Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Распределение стабилизирующих взаимодействий в пространственных структурах белков и их комплексов

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Распределение стабилизирующих взаимодействий в пространственных структурах белков и их комплексов"

МОСКОВСКИЙ ФИЗИКО-ТЕХНИЧЕСКИЙ ИНСТИТУТ ФАКУЛЬТЕТ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКОЙ БИОЛОГИИ КАФЕДРА МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОФИЗИКИ

г^.

На правах рукописи

БЕРЕЗОВСКИЙ ИГОРЬ НАУМОВИЧ

РАСПРЕДЕЛЕНИЕ СТАБИЛИЗИРУЮЩИХ ВЗАИМОДЕЙСТВИЙ В ПРОСТРАНСТВЕННЫХ СТРУКТУРАХ БЕЛКОВ И ИХ КОМПЛЕКСОВ

03.00.02- Биофизика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

Москва 1997

Работа выполнена в Лаборатории компьютерного и структурного анализа биополимеров Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН.

НАУЧНЫЕ РУКОВОДИТЕЛИ:

Доктор физико-математических наук В.Г. Туманян

Кандидат физико-математических наук Н.Г. Ёснпова

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

Доктор физико-математических наук В.И. Иванов

Доктор физико-математических наук В.И. Лобышев

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ:

Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН

Защита состоится 21 октября 1997 года в 1430 часов на заседании Диссертационного совета К 063.91.10 при Московском физико-техническом институте (141700, г. Долгопрудный Московской обл., Институтский пер., 9, Московский Физико-Технический Институт).

С диссертацией можно ознакомиться в Диссертационном совете К 063.91.10 при Московском Физико-Техническом Институте.

Автореферат разослан сентября 1997 года.

Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат физико-математических наук

В.Б. Кирссв

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Введение. Актуальность проблемы.

Более пятидесяти лег проблема структурной организации глобулы белка является предметом активного натиска ученых из различных областей естествознания. Тем не менее до сих пор проблема складывания белка по последовательности остается одной из самых интригующих загадок молекулярной биологии. Сложности понимания процессов структурооб-разоваяил связаны в первую очередь с тем обстоятельством, что белок как макроскопическая система формируется в воде и при участии воды как элемента невалентпого ансамбля структуры глобулы. Это предопределило неудачу многих попыток построения белка по последовательности и, прежде всего, с использованием эмпирических потенциалов. Другая линия исследований структуры белка связана с иерархическим подходом: от первичной структуры ко вторичной и далее - третичной структуре. Этот подход особенно стимулировало открытие нового промежуточного состояпия белков - расплавленной глобулы, в которой вторичная структура мало отличается от таковой в нагивком белке, а трепгшая структура нарушена. Неожиданным результатом термодинамического анализа белков оказалось некооперативное по температуре, но кооперативное по воздействию химических денатурирующих факторов разрушение расплавленной глобулы, т.е. стало очевидным существование еще одного типа компактного состояния белка, переход из которого носит характер фазового по параметру объема.

Эти результата привели к попыткам установить минимальную структурную единицу бежа, которая одновременно является и иерархической единицей самосборки его третичной структуры. Многочисленные исследования показали, что элементарные устойчивые части пространственной структуры белка пе совпадают ни с отдельными участками вторичных структур, пи с домепами, т.е. участками повышенной электронной плотности, определяемыми рентгенографически. Оказалось, что чаще всего ими являются участки супервторичных структур, стабилизированных поверхностными водородными связями или ионными парами. В то же время, структурные домены, выделяемые из данных рснтгеноструктурного анализа, не всегда совпадают с размерами независимо и кооперативно плавящихся областей по данным микрокалориметрии. Это сделало проблему выделения энергетически независимых областей в глобулярных белках одной из ключевых задач в современных подходах к решению проблемы самосборки белков и усилило поэтому интерес к развитию новых, адекватных подходов к оценке потенциальных энергетически независимых областей в белковых макромолекулах.

Цели и задачи исследования.

Цель настоящей работы состояла в создании единого метода выделения энергоемких участков в глобулах белков и их комплексов и последующем анализе с его применением Банка пространственных структур белков. В конкретные задачи работы входило: 1) выбор приближения для оценки энергии взаимодействий в различных участках пространственных структур белков, 2) выбор системы потенциалов для расчета распределения энергии нева-лентпых взаимодействий на отдельных участках молекулы белка, 3) разработка универсального компьютерного метода оценки распределения энергии невалентных взаимодействий в макромолекулах белков и их комплексов, 4) разработка способа графического представления распределения энергии невалентных взаимодействий на разных уровнях иерархии белковых структур и их комплексов, 5) выделение энергетически значимых участков пространственных структур глобул белков на материале Банка негомологичных структур белков, 6) анализ доменной структуры семейств с одинаковым типом пространственной структуры, 7) установление роли доменной структуры в поддержании термостабильности белков.

Научная новизна работы.

Впервые разработан объективный компьютерный метод оценки распределения невалентных взаимодействий по пространству трехмерных структур глобулярных белков. Метод позволяет выделять домены, обнаруживаемые из данных ренттеноструктурного анализа по распределению электронной плотности, а также указывать уровень энергетической иерархии, на котором эти домены могут быть выделены. Метод впервые даст возможность устанавливать конкретные взаимодействия, ответственные за распределение доменов, модулей и элементарных энергоемких участков. Обоснован выбор ван-дер-ваальсова приближения для решения задачи о выделении доменов в глобулярных белках. Разработан графический способ проектирования трехмерных распределений энергии на двумерную диаграмму, позволяющую выявлять иерархию распределения энергий ван-дер-ваальсовых взаимодействий по отношению к последовательности аминокислот и устанавливать, таким образом, роль электростатики во взаимодействии границ энергоемких участков.

На основании развитого метода впервые проанализирован Банк пространственных структур белков с целью получения распределения энергии в пространстве белковых макромолекул, выделены уровни энергетической иерархии в пространственных структурах негомологичных белков. Показано, что новым методом с большой точностью выделяются домены (участки с повышенной электронной плотностью). Помимо этого метод позволяет устанавливать потенциальные энергетические домены - участки, независимые друг от друга в термодинамическом отношении, и указывать условия, в которых такая потенциальная неза-

висимость могла бы проявиться. Показано, что распределение энергии ван-дер-ваальсовых взаимодействий в похожих по пространственной структуре белках гомологично и может быть использовано как дополнительный критерий выравнивания последовательностей.

Практическое значение работы

Разработанный метод и полученный с его помощью Банк доменных структур, включающий их иерархически организованные энергетические характеристики, важпы для развития методов конструирования белков с задахшой теплоустойчивостью и параметрами взаимодействия в любой из частей пространства глобул. С помощью разработанных подходов можно проводить компьютерное конструирование химерных белков на основе энергоемких участков различных глобул, используя их как неизменпые единицы. Метод позволяет также интерпретировать результаты термодинамического анализа белков в терминах энергии взаимодействия участков глобул. Поэтому он может оказаться полезным как для белковой инженерии, так и для компьютерного дизайна в медицинских целях. Разработаппый метод, включая его графические приложения, может быть применен для анализа последовательностей в белках, а созданный комплекс программ использован в качестве базового для структурно-функционального анализа иерархической блочной организации последовательностей символов в белках и их соответствия энергоемким участкам пространственных структур.

Апробация

Результаты диссертации докладывались на Международной конференции по химической термодинамике ("17-th Conference IUPAC on Chemical Thermodynamics"), Осака, Япония, 25-30 августа 1996 года, на рабочем совещании по математическому анализу биологических последовательностей ("Mathematical Analysis of Biological Sequences"), Руан, Франция, 27-29 августа 1997 года, а также были представлен!,i на конференции по биоинформатике ("The 24lh Aharon Katzir-Katchalsky Conference "Bioinformatics-Structure"). Иерусалим, Израиль, 17-21 ноября 1996г.

Публикации

По материалам работы опубликовано шесть печатных работ.

Структура и объем работы

Диссертация изложена на 105 страницах и включает 30 рисунков и 7 таблиц. Список литературы содержит 95 наименований. Диссертация состоит из введения, четырех глав, включая литературный обзор, заключения и выводов.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

Во введении обсиована актуальность темы диссертации, определены цели и задачи исследования, его научная новизна и практическая ценность.

В первой главе приводится подробный анализ литературы, касающейся проблемы доменной структуры белков, ее связи с проблемами самосборки третичных структур белков и данными спектральных и термодинамических методов. Делается вывод о недостаточности существующих экспериментальных данных и последующего их геометрического анализа для понимания природы доменного строения белков как основы кооперативных свойств макромолекул. Продемонстрирована необходимость введения идеи об иерархии доменов в пространственных структурах белков для объяснения всей совокупности структурных н энергетических свойств так называемых олигодоменных белков. При этом возникает проблема выделения элементарных энергетических единиц как основы для построения различных иерархических систем более высокого уровня организации.

Во второй главе изложен новый метод нахождения структурных и энергетических доменов в глобулярных белках, развитый на основе оценок распределения энергии невалентных взаимодействий в пространстве трехмерных структур макромолекул белков.

Основанием для развития нового метода послужили следующие обстоятельства:

1 .Хотя анализ рентгеноструктурных данных и показывает, что распределение участков различной электронной плотности позволяет вывести доменный принцип строения глобулярных белков, установленное при калориметрических исследованиях белков существование в макромолекулах участков кооперативного поглощения тепла, которые только в ряде случаев совпадают со структурными доменами, и, более того, факта, что одна и та же глобула плавятся различными наборами кооперативных участков, приводит к необходимости введения понятия "энергетических доменов" - областей пространственных структур белка, плавящихся кооперативно и независимо друг от друга.

2.Наличие переменных энергетических домепов в большинстве мультидоменных глобулярных белков и сложное распределение электронной плотности даже в тех белках, которые на первый взгляд казались одноядерными, позволило некоторым исследователям предложить концепцию доменного складывания белков. Однако последний принцип требует выполнения определенных условий, а именно: (1) иерархической организации энергосодержания различных участков пространственной структуры; (2) возможности объединения этих участков последовательным иерархическим способом, то есть по принципу уменьшения энергосодержания от низшего иерархического уровня к высшему. Выяснение этого вопроса

потребовало нового метода для анализа энергетического строения пространственной структуры глобулы белка.

В основе нового метода был положен анализ распределения невалентных взаимодействий по пространству макромолекулы бежа. Так как среди различных типов невалентпых взаимодействий только ван-дер-ваальсовы взаимодействия имеют место для всех пар атомов конденсированной среды, естественно начать анализ иерархического строения энергосодержания белка, аппроксимируя взаимодействие любой пары атомов ван-дер-ваальсовым потенциалом. При этом те атомы, которые взаимодействуют по типу водородной связи и будут сближены на расстояния, как правило, меньшие вап-дер-ваальсового радиуса, дадут меньший по абсолютной величине вклад в энергию макромолекулы, чем если бы он рассчитывался по потенциалу водородной связи. Если распределение по энергиям в пространстве глобулы белка, в делом рассчитанное по вап-дер-ваальсовому потенциалу, позволит достоверно выделять участки с различным эпергосодержанием н в том числе видеть те, которые определяются по данным других методов, то ван-дер-ваальсова модель доменной структуры белка сможет считаться обоснованной.

Следует отметить также две существенные особенности дисперсионпых взаимодействий. Как известно, они обусловлены взаимодействием флуктуирующих дипольиых моментов, и характерные частоты этих флуктуации (в случае, когда рассматриваются взаимодействия частей белка друг с другом) соответствуют частотам ультрафиолетового излучения. Поэтому, в отличие от постоянных электрических полей, которые экранируются водой с противоиопами и подобными взаимодействиями, ван-дер-ваальсовы взаимодействия практически не экранируются и действуют по принципу "каждый с каждым". Кроме того, знак взаимодействия всегда один (притяжение) и по порядку величины не сильно меняется для различных молекулярных групп (это является следствием того, что локальная диэлектрическая проницаемость, соответствующая различным аминокислотам, не сильпо варьирует).

С учетом вышесказанного можно оцепить полную дисперсиошгую энергию, прихода

дящуюся на домен как Е ~ , где N • число всевозможных пар атомов в домене. Но

N следовательно, Е не убывает с увеличением размера домепа, несмотря на рост

расстояний между атомами в парах, и Е ~ п1. То есть ван-дер-ваальсова энергия также выражается через плотность среды. В тех местах, где плотность выше и регистрируется домен, там оказывается выше и ван-дер-ваальсова энергия.

Могут ли другие взаимодействия служить индикаторами доменов? В принципе все они участвуют в формировании структуры, и в этом смысле появление доменов зависит от

них. Но в качестве индикаторов доменов они годятся довольно плохо. Кулоновские силы обычно экранированы, если заряды расположены на поверхности и контактируют с водой. Внутри белка ионных пар мало. Что касается гидрофобных взаимодействий и водородных связей, то их характеристики трудно однозначно связать с плотностью среды, что сделало бы их в качестве индикаторов доменов весьма ненадежными.

Распределение ван-дер-ваальсовых взаимодействий в пространстве глобулы моделировали на основании потенциала Леннарда-Джонса 6-12, учитывающего типы атомов введением в него соответствующих каждому атому коэффициентов с помощью стандартной параметризации Шераги. Это особенно важно для определения изменения типов и количества контактов при сравнении белков, в которых имеются замены полярных аминокислот на неполярные, т.е. атомы, образующие водородную связь или ионную пару в одном белке, образуют вая-дер-ваальсов контакт - в другом. Контакт между атомами считали существующим, и его энергию рассчитывали, если расстояние между соответствующими атомами попадало в

о

интервал 2.5-5.0 А.

Процедура выделения энергетически значимых областей и доменов в белке с аминокислотной последовательностью длины N включает следующие этапы:

1. Задается величина перепада энергий ван-дер-ваальсовых взаимодействий в глобуле (в процентах от минимального значения энергии взаимодействий между любыми частями бежа) - будем называть ее в дальнейшем барьером, - которая допускает выделение взаимодействующих частей глобулы как энергетически независимых участков - назовем их сегментами. На разных иерархических уровнях задается разная величина барьера, исходя из разных величин перепадов энергий, описанных выше. На каждом уровне иерархии определяются: внутренняя энергия выделяемых сегментов -еп, суммарная энергия внешних взаимодействий каждого сегмента с остальными -

^Ге,, и все энергии взаимодействий между каждой парой сегментов ед у«

где К -число сегментов)

2. Строится матрица размера (КхК) для самого низкого потенциального барьера (1 -5% от полной энергии), где К - число выделенных сегментов. Элемент еи матрицы отвечает внутреннему энергосодержанию сегмента, элемент е - взаимодействию

между сегментами i и). Данный уровень барьера позволяет выделить сегменты, подавляющая часть внешних взаимодействий которых приходится на не соседний по первичной структуре сегмент. Таким образом определяются возможные составляю-

щие комплексных участков пространственной структуры, и может производиться уточнение границ этих участков.

3. Определяются границы самостоятельных сегментов для больших барьеров, начиная с максимального.

4. Будем считать потенциальным доменом тот сегмент, у которого с„ > иц ; лк>бой

¡*>

потенциальный домен с еи £ будем считать независимым в энергетическом отношении доменом.

5. Любая пара потенциальных энергетических доменов может быть принята как независимая дополнительно к критерию в пункте 4, если у каждого из пары потенциальных доменов, взаимодействие которых рассматривается, окажется сл > .• Лк>-

1*'

бые два потенциальных домена У и к могут быть объединены в один независимый только в том случае, если ел > и еь> еа одновременно. Два потенциальных домена будут объединены в один независимый также и в том случае, если более ., т.е. более 70% внешней энергии одного из рассматриваемых доменов связано с взаимодействием со вторым потенциальпым доменом. В случае если выделено два потенциальных домена, у каждого из которых е„ > <?,,. они будут считаться самостоятельными доменами.

6. Любой выделенный сегмент, у которого с„ < 1,5^ е,. , объединяется с тем сегментом

или потенциальпым доменом, с которым имеет максимальную энергию впешнего взаимодействия.

7. Далее проводится графически процедура, позволяющая на основе нового автоматического метода анализировать распределение энергии взаимодействий в пространственных структурах белков любой степени сложности: то есть с большим числом доменов, а также с комплексными доменами, состоящими из не соседних по цепи участков последовательностей аминокислот. Новый графический метод основан па проекции трехмерного распределения потециальной энергии в пространстве белковых глобул на последовательность

Рис.1. Распределение энергии парных взаимодействий в третичной структуре белка 1аог

ноиор остатка

Рис.2. Распределение энергии парных взаимодействий в пространственной структуре белка 110

.350 -

номер остатка

аминокислот а представлении этой проекции в виде специального графика по следующим правилам: каждой точке 1 (номеру аминокислоты) на графике взаимодействий ставится в соответствие энергия взаимодействия участка белка, содержащего остатки с 1-го по ый, с остальной частью последовательности (остатки с (1+1)-го до К-го). При этом легко обнаруживаются области максимумов потенциальной энергии, отделяющие энергоемкие части структур друг от друга (рисунки 1-7, нижние кривые) - будем считать эту кривую графическим представлением первого иерархического уровня взаимодействий в глобуле. Если исключить величину потенциальной энергии, соответствующую взаимодействиям между ами-

8

Рис.3. Распределение энергии парных взаимодействий в пространстве третичной структуры белка 1аЬк

Рис.4. Распределение энергии парных взаимодействий в пространстве третичной структуры белка 1 иЬ г

20 т-

3

с

-120 -

номер остатка

нокислотами, расположенными на участках, отделенных барьерами потенциальной энергии заданного значения, мы получим в каждой части графика распределение энергий взаимодействий внутри соответствующих частей глобулы (рис. 1-7, кривые, лежащие выше нижней кривой, соответствующей первому иерархическому уровню). В результате такой процедуры выявляется неоднородность распределения энергии внутри уже выделенных участков. Так, белки 1ао2 и 1Ш, изображенные на рис.1 и рис.2, сразу разбиваются на два невзаимодействующих участка каждый (1-335, 337-552 и 1-343, 345-691 соответственно). С

Рис.5. Распределение энергии ваи-дер-ваальсовых взаимодействий в глобуле белка Ика

п

-160

номер остатка

Рис.6. Распределение энергии ван-дер-ваальсовых взаимодействий в глобуле белка 1ЬЬЬ

помощью следующих процедур итерации можно повести дальнейшее выделение независимых в энергетическом отношении участков следующих уровней иерархии (табл.1). Таким образом с помощью разработанного нами графического метода становится возможным установление иерархии распределения энергии по пространству глобулярных белков. Графики, соответствующие разным уровням энергетической иерархии в данном белке, помещаются па один рисунок. Данная процедура одновременно с учетом энергий взаимодействий внутри сегментов и между ними позволяет демонстрировать корректность объединения соседних

Рис.7. Распределение энергии парных взаимодействий в пространственной структуре белка 1егт

номер остатка

сегментов в крупные домены и обнаруживать сегменты, принадлежащие комплексным доме-пам (рис.3, белок 1аЪк).

Мы провели расчет распределения энергий водородных связей, включая потенциальные ионные пары. Показано, что одни лишь водородные связи или ионные пары пе могут позволить установить доменную структуру глобул и дают искаженное представление об иерархии взаимодействий в белках. С другой стороны, именно заряд-зарядовые и заряд-дипольные взаимодействия, могут определять кооперативные свойства на границах доменов.

В третьей главе приводятся результаты анализа доменных структур белков из Банка пространственных структур. Проведен сравнительный анализ выделяемых с помощью нашего алгоритма энергетически зпачимых участков макромолекулы белка со структурными доменами, определенными по алгоритмам Бартона и Штернберга, и по данным рентгенострук-турного анализа . Результирующий пабор данных для 50-ти белков приведен в табл.1, а также продемонстрирован па цитированных выше рис. 1-7. Как легко видеть из приведенных табличных и графических данных, не существует практически ни одного примера из числа разобранных, где не были бы выделены домены, соответствующие полученным из рентгенографических данных с точностью до одной - нескольких амипокислот. Однако часто эти структурные домены выявляются на разных уровнях энергетической иерархии. Таким образом, полученный результат лишний раз подчеркивает необходимость разделения понятий

структурных и энергетических доменов, а также введения понятия об уровнях энергетической иерархии.

Из приведенных на рис.1 -7 графиков видно, что существуют несколько принципиально разных типов иерархических структур энергии белковых глобул. В некоторых случаях уже при высоких величинах энергетического барьера выделяются самостоятельные домены (например, домен 135-211 (1аЬк), 5-49 (1<1Ъг)) и сохраняются как целое до низших уровней, в некоторых - весь белок состоит из сильно разделенных между собой частей (Ниа, 11й). Явным примером энергетической иерархии являются домены 337-552(1аог) и 124-240 (1сШг) , первый из которых разделим в дальнейшем на две части, а второй характеризуется многоступенчатой иерархической структурой. Разработанный метод позволяет разделить пространство глобулы на участки высокого энергосодержания. Однако даже в тех случаях, когда они соответствуют структурным доменам, выделяемым методом реытгсноструктурного анализа, по данным энергетического расчета, они могут взаимодействовать друг с другом с энергиями, позволяющими по разработанным нами критериям, объединить их в энергетические домены. Так, в белке 1ЬЪЬ выделяющиеся на втором энергетическом уровне сегменты сильно взаимодействуют друг с другом, что позволяет сделать вывод о том ,что белок представляет собой единый энергетический домен (рис.6).

Таблица!. Доменная структура белков по данным различных методов

PDB код белка Критерии Разбиение белка на энергоемкие участки различных уровней иерархии Экспериментальные данные (X-ray) и данные геометрического анализа

2aai А (267) 0.3-0.2Е0 0.15Е0 O.lEo 0.05Е0 (I) 1-117(11) 119-267. (I) 1-117, 177-267(11) 119-175 (I) 1-117,177-208,210-267(11) 119-175 (I) 1-78,80-117,119-175, 177-199, 201-208,210-267 X: (1)1-117 (П) 118-210 (111)211-267 В:однодоменный белок

laoz А (552) О.ЗЕо 0.25-0.15Ео O.lEo 0.05Е0 (1) 1-335(11)337-552 (I) 1-127 (II) 129-335 (П1) 337-552 (1) 1-95,97-127(11) 129-335 (Ш) 337-419, 421-552 (I)1-33, 35-95,97-127. (II)129-203, 205-224 (1П) 226-269, 271-335 (IV)337-419,421-552 X: (I) 1-326, 530-552 (II) 327-529 S: (I) 1-123 (II)130-317 (III)337-524

lapk (118) О.ЗЕо 0.25-0.1Е0 0.05Ео однодоменный белок <Т) 143-235 (II) 237-260 (I) 143-201,203-235 (II) 237-260 X: однодоменный белок В:однодоменный белок

larb 0.3-0.15Ео (!) 1-131 (II) 133-263 S: (I) 1-139,229-263

(263) ОЛЕо 0.05Е0 (I) 1-100, 102-131 (II) 133-163, 165-263 (I) 1-100, 102-131, 133-163 (II) 165-209,211-263 (II) 140-228

1а(п А (372) 0.3-0.2Е,, 0.15Е0 О.1Е0 0.05Е„ однодоменный белок (1)1-68 01) 70-136(111) 138-372 (I) 1-68,70-95 (II)97-136, 138-183, 185-372 (I)1-68,70-95, (II) 97-136,138-183,260-372 (Ш) 185-258 X: (I) 1-144, 338-372 (11)145-337 В: (1) 1-137,358-372 (II)138-185,272-357 (П1)186-271 в: (I) 1-32, 70-144, 338-372 (П) 33-69 (III)145-180,270-337 (ГУ)181-269

1ауЬ А (318) 0.3-0.25Ео 0.2Е« 0.15Ео 0.1Е0 0.05Ео однодоменный белок (1)3-71 (П) 73-320 (I) 3-71 (П) 73-158 (Ш) 160-320 (I) 3-71 (П) 73-144, 146-158 (Ш) 160-249 (IV) 251-320 (1)3-44,46-71,73-84 (П) 86-144,146-158 (Ш) 160-224, 226-249 (IV) 251-295,297-320 X: (I) 3-87, 246-320 (П) 88-245 в: (I) 3-87 (II) 88-167 (П1) 168-246 (IV) 247-320

1аИ (363) О.ЗЕо 0.25Ео 0.2Е0 0.15-0.1Ео 0.05Ео однодоменный белок (I) 1-265 (П) 267-363 (I) 1-103,267-363 (П) 105-184 (П1) 186-265 (01-103,267-363 (II) 105-147,149-184,186-265 (1) 1-74,76-103,267-363 (П) 105-124,126-147,149-184, 186-228,230-265 Х:однодоменный белок В: (I) 191-307, 342-363 (II) 138-185,272-357 (III) 186-271

1ЬаЬ В (146) 0.3-0.15Ео 0.1Е0 0.05Ео (I) 1-78 (П) 80-146 ' (I) 1-78,80-97,99-146 (I) 1-67, 69-78, 80-83,85-97, 99-146 Х:однодоменный белок 8:одно доменный белок

1Ъаг В (138) 0.3-0.25Е0 0.2-0.1Ео 0.05Ео однодоменный белок (1) 1-43,45-84,86-138 (I) 1-43,45-62,64-84, 86-138 Х:одподоменный белок ¿¡однодоменный белок

2ЬЬк II (373) 0.3Ео 0.25-0.2Ео 0.15Е0 0.05Е„ однодоменный белок ® 1-118, 254-373 (11) 120-252 (I) 1-118 (II) 120-170,172-205 (III) 254-373,207-252 (I) 1-63,324-333, 335-373 (II)65-94,96-118 (П1) 120-170, 172-205 (IV) 207-252,254-261, 263-322 X:однодоменный белок В: (1ЬЬк А) (I) 120-240 (II) 205-253 (III) 29-68 (IV) 69-119 (V) 254-320 (VI) 321-373

2ЬЬк Ь (116) 0.3-0.2Е0 0.15Е0 0.1Е0 0.05Ео однодоменный белок (1)7-105,107-131 (I) 7-24,2647,49-74,76-105, 107-131 (I) 7-24,2647,49-74,76-77, Х:однодоменный белок В: (1ЬЬкВ)(1) 16-131

79-91,93-105, 107-131

1ауЬ (214) О.З-О.1Е0 0.05Е0 однодомениый белок 0) 1-66, 68-214 Бсоднадоменный белок

1Ьаа (243) 0.3-0.25Ео 0.2-0.15Е0 О.1Е0 0.05Е0 однодомениый белок (I) 1-86 (II) 88-243 (I) 1-86, 88-174,176-243 (I) 1-86, 88-159,161-174,176-234, 236-243 8:однодоменный белок

1ЬЬЬ А! (131) 0.3-0.15Е0 0.1Ео О.ОэЕо (I) 1-70 (II) 72-131 (I) 1-70, 72-78, 80-131 (I) 1-32, 34-61, 63-70, 72-78, 80-104,106-120,122-131 Х:однодоменный белок В:однодоменный белок 8:однодоменный белок

1Ыс (491) 0.3-0.25Ев 0Л-0.15Ео 0.1Ео 0.05Е0 однодомениый белок (I) 5-175 (П) 177-321; 323-495 однодомениый белок (I) 5-86,88-112,137-175, 296-321, 323-365,367-383, 385-495 (II) 114-135, 177-214,216-294 8:однодоменный белок

1Ь\у4 (125) 0.3-0.2Е0 0.15-0.1Ео 0.05Ео однодоменный белок (!) 1-46 (П) 48-125 (I) 1-19,48-57,59-121 (II) 21-36, 38-46, 123-125 5>:однодомс1шьш белок

1сЬх (307) 03-0.1Е0 0.05Е„ (I) 1-139, 141-188 (Н) 190-307 (I) 1-50,52-139 (II) 141-188,190-307 Х:однодоменпый белок В: (I) 1-127,174-307 (II) 128-173

1Ы(1 (177) 0.3-0.15Е0 0.1 Ео О.О5Е0 (I) 1-103 (II) 105-177 (I) 1-103 (II) 105-124, 126-177 (I) 1-78, 80-103 (II) 105-124,126-177 X: (I) 1-106 (11)107-177 в: а) 1-105 (II) 106-177

1соЪ А (151) 0.3-0.1Ео 0.05Е0 однодоменный белок © 1-59,61-116,118-151 Х:однодоменный белок в:однодоменный белок В: а) 43-48,114-146 (11)1-42, 84-113, 147-151

1со1 А (197) 0.3-0.1Е0 0.05Е0 однодоменный белок . ® 1-46,48-51 (II) 53-105, 107-201 Х:одподоменный белок В:одподоменный белок

1<Шг (236) О.ЗЕо О.25-ОЛ5Е0 0.1Ео 0.05Е0 (1)5-49, 51-122 (П) 124-240 (I) 5-49, 51-122 124-177 (П) 179-240 (I) 5-49 (1П) 179-200 (II) 51-73,75-122,124-177,202-240 (I) 5-49 (III) 179-200 (II)51-73,75-122,124-154, 156-177,202-240 в.'однодомеиный белок

ыл (186) 0.3-0.15Е0 0.1Е0 0.05Е„ однодомениый белок (1) 1-150, 152-186 (I) 1-72,74-126, 128-150, 152-186 Х:однодоменный белок В: (1)1-5, 38-116 (11)6-37,117-186

1<1п (271) ОЗЕ0 0.25-0.2Е0 0.15Е0 однодоменный белок (1)1-58,60-271 X: (I) 1-100, 235-271 01) 101-234

0.1Ео 0.05Е0 (I) 1-58,60-99 (II) 101-163,165-271 (I) 1-58,60-99,215-271 (II)101-163,165-213 (I) 1-37,60-99,215-271 (П) 39-58 (III) 101-163, 165-188,190-213 Я: (1) 1-103,236-264 (11) 104-235,265-271

1еаГ (243) 0.3-0.2Е0 О.15Е0 0.1Ео 0.05Е, однодомеппый белок (I) 395-583,585-637 © 395-556, 558-583,585-637 (Г) 395-498, 500-556,558-583, 585-637 Бюднодоменный белок

1еса (136) 0.3-0.25Е0 0.2-0.15Ео О.1Е0 0.05Ео однодоменный белок (I) 1-75 (II) 77-136 (Г) 1-62,64-75,77-90,92-136 (I) 1-17, 64-75, 77-90, 92-99,101-136 (II) 19-62 Х:одподоменный белок Вюдподоменный белок

1С23П (298) 03-ОЛ5Ео 0.15Е0 0.1 Ео 0.05Е0 (I) 1-132 (П) 134-298 (I) 1-77, 77-107, 109-132 (II) 134-197,199-298 (I) 1-62,64-77, 79-107,109-132 (П) 134-197, 199-298 (I)1-23,64-77 (II) 25-62, 79-107,109-132,184-197 (Ш) 134-141, 143-182 (IV) 199-230,232-251,253-298 X: ® Ы35 (П) 136-298 в: (I) 1-134 (II) 135-298 В: (1)1-142,147-199 (П) 143-170, 200-298

1Ы А (207) 0.3-0.1Ео 0.05Е0 (1)238-337(11)339-444 (I) 238-264,266-286, 288-337 (II)339-413,415-444 X: (I) 238-340 (II) 341-444 Б: (1)238-341 (II) 342-443

Шг (296) 0.3-0.15Ео 0.1Ео 0.05Ев (I) 19-158(11) 160-314 (I) 19-158 (П) 160-197,199-314 (I) 19-93, 95-115,117-158 (II) 160-179,181-197,199-257, 259-271,273-314 X: Я) 19-153 (II) 154-314 В: (I) 19-161 (II) 162-314

1йа1 (581) О.ЗЕо О.25-О.1Е0 0.05Е0 однодоменный белок (Г) 2-247,249-583 ■ (I)3-107,109-168,170-247 (II)249-285,287-583 X: (1)3-108,225-327, 514-583 01) 109-225 (Щ) 328-513 В: (I) 67-98,176-210, 323-517 (11)3-66,99-137, 211-322,518-583

(186) 0.3-0.2Ео 0.15-0.1Ео 0.05Е® однодоменный белок (1)1-52,54-117(11)119-186 (I) 1-52,54-65,67-98 (II) 100-117, 119-136,138-186 X: (Г) 1-30, 81 -186 (11)31-80 В: (I) 1-32, 93-186 (II) 33-92

А (119) 0.3-0.1Ео О.О5Е0 однодоменный белок (1)5-94,96-123 Х:однодоменный белок В:однодоменный белок

1я>ь (823) 0.3-0.15Ев 0.1Ео (I) 19-480 (II) 482-841 (1) 19-128, 130-210,212-278 XI: (1)19-481, 817-841 (II) 482-816

0.05Eo (II) 280-480 (III) 482-709,711-841 (I) 19-113, 115-128, 130-189, 191-251, 253-278,319-344,346-371 (II) 280-317, 373-408,410-449,451-480 (III) 555-658 (IV) 482-553,660-709, 711-841 Х2: (I) 19-484, 814-831 (11)485-813 S: (I) 19-489 (II) 490-841 В: (I) 19-481,832-841 (П) 482-431

lgpr (158) 0.3-0-lEo 0.05Eo 30-10: однодомешшй белок 5: (1)4-37,39-82,84-161 Х:однодоменный белок В:однодоменный белок

lgss A (207) 0.3Eo 0.25-0.1Ee O.O5E0 однодомешшй белок (I) 1-74 (U) 76-207 (I) 1-32, 34-49, 51-60, 62-74, 76-207 X: (I) 1-75,182-207 (11)76-181 S: (1) 1-74(11) 81-207

lgst A (217) О.ЗЕо 0.25-0.15E0 0.1-0.05Eo однодоменный белок (I) 1-83 01) 85-217 (I) 1-30,85-217(11)32-84 X: (I) 1-81 (П) 90-217 В:однодомешгый белок

lhil A (211) 0.3 -0.1 Eo O.O5E0 (1) 1-106(11) 108-134, 136-192 (Ш) 194-211 СО 1-45,47-59, 61-106 (П) 108-134 (Ш) 136-154,156-192 (IV) 194-211 X: (I) 1-106 (11)107-211 S: (1)1-104(11) 110-211

lhsa A (276) 0.3-0.2Eo 0.15-0.1Eo 0.05E«, (I) 1-180 (II) 182-276 (I) 1-121 (Н) 123-180(111) 182-276 (I) 1-20, 80-121 (11)22-47,49-78 (III) 123-180 (IV) 182-203, 205-227, 229-257,259-276 X: (I) 1-175 (II) 182-276 В: (1)1-181 (II) 182-276

lilb (151) 0.3-0.15E0 0.1Ee O.O5E0 однодоменный белок (1)3-41,43-153 (I) 3-41, 104-121, 123-153 (II)43-64,66-102 Х:однодоменный белок В:однодоменный белок

life (131) 0.3-0.2Eo 0.15-0.1E0 0.05E0 однодоменный белок © 1-32,34-60,62-131 (1)1-32,34-60,62-75,77-131 Х:однодоменный белок вгоднодоменный белок В:однодомеш!ый белок

lipd (345) 03-0.15Eo 0.1E„ 0.05E0 однодоменный белок (I) 1-97, 99-155, 157-345 0) 1-38, 40-97,99-125,127-155, 157-345 Х:одаодоменный белок В: (I) 100-252 (II) 1-99,253-345

1153 (164) 0.3-0.15Eo O.lEo 0.05E0 (I) 1-70 (П) 72-164 © 1-70(11)72-112,114-164 (I) 1-37, 59-70, 136-141, 143-164 (II) 114-117, 119-134 (III) 39-57 (IV) 72-112 X: (1)1-69 (II) 70-164 В: (I) 1-13, 59-164 (П) 14-58

lle4 (139) 0.3-0.2Eo 0.15Eo O.lEo 0.05E0 однодоменный белок (I) 24-70 (II) 72-127, 129-162 (I) 24-48, 50-70 (II) 72-127, 129-162 (I)24-48,50-70 (II) 72-80, 82-101, 103-111, 13-127,129-162 Х:однодоменный белок 8:однодоменный белок

llfi (691) 0.3-0.15Eo O.lEo 0.05E0 (I) 1-343 (II) 345-691 (I) 1-343 (П) 345-503,505-691 (I) 1-39, 41-172,174-190,190-343 OI) 345-391, 434-503,528-630 X: (1)434-595 (IV) 91-251 (II) 345-433, 596-663 (III) 1-90,252-320

(III) 505-526 (IV) 393-432, 632-691 В: (I) 435-594 (IV) 92-250 (II) 340-434, 595-691 (III) 1-91,251-339

Ийа А (343) 0.3-0.2Е0 0.15Ео O.lEo 0.05Е0 однодомешшй белок (I) 1-118 (П) 120-343 (1)1-118(11)120-143, 145-343 (I) 1-118,120-143,252-302 (II) 145-162,164-199,201-250, 304-343 в: (1) 1-146,266-343 (II) 166-265

llld А (313) 0-ЗЕо 0.25-0.15Ео O.lEo 0.05Е» однодомешшй белок (I) 7-75 (П) 77-319 (1)7-75(11)77-147,149-319 (I) 1-75 (II) 77-117, 119-147 (111) 149-261,263-319 X: (I) 7-146 (П) 147-319 В: (1)7-77(11) 78-145 011) 146-319

Ире (144) 0.3-0.2Ео O.lSEo O.lEo 0.05Ео однодоменпый белок (I) 23-70 (П) 72-166 (I) 23-70 (II) 72-127,129-166 (I) 23-48,50-70 (II)72-101, 103-108,110-127,129-166 X: однодоменный белок В:однодоменный белок

lmba (146) 0-3-0.15Е0 O.lEo 0.05Ео однодоменный белок (I) 1-68, 101-146 (П) 70-99 (I) 1-68, 70-78 (П) 80-86, 88-99, 101-110,112-146 Х:однодоменный белок В:однодоменный белок

2ctc (307) 0.3-0.1Ео 0.05E« (1)1-139,141-190, 192-307 (I) 1-50, 52-139, 141-190,192-307 8:(1с1с) однодоменпый белок

2cwg А (170) О.ЗЕ0 0.25Ео 0.2 Ко O.lSEo © 2-41 (11)43-84 (Ш) 86-145 (TV) 147-171 (I) 2-22,24-41 (II) 43-56,58-84 (Ш) 86-127, 129-145 (IV) 147-171 (I) 2-22,24-41 (II) 43-56, 58-84 (III) 86-127, 129-145 (IV) 147-158,160-171 (I)2-9,11-22,24-29,31-41 (II)43-56,58-84 (III) 86-99, 101-108,110-127,129-145 (IV) 147-151,153-158, 160-171 X: (I) 2-41 (II) 42-88 (III) 89-128 (IV) 129-171 В: (I) 2-42 (П) 43-85 (1П) 86-130 (IV) 131-171

2mnr (357) О.З-О.15Е0 O.lEo 0.05Е0 однодоменный белок (1)3-119,121-191, 193-242,244-359 (I) 3-31, 33-77, 79-119, 322-359 (II) 121-129,244-298,300-320 (III)131-159, 161-191, 193-224, 226-242 X: (1)3-121, 344-359 (II) 133-338 В: (1птг) (I) 161-224 (II) 225-299 (III) 120-160,300-348 (IV) 3-119,349-359

В четвертой гладе описываются доменные структуры в семействах белков с гомологичными пространственными структурами. Учет распределения энергии взаимодействий в пространственных структурах белков позволяет также предложить простой принцип поиска мест вставок и делеций на участках с наименьшими значениями энергий взаимодействий атомов друг с другом.

Изучение гомологичных структур проявляет даваемую нашим методом возможность сопоставлять пространственные и первичные структуры, локализовывать вставки и делении.

По первоначальной кривой определяются позиции аминокислотных остатков, соответствующие минимальным энергиям взаимодействия между частями глобулы. Нулевая величина энергии взаимодействия означает несвязанность соседствующих участков друг с другом. На следующих иерархических уровнях, как мы уже упоминали выше, точки минимальных взаимодействий определяются на основе величины, названной пами "потенциальным барьером": если разница между величиной максимума энергии взаимодействий н величиной предшествующего ему минимума больше, чем выбранная нами величина, то мы полагаем, что этот максимум отвечает точке минимальных взаимодействий на определенном иерархическом уровне. Величина "барьера" определяется как часть величины глобального минимума на первоначальной кривой. Поскольку почти все сравниваемые структурные гомологи имеют, разные значения полной энергии и, соответственно, разные глобальные минимумы на первоначальной кривой, мы ввели коэффициент К для величины "барьера": В2=КВ1, K=Min2/Minl, где Mini, Min2 - величины глобальных мимнимумов на прсвоначальных кривых для белка1 и белка2; Bl, В2 - величины задаваемых "потенциальных барьеров" для бел-ка1 и белка2. Остатки, отвечающие выбранным минимальным величинам энергии взаимодействия, определяются как границы участков аминокислотной последовательности. Рассчитываются величины энергии взаимодействий для выделенных участков последовательности и энергия взаимодействий между ниш. Производится несколько итераций для различных величии "барьера". В данной работе мы рассматривали величины барьеров (B1J 30,25,20,15,10 и 5 процентов от величины минимума на первоначальной кривой для того и: сравниваемых белков, у которого был наиболее глубокий глобальный минимум (белок 1) Для сравниваемого с белком 1 белка2 вычисляются соответствующие величины барьеров Кроме того, так как мы обнаружили иерархию энергетических свойств, которая заключаете) в том, что существуют уровни энергии, отличающиеся друг от друга на величины энерпю взаимодействия между элементарными блоками (участками последовательностей), образую щими соответствующий уровень, аминокислотная последовательность может быть разделе на на части, которые отличаются по масштабу и размеру соответствующих им участков прс странствепной структуры белка. Расчеты, демонстрируемые в главе, проведены для разны величин барьеров, что позволяет проанализировать разные масштабы фрагментов, состав ляющих структуру.

Участки первичной структуры в соответствии с конкретным иерархическим уровне определяемых ими третичных структур представлены в табл.2 (для биназы, барназы, рибо-

Таблица2

Сравнспнс первичных и доменных структур гомологичных белков

Название белка и Критерии Выделяемые части первичной структу-

нормировка барьера ры

Рибонуклеаза А 0.15Е0 1-107,109-124

0.1Е0 1-47,49-107,109-124

0.05Е„ 1-40, 42-47,49-69,71-75, 77-107,109-124

Рибонуклеаза BS 0.2Е0 1-12,14-107,109-124

К=0.85 0.15Е„ 1-12,14-69,71-107,109-124

0.1Е, 1-12,14-69, 71-73, 75-107,109-124

0.05Е„ 1-12, 14-32,34-40,42-59,61-69,71-73, 75-81,83-107,109-124

Биназа 0.25-0.2Е, 1-52,54-110

К=0.9 0.15-0.1Е„ 1-20,22-52,54-110

0.05Е„ 1-20,22-32,34-52, 54-94, 96-102,104-110

Барназа 0.2-0.15Е, 1-53, 55-110

0.1Е, 1-20, 22-52, 54-110

0.05Ео 1-21,23-32,34-53, 55-83, 85-110

Рибонуклеаза Н 0.1 Е0 1-36,38-60,62-155

Escherichia coli 0.05Е„ 1-36,38-47,49-60,62-155

Рибонуклеаза Н

Thermus 0.15-0.1Е» 6-50,52-166

thermophiluse 0.05Е0 6-40,42-50, 52-125, 127-166

К=0.83

Рибонуклеаза MS 0.05Е„ 1-31,33-57, 59-88,90-105

Рибонуклеаза F1

К=0.78 0.1Ео 1-30,32-58,60-88,90-106

0.05Е0 1-9, 11-16, 18-24, 26-30,32-58, 60-72, 75-88,90-106

Рибонуклеаза Т1

К=0.83 0.1Е0 1-30,32-58,60-88,90-104

0.05Е„ 3-30,32-58,6-72,74-88,90-104

нуклеазы А, рибонуклеазы ВБ, а также рибонуклеаз Н, МБ, Р1, Т1). Из представленных данных мы можем заключить, что близкие структурные гомологи демонстрируют сходство участков первичной структуры на определенных иерархических уровнях. Мы видим как структурная гомология отражается на локализации границ участков первичной структуры (Табл. 2). Отличия между структурпыми гомологами также сказываются на характере разбиения первичной структуры на участки, что видно из приведенных в Табл. 2 данных для рибонуклеаз А и В8 и согласуется с данными по первичной структуре, по которым более половины замен сконцентрировало на участках 16-20, 28-40. Как видно из представленных в Табл. 2 результатов для биназы и барназы, выделяемые нами участки соответствуют кооперативным единицам, определяемым в микрокалориметрических экспериментах. Кривые энергетических функций, которые строятся в работе, можно, таким образом, использовать как дополнительный инструмент для выравнивания последовательностей, путем совмещения-сходных участков кривых и точек нулевых взаимодействий между ними. Анализ кривых, соответствующих распределению энергий взаимодействий в рибонуклеазах Н из Е.СоН и ТЪептв ШгторЫкке, приводит к необходимости для совмещения левых частей кривых сдвинуть второй график влево. Соответствующее такому сдвигу совмещение последовательностей приводит к совпадению 21 из 36 первых аминокислот, двум заменам Ьец->11е, одной замене: А1а->С1у, Тгр->Туг, аш! РЬе->Туг. Из этих же кривых легко определяются области 1-31(32) и 32(33)-58(57) для рибонуклеаз МБ ДТП, а также участок (90-еп<1) для рибонуклеаз МВ и Т1, которые могут быть выровнены на основе сходства соответствующих им участков кривой энергии взаимодействия.

Развитый анализ гомологичных структур позволил провести детальное исследование изменений энергетического состояния белковых макромолекул, происходящее вследствие белок-белковых взаимодействий. Показано, что, невзирая на небольшие изменения в пространственной структуре макромолекул, имеющие место при присоединении к пим ингибиторов и кофакторов, различия в кооперативных свойствах систем позволяют устанавливать различия между комплексами типа белок-белок и комплексами с низкомолекулярными ингибиторами и другими лигандами: в случае'макромолекулярных комплексов каждый из участников становится более компактным, что объясняет многочисленные термодинамические данные.

Заключение

Таким образом, в данной работе продемонстрировано, что в рамках ван-дер-ваальеовой модели взаимодействий атомов в глобулах белков можно найти способ аппроксимировать последовательность аминокислот такой системой энергетических характеристик, которые допускают непосредственное графическое сравнение пространственных структур глобулярных белков, выявление доменной структуры, нахождение одинаковых участков на различных уровнях иерархии пространственных структур, формулирование критериев для нахождения мест вставок и делений при выравнивании последовательностей аминокислот.

Выводы

1. Разработан компьютерный метод оценки распределения невалентных взаимодействий в пространстве третичных структур глобулярных белков.

2. Обоснована ван-дер-ваальсова модель для индикации доменов в макромолекулах белков. На ее основе предложен новый объективный метод вьаделения доменов структурного и энергетического типов.

3. Разработан графический метод представления энергии невалентных взаимодействий в пространстве глобулярных макромолекул в координатах энергия - последовательность аминокислот. Показано, что распределение ван-дер-ваальсовых взаимодействий достаточно точпо отражает распределение участков с различной электронной плотностью по пространству макромолекулы белка.

4. Разработан графический прием представления распределения энергии невалентных взаимодействий для макромолекул белков.

5. Определены вклады внутри- и междоменных невалентных взаимодействий в поддержание доменной структуры белков.

6. На основе предложенного метода установлены доменные структуры для существенной выборки белков из Банка данных.

7. Показано, что имеются различные иерархические типы доменных структур белков. Вскрыто отношение между различными форма:,::: дсменны* структур, иерархией распределения энергии в пространстве глобул белков и прогнозируемыми путями их самосборки.

Публикации

1. Березовский И.Н. Туманян В.Г. // Объективный метод выделения доменов глобулярных белков. // Биофизика, т.40, № б, 1171-1178, 1995.

2. Natalia Esipova, Igor Berezovsky, Boris Fedorov, Vladimir Tumanyan, Structural and electrostatic domains in globular proteins, 17-th Conference IUPAC on Chemical Thermodynamics, S7-27m06, August 25-30,1996, Osaka, Japan.

3. I. N. Berezovsky and V.G.Tumanyan // Protein domain structure by means of the non-covalent interactions in globule fl Abstracts of the 24th Aharon Katzir-Katchalsky Conference. Folding & Design, v.l suppl. S9, 1996.

4. Березовский И.Н., Есипова Н.Г., Туманян В.Г. // Выделение энергетически значимых областей глобулы и иерархия доменной структуры макромолекулы белка. // Биофизика, т.42, № 3, 567-576, 1997.

5. I.N. Berezovsky, N.G. Esipova, V.G. Tumanyan // Hierarchy regions of amino acid sequence in accordance -with their role in energetic properties of protein spatial structure. // Mathematical Analysis of Biological Sequences MABS 97 (Proceedings of the Workshop, p.25), August 27-29, 1997, Rouen, France.

6. Березовский И.Н., Есипова Н.Г., Туманян В.Г. // Распределение направленных взаимодействий в пространственных структурах глобулярных белков. // Биофизика, в печати.