Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование структурных особенностей и конформационных перестроек фосфоглицераткиназы радиоспектроскопическими методами

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Исследование структурных особенностей и конформационных перестроек фосфоглицераткиназы радиоспектроскопическими методами"

государственный комитет по народному образованию ссср

московским ордена л ешТнаГордена октябрьской революции и ордена трудового красного знамени государственный университет им. м. в. ломоносова

Физический факультет

На правах рукописи УДК 577.352

ВЛАСОВА Ирина Ивановна

ИССЛЕДОВАНИЕ СТРУКТУРНЫХ ОСОБЕННОСТЕЙ И КОНФОРМАЦИОННЫХ ПЕРЕСТРОЕК ФОСФОГЛИЦЕРАТКИНАЗЫ РАДИОСПЕКТРОСКОПИЧЕСКИМИ МЕТОДАМИ

(специальность 03.00.02 биофизика)

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

Мог к па 1990

Работа выполнена в Московском государственном университете им. М. В. Ломоносова на кафедре биофизики физического факультета.

На уч ни й руководитель доктор .химических наук, профессор Л. А. Блюменфельд.

Официальные оппонент ы:

доктор физико-математических наук, профессор

Э. К. Рууге,

кандидат химических паук, ст. и. с. О. М. Панасеико.

Ведущая организация: Институт молекулярной биологии АН СССР, г. Москва.

. »/^.Су^с/ . 1990 г. в « &

Защита состоится и&г1. . »/<¿¿£¿/7:/ . 1990 г. в «

•часов на -заседании специализированного совета № 3 ОФТТ ; (К 053.05.77) в МГУ им. М. В. Ломоносова по адресу: 119899, ГСП, Москра, Ленинские горы, МГУ, Физический факультет,

„уд. . .АГ^

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке физического факультета МГУ.

Автореферат разослан « г'У.

¿с

1 . . 1990 г.

Ученый секретарь специализированного совета

кандидат фм'аико-ма тс м ати ч ее к их и пун

Т. М, Козлова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Постановка проблемы, ее актуальность. Одной из актуальных проблем современной молекулярной биофизики является выяснение роли конформационных изменений макромолекулы в осуществлении ферментом каталитической функции. Остаются нерешенными некоторые вопросы, связанные со способностью белковых глобул изменять пространственную структуру на различных этапах каталитического цикла.

Диссертация посвяг:> л изучению механизмов функционирования фосфоглицераткиназы 1ФГК' - одного из ферментов, обеспечивающих трансформацию энергии в клетках. ФГК занимает ключевое место в цепи веакций гликолиза, так как осуществляет перенос -макроэргической сеязи на конечном этапе синтеза молекуч АТФ. Час. экспериментов выполнена с другим ферментом гликолиза глицеральдепадфосфатдех'ядрогеназой (ГАФДГ). Изучение конфор-нрцяонцнх изменений этих ферментов, а также эффектов взаимодействия различных веаьс-п» (субстратов, активаторов, кофакторов и др.) с макромолекулой белкз важна для понимания собственно механизмов функционкрог :нии фосфоккназ и могут служить обоснованием имеющихся представлений о роли конформационных перестроек в ферментативном катализе.

Цель и задачи работы. Цель .настоящей расогы состояла в к следовании влияния субстратов и других веществ на структурные и функциональные свойства макромолекулы ФГК из дрожжей, а тлкжр и ГАФДГ V мы!'"1 свиньи с помскыо радиоспектроскопнческих методов: электронного парамагнитного • резонанса и ядерно!' магнитной релаксации протонов воды. В задачу работы входило так я:е развитие методов количественной характеристик!! конформационных изменений ферментов. Выбор фермента ФГК обусловлен особенностями строения белковой глобулы, ее способностью изменять кскфорйацшо, высокой стабильностью и наличием в аминокислотной посл'довательности белка

единственной аминокислоты цистеина, что позволяет присоединить к белку парамагнитный радикал в точно фиксированном месте.

Научная новизна работы. Впервые показано, что участвующие е

фосфоглицераткиназной реакции ионы М.ч2+ прочк е связываются с

фермент-субстратным комплексом ФГК - 3-фосфоглицериновая кислота

'3-ФГ), чем с апоформой фермента. Установлено, что дополнительный

центр связывания АТФ на молекуле ФГК локализован в месте

связывания 3-ФГ в активном центре белка. Зарегистрирована кинетика

связывания ртутьсодержащих меток с БН-группой. Исследование

конформационных изменений белка в области цистеина-97 „ помощью

спиновых меток показало, что различные вещества вызывают

неодинаковые изменения конформации глобулы. При этом было

установлено, что специфический эффект - закрытие "щели" активного

центра - вызывает лишь связывание с ферментом специфического

субстрата 3-фосфоглицерата (3-ФГ). Разработан ме од, позволяющий

о

определять расстояния до 60А между парамагнитными частицами с близкими значениями д-фактор^в путем регистрации кривых насы^ния сигналов ЭПР в ограниченном интервале микроволновой мощности. Получены количественные характеристики влияния субстратов и ряд; других веществ на прочно свягчнную с белком воду. Методо! протонной магнитной релаксации воды зарегистрированы существенны1 конформационные '"зменения белков в ферментативном катализе.

Практическое значение работы. Полученные результаты служа1 экспериментальным подтверждением роли конформационных перестрое белковой глобулы в ферментативном катализе и.углубляют понимани механизм осуществления фосфотрансферазной реакции. Результ; г будут учтены при планировании эка. риментов с другими ферментами Подобранные условия оптимальной модификации остатка цистеина могу использоваться при выборе оптимальных условий иммобилизацл фермента с целью использования его в аналитических и пpoч^

устройствах. Детальное исследование особенностей работы с ртутьсодержащими метками позволяет рекомендовать эти химические соединения для широкого использования в ЭПР-исследованиях белков. Развитие мете, .а измерения расстояний в макромолекулах по параметрам кривых насыщения спин-меток позволяет оценивать расстояния

о

до 60Л. Развит метод регистрации конформационных изменений белков с ломощыо ядерной магнитной релаксации протонов воды.

Апробация работы. Основные результаты работы были долотены на XX Конференции молоды* у.-еьых 'биологического факультета МГУ (Москва, 19В9), на VII и VIII Всесоюзных конференциях. "Магнитный резонанс в биологии и медицине" (1989, 1990. Звенигород), на I Международном симпозиуме "Molecular organisation of biological structures" Москва, 1989).

Публикации. Результаты работы api ставлены в семи публикациях.

Структура и об' ем диссертации. Диссертация „ое?о.ит из введения, шести глав, заключения, выводов и содержит 168 страниц машинописного текста, включая 31 рисунок, 7 Таблиц и список цитируемой литературы из 1£3 наименований.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

Глава 1 представляет ссбой обзор литературных данных, посвященных следующим вопросам:

1. -Строение и функционирование иоследуеких 'белков. Глобула ФГК состоит из двух доменов, соединенных узкой перетяжкой, кеаэду которыми расположена 1цель активного центра (рис.1). Фермент катализирует реакцию обраь..ааяия А7Ф и З-фосфоглицериновой кислоты (3-ФГ) из АДФ и i,3-дифосфоглицериновой кислоты в присутствии ионов двухвалентных металлов. In vitro, однако, удобнее изучать обратную . реакцию, поэтому в качестве субстратов п работе использовали 3-ФГ' и АТФ. ЛТФ связывается из С -ьонцздои,

Рис. 1. Схематическое изображение структуры открытой формы молекулы дрожжевой фосфоглицераткиназы. ск-спиоалп обозначены циг-шдрами, Р>-структуры - стрелками. Цифры - порядковые номера аминокислот здоль полипелтидной цепи. Обозначены места связывания субстратов - З-фосфоглкцер!. .овой кислоты -(3-ФП и АТФ ОЧа'^оп, 1982). Цис-97 - единственный аминокислоты?! остаток цистеина.

3-ФГ - на М-концевом доменах белка. Активаторами фермента являются

о

анионы сульфата БО^ . Основное внимание в обзоре уделено

О

взаимо; иствию субстратов и ионов 30| с ■ ферментом и к нформационным. изменениям белка. Методами малоуглового рентгеновского рассеяния, ультрацентрифугирования, кругового дихроизма, ЯМ!' зарегистрированы крупномасштабные изменения конформации ФГК при связывании субстратов. В литературе нет единого мнения ^ том, связывание какого субстрата приводит к закрыванию "щели" активного центра и какую роль в осуществлении кате, лтическсй реакции играют ионы двухвалентных металлов. Приведено краткое описание строение и свойств фермента ГАФДГ. 2.Применение радиоспектроскопических методов в исследовании белков.

Описаны работы по измерению расстояний в макромолекулах методо;.! ЭПР

С учетом известных структурных . особенностей ФГК были

сформулированы основные задачи диссертационной работы. Локальные

¡информационные изменения белка в области Cys-97 можно

ре:лстрпровать с помощью ершовых меток. Количественные

характеристики изменений конформации глобулы нежно получить с

помощью насыщения спектрса ЭПР спиг чеченого белка и IMP воды.

Такие исследования позволят сделать выводы о роли различных

веществ в конформационных перестройках глобулы. Для оценки

расстояний в молекуле использовали cj;i дующий подход. Фермент ФГК

обладает единственной SH-группой - цистеин-97, с которой можно

ковалентно связать парамагнитную метку. В качестве ионов ¡еталла

можни выбрать парамагнитные ионы, например, Мп или Сг . Это

позволит локализовать на поверхности белка двэ парамагнитные

частицы: метку, связанную с Cys-^, и ион в активном центре. С

помощью насыщег ч спектров ЗПР спин-метки возможно вычисление о

больших (>25А) расстояний между двумя частицами.

Глава 2 "Материалы и мето'-«". Подробно описана методика выделения ФГК с учетом внесенгчх нами кодификаций. Полученный белок обладал активностью не менее 400 ед/мг (при 23°С, в отсутствии конов сульфр-'а). Описал синтез других веществ, и .итользуемых в экспериментах, также условия проведения

измерений. Приведены формулы, использованные для математической обработка ре: льтатов измерений.

Глава 3. "Кодификация фосфоглицераткиназыспиновыьи метками и влияние различны: веществ и процессов__иа спектры -спин- меченого ¿елка]\ Подобраны условия оптимальной модификации единственной SH-группы белка спиновой меткой на оенрве малеимида (M-SL) и ртутьсодериащими метками CHgSL-1 и HgSl-2, шс.2). Изучено влияние субстратов,

ионов сульфэ.тэ, асиорбата, температуры, рН и времени

М-5ЬЕ

хранения спектры

И-—п белка.

при 23°С 1.а спин-меченого

Спектр'" ЭПР спин-меченэй ФГК приведены на рис. ?.. Следующие факты позволяют утверждать, что спектры принадлежат ■ метке, связанной именно с БК-группой белка: быстрое < язывание меток (циете;га-97 расположен недалеко от поверхности белка); отношение \ 0.7:1-1:1 количества белка к количеству метки в растворе спин-меченого белка; мечение белкг не меняет его активность, что справедливо для модификации БН-группы ФГК. Кроме того, при выбранных условиях ртутьсодержащие метки не взаимодействуют с цитохро-_ ___________________ ___ ти-С из мышц лошади, не

Рисунок 2. Спектры ЭПР спии-мечеиой■содержащим БН-групп, метка ФГК (БЬ-Е), 25мМ НЕРЕ5-На, оН=7.4,

о!о5М 1,^X1, 23°С. . " на основе малеимг-а

A. Спин-метка на основе малеим"да,связывается не более чем с

(М-Би^

B,С - ртутьсодержащие метки (^БЬ). В. спектр ЭПР ртутьсодержа:цих меток при 77К, 50% глицерин. меткой на основе малеимида

5% цитохрома-С.

Модификацию белка ФГК

проводили при рН=а.4, С :СГ=10:1, 23°С в течение 6 часов. Спектр 15-SL, связанной с Суя-97 белка, представляет собой суперпозицию двух спектров, которые соответствуют двум типам связывания метки: по одной из карбонильных групп с раскрыванием кольца имида (слабо иммобилизованная метка) или по двойной С-С связи (сильно иммобилизованная метка), рис.2Л.

Модификацию белка рг/тьсодержаш"чи неткани осуществляли при рН=8.2, 23°С. В условиях С„<С, (1.2*Ю'4М- и 1.6*10"4М

■ Л Ü

соответственно) зарегистрировали ' кинетику связывания ртуть-

содержащих меток с SH-группой белка Предполагая, что реакция

второго порядка, получили константу скорости реакции

о

К~10 (1./М*мин.) .■ Быстрое связывание метки с тиоловой "рупвой ri03L ляет приводить модификацию Л1< при незначительном избытке метки по отношению к белку. За 6С- минут метится 80-90% белка. Спектр спин-меченон фГК (HgSÎ-E) соответствует спектру сильно иммобилизованной метки, доля слабо имчобилизовянной компоненты в случае HgSL-i-E не превышает 3-5% всей концентрации меш, рис.ЯВ.

Для изучения влияния субстрат в и активирующих ионов сульфата на спектры спин-меченого белка использовали как малеимвдную, так и ртутьсодержащую (HgSL-1) метки.

Было обнаружено, что 3-ФГ и So|" изменяют вид спектра ЭПР Г SL, связанной с ферментом, рис.2А (пунктир). Зто изменение проявляется как исчезновение низкопольной компоненты спектра "В", отвечают .й спилу сильно иммобилизованной метки, и рост других компонент (Т.и , IQ), являющихся суперпозицией сигаало. двух типов метки. Увеличение подвижности сильно иммобилизованной мыки при

о

дооавле, ли 3-ФГ и S0| з раствор ФГК свидетельствует о. локальном изменении конформации белка в районе Cys-97. Ka основе полученных

зависимостей изменения амплитуд низкопольной к средней компонент

?

спектра от концентрации 3-ФГ или ионов S0¿ оценены константы

■ в

диссоциации (К ) комплексов. Для комплекса ФГК-8о|~ получе. х

Кд=(3±0.5)пй1, для ФГК-З-ФГ процесс носит двухступенчатый характер

с К^<0.5л" и К2>50шМ. Зти оценки хорошо согласуются с данными,

приведенными в литераторе. Добавление ЛТФ в раствор М-БЬ-Е не

меняет спектра ЭПГ

Для расстояние между крайними пиками спектра

лНмакс=62.75Ге. . лНмакс увеличивается до 64.75Гс при добавлении

субстратов - АТФ или 3-ФГ - в раствс, г^БЬ-ЬЕ. Добавление к белку о.

мало меняет лНмакс (63.5Гс). Таким образом, при добавлении субстратов и ионоз сульфата изменения стру...уры ФГК у области ЗН-группы таковы, что движение ртутьсодержащей метки замедляется

Так как характер изменения спектров ЭПР спин-иеток неодинаков для разных субстратов, мэино предположить, что все три вещества (АТФ, 3-ФГ, ЫаБОд) вызывают разные изменения конфигурации глобулы

о

ФГК в области Суз-97. Тот факт, что действие ионов на спектр ЭПР, а следовательно, на нонформацию -макромолекулы в районе Н-группы,• аналогично действию субстрата 3:ФГ, подтверждает предположение И.К.осорег (1978) о том, что анион связывается с ферментом в районе присоединения 3-ФГ. Максимальные изменения спектров для обоих типов спиновых меток наблюдаются при добавлении к белку З-фосфоглицерата, специфического субстрата ФГК. Можно предположить, что этот субстраг приводит к крупномасштабным изменениям конформации белка, то есть к закрытию "щели" активного центра.

Основные' результаты главы: 1. -Найдены оптимальные условия модификации ФГК спин-меткой на основе малеимид . и двумя ртутьсодержащими метками. Показаны преимущества ртутьсодержащих меток: их- быстрое связывание с БН-группой, небольшие соотношения С[(:Сб в процессе мечения, возможность регистрации кинетики иммобилизации радикала.

2. Оценены константы диссоциации комплексов ФГК с субстратами и конами сульфата. Показано, что разные вещества вызывают различные изменения' конформации белковой глобулы. Высказано предположение, что к закрыванию "щели" активного центра приводит связывание с ФГК субстрата, специфичного для данного фермента - 3-ФГ.

3. Выбраны условия работы с белком'ФГК, т.е. области температуры и ph, где стабильность белка максимальна.

о

Глава 4. "Связывание исноа Мп с ферментом фосфоглкцерат-киназой из дрошей". Оценены константы диссоциации комплексов ионов марганца с апоформой белка " с белком в присутствии субстратов. Изучено влияние конов на спектры спин-меченого

белка при комнатной температуре.

Расчеты констант диссоциации (Кд> . проводили при помощи стандартного пакета программ "MCAD' на комь^ютере IBM-PC путем аппроксимации экспериментальных данных расчетными значениями, варьируя Кд как параметр. В эксперименте измеряли уменьшение амплитуды спектра свободного марганца (пересчитывали на концентрацию) при добавлении бел а. Mnf-

0b М

ft. О

Рис. 3. Завт мость концентрации- свободного от концентрации ФГК в растворах:

(О) - 6*10"5М МпС12; (Л ) - 10"4М МпС12>

10"4М да, (О) - ■ В*10'5М МпС12,

10" л\! 3-ФГ. 25шМ HEPES-Ha, гтг=7.4, 0.05М NaCl, -23°С.

о о;г . о,2 о.з ФТкт1ч,

рг

На. рис.3 приведен график зависимости концентрации свободного Мп в растворе от концентрации белка. Для коне-анты диссоциации ионов марганца, связанного • с белком, получено значение

Кд=(1.2±0.3)*10"^М . Этот центр связывания ионов металла можно назвать центром неспецифического связывания (центр НС), так как К. ионов в чем >10"%; центр неспецифичен в том смысле, что связывание в нем ионов не существенно для протекания фосфотрансферазноГ реакции. Этот вывод подтверждают экспериметы с

ионами Mg* . Связывание с ФГК ионов Mg изучали по вытеснению ими

Районов Мп ■ с поверхности *елка (концентрация ионов свободного

/у,

марганца, растет). Получили, что Кд комплекса ФГК с Mg в 8 раз выше, чем для комплекса ФГК с Мп . Следовательно, центр связывания ионов неспецифичен для реакции, канализируемой ФГК, гак как в кинетических измерениях ионы марганца и магния эквивалентны (Larsson-RazniKiewicz, 1970)..

Константы диссоциации комплекса белка с ионами марганца в присутствии субстра^ ->в оценивали согласно модели связывания Мп' в двух центрах с разными константами диссоциации: в упомянутом выше цен.ре НС на белке и центре на субстрате (Кд с субстратом ..звестна). Анализ данных, приставленных на. рис.3 показал, чтс при добавлении МпАТФ в раствор ФГК К в центре НС не изменяется.. Коны марганца сильно связаны с молекулой АТФ, добавление комплекса МпАТФ к раствору белка приводит, по-видимому, лишь к перераспределению связей в координационной сфере Мп '. Для комплекса белка с субстратом, 3-ФГ Кд уменьшается до (x.5i0.3)*10"bM. Очевидно, что в этом случае на ФГК появляется

24

центр сильного связывания и^нов (3-ФГ связывает ионы Мп слабо

К=10'3М). Не исключено, что это центр связывания комплекса д

Ып-З-ФГ в активном центре белка. Можно предположить, что ионы марганца служат „ля координации фосфатных остатков не только АТФ (Watson, 1979), но и 3-ФГ.

4Для белка, меченого M-SL, изучено влияние парамагнитных ионов на амплитуду спектра и, следовательно, на время спин-спшювсй

релаксации Т?_ слабо иммобилизованной метки. Применение метода

Leigh позволило оценить расстояние от спиновой метки до центра НС о

ионов - (22±3)А.

Наличие парамагнитных ионов в центре КС недалеко от спгл-метки скажется и на времен" спин-решеточной релаксации Tj (так как Т^ чувствительнее к присутствию парамагнитных ионов, чем Т2), что помешает вычислению расстояния между SH-группой и ионами в активном центре. Это было подтверждено в эксперименте с ртутьсодержащими метка!".".: Мп существенно влияет на насыщение низкополыюй компоненты спектра сил; ло иммобилизованной метки (HgSL-E) при комнатной температуре. Однако, в присутствии МпАТФ в эквивалентных концентрациях кривая насыщения той же компо' -готы не изменяется в пределах ошибки эксперимента,. Следовательно, та часть Мп2+, которая не.связана с А'ГФ, и остается в центре НС , уже не меняет релаксационных характеристик спин-метки при комнатной температуре, та- как процент белка, несущего марганец в центре ПС невелик. Парамагнитный центр (МпАТФ), находящийся в активном центре фермента, метка "не чувствует", так как расстояние между ними велико. Чтобы повысить чувствительность метода измерения были выполнены при температуре жидкого азота (Гл.5). Основные результаты павы:

1. Показано,, что на поверхности белка существует центр неспецифического (по отношению к фосфокиназкой реакции) связывания

ионов Металл- , K!;to=(1.2±0.3)*10"4M, l№=(9±P.5)*10"4M.

д h

2. Ионы марганца сильнее связываются с комплексом 3-фс,-фоглицерат -ФГК, чем с апофор ой белка Можно предположить, что ионы металла в фосфоглкцэратккиазной реакции служат кз только для координации фосфатных групп АТФ на белке, но и для координации фосфатного остатка 3-фосфоглицерата.

3. При комнатной температуре Мп2+ влияет на ьремя спин-спиновой и

спин-решеточной релаксации белка. Оценено расстояние от

цистеина-97 до цент неспецифического связывания ионов металла на

о

поверхнос:,; белка:(22±3)А. Добавление АТФ в концентрация, эквивалентной концентрации устраняет влия ие парамагнитных

ионов на релаксационные характеристики метки при 23°С.

Глава У. "Оценки расстояний в молекуле дрожжевой фосфоглицераткиназы методом ..асышения спектров ЭПР при 77К"■

Приведены кривые насыщения при 77К для белка, модифицированного ртутьсодержащими метками, в присутствии комплексов МпАТФ и СгАТФ. Кривыми насыщения называем зависимость отнс .ительной амплитуды средней компоненты спектра (IQl рис.2D) от корня квадратного из мощности микроволнового излучения. Рассчитав времена релаксации метки, оценили расстояние между спин-меткой на SH-группе белка и парамагнитными ионами в активном центре.

Результаты одинаковы для HgSL-1 и HgSL-2. В лит'ратуре не было

о

примеров расчета расстояний в макромолекулах, превышающих 25А.

На рис.4 приведены кри. ле насыщения для свободного бел..а и белка' в присутствии ионов Мп2+ при 77К. Присутствие МпС12 ь растворе сильно меняет вид кривой насыщения спин-меченого фермента. При добавлении ионов м.г-танца в раствор свободной HgSL изменений параметров релаксации метки не наблюдали. Как v следовало ожидать , из результатов Гл.4, ионы марганца влияют на времена продольной и поперечной релаксации белка из центра НС. В отличие от экспериментов ьри комнатной температуре, при 77К наблюдали сильное влияние парамагнитных ионов на релаксацию метки в случае квимолярных концентраций МпС12 и АТФ, рис.4.

Из литературы известно о сущее, вовании на белке двух центров связывания адекозинтрифосфата (Scopes, 1978). С помощью метода 31Р-ЯМР расчитачы константа диссоциации комплексов белка с АТФ и МеАТФ (Ray, Rao, 1988), табл.1. Первый центр - место связывания MeАТФ на С-концевом Д' -ене в активном центре. Положение второго

отн.ед.

Рис.4. Влияние МпЛ+ на кривую насыщения HgSL-E, Сб~2*Ю^'М:

(О)- спин-меченый белок (SL-E); (Э) + [МпС121=2.5*10*"М;

-4,1

(Д) + [ MnCIg i=[ АТФ ]-2. 5* Ю М

(А) + (МПС1^]=2.5*10"4М. [АТФ]=5*10"4М. 25гаМ HEPES-Na, рН=7.4, 0.05М NaCl,50% глйцерин, 77К.

центра неизвестно, вероятно, он находится на N-концевом домене ФГК (Adams, Pain, 1986). Ионы металла связываются в трех центрах: в центре НС (Кд='{ 1.2±0.3) *10"4К), з каталитическом центре связ,зани>. AT® в активном центре белка и во втором центре связывания АТФ. Процент белка, несущего парамагнитные ионы в трех центрах связывания Мп2+, приведен в таблице 2.. При добавления АТФ в раствор ФГК и МпС12, процент белка, несущего парамагнитные ионы в центре НС уменьшается с 50 до 17, однако, их влияние на релаксацию метки меняется мало, рис.5. Следовательно, в этом случае ионы Ып влияют на релаксацию радикала не только из центра НС, но и из активного центра, где они связаны в комплексе с АТФ. Во втором центре связывания АТФ парамагнитных ионов практически нет, так как КАТФ<<КГ.АТФ^ £слн к белку добавить МпС12.АТФ=1:2, количество

свободных ионов Мл уменьшится, следовательно, уменьшится число молекул белка, несущего ионы в центре НС. Кроме того, в случае избытка АТФ уменьшается процент белка, содержащего парамагнитные ионы в активном центре. Эти две причины приводят к ослаблению

Табл. 1. Константы диссоциации (М) комплексов ФГК и субстратов

субстрат МпАТФ АТФ СгАТФ 3-ФГ

центр АТФ 6.5*10 5 7*10~5 -

II-центр АТФ =центр 3-ФГ 5*1С'3 5*10"4 6.5*10"5 3*10"5

Табл. 2. %ФГК, содержащей субстраты и парамагнитные ионы металл, .в разных центрах связывания (концентрации субстрато: (2.5-Г5)*1С"4М, Сб=2*10"4М).

лиганд МпС12 МпАГФ 1:1 МпАТФ 1-2 СГАТФ ' СгАТФ 3-ФГ . 3-ФГ

центр АТФ 49%МпАТФ 16ХАТФ 39Й!пАГФ 44%АТФ "Т4ЙСгАТФ"

Н-ц.АТФ =ц.3-ФГ - - 5%АТФ 36%АТФ 74%СгАТФ 91%3-фГ 91%3-Ф

центр НС ионов 50% • 17% 7% - - -

,лияь..я пргмагнитных ионов на релаксацию-метки, рис.4. Добавлен; 3-ФГ в раствор не меняет вид кривых насыщения, приведенных } рис.4. .

Так как активный центр белка невозможно насытить ионами Мп2' не име" этих^ ионов в центре КС, удобнее работать со,стабильны! недиссоциирующим комплексом СгАТФ. В этом случае свободш парамагнитных ионов в растворе ' нет. Константы диссоцнащ комплекса ФГК и СгАТФ для д ух центров связывая: аденозиитрифосфата, а также процент белка, несущего парамагкитге комплекс в разных центрах связывания, приведены в таблицах 1, Изменения кривых насыщения' спин--'еченого бёлка в присутств комплекса ' показаны на рис. 5. ■ Добавление второго субстрата раствор, держащий белок и.МеАТФ, должно привести к закрывай "щели" активного центра и сближению доменов белка, следовательно, к уменьшению расстояния и усилению взаимяцейств мп ду парамагнитными частицами. Как видно из рис. 5,

отн.ед,

0.8

0.6 0.4

).2

О

•БЬЕ

«БЬЕ + СгАТФ «5ЬЕ +СгАТФ +- ФГ

О

8

10

к ТРглВт

Рис. 5. Влияние парамагнитного комплекса СгАТФ на насыщение связанной с белком, Сб=2*10"4М ( г ) - спин-меченый белок (БЬ-Е); ( Д ) - 4.2*10"4М СгАТч-; (о ) - 4.2*10'4М СгАТФ + 8*10"4М 3-ФГ. 25тМ ИЕРЕЗ-Иа, рК-7.4, 0.05М МаС1,Л7К.

уменьшает влияние парамагнитных ионов на релаксацию спин-метки. Это может быть только в том случае, если 3-ФГ вытесняет СгАТФ из второго центра связывания. Наши эксперименты позеоляпт утверждать, что второй центр связывания аденозинфосфата находится в месте связывания 3-ФГ в активном центре белка., Это согласуется с расчетами расстояний до парамагнитных ионов в активном центре, габл.З.

Расчет времен релаксации метки вели путем подбора соответствия теоретических и экспериментальных кривых с помозые стандартного пакета программ "ИСАВ". Теоретические кривые 1асыщения моделировали с помощью уравнения, устанавливающего зависимость между формой кривой насыщения и временами шин-спиновой и спин-решеточной релаксации метки, СавЬпег (1959):

V—*_ехр(а2Х2)11~фН1+Х2Й_ [1}

{1+Х2}1/2 Р1 'И-Ф/пН

[1-Ф(а)]

•де V - относительная амплитуда сигнала ЭПР парамагнитного центра;

*(Т1*Т2)1/<!, Н1" напряженность СВЧ поля, Н^каР2, Р-мощяссть СВЧ поля, к-С.0037; а=(Т2*^[ * лНгО'1- параметр, определяющий степень негомогенности уширения, 4Нр-гауссова полуширина линии; Ф(аО - интеграл ошибок, а-параметр, Ь- временная. .

Варьировали Т^ и Т2, добиваясь совпадения теоретической и экспериментальной кривых. Такой метод вычисления времен релаксации удобен тем, что он не требует регистрации полной кривой насыщения (уме..ишения относ! ельной амплитуды после достижения максимума по крайней мере до половины максимальной величины), то есть применим в ограничег*ом'интервале микроволновой мощности для большинства парамагнитных образцов. .Достаточно зарегистрировать максимум кривой. Значения времен релаксации для свободного белка и белка, несущего ионы парамагнитных металлов, приг 1ены в табл.3. Видно, что в присутствии парамагнитного иона время спит решеточной релакгаций меняется сильнее, чем время спин-спиновой релаксации. Для оценки расстояний между парамагнитными частицами чепольэовали формулу [2], которая получена из более общей зависимости дСТ^)"1 от расстояния мееду спин-меткой и парамагнитным ионом "г", приведенной.. о работах А.В.Куликова С1976), .юсле усреднения пс телеснь«< углам и в приближении равенства £-факторов метни иона.

где и- магнатом Вора .(^-частота резонанса. X время корреляции для

п 1 л р ,

парамагнитных ионов, выбчрали: для Мп "С =5*10 с, для Сг" Т=10"10с. В нашил условиях второй член много,-меньше первого и I расчетах не учитывается. ,

Оценки расстояний приведены в таблице 3. В нижней строчш

этой же таблицы приведены расстояния, рассчитанные на основ! данных о координатах атомов белка. В случае ионов Мп результат: иятерпрет)фор£.ть трудно, так как мы'имеем два иентра свя-лвания ]

ни один из них не насыщен парамагнитными ионами (табл.2;. В случае 3+

ионов Сг оба центра связывания СгАТФ в активном центре насыщены

исиами. "г", расчитаннсе методом ЭПР, разно расстоянию до середины

активного центра, что хорошо соответствует расстоянию,

о

вычисленному из координат атомов - (30±3)А. Добавление 3-ФГ

вытесняет СгАТФ из второго цзктра связывания, парамагнитный

комплекс остае-чя связанным толоко на С-концевом домене на о

расстоянии (38+3)А от парамагнитной "етки. '.

Таблица 3. Времена спин-решеточной (Т1) и спин-спиноеой (Т2) релаксации спин-метки, связанной с Слком. Расстояния в молекуле ФГК

своб белок +МпС12 +МпиТФ 1:1 +Мг.АТФ 1:2 +СгАТФ +СгАТФ 3-ФГ

Т^Ю^с 2.2 0.25 0.3 1 0 75 1.5

Т2*Юу,с 1.3 0.7 0.8 1 1.25 1.3

г А ' расч.*" - 35 36 44 30 33

г 1 крис. ' - - - - 33 40

Основные результаты главы:

1. Показано, что присутствие парамагнитных ионов в активном центре ФГН влияет на время релаксации спиновой метки, связанной с БН-группой белка. Мп2+ меняет релаксационные характеристики метки, не годясь в центре неспецифического связывания, что затрудняет интерпретац :ю экспериментов с этими конами.

2. Предложен метод вычисления времен релаксации метки на основе ее кривых насыщения при 77К, преимущество которого заключается в том, что нет необходимости иметь полную кривую насыщения, достаточно лишь зарегистрировать .а максимум. Проведены рассчеты расстояний в макромолекуле белка для к^нов с g-фaктopoм, близким к g-фaктopy метки.

3. Используя стабильный комплекс СгАТФ, . оценили расстояние от

SH груты приблизительно до середины активного центра (ЗОА) и до

■ ■ о

основного места связывания АТФ в активном центре - 38А. Таким

образом, метод позволяет вычислять достаточно большие расстояния

на поверхности белка. _ .

4. Показаьо, что вч^рой центр связывания АТФ находится в активном

центре белка в месте связывания 3-ФГ.

Глава 6. "Изменения скорости релаксации пготонов воды при добаолении субс. ,.атов к ферментам фосфоглицераткиназе и глицерапьдегидфосфатдегидрогеназе".

Основн й.задачей данной главы являлось детальное исследование эффекта уменьшения скорости протонной магнитной релаксацнии (ГШР) воды при добавлении субстратов к дрожжевой ФГК (Куприн С.П., Денисов Б.П., 1989), а также доказательств1 того, что этот эффект связан с изменением конформации белковой глобулы ' скрыванием "щели" активного центра) при связывании белком субстратов.

.С этой целью изучали' зависимости скоростей продольной ( 1/Т^)=Rj. и поперечной (l/'^bf^ В°ДЫ от концентрации белка. При добавлении 2тМ 3-ФГ' к растворам Ф1К тангенс угла наклона концентрационных прямых (зависимости • Рц 2 концентрации ФГК) уменьшается для R1 на 41%, для R2 на 19%, рис.б. При добавлении ' 8шМ АТФ изменения R существенно ме^ше: 7% и 8% соответственно. Дальнейшеее увеличение концентрации субстратов не пр^о.дит к изменению ПМР воды для 3-ФГ и уменьшает Р. в' случае добавления 3-ФГ в раствор белка и'АТФ до значений представленных на рис.6. Полученшле результаты уменьшения скорости,. ПМР ' воды можно интерпретировать как вытеснение во,гч из активного центра белка вследствие закрывания "щели" активного центра белка при связывании им субстратов. ' .

Чтобы показать, что эффект связан с такими изменениями " -^Формации fiejiKn, надо доказать:

Зависимости продольной Я^/Тт к нопорочпойЯ^ХЛ^ скоростей-протонной магнитной редаксадаи вода от коицевтрацЕИ Ль^ментол ( 25 мМ ИЕРЕБ-Ка, рН7.4, 0.05М МаС1, 5°С):

Рао.6 Дрожжевая фосфоглицераткиназа. (0,Д ) - алофермент, ( е, А) - фермент с 2гМ 3-?осфогляцвратом.

Рис .7 Глицераяьдегшйосфатдетадрогепаза. .( О ,Д) - свободный

фермент,- ' 3,д) - ферме гас 1.7 мГД глицеральдегидфосфатом.

- сущр"твует предельная концентрация субстрата, выше которой его добавление не. меняет скорость релаксации протонов воды. Эта концентрация должна согласовываться с извг -тными константами диссоциации субстратов.

- если наблюдаемый .аффект связан с ферментативной активностью ФГК, он должен наблюдаться и для любого другого белка, закрывающего "щель" активного центра в акте ферментативного катализа.

- эффект должен бь ь специфичен для собственных субстратов белка.

Титрование субстратами 3 и 6% растворов белка регистрироЕ 1и -зависимость скоростей релаксации от концентрация субстратов, рис.8 для 3-ФГ,- позволило оценить константы диссоциации комплексов ФГК-субстрат. Кд оценивали с помэщьх моделирования -экспериментальных кривых титг звания теоретическими,

Р2

2.0

6%

1.9

И.З

3 /о

-81.3

I 2 3 ~ о I 3-ФГ тМ

Рис.8. Зависимости скоростей продольной ¡^ и поперечной И релаксации протонов воды от концентрации 3-ФГ в раствора дрожжевой ФГК: (О, О) - 6% белок, ( Д , к ) - 3% белок. ?.5шМ НЕРЕЗ - На, рН-7.4, 0.05М ЫаС] , 5°С.

гспользуя стандартный пакет программ "МСАй". Для 3-ФГ / ■ - 5

Сд=(5.5±2)*1С 'М, что соответствует связыванию 3-ФГ в активном венгре. Для АТФ КД=(7.5±2)«10*4М, что соответствует константе

о

ыссоциац.ш этого с>остратз во втором центре, табл.1 Иены БС^ не (еняют скорость релаксации протонов воды в растворе ФГК.

Для фермента ГАФДГ добавление 1.7мМ глццералъдегидфосфата ГАФ) приводит 1 24% изменениям таьгенса уг^ч наклона для К, и Р,2, >ис.7. 2мМ 3-ФГ в этом случае дает ишь 10% изменения, а ЗмМ АТФ • ювее „а меняет тангенса угла наклона. Аналогично для ФГК., 1.7мМ-'ЛФ не меняет релаксационных харак.еристик протонов воды раствора, контрольные эксперименты проведень. с 3% раствором альбумина. Для того белка ни 3-ФГ, ни ГАФ не меняют скорость релаксации протонов ¡оды раствора. Таким образом, показа, х сг :цифичноеть эффекта для обственных субстратов фермента. Для ГАФДГ зарегистрированы также ■ зменения скорости релаксации протонов воды при добавлении в ^ 'астзор второго субстрата - НДДН. Фермент козалентно связывает АФ, поэтому определение константы диссоциации в этом случае не меет смысла. Кривые титрования ГАФДГ глиперальдегидфосфатом зависимость И от концентрации белка) позволили сделать вывод, что ри насыщении белка субстратом с одной глобулой в молекуле ермента связывается одна молекула субстрата.

¿.олица 4.Тангенсы угла наклона линейных зависимостей Н^ ¿^б^ и оличество "вязанной с белком воды..

макс.конц, белка,субстрат 6%ФГК 6%ФГК 3-ФГ 6%ФГК АТФ 4%ФГК 5.5%ГАФДГ 5.5%ГАФДГ ГАФ

ьв, 7 4.2 6.3 6.5 11.5 8.8

tg2 24 18.8 22.2 24 57.8 47.3

N связ . 212 З/ч 192 207 425 338

N % СЗЯЗ' " - 30 9 - - 20

Если допустить приближение, что в растворе есть только две

7.2

фракции водь;: связанная и свободная, можно оценить изменени; количества связанной с белком веды по результатам экспериментов приведенных на рис.6,7. Е расчетах учитывали толы вращательну релаксацию протонов, поэтому лишь относительные изменени количества связание" с белком воды имеют смысл, табл.4. Основные результаты главы:

1. Зарегистрировано уменьшение скорости магнитной релаксаця прот юв воды при "обавлении субстратов к ферментам,ФГК и ГАФдГ.

2. Проведенные эксперименты позволяют утверждать, что уменьшен! скорости ПМР воды в растворах ферментов связано именно ферментативной активностью белка и обусловлено вытеснением воды ! активного центра при связывании субстратов.

3. Методом ПМР в.еды оценены константы диссоциации комплексов Ф. с субстратами. Резуль. ты согласуются с данными литературы, также с оценками", сделанными на основе метода ЭПР.

Для фермента ФГК показано, -что только связывание специфическо для белка субстрата З-ФГ приводит к закрыванию щели активно центра.

Заключение, Приведенные выше результаты экспериментов ЯМР

совоку- ности с результатами исследований ФГК методом ЭПР г'зволг

о.

представить следующую картину связывания субстратов и ионов БО^ - Связывание специфического для белка ФГК субстрата - 3-приводит к изменениям конфорыации всей белковой глобулы, иото| выражаются в закрывании'"щели" активного центра (так как в слу З-ФГ изменения всех экспериментальных величин максимальны). Есл! активном центре белка уже связан Аг ■> (концентрация этого субстр в клетке велика), то связывание З-ФГ приводит к элементарному а химической реакции.

Связывание ЛТФ в основном месте в активном центре не приводи изменениям кнчфорнация белка. Возможно, оно проявляете.« лшш

изменениях конфигурации белковой поверхности (что видно по изменению формы спектра ртутьсодержащей метки). Связывание АТФ в центре связывания 3-ФГ приводит к частичному вытеснению воды из активного центра, однако, полное закрывание "щели" активного центра затруднено, по-видимому, стерическими препятствиями, рис.1.

п

- Коны БО^* связываются в центре 3-ФГ (возможно, и в других участках поверхности белка), что видно по изменению спектров ЭПР спин-меченого белка, но не приводят к закрывзнию "щели" активного центра.

Связывание всех трех веществ в центре 3-ФГ обусловлено пулом положительно заряженных аминокислот в этом участке активного центра. ВЫВОДЫ: ' '

1. Найдены оптимальные условия модификации единственной БН-группы ФГК спиновой меткой на основе малет'мида и ртутьсодержащими метками. Показаны преимущества ртутьсодержащкх меток в » исследовании белков.

2. Установлено, что присоединение к молекуле ФГК субстратов - АТФ и 3-ФГ - и ионов сульфата приводит к разным изменениям локальной конформации белка в области цистеияа-97.

3. Радиоспектроскопическими методами показано, что закрывание "щели" активного центра белка вызывает его специфический субстрат 3-^осфоглицерат.

4. Радио лектроскопическими методами измерены константы диссоциации комплексов ФГК с субстратами и анионами сульфата.

5. Разработан метод регистрации внутримолекулярных расстояний с помощью насыщения спектров ЭПР при 77К в ограниченном интервале СВЧ-мощности для ионов с g-фaктopoм равным £-фактору метки.

6. Установлено, что второй центр связывания аденозинтрифосфата находится в месте связывания 3-ФГ в активном центре белка.

7. Показано, что ионы Мп2+ сильнее связываются с комплексом

ФГК-З-^г, чем с апоформой белка. Можно предположить, что ионы металла слуиат для, координации фосфатных групп не только АТФ, но и координируют фосфатный остаток 3-ФГ.

8. На примерах ФГК и ГАФДГ доказано, что изменен' ' количества прочно свкзанной веды при связывании белком субстратов происходят за счет изменения конформации белка в акте ферментативного катализа.

Основные результаты диссертации опубликованы в следую.щш работах: ■

1. Власова Куприн С.П Изучение фосфоглицераткиназы из дрожжей методом спиновых меток. - Биохимия, 1985, т.50, с.1738-1742.

2. Власова И.И., Куприн С.П. Исследование методом электронно« парамагнитного резоиаса связывания ионов марганца с фермеито» фосфоглицераткиназой из дрожжей. - В грудах V Всесоюзно} Межуниверситетской конф. "Биология клетки", Тбилиси, 1987, ч.1 •С.439-441.

В-.асова Я.И, Изучение взаимодействия ионов Мп^+ с ферменте: фосфоглицераткиназой из дрожжей методом ЗПР. - Депон. в ВИНИТИ 1989, N642-В90.

4. Vlasova I.I., Kuprin S..P. Electron s; in resonance relaxatioi study of substrate binding to sping-label led уеал1 phosphoglycefate kinase. - Abstract book of Inter.Symp "Molec.organ.of biol. structures", Moscovi, 19Й9, v.l, р.16С

5. Власова И.И., Куприн С.П., Нушнарева Т. Г. Определена расстояний в молекуле дрожжевой фосфоглицераткиназы методо1 насыщения спектров ЭП? при 77К. - Тезис" докл. XI конф. "(.¡агнитна резонанс в биологии и медицине", Звенигород, 1990, с.34.

6. Куприн С.П.., Власова И.И., Денисов Б.П. Регистраци. . ¡информационных изменений ферментов, методом протонной магнитно

релаксаЦии воды. - Тезисы докладов XI конф. "Магнитарезонанс биологии и медицине", 1990, с.35.

7. Vlasova I.I., Denisov V.P. ,• Kuprin S. P., Revocatov O.P. Th decrease of water proton NMR relaxation rates upon substrat bingding to the yaest phot. aoglycerate kinase. - Studi