Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Биохимический полиморфизм наследственной недостаточности эритроцитарной фосфоглицераткиназы человека

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Биохимический полиморфизм наследственной недостаточности эритроцитарной фосфоглицераткиназы человека"

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ СССР

ВСЕСОЮЗНЫЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА И ОРДЕНА ТРУДОВОГО" КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГЕМАТОЛОГИЧЕСКИЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР

На правах рукописи

РАШИДОВА АФАГ МАМЕД кызы

БИОХИМИЧЕСКИЙ ПОЛИМОРФИЗМ НАСЛЕДСТВЕННОЙ НЕДОСТАТОЧНОСТИ ЭРИТРОЦИТАРНОЙ ФОСФОГЛИЦЕРАТКИНАЗЫ ЧЕЛОВЕКА

(03.00.04 — Биохимия)

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва —

19 0 1

РпГмгга выполнена в Институте молекулярной биологии и биотехнологии Научно-производственного объединения «Биотех» Академии наук Азербайджанской Республики.

заслуженный деятель науки РСФСР, доктор медицинских наук, профессор Ю. Н. ТОКАРЕВ,

кандидат биологических наук К. М. МОВСУМ-ЗАДЕ.

доктор биологических наук, профессор С. С. ШИШКИН, доктор медицинских наук, профессор С. И. КОЗЛОВА.

Ведущее научное учреждение — Институт питания АМН СССР.

Защита состоится «. . .» ....... 1991 г. в ... час.

на заседании специализированного совета Д 074.08.02 Всесоюзного ордена Леиина и ордена Трудового Красного Знамени гематологического научного центра МЗ СССР (125167, г. Москва, Новозыковский проезд, Д. 4«а»),

Научные руководители:

Официальные оппоненты:

Автореферат разослан

1991 г.

Ученый секретарь специализированного совета, кандидат биологических наук

В. Д. РЕУК

СБцЛЛ ХЛРА1СГ2П IGTIuiA РАБОТЫ

Исследованиями последних лот особое значение придается изучению роли различных ферментных систем в реализации физиологических процессов в организме.

сто достигается изучением колебания как основных: функциональных ( активность, Ii;l в отнопении субстратов, рН~оптимука, элек-трофоретической подвижости, нуклеоТ1!дкой специфичности, термостабильности и т.д.) показателей, так и параметров измененных форм. Последние могут являться следствием выпадения или частичного искажения действия в результате мутаций генетических факторов синтеза отдельных ферментов и способны детерминировать развитие наследственных онзныопатпй.

Поэтому исследование структурно-функциональных особенностей нормальных и измененных ферментные систем является одной из актуальных проблем современной биохимии.

Установление перш.- -.ого биохимического дефекта при каждой мутации структурных: или регуляторшх генов является основополагающим для изучения любой формы моногенного нарушения, так как аномальные белки являются главной причиной последующих изменений клеточного метаболизма и функционирования организма в целом. Генетически предопределенная недостаточность активности некоторых ферментов гликблиза приводит к анемии, и как следствие, к повреждению ряда систем органов, что объясняется функционированием в их тканях мутантного гена.

В частности, дефицит активности одного из ключевых ферментов генерации АТ2 в гликолитическом пути превращения глюкозы - фос-фоглицераткиназы (ФГК; АТЗ: З-фосфо-Д-глицерат-1-фосфотрансфера-за; КЗ 2.7.2.3), приводит к нарушению гликолитичесиого цикла, что клинически выражается несфероцитарной гемолитической анемией, а у мужчин такте и нервно-психическими расстройствами.

Синтез фермента 2ГК контролируется единственным структурным геном, локализованным на X -хромосоме, поэтому недостаточность фермента передается по наследству как признак, сцепленный с полом, чаще рецессивного характера.

В силу Х-сцепленности ЗГК является одним из исключительных объектов для изучения мутационного разнообразия белков вообще, и ФГК в частности.

3.

Акг^льность_темьк Анализ научной литературы по распространению ФГК-недосгаточности в ряде зарубежных стран отмечает, что частота встречаемости дефекта выше ч зонах с высоким кооффициен--том инбридинга.

Б силу этнических особенностей Азербайджана, результирующих высокий коэффициент инбридинга, а такие с учетом эндемичности некоторых наследственных нарушений, в частности, энзимо- (Мов-сум-заде K.M. и др., 1934; Лысенко Л.Я. и др., 1973) и гемогло-бинопатий (Мовсум-эаде K.M. и др., 1905), г "составляется актуальным исследование распределения среди населения республики му— тантных форм эритроцитарной ЙГК. Актуальность изучения ФГК-дефи-цита возрастает с учетом отсутствия как в Азербайджане, так и в других регионах страны работ по данному вопросу.

_Ц22Ё_и_защачКд Целью настоящего исследования является анализ частоты и биохимических особенностей аномального фермента СЕГК среди лиц азербайджанской популяции.

Для выполнения поставленной цели выдвинуты следующие задачи:

1) разработка и внедрение метода идентификации мутантной эритроцитарной ÜTK, приемлемого для клинических и популяционных исследований;

2) проведение популяционных и юшнико-гематологических исследований среди населения города Баку, а также Шекинского и Ахсу-инского районов республики;

3) осуществление клинияо-гематологического и генеалогического анализа в семьях пробандов с дефицитом фермента 2ГК;

'4) выделение, частичная очистка и изучение физико-химических и кинетических свойств различных форм фермента эритроцитарной ФГК из крови доноров и пробандов,

_Научная_новизна1_ Разработан прлуколичественный. скринирующий

метод флюоресцирующих пятен для идентификации эритроцитарного ЙГК-дефицига при массовых обе: даваниях.

Внедрение метода осуществлено в детской неврологической клинике и на кафедре невропатологии и медицинской генетики Азербайджанского ордена Трудового Красного 8намени государственного медицинского университета им. Н.Нариманова.

Впервые в Азербайджане проведено массовое обследование кителей на выявление ФГК-недостаточности, изучена и установлена час-

гота встречаемости ЗГК-дефицита в 2-х районах (Шеки и Ахсу) республики, а такне в г. Баку на фактическом материале около 4000 образцах крови. >

Модифицированным нами методом очищены, выделены и охарактер!. зованы по физическим, химическим и кинетическим параметрам нор-мальние и мутантные молекулярные варианты $ГК.

Гетерогенные \вари анты -5ГК эритроцитов человека дифференцировались на основании изучения уровня активности, сродстза к суСстратам З-З1 и АТФ, злектрофоретической подвижности, рН-оптимума среды определения, термостабильности, нуклеотидной специфичности ферлентного препарата, выделенного и очищенного разработанным нами методом. Указанный комплекс методических приемов позволил выявить 4 типа мутантных вариантов. Для облегчения и ускорения обнаружения -мутантных вариантов б клинических и популяциоших исследованиях предлагается модифицированный метод идентификации ЗГК-недоста-точности эритроцитов,по степени дефлюоресценции НДД«Н.

ШГК-энзимопатия эритроцитов в Азербайджане распространена с частотой 0,0292 -ф,505, имеет наследственный характер, что подтверждается сопоставлением числа опираемых и наблюдаемых носителей мутантного аллеля в ядерных семьях и-соответству ет гипотезе сцепленного с Х-хромосомой наследования. Клиническое проявление ¡ЕГК-недостаточности отличается полиморфизмом, наиболее характерны гемолитическая анемия и нервно-психические нарушения.

^¡¡иктическая_уенность._ Разработанный нами метод флюоресцирующих пятен для идентификации эритроцитарной 2ГК можно использовать в клиниках как диагностический тест.

Доступность пересылки образцов крови по почте, не оказывающая значительное влияние на ее качество, а также возможность исследования более 100 проб в день позволяет использовать указанный метод для классовых популяционных работ по выявлению и изучению распространения ФГК-недостаточности.

Своевременная диагностика аномальных ферментов способствует проведению эффективных мероприятий по коррекции обменного нарушения, с целью предотвращения клинических осложнений и нервно-психических отклонений. С другой стороны, предлагаемый метод

позволяет выделять группу гетерозиготных носителей мутантного гена, что может быть использована при медико-гензтлческом консультировании.

Идентифицированные молекулярные варианты ОГК позволяй! установить характер мутации белка, свойственной популяции Азербайджана.

Лубликащш.. По материалам диссертации опубликовано 9 научных работ, из которых: 5 - в центральной и 4 - в республиканской печати.

_Апробацкя_работы. Материалы диссертации доложены и обсундены на 11-ом Всесоюзном съезде медицинских генетиков ( г.Алма-Ата,

1990 г.); на Всесоюзном гаколе-семинаре "Молекулярная биология и медицина" ( г.Ленинград, 1990 г.); 11-ом съезде гематологов и трансфузиологов Азербайджана (г.Баку,1990 г.): республиканской конференции аспирантов (г.Баку, 1984 и 1986 г.г.); научных се-М"нарах Института молекулярной биологии и биотехнологии НПО "Био-тех" АН Азерб. Республики (г.Баку, 1990,1991 г.г.); заседании проблемной комиссии "Патология эригрона" ВГНЦ МЗ СССР (г.Москва,

1991 г.); Всесоюзной научной конференции молодых ученых и специалистов, где выступление на тему:"Случаи сочетаниях форм дефицитов ферментов фосфоглицераткиназы с глюкозо-6-фосфатдегид-рогеназой" отмечено дипломом (г.Баку, 1991 г.).

_2бъем_и_сгруктура_работыд Диссертация изложена на 122 страницах машине ;иси; состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и использованных методов исследований, собственных результатов исследований и их обсуждения, заключения, выводов и библиографического указателя, содержащего 171 источников, из коих 16 отечественных и Еэзарубежных авторов, содержит 15 таблиц и 14 рисунков.

СОДЕШНИЕ РАБОТЫ Глава I. Биохимия фосфоглш*е£ат1^ады^Б1^ишческий_шлшорфизм_

Обзор состоит из двух частей. В первой части дается анализ литературных данных по строению и функции ФГК, механизму реакции и кинетике, субстратной специфичности, активации и ».нгибиро-вания фермента, а также его функции в эритроцитах, то есть, био-

е

химическая характеристика и функциональное значение этого фермента .

Во второй части содержится обзор современной литературы по наследственным энзимопатиям эритроцитов, и в частности, фосфо-глицераткиназы и ее биохимическому полиморфизму. Рассмотренные в обзоре работы указывают на своевременность и актуальность исследования структурно-функциональных особенностей нормальных и измененных ферментных систем, в том числе и 2ГК, в различных популяциях.

Приводится описание разработанного совместно с проф. Т.К.Ка-дыровой, К.М.Мовсум-заде и З.М.Агарзаевой модифицированного скрининг-теста флюоресцирующих пятен для знзим-диагностики ФГК-дефицига, основанного на окислении НДЦ'Н, визуально наблюдаемому в лучах ультрафиолетового света, при Д=340 нм. Сопоставление данных, подученных различгшми методами (Бойтлер, 1975; Васа, 1981) с предложенным нами модифицированным, свидетельствует об их идентичности и позволяет в силу ряда преимуществ отдать предпочтение последнему, наиболее удобно^.

Количественное определениз активности £ГК и некоторых других ферментов гликолитического и пентозофосфатного цикла превращения глюкозы, а 'также идентификация нормальных и аномальных молекулярных форм <ЕГК проводилась в венозной кроЕИ объемом 1,0-1,5 и 6,0-10,0 мл, соответственно. Показатель гемоглобина определялся гемоглобинцианидным методом, а гематокрита - методом осаждения форменных элементов в градуированных пипетках при центрифугировании. Контролем служила группа доноров центральной станции переливания крови МЗ Азербайджана, дзти дошкольного возраста, школьники и студенты. Массовые обследования на выявление ФГК-де- • фицита проводились среди населения ¡Пекинского и Ахсуинского районов Азербайджана, среди выходцев из различных районов республики, проживающих в городе Баку, в частности, студентов вузов и лиц, находящихся на стационарном лечении в детской неврологической больнице при кафедре невропатологии и медицинской генетики Аз.гос. медукиверситета им. Н.Нариманова. При обнаружении ЗГи-дефицита проводилось генеалогической исследор^ние. Количественное определение активности ферментов 5ГК, Г&ВД, ПК, ГР и ГФИ в гемолизатах

проводилось по рекомендованным методам исследования эритроцитар-ных ферментов, разработанных интернациональным Комитетом стандартизации в гематологии (Бойглер, 1977). За единицу активности приняли количество фермента, катализирующее превращение одного микромоля субстрата НАД или НАД'Н в минуту, при длине волны 340 нм с миллимолярным коэффициентом активности, равным 6,22.

' Для изучения физико-химических и кинетических параметров iTK с целью идентификации молекулярных вариантов, фермент выделяли и очищали из эритроцитов по модифицирование.! нами разработке, основанной на методах Ёшида и сотр. (1972) и Али М. .и сотр. (1976), которая заключается в использовании меньшего количества исследуемого материала, в данном случае крови человека и сокращения числа проводимых стадий по следующей схеме:

1дЛВ2Е2221ШШМ£_2Ш2Е2ШШШ.1._

• Отделение эритроцитов центрифугированием при 15 n00 g в теч. 20 мин. Промывание эритроцитов дважды в 2-х объемах раствора "А", смешивание с эквивалентным объемом раствора цитрат-глицеро-ла. Диализация против 10-ти объемов HgO в теч. г ночи. Замораживание.

Смешивание эритроцитов с этанол-хлороформом (2:1, 1f /у , при -60°С) в теч. 20 мин. на магнитной мешалке. Центрифугирование при 15 0C0<j, в теч. 20 мин. Добавление к супедэнатангу 15-ти объемов этилового спирта (при -25 С). Постепенное помешивание на магнитной мешалке в теч. 20 мин. Цон-трифугирование при 15 ООО ^ в теч. 20 мин. Дис-сольватация осадка 0,01 Ы фосфатным буфером, .. рй-7,0 в течение ночи.

III. Вьщеление--и_очистка_ДГК.

Центрифугирование при 15 ООО ^ в теч. 30 мин. Диссольватация осадка 0,01 М фосфатным буфером, pH 7,0. Нанесение образца на КМ Сефадекс С-50, ураиювгшаннЕГо 0,01 М фосфатным буфером, pH 7,0.

Элюцня фермента с Сефадекса 0,01 М фосфатным буфером, pH 7,0. с Концентрация ультрафильтрацией.

Насыщение фермента 30-65 %-vm (NH^JgSO^ путем диализа - отив 0,1 М фосфатного буфера при pii 7,0 в течение 48 часов.

Учитывая отсутствие методических рекомендаций для идентификации молекулярных вариантов ЗГК, критерии для дифференцировки мутант шк аллелей были выбраны по примеру исследования аномальных ферментов прочих энзкмопатий. Идентификацию нормальных и мутант-ных аллелей ФГК проводили по кинетическим ч физико-химическим параметрам фермента. Изучены электрофоретическая подвижность фермента в ПААГ-е методом диск-электрофореза,'константа Михаэлиса-Ментен в отношении субстратов З-ЗгГ (0,05 - 35,0 ыМ) и АТФ (0,05 -10,0 мМ), термостабильность при 45°С среды определения, рН-оп-тимум, а также нуклеотидная специфичность в отношении нуклеоти-дов-аналогов ГТ®, УТФ и ЦГФ. Молярные концентрации субстратов для определения температурный режим для установления термостабильности фермента, а также подбор рН-среды для определения piI— оптимального условия функционирования фермента отработаны экспериментально.

Достоверность различий между двумя средними для независимых совокупностей оценивалась методом Стьюдента (Лакин Т.О., 1968).

Глава 3. Результаты исследования и их обсуждение.

Приводятся данные исследования контрольной группы лиц по изучению активности 5гГК в эритроцитах здоровых людей популяции Азербайджана в зависимости от пола, возраста и национальности.

I. Активность эритроцитарной ФГК в зависимости от пола и возраста среди здоровых лиц:

I. взрослые

II. дети

О л 211,6 + 9,58 232,02 + 14,38

о 8 п = 120 л = 60

1 206,4 + 7,74 224,2 + 13,8

С ю п = 60 п = 30

ж и X / 216,8 + II,42 239,8 + 14,86

1=1 ф п = 60' И = 30

о со л 324,17 + 32,7 354,99 + 32,47

в о. п = 120 п ■= 60

п

и и ? 323,3 + 15,95 343,03 + 28,63 ■

и X п = 60 п = 30

1=1 О) / 326,54 ± 28,67 366,89 + 33,02

п = 60 п = 30

2. Активность £ГК (ед/гНв при 37°С) в эритроцитах практически здоровье, лиц, различных этнических групп, проживающих в Азербайджане:

/I I

азербайджанцы 324,17 323,3 ■ 326,5

русские 357,16 336,03 378,28

др. национальности 385,75 365,2 406,29.

Как видно, среднее значение активности ОГК в эритроцитах здоровых детей в зозрасте от 3-х месяцев до 15 лет превышает таковою у взрослых (от 15 до 70 лег) в среднем на 30,82 + 18,77 ед/гНв при 37°С среды определения, что можно объясните интенсивным эритропоэзом у детей. Активность фермента у женщин ниже, чем у мужчин, что вполне объяснимо Х-сцепленностыо и гипотезой X-инактивации Э?К (Валентин, 1969; Дейс, 1972; Конрад, 1°73).

При сопоставлении изменения показателей активности ферменк по полу и возрасту установлены статистически достоверные различия между взрослыми мужчинами и женщинами ( по кри 'ерию Стью-дента). Эти различия выражались высокой активностью фермента у мужчин iij - 10,12;^ = 3,4; р<0,001). Различия между возрастными группами внутри пола и в целом мевду взрослыми и детьми оказались статистически недостоверными.

Наблюдаемые различия энзиматической активности в эритроцитах практически здоровых лиц различных этнических групп, проживающих .в республике, говорит о том, что для каждой этнической группы в казвдой популяции нужно отработать свою контрольную груг пу и установить средний показатель нормального уровня для последующей идентификации 2ГК-дефицита.

Полученные данные были сопоставлены с показателями, полученными методом полуколичественного определения, то есть, методом флюоресцирующих пятен для идентификации дефицита эритроцитарной 5ГК. Предложенный Baca в 1981 году тест в качестве скринирующе-го, имеет ряд недостатков и трудоемок в работе. Исходя из этого, нами разработана модификация метода, более приемлемая для массовых исследований, заключающаяся в следующем:

1. для удобства работы в экспедиционных условиях крочь.забиралась на хроматографическую бумагу -FH=I3, что:

а) эффективно для пересылки и хранения образцов;

б) экономично, так как исключается применение дорогостоящего биореактива - антикоагулянта гепарина;

2. изменен состав буферной среды (табл. I).

__Вшвление_тосител2й_^К^ефищ}га_.__

Анализ результатов исследования отдельных популяций позволил установить частоту носительства мутантных генов, составивших: среди жителей Шекинского района 2,0% - геми-, гомо- и 5,3% - ге~ герозигот; среди жителей Ахсуинского района - 1,2% к 3,0%; по городу Баку - 1,2455 и 3,4%, соответственно. •

Для проверки гипотезы :. о оцепленном с Х-хромосомой наследовании проводилось сравнение ожидаемого и фактически наблюдаемого числа пораженных. В оценку ожидаемой сегрегационной частоты необходимо включить показатели частот доминантного и рецессивного аллелэй из совокупности взятых наудачу и ничем не связанны: между собой особей. Соответственно гипотезе условного доминиро-

Таблица I.

Сравнение методов идентификации йГК-дефицига при различных условиях сре.г' определения.

Реагенты _ ,j Конечная конц-я (М) Объем в смеси (мкл)

модиф.метод прототип мод.мет.'прото-! тип

трис-HCI б.(рН 8,0) ——. I _ 300

трис-НС1/ЭДГАб.(рН8,0) 0,1/0,0005 ' - 400 -

MgCIg 0,01 • 0,01 100 100

АТЙ 0,08 0,08 100 100

3-й1 0,5 0,5 200 200

НДЦН 0,005 0,005 . 100 100

гаэд 40 ед/ыл 40 ед/мл 100 100

гемолизат I диск+400 1:50 20 10

мкл HgO

Н20 ____ ___ - 100

вания среди женщин различается 3 фенотипа, а среди цужчин -2, поскольку, генетическая классификация пораженных сводится к гегеро-, геми- и гомозиготноети. С учетом изложенного, частоты цутантного и нормального аллелей, вычисленные для каждой исследуемой популяционной выборки в отдельности составили:

Баку: <j,= 0,0292; р = 0,9708; ¿= 0,0045;

Шеки: ц = 0,0505; р = 0,9495; ¿= 0,0055;

Ахсу: cj =' 0,0329; р » 0,9671; 3= 0,0045.

Математическое ожидание численности каждой категории получено путем подстановки оценок генных частот. Разница между теоретически ожидаемым и фактически наблюдаемым чисд^м больных оказалась статистически недостоверна. Значения J[ колебались от 1,623 до 0,009; р?-0,05. Совместимость полученных данных с вьщвинутой гипотезой не только подтверждает тип наследования, но и предполагает шполненив условий устойчивого равно вес да закона Харди-Вайнберга.

Результаты проведенного анализа можно расценивать как формальное доказательство локализации в Х-хромосомэ гена фермента

агк.

12.

Последующее исследование среди пробандов других ферментативных систем, как окислительно-восстановительного, так и энергетического ' ряда выявило закономерное компенсаторное повышение активности пи-руваткиназы и гексофосфоизомеразнг, при нормальных значениях глюко-зо-6-фосфатдегидрогеназы и глютатион-редуктазы.

Наследственный характер нарушения подтверждался обследованием членов семьи пробандов.

Среди 537 детей, находившихся та стационарном лечении в детской неврологической больнице,в 43-х случаях выявлено значительное снижение активности ФГК: из них 35 - гетерозиготных; 8 - геми- гомозиготных носителя гена дефицита £ГК. Кроме этого 3 человека - с гиперактивностыо фермента. Больные с-дефицитом фермента в основном лица мужского пола. Клинические проявления нарушения характеризуются полиморфностыо и выражаются с одной стороны различной степенью отклонения нервно-психической деятельности (отставание в интеллектуальном развитии, задержка речи, плохое усваивание школьной программы и т.д.), с другой же - гемолитической анемией. Зачастую указания на наличие гемолитической анемии отсутствуют.

Есть основания предполагать, что нарушение деятельности нервной системы своим происхождением обязано избирательному участию ОГК в обменных процессах нейрона.

Из анамнеза матерей установлено, что периоду беременности сопутствовали различные инфекции (стафилококковая, гриппозная и др.), токсоплазмоз, анемия, болезни печен: и почек.

Особо следует отметить случаи сочетания дефицита двух локализованных в Х-хромосоме генов ферментов: ЗГК - ключевого фермента генерации АТЗ; и Г6ФД - играющей важную роль в цикле редукции глю-татиона. При этом нарушении выявлено повышение активности ферментов пируваткиназы и глютатион-редуктазы, имеющее, вероятно, компенсаторный характер. Семейное обследование подтвердило наследственный характер передачи аномальных генов. Во всех случаях соче-ганных нарушений в клиническом проявлении помимо нервно-психических отклонений, отмечалась выраженная гемолитическая анемия. Среди детей пробандов наблюдалась высокая смертность в раннем детском возрасте. Биохимическая картина"характеризовалась наличием в мазке крови телец Гейнца-Эрдиха и повышением аутоГемолиза, обусловленных нарушением синтеза ферментов «ГК и Г6СД.

Таким образом, клинические, популяционные и биохимические исследования, проведенные в Пекинском и Ахсуинском районах, а также городе Баку позволили обнаружить сочетанные формы дефицита 5ГК и Г6ФД, которые на фоне сопутствующих интеркуррентных инфекций могут снижать общий иммунный фон организма и даже могут стать причиной летального исхода в раннем детском возрасте.

Анализ показателей активности фермента $ГК позволил выделить носителей аномального алле'ля. Так снижение активности фермента ниже 20% характеризовало геми- гомозиготное состояние цутантного гена; снижение активности меньше 5С$ было принято за гетерозиготное состояние цутантного аллеля с учетом гипотезы инактивации Х-хромо-сомы.

_^сследование_норшль1Ж_молекутарнж_ва _эритроцитов_человекал_

Отсутствие единого метода выделения и частичной очистки 2ГК привело нас к решению разработать оптимальный метод очистки фермента на основе имеющихся и предложенных ранее авторами разных лет (Ёшида,1972; Али, 1976), но по некоторым причинам не подходящих нашим условиям исследования.

Для характеристики нормального молекулярного варианта ФГК выделена из 12 образцов донорской крови. Электрофоретическим методом подтверждена гомогенность полученного препарата. Результаты очистки суммированы и представлены в таблице 2.

Средние значения (М + м) итоговых результатов показателей физико- химических и кинетических параметров из 12-ти образцов донорской крови следующие: при активности фермента, а также его электро$юретической подвижности в 1(Х$-ов, К^ для 3-5Г составил 0,57+0,06 ыМ; И^ для АТФ 0,21+0,4 ыМ; рН-оптимум 6,0-8,0; термостабильность при 45°С - 83,0+2,57$; нуклеотидная специфичность для ГТФ - 41,4+2,64; для УТФ 9,02 + 0,47 и ЩЖ - 0 % от АТФ.

_Идент1 ^икация мутанткых аллелей__фос$оглкдераткиназы_._

Идентификация молекулярных вариантов наследственных эритроци-тарных энзимопатий необходимо для изучения особенностей структуры и функции генома высших организмов в норме и при патологии.

Среди 900 лиц - жителей Баку, обследованных на ФГК-д^фицит,

Таблица'2.

Средние результаты очистки 2ГК из эритроцитов 12-ти образцов донорской крови.

----------г----

Стадии Общий очистки объем ____|,_мл__

Общий белок мр

Активность_|Г1{|Кратн. ¡Выход

оЗщая" удельнГ очистки i

-------J------

j юо j

I,II I 100

' I I

I

653,4 j 80,4 1

779 j 84,5

968,4£| 9,72

I

1.Гемолизат

2.Гемолизат на глицериновой основе

3.Этанол-хлороформ. обработка супернат

4.Преципитация этанолом.

б.Элюаг после хроматогр. на

КМ-сеф. С-50

50 175

150 50

52500 76,5 27,5

12 j 6,24

178,7 178,7

229,7 270,0

536.1 0,5361

350,3

.417,6

519.2

0,55 0,52

выявлены 9 гемизиготных носителя мутантного аллеля с активностью от 5 до 20% от нор:.и, не состоящих между собой в кровном родстве. Из них кровь 6 пациентов послужила для физико-химического и кинетического изучения выделенных и частично очищенных препаратов фермента. Результаты исследований показали, что все варианты полученных ферментов отличаются друг от друга и. от нормального препарата.

Варианты I и У обладают повышенным сродством к З-ФГ и АТ5 ( d обратной реакции), термолабильны. Во II, III, ЗУ и У1 вариантах при общей картине замедленной электрофоретичоской подвижности "ер-мента, наблюдаются существенные различия в показателях физико-химических параметров: II вариант крайне термолабилен при небольшом снижении сродства к субстратам 3-ФГ и ATSf; III - при повышенном сродстве к субстратам менее специфичен к УТФ-цуклеотиду; в ЗУ и У1 вариантах на общем фоне повышенного сродства фермента к субстратам наблюдается небольшая термолабильность. Все 6 вариантов обладают пониженной ГТЗ-специфичностыо (рис. 1-5; табл. 3).

Сравнивая идентифицированные нами молекулярные варианты ШС с описанными в литературе можно сказать, что' I и У варианты по характеру мутации почти идентичны варианту "Упсала", II-ой вари-

К (АТ5) (0,05-10,0 i£i) - зависимость активности фосфоглицераткиназы: Н - нормальный фермент; I-7I - мугантныз варианты ЗГК.

5 0 6,0 7,0 6,0 9,с 10,0

Рис.3.График зависимости активности ФГК от рН-среды (Н-нормаль-ный йермент; 1-УI-мутантные варианты).

10 20 30 40 50 60

Рис.4.График зависимости активности ЙГК от нагревания при 4й°С (Н-нормальный фермент; I—УI - мутантные варианты).

яук.".

Рис.5.Зависимость активности ФГК от • стбстрзтов-аналогов АТФ: ГТФ, УТФ и !_СГэ в и -х по сравнению с АТШ, принятой за 100$ .(Н-нормальный фермент; 1-УI - мутантные варианты).

ТАБЛИЦА 3-

КИНЕТИЧЕСКАЯ И ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА МОЖКШШО-АШШЬНЫХ ЗОШ ЭМГРОЦИТАЯЮЯ ФОСФОГЛИЦЕРАТКИНАЗЫ ЧЕЛОВЕКА.

Физико-химические и кинетические свойства Средн.зкач.пока-! гт зателей для доно^—----ской группы 1 I М± м ! (A.C.) затели_зт Ii (М.А.) жтроцито III (М.С.) в_пробаь ~ Ш (С.Т.) яов . .-"у (М.Р.) " У1 (И.О.)

I. <ЕГК-актизность % (ед/гНв) 100 + 11,3- j 20,3 (352,7+47,6) j (71;6) 12,5 (44,1) 18,7 (66,01) 9,6 (33,9) 5,7 (20,12) 17,2 (60,7)

2. К (3 - 6Г) ( ш! ) 1 0,57+0,06 ¡5,0 0,42 1,25 3,6 4,7 2,9

___ _ _ ___________ 3. К ( ЛТЗ ) ( мМ) м 0,21 + 0 04 I 1,09 " i 0,17 0,69 1,76 1,5 1,32

4. рН - оптимум 6,0 - 8,0 ¡6,0-7,5 7,5-8,0 6,5 -7,5 6,5-8,0! 7,0-8,0 7,5-8,0

5. ТесмостабклькостьСЙ остаточной ак;гл„в.ге моЛизате за I час ккк^оацки при 4о°С.) - 83,0 + 2,57 ¡ 29,8 21,6 84,0 __ 71,0 34,2 - _ _ 63,8

с. Злектрофорзгическая подвижность (% от нормы) ____ _____ . i 100 | 100 80 ' 75 57 93 62

7. Нуклеотидная специфичность{% от АТФ)для: ГТФ УТФ 1 1 41,4 + 2,64' ¡. 30,0 9,02+~~0,47 8,6 - 0 |0 23,0 S'8 25,0 3,0 0 28,0 6,3 0 36,2 о'6 - 32,8 6,8 0

3. гСлинпческое проявление iTA+НПН i i ГА+ШК ГА ГА+НЛН ГА+НШ ^А+НПН i t

ант - "Ыацу"-подобный вариант. Варианты III, 1У и У1 - не описаны ранее в литературе и, вполне вероятно, свойственны исследуемой популяции.

Исследование активности фермента у других членов семей про-бандов подтвердил наследственный характер и специфичность изменений, а также гипотезу Х-сцепленного наследования.

- Активность ферментов Г65Д и ГР были на уровне нормы, в то время, как активность ферментов гликолиза: ПК и ГЙ1 были выше нормы. Уровень гемоглобина и гематокрита снижен.

У пятерых пробандов клинический процесс помимо анемии сопровождался еще и нервно-психическими нарушениями. В одном случае (III вариант) дефицит фермента проявлялся в форме гемолитической анемии.

Пробанд I (A.C.) - мальчик, 12 лег, азербайджанец, родился с неонатальной ж лтухой, длившейся 6 дней, селезенка и печень пальпировались. В процессе развития гемолитической анемии наблюдалось нарастание гепатоспленомегалии и усиление желтухи из-за несвязанного билирубина, ретикулоцитоз, гемоглобин - 85 г/л, гематокрит-26%. У ребенка наблюдалась задержка развития.

Пробанд II (М.А.) - мальчик, 10 лет, поступил в детскую неврологическую больницу в возбужденном состоянии, с симптомом частого моргания. В соматическом статусе изменений не выявлено. В неврологическом статусе определяется общее психомоторное возбуждение, функциональные гиперкиь.зы в форме частых морганий, светобоязнь, нарушение ритма сна.

Пробанд III (М.С.) - мальчик, 5 лет. Неоднократно обращался в клинику по поводу хронической гемолитической анемии, сопровождающейся гепатоспленомегалией, повышением неконыогированного билирубина.

Пробанд 1У (С.Т.) - мальчик, 3 лет. Клинический диагноз: детский церебральный паралич со снижением интеллекта.

В невролг"ичес..ом статусе определяется задержка умственного и физического развития, отмечается сходящееся косоглазие, ассим-ыегрия носогубных складок.

Пробанд У (М.Р.) - мужчина, 26 лет. Клинический диагноз: энцефалопатия со снижением интеллекта. Наблюдается отставание интеллектуального развития, нарушение речевой деятельности Сестра и брат находились на стационарном лечении по поводу различных

форм неврологических расстройств.

Пробанд У1 (!.!.0.) - мальчик, 12 лет. Диагноз: детский цереб-ралышй паралич со снижением интеллекта. Болезнь протекает идентично, как и у пробанда 1У.

Предполагается, что конкретное нарушение синтеза структурного гена ОГК дает определенную картину его клинического проявления.

Таким образом, .на основании биохимических и клинических исследований идентифицированы новые вдтантные варианты эритроци-тарной фосфоглкцераткиназы человека среди лиц азербайджанской популяции.

Резюмируя moeho указать, что дефицит фермента ФГХ проявляется, в основной, изменениями в психическом статусе, снижением интел*- • лекта, задержкой речи, снижением восприимчивости и т.д., иногда в сочетании с гемолитической анемией различной степени тянести. Видимо, обусловленное ОГК-дефицит и полиморфное клиническое точение болезни зависит от существования различных нрлекуляриых вариантов фермента.

ВЫВОДЫ :

1. Разработан м-лод выделения и частичной очистки в IOOO, раз эритроцитариой фосфоглицераткиназы. Идентификация молекулярных вариантов фосфоглицераткиназы осуществлялась по электрофороти-ческой подвидностп, констант«! Нихаэлиса-Ментен для 3-й? и АТФ, тераостабильности, рН-эависимости и нунлеотидной специфичности ферментного препарата.

2. Выявлены 4 типа мутаций йосфоглицераткиназы и установлена гетерогенность этих мутантаых образцов, отличающихся от нормы

по уровню активности, сродству к 3-ФГ и АТФ, электрофоретической подв'шности и нуклеотиднои специфичности.

3. Предложена модификация метода идентийикации дефицита фосфоглицераткиназы в эритроцитах человека по изменению флюоресценции, пригодная для клинических и популяционных исследований.

4. Обнаружено наличие наследственной фосфоглицераткиназной энзимопатии эритроцитов в Азербайджане с колебанием частоты распространения цутантного аллеля в различных популяциях от 0,0292 до 0,0505.

5. Наследственный характер дефицита фосфоглицераткиназы в эритроцитах подтвержден анализом родословных. Сопоставление в популяциях ожидаемых и наблюдаемых частот лиц с дефицитом фосфо-глицераткиназы не выявило статистически достоверных различий, что свидстельси J9T о соответствии гипотезе сцепленного с Х-хро-

цосоиой наследования.

6. Проявление дефицита фосфоглицератниназы в эритроцитах отличается полиморфизмом и выраженностью клинической картины, наиболее характерными симптомами котор ' являются гемолитическая анемия и нервно-психические нарушения.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Рашидова А.'.1. Фосфоглицераткпназа эритроцитов человека, //тезисы доклада. Материалы республиканской .аучной конференции аспирантов. Кн.1. - Баку,'1984- г. -'с.39-«.

2. Рашидоза А.II. К зопросу изучения активности фосфоглицерат-киназы эритроцитов человена в Азербайдкане^Дезисы доклада. Материалы республиканской научной конференции аспирантов. Кн.П.Баку, 1986 г. - С. 25-26.

3. КадироЕа Т.К., ¡.!овсум-заде K.U., Рашидова A.Î.I., Ибрагиыо-ва Г.Н. К оценке активности фосфоглицераткиназы эритроцитов человека при различных органических поранениях центральной нервНой систеш в детской возрасте. // Азербайджанский медицинский журнал. 1986 г. - - с.19-22.

Рашидова А.1.1. Новый молекулярный вариант эритроцитарной фосфоглицерзткиназы человека. //Тезисы доклада. Всесолзнгя школа-семинар "Молекулярная биология- и медицина", 12-18 мая 1990 г., г.Ленинград - Москва, 1990 г. - 6. 33.

5. Кадырова Т.К., Мовсум-заде K.M., Рашидова A.M. Эмоционально-интеллектуальные изменения у детей с молекулярными аномалиями фосфоглицераткиназы. //Азербайджанский медицинский журнал. -.1990 г., - te5 - с. 28-30.

6. Рашидова A.M., Ыозсум-заде K.M. К вопросу изучения активности эритроцитарной фосфоглицераткиназы человека в Азербайджане. Сообщение 2.//Тезисы доклада. П-ой съезд гематологов и транс-фузиологов Азербайджана. - Бг у, 1990 г., - о. 71-72.

7. Рашидова A.M., Мовсум-заде K.M. Молекулярные аномалии эритроцитарной фосфоглицераткиназы человека. //Тезисы доклада. П-ой Всесоюзный съезд медицинских генетиков, г.Алма-Ата, 4-6 декабря 1990 г., - •'осква, 1990 г. - с. 372.

22.