Динамика биополимеров в растворе и метод спин-метки

Тимофеев, Владимир Петрович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Динамика биополимеров в растворе и метод спин-метки
ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Динамика биополимеров в растворе и метод спин-метки"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОЛОГИИ им. В. А. ЭНГЕЛЬГАРДТА

Г б од

' ноя isos

На правах рукописи

ТИМОФЕЕВ Владимир Петрович

ДИНАМИКА БИОПОЛИМЕРОВ В РАСТВОРЕ И

МЕТОД СПИН-МЕТКИ 03.00.02 - биофизика

Диссертация в виде научного доклада на соискание ученой степени доктора физико-математических наук

Москва -1995

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор

Ванин А.Ф.

доктор физико-математических наук, профессор

Куликов А. В.

доктор физико-математических наук, профессор

Аксенов С. И.

Ведущая организация:

Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН (Пугцино)

Защита состоится 7 декабря 1995 г. в 15.30 часов на заседании Диссертационного совета Д 053.05.53 по биофизике при МГУ им. М. В. Ломоносова по адресу: 119899, Москва, Воробьевы горы, МГУ, биологический факультет, аудитория: "Новая".

С диссертацией в виде научного доклада можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ

Диссертация в виде научного доклада разослана 1 ноября 1995 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета доктор биологических наук,

профессор Кренделева Т.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Постановка проблемы н ее актуальность. Фундаментальная проблема структуры биополимеров и механизма их молекулярных взаимодействий - одна из важнейших в молекулярной биологии. В настоящее время не вызывает сомнения тот факт, что для понимания процесса функционирования белков и нуклеиновых кислот недостаточно знания пространственной структуры макромолекул (статических состояний, получаемых методом рентгеноструктурного анализа). Недостаточно знания и электронной структуры биополимеров. Не менее важная роль отводится динамике. Необходимо знать проявления динамических особенностей биополимеров в растворе, обладающих конформационной жесткостью и флуктуационной подвижностью. По значимости понимание сути динамики биополимеров нужно равноценно ставить как промежуточное звено в цепи рассуждений от знания пространственной и электронной структуры биполимеров к пониманию их функции:

СТРУКТУРА ДИНАМИКА => ФУНКЦИЯ Динамическая концепция, наряду с молекулярной динамикой мелкомасштабного типа, включает крупномасштабную и среднемасштабную динамику, которые играют важную роль, например, при функционировании иммуноглобулинов, в том числе при взаимодействии их с рецепторами, при белково-нуклеиновом и белок-белковом узнавании. Крупномасштабная динамика проявляется в подвижности субъединиц, подвижности доменов в пределах субьединицы. Среднемасштабная динамика проявляется в подвижности боковых остатков полимерной цепи. Каждое из этих движений характеризуется своим временем вращательной корреляции и амплитудой переориентации. Большой объем информации при изучении молекулярной динамики был получен с помощью методов ЯМР и поляризации люминесценции. Однако присущие каждому из этих методов ограничения сковывают возможности исследователя. В связи с этим все большее внимание в последние годы привлекает метод спин-метки, обладающий рядом существенных преимуществ.

Метод спин-метки относится к косвенным методам изучения. Для того, чтобы им воспользоваться, необходимо избирательно вводить в объект исследования репортерскую группу - нитроксил. Поскольку магнитный момент нигроксила, представляющего собой радикал, резко анизотропен, спектры ЭПР становятся необычайно чувствительными к геометрии вращения и к малейшим изменениям собственной подвижности радикала в диапазоне времен вращательной корреляции: от 10 не до 10 с, если учитывать спектроскопию с переносом насыщения.

Теория метода хорошо разработана. Однако в расшифровке спектров ЭПР спин-меченых макромолекул еще содержится много неопределенностей. И это несмотря на то, что прямая задача ЭПР спектроскопии нитроксильных радикалов к настоящему моменту решена: по заданной модели движения радикала теоретически возможно

рассчитать и смоделировать на ЭВМ нужный спектр ЭПР. Это сделано, например, для изотропно вращающегося радикала в области быстрых и медленных вращений (Б.ЙУекоп, Н.МсСоппе11,1.Ргесё, А.Н.Кузнецов, В.АЛившиц) или для анизотропно быстрого вращения радикала (Н.МсСоппеИ, Н.ОпПиЬ, Лившиц В.А.), а также для радикала, сложным образом вращающегося в мембранных слоях (Е.МеегсмсЬ, .ГРгеесЗ). Однако, чтобы подойти к решению биофизических задач исследования, упомянутых выше, с помощью метода спин-метки необходимо прежде всего разобраться с обратной задачей ЭПР спектроскопии применительно к нитроксильным радикалам. Обратная задача, заключающаяся в расшифровке экспериментальных спектров ЭПР спин-меченых макромолекул, которая включает выбор адекватной модели поведения радикала и выбор его магнитных параметров необходимых для описания спектров ЭПР, еще не решена однозначно. Это порождает много неясностей в интерпретации вырожденных по многим параметрам спектров. Ввиду наличия огромного количества работ, использующих метод спин-метки, среди которых встречаются разные подходы в истолковании спектров ЭПР, решение обратной задачи заслуживает самого пристального внимания. Только после решения этой задачи возможно однозначное, непротиворечивое извлечение информации о динамических особенностях биополимеров в растворе из спектров ЭПР спин-меченых образцов.

Цель работы и задачи исследования состояли в решении сформулированной выше обратной задачи ЭПР спектроскопии для широкого круга биологических образцов, в которых вводилась спин-мегка. Среди них: сывороточные альбумины, гемоглобины, иммуноглобулины в, М и А и их фрагментов, фосфорилаза, липаза, протеинкиназа и ее субьединицы, аспартатаминотрансфераза, рудифкарбоксилаза, нейротоксин, гистон Н1, белки гастосовместимости, полирибонуклеотидов, синтетических полимеров и др. (в каждом конкретном случае в дальнейшем используются самые разные названия: макромолекулы, биополимеры, большие молекулы полимерного типа). В создании нового универсального метода расшифровки спектров ЭПР спин-меченых биомолекул и применении его к различным биофизическим задачам, в том числе: получение новых данных о динамике разного уровня структуры биополимеров в растворе и анализ локальных конформационных изменений в них, систематическая обработка - на основе предлагаемой модели движения спин-метки - уже имеющихся в литературе биофизических данных, охватывающих обширный экспериментальный материал, полученный к настоящему времени. В создании каталога спектров ЭПР спин-меченых макромолекул для научных работников и специалистов, работающих в разных областях биологии, молекулярной биологии, биофизики и медицины и использующих в своих исследованиях методы спин-метки и спин-зонда для быстрой диагностики спектров ЭПР.

Для достижения этой цели были поставлены следующие конкретные задачи:

1. Разработать однозначный способ разграничения вкладов в усреднение эффективного спин-гамильто>..<ана спин-метки от медленного движения носителя и быстрого движения маркера. Получить номограммы и вывести расчетные формулы для определения времени вращательной корреляции макромолекул в растворе и параметра упорядоченности для характеристики быстрого анизотропного движения метки в форме удобной для их адекватного сравнения с формулами других релаксационных методов - ЯМР и поляризации люминесценции.

2.Решить вопрос о том, как различные динамические и структурные характеристики макромолекулы в растворе (такие как эллипсоид алыгость, сферичность или гибкость) проявляются в спектрах ЭПР присоединенных к макромолекуле спин-меток или адсорбированных спин-зондов.

3.Разработать теоретические модели для процесса быстрой угловой переориентации маркера относительно носителя, позволяющей проводить сравнение теоретически полученного спектра ЭПР с экспериментальным и получать полное, точное сходство по всем особенностям формы линии спектра. Создать компьютерный метод анализа спектров ЭПР спин-меченых макромолекул. Для этого сконструировать и отладить программы на ЭВМ с целью расчета спектров ЭПР нитроксильных радикалов - прямая задача ЭПР спектроскопии - в порошковом состоянии, при изотропном и анизотропном вращении, используя уравнение Блоха (Макконел) или стохастическое уравнение Лиувилля (Фрид), а также для численной обработки как экспериментальных, так и теоретических спектров ЭПР и всех результатов эксперимента в целом.

Научная новизна работы определяется следующими факторами. Создан новый универсальный подход в применении метода спин-метки в молекулярной биологии, биофизике и медицине, который позволяет количественно получать в эффективных параметрах максимально возможную однозначную информацию, которая содержится в спектрах ЭПР спин-меченых биологических образцов, будь то ковалентно связанный радикал - спин-метка или адсорбированный радикал - спин-зонд. Доказана компьютерная теорема: ЭПР спектр спин-меченых биополимеров может быть адекватно описан моделью изотропного вращения носителя и набором быстрых осевых вращений нитроксильного радикала относительно носителя. Получены новые данные по динамической структуре синтетических полимеров и белков, в том числе ферментов и иммуноглобулинов.

Впервые показано, что:

1.Новый экспериментальный подход и метод компьютерного анализа ЭПР спектров спин-меченых биополимеров позволяет обнаружить и количественно оценить динамику их молекул в целом, а также локальные конформационные изменения и сегментальную гибкость в некоторых биополимерах (ферментах,

иммуноглобулинах). Впервые обнаружена гибкость не только дошера аспартатаминотрансферазы, но и составляющих ее мономерных субъединиц. Впервые обнаружены динамическая подвижность доменов в Fc и pF фрагментах иммуноглобулинов G и М. Впервые показана гибкость белков гистосовместимости. Подтверждено существование гибкости молекулы гистона Hj и показано, что комплекс гистона Hj с каталитической субъединицей протеинкиназы представляет собой гибкое образование.

2. Впервые детально проанализирован процесс связывания субстратов и ингибиторов с ферментами трансаминазами и фосфорилазой В по наличию локальных конформационных изменений в белке, регистрируемых спин-меткой ковалентно-связанной с их SH-группами. Впервые обнаружена жесткость прилегания углеводной цепи к Сн2 домену IgG при 1°С с последующей резкой температурной активацией его подвижности.

3. Доказано существование быстрой ограниченной по углам переориентации спин-зондов, адсорбированных на молекуле сывороточного альбумина.

Научное направление заключается в развитии нового подхода в решении обратной задачи ЭПР спектроскопии спин-меток и спин-зондов, основанного на строгой теории магнитного резонанса и качественно нового проведения эксперимента с обработкой и прогнозом экспериментальных данных на ЭВМ.

Практическое значение работы состоит в том, что созданный метод расшифровки спектров ЭПР спин-меченых биомакромолекул имеет универсальное применение к объектам исследования, в различных областях молекулярной биологии, биофизики и медицины. На основании полученных в работе результатов разработаны способы диагностики таких заболеваний, как бронхиальная астма и инфаркт миокарда, и диагностики физического состояния спортсменов при длительных нагрузках.

Апробация работы. Материалы по теме диссертации были доложены на II Всесоюзном биохимическом съезде (Ташкент, 1969); ГУ Международном биофизическом кошрессе (Москва, 1972); семинаре по активным центрам ферментов (Москва, 1972); Советско-американском симпозиуме по пиридоксалевому катализу (Ленинград, 1974); II, III и Y Всесоюзных совещаниях по конформационным изменениям биополимеров в растворах (Тбилиси, 1973; Тбилиси, 1975; Телави, 1980); III Всесоюзном симпозиуме по структуре и функции активных центров ферментов (Москва, 1976); I и II Всесоюзных симпозиумах по магнитному резонансу в биологии и медицине (Звенигород, 1977 и 1981); Международной конференции по квантовой химии, биологии и фармакологии (Киев, 1978); Европейском иммунологическом семинаре (Будапешт, 1978); XX конгрессе Ампера (Таллин, 1978); Всесоюзном симпозиуме по макромолекулам клетки (Москва, 1979); Всесоюзной конференции по актуальным вопросам иммунологии (Алма-Ата, 1981); Международном совещании по молекулярным факторам иммунитета (Ялта,1981); Всесоюзной конференции по нитроксильным радикалам (Черноголовка, 1982); Симпозиуме по равновесной динамике структуры биополимеров (Пущино, 1982); I Всесоюзном биофизическом съезде (Москва,1982); Микросимпозиуме по структуре, биосинтезу и функции

мекулярных элементов в иммунной системе (ГДР, 1983); Всесоюзной конференции ) магнитному резонансу в конденсированных средах (Казань, 1984); Методических мшарах по применению ЭПР в биологии и медицине (ГДР, 1982 и 1984, ратисяава, 1988); 16 конференции федерации европейских биохимических обществ Москва, 1984); 8 объединенном симпозиуме биохимических обществ СССР и ГДР по эоблемам современной биохимии и биотехнологии (Рига, 1985); Школе симпозиуме з магнитной радиоспектроскопии в биологии и медицине (Одесса, 1986); 6 еждународный конгресс по иммунологии (Торонто, 1986); Международном шпозиуме по структуре, биосинтезу и функциям молекулярных элементов ммунной системы (Пущино, 1987); 9 специализированный коллоквиум Ампера по агнитному резонану в полимерах (Прага, 1989); Международная конференция по игроксильным радикалам (Новосибирск, 1989); III Всесоюзной конференции Макромолекулы клетки", (Москва, 1989); Международный симпозиум по динамике ^логических структур (Казань, 91); Международная конференция "Молекулярная яология на рубеже 21 века." (Москва, 1994); 28 ежегодной международной сшференции по ЭПР спектроскопии радикалов в органических и биоорганических гсгемах (Ьопйоп-Биггеу, 1995).

РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ II ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Целенаправленное изменение макроскопических параметров, температуры и изкости растворов спин-меченых биологических образцов, создает возможность по гсектрам ЭПР извлекать ценную информацию о динамике спин-меченых акромолекул. Эта информация выявляется из сложной динамики спин-метки или пин-зонда в составе макромолекулы и закрепляется теоретическим моделированием пектров ЭПР с помощью ЭВМ для определенной модели движения спин-метки, декватно отражающей реально происходящее поведение спин-метки. При этом егко осуществляется прогнозирование динамического состояния макромолекулы в ех экспериментальных условиях, которые планируются.

1. Теория спектров ЭПР нитрокенлытх радикалов. Моделирование и расчет их

на ЭВМ

1.1 Введение. Чтобы оценить место данной работы в теории и эксперименталь-;ых подходах метода спин-метки необходимо дать краткое введение о том, что было звестно до результатов данной работы. В основу данной работы положено то, что .заимодейсгвие нитрокешга с постоянным магнитным полем описывается хорошо пвесгной формой эффективного спин-гамильтониана без учета диполь-дипольного заимодействия между радикалами.

Спектры ЭПР нитроксильных радикалов в статическом и квазистатическом сос-ояниях описываются время независимым спин-гамильтонианом и подразделяются га три типа: 1) спегары ЭПР ориентированных радикалов в магниторазбавленных юнокристаллах; 2) спектры ЭПР хаотически распределенных радикалов или, так (азываемые, спектры ЭПР "порошкового" типа; 3) спектры ЭПР радикалов в зазистатическом состоянии в изотропных и ориентированных средах, допускающие «большие по амплитуде колебания нитроксила, приводящие к частичному 'среднению его магнитных параметров.

Спектры ЭПР радикалов в динамическом состоянии описываются вре» зависимым спин-гамильтонианом. При этом рассматриваются два случая изотрош вращающихся радикалов: 1) быстро с временем вращательной корреляции т<1 не и медленно с т>5 не. В первом случае величина т определяется из экспериментальш спектров ЭПР по формуле Кивельсона, куда входят отношение интенсивностей да; острых пиков триплетного спектра ЭПР и ширина линии одного из них. Во вторе случае величина х определяется более сложным образом по сдвигам крайних широк! пиков (КШП) в спетрах ЭПР иммобилизованного вида (Кузнецов А.Н., McConni Н.М., Freed J.H.). Зависимость сдвигов КШП от величины т находятся теоретическ после моделирования на ЭВМ спектров ЭПР. Важно отметить, что и в этом случае i экспериментальных спектров ЭПР берутся лишь три параметра: положения КШ для данного т и для т=2000 не (порошковый спектр), а также величину осгаточнс ширины индивидуальной линии. Эти известные подходы находят ограничение применение и применимы только х макромолекулам с жестко связанной епш меткой - случаю фактически не реализуемом на практике. Поэтому для любых 6 исключений спин-меченых макромолекул анализ спектров ЭПР нельзя счита-корректным, если он сводится к вычислению величины t по формуле Кивельсо! иди по однократно измеряемому от предельной величины сдвигу КШП [37,46,6] Анализ таких спектров является предметом данной работы и представлен последующих главах. Важно отметить, что во всех опубликованных работах по те» диссертации ни разу не вычисляется х по формуле Кивельсона.

На рис.1 схематически представлена классификация наиболее известь моделей поведения шпроксильных радикалов в различных статических динамических состояниях, для которых теоретически рассчитывается спектр ЭП Последней в этом списке представлена модель поведения нитроксильного радикала составе спин-меченых макромолекул, разработанная в данной работе.

2. Описание, динамической структуры спин-меченых биополимеров в растворе и: анализа их спектров ЭПР

В згой главе рассматривается общий теоретический подход для описаю движения спин-метки или спин-зонда, связанных с макромолекулой, находящейся растворе. Глава включает: 1) оценку эффективного времени вращательно корреляции сложной молекулы, 2) количественную меру описания быстрой по ЭП шкале анизотропной переориентации радикала относительно макромолекулы доказательство существования этой быстрой переориентации из независимь источников, 3) модель быстро вращающегося волчка на медленно вращающей« сфере и следствия из этой модели, наблюдаемые в эксперименте для спин-метки для спин-зонда, 4) теоретические номограммы по определению времен вращательной корреляции макромолекул и каталог спектров ЭПР, 5) особенной спектров ЭПР спин-меченых регулярных полимеров, влияние водородной связи и

Классификация доступных симуляции на ЭВМ спектров ЭПР для нитроксил содержащих образцов

1. Монокристалл разобщенных молекул спин-меток (нитроксилов).

2. Порошок монокристалла или замороженный при при 77 К водный раствор.

3. Квазистатический ориентированный липид в фосфолипидных слоях.

4. Неориентированные спин-меченые липиды в квазистатическом состоянии .

5. Спин-метка в водном растворе в случае быстрого изотропного вращения и медленного в вязкой среде.

6. Спин-меченые глобулярные белки: быстрый анизотропный ротатор на медленно вращающейся сфере.

Рис.1 Классификация моделей вращения нитроксильных радикалов, доступных теоретическому моделированию (симуляции) на ЭВМ. Во всех моделях симуляции в случаях [3,4,6] анизотропного вращения метки время корреляции метки т<0,1 не.

В случае [5.] изотропного вращения метки время корреляции изменяется во всей области изменений ЭПР шкалы времени, т.е. от 0,01 не до 2000 не. В случае [6.] время корреляции изотропно вращающейся сферы лежит в диапазоне от 3 до 2000 не.

полярности среды на распределение электронной плотности в нитроксиле ковалентно связанном с макромолекулой, а также краткое рассмотрение статическо) и динамической конформации самих шпрокснлов.

Динамика поведения шггроксильного радикала в составе спин-метки ковалентно присоединенной к макромолекуле, рассматривается с точки зрения дву. независимых процессов переориентации. Первый процесс определяете; подвижностью нигроксильной группы относительно макромолекулы, а второ] вращательным броуновским движением носителя. При интерпретации спектров ЭП1 спин-меченых макромолекул необходимо учитывать оба процесса, каждый к которых частично усредняет оба магнитных тензора нигроксильного радикала.

2.1 Процесс диффузионного вращения макромолекулы в растворе с жесткс закрепленным радикалом с точки зрения метода спин-метки с хорошей сгепеньк точности можно считать изотропным и строго описывать одной величиной • эффективным временем корреляции т^. По форме макромолекулы в раствор! можно отнести к трем типам (Рис.2): а) несферическим, динамическое поведенго которых описывается тензором вращательной диффузии с двумя компонентами I £>а, б) сферическим с Ва и в) молекулам с внутренней гибкостью. Все три случа) удовлетворяют неравенству:

* / < / < х± / Ь (!)

где: х = т1=1/6£>1, т„=1/6В„ и т„=1/6Д,

Коэффициент соответствует сфере того же объема, что и эллипсощ вращения. Из рис.3 видно, что обе величины тх и х([ могут только увеличиваться ( увеличением отношения осей а/Ь. Для эллипсоида вращения с Ои >ЗБ± сдам КШП, как показал Ргеес1(1974), будет таким же, как для сферы, вращающейся с временем корреляции т, а ошибка определения эффективного времени корреляцю не будет превышать 8%. Необходимо отметить, что форма биологически макромолекул такова, что редко когда соотношение осей для эллипсода вращенш превышает соотношение 3:1.

Ввиду того, что при медленном изотропном вращении макромолекулы с жеегке связанным радикалом крайние широкие пики в спектре ЭПР сдвигаются ш величину:

К=1Аг-2А', (2)

соответствующую величине т^, то го вышесказанного следует простой способ количественной оценки времени вращательной корреляции макромолекулы Допустим экспериментально определено ^зфф макромолекулы, динамическая структура которой неизвестна, и рассчитано т0 по формуле Сгокса-Эйнштейна для

данного молекулярного веса этой молекулы, ее плотности и сольватации, то тогда возникают три случая (Рис.4): а) если то , то макромолекула имеет не сферическую форму, а форму вытянутого эллипсоида вращения. Более того в этом

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ВРЕМЕНИ ВРАЩАТЕЛЬНОЙ КОРРЕЛЯЦИИ МАКРОМОЛЕКУЛ С ПОМОЩЬЮ РЕПОРТЕРСКИХ ГРУПП

КРАСИТЕЛЬ СПИН-МЕТКА

СЛУЧАЙ ЖЕСТКО СВЯЗАННОЙ МЕТКИ

2А22-2А* = с. Т -0

СЛУЧАЙ ПОДВИЖНО СВЯЗАННОЙ МЕТКИ

случае можно оценить ориентацию нитроксила по отношению к осям эллипсоида. Действительно, при ось X нитроксила параллельна большой оси эллипсоида,

а при ^зфф= т перпендикулярна ей; б) если х^ = т,, то возникает два случая, если

форма макромолекулы вытянута, то следует вывод о ее гибкости, а если имеет сферическую форму, то следует вывод о ее жесткости; в) если тэ^<т0, то

макромолекула, в независимости от формы, должна обладать в той или иной степени гибкостью.

Таким образом, ничего другого, кроме эффективного времени корреляции макромолекулы, методом спин-метки определить невозможно и ценность получаемой информации зависит от сравнения х^ с теоретической оценкой релаксационных свойств биомолекул в растворе, т.е. с х„.

Из величины сдвигов КШП (2) можно достаточно корректно определять время корреляции. В случае прочно связанного радикала с макромолекулой это время определяется из спектра ЭПР иммобилизованного вида по сдвигу КШП (2), а величина х вычисляется из следующей формулы (1.Ргеес1), применимой для диффузионного вращения нитроксила:

х = 0,54.(4)^, (3)

где сдвиг КШП равен: Дг = 2А2 - 2А', как в (2), а спектр ЭПР вычисляется для аксиально симметричного нитроксила с 2А2=32 Гс.

Весь опыт применения метода спин-метки говорит за то, что спин-метка, будучи ковалентно связанной с внешними боковыми остатками полипептидной цепи белка, не является жестко связанной с молекулой белка. Свидетельством тому является, впервые полученная в данной работе [10],' экспериментальная зависимость, показанная в Табл.1, расстояния между КШП (2А') в спектрах ЭПР спин-меченогс белка от вязкости раствора при постоянной температуре, на основании которой былг предложена другая формула, учитывающая этот факт [46]: _

-139

(4)

где: Дх = 2 А - 2А', (5)

т.е. теперь сдвиг КШП в спектре ЭПР оценивается по отношению к предельном) спектру ЭПР, в котором броуновское движение макромолекул "заморожено" (т = а подвижность метки относительно макромолекулы сохраняется. Параметр Я есп параметр упорядоченности, определяемый экспериментально:

Аг-о.

Все три величины А,,а0,А2 находят из эксперимента, как расстояния междз экстремумами крайних широких (узких) пиков в соответствующих спектрах ЭПР. Формулы (3) и (4) выведены для случая индивидуальной ширины линии 6=ЗГс.

Рис.2

Три типа форм макромолекул: вытянутый эллипсоид вращения с полуосями а и Ь, эквивалентная ему по объему сфера с радиусом Г и сферы, соединенные гибкими связями.

5 4

3 --

Vхо

I I I

1 2 3 4 5

а/Ь

Рис.3

Зависимость корреляции

отношения

времен

эллипсоида вращения к изотропному времени корреляции т0 сферы того же объема от отношения полуосей а/Ь.

Рис.4

эфф

П/Т

Схематическое представление сравнения экспериментальных величин времен

корреляции

эфф

с теоретически

рассчитанными по закону Стокса-Эйнштейна х0 для данной молекулы белка: 1) '1эфф>тО' эллипсоид вращения, 2) хэфф~^о' сФеРа ти

гибкий эллипсоид вращения, 3) хэфф<4, только гибкая макромолекула.

Главное отличие второй формулы от первой состоит в том, вводится в рассмотрение параметр Я, учитывающий хаотический стационарный процесс переориентации метки относительно молекулы белка. Теперь необходимо обсудить специфику этого процесса.

2.2 Описание хаотической, быстрой переориентации метки относительно макромолекулы, приводящей к частичному усреднению главных значений компонент обоих тензоров радикала, можно проводить различными способами согласно различным моделям вращения радикала.

Однако в любой модели, для получения частичного усреднения тензоров, необходимо математически выполнить операцию усреднения по времени следующего выражения (в дальнейшем все математические выкладки будут получены только для тензора А, которые для тензора ¡> абсолютно аналогичны, считается, что главные оси обоих тензоров совпадают):

А = Т~ХЛТ , (7)

где: А - диагональная матрица вида (1), след которой а0 =(ЛХХ + АГГ + Агг)/3 сохраняется при любых унитарных преобразованиях типа (2), а Т- оператор перехода из одной системы координат в другую для какого-то вполне определенного закона переориентации. В общем случае оператор Т состоит из 9 направляющих косинусов, определяющих положение системы координат Х,Г,2относительно Х',Т,Т\

с,, <42

т = Сп С21 С23

СЦ сээ у

Сгохастичность переориентации нитроксила проявляется в зависимости направляющих косинусов от времени. Усреднение по времени заменяется усреднением по угловому пространству, если выбирается конкретный характер движения нитроксила. Многие авторы, например, Зилиг, Гриффит, рассматривают такие случаи быстрой переориентации нитроксила, которые приводят оба тензора к аксиальной симметрии. Способ переориентации не конкретизируется, важно только то, что ось 2 упорядочивается в некотором направлен™, задаваемым средними величинами направляющих косинусов. Это может быть, например, вращение оси 2 нитроксила относительно оси 2 (тогда один из косинусов не зависит от времени, а два других приобретают некие средние значения) при беспорядочной переориентации двух других осей Хп У, как показано на рис.5.

Математически это означает, что формула (7) даст следующее выражение для параллельной компоненты тензора А, в котором участвуют только три направляющих косинуса: С31,С32,С33, оси 2нитроксила по отношению к осям Л", У, 2' \

= Сз1' Ахх + 4 ■ Ауу + 4 • А^ (9)

при необходимом условии:

4+4+4=1 . " (10)

Перпендикулярная компонента находится из условия существования аксиальной

(П)

симметрии и из условия сохранения следа тензора: (Ацх +Ау, +Аг2)/г = а„

при преобразованиях типа (7):

_'' (12) Таким образом вид усредненных в этом случае тензоров будет следующим:

А = = (1 - 4) • Ла + (1 ■- 4) ■ Ап+{ 1 - 4)'

% 0 «И '¡1 0 о"

0 Ах 0 , ¿ = 0 0

0 V 0 А, 0 ч 0

А =

Выражения (9) и (12) удобно переписать в параметрах упорядоченности _ _ _

с _з4-1

V 34-1

^у — Г »

подчиняющихся уравнению, из которых только два взаимонезависимы:

5", + Бг + Б2 = 0 ,

(13)

(14)

А = а» + з • (^л- ■ Ахх + ■ АУГ + ■ А2Х)

2 1Гл а° з" •

— А?*

А1 = а0 - у • (.У, ■ Аш + Ап + .Уг • ) = а0 -1 • &А ,

где: ДА = АА-Я7-5Л-(1-£2)-к и АЛ = А^ - *,

вводить зависимость 5Х и ¿у от дУ2 и вспомогательного параметра к в виде:

^ -[-5, -(1-5,Н 5$, +(1-^) к].

Такой подход приводит к тому, что экспериментально определенному параметру упорядоченности оси Z нигроксила:

(9') (12')

если

(15)

5 =

А,-А1 _ А,- а0

(6')

Аг ~ А± А2 - а0

ставится в соответствие величина теоретического параметра упорядоченности 32, согласно формулам (9') и (12').

Два независимых параметра и к связаны с двумя углами в, Ф, которые определяют положение оси Я (рис.5,6), следующим образом:

Эя =(Зсоз 0-1)/2, к^^'-ф) (131)

Рассмотрим второй случай, для которого возьмем конкретную модель -колебание нигроксила (т.е. его молекулярной системы координат) на угол а вокруг произвольной оси Л, как на рис.6.

Для этого случая необходимо воспользоваться оператором вращения молекулярной системы координат на угол 6, который имеет вид:

то есть:

Рис.5 Модель быстрых аксиально-симметричных вращений шггроксильного

радикала. X, - молекулярная система координат нитроксила. Х\ У,2' - лабораторная система координат или система координат, жестко связанная с макромолекулой. Я - ось вращения. Н - направление магнитного поля. а,р,у - углы (также как и углы 0,Ф), определяют положение оси 2 нитроксила. Эг = (3 со!!2 6 -1) / 2, к = #(45° - ф)

'1 0 (Г 'с, с, ctc2 С,С j' ' 0- С, cT

Т = cos5 ■ 0 1 0 + (1 - cos 5) • с2с, с2с2 С2Сj + sin5- c¡ 0 -c,

о 0 к с,с2 C3CJ , ГС 2 c, oj

(16)

где с, = cosa, с3 = eos р, с, = cosy есть уже направляющие косинусы оси вращения R

(17)

с соответствующими параметрами упорядоченности для нее: з • cf -1 ^ 3 ■ с,2 -1

2 2

Используя оператор вида (16), состоящий из суммы единичной, симметричной и кососимметричной матриц, нужно иметь ввиду,■ что система (8) ортогональна:

' з [0, если i , .

Ъс,с"=ЪС*С*= u>если«=* j {,>k=w)'

поэтому обратная матрица Т'х равна транспонированной Т и поэтому, если Т представлена в виде суммы матриц, то Г"1 сводится к сумме таких же, но уже транспонированных матриц. Направляющие косинусы сЛ матрицы (8) и косинусы оси вращения Л связаны с углом 6 следующими соотношениями: _ сп ~ сп п _ сп ~ сз| с _ С:1 ~ сп

с, =-

cos5=i(c11+cn+c33-l) (18)

28шб ' 2 2зт5 ' 3 2«т5 В результате операции (7) для оператора (16) получаем следующие усредненные по углу 5 при колебании нитроксила от -а до а диагональные элементы матрицы А: Аа = со*18-А„

cosS-(l - •eos5)-2c2 Ля +-

• Aa + c¡ Ayr +Сз-А22)-^ + (19)

Azz + Cj • Ayy) ,

cos6-(l- cos5) -2c\ - Ayy +

■A„ +c¡- An +c¡-Az)-c¡ + (20)

■ Aa + c,2 ■ Az) ,

Azz = cos2 5 • Ajz + cos5 • (l - cos б) ■ 2c] ■ A^ + + (1 - cos 5)г • (с? • Aa + c¡ ■ Ayy +c2-Ал)-с,2 + + (l-cos2 б)-(с2A„ + с2 ■ Ayy) . После интегрирования из 9 коэффициентов остается только 4:

(21)

X, = cos2 5 = —• j cos5 5 • dS 2a

1 (. sin 2a

v --ít sino 1 í, sin 2ct")

X2 = cos6-(I-cos5) =---- 1 + ——

a 2 V, 2a )

rr 7. T^í . ~ sin a 1 (, sin 2a ^ *3=(l-coS5) = 1-2—+ —J

Формулы (19-21) можно переписать через параметры упорядоченности оси R:

(22)

+ oi

-cL

R H

у.

-о*.

Рис.6 Модель быстрых осцидляций нитроксильного радикала.

X,y,Z- молекулярная система координат нитроксила. X1, T,Z' - лабораторная система координат или система координат, жестко связанная с макромолекулой. R - ось колебаний. Н - направление магнитного поля. а,р,у - углы (также как и углы ©,Ф), определяют положение оси R в системе X, Y,Z, вокруг которой колеблется широком, ос - угол колебаний шпроксила. = (з cos19 -1) / 2, к = tg(45° - ф)

лв = [*,+ +1) -Аа +

+ у■*,•[«. + §(Ла- + ^ +1)-

Ауу ~ ~ * ' " ^У + 0 *

+ •[«. +|■-(¿П я? + -5#) (2 ^/ +1)-

+ [(2.^+1)-^ +(2.^+1)-^] Да = *.+ +

+ ук3 ■ -(2• +1)-

(20')

(21')

2.3 Из этой общей модели усреднения диагональных компонент тензоров А и £, определяемых формулами (19',20',21') легко получить частные случаи.

Рассмотрим первый случай -колебание нитроксила от -тс до тс, что соответствует модели быстро вращающегося волчка. Тогда формулы (19',20',21') с учетом (15),(17) и (22) для а=я можно записать следующим образом:

Аа = а.■■ Ап + Я*. А,, ¿*.Аа).3* = а.+1-ААЛ-в*, Д* = о. +1• + • Ап + .)■ = а„ +1■.Й' ..

(23)

Все входящие сюда величины выражаются также, как и формулы (4') и (6'), с подстановкой вместо параметра упорядоченности £г оси 2 нитроксила параметра упорядоченности оси Д, например:

ДЛ^ = ДЛ^-бЛ-^-^)* (24)

Как видно из (18) колебание нитроксила от -тс до л не приводит магнитные тензора к аксиальной симметрии и лишь при к = 0, когда согласно (8) и (9):

(25)

V-*

с* _ г* _ г - "г _

формулы (18) сводятся к аксиально-симметричному виду: А, = <7„+|-Д/ф*)\

Из формул (26) следует (принимая во внимание, что — • ДЛ = Аг - ас) формула для

2 з"

параметра упорядоченности S (см.(б')):

s = AzA- = Az^ = (s«f (б-)

т.е. во второй модели усреднения в аксиально симметричном случае экспериментально определенному параметру упорядоченности S уже ставится в соответствие величина теоретического параметра упорядоченности оси Ü в квадрате, т.е. . Это очень важный впервые полученный вывод [70].

Рассмотрим второй частный случай - колебания системы координат X,Y,Z вокруг той или иной оси X,Y,Z , т.е. формулы (14,15,16) соответственно преобразуются в хорошо известные формулы (см., например, Grifíith).

Так при с, = 1 или = 1 в-.

Ая = (K¡ + + Хз)' Ахх = Ахх

1 - f А л- г л - + . ~ ^zz ^^а

лп - Л, • 1- Л4 ■ Л22--- h - 2а

7 .С ( , у А _ А72 + АП . AZZ ~ 4т SÚ! 2а лzz ~ Л1 ' Azz 4 лгг ~

При c¡ = 1 или S" = 1 в:

(27)

2' 2 2а

г - *

v t Ауг + -^TZ . АГГ ~ Ату sin 2а

"xr "i "хг ' "zz 2 2 2а

=(Jf,+2A:,(28)

1 - ir /1 i у л - ^zz + , -^zz ~ Ахх sin 2а лш - Л1 ~л22 + 4 -^хг ~-j- -2---2сГ~

При с3 = 1 или S§ ~ 1 в:

Ахх + Aiт . Лг - ^jt sin 2ct

Лст - • + К4 ■ Ап - ■

2 2 2а

(29)

^ = + 2ЛГ, + • Дд = А&

Соответствие теоретических величин или ('У!)* экспериментально

подученной величине 5 выявляется лишь в том, что только экстремумы КШП совпадают в обоих теоретическом и экспериментальном спектрах. Этому соответствует наиболее вероятное состояние дм нитроксила спин-метки, дающее моноспекгр ЭПР с КШП. В этом случае расстояние (2А')тго/: соответствует (2А')ха1.

Таким образом, все многообразие теоретических моделей, имеющихся в литературе, можно свести к двум основным моделям, представленным выше. При этом, во всех случаях сдвиг КШП в спектрах ЭПР из-за быстрой переориентации метки должен быть равен:

Д* = 2А2 - 2А (30)

Это означает, что большое количество скачков нитроксила из-за рельефа на поверхности биополимера и химической структуры спин-метки группируется в некотором направлении, фактически задавая наиболее вероятное направление псевдооси (директора) преимущественного вращения оси Ъ нитроксила или колебания всей молекулы нитроксила. Переключатели и к служат для математического описания существования других возможных направлений "псевдоосевых вращений" нитроксила, принимая во внимание весь ансамбль спин-меченых макромолекул.

Равномерное распределение скачков вокруг директора обуславливает за временные ворота метода аксиальную симметричность частично усредненных тензоров. Временные ворота, как известно, задаются анизотропией А и £ тензоров, что схематически можно представить прямоугольным окном со сторонами АА = - Ах и l^g = gx-gz^ переведенными в шкалу времени, как 10 и 30 не соответственно для Х-диапазона и для 2-мм диапазона 10 и 2 не.

Таким образом, быстрая хаотическая либрация нитроксила относительно молекулы белка такова, что оставшаяся после частичного усреднения тензоров их анизотропия фактически является тем инструментом (временные ворота), с помощью которого определяется т макромолекулы. Чем больше компоненты тензоров будут усреднены (или чем больше величина 51 будет отличаться от 1), тем меньший диапазон т, отсчитываемый от предельной величины 1000 не, доступен измерению. На рис.7 приведены теоретические "температурно-вязкостные" зависимости, которые нужно сравнивать с экспериментальными, дая расстояний между КШП (2А') в иммобилизованных спектрах ЭПР, симулированных на ЭВМ. Постоянная величина .У для каждой прямой соответствует постоянной температуре меняется только т при изменении вязкости раствора т|. Из эксперимента следует, что получение зависимости величины 2А' от вязкости при постоянной температуре является необходимой основой для расшифровки спектров.

В принципе невозможно теоретически предсказать вклад в общее частичное усреднение тензоров отдельно от величины х или от величины 5.

Осевое вращение радикала приводит фактически к двухкомпонентному тензору. Либрационное движение нитроксила, как частный случай, может включать колебательное движение, приводящее к трехкомпонентному тензору. Самое простое из таких движений это вращение вокруг осей молекулярной системы координат. В этом случае формулы усреднения будут следующими (см. также формулы (28)):

Ау=А, (31)

2000 (пв) 20 7

(т-0.74)хМ0

Рис.7 Теоретические "температурно-вязкосгные зависимости" расстояний между экстремумами КШП (2А'). Повышение температуры снижает параметр Л. Повышение вязкости раствора увеличивает время вращательной корреляции т макромолекулы.

„ , sin 2a где: P = 1 + —-

Таким образом, обе модели, описывающие частичное усреднение компонент тензоров, представляются, как частный случай более общей модели поведения нитроксила, соверщающего колебания на угол ±а вокруг оси К, положение которой задается ее направляющими косинусами или параметрами 5 и к (см. Рис. 6).

2.4Наиболее вероятная величина параметра 51 определяется только экспериментально по предложенной здесь оригинальной методике, дающей возможность оценить броуновское вращение макромолекулы (или ее доменов), несущей метку. В Табл.1 была показана схема температурно-вязкосгной зависимости расстояний между эктремумами КШП. Линейность этих зависимостей в указанных координатах при больших вязкостях нарушается, поскольку нарушается условие быстрых переориентаций нитроксила. Продолжение линейных зависимостей до пересечения с осью ординат дает величины 2А, по которым рассчитываются параметры Я для каждой температуры.

Величина параметра равного величине для модели вращения оси Ъ нитроксила или равного величине для модели осевого вращения нитроксила,

как целого, определяется экспериментально только по положению экстремумов КШП. Тем не менее форма линии КШП и центральной части спектра описывается набором значений .У и к. В ранних работах теоретически параметр 5 представлялся как произведение двух других параметров упорядоченности: относящегося к ориентации оси преимущественного вращения оси 2. нитроксила по отношению к осям и относящегося к переориентации оси 2. нитроксила в объеме

конуса с раствором угла при вершине 2а и осью, совпадающей с то есть:

где £ - угол между осью Т, неподвижно связанной с макромолекулой, и осью конуса, а параметр упорядоченноси 5 как:

где a - половина угла при вершине конуса, в котором переориентируется ось Z нитроксила ( 0 < a < 90 ).

Введенная конкретизация быстрого анизотропного вращения нитроксила позволяет наглядно пояснить существование гетерогенности формы линии экспериментального спектра и ряд других его особенностей, как результат случайного характера переориентации нитроксила, приводящего к распределению плотности вероятности параметра S от угла Е, (модель "пшеничного поля", Griffith, 1975) и параметра S от угла раствора конуса 2а, принимая во внимание пределы изменения параметров упорядоченности, входящих в формулу:

(33)

При этом параметр упорядоченности S определялся как: S„ = (3cos2&-l)/2

(34)

SKaH =(cos2a + cosa)/2

(35)

(-1/2 < 5 <1) = (-1/2 < <1) (0 < ^ <1) " (36)

Из формулы (14) видно, каким образом вводится в рассмотрение разброс в величине 8 по ансамблю спин-меченых макромолекул. Разброс характеризуется числом возможных быстрых переориентации спин-метки, ограниченных временными воротами, задаваемых анизотропией СТС и g-фaктopa радикала, который и приводит к различию в характере усреднения компонент обоих тензоров.

Оба стохастических процесса (медленный и быстрый) происходят одновременно и ввиду их независимости аддитивно производят сдвиг КШП в спектрах ЭПР. Ввиду этого мы приходим к тому, что суммарный сдвиг КШП нужно представлять в виде:

А = 2Аг - 2А' = (2А2 - 2А) + (2А - 2А') = Д5 + Дт (37)

где: Л5 и А* есть выражения (30) и (5), полученные выше, при рассмотрении влияния каждого из двух стохастических процессов на сдвиг КШП.

Сдвиги А® и А" легко определяются из температурно-вязкостной зависимости, представленной в Табл.1. Для спин-зондов имеет место обратный загиб изотерм при больших вязкостях.

Подстановка частично усредненных, аксиально симметричных тензоров # и А в стохастическое уравнение Лиувилля р.Ргееё) для описания броуновского движения нигроксила, с последующим вычислением ЭПР спектров, приводит при соблюдении постоянства шпура дам обоих тензоров к функциональной зависимости сдвигов КШП в спектре от х макромолекулы и параметра упорядоченности Б (см.Рис.8):

х-5" = с-(А (38)

где: = (см.(6)), то есть

Л _ А _ А_~ ао

^ жен

А2 ~А А2 - а. А1 - а0 Коэффицекты а и Ь находятся из теоретических номограмм (Рис.8) методом наименьших квадратов. В результате получен рад формул:

т • .У - 197 ■ (лт/5) и9 (39)

в диапазоне 10 не < х < 2000 не, с 5#=ЗГс,

х-5' = 80-(дт/^Г (40)

в дапазоне 5 не < х < 10 не для КШП и

х-5' = 85-(дт/5,Г^ (41)

в диапазоне 5 не < х < 40 не и 0,5 < 5 < 0,8 для ВШП.

Модель количественно точно описывает положения КШП в спектрах ЭПР, а также качественно выявляет некоторые основные особенности формы линии центральной части спектра при определенных условиях, легко осуществляемых на практике. Благодаря этому создается возможность получать, как в методе спин-метки, так и в методе спин-зонда однозначную информацию.

20 10 5.0

, С

1.0

0.1

о 1.0 а 0.9 д 0.8

' ' 11111^1111111111 I I .. I . I .!.,.!■■,,•, ,

1000

100

Т ПЗ

Рис. 8 Номограмма по определению времени вращательной корреляции макромолекулы из величины сдвигов КШП (дт =2 А - 2 А') и

ВШП (Ь\=2А1_-2А[) и величины параметра 5.

Следствия, вытекающие из предлагаемой модели, следующие:

1. Если параметр .SM, то метка "жестко" связана с белком. При этом может сохраняться быстрое вращение оси Z нитроксила вокруг оси Z', или иначе должна сохраняться переориентация оси Z нитроксила в пределах конуса с углом при вершине в 20° (или с S= 0,95). В результате экспериментальная линейная зависимость (Табл.1) 2А' от (r/i/)"'74 с увеличением вязкости среды при постоянной температуре должна стремиться к величине максимально возможной величине 2Ах (т.е. к 2А = 2AZ ) с наклоном, задаваемым величиной т.

2. Если параметр 5<1, то линейные зависимости (Табл.1) 2А' от вязкости должны располагаться параллельно со сдвигом, зависящим от величины S, и иметь характерное отклонение вверх (загиб) в области больших вязкостей для спин-меток и отклонение вниз для спин-зондов, а при экстраполяции прямолинейных участкоЕ давать величины 2 А .

3. При т>2000 не сдвига As практически нет, прэтому наклон изотерм должен отсутствовать (Табл.1). При больших вязкостях прямые параллельные оси абсцисс пересекаясь с осью ординат, должны давать 2А. Эти точки пересечения можнс получать экспериментально путем связывания спин-меченого белка с адсорбешт или используя сшивающий белки реагент.

4. При т<5 не в спектрах ЭПР спин-меченых макромолекул КШП должнь отсутствовать уже при ¿"=0,8.

5. Ширина крайних широких пиков, особенно высокопольного, превосходит, ] зависимости от температуры и вязкости среды, ширину индивидуальной линии ЭП1 сигнала нитроксила в растворе в 2-3 раза, что является следствием суперпозицш спектров ЭПР.

Все зги следствия подтверждаются экспериментально на большом количеств разных биологических образцов.

2.5 Существование быстрой переориентации радикала относительн макромолекулы к настоящему моменту подтверждается, многочисленными данным: ЯМР спектроскопии, поляризации люминесценции, рентгеновской спектроскопии. ] результате присоединения спин-метки к концу того или иного аминокислотног остатка белка, боковая группа удлинняется, а спин-метка подвергается еще боле интенсивному стохастическому процессу, приводящему к укорачиванию анизотропной переориентации нитроксила по сравнению с т немодифицированно концевой группы. Величины х атомов боковых групп по данным ЯМ спектроскопии, например, для ингибитора трипсина сотавляют от 0,01 до 0,4 не.

В случае длинных полимерных молекул синтетического или биологически происхождения сегментальная подвижность полимера рассматривается аналогичн изотропному движению глобулярных белков. С помощью метки, связанной с боковс группой полимера, измеряется изотропное в первом приближении эффективне

время вращательной корреляции сегмента полимера и характер подвижности боковой группы. Но есть характерное отличие - метка равновероятно присоединяется по длине полимера (в середине или на его концах) и поэтому будет иметь разную амплитуду переориентации. Следовательно, в зависимости от положения метки на регулярной полимерной цепи спектр ЭПР спин-меченого полимера будет отражать некое распределение величин т и 5. В результате это должно приводить к уширению линии в суммарном спектре из-за суперпозиции спектров, от каждого кластера (или скопления спин-меток), каждый из которых соответствует одному определенному набору параметров 1иХ

Спектры ЭПР нитроксильных радикалов чувствительны не только к молекулярным движениям, но и к полярности среды, в которой они растворены, а гакже к динамике образования водородной связи. Как правило, метки, модифицируя боковые группы биополимеров, экспанированы в раствор, поэтому величине а0 радикала будет постоянна и соответствовать полярности водной среды. Наличие водородной связи радикала с молекулой воды через >N-0 группу или с другими протонодонорными группами белка может значительно увеличивать величину а0 радикала. Это увеличение тем больше, чем больше время существования водородной :вязи.

Известно, что широксилы с пиперидиновым и пирролидиновым циклом имеют эазную структуру. Для тггроксилов с 5-ти членным циклом существует плоская информация, с 6-ти членным циклом конформация "кресло", в которой угол между :вязью >N-0 и плоскостью нитроксильной группы составляет 17°. В динамическом состоянии происходит быстрая инверсия "кресло-кресло", которая приводит к юбавочному уширению линий в спектрах ЭПР. Наличие водородной связи с >N-0 -руппой нитроксила или нахождение образца при низкой температуре, начиная с -100° С и ниже, уничтожают инверсионный процесс.

3. Процедура проведения эксперимента методом спин-метки

3.1 После получения спин-меченого образца и записи его ЭПР спектра в буферной среде при комнатной температуре, расшифровку спектра нужно начинать с эксперимента по изучению его формы линии от вязкости среды, при постоянной температуре путем добавления сахарозы, поскольку из одного единственного жспериментального спектра невозможно получить корректно информацию о щнамике поведения метки и ее носителе. Для однозначной расшифровки жспериментальные спектры должны содержать КШП. Если таковых нет при •емпературе 20°С, то необходимо снижать температуру вплоть до 0°С. Если и при »той температуре еще нет ярко выраженных КШП, то необходимо добавлять сахарозу го тех пор, пока они не начнут появляться.

3.2 Для" определения главных компонент магнитных тензоров | и А гредлагается следующая процедура. Записать спектр ЭПР от свободной спин-метки в

буфере при концентрации не более Ю-4 М и, измерив расстояние между крайними острыми пиками, определить 2а„. Записать спектр ЭПР образца при 77°С, чтобы из этого "порошкового спектра" определить 2Аг и найти сумму: (Аж + Аг) = Зд0 - Аг. Из этого же спектра определить g0, вычислив первый момент спектра (РИЬго\у, 1980). Далее, принимая =2,0022 и зная я, легко получить другую сумму: + ) = 3£„ - . Далее величины gx и Ах подбираются в процессе симуляции

спектров.

3.3 Записать при постоянной температуре спектры ЭПР образцов, в которых создается различная вязкость, путем добавления сахарозы. Из спектров измеряется 2А', расстояние между КШП, и строится зависимость этого расстояния от (Т/т\)0'74. Из этой зависимости определяется необходимые динамические параметры в том числе 2А и параметр 51, рассчитываемый по формуле 5 = (/4 - -о„)> а затем

рассчитывается время корреляции х по формулам (4, 39-41), считая величину S, найденную по экстремумам КШП, как наиболее вероятную.

4. Процедура симуляции ЭПР спектров

Как упоминалось выше однозначное моделирование ЭПР спектров спин-меченых молекул возможно лишь в том случае если из эксперимента определены величины тиХ Далее поступают следующим образом:

4.1 Необходимо выбрать сначала одну из моделей усреднения диагональных компонент обоих тензоров. Таких моделей две: аксиально-симметричная и колебательная, т.е. , соответственно, вращение оси Ъ нитроксила и колебание всего нитроксила относительно оси преимущественного вращения. Выбор модели проверяется при однократной симуляции спектра для величин Лит, подбирая компоненты тензоров, ширину индивидуальной линии и величину к. Затем для каждого случая рассчитывается набор спектров ЭПР, каждый из которых соответствует определенному кластеру. Кластер сответствует одному типу нитроксильных радикалов из всего ансамбля спин-меченых молекул в образце, е котором все радикалы имеют одни и те же величины .У и к.

4.2 Плотность вероятности распределения кластеров представляется в виде Гауссовых распределений:

2 к.-к0

е 2 а -Л . к

.^к-] (41)

р (42)

Ру - вес соответствующего ц-класгера в суммарном ЭПР спектре пр!

фикированном угле осцилляций а. Величины и к„ определяют положение ом

преимущественного вращения нитроксила в системе координат связанной с глобулой белка (см. Рис.5,6).

рп - вес соответствующего п-кластера в суммарном ЭПР спектре при фиксированных величинах 5„ и к„. а0 - величина наиболее вероятного угла осцилляций нитроксила.

Тогда теоретический спектр ЭПР представляется в виде:

Яр'* =2Р

•5С (43)

I п

р, =1

- есть симуляционный спектр, полученный суммированием по большому числу кластеров. Этот спектр уже передает все особенности экспериментального спектра. Параметры распределений подбираются в процессе симуляции.

5 Сравнение трех методов изучения вращательной релаксации макромолекул и динамических параметров их боковых групп

В данной главе проводится сравнение метода спин-метки с методами поляризации люминесценции (Табл.1) и ЯМР, которые применяются к изучению вращательной релаксации макромолекул [37]. Для этого необходимо кратко привести основные соотношения и уравнения, использующиеся в методах.

5.1 В методе поляризации люминесценции, при параллельной и перпендикулярной ориентациях красителя по отношению к падающему поляризованному свету для случая жестко связанного красителя с неподвижными хаотически распределенными глобулами белка, величины /и и Г1 соответственно являются компонентами интенсивности испущенного поляризованного света. Если размораживается связь красителя с белком, то за счет быстрой, ограниченной по углам переориентации красителя обе компоненты, частично усредняются и ггановятся равными величинам /„ и Т1. Если в свою очередь размораживается и эроуновское движение молекул белка, то обе компоненты уже становятся величинам :о штрихом /,', и 1[ .

Тогда степени поляризуемости красителя определяются как:

Р - ~ ^ р - ~ ^ р< - I» ~

~ /„+/;' ц+п

При этом максимальная амплитуда быстрой угловой переориентации красителя зтносительно молекулы белка характеризуется величиной:

У = Щ^Щ (45)

1/Р-1/3 ^ '

Величина Р определяется непосредственно из эксперимента, а величина Р определяется путем экстраполяции линейной части зависимости 1 / Р' от Т/т) при г1->со. Аналитически эта зависимость представляется уравнением Левшина-Перрена-Вебера, в которое входит время вращательной релаксации р=3т и время жизни возбужденного состояния красителя т0:

В табл.1 (нижний рисунок слева) приведен характерный график зависимости —

от вязкости раствора, в котором находится иммуноглобулин О, меченый красителем Экстраполяционную величину Р на графике можно представить в безразмерною виде:

И не случайно вид этой формулы аналогичен формуле для параметр; упорядоченности 5, см. (6'). Величине У можно сопоставить некий угол, в которок^ происходят быстрые колебания красителя.

Таким образом, в обоих методах графики зависимости текущей величины (—

или 2А') от вязкости раствора при постоянной температуре сходны, а из аналитические выражения эквивалентны. Обе зависимости отражают общую и самук главную закономерность "вращательного" движения репортерской группы - красител) или спин-метки - участие в двух независимых стохастических процессах углово! переориентации: быстром анизотропном относительно глобулы белка и медленно\ изотропном вместе с белком. Действительно, работа [21] по применению обои; методов к иммуноглобулинам А и М подтверждает теоретический подход.

5.2 В методе ЯМР, при рассмотрении поведения боковой группь макромолекулы, прибегают к аналогичному подходу при интерпретацш экспериментов по ЯМР релаксации того или иного ядра в составе этой группь [Ыррап, БгаЬо, 1983 и Федотов В.Н, 1978, 1985]. Магнитная релаксация концевоп ядра в боковой цепи макромолекулы определяется угловыми флуктуациями вектор; концевого звена "метки". Очевидна аналогия со спин-меткой, присоединенной ] концевой группе бокового радикала. Если величины эффективного времен] корреляции (хм) процесса переориентации этого вектора относительн« макромолекулы и времени вращательной корреляции (т) самой макромолекул! удовлетворяют условию: т„ « х, то можно оба процесса считать независимыми ] представлять общую корреляционную функцию всего процесса переориентаци: вектора относительно лабораторной системы координат в виде произведения

(46)

у _ А: 1±

(47)

С.(/) = С(/)-Ся(/)

(48)

где: =

(49)

корреляционная функция изотропного движения макромолекулы, а

(50)

корреляционная функция анизотропной угловой переориентации вектора концевого звена относительно системы координат (Х',Т,£), жестко связанной с макромолекулой.

Форма представления корреляционной функции (49) в виде экспоненты является общей и для методов спин-метки и поляризации люминесценции. В то время как функцию (50) необходимо представлять серией экспонент, если сложное движение вектора описывать марковским стохастическим процессом. Точный вид этой функции будет зависеть от той или иной выбранной модели движения вектора. Поэтому, используя безмодельный подход, можно резко упростить задачу, представляя функцию (50) в следующем виде:

начальное (при 1=0) и ассимптотическое (при 1=°°) значения которой не зависят от модели быстрого движения метки. В аксиально симметричном случае величина 5 имеет смысл параметра упорядоченности, такой же как и в других методах.

Комбинируя уравнения (48), (49) и (50'), легко получить общую корреляционную функцию:

где х;1 = х"1 + тм'.

Таким образом, в ЯМР экспериментах по протонной релаксации движение концевого вектора боковой группы в молекуле белка описывается аналогично тому, как в ЭПР методе движение спин-метки на конце аминокислотного остатка описывается тремя эффективными величинами: т, 8 и тм. Но если в ЭПР методе величины т и Э оцениваются непосредственно из эксперимента, то в ЯМР методе эти величины находятся из выражения для спектральной плотности, соответствующей корреляционной функции (51):

через которую в свою очередь по известным формулам выражаются экспериментально полученные времена продольной и поперечной времен релаксации (Т[, Т2) и величина ядерного эффекта Оверхаузера. Определяя экспериментально эти величины, вычисляют величины т и тм с помощью фурье-преобразования. Эту довольно громоздкую процедуру можно также как и в двух предыдущих методах осуществлять в случае наблюдения за релаксацией ядер в зависимости от вязкости среды при постоянной температуре.

(50')

(51)

(52)

Во всех работах по ЯМР, в которых определяются величины т и легко видеть, что диапазоны их изменений равны, соответственно, от 2 до 160 не и от 10 до 160 пс при нормальных условиях. Разница метода ЯМР по сравнению с ЭПР состоит лишь в том, что число переориентации метки за временные ворота одного метода по сравнению с другим в 20-100 раз больше. К этому нужно добавить, что в методе ЯМР-релаксации протонов наблюдение неизбежно проводится сразу за всеми протонами внутренних и внешних боковых групп, что приводит к несколько завышенным величинам т.

Таким образом, симуляция спектров ЭПР является необходимым инструментом получения дополнительных статических и динамических параметров, строгим доказательством правомерности выбранного теоретического подхода.

б. Материалы, методы и полученные результаты по каждому объекту исследования.

В этой главе дается список всех объектов, исследуемых в данной работе, а также все спин-метки, представленные в Табл.2 и 3.

Основной метод - ЭПР спектроскопия. Использовались методы импульсной и стационарной поляризация люминесценции, видимой и УФ спектроскопии, метод кругового дихроизма.

Ферменты: Ь-Аспартат-2-оксоглутарат-аминотрансфераза (ААТ, трансаминаза) -фермент (КФ 2.2.6.1), молекула которого состоит из двух субъединиц с мол.весом 90000 Дальтон. Пиридоксаль-5'-фосфат - кофермент. Впервые установлено, различие в динамических свойствах изоэнзимов аспартатаминогрансферазы, полученных из сердца свиньи и курицы [4-9,45]. Обнаружена гибкость не только димера молекул этих ферментов, но и составляющих ее мономерных субьединиц. По спектрам ЭПР ковалентно присоединенных спин-меток обнаружено обратимое локальное конформационное изменение в районе остатка Су5-45 мономера аспартат аминотрансферазы на стадии образования комплекса Михаэлиса. Моделирование спектров на ЭВМ показало, что конформационное изменение связано с ограничением объема, в котором переориентируется метка, из-за сдвига малого домена. С помощью спин-меченых аналогов витамина В^ (Табл.3) проведена оценка расстояний от БН-группы остатка цистеина-390 фермента до центра, связывающего а-карбоксильную группу (5 А), и до кольца пиридина кофермента (8А).

Фосфорилаза Б. Впервые детально проанализирован процесс связывания субстратов ингибиторов с ферментом фосфорилазой Б по наличию локальных конформационных изменений в белке [20]. Проведен анализ сложных по форме экспериментальных спектров путем сравнения их с моделированными иа ЭВМ спектрами, доказывающий существование в них суперпозиции, и показано, что добавление глюкозо-6-фосфата угнетает подвижность только одной из двух БН-групп, алкилированных спин-меткой на основе йодацетамида, в обоих мономерах белка.

л:н2-с-мн

исн2-с-мн-сн2-с-мн

1=0

л;н2-с-мн

N I.

N исн2-с-сн2 сн3

I •

НдС!

С=СН2 16 НдС1

Таблица 2 Спин-метки

ноос-сн-сн2-сн2-соон

° нСО НО-росн2 ' он

N сн3

ноос-сн-сн2-сн2-сн2~соон

о 1

N сн3 20

но-росн

N"0

N сн3

Таблица 3

Спин-меченые аналоги пиридоксаль-5'-фосфата

Рибулозофосфат карбоксилаза; Протеинкиназа. Обнаружены два типа SH-групп, обладающих разной подвижностью относительно белка в протеинкиназе и рудифкарбоксилазе. Существование подобных типов есть следствие белков с четвертичной структурой 128,36,30,35].

Сывороточный альбумин быка (САБ) - белок сыворотки крови, молекула которого состоит из одной субьединицы с мол.весом 67000 Дальтон (Lowson, Serva, Fluka). На этом белке проверялись все типы спин-меток, алкилирующих SH-группы. Впервые новый подход применен для расшифровки спектров ЭПР спин-зондов карболинового и бензокарболинового ряда, адсорбированных на молекуле сывороточного альбумина [15,23]. Доказано существование быстрой ограниченной по углам переориентации спин-зонда, адсорбированного на гидрофобном участке альбумина. Показано в частности, что набор далеко отстоящих друг от друга прямолинейных участков в температурно-вязкосгных зависимостях обусловлен частичным усредне-нием магнитных параметров за счет быстрой переориентации зонда, сохраняющему полярность водной среды. Показано, что ртуть содержащие спин-метки ковалентно связываются в две стадии с цистеиновыми остатками молекулы сывороточного альбумина в растворе [37,64]. Быстрый процесс происходит за время меньше 1 млсек, а медленный за 40-60 млсек обусловлен дополнительным конкурентным процессом связывания радикала с гидрофобной площадкой белка. С помощью спин-меток разной' длины, присоединенных к одной и той же SH-rpyrme БСА, установлено постепенное увеличение гибкости молекулы БСА при снижении рН от нейтральных значений до рН2,5 и одновременное увеличение стерических ограничений со стороны белка движению цистеинового остатка [37]. Показано также, что частичное усреднение магнитных параметров связано с изменением объема вращения радикала, увеличивающегося с его длиной, а не с изменениями полярности окружения нигроксила. С помощью спин-метки длиной в 14 А установлен факт близкого расположения гидрофобной площадки белка к его SH-rpyime [25].

Белки главного комплекса гистосовмесгимости классов I и II. Введением спин-меток по пептидной и углеводным частям белков определялось их время вращательной корреляции. Подтверждена определенная гибкость структуры белков обоих классов, и выявлено, что белковая часть белка намного превосходит ту часть белка, которая содержит углеводную компоненту [49,50,56].

Нейротоксин. Спин-метка 3 в Табл.2. Впервые на количественной основе проведена оценка подвижности спин-метки на пяти лизиновых остатках и измерено время корреляции белка [33]. Остатки Lys-25 и -26 самые иммобилизованные, Lys-44 и Lys-45 самые подвижные, а остаток Lys-15 имеет промежуточную подвижность.

Иммуноглобулины G, А и M и их фрагменты. Спин-метки 3,6,8 в Табл.2. Раскрыты новые в качественном и количественном отношении потенциальные возможности метода спин-метки, позволяющим решать целый ряд биологических

задач недоступных для ранее используемых методов. Степень подвижности домен различна, если он находится в составе Рс-области или Рс-фрагмента того или иног< класса иммуноглобулинов [12,47-49]. Динамическая структура Рс-фрагменг проявляется еще и в том, что СООН-концевой домен рИс' тяжелых пептидных цепе! также обладает гибкостью, включая составляющие его домены. Исследована сложна динамическая структура молекулы иммуноглобулина М [42,59]. Показано, что результате необратимого конформационного перехода при рНЗ происходи уплотнение структуры ИгМ в основном за счет Рс 5 -области, сопровождающееся локальными конформационными изменениями в РаЬ-обласги, что проявляется большей подвижности углеводных групп в РаЬ-обласги, чем в 5-области, где метк прикреплена к домену Сц 3. Структура Рс 5 фрагмента, выделенного из ИгМ

становится более лабильной по сравнению с интактной молекулой, как в пептидной так и в углеводной части белка. Из анализа спектров ЭПР спин-метки, селектив» введенной по единственному углеводному остатку РаЬ-обласги молекулы ^М установлено, что он обладает высокой пространственной мобильностью [54] Установлено различие в гибкости молекул преципитирующих ]

непрецигоггирующих антител свиньи с помощью спин-метки на основ триазинилхлорида, которая для этого белка связывается с его активным центром Обнаружен и исследован медленный (в течение нескольких минут) процео обратимого конформационного изменения в молекулах антител из свиньи (клао ДО) после быстрого добавления антигенов [18]. Локальное конформационно изменение происходит вдали от активного центра в районах двух различны аминокислотных остатков, к которым прикреплена спин-метка. Обнаруже] низкомолекулярный белок, связывающийся с Рс-областью или Рс-фрагменто» антитела кролика против сывороточного альбумина [38]. При образованш преципитирующего комплекса антитела с антигеном происходят структурны изменения в Сн2-домене Рс-области, наблюдаемые по спектрам ЭПР спин-метки введенной в углеводную часть домена, и приводящие к высвобождении

низкомолекулярного белка.

Обращенные мицеллы, хлоропласта. По спектрам ЭПР содержащих нитрокси цвитгерионов, солюбшшзированных обращенными мицеллами, установлено сильно-взаимодействие молекул зонда с поверхностью мицелл [39,40,43]. При этом зон, оказывается локализованным главным образом на границе раздела между водной ] углеводородными фазами.. Установлено также, что молекулы спин-меченоп сывороточного альбумина, включенного в мнкроэмульсишшые капли, претерпеваю значительные конформационные изменения. Исследована молекулярная динамик водорастворимого фактора хлоропластов (СР1) при активации фермента [51,63] Обнаружена методом спин-метки сегментальная гибкость молекул!

неактивированного фермента, исчезающая при активации, с последующим увеличением количества ЭН-групп, доступных для модификации спин-меткой.

Синтетические полимеры и полирибонуклеотиды. Впервые с помощью нового подхода определена сегментальная гибкость спин-меченых синтетических полимеров: поливинилпирвдина, поливинилкапролактама и терефталоилхлорида, содержащего спин-меченый 1,10-декандаол [26,27,34,41]. Показано влияние длины боковых групп, несущих радикалы, и жесткости прикрепления их к сегменту полимеров на спектр ЭПР. Изучена динамика олигорибонуклеотидов поли(Ц), поли(А), поли(С) и их комплексов [46,60]. Показано, что сегментальная подвижность полимеров резко »висит от рН и температуры. Оказалось возможным по форме КШП в спектрах ЭПР эценить соотношение находящихся в динамическом равновесии комплексов толи(ииА) и поли(ААТ-Г), состоящих из трех нитей и впервые методом спин-метки юказать образование трсшитчатой полинуклеотидной спирали поли(АА11) [601.

Гистоны и ДНК. Исследована динамика поведения молекулы гистона Н| в растворе отдельно и в комплексе с каталитической субъединицей протеинкиназы из .юзга свиньи [24]. Подтверждено существование гибкости молекулы гистона Н( и юказано, что комплекс молекулы гистона с каталитической субьединицей также гредставляет собой гибкое образование. При этом в процессе комплексообразования юдвижность спин-метки, присоединенной к остатку тирозина, заметно ■величивается. Показана возможность наблюдения связывания спин-меченых истонов Н] и Н2Ь с ДНК.

Рибосомы. Исследована температурно-вязкостная зависимость метки 5 (Табл.2) [рисоединенной к БН-группам этого огромного белкового образования [61]. )казалось, что метка присоединена к жесткой молекуле огромного молекулярного еса при этом выполняется следствие 3 раздела 2.4, то есть расстояние между КШП в пектрах ЭПР при изменении вязкости среды не измеяется [37].

Как было показано в главе 2.1 время корреляции макромолекулы сравнивается с соретическим для соответствующего ей молекулярного веса, как на рис.4. На рис.9 плошной прямой показана стоксовская зависимость времени корреляции акромолекулы от ее объема (или молекулярного веса) и отложены времена орреляции, приведенные к нормальным условиям, для всех макромолекул, сследуемых в данной работе. На рисунке легко различать три случая динамического введения макромолекулы в растворе в зависимости от аллипсоцдальности, есгкости и гибкости ее формы.

7. Примеры изучения дюодтческих и структурных сеойстз спин-меченых глобулярных беякоз в локальных информационных изменений в них. этой главе первым га спин-меченых объектов исследования рассматривается злекула гемоглобина. Гемоглобин человека - белок с мол.весом 64000, молекула ггорого состоит из 4-х субьединтщ (две а и две р) [3,37], а молекула гемоглобина

речной миноги [65]из одной субьединицы. Форму тетрамерной молекулы с большой степенью точности можно рассматривать, как сферу, вращательное движение которой строго изотропно и для которой выполняется закон Стокса-Эйнштейна (см.Рис.9). К двум уникальным р93 БН-группам молекулы гемоглобина присоединяли различные по структуре спин-метки из Табл.2 (4-6,8-16). Используя все эти метки определялось время вращательной корреляции молекулы гемоглобина по температурно-вязкосгным зависимостям ЭПР спектров и методике, изложенной в главе 3. Как и следовало ожидать время х соответствует теоретически рассчитанной величине с учетом сольватации 26 не, все спектры ЭПР различаются по форме линии. Это различие в первую очередь связано с разным типом нитроксила (5-ти или 6-ти членный), с различной структурой спин-метки и с различной стохастической природой динамического взаимодействия нитроксильного фрагмента с ближайшим белковым окружением вблизи спин-метки. Оказалось, что наиболее жестко связанной с молекулой гемоглобина спин-меткой является метка 8 (см.Табл.2) о чей свидетельствуют изотермы при 0° С с величиной 2А =70,5 в близкой к 1А-а =72 в Таким образом, различные структуры спин-меток и нитроксильных раликало! согласно предлагаемой теории никак не влияют на время корреляции (х = 26 не' глобулы белка, но значительно сказываются на эффективной величине параметра Б I его функции распределения. На рис.10,11 показаны спектры ЭПР спин-мечено! (метка 5) молекулы гемоглобина в водном растворе и растворе с сульфатом амммония и соответствующие им теоретические спектры, для которых проведен симуляция по схеме, изложенной в глава 4. На рис.12 схематически показан плотность распределения вероятности параметров £ и к по кластерам спин-мечены макромолекул, а на рис.13 графики зависимости частичного усреднения магнитны тензоров радикала от угла а для модели быстрых осцилляций (см.Рис.6). Следуе отметить, что полученные теоретически спектры ЭПР на рис.10,11 отличаются лиш одним параметром т (в полном теоретическом наборе параметров для программы н ЭВМ) равном в первом случае 26 не, а во втором 300 не.

Рассмотрим пример гибкой макромолекулы - спин-меченый (метка 6 в Табл.:

[12]. Молекулярный вес равен 150000, а время корреляции, определенное г температурно-вязкостной зависимости, равно 26 не. На Рис.14 показаны зкепериме! тальный и теоретический спектры ЭПР, а на рис.15 зависимость частичнь усреднений магнитных тензоров. На рис.16 показана функция плотно« распределения вероятное™ по кластерам.

Рассмотрим последний пример [67] также гибкой молекулы - лизоцим го бел куриных яиц, спин-меченый меткой 4 (Табл.2), в спектра:: ЭПР которого, в отлич: от не содержатся КШП при нормальных условиях. Время вращательн

корреляции молекулы белка определяется не мономерной формой макромолекулы, подвижностью гистидин содержащего домена. Согласно молекулярному весу 14,6 ^

■ itfbO

- Л» м / 1) та At 0 / А> А52 t

/ ы-> At 1 1 1 1 1 1 11 1 1 1 1 1 1 1 1

▲

▲ 64

А«о

▲so

41000

A100

A<4.i

A'80 A90 A«o A 67 Aso A 67 A»50 A850

A<o

▲ 22 A62 A180 A«o

A400

A»o A»o

10 100 Мол.вес/1000

Рис.9 Зависимость экспериментально определяемого времени врашательной

корреляции макромолекул X (не) от их молекулярного веса (Дальтон). 64000 - Гемоглобин, 150000 - Иммуноглобулин G, 50000 - Fab- фрагмент IgG, 100000 - (Fab')2 , 850000 - IgM, САБ - 67000, Лизоцим - 14600, Каталитическая субъединица протеинкиназы с гистоном Hp 62000, гистон Hp 22000, Протеинкиназа - 120000, Аспартатаминотрансфераза - 90000, Каталитическая протеинкиназа - 34000, IgA - 40000. Гликопротеиды мечены спин-меткой по пептидной или углеводной частям.

Рис.10 Спектры ЭПР спин-меченого гемоглобина в растворе при нормальных условиях (спин-метка 4 в Табл.2). Верхний спектр экспериментальный, нижний - теоретический (Параметры симуляции см. на рис.11) Расстояние между крайними точками спектра равно 95,6 Э.

Рис. 11 Спектры ЭПР спин-меченою гемоглобина (спин-метка 4 в Табл.2) в растворе сульфата аммония. Верхний спектр экспериментальный, нижний - теоретический, который состоит из двух мод: 1) 5=0,7(0,1) и к=-1(0,'05) при а=28°; 2)5=0,5(0,2) и к=-1(0,4) при а=42°. В скобках указаны дисперсии приведенных величин. Расстояние между крайними точками спектра равно 95,6 в.

А.

о хо го эо «о яо >о то «а »о

Рис.12. А - плотность распределения вероятност и существования кластеров для моделированного спектра спин-меченной молекулы НЬ в зависимости от параметров 5 и к, определяющих положения оси Л для каждого кластера (см. рис.10Д1); В - то же самое, что и А в координатах углов 0, Ф, пересчитанных из величин ^ и к по формуле (13'), см.рис.6.

Ргям < Сп * * г > ^о Хм и«1и«ж

Ргяхя <Е5С> to Пи 1 ( |Н« Ргодгт

Рис13 Зависимость частично усредненных компонент А и | тензоров от угла а для основного кластера первой моды спин-меченого гемоглобина при 8=0,7 и к=-1 (см.рис.11 и формулы (19'),(20'),(21')).

Рис.14 Спектры ЭПР спин-меченого иммуноглобулина в при 20"С (спин-мет 6 в Табл.2). Верхний спектр экспериментальный, нижний -теоретический. Спектр состоит из 4 мод:

1)5=0,6(0,1) и к=1(0,1) с весом 0,3;

2)5=0,6(0,5) и к=-1(0,1) с весом 0,3;

3)5=0,6(0,4) и к=1(0,5) с весом 0,2;

4)5=-0,15(0,6) и к=0,5(0,7)

Расстояние между крайними точками спектра равно 95,6 в.

Рг«** <Еп1вг> (и Хм О- 1®п*ог* и«1им

Рг»>» <Е»С> »о Ои»« «К» Ргоагап

Рис.15 Зависимость частично усредненных компонент А и £ тензоров от угла а для первой моды спин-меченого иммуноглобулина в при 8=0,6 и к=1 (см.рис.14 и формулы (19'),(20'),(21')).

А.

В.

90; 80 У0 «О

зо

40 3(2 2С1 Ю

О 1И »О ао 4« й» (.11 •?£» 1Ш . «Л1

Рис.16 А -плотность распределения вероятности существования Кластеров для моделированного спектра ЭПР спин-меченной молекулы в зависимости от параметров Ям к, определяющих положения оси Я для каждого кластера; В - то же самое, что и А в координатах углов 0, Ф, пересчитанных из величин 5 и к по формуле (13'), см.рис.6.

Рис.17 ЭПР спектры спин-меченого лизоцима (вверху) при 0,6%(1) и 23,5%(2) сахарозы и диаграмма тета-фи (см.рис.12) (внизу): 1 мода - 8=0,2(0,05) и к=-0,6(0,1); 2 мода - в—О,1(0,4) и к=0(0,5). Расстояние между крайними точками спектров равно 95,6 в.

Рг«*« 4Е()|«г> *о Хм* В-1«П»ОГ* 1Г«1(М£

Ргаа <ОС> «о №11 (Ьа Ргоягап

Рис.18 Зависимость частичного усреднения компонент А и | тензоров от угла а для основного кластера первой моды спин-меченого лизоцима при 8=0,2 и к=-0,6 (см.рис.17 и формулы (19'),(20'),(2Г)).

молекула лизоцима должна иметь величину т=б,7 не, однако экспериментальное значение равно 2 не, что отражает движение белкового фрагмента, содержащего На-15, к которому ковалентно присоединена спин-метка. На рис.17 (вверху) даны два спектра ЭПР из которых видно, что КШП появляются отчетливо в том случае, если снизить температуру до 1°С и добавить сахарозы около 20%. На том же рисунке (внизу) приведена диаграмма тета-фи, как на рис.16 В. На рис.18 даны зависимости частичных усреднений магнитных тензоров для основного кластера спин-меток на боковом остатке лизоцима.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В настоящее время ни у кого не вызывает сомнения, что для понимания функции биополимеров необходимо знать не только трехмерную статическую структуру макромолекулы, но и ее динамическую структуру. Экспериментально получить динамику всех частей макромолекулы с большой молекулярной массой практически невозможно. Поэтому знание динамики поведения боковых остатков огромной макромолекулы в их ближайшем окружении несомненно представляет интерес. Тем более, что эта задача может быть решена точно, как на экспериментальном уровне, так и на теоретическом.

В данной работе показывается, что по одному экспериментальному спектру ЭПР невозможно однозначно получать динамические параметры, и предлагается полное решение обратной задачи ЭПР спектроскопии спин-меченых макромолекул. Для этого было изучено поведение бокового остатка методом ЭПР по присоединенной к нему репортерской группы - спин-метке. Традиционно это делается путем определения времени вращательной корреляции по спектрам ЭПР при разных температурах или путем симуляции ЭПР спектров по анизотропной модели вращения спин-метки, а поскольку спектры ЭПР по многим параметрам вырождены, то на этом пути возникает много неопределенностей. Нами было показано, что при определенных экспериментальных условиях, которые легко осуществляются на опыте, необходимо рассматривать два процесса переориентации спин-метки, ковалентно связанной с боковым остатком биополимера. Первый процесс связан с медленным броуновским вращательным движением макромолекулы, второй с быстрой переориентацией метки относительно молекулы биополимера. Ключом для разделения обоих процессов является получение зависимости спектров ЭПР от вязкости при постоянной температуре. Выведены формулы для определения времени вращательной корреляции спин-меченой макромолекулы, учитывающие быстрое движение метки. Для описания быстрого движения развит следующий подход, который представлен на рисунке (на примере тензора СТС радикала):

М«о о

Модель осцилляции 0^0

[о о 2Я

А„ О О 1 О А„ О 0 0 А,

спектр ЭПР -,

"л

X )><* = сою!

"ох 2 ^ах!

Модель вращений

б. движение ) ^ рез.спектр ЭПР , $р - ^ .5:р спектр ЭПР , ^ т

Ах О О О А, О О О А,

Весь ансамбль спин-меченых макромолекул разделен на кластеры, в каждом и: которых работает определенная модель переориентации ннгроксила. Каждая и: моделей: осцилляций или вращений - частично усредняет компоненты тензоров, те* самым давая результирующий спектр ЭПР, сходный с экспериментальным. Из набор: параметров, определенных по данному методу, восстанавливается динамически характеристики боковой цепи, включая пространственную переориентацш концевого звена бокового остатка. Таким образом на количественной основ измеряется очень важная характеристика макромолекулы в растворе - врем вращательной корреляции и локальные конформационные иэменени макромолекулы с помощью параметра упорядоченности.

Впервые проведено сравнение с другими релаксационными методами ЯМР поляризации люминесценции и даны общие методы описания подвижной репортерской метки на боковом остатке белка.

Развитые в диссертации представления о частичном усреднении магнить тензоров нитроксила, связанного с макромолекулой, из-за быстрых переориентащ? спин-метки можно легко использовать в ЭПР спектроскопии с переносо насыщения. Для чего потребуются более сложные программы для расчета спектр! ЭПР и более мощные компьютеры для реализации этой задачи.

Разработанный метод диагностики спектров ЭПР спин-меченых макромолекул сочетании с методом молекулярной динамики мог бы дать возможное восстанавливать динамику поведения боковых остатков белков с учете трансляционных движений и корректно учитывать потенциалы молекулярш взаимодействий с молекулами воды.

Данный подход имеет универсальный характер и применяется к различи! биологическим объектам. Наиболее важные из них иммуноглобулины разн классов, ферменты и протяженные полимеры. На основании данного подхс разработаны способы диагностики таких заболеваний, как бронхиальная астма инфаркт миокарда, и диагностики физического состояния спортсменов п длительных нагрузках.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ВЫВОДЫ

1. Предложен и введен в практику научного эксперимента новый метод анализа ЭПР спектров спин-меченых макромолекул, как решение обратной задачи ЭПР спектроскопии. Метод учитывает два независимых стохастических процесса переориентации спин-метки, резко различающихся по частоте колебаний в интервале физиологических температур и умеренных вязкостей. Новый метод анализа приводит к качественно новым результатам и согласуется с другими релаксационными методами ЯМР и поляризации люминесценции.

2. Установлено, что форма экспериментальных спектров ЭПР количественно отражает (при изменении температуры и вязкости среды) аддитивный вклад в частичное усреднение эффективного спин-гамильтониана от двух независимых процессов: медленного вращения макромолекулы и быстрой переориентации присоединенной спин-метки. Основываясь на этом факте было предложено решение обратной задачи ЭПР спектроскопии спин-меченых макромолекул, которое зключалось в разработке моделей движения репортерской группы нитроксила (быстрый анизотропный ротатор на медленном изотропном ротаторе) и создании программ для ЭВМ, по которым рассчитываются спектры ЭПР в широком диапазоне изменения динамических и магнитных параметров нитроксила.

При этом все разнообразие теоретических моделей сведено к двум типам движения анизотропного ротатора: быстрое вращение оси 2 нитроксила, приводящее к аксиально симметричному усреднению магнитных тензоров, и быстрое колебание всего нитроксила вокруг оси, приводящее к неаксиально симметричному усреденению магнитных тензоров.

В итоге результирующее движение нитроксила описывается двумя динамическими параметрами: изотропным временем вращательной корреляции диффузионного движения макромолкулы т и параметром упорядоченности учитывающим частичное усреднение магнитных тензоров нитроксила.

В аналитическом виде дан способ определения времени вращательной корреляции макромолекул и эффективного параметра упорядоченности 5 из анализа температурно-вязкостных зависимостей положения крайних широких пиков в спектрах ЭПР спин-меченых образцов. Динамические параметры, полученные таким способом, не зависят от типа используемого радикала.

Новый метод применен к многочисленному ряду биологических объектов.

3.Впервые с помощью универсального подхода получена информация о молекулярной динамике в растворе следующих спин-меченых молекул: гемоглобина, сывороточного альбумина, аспартатаминогрансферазы, фосфорилазы, липазы, протеинкиназы и ее субьединиц, рудифкарбоксилазы, нейротоксина, гистона Н1, иммуноглобулинов в, А, М и их фрагментов, белков гистоеовмесгимости, синтетических полимеров и др. В результате измерения времен вращательной

корреляции глобулярных белков в растворе показано, что для молекул гемоглобина, альбумина, фосфорилазы, липазы, протеинкиназы и ее субьединиц, рудифкарбоксилазы и нейротоксина времена корреляции соответствуют жесткой глобуле с различной степенью эдлипсоидальности. Для молекул аспаргатаминотрансферазы, гистона HI, иммуноглобулинов, белков гистосовместимости и гликопротеинов из мембран лимфоцитов установлено существование их внутренней гибкости, а для молекул инсулина при рН7 существование агрегатов ю трех молекул. Подтверждены известные факты о гибкости иммуноглобулинов G, А и М в шарнирной области и жесткости их Fab фрагментов. Впервые показана динамическая лабильность Fc фрагмента иммуноглобулинов и резкая температурная активация углеводного остатка в IgG в составе СН2 домена.

4.Усганоалено на большом и разнообразном количестве биологических образцов, что новый полуфеноменологический подход для анализа ЗПР спектров спин-меченых макромолекул является единственно возможным, так как ведет к однозначному выбору модели вращения метки, и в свою очередь к однозначному определению набора необходимых магнитных параметров для моделирования спектров ЭПР с помощью ЭВМ, корректно учитывая при этом полярность окружения нитроксила.

5.В рамках предлагаемого подхода впервые проведено сравнение метода спин-метки с методом поляризации люминесценции и показана их полная аналогия, как репортерских методов, при этом объем информации получаемый в методе спин-метки, не требующего условия прозрачности среды, перекрывает информацию метода поляризации люминесценции в его стационарном и импульсном варианте, количественно давая больше динамических параметров.

6.Изучено влияние водородной связи на величину изотропной константы сверхгонкого взаимодействия нитроксила, растворенного в двойных и тройных смесях вода-неэлектролит. Показано, что вклад в полярность этих смесей от водородной связи может быть значительным и пропорциональным частоте столкновений нитроксила с протонодонорными группами растворителя.

Результаты диссертация изложены в следующих публикациях:

1.V.P.Timofeev, O.L.Polyanovsky, M.V.VoUcenstein, G.I.Likchtenstein "Mobility of the paramagnetic label bound by aspartateaminotransferase."

Biochim. Biophys. Acta 220, 357-360, 1970.

2.В.П.Тимофеев, ОЛ.Поляновский, М.В.Волькенштейн, О.В.Преображенская, Г. И Лихтенштейн, Ю.В.Коханов "Исследование конформационных свойств молекул аспартат аминотрансферазы с помощью спин-меток."

Молекуляр. биология 6, 377-387, 1972.

ЗАИ.Кяйвяряйнен, В.П.Тимофеев, М.В.Волькенштейн "Исследование конформационных свойств гемоглобина методом двух парамагнитных меток." Молекулярная биология 6, 875-882, 1972.

4.0.L.Polyanovsky, V.P.Timofeev, M.I.Shaduri, AYu.Misharin, M.V.Volkenstein "Conformational changes of aspartate aminotransferase ransferase in the region of cys-45 residue observed by means of spin label." Biochim. Biophys. Acta 327, 57-65, 1973.

5.A.Yu.Misharm, V.P.Timofeev, A.B.Azsacv, O.LPolyanovsky "Synthesis of some spinlabelled reagents and their applications for the study of aspartateaminotransferase." Abstracts, USA-USSR symposium on biology pyridoxal catalysis, p.105, 1974.

6.A.Yu.Misharm,O.L. Polyanovsky, V.P.Timofeev "Application of srin-labelled vitamin Вб analogues for the study of aspartateaminotransferase." FEBS Letters 41, 131-134, 1974.

7.АЮ.Мишарин, ОЛ.Поляновский, В.П.Тимофеев "Взаимодействие спин-меченых аналогов витамина В6 с активным центром апотрансаминазы." Молекулярная биология 2, 113-120, 1975.

8.АЛО.Мишарин, АЮАжаев, В.П.Тимофеев, ОЛ.Поляновский "Взаимодействие спин-меченых ингибиторов с аспартатаминогрансферазой."

Биорганическая химия 1, 257-265, 1975.

9.В.П.Тимофеев, АЮ.Мишарин, М.И.Шадури, Л.М.Винокуров, ОЛ.Поляновский, М.В.Волькенштейн "Изучение локальных конформационных и структурных особенностей аспартат аминотрансферазы методом спин-метки." "Конформационные изменения биополимеров в растворах", 208-215, Тбилиси, 1975.

Ю.И.В.Дудич, В.П.Тимофеев, М.В.Волькенпггейн, АЮ.Мишарин "Измерение времени вращательной корреляции макромолекул методом ЭПР в случае ковалентно связанной спин-метки." Молекулярная биология 11, 685-693, 1977.

11.R.S.Nezlin, V.P.Timofeev, Sykulev,S.E. Zurabyan "Spin-labeling of immunoglobulin carbohydrates." Immunochemistry 15, 143-144, 1978.

12.V.P.Timofeev, I.V.Dudich, Yu.K.SykuIev, R.S.Nezlin "Rotational correlation times of IgG and its fragments spin-labeled at catbohydrate or protein moieties. Spatialy fixed position of the Fc carbohydrate." FEBS Lett., 89, 191-194, 1978.

13.А.В.Гагуа, Г.Г.Маленков, В.П.Тимофеев, И.В.Дудич "Полярность окружения как фактор, определяющий конформацию ДНК."

Молекулярная биология 12, 669-674, 197S.

14.A.V.Gagua, G.G.Malenkov, V.P.Timofeev "Hydrogen bond contribution to the isotropic hyperfine splitting constant of a nitroxide free radical."

Chem.Phys.Lett. 56, 470-473, 1978.

15.G.G.Malenkov, A.V.Gagua, V.P.Timofeev "Influence of intermolecular interactions on the DNA conformation." International J. of quantum chemistry XVI, 655-668, 1979.

16.A.Yu.Misharin, O.L.Polyanovsky, V.P.Timofeev "Spin-labeled vitamin B6 derivatives: synthesis and interaction with aspartate aminotransferase." Methods in enzymology, Academic Press, N.Y., 62, 495-510, 1979.

17.V.P.Timofeev, I.V.Dudich, Yu.K.Sykulev, R.S.Nezlin, F.Franek "Slow conformational change in anti-dansyl antibody as consequence of hapten binding. Demonstration by ESR spectra." FEBS Letters 102, 103-106, 1979.

18.Yu.K.Sykulev, V.P.Timofeev, R.S.Nezlin, A.Yu.Misharin, F.Franek "Spin label study of segmental flexibility of anti hapten antibodies. Precipitating pig anti-DNP antibody is more flexible than non-precipitating." FEBS Letters 101, 27-30, 1979.

19.I.V,Dudicb, V.P.Timofeev, M.V.Volkenstein "Simple analysis of ESR spectra of spin-labeled macromolecules. Consideration of rapid anisotropic rotation of a spin label and slow diffusion rotation of a macromolecule. Magnetic resonans and related phenomena." Ed.Kundla E., Liptnaa E., Saluvere Т., Tallin, p.521, 1979. "

20.ПЛ.Вульфсон, Л.П.Михайлова, Л.И.Сколышева, И.ВДудич, В.П.Тимофеев "Изучение конформащюнных изменений спин-меченых нативной и модифицированной фосфорилазы Б." Биохимия 45, 532-543, 1980.

21.I.V.Dudich, E.I.Dudich, V.P.Timofeev "Fluorescence polarization and molecular study of human myelloma immunoglobulins A and M. Presence of segmental flexibility." Molecular immunology 17, 1335-1339, 1980.

22.V.P.Timofeev, I.V.Dudich, M.V.Volkenstein "Comparative study of dynamic structure of pig and chicken aspartate aminotransferases by measuring the rotational correlation time." Biophys. Struct. Mechan. I, 41-49, 1980

23.В.П.Тимофеев, АЕ.Герасимов, И.В.Дудич, Е.И.Дудич, В.И.Сускина "Исследование связывания спин-зондов карболинового и бензокарболинового ряда на бычьем сывороточном альбумине." Молекулярная биология 14, 1406-1412, 1980.

24.В.П.Тимофеев, О-Д.Тураев, И.С.Садитра, В.К.Буриченко, В.А.Шибнев

"О поведении спин-меченых гистонов Hj и Hjb в растворе и при комплексообраэовании с ДНК." ДАН ТССР XIII, 653-655, 1980.

25.В.П.Тимофеев, А.Е.Герасимов, И.ВДудич "Изучение динамической структуры поверхности глобулярных белков методом спин-зонда." "Конформационные изменения биополимеров в растворах", 63-64, Тбилиси, 1980.

26.A.M.Wasserman, T.A.Aleksandrova, I.V.Dudich V.P.Timofeev "An investigation of the segmental flexibility of spin-labelled synthetic macromolecules in solutions." Eur. Polym. J. 17, 347-352, 1981.

27.Л.М.Вассерман,Т.А. Александрова, И.В. Дудич, V.P.Timofeev "Исследование сегментальной подвижности спин-меченых синтетических макромолекул в растворах." Высоком, соед. (А)33, 1428-1436, 1981.

28.E.A.Mullokandov, I.V.Dudich, V.P.Timofeev "A spin label study of interaction of magnezium and ribulose 1,5-biphosphate with ribulosephosphate carboxilase from spinach." Biochim. Biophys. Acta 709, 13-18, 1982.

29.В.П.Тимофеев, В.АЛапук "Исследование необратимого конформационного перехода в иммуноглобулине М методом спин-метки, введенной в углеводную и пептидную части его молекулы." Молекулярная биология 16, 403-410, 1982.

30.В.П.Тимофеев, Э.М.Багиров, А.Г.Габибов, С.Н.Кочетков "Изучение методом спин-метки релаксационных свойств протеинкиназы, ее субьедишщ и комплекса каталитической субъедигогцы с гисгоном HI." Молекулярная биология 16, 1263-1270, 1982.

31.И.В.Дудич, Е.И.Дудич, В.П.Тимофеев "Освобождение низкомолекулярного фактора из Fc фрагмента иммуноглобулина G кролика при образовании преципитирующих комплексов с антигеном." ДАН СССР, 263, 231-234, 1982.

32.Н.Н.Нуцубидзе, Т.В.Ротанова, ААМишин, В.П.Тимофеев, "Конформацион-ные состояния панкреатической липазы." Биофизика XXYII, 403-406, 1982.

33.V.P.Timofeev, V.I.Tsetlin "Analysis of mobility of protein side chains by spin label technique." Biophys. Struct. Median. 10, 93-108, 1983.

34AM.Wasserman, V.P.Timofeev, T.A.Aleksandrova, T.M.Karaputadze A.B.Shapiro, Yu.E.Kiish "Intramolecular mobility of spin-labeled polyvinylpyrrolidone) and poly(vinylcaprolactam) in solutions." Eur.polymJ. 19, 333-339, 1983.

35.A,G.Gabibov, S.N.Kochetkov, L.P.Saschenko, I.V.Smirnov, V.P.Timofeev, E.S.Severin "Studies on the mechanism of action of histon kynase dependent on adenosine 3,5-monophosphate. Investigation of protein interaction by ESR and stopped-flow method." Eur. J. Biochem. 132, 339-344, 1983.

36.Э.А.Муллокандов, В.П.Тимофеев, И. В. Дудит, П.М.Соложенкин "Исследование взаимодействия рибулозо-1,5-дифосфаткарбоксилазы с рибулозо-1,5-дифосфатом и ионом магния методом спин-метки." Молекулярная биология 17, 279286, 1983.

37. В.П.Тимофеев "Описание динамического поведения боковых групп глобулярных белков при помощи методов спин-метки, ЯМР и поляризации люминесценции." Молекулярная биология, 17, 519-531, 1983.

38.I.V.Dudich, E.I.Dudich, V.P.Timofeev "Release of low molecular weight proteins from trie Fc fragment of rabbit immunoglobulin G induced by formation of insolible complexes with antigen." Mol. Immunol. 20, 1273-1276, 1983.

ЗЭЛ.В.Беловолова, В.П.Тимофеев, Р.М.Давыдов, А.Б.Шагтаро, И.М.Закс, А.М.Моисеенков "Влияние солюбилизации обращенными мицеллами на спектры ЭПР парамагнитных цвитгер-ионов." ЖФХ, 47, 2761-2764, 1983.

40Л.В.Беловолова, Р.МДавыдов, В.П.Тимофеев, "Белки в обращенных мицеллах как модель биологических мембран. Солюбилизация сывороточного альбумина обращенными мицеллами." ЖФХ, 47, 2765-2768, 1983.

41.F.Sundholm, A.M.Wasserman, I.I.Barashkova, V.P.Timofeev, A.L.Buchachenko "Molecular mobility of spin-labeled terephthaloyl chloride and 1,10-decandiol copolymer in solution." Eur. Polym. 1. 20, 733-738, 1984.

42.V.A.Lapuk, V.P.Timofeev, A.I.Tchukchrova, N.M.Khatiashvili, T.M.Kiseleva "Some peculiarities of the dynamics of the immunoglobulin M structure." J. Biomolec, Struct. Dynam. 2, 63-76, 1984.

43Л.В.Беловолова, В.П.Тимофеев, М.В.Генкин, Р.М.Давыдов "Исследование методом ЭПР солюбилизации нитроксильного цвитгер-иона и спин-меченого сывороточного альбумина микроэмульсиями лецитина в органических растворителях." Studia biophysica 105, 49-58, 1985.

44.Р.С.Незлин, А.Е.Арутюнян, В.П.Тимофеев "Сегментальная подвижность СООН-концевого фрагмента тяжелых цепей иммуноглобулина G в растворе." Биофизика XXX, 161-162, 1985.

45.V.P.Timofeev, A.Yu.Misharin "Spin-labeled vitamin Bg analogs: Synthesis and interaction, with aspartate aminotransferase - active site and conformational changes. Coenzyme and cofactors, ed." Dolphin, John Wiley . Sons, Inc., 309-334, 1986.

46.В.П.Тимофеев "Сегментальная подвижность поли(и) и метод спин-метки." Молекулярная биология 20, 697-711, 1986.

47.Р.С.Незлин, А.Е.Арутюняк, В.П.Тимофеев "Определение подвижности олигосахаридов гликопротеинов из мембран лимфоцитов методом спиновой метки." Биофизика, XXXI, 711-712, 1986.

48.Арутюнян, В.П.Тимофеев, Н.ПДикинене, О.В.Акуните "Различия в сегментальной гибкости и локальной конформационной подвижности боковых групп спин-меченых молекул двух подклассов IgG сыворотки крови коров в норме и при паталогии." Биофизика, 32, 514-516, 1987.

49.Р.С.Неалин, ЕВ.Панкратова, В.В.Кульгускин, А.Е.Арутюнян, В.П.Тимофеев "Внутримолекулярная подвижность белков главного комплекса гисгосовместимосги человека. Изучение методом спин-метки."

Молекулярная биология 21, 1426-1437, 1987.

50.R.S.Nezlin, E.V.Pankratova, A.E.Arutyunyan, V.P.Timofeev "Extracellular portions of HIA antigens are not compact globulae." Molecular Immunology 24, 803-806, 1987.

51.Ц.Г.Ганчев, П.Т.Моминов, В.Н.Верхогуров, К.Н.Тимофеев, В.П.Тимофеев "Молекулярная динамика водорастворимого сопрягающего фактора хлоропластов (CF1). Исследование методом спиновых меток." Молекулярная биология 21, 10331039, 1987.

52.В.П.Тимофеев, Г.С.Качалова, Р.И.Арпох, И.В.Дудич, А,Е.Арутюнян "Каталог спектров ЭПР спин-меченых макромолекул." Пущино, НЦБИ АН СССР, 1987.

53. V.P.Timofeev, A-I.Lapuk, A.I.Tchuchrova, A.E.Amtiunian "Selective spin-labelling of N-acetylneuraminic acid residue in the Fab-region oligosaccaride of immunoglobulin M." Immunology Lett. 17, 173-176, 1988.

54.В.П.Тимофеев, В.АЛапук, А.И.Чухрова, А.Е.Арупонян, Т.М.Киселева "Избирательное введение спин-метки в остаток N-ацетилнейраминовой кислоты олигосахардной группировки Fab-облгсги иммуноглобулина М." Биополимеры и клетка 4, 78-78, 1988.

55.А.Е.Арутюнян, И.В.Дудич, В.П.Тимофеев "Измерение времени вращательной корреляции молекулы бычьего сывороточного альбумина с помощью йод и ртуть содержащих спин-меток." Молекулярная биология 22, 1045-1061, 1988.

56.Р.С.Незлин, Е.В.Панкратова, В.П.Тимофеев "Изучение методом спин-метки компонентов белков главного комплекса гистосовместимости." Биологические мембраны 5, 258-262, 1988.

57.А.Е.Арутюнян, В.П.Тимофеев, Н.П.Дикинене, О.В.Акуните, В.АЛапук "Сегментальная гибкость Fe-области спин-меченых молекул IgG двух подклассов сыворотки крови коров и локальная информационная подвижность юс углеводных компонент." Биофизика 34, 946-947, 1989.

58.А.Е.Арутюнян, В.П.Тимофеев "Сегментальная гибкость поливинилового спирта в водном растворе по данным метода спиновой метки." ЖФХ 53, 1399-1401, 1989.

59.В.АЛапук, А.И.Чухрова, Н.М.Хигиашвили, Ф.В.Шиакова, ЕД.Каверзнева, В.П.Тимофеев "Доступность остатков триптофана в иммуноглобулине М как показатель его конформационкой изменчивости." Биохимия 54, 1956-1964, 1989.

60.В.П.Тимофеев, А.Е.Арутюнян, А.И.Петров "Сегментальная гибкость одно-, прух- и трехспиральных полирибонуклеотидов по данным метода спин-метки. Образование трехнитчатой полинуклеотидной спирали поли(А А-и)." Молекулярная биология 24, 140-155, 1990.

61.В.П.Тимофеев "Проявление динамических особенностей глобулярных белков л нуклеиновых кислот в данных метода спиновых меток." В сборнике научных трудов 'Равновесная динамика структуры биополимеров," Пущино, с. 39-48, 1990.

62.VALapuk, V.P.Timofeev, A.I.Tchuchrova "Acsessability of Tryptofan residues in Immunoglobulin M as an Index of its Conformational Changeability." J. Biomolec. Structure & Dynamics, 8, 709-720, 1990.

63.T.Gantchev, T.Tsanova, G.Gotchev, V.P.Timofeev "Conformational dynamics properties of water-soluble coupling factor of photophosphorylation studied by spin-labeling." Biochim. Biophys. Acta 1015, 69-78, 1990.

64.B.Ebert, V.P.Timofeev "Binding mechanism of Mercury Spin Labels to Serum Albumin." Studio Biophys., v.139, N1, pp. 47-54, 1990.

65.Р.И.Артюх, Г.С.Качалова, О.СКислюк, В.П.Тимофеев "Исследование методом спиновой мети: конформационной и вращательной подвижности молекул гемоглобина речной миноги Lampetra Jluvmtilis." Молекулярная биология, том.25, вып.2, 492-502, 1991.

66.V.P.Timofeev, B.A.Samarianov "About new universal approach to the EPR-spectra simulation of the spin-labeled macromolecules." Appl. Magn. Reson. v.4, 523-539, 1993.

67.В.П.Тимофеев, В.А.Лапук, Б.А.Самарянов "Дифференциация пространственной подвижности остатков лизшов в иммуноглобулинах G методом спин-метки." Молекулярная биология, том 28, N б, 1315-1320, 1995.

68.Р.И.Артюх, Г.С.Качалова, БАСамарянов, В.П.Тимофеев "Динамическая подвижность гистидин-содержащего домена спин-меченого лизоцима." Молекулярная биология, том 29, N1, 149-158, 1995.

69.T.Turu:ien, H.Tenhu, B.A.Samarianov, V.P.Timofeev "Solutions and gels of spinlabelled poly(octyl isocyanate) in nonpolar hydrocarbon solvents."

Polymer, v.35, 1678-1681, 1995.

70.V.P.Timofeev, BASamarianov "Dynamics of macromolecule spin-labelled side-chain groups by EPR spectra simulation"

J. Chem. Soc. PERKIN TRANS., v.2, 1345-1353, 1995.

71.M.A.Ponamarev, V.P.Timofeev, D.I.Levitsky "The difference between ADP-bemlium fluoride and ADP-aluminium fluoride complexes of the spin-labelled myosin subfragment 1." FEBS Letters, 371, 261-263, 1995

Тир. 100

Подписано в печать 23.I0.S5

ЫГП "Агошадиграфсервис'

Зак. 584

Информация о работе

Тимофеев, Владимир Петрович
доктора физико-математических наук
Москва, 1995
ВАК 03.00.02

Автореферат

Похожие работы

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему Динамика биополимеров в растворе и метод спин-метки ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Динамика биополимеров в растворе и метод спин-метки"

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Динамика биополимеров в растворе и метод спин-метки
ВАК РФ 03.00.02, Биофизика