Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Биохимический полиморфизм наследственной недостаточности эритрофитарной фосфоглицераткиназы человека

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Биохимический полиморфизм наследственной недостаточности эритрофитарной фосфоглицераткиназы человека"

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ СССР

ВСЕСОЮЗНЫЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГЕМАТОЛОГИЧЕСКИЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР

РАШИДОВД АФАГ МАМЕД кызы

БИОХИМИЧЕСКИЙ ПОЛИМОРФИЗМ НАСЛЕДСТВЕННОЙ НЕДОСТАТОЧНОСТИ ЭРИТРОЦИТАРНОЙ ФОСФОГЛИЦЕРАТКИНАЗЫ ЧЕЛОВЕКА

(03.00.04 — Биохимия)

На правах рукописи

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва — 1991

Работа выполнена в Институте молекулярной биологии и биотехнологии Научно-производственного объединения «Биотех» Академии наук Азербайджанской Республики.

Научные руководители:

заслуженный деятель науки РСФСР, доктор медицинских наук,

профессор Ю. Н. ТОКАРЕВ,

кандидат биологических наук К. М. МОВСУМ-ЗАДЕ.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор С. С. ШИШКИН,

доктор медицинских наук, профессор С. И. КОЗЛОВА.

Ведущее научное учреждение — Институт питания АМН СССР.

Защита состоится « .^0» . 199$~г. в (У. час.

на заседании специализированного совета Д 074.08.02 Всесоюзного ордена Ленина и ордена Трудового Красного Знамени гематологического научного центра МЗ СССР (125167, г. Москва, Новозыковский проезд, д. 4«а»),

Автореферат разослан « //.» . 1991г.

Ученый секретарь специализированного совета, кандидат биологических наук

В. Д. РЕУК

СЩЛЯ XAPAIffSKICTlUCA РАБОТЫ

Исследованиями последних лет особое значение придается изучен™ роли различных ферментных систем в реализации физиологических процессов в организме.

Это достигается изучением колебания как основных функциональных ( активность, Kj в отношении субстратоз, рН-оптимука, элек- -. трофоретической подвтности, нуклеотидной специфичности, терм'о-стабильности и т.д.) показателей, так и параметров измененных форм. Последние могут являться следствием выпадения или частичного искажения действия в результате мутаций генетических факторов синтеза отдельных ферментов и способны детерминировать развитие наследственных экзпиопатий.

Поэтому исследование структурно-функциональных особенностей нормальных и измененных ферментных систем является одной из актуальных проблем современной биохимии.

Установление перш'-люго биохимического дефекта при каждой мутации структурных или регуляторкых генов является основополагающим для изучения любой формы моногенного нарушения, так как аномальные белки являются главной причиной последующих изменений клеточного метаболизма и функционирования организма в целом. Генетически предопределенная недостаточность активности некоторых ферментов гликблиза приводит к анемии, и как следствие, к повреждению ряда систем органов, что объясняется функционированием в их тканях мутантного гена.

В частности, дефицит активности одного из ключевых ферментов генерации АТ2 в гликолитическом пути превращения глюкозы - фос-фоглицераткиназы (ФГ!{; АГЗ: З-фосфо-Д-глицерат-1-фосфотрансфера-за; КЗ 2.7.2.3), приводит к нарушению гликолигического цикла, что клинически выражается несфероцитарной гемолитической анемией, а у мужчин также и нервно-психическими расстройствами.

Синтез фермента 2ГК контролируется единственным структурным геном, локализованным на X -хромосоме, поэтому недостаточность фермента передается по наследству как признак, сцепленный с полом, чаще рецессивного характера.

В силу Х-сцепленносги ШГК является одним из исключительных объектов для изучения мутационного разнообразия белков вообще, и ФГК в частности.

3.

^т^льность_темы. Анализ научной литературы по распространению ФГ'К-недостаточности в ряде зарубежных стран отмечает, что частота встречаемости дефекта вше ч зонах с высоким кооффициен--том инбридинга.

В силу этнических особенностей Азербайджана, результирующих высокий коэффициент инбридинга, а такие с учетом эндемнчности некоторых наследственных нарушений, в частности, энзимо- (Мов-. сум-заде K.M. и др., 1984; Лысенко Л.Я. и др., 1973) и гемогло-бикопатий (Мовсум-заде K.M. и др., 1985), представляется актуальным исследование распределения среди населения республики му-тантных форм эритроцитарной STK. Актуальность изучения STK-дефи-цита возрастает с учетом отсутствия как в Азербайджане, так и в других регионах страны работ по данному вопросу.

Целью настоящего исследования является анализ частоты и биохимических особенностей аномального фермента STK среди лиц азербайджанской популяции.

Для выполнения поставленной цели выдвинуты следующие задачи:

1) разработка и внедрение метода идентификации мугантной эритроцитарной <£ГК, приемлемого для клинических и популяционных исследований;

2) проведение популяционных и клинико-гематологических исследований среди населения города Баку, а также Шекинского и Ахсу-инского районов республики;

3) осуществление клинико-гематологического и генеалогического анализа в семьях пробандов с дефицитом фермента '2ГК;

' 4) выделение, частичная очистка и изучение физико-химических и кинетических свойств различных форм фермента эритроцитарной ФГК из крови доноров и пробандов.

_Научная_новизн£ц_ Разработан прлуколичественный скринирующий

метод флюоресцирующих пятен для идентификации эритроцитарного ■ ФГК-дефицита при массовых o6cj -дованиях.

Внедрение метода осуществлено в детской неврологической клинике и на кафедре невропатологии и медицинской генетики Азербайджанского ордена Трудового Красного Знамени государственного медицинского университета им. Н.Нариманова.

Впервые в Азербайджане проведено массовое обследование жителей на выявление ЙГК-недостаточности, неучена и установлена час-

тота встречаемости <ЗГК-дефицита в 2-х районах (Шеки и Ахсу) рас публики, а такие в г. Баку на фактическом материале около 4ООО образцах крови. '

Модифицированным наш методом очищены, выделены и охарактэр). зованы по физическим, химическим и кинетическим параметрам нормальные и мутантные молекулярные варианты ФГК.

Гетерогенные 'вгри анты ФГК эритроцитов человека дифференцировались на основании изучения уровня активности, сродства к субстратам 3-Я1 и АТФ, электрофоретичесной подвижности, рН-оптицума среды определения, термостабильности, нуклеотидной специфичности ферментного препарата, вдавленного и очищенного разработанным нами методом. Указанный комплекс методических приемов дозволил выявить 4 типа мутантных вариантов. Для облегчения и ускорения обнаружения ■ ыутантных вариантов е клинических и популяциоти'ьк исследованиях предлагается модифицированный метод идентификации ®'К-недоста~ точности эритроцитов.по степени дефлюоресценции НДД-Н.

ШГК-онэимолатия эритроцитов в Азербайджане распространена с частотой 0,0292 -ф.505, имеет наследственный характер, что подтверждается сопоставлением числа ожидаемое и наблюдаемых носителей мутантного аллеля в ядерных семьях исоответств.ет ги-потеяо сцепленного с Х-хромосомой наследования. Клиническое проявление ЗГН-недостаточности отличается полиморфизмом, наиболее характерны гемолитическая анемия и нервно-психические нарушения.

_^1рактичеекая_15енностьл_ Разработанной нами метод флюоресцирующих пятен для идентификации эритроцитарной ОГК можно использовать в клиниках как диагностический тест.

Доступность пересылки образцов крови по почте, не оказывающая значительное влияние на ее качество, а также возможность исследования более 100 проб в день позволяет использозать указанный метод для массовых популяционных работ по выявлению и изучению распространения ФГК-недосгаточности.

Своевременная диагностика аномальных ферментов способствует проведении эффективных мероприятий по коррекции обменного нарушения, с целью предотвращения клинических осложнений и нервно-психических отклонений. С другой стороны, предлагаемый метод

позволяет выделять группу гетерозиготных носителей ыутантного гена, что монет быть использована при медшсо-генетлческоы консультировании.

Идентифицированные молекулярные варианты 5ГН позволяют установить характер мутации белка, свойственной популяции Азербайджана.

публикации. По материалам диссертации опубликовано 9 научных работ, из которых: 5 - в центральной и 4 - в республиканской печати.

_Апробацкя_работы_, Материалы диссертации доложены и обсуждены на 11-ом Всесоюзном съезде медицинских генетиков ( г.Алма-Ата,

1990 г.); та Всесоюзном школе-семинаре "Молекулярная биология и медицина" ( г.Ленинград, 1990 г.); 11-ом съезде гематологов и трансфузиологов Азербайдягана (г.Баку,1990 г.): республиканской конференции аспирантов (г.Баку, 1984 и 1986 г.г.); научных се-М"нарах Института молекулярной биологии и биотехнологии НПО "Био-тех" АН Азерб. Республики (г.Баку, 1990,1991 г.г.); заседании проблемной комиссии "Патология эритрона" БГНЦ МЗ СССР (г.Москва,

1991 г.); Всесоюзной научной конференции молодых ученых и специалистов, где выступление на тему:"Случаи сочетанных форм дефицитов ферментов фосфоглицераткиназы с глюкозо-6-фосфатдегид-рогеназой" отмечено дипломом (г.Баку, 1991 г.).

_0бъем_и_ст22й51Х2§_Ш^23!Ц1 Диссертация изложена на 122 страницах машине шеи; состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и использованных методов исследований, собственных результатов исследований и их обсуждения, заключения, выводов и библиографического указателя, содержащего 171 источников, из коих 16 отечественных и 155зарубежных авторов, содержит ¡5 таблиц и 14 рисунков.

СОДЕНШИЕ РАБОТЫ

Глава I. Биохимия фосфоглицераткшмы._Шохимический_пол™о^юм_ наследственной недостаточности эритроцитарной фосфоглкцераткина;__

Обзор состоит из двух частей. В первой части дается анализ литературных данных по строению и функции $ГК, механизму реакции и кинетике, субстратной специфичности, активации и ».нгибиро-вания фермента, а "также его функции в эритроцитах, то есть, био-г

химическая характеристика и функциональное значение этого фермента.

Во второй части содержится обзор современной литературы по наследственным энзимопатиям эритроцитов, и в частности, фосфо-глицераткиназы и ее биохимическому полиморфизму. Рассмотренные в обзоре работы указывают на своевременность и актуальность исследования структурно-функциональных особенностей нормальных и измененных ферлентных систем, в том -числе и ЗГК, в различных популяциях.

исследования.

Приводится описание разработанного совместно с проф. Т.К.Ка-дьгровой, К.М.Мовсум-заде и З.Ы.Агарзаевой модифицированного скрининг-теста флюоресцирующих пятен для энзим-диагностики £>ГК-дефицита, основанного на окислении НДД'Н, визуально наблюдаемому в лучах ультрафиолетового света, при _Д=340 нм. Сопоставление данных, полученных различгшми методами (Войтлер, 1975; Васа, 1981) с предложенным нами модифицированным, свидетельствует об их идентичности и позволяет в силу ряда преимуществ отдать предпочтение последнему, наиболее удобному.

Количественное определенна активности 5ГК и некоторых других ферментов гликолитического и пентозофосфатного цикла превращения глюкозы, а 'также идентификация нормальных и аномальных молекулярных форм ШГК проводилась в венозной крови объемом 1,0-1,5 и 6,0-10,0 мл, соответственно. Показатель гемоглобина определялся гемоглобинцианидшм методом, а гематокрита - методом осадцения форменных элементов в градуированных пипетках при центрифугировании. Контролем служила группа доноров центральной станции переливания крови МЗ Азербайджана, дзти дошкольного возраста, школьники и студенты. Массовое обследования на выявление ФРК-де- • ф:щита проводились среди населения ¡Пекинского и Ахсуинского районов Азербайджана, среди выходцев из различных районов республики, проживающих в городе Баку, в частности, студентов вузов и лиц, находящихся на стационарном лечении в детской неврологической больнице при кафедрэ неЕропагологкк и медицинской генетики Аз.гос. медукиверситета им. Н.Наримачова. При обнаружении йГи-дефицита проводилось генеалогической иеслодор'-'ние. Количественное определение активности ферментов 5ГК, Г&1Д, ПК, ГР и ГФИ в гемолизатах

проводилось по рекомендованным методам исследования эритроцитар-ных ферментов, разработанных интернациональным Комитетом стандартизации в гематологии (Бойтлер, 1977). За единицу активности приняли количество фермента, катализирующее превращение одного микромоля субстрата НАД или НДД'Н б минуту, при длине волны 340 нм с миллимолярным коэффициентом активности, равным 6,22.

' Для изучения физико-химических и кинетических параметров ¡2ГК с целью идентификации молекулярных вариантов, фермент выделяли и очищали из эритроцитов по модифицирование Л нами разработке, основанной на методах Ёшида и сотр. (1972) и Али М. .и сотр. (1976), которая заключается в использовании меньшего количества исследуемого материала, в данном случае крови человека и сокращения числа проводимых стадий по следующей схеме:

• Отделение эритроцитов центрифугированием при 15 г00 д в теч. 20 мин. Промывание эритроцитов дважды в 2-х объемах раствора "А", смешивание с эквивалентным объемом раствора цитрат-глицеро-ла. Диализация против 10-ти объемов Н^О в теч. " ночи. Замораживание.

' Смешивание эритроцитов с этанол-хлороформом (2:1 VIV ъ при -60°С) в теч. 20 мин. на магнит ной мешалке. Центрифугирование при 15 ОСО^ в теч 20 мин. Добавление к супе^натангу 15-ти объемов этилового спирта (при -25 С). Постепенное помешивание на шгниттой меыадке в геч. 20 ыин. Центрифугирование при 15 ООО ^ в теч. 20 мин. Дис-сольватация осадка 0,01 Ы фосфатный буфером, ,, рН-7,0 в течение ночи.

III. Выделение и очистка .&ГК._

Цзг^рифугировакяэ при 15 ООО ^ в теч. 30 мин. Дкссольватация осадка 0,01 Ы фосфатным буфером, рН 7,0. Нанесение образца на КМ Сефадекс С-50, урашоЕЗванкрго 0,01 М фосфатным буфером, рН 7 ,<

Элюция фермента с Сефадекса 0,01 М фосфатным буфером, pH 7,0.

Концентрация ультрафильтрацией. Ж^_&2ь^^ашонийная_обработкал_ 1

Насыщение фермента 30-65 %-кш (HH^Jg^O^ путем диализа - огив 0,1 М фосфатного буфера при pH 7,0 в течение 48 часов.

Учитывая отсутствие методических рекомендаций для идентификации молекулярных вариантов 2ГК, критерии для дифференцировки му-тантных аллелей были выбраны по примеру исследования аномальных ферментов прочих энзкмопатий. Идентификацию нормальных и мутант-ных аллелей 2ГК проводили по кинетическим м физико-химическим параметрам фермента. Изучены электрофоретическая подвижность фермента в ПААГ-е методом диск-электрофореза,'константа Михаэлиса-Ыентен в отношении субстратов 3-Я1 (0,05 - 35,0 мМ) и АТФ (0,05 -10,0 мМ), термостабильность при 45°С среды определения, рН-оп-тимум, а также нуклеотидная специфичность ;в отношении нуклеоти-дов-аналогов ГТФ, УМ и ЦТ®. Молярные концентрации субстратов для определения Н^, температурный режим для установления термостабильности фермента, а также подбор рН-среды для определения рН-оптимального условия функционирования фермента отработаны экспериментально. '

Достоверность различий между двумя средними для независимых совокупностей оценивалась методом Стьюдента (Лакин Т.Ф., 1968).

Глава_3. Результаты исследована и_ихп>обсуждение.

Исследование активности ФГ'К в эритроцитах здоровых людей.

Приводятся данные исследования контрольной группы лиц по изучению активности ЙГК в эритроцитах здоровых людей популяции Азербайджана в зависимости от пола, возраста и национальности.

I. Активность эритроцитарной ФГК в зависимости от пола и возраста среди здоровых люд:

о о а си С Я ас и •V. ф л 1 / I. взрослые 211,6 + 9,58 п = 120 206,4 + 7,74 п = 60 216,8 +11,42 п = 60' II. дети 232,02 + 14,38 п = 60 224,2 + 13,8 п = 30 239,8 + 14,86 И = 30 •

о со л 324,17 + 32,7 354,99 + 32,47 .

¡8 а, о п = 120 п.= 60

Ю ре 1 323,3 + 15,95 343,03 + 28,63

и п = 60 п = 30

& / 326,54 + 28,67 ' 366,89 + 33,02

п = 60 п = 30

2. Активность ФГК (ед/гНв при 37°С) в эритроцитах практически здоровы;, лиц, различных этнических груш, проживающих в Азербайджане:

/? з /

азербайджанцы 324,17 323,3 326,5

русские 357,16 336,03 378,28

др. национальности 385,75 365,2 406,29..

Как видно, среднее значение активности $ГК в эритроцитах здоровых детей в возрасте от 3-х месяцев до 15 лет превышает таковую у взрослых Сот 15 до 70 лет) в среднем на 30,82 + 18,77 ед/гНв при 37°С среды определения, что можно объясните интенсивным эритропоэзоы у детей. Активность фермента у женщин ниже, чем у мужчин, что вполне объяснимо Х-сцепленностыо и гипотезой X-инактивации <5ГК (Валентин, 1969; Дейс, 1972; Конрад, 1°73).

При сопоставлении изменения показателей активности ферменте по полу и возрасту установлены статистически достоверные различия мевдг взрослыми мужчинами и женщинами ( по кри 'орию Стью-дента). Эти различия выражались высокой активностью фермента у мужчин {.i¿ = 10,12;^ = 3,4; р<0,001). Различия мевду возрастными группами внутри пола и в целом мевду взрослыми и детьми оказались статистически недостоверными.

Наблюдаемые различия энзиматической активности в эритроцитах практически здоровых лиц различных этнических групп, проживающих .в республике, говорит о том, что для каждой этнической группы в каждой популяции нужно отработать свою контрольную груг пу и установить средний показатель нормального уровня для последующей идентификации 5ГК-дефицита.

Полученные данные были сопоставлены с показателями, полученными методом полуколичественного определения, то есть, методом флюоресцирующих пятен для идентификации дефицита эритроцитарной £ГК. Предложенный Баса в 1901 году тест в качестве скринирующе-го, имеет ряд недостатков и трудоемок в работа. Исходя из этого, наш разработана модификация метода, более приемлемая для массовых исследований, заключающаяся в следующем:

1. для удобства работы в экспедиционных условиях крочь забиралась на хроматографическую бумагу-РЫ=13, что:

а) эффективно для пересылки и хранения образцов;

б) экономично, так как исключается применение дорогостоящего биореангива - ангикоагулянта гепарина; '

2. изменен состав буферной среды (табл. I).

_Выявление носителей ФГК-дефицита.__

Анализ результатов исследования отдельных поцуляций позволил установить частоту носигельсгва мутантных генов, составивших: среди жителей Шекинского района 2,0% - геми-, гомо- и 5,3% - ге-терозигот; среди жителей Ахсуинского района - 1,2$ и 3,0^; по городу Баку - 1,24$ и 3,4%, соответственно. •

Для проверки гипотезы г..о сцепленном с Х-хромосомой наследовании проводилось сравнение ожидаемого и фактически наблюдаемого числа пораженных. В оценку ожидаемой сегрегационной частоты необходимо включить показатели частот доминантного и рецессивного аллелэй из совокупности взятых наудачу и ничем не связанны: между собой особей. Соответственно гипотезе условного доминиро-

Таблица I,

Сравнение методов идентификации йГК-дефицита при различных условиях срег' определения.

Конечная конц-я (М) Объем в смеси

Реагенты (мкл)

модиф.метод прототип мод.мет. прото тип

трис-НС1 б.СрН 8,0) _ I _ 300

трис-НС1/ЭДГАб.(рН8,0) 0,1/0,0005 ' - 400 -

МдС12 0,01 • 0,01 100 100

АТФ 0,08 0,08 100 100

3-$Г 0,5 0,5 200 200

ВД 0,005 0,005 . 100 100

ГАВД 40 ед/мл 40 ед/ш 100 100

гемолизат I диск+400 мкл 1^0 1:50 20 10

н2о - " - 100

х

вания среди женщин различается 3 фенотипа, а среди цужчин -2, поскольку, генетическая классификация пораженных сводится к гетеро-, теми- и гомозиготности. С учетом изложенного, частоты мутантного и нормального аллелей, вычисленные для каддой исследуемой популяционной выборки в отдельности составили:

Баку: <},= 0,0292; р = 0,9708; ¿= 0,0045;

Шеки: <},= 0,0505; р = 0,9495; ¿= 0,0055;

Ахсу: =' 0,0329; р = 0,9671; 0,0045.

Математической ожидание численности каждой категории получено путем подстановки оценок генных частот. Разница между теоретически ожидаемым и фактически наблюдаемым чисд^м больных оказалась статистически недостоверна. Значения колебались от 1,623 до 0,009; рр*0,05. Совместимость полученных данных с выдвинутой гипотезой не только подтверждает тип наследования, но и предполагает ьыполнение условий устойчивого равновесия закона Харди-Вайнберга.

Результаты проведенного анализа можно расценивать кап формальное доказательство локализации в Х-хромосоые гена фермента $ГК. '12.

Последующее исследование среди пробандов других ферментативных систем, как окислительно-восстановительного, так и энергетического ряда выявило закономерное компенсаторное повышение активности пи-руваткиназы и гексофосфоиэомеразы, при нормальных значениях глюко-зо-6-фосфагдегидрогеназы и глютатион-редуктазы.

Наследственный характер нарушения подтверждался обследованием членов семьи пробандов.

Среди 537 детей, находившихся на стационарном лечении в детской неврологической больнице,в 43-х случаях выявлено значительное снижение активности 2ГК: из них 35 - гетерозиготных; 8 - геми- гомозиготных носителя гена дефицита (ЕГК. Кроме этого 3 человека - с гиперактивкосгыо фермента. Больше с дефицитом фермента в основном лица мужского пола. Клинические проявления нарушения характеризуются полиморфностыо и выражаются с одной стороны различной степенью отклонения нервно-психической деятельности (отставание в интеллектуальном развитии, задержка речи, плохое усваивание школьной программы и т.д.), с другой же - гемолитической анемией. Зачастую указания на наличие гемолитической анемии отсутствуют.

Есть основания предполагать, что нарушение деятельности нервной системы своим происхождением обязано избирательному участию ФГК в обменных процессах нейроиа.

Из анамнеза матерей установлено, что периоду беременности сопутствовали различные инфекции (стафилококковая, гриппозная и др.), токсоплазмоз, анемия, болезни печекл и почек.

Особо следует отметить случаи сочетания дефицита двух локализованных в Х-хромосоме генов ферментов: £ГК - ключевого фермента генерации АТ5; и Г6$Д - играющей ваяную роль в цикле редукции глю-татиона. При этом нарушении выявлено повышение активности ферментов пируваткиназы и глютатион-редуктазы, имеющее, вероятно, компенсаторный характер. Семейное обследование подтвердило наследственный характер передачи аномальных генов. Во всех случаях соче-ганных нарушений в клиническом проявлении помимо нервно-психических отклонений, отмечалась выраженная гемолитическая анемия. Среда детей пробандов наблюдалась высокая смертность в раннем детдом возрасте. Биохимическая картина характеризовалась наличием ) мазке крови телец Гейнца-Эрлиха и повышением аутогемолиэа, обус-'.озленных нарушением синтеза ферментов *ГК и Г63Д.

Таким образом, клинические, популяционные и биохимические исследования, проведенные в Шекинском и Ахсуинском районах, а такие городе Баку позволили обнаружить сочетанные формы дефицита 2ГК и Г6ФД, которые на фоне сопутствующих интеркуррентных инфекций могут снижать общий юллунный фон организма и даже могут стать причиной летального исхода в раннем детском возрасте.

Анализ показателей активности фермента <ЕГК позволил выделить носителей аномального аллейя. Так снижение активности фермента ниже 20% характеризовало геми- гомозиготное состояние мутангного гена; снижение активности меньше 50/5 было принято за гетерозиготное состояние мутантного аллеля с учетом гипотезы инактивации Х-хромо-сомы. о

Исследование нормальных молекулярных вариантов ШГК _эритрощ1Тов_человенал_

Отсутствие единого метода выделения и частичной очистки ФГК привело нас к решению разработать оптимальный метод очистки фермента на основе имеющихся и предложенных ранее авторами разных лет (Ёыида,1972; Али, 1976), но по некоторым причинам не подходящих нашим условиям исследования.

Для характеристики нормального молекулярного варианта йГК выделена из 12 образцов донорской крови. Электрофоретическим методом подтверждена гомогенность полученного препарата. Результаты очистки суммированы и представлены в таблице 2.

Средние значения (М + м) итоговых результатов показателей физико- химических и кинетических параметров из 12-ти образцов донорской крови следующие: при активности фермента, а также его электрофоретической подвизшости в 100%-ов, Ку для З-Е1 составил 0,57+0,06 ыМ; К^ для АТФ 0,21+0,4 ыМ; рН-оптимум 6,0-8,0; термостабильность при 45°С - 83,0+2,57%; нуклеотидная специфичность для ГТФ - 41,4+2,64; для УТФ 9,02 + 0,47 и ЦГ$ - 0 % от АТФ.

__фйсфоглщератктазы.^ .

Идентификация молекулярных вариантов наследственных, эритроци-тарных энзимопатий необходимо для изучения особенностей структуры и функции генома высших организмов в норме и при патологии.

Среди 900 лиц - жителей Баку, обследованных на <ЕГК-тфицит,

т.

Таблица'2.

Средние результаты очистки <БГК из эритроцитов 12-ти образцов донорской крови.

Стадии очистки

бщий бъем и_мл„

Общий белок мг

Активность ЗГ1С|Кратн. ¡Выход оЗщая удёльнГ очистки j %

Бедок мг/ыл

1.Гемолизат

2.Гемолизат на глицериновой основе

З.Зтанол-хло-роформ. обработка супернат

4.Преципитация этанолом.

б.Элюат после хроматвгр. на

КМ-сеф. С-50

50

175 152500

I I

150 \ 76,5

50 12

27,5 6,24

178,7

178,7

229,7 270,0

536.1 0,5361

350,3

417,6

519.2

1,И

653,4

779 968,4£

100 100

80.4

84.5 9,72

10500 300

0,57

0,55 0,52

выявлены 9 гемизиготных носителя мутантного аллеля с активностью от 5 до 20$ от нор:.и, не состоящих между собой в кровном родстве. Из них кровь 6 пациентов послужила для физико-химического и кинетического изучения выделенных и частично очищенных препаратов фермента. Результаты исследований показали, что все варианты полученных ферментов отличаются друг от друга и от нормального препарата.

Варианты I и У обладают повышенным сродством к 3-ФГ и АТФ ( в обратной реакции), гермолабшгьны. Во II, III, 1У и У1 вариантах при общей картине замедленной электрофоретичоской подвижности "ер-мента, наблюдаются существенные различия в показателях физико-химических параметров: II вариант крайне термолабилен при небольшом снижении сродства к субстратам 3-ФГ и ATS; III - при повышенном сродстве к субстратам менее специфичен к УТФ-цуклеоищу; в 1У и У1 вариантах на общем фоне повышенного сродства фермента к субстратам наблюдается небольшая тзрмолабильность. Все 6 вариантов обладают пониженной ГТЗ-специфичностью (рис. I - 5; табл. 3).

Сравнивая идентифицированные нами молекулярные варианты 5ГК с описанными в литературе можно сказать, что I и У варианты по характеру мутации почти идентичны варианту "Упсала", П-оЙ вари-

2. К (АТФ) (0,05-10,0 мы) - зависимость активности фосфоглицераткиказы: Н - нормальный фермент; 1-У1 - мутантные варианты 5ГК.

50

Акт.

5 0 6,0 7,0 Б,О 9,v 10,0

РН

Рис.3.График зависимости активности ФГК от рН-среды (Н-нормаль-ный сЬермент; 1-У1-мутантные варианты).

10 20

50 60

(мин).

Рис.4.График зависимости актив-кости ФГК от нагревания при 4ü°C Ш-нормалъкый фермент; 1-УI - ыутантные варианты).

яук.".

Ríe.5.Зависимость активности ФГК от ■ субстратов-аналогов АТФ: ГТФ, УТ5 и Lija в 'а -х по сравнению с АТ®, принятой за 100% ХН-нормальный фешент; I—УI - мутантные варианты).

ШЩШ1ЧШШ И ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА МОЖШЯНЮ-АНОМАЛЬНЫХ ШОМ ЭРИТРОЦИТАМ® ШСФОГЛИЦЕРАТКИНАЗЫ ЧЕЛОВЕКА.

Физико-химические и кинетические свойства

I. ФГК-активнос'х'ь % (ед/гНв)

2. К (3 - 8Г) ( мМ ) -----и_________________

100 + 11,3* -0,5? + 0,06

3. К ( АТ® ) ( мМ) м

4. рН - оптимум

5. ТеомостабильностьО* остаточной акул_в.ге|- 83,0 + 2,57 .____1_______Г_____

о. Электрофоратическая подвижность {% от . нормы)

Средн.зкач.пока- . зателей для доной^ ской группы I 1 М+ м ! (А.С.)

0,21 + 0 04

6,0 - 8,0

100

______^___

20,3

.1211-2 5,0

1,09

6,0-7,5 29,8

100

Ь

(Ы.А.)

12,5 _(44_,1)

0,42

0,17

7,5-8,0 21,6

80

III

18,7 (66,01

1,25

0,69 >,5 -7,!

84,0 75

1У ! У

(с.т.) ! (м.р.)

9,6

5.7

9) _[__(20_, 1^2

3,6 | 4,7

У1

(М.0.)_ 17,2 _(60_,7)_

2,9

1,76.

1,5

6,5-8,а_7,0-820 71,0 I 34,2

57

93

1,32 68,8

62

7. Нуклеотидная специфичность(% от АТ$)для;

ГТФ

УТФ ЩФ

41,4 + 2,64 9,02+~0,47 - О

30,0 8,6 О

23,0

25,0 3,0 О

28,0 6,3 О

! 36,2 !

32,8 6,8 О

3. Клиническое проявление

!ГА4Н1Ш

ГА+ШН

ГА

ГА+НПН ! ГА+НПН ^А+НПН

I I

ант - "Мацу"-подобный вариант. Варианты III, 1У и У1 - не описаны ранее в литературе и, вполне вероятно, свойственны исследуемой популяции.

Исследование активности фермента у других членов семей про-бацдов подтвердил наследственный характер и специфичность измене- • ний, а такие гипотезу Х-сцепленного наследования.

■ Активность ферментов Г6<5Д и ГР были на уровне нормы, в то время, как активность ферментов гликолиза: ПК и Г® были вше нормы. Уровень гемоглобина и гематокрита снижен.

У пятерых пробандов клинический процесс помимо анемии сопровождался еще и нервно-психическими нарушениями. В одном случае (III вариант) дефицит фермента проявлялся в форме гемолитической анемии.

Пробанд I (A.C.) - мальчик, 12 лет, азербайджанец, родился с неонатальной ж лтухой, длившейся б дней, селезенка и печень пальпировались. В процессе развития гемолитической анемии наблюдалось нарастание гепагосплекомегалии и усиление желтухи из-за несвязанного билирубина, ретикулоцитоз, гемоглобин - 85 г/л, гематокрит-26%. У ребенка наблюдалась задержка развития.

Пробанд II (М.А.) - мальчик, 10 лет, поступил в детскую неврологическую больницу в возбужденном состоянии, с симптомом частого моргания. В соматическом статусе изменений не выявлено. В неврологическом статусе определяется общее психомоторное возбуждение, функциональные гиперкиь.зы в форме частых морганий, светобоязнь, нарушение ритма сна.

Пробанд III Ш.С.) - мальчик, 5 лег. Неоднократно обращался в клинику по поводу хронической гемолитической анемии, сопровождающейся гепатоспленомегалией, повышением неконыогированного билирубина.

Пробанд 1У (С.Т.) - мальчик, 3 лег. Клинический диагноз: детский церебральный паралич со снижением интеллекта.

В невроло^ичес-.ом статусе определяется задержка умственного и физического развития, отмечается сходящееся косоглазие, ассим-метрия носогубных складок.

Пробанд У (М.Р.) - мужчина, 26 лет. Клинический диагноз: эн-' цефалопатия со снижением интеллекта. Наблюдается отставание интеллектуального развития, нарушение речевой деятельности Сестра и брат находились на стационарном лечении по поводу различных

форм неврологических расстройств.

Пробанд Л (И.О.) - мальчик, 12 лет. Диагноз: детский церебральный паралич со сиияенкем интеллекта. Болезнь протекает идентично, как и у пробанда 1У.

Предполагается, что конкретное нарушение синтеза структурного гена ФГК дает определенную картину его клинического проявления.

Таят образом, .на основании биохимических и клинических исследований идентифицированы новые ыутантные варианты эритроци-тарной фосфоглицераткиназы человека среди лиц азербайджанской популяции.

Резюмируя и окно указать, что дефицит фермента ФГК проявляется; в основном, изменениями в психическом статусе, сшнениеи интел- -лента, задержкой речи, снижением восприимчивости и т.д., иногда в сочетании с гемолитической анемией различной степени тякести, ' Видимо, обусловленное ФГК-дефицит и полиморфное клиническое течение болезни зависит от существования различных ырлекулярных вариантов фермента.

ВЫВОДЫ:

1. Разработан метод выделения и частичной очистки в 1000 раз эритроцитарпой фосфоглацератниназы. Идентификация молекулярных вариантов фосфоглицератвинэзы осуществлялась по элемрофорзти-ческой подвижности, константен Михаэлиса-Ментен для 3-ФГ и АТФ, терыостабяльности, рН-зависимости и нуклаотидной специфичности ферментного првпарзта.

2. Быяэлени 4 типа нутаций фосфоглицераткиназы и установлена гетерогенность этих мутантнше образцов, отличающихся от норны по уровню активности, сродству к 3-ФГ и АТФ, электрофоретичесной подвияносги и нуклаотидной специфичности.

3. Предложена модификация метода идентификации дефицита фос-фоглмцераткиназы в эритроцитах человека по изменению флюоресценции, пригодная для клинических и популяционных исследований.

Обнаружено наличие наследственной фосфоглицератниназной энзимопатии эритроцитов в Азербайджане с колебанием частоты распространения мутангного аллеля в различных популяциях от 0,0292 до 0,0505.

5. Наследственный характер дефицита фосфоглпцератниназы в эритроцитах подтзеркден анализом родословных. Сопоставление з популяциях ожидапых и наблюдаемых частот лиц о дефицитом фосфо-глицераткиназы не выявило статистически достоверных различий, что свидсгельспует о соответствии гипотезе сцепленного с Х-хро-

ыосомой наследования.

6. Проявление дефицита фосфоглицераткиназы в эритроцитах отличается полиморфизчом и выраженностью клинической картины, наиболее характерными симптомами котор ' являются гемолптичоская анемия и'нервно-психические нарушения.

Список работ, опубликованных по темо диссертации:

1. Рашидова А.f.!. фосфоглицераткиназа эритроцитов человека, //тезисы'доклада. Материалы республиканской ручной конференции аспирантов. Кк.1. - Баку/l984 г. -'с.39-41.

2. Рашадоза А.И. К вопросу изучения активности фосфоглицарат-киназы эритроцитов человека в Азербайджане,//Тезисы доклада. Материалы республиканской научной конференции аспирантов. Кн.П.Баку, 1986 г. - С. 25-26.

3. Кадырова Т.К., Мовсум-задв K.M., Рашидова АЛ.!., Ибрагимова Р.Я. К оценке активности фосфоглицераткиназы эритроцитов человека при различных органических поражениях центральной нервНой оистеш в детском возрасте. // Азербайджанский медицинский журнал. 1986 г. - iiS - с.19-22.

4. Рашидова A.M. Новый молекулярный вариант эритроцитарной фосфоглицераткинааы человека. //Тезисы доклада. Всесоюзная

школа-семинар "Молекулярная биология-и медицина", 12-18 мая 1990 г., г.Ленинград - Москва, 1990 г. - 6. 33.

5. Кадырова Т.К., Мовсум-заде K.M., Рашидова A.M. Эмоцио-нально-интеллектуайьныз изменения у детей с молекулярными аномалиями фосфоглицераткиназы. //Азербайджанский медицинский журнал. - 1990 г., - №5 - с. 28-30.

6. Рашидова A.M., Мовсуы-заде K.M. К вопросу изучения акти: ности эритроцитарной фосфогзшцератниназы человека в Азербайджа: Сообщение 2.//Тезисы доклада. П-ой съезд гематологов и транс-фузиологов Азербайджана, - Es у, 1990 г., - с. 71-72.

7. Рашидова АЛ., Мовсум-эаде K.M. Молекулярные аномалии эритроцитарной фосфоглицераткиназы чвловеьа. //Тезисы доклада. П-ой Всесоюзный съезд медицинских генетиков. г.Алма-Ата, 4-6 декабря 1990 г., - Москва, I99Û г. - с. 372.

22.

8. Рашидова А. М. Случаи сочетанных форм дефицита ферментов фосфоглицераткнназы с глюкозо-6-фосфатдегид-рогелазой.//тезисы доклада. Всесоюзная научная конференция молодых ученых и специалистов. — Баку, 1991 г., — с. 90—91.

9. Рашидова А. М., Кадырова Т. К., Мовсум-заде К. М., Агарзаева 3. М- Модификация метода флюоресцирующих пятен для идентификации дефицита эритроцитарной фосфоглицераткнназы при массовых обследованиях.//ж. Лабораторное дело., — Москва, 1991 г., — № 5 — с. 41—43.

Зак. 1141. Тир. 100. П. л. 1,0. Тип. АзЙУ им. М. Азизбекова. Баку—ГСП, проспект Ленина, 20.