. - Vol. 3 -P. 699-707.

89. Shaw, T.J., Lacasse, E.C., Durkin J. P., Vanderhyden B.C. Downregulation of XIAP expression in ovarian cancer cells induces cell death in vitro and in vivo // Int. J. Cancer. — 2008. Vol. 122. - P. 1430-1434.

90. Denault, J.В., Bekes, M., Scott, F.L., Sexton, K.M.B., Bogyo, M., Salvesen, G.S. Engineered hybrid dimers: tracking the activation pathway of caspase-7 // Mol. Cell. 2006. - Vol. 23. - P. 523-533.

91. Matta, H., Chaudhary, P.M. The proteasome inhibitor bortezomib (PS-341) inhibits growth and induces apoptosis in primary effusion lymphoma cells // Cancer Biol. Ther. 2005. - Vol. 4. - P. 77-82.

92. Lu, G., Punj, V., Chaudhary, P.M. Proteasome inhibitor Bortezomib induces cell cycle arrest and apoptosis in cell lines derived from Ewing's sarcoma family of tumors and synergizes with TRAIL // Cancer Biol. Ther. 2008. - Vol. -7. - P. 603-608.

93. Yang-, H., Zonder, J.A., Dovl, Q.P. Clinical development of novel proteasome inhibitors for cancer treatment // Expert Opin. Investig. Drugs. 2009. - Vol. 18. - P. 957-971.