Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Распределения дипольных моментов в пространственных структурах биополимеров и их связь с функционированием биологических макромолекул и их комплексов

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Распределения дипольных моментов в пространственных структурах биополимеров и их связь с функционированием биологических макромолекул и их комплексов"

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА ОРДЕНА ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИ И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им. М.В.ЛОМОНОСОВА

Физический факультет

На правах рукописи

ФЕДОРОВ БОРИС БОРИСОВИЧ

Распределения дипольных моментов в пространственных структурах биополимеров и их связь с функционированием биологических макромолекул и их комплексов

Специальность 03.00.02-Биофизика

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

Москва -1998

Работа выполнена в лаборатории компьютерного и структурного анализа биополимеров Института молекулярной биологии им. В.А.Энгельгардта РАН

НАУЧНЫЕ РУКОВОДИТЕЛИ:

кандидат физико-математических паук Н.Г. Есипова доктор биологических наук А.А. Макаров

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

доктор физико-математических наук, профессор ВЛЛобышев доктор физико-математических наук А.С.Заседателев

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ:

Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН (г. Пупшно)

Защита состоится 15 октября 1998 года в 15 часов 30 минут на заседании диссертационного совета К.053.05.77 при МГУ им. М.В.Ломоносова по адресу: 119899, Москва, Воробьевы горы, МГУ им. М.В Ломоносова, физический

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке физического факультета МГУ им. М.В.Ломоносова

Автореферат разослан 15 сентября 1998 года.

Ученый секретарь Диссертационного совета,

Кандидат физико-математических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

Исследования физико-химических свойств белковых макромолекул продолжают бьггь в центре внимания исследователей, работающих в самых разных областях: молекулярной биологии, биофизики, цитологии и других биологических дисциплин. Причина кроется прежде всего в том, что долгие годы исследований белков пока не привели к решению основного вопроса физики белка - проблемы построения белка по последовательности аминокислот. Более того, сейчас, более чем раньше, эта проблема кажется далекой от разрешения, так как стало очевидпым, что статистические подходы (основанные на принципах математической статистики и статистической физики) не могут быть использованы для принципиального решения этого вопроса. Таким образом, белковая инженерия, на бурное развитие которой рассчитывает современная фармакология, остается пока без теоретической основы.

Тем более важным представляется изучение физических характеристик белковых макромолекул, их связи со структурой и влиянием на них физических свойств индивидуальных аминокислот. Последнее время особенно активно развиваются исследования электростатических свойств белковых макромолекул, наибольший интерес среди которых вызывают расчеты распределения электростатического потенциала в трехмерной структуре макромолекул. Эти данные позволили предсказать рК ионизации большинства ионизующихся групп в белках, продемонстрировать, как распределение потенциалов и их градиентов может прояснить некоторые, до сих пор непонятные проявления физико-химических свойств и функциональной активности белков.

В расчетах электростатического потенциала по уравнению Пуассона -Больцмана или в любом другом приближении есть та сложность, что его величина несомненно зависит от параметров среды, упорядочение которой приводит к необходимости знания ее структурных параметров. Совсем уже трудно учесть возможные места посадок ионов, локализация которых всегда затруднена.

Вместе с тем, белки, являющиеся полиамфолитами, в целом ряде процессов выступают как постоянные диполи, т.е. играют роль асимметричного фактора, определяющего ориентацию белка или отдельных его участков в

пространстве клетки. Постоянные дипольные моменты белков могут играть важную роль процессах связывания кофакторов и субстратов в ферментативном катализе.

Очевидно, однако, что в реальных процессах в клетке среда играет важную, едва ли не определяющую роль. При этом ее основа - белок - всегда играет роль структурообразующего фактора, но он может играть роль и асимметрнзукяцего фактора не за счет внешних зарядов, возникающих при ионизации боковых радикалов, но за счет суммарного дипольного момента, возникающего как следствие парциального заряда атомов при общем нейтральном состоянии макромолекулы. Удивительно, но до сих пор не было проведено систематического исследования дипольных моментов белков в . нейтральном приближении. Вместе с тем именно при анализе роли электростатики в структурообразовании белков и их функционировании в первую очередь должны быть предприняты исследования распределения дипольных моментов в пространственных структурах глобулярных белков.

Распределение дипольных моментов связано также и с важнейшей особенностью динамики белковых глобул - существованием так называемой сегментарной подвижности в белках. Данный тип подвижности отражает наличие в макромолекуле энергетически сильно связанных участков. Дипольные моменты таких энергоемких сегментов могут играть важную роль в процессах структурообразования н функционирования мультидоменных белков.

Наконец, распределение дипольных моментов в третичной структуре глобулярных белков играет серьезную роль во взаимодействии глобулярных белков с водой. Вода - полярная молекула, ее взаимодействие с белком может приводить к нейтрализации некомпенсированных зарядов и, соответственно, уменьшению общего дипольного момента макромолекулы. Однако, организация гадратной оболочки с упорядоченными сетками воды может приводить к более сложным распределениям остаточных зарядов. Эта проблема важна для оценки роли воды в процессах белок - белковых и белок - нуклеиновых взаимодействиях.

Наконец, образование комплексов макромолекул - этот, едва ли не самый важный, процесс, сопутствующий функционированию большинства макромолекул, несомненно опирается на их дипольные свойства.

Перечисленные выше примеры роли асимметричных факторов в структуре и функционировании белков и их комплексов свидетельствуют о

серьезной актуальности проблемы анализа распределения дипольных моментов в третичной структуре белков именно в нейтральном приближении.

Цели и задачи исследования

Целью данного исследования было изучение распределения дипольных моментов в третичной структуре глобулярных макромолекул и их комплексов в нейтральном приближении. В качестве объектов предполагалось использовать все белки с надежно установленной трехмерной структурой из банка пространственных структур (РОВ).

Задачей исследования было:

1. Изучение зависимости суммарных дипольных моментов бежов от их молекулярного веса.

2. Анализ зависимости распределения дипольных моментов в белках от типа пространственной структуры. Поиск связи между распределением дипольных моментов и распределением аминокислотных остатков в структурах гомологичных белков.

3. Анализ влияния воды на дипольные моменты белков. Сравпепие с фрактальными размерами.

4. Установление связи между доменной структурой и распределением дипольных моментов.

5. Распределение дипольных моментов в белок - белковых и ДНК - белковых комплексах.

Научная новизна работы

Впервые создан исследовательский метод ( с комплексом программ для пользователей ) расчета распределения дипольных моментов ( в нейтральном приближении ) в пространственных структурах глобулярных белков. Метод включает обоснование использования нейтрального приближения для расчетов распределения дипольных моментов белков, в него входит обоснование иерархического способа нейтрализации зарядов на элементах структуры глобулярных белков, а также комплекс программ для расчетов и анализов распределения дипольпых моментов в третичных структурах глобулярных белков и их комплексов. Комплекс программ включает расчет карт

распределения дипольных моментов с их графическим представлением, в двумерном и трехмерном видах. Создан комплекс графических программ, включающий трехмерные изображения атомных структур белков с указанием распределения физико-химических характеристик отдельных участков белков, а также изображения направлений дипольных моментов в любых частях трехмерной структуры глобулы.

Графический способ построения двумерных карт включает в себя изображение цветом определенных интервалов значений физических характеристик отдельных определенных участков белка или (по заданию) суммарных дипольных моментов модулей, доменов, субъединиц или комплексов белков, ДНК и т.д.

В комплекс программ входят также различные способы одномерного графического представления свойств биополимеров и их комплексов, что позволяет, например, поставить в соответствие дипольные моменты тем аминокислотным последовательностям, которые их определяют. С помощью разработанного метода:

1. Впервые рассчитаны дипольные моменты более чем для 4100 белков из РОВ-банка. В отличие от принятых способов составления белковых выборок мы учли все белки (в том числе и белки одного наименования, структура которых определена в различных комплексах) в силу того, что дипольный момент белка (даже в нейтральном приближении) серьезным образом зависит от конформациопного состояния боковых радикалов. Последнее впервые продемонстрировано нами на примере лизоцима фага Т4: показано, что в этом белке замена 01уЮ5 на А1а105 приводит к изменению дипольного момента вдвое и что причиной этого является изменение конформации боковых радикалов при сохранении конформаций пептидных групп.

2. Проанализирована зависимость дипольного момента белков от длины молекулярной цепи. Показано, что максимальное значение дипольного момента возникает в белках, содержащих около 450 аминокислотных остатков. С дальнейшим увеличением длины цепи максимальное значение дипольного момента падает. Причем дипольный момепт мультидоменных белков приближается к значению, соответствующему величинам не большим,чем максимальные дипольные моменты белков с ~ 50 - 100 аминокислотами. Таким образом, структура мультидоменных белков

образуется при минимизации суммарных дипольных моментов доменов мультидоменного белка.

3. Показано, что суммарный дипольный момент белков минимизируется с увеличением в них количества Р-структуры, начиная примерно с 20%-ого ее содержания. Минимизация дипольных моментов а-спиралшых белков начинается с 50% содержания а-спиралей.

4. Проанализирована роль гидратной воды в организации поверхности глобулярных белков и показапо, что в отличие от ожидаемого, вода только незначительно уменьшает фрактальный коэффициент поверхности глобулярных белков. В то же время дшгольные момепты белка с водой растут в большинстве исследованных случаев. Изучены все случаи, когда различными методами, в том числе и нейтронографии, установлены координаты атомов водорода воды. Полученные результаты означают, что гидратяая вода, являясь частью физической структуры белка, усиливает асимметрические свойства белков.

5. Показано, что на границах доменов суммарный дипольпый момент изменяется, указывая на роль электростатики в их формировании.

Апробация

Результаты диссертации докладывались международной конференции по

химической термодинамике, Осака, Япония, 1996 и на международной школе

"Проблемы теоретической биофизики", Москва, 15-20 июня 1998.

Публикации

По материалам работы опубликованы шесть статей и тезисы.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Дипольный момент белка зависит не только от кокформации пептидных групп, но и от конформационного состояния боковых радикалов.

2. Максимальным значением суммарного дипольного момента характеризуются белки, содержащие около 450 аминокислотных остатков. Структура мультидоменных белков образуется при минимизации суммарных дипольных моментов отдельных доменов.

3. Гидратная вода, являясь частью физической структуры белка, усиливает асимметрические свойства их макромолекул.

4. Распределение дипольных моментов в пространственной структуре белков играет важную роль в процессах формирования доменов.

Структура и объем работы

Диссертация изложена на 129 страницах и включает 35 рисунков и 15 таблиц. Список литературы содержит 103 наименования. Диссертация состоит из введения и семи глав, заключения, выводов и списка литературы.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении обоснована актуальность темы диссертации, определены цели и задачи исследования, его научная новизна и практическая значимость.

В первой главе дан критический обзор литературы, в котором проанализированы различные методы определения дипольных моментов биологических макромолекул: метода связей и метода зарядов, в том числе и с точки зрения развития этих методов, начиная от определения дипольных моментов простейших соединений в органической химии, показана правомерность использования этих методов для расчетов дипольных моментов биополимеров, а также преимущества и недостатки каждого из этих методов. Особое внимание уделено работам по определению дипольных моментов глобулярных белков и влиянию дипольных моментов на стабильность и функционирование белковых глобул.

В второй главе описываются методы расчета распределения дипольных моментов в нейтральном приближении и разработанные пакеты программ. Методы расчета дипольных моментов биополимеров. Расчет дипольных моментов проведен исходя из зарядов атомов (метод зарядов), а также и из стандартных дипольных моментов связей (метод связей). Наш расчет основывался на модели нейтрализации зарядов на разных иерархических уровнях организации белков в аддитивном приближении. Заряды на атомах рассчитывались с помощью квантово-химического подхода, в предположении скомпенсированного заряда каждой пептидной единицы. Вычисления дипольных моментов по методу зарядов были проведены по формуле: к

<1 = , где ц, -парциальный заряд /-ого атома, а г, - расстояние от точки

ы

п

отсчета до 1-ого атома, а по методу связей по формуле ¡й = , где

м

/1ИВ<1„- вектор, имеющий направление ¡-той связи, а его величина получена как усредненное значение экспериментально определенных дипольных моментов связей данного типа.

Для расчета по методу зарядов использовали стандартные заряды на атомах аминокислот, определенные по методу молекулярных орбиталей [21]. Координаты атомов водорода были рассчитаны по единому алгоритму для всех белков в соответствии с известными длинами, углами и торсионными углами связей. При расчете общий заряд каждой пептидной группы и каждого бокового радикала предполагался равным нулю, поэтому при расчете дипольных моментов только отдельно петидных групп и отдельно боковых радикалов для нейтрализации общего заряда к каждой аминокислоте добавлялся дополнительный компенсационный заряд в районе Са-атома.

Описание программного пакета. В программную часть метода входят как расчет самих физических величин, так и их графическое представление.

■ г^тМ . ',-1^1 --С"- п™ ;]

.к»»;«., гади

Рис.1 Внешний вид пакета й1РАЫ для расчета и анализа пространственных

структур макромолекул.

(рис.1)

В расчет величин входит: определение величин общего дипольного момента, дипольного момента только пептидных групп, а также дипольного момента только боковых радикалов для любых различных частей белка, молекулы белка в целом и комплексов белков друг с другом и другими макромолекулами и водой; определение угла между диполями любого уровня организации, начиная с аминокислоты, например, между суммарным дипольным моментом определенного участка белка и суммарным дипольным моментом всего белка. В качестве вспомогательного средства для сравнения результатов предусмотрен расчет и построение карт и ряда других представлений расстояний между Са - и другими типами атомов аминокислот в белках. Для каждого вида расчета из вышеперечисленных можно получить эти величины как для каждой отдельно выбранной молекулы белка, для данной конкретной части ее цепи, так и в виде матрицы для всевозможных непрерывных по последовательности частей данного белка, а также и в виде таблицы, каждый ряд которой соответствует определенному выбранному белку, а колонка - одному из выбранных видов расчета. Например, может быть создана таблица для отображения величин общего дипольного момента, дипольного момента пептидных групп и дипольного момента боковых радикалов вместе с содержанием аминокислот в N отобранных белках. Используемые для отображения результатов расчета матрицы представляют собой наборы ячеек с цифровыми значениями, каждой из которых соответствуют две аминокислоты данного белка: начальная и конечная. Для одних видов расчетов, таких как определение расстояния между любыми двумя Са - атомами, занимающими ь тое и к-тое положения в полипептидной цепи, используются только две крайние аминокислоты, в то время как для других (например, расчет дипольного момента) используются все аминокислотные остатки, относящиеся к интервалу от ьтой до к-той аминокислоты данной последовательности .

Графический способ представления подразделяется на двумерный и трехмерный. Двухмерный способ представления состоит, в свою очередь, из изображения графиков, двумерных карт и контуров. В данном методе графики были использованы, как правило, для отображения результатов нескольких видов расчетов для сформированной нами выборки, где каждой паре (белок-вид расчета) ставилась в соответствие точка, причем вид этой точки (круг, квадрат и т.д.) зависел от вида расчета. Таким образом, для построения таких графиков

используются таблицы с результатами расчета для данного набора белков. Для отображения двумерных карт и контуров, напротив, используются матрицы значений определяемой величины для данного белка. Для двумерных карт каждому элементу данной матрицы ставится в соответствие квадратик в соответствующем месте карты вдоль координаты, связанной с ходом полипептидной цепи, т.е. последовательностью аминокислот, с цветом, соответствующим данному интервалу значений. Цвет каждого такого интервала, также как и количество самих интервалов, определяется произвольно. Для данного расчета были взяты за основу 16 интервалов, с изменением цвета от фиолетового до темно-красного при изменении значения от минимального до максимального. Карты расстояний и диполышх моментов представляют собой квадраты, па верхней и левой сторонах которых расположены номера остатков, и, таким образом, получаются изображения расстояний и величин дипольных моментов, симметричные относительно диагонали, проведенной из левого верхпего угла в правый нижпий. Т.к. диполыше моменты суммируются векгорпо, точка, лежащая ниже этой диагонали, соответствует суммарному дипольному моменту от г'-го - до у'-го остатка включительно. Контуры представляют собой графическое изображение локальных мипимумов и максимумов используемой матрицы с последовательностью аминокислот в качестве Х- и У- координат, как и на описанных выше картах. Глубины и высоты этих минимумов и максимумов также отображены цветом по описанному выше методу.

Трехмерный графический способ отображения результатов производится для векторных значений, которыми могут являться, например, дипольные моменты. Частью метода является способ проектирования вектора дипольного момента на пространство декартовых координат, который состоит в использовании направления исходного вектора для изображения отрезка, длина которого пропорциональна величине дипольного момента. Изображения векторов дипольных моментов в декартовом пространстве удобно сочетать с изображением атомов данной молекулы белка. При этом программа позволяет выбрать наиболее удобный ракурс и положение для просмотра данной трехмерной структуры.

Особенностью данного программного пакета является создание интерфейса как на уровне конечного пользователя, так и на уровне прикладной разработки программы, обрабатывающей трехмерные структуры отобранных белков. Интерфейс включает в себя библиотеку, позволяющую наиболее

простым интуитивным способом описать алгоритм нового метода расчета, используя язык С, причем данный программный интерфейс позволяет описывать этот алгоритм только для одного объекта, каким может являться молекула белка, для построения таблиц и аминокислотный остаток для построения матриц. Разработчик алгоритма не должен заботиться о выборе белков, считывании их координат и структуры с диска и записи результатов, все это происходит на уровне программного пакета. Поэтому все, что нужно разработчику, это описать новую функцию, реализующую новый алгоритм, определив при этом тип (целый, действительный, вектор или строка) и количество результирующих значений, использовать структуру, содержащую всю доступную информацию о конкретном белке и пользоваться стандартными функциями, работающими как с данной структурой в целом, так и с отдельными ее элементами: остатками, атомами, координатами, зарядами атомов и названиями остатков и атомов. Например, перед основным расчетом удобно использовать функцию £е!_сЬаг§е() - указать стандартные заряды и П181а11_11ус1к^еп0 рассчитать положения

атомов водорода для аминокислот. Для расчета распределения дипольных моментов были отобраны молекулы белка из банка данных РБВ по состоянию на июль 1997,пространственная структура которых была определена с высоким

разрешением (< 2,5 А ), не имеющие разрывов в ходе полипептиднои цепи, включающие все неводородные атомы боковых цепей. Мы отобрали 4131 молекулу белка (полипептидную цепь), удовлетворяющую данным критериям, причем количество полных комплексов белков, в которые входят более одной отобранной молекулы - 754, молекул, не входящих в комплекс - 1410.

»

МО «00 .1 - 1

эм . аоо . 100 . Ж» 1 ! 2* * АЖ'ЗЗ а I Г.д * _< : 1 - г 1

Рис.2 Зависимость величины суммарного дипольного момента (черные

кружочки), дипольного момента пептидных групп (светлые крестики) и

дипольного момента боковых радикалов белков (светлые квадраты) от

количества аминокислот.

В третьей главе приводятся результаты исследования распределений дипольных моментов в глобулярных белках на основе анализ Банка данных пространственных структур белков (РОВ).

На рис. 2 приводятся результаты результатов расчетов величин суммарного дипольного момента, дипольпого момента пептидных групп и дипольного момента боковых радикалов для всех выбранных молекул. Как видно из этого рисунка, величина дипольного момента белков в нейтральном приближении находится в пределах 0 - 700 Дебай, причем максимум приходится на белки, содержащие около 450 аминокислот.

При дальнейшем увеличении размеров белков значения дипольных

»■ .1 ■ ■ ■

■»Г'. . ■

аЕ Но 5Е

Рис.3 Зависимость разницы суммарного дипольного момента и дипольного момента пептидных групп от количества аминокислот в белке

\»итп 1

1 Ч 1 I Ч 1 I 1 I 1 I Ч Ч 1 I

Рис.4 Зависимость разницы суммарных дипольных моментов и дипольных моментов пептидных групп, нормированных по количеству аминокислот от количества аминокислот, вместе с огибающей этой зависим оста

Рис.5 Фрагмент зависимости суммарных дипольных моментов, нормированных по количеству аминокислот от количества аминокислот, вместе с огибающей этой зависимости

«О 140 121

.иж . .»»цмщмиип, ч ■ ^

я 8 8 ?? О а 3 § 5 ? § 12 8 § § О § й 8 2 & !

Рис.6 Гистограмма распределения числа молекул белка, отобранных для расчетов, по количеству аминокислот.

моментов постепенно спадают. Отчетливо видно, что величины суммы

дипольных моментов боковых радикалов аминокислот значительно меньше, чем

соответствующие величины для суммы дипольных моментов пептидных групп

и суммарных дипольных моментов белков в целом. Этот результат означает, что

11

при использовании нейтрального приближения, основной вклад в величину

диполыюго момента белка вносят пептидпые группы.

Зависимости разности величин суммарного дипольного момепта белка и суммы дипольных момента пептидных групп от количества аминокислот в белке ' приведены на рис.3. Модули данных разностей статистически увеличиваются при увеличении количества аминокислот в молекуле.

При рассмотрении этой же зависимости, нормированной на количество аминокислот в молекуле (рис.4), наблюдается периодическое, почти синусоидальное убывание с четкими максимальными значениями. Наиболее характерная периодичность на графиках этой зависимости оказывается у белков с числом аминокислот от 100 до 200 (рис. 5).

Максимум распределения числа белков по количеству остатков лежит в интервале 100 - 200 аминокислот (рис. 6). Таким образом, обнаруженная закономерность отражает свойства большинства изученных белков. При этом получено, чгго средняя величина разброса наблюдаемых значений остается постоянной при любом количестве молекул с данным размером.

Установлено, что распределение дипольных моментов в зависимости от степени а-спиральности белка является гауссовым (рис.7). При этом наибольшие значения дипольных моментов наблюдаются у тех белков, у которых около половины остатков входят в состав а-спиралей.

Таким образом, большой процент а-спиралей в структуре позволяет

эффективно уменьшать

суммарный дипольный

момент белка, что важно для его функционирования и образования комплексов. В зависимости величин дипольных моментов от количества остатков,

ТОО 600 500 400

ЭОС

200 100

0 0.1 02 0.3 04 0.3 0в 0,7 0.8 Рис.8 Зависимость суммарного дипольного

момента от содержания Р-струкгур в белке.

входящих в р-структуры (рис.8), была выявлена другая тенденция: приблизительно с 15-процентного содержания Р-структура начинает играть существенную роль в минимизации суммарного диполыюго белка, причем, чем больше Р-структуры в белке, тем меньше величина его суммарного диполыюго момента.

При этом наблюдается гиперболическая колебательная зависимость. Чем больше молекулярный вес, тем больше находится вариантов для компенсации дипольпых моментов внутри белка (рис.9). При этом надо иметь в

виду, что белки большого

Рис.9 Зависимость количества аминокислот в молекулах белка от содержания р-структур в белке.

Ряс.10. Градиент разницы дипольпых моментов двух мугангных форм лизоцимов фага Т4 (1ЬОО и 1Ь99) от количества

ЙМЦМП^НГПГГГ

молекулярного веса как правило являются

мультидоменными и поэтому компенсация дипольпых

моментов может достигаться за счет расположения не только отдельных пептидных групп, но и - далее - участков вторичных структур, а также модулей доменов и доменных комплексов.

Проведенные расчеты показали, что дипольные моменты макромолекул зависят от огромного набора параметров структуры белков. Они могут случаях радикального изменения

значительно отличаться как в пространственных структур, так и для макромолекул одного и того же белка,

находящегося, однако, в

Таблица 1 Дипольные моменты лизоцима фага Т4 и его мутантов

Название Количест во остатков Общий ДИПОЛЬНЫЙ момент Дипольный момент пептидных групп Дипольн ый момент боковых радикало в

Мутант лизоцима сА1аЮ5 (1Ь00) 164 39.980 57.046 27.501

Мутант лизоцима с (Йу105 (11.99) Ш 69.125 60.143 44.649

Дикий ТИП газоцима (ЗЬШ) 164 64.986 59.037 8.486

различных положениях элементарной ячейки кристаллов. Это и определило неплодотворность проведения систематического

анализа дипольпых моментов для небольших, родственных в структурных отношениях выборок макромолекул. Также оказалось неплодотворным

13

исследование диполышх моментов с опорой на топологический шп структуры белка.

Хорошей иллюстрацией сказанного являются расчеты диполышх моментов в трех формах лизоцима фага Т4: одного белка из штамма дикого типа и двух

мутантов: 1) с заменой Glnl05 па Ala и 2) с заменой Glnl05 на Gly. В табл. 1 представлены расчеты диполышх моментов для всех трех форм лизоцима.

Как следует из рассмотрения данной таблицц данные замены приводят к достаточно значительным

радикалов и вследствие этого к значительным изменениям суммарных дипольных моментов. Заметим, что мутации могут вызывать не только изменения в тех областях, в которых произошли замены аминокислот, но и вообще в третичной структуре белка в целом. Поэтому разумно рассмотреть теперь, какие именно аминокислотные остатки столь сильно меняют суммарный дипольный момент этого белка. Для

Рис. 12 Мутанты люоцима 1Ь00 (слева) к 1Ь99 (справа) с выделенными аминокислотными остатками, наиболее сильно изменившимися в результате аминокислотной замены.

этого мы рассчитали для этих белков (коды по байку РОВ: 1Ь00 и 1Ь99) разность дипольных моментов участков полипептидной цепи от первого остатка

200

Рис. 11. Градиент разницы дипольных моментов мутанпюй формы люопнма фага T4 (1 LOO) и его дикого типа (3LZM) от количества вминокислсгг.

изменениям дипольных моментов боковы

до ¡-го, где 1 - все числа от 1 до 164 (общего количества аминокислот в лизоциме фага Т4). Чтобы обнаружить искомые остатки, мы построили зависимость изменения найденного соотношения, приходящегося на один остаток (рис.10). Из этого графика мы получаем, что остатками, наиболее сильно изменившими суммарный дипольный момент лизоцима являются 14, 55 и 154 остатки. Теперь, после того, как мы узнали из анализа распределения диполышх моментов лизоцима номера наиболее изменившихся остатков, сопоставим эти две молекулы так, чтобы максимально разглядеть эти три аминокислоты в них (рис.П).Как можно увидеть из этого рисунка, изменения коснулись в основпом не тех боковых радикалов, которые мутировали. Причем интересно, что участок примерно от 80-той до 120-той аминокислоты не содержит вообще никаких изменений величин диполышх моментов.

Боковые радикалы, изменение состояния которых так сильно повлияло на суммарный дипольный момент лизоцима в целом. - это полярные, ионизующиеся боковые радикалы, измепение вклада которых в суммарпый диполышй момент белка произошло из-за изменения их ориентации относительно суммарного дипольного момента белка в целом. Это хорошо видно из рис.12 . Важно, что изменение дипольного момента произошло из-за изменения ориентации боковых радикалов, по пе из-за изменения характера их ионизации, что еще раз позволяет понять важность исследования распределения дипольных моментов в приближении нейтральности глобулы. Полученный результат показывает важную роль дипольных моментов в определении

конформационных свойств белков. Относительный

консерватизм дипольных моментов пептидных групп целых молекул подтверждает, что в результате данной замены изменилась копформация только боковых радикалов.

Дипольные моменты пептидных групп остаются малоизмененными, что означает, что по распределению дипольных моментов пептидных групп можно проводить достаточно тонкую классификацию происходящих в белках конформационных перестроек п следующих из них изменений регуляторных и функциональных свойств белков.

«0 1

МО 200 - .мЩ-'-л' ' '' ! ШРр! •

Рис. 13 Зависимость дипольного момента пептидных групп в

белках от количества аминокислот в полилептидной цепи

Для иллюстрации этого мы приводим рис.13, на котором изображены зависимость дипольных моментов пептидных групп белков от общего количества аминокислот в полипептидных цепях.

Как следует из рассмотрения данного рисунка все выведенные закономерности для суммарных дипольных моментов проявляются и на этом рисунке, однако разброс величин дипольных моментов в вертикальных рядах значительно меньше. Это означает, что разброс суммарных дипольных моментов в белках в составе большинства использовавшихся комплексов определяется изменением состояния боковых радикалов в них. Полученные нами результаты свидетельствуют о том , что расчеты дипольных моментов могут позволить создать банк для предсказаний направленных замен аминокислот в белках для целевого изменения их регуляторных свойств и энергий взаимодействия в белок-белковых и белок-нуклеиновых комплексах. Это может позволить использовать незначительные изменения в первичной, а следовательно, и в пространственной структурах белков для проектирования функционально значимых изменений, важных для биотехнологических и медицинских целей.

В четвертой главе приводятся результаты анализа влияния воды на распределение дипольных моментов в глобулярных белках на основе комплексного изучения поляризации белка в присутствии растворителя. В качестве молекул растворителя учитывались относительно неподвижные, фиксированные относительно поверхности белка молекулы воды. Для более полного понимания роли фиксированных молекул воды на поверхности белка был применен метод фрактального анализа. Фрактальные размеров глобулярных белков рассчитывались по новому методу определения фрактальных размеров макромолекул. В случае молекул с учетом воды для всех рассмотренных белков фрактальный размер почти не изменяется, хотя заметна некоторая тенденция в сторону уменьшения. Из этого был сделан вывод: фиксированные молекулы воды, заполняя в ряде случаев впадины на поверхности белка, сглаживают эту поверхность и уменьшают тем самым ее фрактальный размер. Фиксированные молекулы воды оказывают определяющее влияние на форму поверхности белковой глобулы. Чтобы понять их влияние на электростатические свойства белка мы проанализировали дипольные моменты комплексов белков с молекулами воды. Для этой цели было отобрано более 330 комплексов молекул белка с фиксированными молекулами воды.

900 800 700 600 500 400 300 200

Рис.14 Зависимость разницы вели тоны общего дипольного момента и дипольного момента белков от количества аминокислот белков, входящих в комплекс.

Были произведены расчеты для выбранных белковых комплексов как суммарного дипольного момента комплекса белка с водой, так и отдельно общего дипольпого момента только молекул белка, только молекул воды, а также угла между этими величинами. Исходя из полученных результатов можно сделать вывод, что дипольные моменты воды лишь иногда уменьшают дипольпый момент комплекса, на чаще увеличивают его, величины углов между дипольными моментами белков и воды находятся и до 90° и после. Таким образом, здесь отсутствует общая тенденция к минимизации физических характеристик, найденная нами для фрактального размера белков. Из рис. 14 можно видеть, что вода может лишь незначительно понижать общий дипольный момент, тогда как в ряде случаев она сильно его увеличивает. Также можно отметить практически гауссово распределение разпицы величины общего дипольного момепта и дипольного момента белков в зависимости от количества аминокислот. Тот факт, что вода в большинстве наблюдаемых случаев не уменьшает дипольный момент системы приводит к выводу, что электростатические взаимодействия не являются определяющими в стабилизации фиксированных молекул воды, и вода не уменьшает степени асимметрии распределения физических характеристик в глобулах белков.

100

1800 2000 2200 2400 2600

В пятой главе проведен анализ влияния распределения дипольных моментов на функционирование глобулярных белков. В качестве

объектов для решения этой задачи были выбраны близкие природные структурные гомологи бактериальные рибонуклеазы

Bacillus amyloliquefaciens (барназа) и Bacillus intermedius 7Р (биназа), позволяющие выявлять влияние определенных взаимодействий путем изучения изменения энергетических характеристик и поведения вышеуказанных

объектов вследствие точечных замен в структурах, не влияющих на ход полипептидной цепи. При этом в расчетах были учтены экспериментальные свидетельства того, что все взаимодействия между поверхностными зарядами боковых радикалов в барпазе дают малый вклад в ее стабильность, из-за того, что все заряды и в барназе, и в биназе, образуют ионные пары. Экспериментальные данные

свидетельствуют о разном термодинамическом поведении белков: барназа плавится как единая кооперативная система во всем интервале значений pH, природная биназа проявляет два пика теплопоглощения при рН<4.

Для характеристики различий в термодинамических свойствах биназы и барназы, проявляющихся при плавлении этих белков в кислой области, следует отметить, что хотя реальные заряды находятся на постоянных позициях (положения заряженных аминокислот не меняются), взаимное расположение

20 40 60 80 100 Рис.15 Карта дипольных моментов барназы, рассчитанных по методу зарядов.

дипольных моментов доменов меняется, что означает, что именно диполь-диполыше взаимодействия определяют в данном случае влияние рН среды на термостабилыюсть бипазы И барназы. Сопоставление карт расстояний последовательностей показывает высокую степень сходства между ними. Показана возможность соотнесения распределения дипольных моментов и

вторичных структур

определенного типа. По распределению дипольных

моментов выделены области, соответствующие возможным структурным доменам. Разница в величипах суммарных дипольных моментов фрагментов этих молекул при том^ что соответствующие величины для доменов белков очень близки по абсолютной величипе говорит об их разной ориентации в пространстве, которая определяет отличающиеся распределения зарядов и взаимодействий электростатического типа в глобулах. Мы установили, что существует сильное отличие в углах между дипольпыми моментами доменов. Таким образом, электростатические взаимодействия, нашедшие в данном случае свое отражение в характеристиках дипольных моментов, модулируют энергетическое поведение белков при изменении условий внешней среды.

В шестой главе были рассмотрены белок - белковые взаимодействия. При анализе белковых комплексов по всему банку РОВ был произведен расчет дипольных моментов белков, составляющих единую чеггвертичнуго структуру или входящих в одну элементарную ячейку. Результаты анализа распределений в таких комплексах включали в себя как влияния межмолекулярного взаимодействия на электростатические свойства данного комплекса, так и изменение внутримолекулярного распределения за счет воздействия внешних молекул белка. Распределение суммарных дипольных моментов полных комплексов, изображено на рис. 17. Оно отличается от распределения дипольных моментов для одиночных полипептидных цепей. Здесь нет плавного увеличения определяемого значения при возрастании количества остатков в белках, также как и почти полностью отсутствует плавный спад этих значений

те 1

а» . «X ^ ■ :

»

! ^. д'!.1' -. •

• '-¿Г „ м и," ж -

Рис.17 Зависимость величины суммарного

дипольного момента комплексов белков, в

которых входит более чем одна молекула от

количества аминокислот

после максимума при среднем количестве аминокислот. В то же время нельзя сказать, что здесь отсутствует какая-либо закономерность - скорее данное распределение представляет собой объединение различных групп зависимостей. К первой группе можно условно отнести комплексы со сбалансированным дипольным моментов с общим размеров до 600 аминокислот в каждом. Про группу комплексов с общим размеров от 600 до 1000 аминокислот трудно что-либо сказать - в этом интервале значения суммарных дипольным моментов разбросаны по всему интервалу с небольшим промежутком. Зато область с количеством остатков в комплексе 1000 - 1500 можно за некоторым исключением охарактеризовать как группу комплексов с преимущественно большими значениями их дипольных моментов. Несколько белковых комплексов, размер которых превышает 1500 остатков, имеют практически нулевой (с учетом их размера), т.е. полностью скомпенсированный дшюльный момент. При этом наблюдается понижение (компенсирование) суммарного дипольного момента комплексов относительно одиночных белков того же размера. Следует отметить также, что даже группа с относительно высоким значением дипольных моментов комплексов (с размерами 1000-1500 остатков) практически не выходит за значение максимального дипольного момента одиночных белков. Большие значения дипольных моментов этой группы могут служить основанием для предположения об их особой функциональной роли, связанной со взаимодействием с другими биологическими объектами, тогда как остальные комплексы в рамках данных условий можно считать "самодостаточными".

При рассмотрении влияния воздействия субстрата на распределение дипольных моментов белка на примере молекулы барназы был произведен сравнительный анализ двух конформаций молекулы барназы, одна из которой входит в комплекс с ингибитором ОС, а другая - свободная. При расчете суммарных дипольных моментов первоначальной информации барназы и в составе комплекса заметна существенная разница: суммарные дипольные моменты молекулы отличаются практически в два раза и имеют следующие значения: 39.9 Э и 68.5 Б.

Изучение межбелкового взаимодействия было произведено также на примере комплексов биназы с барстаром и барназы с барстаром. При этом было получено, что величина угла между суммарными днпольпыми моментами биназы и барстара составляет 64,1°, величина дипольпого момента биназы в этом комплексе составляет 63,70, барстара - 79,ОБ, общий дипольный момент комплекса - 121 В то время как величина угла между суммарными дипольными моментами барназы и барстара составляет 46,0°, величина дипольпого момента барназы в этом комплексе составляет 55,Ш, барстара -70,6В, общий дипольный момент комплекса - 115,90. Рассмотрение суммарных дипольных моментов комплексов показывает, что и тот и другой похожи друг на друга. Это означает, что барстар - эффективный ингибитор барназы может также эффективно ингибировать и биназу. Таким образом, мы продемонстрировали, что расчет дипольных моментов в нейтральном приближении может помочь в поиске эффективных ингибиторов ферментов при учете определенной гомологии.

Рис. 18 Изображение комплекса сго-белка со специфическим оператором с проекциями их дипольных моментов.

В главе седьмой рассмотрены дипольные моменты белок- нуклеиновых комплексов в нейтральном приближении. Такого рода рассмотрение интересно применительно к специфическому белок-нуклеиновому взаимодействию, поскольку именно оно не связано непосредственно с заряд-зарядовыми взаимодействиями. На рис.18 приведены расположения дипольных моментов ДНК и сго-белка. Интересно, что нейтрализованный дипольный момент сго-белка обращен к ДНК своей отрицательно заряженной составляющей, что означает, что на специфических участках поиск оптимальной посадки может

опираться на отталкивание локальных отрицательно заряженных участков

белков.

Выводы.

1. Развит метод расчета дипольных моментов глобулярных белков и их комплексов в приближении компенсированных зарядов. Создан комплекс программ для конечного пользователя, включающий компьютерную обработку пространственных структур биомакромолекул, возможность расчета любых физических характеристик трехмерных структур макромолекул. Комплекс включает пакет программ компьютерной графики для анализа пространственных структур белков и изображения распределения физических характеристик макромолекул в их трехмерной структуре и проекциях разной размерности.

2. Рассчитаны дипольные моменты более чем для 4100 белков из РОВ-банка. Показано на примере лизоцима фага Т4, что суммарные дипольные моменты резко мепяются в зависимости от конформационного состояния боковых радикалов при сохранении конформаций пептидных групп.

3. Показано, что максимальное значение дипольного момента возникает в белках, содержащих около 450 аминокислотных остатков. Структура мультидоменных белков образуется при минимизации суммарных дипольных моментов доменов мультидоменного белка.

4. Установлено значительное изменение суммарных дипольных моментов в комплексах белков как с низко-, так и с высокомолекулярными соединениями при сохранении хода полипептидной цепи.

5. Показано, что гидратная вода незначительно уменьшает фрактальный коэффициент поверхности глобулярных белков. В то же время дипольные моменты белка с водой растут в большинстве изученных случаев. Полученные результаты означают, что гидратная вода, являясь частью физической структуры белка, усиливает асимметрические свойства белковых макромолекул.

6. Показано, что на границах доменов . суммарный дипольный момент изменяется, указывая на роль электростатики в их формировании.

Материалы диссертации опубликованы в следующих работах:

1. A.A.Makarov, I.I.Protasevich, N.V.Kuznetsova, B.B.Fedorov, S.V.Korolev, N.K.Struminskaya, N.P.Bazhulina, I.B.Leshchinskaya, R.W.Hartley, M.P.Kirpichnikov, G.I.Yakovlev, N.G.Esipova. Comparative study of thermostability and structure of close homologs - barnase and binase. // J.Biomol.Struct.Dyn. 1993. V.10. N.6. P.1047-1065.

2. А.А.Макаров, Н.В.Кузнецова, И.И.Протасевич, Б.Б.Федоров, С.В.Королев, Н.К.Струминская,Н.П.Бажулина, Н.П.Балабан, И.Б.Лещинская, Р.В.Хартли, М.П.Кирпичшпсов, Г.И.Яковлев, Н.Г.Есипова. Сравнение термостабильпости и структуры близких гомологов - рибонуклеазы Bacillus Amyloliquefaciens и рибонуклеазы Bacillus Intermedus 7Р. Молекулярная

биология,т.27,вьш.2,стр.416-428,1993

3. Б.Б. Федоров, Н.Г. Еснпова. Распределение дилольных моментов в макромолекулах глобулярных белков. Анализ банка данпих пространственных структур.// Биофизика. 1998. В печати.

4. Федоров Б.Б., Федоров Б.А. Влияние фиксированных молекул воды на фрактальные свойства поверхностей глобулярных белков.//Биофизика. 1993. Т.38, вып.4, стр. 611-618

5. Федоров Б.Б., Федоров Б.А. Модифицированный метод расчета фрактальных свойств поверхностей глобулярных белков.//Биофизика (1998) В печати.

6. Fedorov В. A., Fedorov В.В., Schmidt P.W. An Analysis of the Fractal Properties of the Surfaces of Globular Proteins. The Journal of Chemical Physics. Sep 1 1993, V 99, N 5, P 4076.

Издательство АО "Диалог-МГУ". J1PN 063999 от 04.04.95 Подписано к печати 15.09.98 г. Усл.печ.л.1,5. Тираж 80 экз. Заказ 880. Тел. 939-3890, 939-3891, 928-1042. Тел./факс 939-3891. 119899, Москва, Воробьевы горы, МГУ.