Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование равновесных и кинетических промежуточных состояний на пути самоорганизации глобулярных белков

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Исследование равновесных и кинетических промежуточных состояний на пути самоорганизации глобулярных белков"

*ч

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ ТЕОРЕТИЧЕСКОЙ И ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ БИОФИЗИКИ

На правах рукописи УДК 577. 322. 7

СЕМИСОГНОВ ГЕННАДИЙ ВАСИЛЬЕВИЧ

ИССЛЕДОВАНИЕ•РАВНОВЕСНЫХ И КИНЕТИЧЕСКИХ ПРОМЕЖУТОЧНЫХ СОСТОЯНИЙ НА ПУТИ САМООРГАНИЗАЦИИ ГЛОБУЛЯРНЫХ БЕЛКОВ

ОЗ. 00. 02 «■ Виофизика

Диссертация на соискание ученой степени доктора физихо-математических наук в форме научного доклада

Пушило - 1994

Работа выполнена в Институте белка РАН ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

Доктор биологических наук, член-корреспондент РАН В.А. Иувалов Институт почвоведения и фотосинтеза РАН

Доктор физико-математических наук И. Н. Сердюк Институт белка РАН

Доктор физико-математических наук В. И. Иванов Институт молекулярной биологии РАН

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ: Институт биоорганической химии

имени Н.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН

заседании Специализированного ученого созега Д. 200. 01 при Институте теоретической и экспериментальной биофизики РАН по адресу: 142292, "г.Пущино Московской области, проспект Науки, ИТЭБ РАН.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Научного центра биологических исследований РАН (г.Пущино).

Автореферат разослан « 13 ■■ ёарх.- ¡эзЛ'года.

Ученый секретарь Специа:

Тапжта состоится

з

часов на

кандидат биологических [

1. ВВЕДЕНИЕ.

1.1 Актуальность работы. Созревание глобулярных белков в клетке обусловлено двумя основными процессами: биохимическим -синтезом аминокислотной последовательности, осуществляемым рибосомой с участием белок-синтезирующего аппарата клетки, и физическим - приобретением белковой молекулы функциональной пространственной организации. Вопрос каким образом белки сворачиваются в функционально активную пространственную структуру является одним из основных в физике белка с тех пор как была установлена первая пространственная структура глобулярного белка/ Открытие того, что зрелый функционально активный белок может приобретать свою исходную пространственную структуру вне клетки (в отсутствие клеточных факторов) после того как он был предварительно развернут денатурирующими агентами, привело к центральной гипотезе о тон, что вся необходимая и достаточная информация о пространственной организации белка закодирована в его первичной структуре (аминокислотной последовательности) и сделало возможным экспериментально изучать процесс сворачивания белков прямыми структурными методами. Оценка вероятности того, что белок сворачивается путем беспорядочного перебора всех возможных конформаций полипептидной цепи дала астрономически большое время, что противоречило реальности (парадокс Левинталя). Это обстоятельство привело к другой важной гипотезе о том, что должен существовать путь сворачивания (определенная последовательность событий), общий для всех глобулярных белков. В то же время, данные по рентгеноструктурному анализу пространственной структуры большого количества глобулярных белков указывали на их общие структурные характеристики. Так' все глобулярные белки содержат большое количество элементов вторичной структуры (ос-спирали и (3-листы), на одной стороне которых обычно находятся скопления гидрофобных боковых групп (гидрофобные кластеры). Гидрофобные кластеры образуют гидрофобное ядро молекулы белка, которое обеспечивает глобулярность и фиксацию элементов вторичной структуры друг относительно друга в пространстве (так называемую "топологию" укладки или третичную пространственную структуру полипептидной цепочки). Наконец, ферментативные функции белковой молекулы и ее устойчивость к

изменяющимся условиям внешней среды обеспечиваются жесткой фиксацией большинства белковых групп. При этом формируется конфигурация активных центров белков, а гидрофобное ядро экранируется гидрофильными белковыми группами, обеспечивая тем самым растворимость обычных (не мембранных) глобулярных белков в водной среде. Наличие определенной иерархии структурной организации белковой молекулы, обшей для всех глобулярных белков, наводит на мысль, что существует определенная последовательность событий, определяющая путь ее самоорганизации. Экспериментальное исследование самоорганизации белка включает два основных подхода: равновесный и кинетический. Равновесный подход заключается в том, чтобы "выключать" часть внутримолекулярных взаимодействий, поддерживающих нативную структуру белка, и анализировать конформационное состояние, которое при этом реализуется. Такое "выключение" части внутримолекулярных взаимодействий достигается постепенным изменением внешних условий (состава растворителя, температуры, рН среды и т.д.). Кинетический подход заключается в том, что внешние условия, в которых белковая молекула находится в полностью развернутом состоянии (например, высокие концентрации сильных денатурантов, таких как мочевина или

гуанкдингидрохлорид), резко (скачком) изменяются на условия, в которых белковая молекула находится в нативном (биологически активном) состоянии (например, низкие концентрации денатурантов), а за формированием пространственной структуры белка следят во времени. Используя равновесный подход, исследователи довольно быстро обратили внимание на то, что на пути разворачивания (денатурации) белковых молекул часто накапливаются конформацнонные состояния, промежуточные между нативным и полностью развернутым. Такие промежуточные конформацнонные состояния получили название "частично свернутых". Однако, всестороннее исследование основных структурных характеристик, равновесных промежуточных конформационных состояний глобулярных белков продолжается по настоящее время и, в значительной части, является составом настоящей работы. Развитие кинетических исследований в существенной степени сдерживалось отсутствием хорошо разработанных экспериментальных подходов, позволяющих следить за быстрым изменением основных структурных характеристик белковой молекулы в процессе ее сворачивания. Особенно это

касалось методов, чувствительных к формированию гидрофобных кластеров и глобулярности белковой цепи.

В настоящей работе разработаны и успешно использованы четыре методических подхода, позволяющих следить за формированием гидрофобных кластеров и глобулярности белковой цепи в субсекундном временном интервале, что в значительной степени стимулировало кинетические исследования процесса самоорганизации белков. Используя как разработанные так и ранее известные методические подходы, в работе был исследован процесс самоорганизации более десяти глобулярных белков, выявлены и структурно охарактеризованы как равновесные так и кинетические общие промежуточные состояния, накапливающиеся на пути их сворачивания. Важным вопросом является соответствие процесса самоорганизации белка in vitro с процессом его сворачивания в клетке (in vivo). В частности, в последнее время широкое внимание привлек особый класс белков теплового шока - так называемые молекулярные шапероны. Как было установлено, эти белки принимают непосредственное участие в процессах сворачивания и внутриклеточного транспорта вновь синтезированных белковых цепей. В работе исследовано влияние на процесс самоорганизации глобулярных белков одного из представителей молекулярных шаперонов - белка GroEL из Е. Coli. Показано, что взаимодействие GroEL с ранними кинетическими промежуточными состояниями на пути сворачивания белков не ускоряет, а наоборот замедляет приобретение сворачивающимся белком окончательной нативной структуры. Единственным, физически оправданным объяснением участия GroEL в сворачивании белков в клетке является то, что взаимодействуя с ненативными конформациями белков, он предотвращает их от неспецифической ассоциации, которая является "фатальной" для дальнейшего сворачивания в нативную^труктуру.

1.2 Цель и задача исследования. Цель настоящей работы состояла в том, чтобы экспериментально установить последовательность основных событий, которые формируют пространственную структуру глобулярного белка из полностью развернутого состояния, т. е. "грубый" путь самоорганизации белковой цепи, закодированный в ее аминокислотной последовательности.

При этом решались следующие задачи:

- разработка методических подходов, позволяющих следить за

формированием основных структурных характеристик глобулярного белка ( вторичной структуры, гидрофобных кластеров, глобулярности и жесткости третичной структуры ) как в равновесии так и во времени;

- мультипараметрическое исследование процесса самоорганизации основных классов мономерных глобулярных белков (а-спиральных и /3-структурных, имеющих и неимеющих интактные дисульфидные связи, одно и мультидоменных ) с целью выявления общих закономерностей;

выявление и структурная характеристика основных промежуточных конформационных состояний белковой цепи, накапливающихся на пути ее самоорганизации;

установление природы факторов, лимитирующих скорость сворачивания глобулярных белков;

- влияние на процесс сворачивания глобулярных белков таких клеточных факторов как молекулярные щапероны.

1.3 Научное значение и новизна работы определяется тем, что: впервые представлены наиболее полные, экспериментально обоснованные данные о процессе самоорганизации целого ряда мономерных глобулярных белков, на основании которых установлена последовательность основных общих событий, формирующих пространственную структуру белка из полностью развернутого состояния. Показано, что эта последовательность событий иницируется полным или частичным формированием элементов вторичной структуры (а-спиралей и /3-листов) и, следовательно, гидрофобных кластеров, которые затем коллапсируют с образованием нежесткого гидрофобного ядра (происходит полная или частичная глобуляризация). Эти два промежуточных состояния являются общими для всех исследованных глобулярных белков. Последующее формирование жесткой третичной структуры может в некоторых белках реализоваться через формирование еще одного промежуточного состояния, которое имеет жестко упакованное гидрофобное ядро при отсутствии жесткой упаковки (фиксации боковых групп) на поверхности;

показано, что скорость цис-транс изомеризации пролиновых остатков может контролировать в достаточно широком временном интервале только последний этап самоорганизации белка приобретение жесткой третичной структуры, в то время как предыдущие этапы самоорганизации не чувствительны к пролиновой

изомеризации.

- Выявлен второй внутримолекулярный фактор, замедляющий процесс самоорганизации белков, которым является нестабильность части элементов вторичной структуры в отсутствие специфических (короткодействующих) внутримолекулярных взаимодействий, формирующих жесткую третичную структуру белка.

- Установлено, что последовательность основных событий в процессе самоорганизации глобулярных белков не может быть изменена или ускорена молекулярными шаперонами.

Практическая ценность. Установленные закономерности процесса самоорганизации глобулярных белков позволяют вплотную приблизиться к пониманию механизма сворачивания белков, что в свою очередь делает возможным создавать (конструировать) белки с заранее заданными биологическими функциями, более четно представлять процессы, происходящие при созревании белков в клетке, и роль в этих процессах клеточных факторов, т. е. к решению целого ряда биотехнологических и медицинских задач.

Публикации. Основные результаты представленной к защите диссертационной работы опубликованы в 30 печатных работах, включая 17 публикаций в рецензируемых отечественных и международных научных журналах.

Апробация. Материалы диссертационной работы докладывались на 1-ом Биофизическом съезде ( Москва, 1982); V-ой Конференции по спектроскопии биополимеров ( Харьков, 1984); VI-ом Симпозиуме по конформационным изменениям биополимеров в растворах (Тбилиси, 1985) ; Симпозиуме "Физико-химические свойства биополимеров в растворах и клетках" ( Пущина, 1985) ; V-ой международной конференции молодых ученых по биоорганической химии (Рига, 1988); FEBS congress (Budapest, 1990); международной конференции "Protein biosynthesis" (Пущино, 1991); VII-ой конференции по спектроскопии биополимеров (Харьков, 1991 ); IV-ой международной конференции "Biophysics and synchrotron radiation" (Tsukuba, Japan,1992); IX-ом русско-германском симпозиуме по химии пептидов и белков ( Пущино, 1994 ).

На защиту выносятся:

1). Разработка экспериментального подхода для изучения формирования гидрофобных кластеров и гидрофобного ядра белков в процессе их сворачивания, основанного на использовании

гидрофобного флуоресцирующего зонда.

2). Разработка экспериментальных подходов для изучения глобуляризации белковой цепи в процессе ее сворачивания, основанных на использовании миграции энергии между флуоресцирующими группами, иммобилизации спиновой метки и малоуглового рассеяния рентгеновских лучей.

3). Результаты исследования основных структурных характеристик равновесных и кинетических промежуточных конформационных состояний, накапливающихся на пути сворачивания глобулярных белков.

4). Последовательность основных событий, в,результате которых развернутая белковая цепь приобретает свою жесткую пространственную организацию.

5). Исследование скорости спонтанного сворачивания (самоорганизации) глобулярных белков и лимитирующих ее факторов,

..6). Исследование влияния на кинетику спонтанного сворачивания глобулярных белков таких клеточных факторов как молекулярные шапероны.

Данная работа представляет собой первое систематическое исследование процесса самоорганизации глобулярных белков с использованием большого количества адекватных экспериментальных методов и объектов исследования, охватывающих различные структурные классы и источники получения.

2. СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

2.1 Объекты исследования

С целью выявления общих закономерностей в процессе самоорганизации глобулярных белков, в работе были использованы следующие объекты исследования: а-лактальбумины человека и коровы, апомиоглобины кашалота и лошади, карбоангидразы коровы и человека, р-лактамаза из Staphylococcus aureus,

фосфоглицераткиназы из дрожжей и печени свиньи, (S - субъединица триптофансинтазы из E.Coli, /3-лактоглобулин коровы, а также гомополипептиды - полиглутаминовая кислота и полилизин.

2.2 Методы исследования

Для получения адекватной информации об изменении основных структурных характеристик в процессе самоорганизации глобулярного

I ч

белка использовались следующие методические подходы:

1. Содержание вторичной структуры контролировалось с использованием широко известного метода кругового дихроизма (КД) в области поглощения пептидных групп (190 - 250 нм).

2. Для того, чтобы следить за формированием гидрофобных кластеров и гидрофобного ядра в процессе сворачивания глобулярного белка, был разработан новый подход, основанный на способности некоторых флуоресцирующих зондов связываться с протяженными гидрофобными областями (кластерами) белковой молекулы, экспонированными на растворитель. В настоящей работе был использован один из таких зондов 1-анилино-нафтален-8-сульфонат (АНС). В работе показано, что этот зонд практически не связывается с полипептидной цепью, не содержащей гидрофобные кластеры (например, клубкообразные белковые полипептидные цепочки или гидрофильные гомополимеры в а-спиральной и ft- структурной конформациях). АНС также плохо связывается с нативными жесткими глобулярными белками, у которых гидрофобные кластеры хорошо закрыты от растворителя плотно упакованными гидрофильным» боковыми группами. Однако, АНС имеет сильное сродство к промежуточным конформационным состояниям белковой молекулы, в которых плотная упаковка боковых групп нарушена, однако, гидрофобные кластеры (гидрофобное ядро) сохранены (например, кислые формы а-лактальбумина и карбоангидразы). При этом интенсивность флуоресценции АНС резко возрастает, что позволяет легко регистрировать взаимодействие АНС с гидрофобными областями белковой молекулы (рис.1).

3. За глобулярностью белковой цепи при равновесных исследованиях можно следить с помощью традиционных методов - измерением характеристической вязкости или использованием колоночной хроматографии. Однако, эти методы совершенно неприемлемы для регистрации быстрых (субсекундных) кинетических процессов глобуляризации белковой цепи при ее спонтанном сворачивании. Для этой цели в работе были разработаны три различных по своей сути методических подхода. Первый основан на известном явлении безизлучательной миграции энергии между двумя флуоресцирующими группами (донором и акцептором) при их достаточной сближенности в пространстве. При этом интенсивность флуоресценции донора уменьшается, а акцептора увеличивается. Кроме того, в спектре

t

Рис.1 Спектры флуоресценции АНС (ANS) в присутствии: (А) нативных (0,05 М Tris HCI, рН 8) и клубкообразных (0,05М Tris HCI, рН 8, 8,5М мочевины) бычьей карбоангидразы - 1, 2 и а-лактальбумина -4, 3, а также клубкообразного апоцитохрома "С" (0,05М KCI, рН 5,6) - 5; (В) кислых форм а-лактальбумина (рН 2,0) - б и карбоангидразы (рН 3,6) - 7. Отношение молярных концентраций [АНС]/[белок]=250/1.

8

возбуждения флуоресценции акцептора появляется спектр возбуждения флуоресценции донора (рис.2). В настоящей работе была использована хорошо известная донор-акцепторная пара: собственные остатки триптофана белка и химически присоединенные к аминогруппам белка дансильные флуоресцирующие группы.

Второй методический подход основан на известном явлении уширения линий в спектре электронного парамагнитного резонанса (ЭПР) так называемых "спиновых" меток при их иммобилизации, т.е. стерическом ограничении их подвижности. Поскольку стерические ограничения на внутримолекулярную подвижность спиновых меток в глобулярной конформации белковой молекулы существенно больше, чем в неглобулярной, то интенсивности линий спектра ЭПР спиновых меток также заметно отличаются (рис.2).

Эти два методических подхода позволяют получать информацию об изменении глобулярности белка (рис.3) и работать с достаточно низкими концентрациями белков (менее 0,1 мг/мл), что в некоторых случаях чрезвычайно важно. Однако, оба эти подхода реализуются путем некоторой кодификации белка и требуют дополнительных исследований влияния присоединения меток на конформацию и процесс самоорганизации белковой цепи. Кроме этого, оба подхода страдают "локальностью" получаемой информации, поскольку прямо отражают пишь ситуацию вблизи меток, а не всей молекулы в целом (хотя использование нескольких меток и их неадресное введение существенно усредняет локальную информацию по всей

иолекуле).Таким образом, наличие глобального (неметочного) юдхода к исследованию процесса глобуляризации белковой цепи зущественным образом повысило бы достоверность получаемой «нформации. Такой подход был найден и разработан для изучения фоцесса самоорганизации глобулярных белков.

Третий метод, который несет информацию о глобулярности 5елковой молекулы, основан на малоугловом рассеянии рентгеновских гучей. При использовании мощного синхогронного излучения, которое :ущественно повышает чувствительность метода, можно работать с фиеклемыми концентрациями белков (5 мг/мл) и в субсекундном ¡ременном интервале при исследовании кинетики сворачивания белков. В этом методическом г(одходе, вместо широко используемого анее в статических измерениях параметра - радиуса инерции, редлагается использовать интегральную интенсивность под кривой

ехсНаЯоп(Тгр) ет'^в'юпЮЫБ)

Рис.2 Спектры возбуждения и флуоресценции меченной дансилом - Ш! (А) и спектры ЭПР спин-меченной (В) бычьей карбоангидразы в

глобулярном ( ---- ) и клубкообразном ( - ) конформационных

состояниях. Число меток на молекулу белка составляло от 3 до 4. Глобулярное состояние - нативное (0,05 М Тг15-НС1, рН 7,5), клубкообразное - в присутствии 8,5 М мочевины.

и .0

Э.5

-

§—0О-®_л

° А

%

/ о

0,0 а

о

/г

>Л

/о

,0»

/о

епегду ког^ег (ТНР-ОЫБ) о-ЕЗР ¡п1епБ11у

О 2 4 6 М виНС1

Рис.3 Разворачивание человеческой карбоангидразы в гуанидингидро-хлоридом (Си-НС1), зарегистрированное по уменьшению миграции энергии с триптофановых остатков на дансильные метки (•), уменьшению иммобилизации (увеличению внутримолекулярной подвижности) спиновых меток (о) и по увеличению характеристической вязкости (0 ). Г - доля клубкообразного состояния. Глобулярное промежуточное состояние с выраженной вторичной структурой, но без жесткой третичной структуры накапливается при 1,5 М ви-НСХ.

рассеяния рентгеновских лучей в малоугловой области (рис.4). В работе (на примере 6 глобулярных белков и двух гомополимеров) экспериментально установлено, что интегральная интенсивность рассеяния рентгеновских лучей в малоугловой области для мономерной глобулярной конформации значительно выше, чем для мономерной неглобулярной конформации полипептидной цепи (рис.4А). Этот принципиальный эффект обусловлен тем, что при сохранении одного и того же молекулярного веса существенно изменяется форма и внутренняя электронная плотность молекулы при ее переходе из глобулярной конформации к гаусовоподобной, которая моделирует клубкообразную конформацию или неглобулярные (без гидрофобного ядра) элементы вторичной структуры (а-спирали или /3-листы). Это различие проявляется в форме кривой малоуглового рассеяния рентгеновских лучей и особенно хорошо видно при использовании специального построения - так называемого преобразования Кратки (рис. 4В). Видно, что кривая рассеяния для глобулярной конформации в этом построении характеризуется выраженным максимумом, в то время как- для неглобулярной конформации этот максимум отсутствует.

4. Еще одной, общей для всех глобулярных белков, структурной характеристикой является жесткость третичной структуры или жесткая фиксация большинства белковых групп относительно друг друга. Эмпирически было установлено ранее и прямо показано в настоящей работе, что спектр кругового дихроизма в области поглощения ароматических групп белка (250-350 нм) чувствителен к жесткости их непосредственного окружения. То же самое относится (в некоторых случаях) и к интенсивности флуоресценции триптофановых остатков. В работе также показано, что при формировании жесткой пространственной структуры белка значительно уменьшается его сродство к гидрофобным зондам (по сравнению с промежуточными конформационными состояниями). И, наконец, этот процесс часто сопровождается появлением биологической функции белка (или ферментативной активности). Однако, прямое измерение жесткости фиксации белковых групп друг относительно друга в растворе возможно только методом ядерного магнитного резонанса высокого разрешения. Во-первых, жесткая третичная структура обеспечивает взаимодействие протонов метильных групп с кольцевыми токами ароматических групп белка, что в свою очередь проявляется

x-ray

Рис. 4 Кривые синхротронного малоуглового рассеяния рентгеновских лучей (А) и преобразование Кратки (В) для карбоангидразы в глобулярном (0,05 М Tris НСI, рН 8 ) - 1 и клубкообразном (8,5М мочевины ) - 2 конформационных состояниях ; S = 4л sin 0/А. , где 20 - угол рассеяния, А - длина волны ( 1,5 А ). Отсутствие максимума в преобразовании Кратки характерно и для полиглутаминовой кислоты и полилизина в а-спиральной и (3- структурной конформациях.

в сильных вторичных хинических сдвигах сигналов этих протонов, в частности, в высокопольную область спектра. Во-вторых, используя этот кетод можно получать прямую информацию о внутримолекулярной подвижности различных белковых групп при помощи релаксационных подходов. В последнее время, для получения инфоркации о жесткости (кооперативности) пространственной организации глобулярных белков используется наличие или отсутствие кооперативности денатурационных переходов (температурных или с использованием сильных денатурантов).

Таким образом, в работе было использовано достаточное количество объектов и методов для получения достоверной • информации о процессе самоорганизации глобулярных белков и выявления общих закономерностей этого процесса.

2.3 Равновесные промежуточные конформационные состояния белков

Чтобы установить соответствие изменения используемых структурных параметров изменению определенных структурных характеристик глобулярных белков, а также структурно охарактеризовать равновесные (термодинамически стабильные) промежуточные состояния, накапливающиеся на пути самоорганизации белков, было предпринято мультипараметрическое исследование процессов равновесной де- и ренатурации ряда глобулярных белков. На рис.5 в качестве примера приведены ряд структурных параметров для карбоангидразы В коровы в трех равновесных конформационных состояниях: нативном (рН 7.2), полностью развернутом (в присутствии 8.8М мочевины) и промежуточном (частично свернутом) при пониженных значениях рН (кислая форма, рН 3.6). Видно, что частично свернутое состояние (реализующееся при низких рН) обладает выраженной вторичной структурой (выраженным спектром КД в области поглощения пептидных групп, существенно отличным по интенсивности от полностью развернутого состояния) и глобулярностью близкой к нативной (практически совпадающим с нативным состоянием положением спектра триптофановой флуоресценции и значением характеристической вязкости [т)]). Вместе с тем, белок в этом состоянии не обладает выраженным спектром КД в области поглощения ароматических групп, что свидетельствует об отсутствии жесткой фиксированности их ближайшего окружения (рис.5А). К тому же белок в этом состоянии

Рис. 5 Спектры кругового дихроизма (А - а и б) и флуоресценции триптофановых остатков (А - в), а также спектры Н-ЯМР (В) бычьей карбоангидразы в: нативном состоянии (рН 7,5, [ч] = 3,2 см3/г) -1; кислой форме (состояние "расплавленной глобулы", рН 3,3-3,6,

3

[11] = 4,1 см /г) - 2 и клубкообразном состоянии (в присутствии

з

8,5 М мочевины, [17] = 29 см /г) - 3. Стрелками указаны резонансы,

на которых измерялось время спин-спиновой релаксации Т (см.ниже,

1

рис.6). Заштрихованная часть спектра Н-ЯМР - область высокопольных резонансов.

имеет высокое сродство к гидрофобному зонду АНС (сн. рис.1), что свидетельствует о повышенной (по сравнению с нативным состоянием) экспонированности его гидрофобных кластеров (гидрофобного ядра) на растворитель. Все это указывает на то, что молекула белка при кислых рН не обладает жесткой фиксацией большинства боковых групп, однако сохраняет при этом значительное количество элементов вторичной структуры и выраженное гидрофобное ядро (глобулярность). Такое промежуточное термодинамически стабильное конформационное состояние глобулярных белков получило название "расплавленная глобула". На рис. 5В приведены спектры 'н-ЯМР карбоангидразы В в этих конформационных состояниях. Видно, что отсутствие жесткости пространственной организации белковой молекулы как в полностью развернутом состоянии так и при кислых рН приводит к значительному уменьшению вторичных химических сдвигов протонных сигналов по всену спектру (как в алифатической области от 3,5 до -0,5 м. д. так и в ароматической области от. 8 до 6 м. д. ).

Рис. 6 демонстрирует резкое увеличение внутримолекулярной подвижности как алифатических (метильных) так и ароматических групп белка в состоянии расплавленной глобулы (по сравнению с нативным), которое следует из релаксационных 1Н-ЯМР экспериментов по измерению времени релаксации Т2 или спада амплитуды "спинового эха" от времени (время спада "спинового эха" обратно пропорционально подвижности протонов в пространстве). Надо отметить, что подобное конформационное состояние (типа "расплавленной глобулы") реализуется при кислых рН и для других белков таких как а-лактальбуиины коровы и человека, /3-лактамаза, фосфоглицераткиназа и |32-субъединица триптофансинтазы. Промежуточное состояние типа "расплавленной глобулы" накапливается в некоторых случаях и при разворачивании глобулярных белков гуанидингидрохлоридом или мочевиной. На рис.7 в качестве примера представлено изменение сродства гидрофобного зонда АНС (АЫв) к молекуле белка при разворачивании (3-лактамазы, карбоангидразы В человека и коровы гуанидингидрохлоридом. Видно, что по мере перехода белковой цепи из полностью развернутого состояния в нативное ее сродство к гидрофобному зонду проходит через максимум, указывая тем самым на накопление на пути сворачивания белков промежуточного состояния с сильным сродством

sec

Рис. В Зависимости спада амплитуды "спинового эха" от времени для метильных (резонанс на 0, 98 м. д. ) - А и ароматических (резонанс на 7,2 м. д. ) - В протонов бычьей карбоангидразы в нативном состоянии (рН 7,2), в состоянии "расплавленной глобулы" (рН 3,3) и в полностью развернутом (8 М urea) состояниях. Концентрация белка 8 мг/мл. D_0.

4 cgu.hci<n>

Рис. 7 Изменение интенсивности флуоресценции на 480 нм свободного АНС (ANS) ( — О — ) ив присутствии /3-лактамазы (1), человеческой карбоангидразы (2) и бычьей карбоангидразы (3) при увеличении концентрации гуанидингидрохлорида (Gu-HCl) в растворе. Концентрация белка - 10~6М; pH 7, 5 ; 25°С. Отношение молярных концентраций [АНС] / [белок] - 250/1.

к гидрофобному зонду. Исследование этих переходов другими методами показало, что это промежуточное состояние обладает выраженной вторичной структурой и глобулярно (сравни для случая карбоагидразы В человека с рис.3). Вместе с тем, оно не обладает жесткой третичной структурой (отсутствие выраженных спектров КД в области поглощения ароматических групп) и ферментативной активностью. Таким образом, одним из равновесных

(термодинамически стабильных) промежуточных конформационных состояний, накапливающихся на пути сворачивания глобулярных белков, является состояние типа "расплавленной глобулы". Оно характеризуется наличием выраженной вторичной структуры, глобулярностью (наличием гидрофобного ядра), но отсутствием жесткой фиксации большинства белковых групп друг относительно друга. Это приводит к повышенной экспонированности гидрофобного ядра молекулы на растворитель и повышенной склонности к неспецифической межмолекулярной ассоциации, которая в некоторых случаях заметно проявляется при больших концентрациях белка (более 5 мг/мл).

При равновесном разворачивании белков сильными денатурантами при некоторых условиях (в частности, при пониженных температурах) может накапливаться еще одно термодинамически стабильное промежуточное конформационное состояние, которое характеризуется наличием выраженной вторичной структуры, но отсутствием

глобулярности (гидрофобного ядра). На рис.8 представлено равновесное разворачивание |3-лактамазы гуанидингидрохлоридом при 4°С, регистрируемое методами высокоэффективной колоночной хроматографии (ГРЬС), кругового дихроизма и ферментативной активности. Видно, что по мере увеличения концентрации денатуранта высокоэффективная колоночная хроматография разделяет два пика, один из которых отвечает существенно менее компактной чем нативная молекула конфориации (выходит с меньшим объемом элюции, рис.За). Если представить уменьшение глобулярной фракции белка (уменьшение площади под пиком с большим объемом элюции) по мере увеличения концентрации денатуранта наряду с уменьшением ферментативной активности и кругового дихроизма в области поглощения ароматических групп, а также наряду с уменьшением кругового дихроизма в области поглощения пептидных связей (как это сделано на рис.8Ь), то можно видеть, что разворачивание

< /

ШП йи-НЩ а.

тпси-наёХ

а,55Пйи-НШ/К_

а,чт&и-на) №

а&мьи-на

о,а-а,Ши-иа 1

1 1 1

О V 20 Объеп злюции, пп

Эи-НС! СМ)

Рис. 8 Изменение структурных параметров при разворачивании р-лактамазы гуанидингидрохлоридом при 4°С: а - профилей ГРЬС; Ь -энзиматкческой активности ( О ) и спектров КД на 270 нм ( • ) -1, уменьшение площади под пиком элюции глобулярной фракции в профиле ГРЬС - 2 и уменьшение интенсивности спектра КД на 220 нм - 3; £ - доля денатурированного состояния.

Рис. 9 Блок - схема приставки "остановленного потока" для исследования быстрых ( субсекундных ) кинетических процессов с помощью серийных спектральных приборов ( пояснение в тексте ).

молекулы белка при этих условиях происходит через три последовательные стадии. На первой происходит потеря ферментативной активности и выраженного спектра КД в области поглощения ароматических групп, на второй - потеря глобулярности и части вторичной структуры, и на третьей происходит исчезновение оставшихся элементов вторичной структуры. Таким образом, в этом случае на пути разворачивания (3-лактамазы накапливается по крайней мере два промежуточных состояния. Первое является глобулярным с выраженной вторичной структурой, но при отсутствии жесткой третичной структуры (состояние "расплавленной глобулы"). Второе же не является глобулярным, но содержит достаточно большое ( - 50%) количество элементов вторичной структуры. Между этими промежуточными состояниями имеет место довольно медленный обмен (при 4°С) поскольку они разделяются колоночной хроматографией (рис.8а). Аналогичный результат был получен и при исследовании равновесного разворачивания гуанидинхлоридом при 4°С карбоан-гидразы В коровы.

Представленное выше исследование равновесных денатурационных процессов ряда глобулярных белков позволило с одной стороны четко разграничить используемые методы с учетом той структурной характеристики белка, которую они в основном отражают, а с другой стороны - выявить и структурно охарактеризовать по крайней мере два из возможных термодинамически стабильных промежуточных конформационных состояний, накапливающихся на пути самоорганизации глобулярных белков. Все это в существенной степени упростило обнаружение и структурную характеристику коротко живущих кинетических промежуточных конформационных состояний.

2.4 Кинетика самоорганизации глобулярных белков

2. 4. 1 Техника остановленного потока

Для того, чтобы изучать быстрые (в субсекундном временном интервале) кинетические процессы самоорганизации белков была разработана и создана приставка "остановленного потока" к серийным спектральным приборам (спектрофотометрам,

спектрополяриметрам и спектрофлуориметрам), обеспечивающая быстрое смешение жидкостей с различающимися плотностями и быструю регистрацию изменения структурных параметров (Рис.9). Принцип

действия приставки заключается в следующем. Растворы впрыскивались в регистрационную ячейку (1) с помощью пневматического толкателя (2) через термостатируемые шприцы (3) с отношением объемов 1:5. Поскольку разворачивание белка обычно происходит в достаточно узком интервале концентраций денатурантов, разбавление в 6 раз было достаточным для смены условий, при которых белковая молекула находится в полностью развернутом состоянии (например, высокие концентрации денатурантов), на условия, при которых белок сохраняет свою нативную структуру (низкие концентрации денатурантов). Оба шприца соединены через систему клапанов (4) и термостатируемых гибких шлангов (5) с 12-ти струйным тангенциальным смесителем (6), помещенным на дне регистрационной ячейки (1). Смеситель (Б) и регистрационная ячейка (1) собраны внутри термостатируемого блока (7) с внешними размерами 12x12x50 мм (в соответствии с размерами держателя кювет в серийных спектральных приборах). Прореагировавшая смесь собирается в шприце (8). Система регистрации включает в себя персональный компьютер, цифровой осцилограф, самописец и пять усилителей с широкими возможностями регулировки постоянной времени измерений от 0,5х10"3 сек до 5 сек. Объем регистрационной ячейки составляет 0,09 мл, а мертвое время измерений составляет 10~2 сек. В работе использовались также серийные зарубежные приставки "остановленного потока" фирм Durrum (США), Unisoku (Япония) и Biologic (Франция).

2. 4. 2 Формирование вторичной структуры

Для регистрации формирования вторичной структуры белка использовался метод кругового дихроизма в области поглощения пептидных групп. На рис.10 и 11 в качестве примера приведены кинетики изменения эллиптичности в области поглощения пептидных групп для двух белков карбоангидразы В коровы и фосфоглицераткиназы из дрожжей. Видно, что значительная часть вторичной структуры белков формируется чрезвычайно быстро (за времена существенно меньшие мертвого времени измерений, т. е. быстрее чем за 10~2 сек). Обращает внимание, что в случае карбоангидразы В элиптичность на 222 нм сразу достигает нативной величины*, в то время как в случае фосфоглицераткиназы за быструю фазу востанавливается только 50%, а остальная вторичная структура формируется медленно. Эти два примера отражают непростую ситуацию

WAVELENGTH (nm) TIME(S)

Рис. 10 (А) Спектры кругового дихроизма пептидных групп бычьей карбоангидразы в развернутом (8, 5М мочевины) и нативном (4М мочевины) состояниях. (В) Кинетика восстановления эллиптичности на 222'нм при сворачивании белка из 8.5М в 4М мочевины.

ШО"10'5 CONDITIONS:

degree-cm^ lnitial:5.5M urea

dmol Final:0.5W urea

Рис. 11 (А) Спектры кругового дихроизма пептидных групп дрожжевой фосфоглицераткиназы в развернутом (5,5М мочевины) и нативном (О, 5М мочевины) состояниях. (В) Кинетика восстановления эллиптичности на 225 нм при сворачивании белка (из 5, 5М в О, 5М мочевины).

с формированием вторичной структуры в процессе самоорганизации глобулярных белков. Тем не менее, исследование кинетик формирования вторичной структуры 10-ти глобулярных белков позволило установить, что во всех случаях в качестве первого шага происходит неизмеримо быстрое формирование элементов вторичной структуры (либо существенной их части, либо полностью).

2. 4. 3 Формирование гидрофобных кластеров и гидрофобного ядра.

За формированием гидрофобных кластеров и гидрофобного ядра в процессе самоорганизации белка очень удобно следить по изменению сродства к флуоресцирующему гидрофобному зонду АНС, которое проявляется в изменении интенсивности флуоресценции зонда ( см. рис. 1 и 7). На рис. 12 представлены кинетики спонтанного сворачивания ряда глобулярных белков в присутствии АНС. Важно отметить, что само по себе связывание АНС с гидрофобными мишениями в наших условиях происходит неизмеримо быстро, поэтому регистрируемое изменение сродства АНС к молекуле белка в процессе его самоорганизации обусловлено конформационными изменениями, происходящими в белке по мере его сворачивания. Первое, что обращает внимание, это наличие максимума на кривых изменения сродства АНС к молекуле сворачивающегося белка. Это свидетельствует о том, что как и при равновесной самоорганизации (см. рис.7) на пути сворачивания белка накапливается кинетическое промежуточное конформационное состояние с высоким сродством к гидрофобному зонду. Второе заключение можно сделать при более внимательном анализе представленных на рис. 12 кривых. Во всех случаях происходит неизмеримо быстрое частичное связывание гидрофобного зонда с молекулой белка, т. е. некоторое сродство к гидрофобному зонду появляется на самых ранних (самых быстрых) стадиях сворачивания белка. Этот факт не является удивительным, если принять во внимание, что элементы вторичной структуры (и, следовательно, гидрофобные кластеры, формируются неизмеримо быстро (см. рис. 10 и 11). Уменьшение сродства молекулы белка к гидрофобному зонду (т.е. уменьшение интенсивности флуоресценции АНС) в процессе его сворачивания (рис.12, правая часть кинетик) может происходить только при формировании жесткой третичной структуры, которая закрывает гидрофобные кластеры от контакта с растворителем (что подтверждается другими методами (см.ниже). Однако, интерпретация регистрируемого значительного увеличения

ans fluorescence

So.obs BOVINE CARBONIC ANHYORASE (ll*C)

I \(

/0.05 S \\ YEAST PHQSPHOGLYCERATE \ KINASE (23'C)

j J^pois J 0.05s\v VV ---------- \V 1—1' I0OS BOVINE p-LACTOCLOBUUN M.S'C)

fH\ / 1 f (j V HUMAN ot-LACTALBUMIN I5*C) l [ S.oureus /S-IACTAMASE (23'C)

f 0.05 S \ E.coli p2-TRYPTOPHAN SYNTHASE (I2-C) \/ \ I00S

Рис. 12 Кинетики изменения интенсивности флуоресценции (сродства) гидрофобного зонда АНС (ANS) в процессе сворачивания глобулярных белков. Отношение [АНС]/[белок] - 200. Слева расположены быстрые (в субсекундном временном интервале) фазы кинетик, а справа -медленные. Концентрация белков - 2x10 6М.

сродства АНС к молекуле белка, происходящего в субсекундном временном интервале (рис.12, левая часть кинетик), не столь очевидна.

2.4.4 §ормирование глобулярной структуры.

Рис.13 представляет кинетику самоорганизации карбоангидразы В в субсекундном временном интервале, • зарегистрированную как методами, отражающими формирование глобулярности, так и по увеличению сродства к АНС. Видно, что все методы (увеличение миграции энергии с триптофановых остатков на дансильные группы, увеличение иммобилизации спиновых меток, увеличение интенсивности рассеяния рентгеновских лучей и увеличение сродства к гидрофобному зонду) отражают один и тот же кинетический процесс с полувременем около 40 млсек (4х10~2 сек). Это может означать только формирование гидрофобного ядра белка (коллапсирование сформированных ранее элементами вторичной структуры гидрофобных кластеров) и, следовательно, его глобуляризацию. Естественно, что сформированное на этой стадии гидрофобное ядро белка (большая гидрофобная поверхность) не закрыто от растворителя жесткой третичной структурой (которая формируется на более поздних стадиях, см. рис. 12, правая часть кинетик) и представляет отличную мишень для гидрофобного зонда. Аналогичный результат был получен для фосфоглицераткиназы из дрожжей с использованием интегральной интенсивности малоуглового рентгеновского рассеяния и миграции энергии с триптофановых остатков на дансильные группы как методов, отражающих процесс глобуляризации молекулы белка, наряду с увеличением сродства к гидрофобному зонду в субсекундном временном интервале (рис.14 и 15). Видно, что также как и в предыдущем случае, в субсекундном временном интервале все три метода фиксируют один и тот же кинетический процесс глобуляризацию молекулы белка и формирование не жестко упакованного гидрофобного ядра.

Таким образом, из исследования ранних кинетических стадий самоорганизации глобулярного белка (до формирования жесткой третичной структуры) можно заключить, что формирование пространственной структуры белка иницируется формированием элементов вторичной структуры, которые формируют гидрофобные кластерЧ1. Гидрофобные кластеры в свою очередь обеспечивают формирование гидрофобного ядра (коллапсирование сформированных на

Time, s

¡J

Рис. 13 (А) Кинетики увеличения миграции энергии между Трп остатками и дансильными метками (1) и уменьшения интенсивности спектра ЭПР спиновых меток (2) в процессе сворачивания карбоангидразм В коровы (из 8, 8М мочевины в 4И мочевины при рН8 и 23°с). (В) Кинетика увеличения сродства АНС к белковой молекуле при тех же условиях. Во врезке показана кинетика увеличения (восстановления нативной величины) интенсивности рассеяния рентгеновских лучей в малоугловой области.

РИС. 14 Кинетика сворачивания дрожжевой фосфоглицераткиназы зарегестрированная по изменению интегральной интенсивности малоуглового рентгеновского рассеяния в субсекундном временном интервале (А) и в минутном временном интервале (В). Концентрация белка - 3 мг/мл; 0.01М ТПэ-НС!, рН 8,0; 23°С.

TIME (s)

TIME (s)

Рис. 15 Кинетика сворачивания дрожжевой фосфоглицераткиназы зарегестрированная по увеличению миграции энергии с триптофановых остатков на дансильные метки (А) и по изменению сродства к гидрофобному флуоресцирующему зонду - АНС (В) в двух временных интервалах: 1 - субсекундном и 2 - минутном. Концентрация белка 0,05 мг/мл; 0.01М Tris-HCI, рН 8,0; 23°С.

самых ранних стадиях элементов вторичной структуры) и, следовательно, глобуляризацию белковой цепи. Конечно, это достаточно грубое описание реальных событий, происходящих в процессе самоорганизации белков. Например, не ясно почему формирование элементов вторичной структуры, инициирующих сворачивание белка существенно "опережает" формирование гидрофобного ядра и глобуляризацию полипептидной цепи. В отличие от карбоангидразы процесс глобуляризации фосфоглицераткиназы, происходящий на ранних стадиях сворачивания белка (см.рис. 14 и 15) охватывает не всю полипептидную цепь, а только ее часть. Остальная часть полипептидной цепи фосфоглицераткиназы глобуляризуется одновременно с приобретением белком жесткой третичной структуры (см. ниже). Если принять во внимание, что и вторичная стуктура этого белка только частично формируется на самой ранней стадии сворачивания (см.рис.11), то можно предположить важную роль скорости формирования вторичной структуры для процесса самоорганизации белка в целом. Однако, несмотря на все эти вопросы, приведенная выше последовательность событий, происходящих до формирования жесткой третичной структуры, является общей для всех исследованных глобулярных белков ( си. рис. 10-15 и ниже табл.1).

2. 4.5 Нормирование жесткой третичной структуры является последней основной кинетической стадией в самоорганизации глобулярного белка. Однако, и этот процесс в некоторых случаях не является высококооперативным. На рис. 16 приведена кинетика формирования жесткой третичной структуры карбоангидразы В, зарегестрированная различными методами. Обращает внимание, что утеря белком сродства к гидрофобному зонду (АНС) и восстановление площади под высокопольными сигналами в спектре 'н-ЯМР (см. рис. 5) происходит заметно быстрее (с полувременем 140 сек), чем восстановление спектров кругового дихроизма в области поглощения ароматических групп и ферментативной эстеразной активности (полувремя процесса 600 сек). Оба процесса проявляются и в кинетике восстановления спектра поглощения белка (см. ниже, рис.17). Это может означать, что процесс формирования жесткой третичной структуры карбоангидразы В начинается с плотной упаковки гидрофобного ядра и прилегающего среднего слоя, а затем плотно упаковываются поверхностные белковые группы. В пользу

-1-1_I_

О 400 ^ 1200 Б

и те

Рис. 16 (А) Уменьшение сродства АНС н белку - 1 и увеличение площади под высокопольными сигналами (от 0, 7 до - 0,6 м. д. , см. рис. 3) спектра 'н-ЯМР - 2 в процессе сворачивания бычьей карбоангидразы. (В) Восстановление спектра КД ароматических групп на 270 нм - 3 и эстеразной активности - 4. Г - нормализованная амплитуда реакции. Условия сворачивания такие же как для рис. 13.

и го

Структурная Белки, параметры

характеристика,

метод ФГК ТС лм ькд ЛГ ЧЛА

т 1/2 А Т1/2 А Т1/2 А Т1/2 А Т1/2 А Т1/2 А

1.Вторичная структура: Круговой дихроизм -2 «10 45 -2 «10 57 «Ю-2 70 «ю-2 100 «Ю-2 100 «ю-2 100

пептидных связей. 160 55 70 43 ЗхЮ-1 30

2.Гидрофобные кластеры: (гидрофобное ядро) Связывание гидрофобного -2 «10 ю"1 50 50 «ю-2 2х10-1 60 40 «ю-2 ю-2 90 10 «ю-2 4х10-2 50 50 «ю-2 2х10-1 60 40 «10~2 ЗхЮ-2 60 40

зонда - АНС

3. Глобулярность: Миграция энергии ю"1 140 40 60 - - - - 4х10~2 100 ю-1 100 - -

Иммобилизация спиновых меток Интенсивность малоуглового ю-1 70 _ _ — — Зх10~2 5х10~2 100 100 _ — — -

рентгеновского рассеяния 160 30

Таблица 1. Кинетические параметры [полувремя - Т1^2 (сек) и амплитуда - А (%)] процессов формирования структурных характеристик при самоорганизации глобулярных белков.

4. Жесткость третичной

структуры:

Уменьшение сродства 110 100 80 100 10 100 140 100 200 100 0.15 100

к гидрофобному зонду АНС

Восстановление высокопольной - - - - - - 140 100 - - - -

части спектра 1Н-ЯМР

Восстановление спектров 120 100 - - - - 140 50 - - - -

поглощения ароматических 600 50

групп

Восстановление интенсивности 120 100 80 100 - - 350 100 - - 0.15 100

флуоресценции триптофановых

остатков

Круговой дихроизм аромати- 140 100 100 100 500 100 500 100 200 100 0.15 100

ческих групп •

Ферментативная активность 120 100 - - 500 100 600 100 - - — —

ФГК - фосфоглицераткиназа из дрожжей (м. в. 45 КОа), 0.01М Тг13-НС1, рН 8, 4М мочевины -> 2М, 23 С ТС - (3-субъединица триптофансинтазы из Е.Со11 (м. в. 35 КБа), 0.01М К-фосфатный буфер, рН 7.2, 6М мочевины 1М, 12°С

ЛМ - (З-лактамаза из З.аигепэ (м. в. 30 КОа), 0.01М К-фосфатный буфер, рН 7.2, 5М мочевины -> 0.8М,

БКА - бычья карбоангидраза (м. в. 29 КОа), 0.01М Тг1з-НС1, рН 8.0, 8.5М мочевины -> 4М, 23 С

ЛГ - |9-лактоглобулин коровы (м. в. 18 КОа), 0.01М глициновый буфер, рН 3.6, 6М мочевины -» 1М, 4.5 С

-3

ЧЛА - человеческий ос-лактальбумин (и. в. 14 КОа), 0.01М Тг1з-НС1, 10 М ЭДТА, рН 8.0, 8.5М ночевины 1. 4М, 23°С

Time, sec

Рис. 17 Восстановление поглощения на 280 нм при сворачивании бычьей карбоангидразы в зависимости от времени инкубации (задержки) белка в полностью развернутом состоянии ( 6М Gu-HCI, 12 °С ) : 1-20 сек, 2 - 100 сек, 3 - 600 сек. Белок из нативного состояния (0,01М Tris-HCI, рН 8,0, 23°С) быстро переводился в полностью развернутое состояние ( 6М Gu-HCI, 12°С ), а затем через 20, 100 и 600 сек быстро переводился в нативные условия (0,5М Gu-HCI, рН 8,0, 23°С). Кинетика восстановления поглощения имеет две фазы с полувременами (t^) 140 сек и 600 сек. Уменьшение нерегистрируемого (быстрого) восстановления поглощения (отрезка на оси ординат) при увеличении времени инкубации в развернутом состоянии означает уменьшение доли быстросворачиваю-щихся молекул белка.

этого заключения свидетельствует то, что большинство триптофановых остатков белка (всего 8 Трп), которые, в основном, ответственны за круговой дихроизм в ближней ультрафиолетовой области, находятся в поверхностном слое (согласно рентгеноструктурнык данный). Обращает также внимание чрезвычайно медленное (по сравнению с ранними стадиями сворачивания) формирование жесткой третичной структуры белка. Это связано с наличием одного из внутримолекулярных механизмов, способных ограничивать скорость приобретения белком жесткой третичной структуры - цис-транс изомеризации пролиновых остатков (см. ниже). Аналогичная последовательность событий при формировании жесткой третичной структуры замечена и при самоорганизации /3-лактамазы. Однако, в большинстве случаев процесс формирования жесткой третичной структуры глобулярного белка достаточно кооператмвен и все методы, чувствительные к этому процессу (уменьшение сродства к гидрофобному зонду, круговой дихроизм в области поглощения ароматических групп, интенсивность флуоресценции триптофановых остатков и ферментативная активность), показывают очень схожие кинетические характеристики (см. Табл. 1).

2. 4. 6 Стадии и скорость сворачивания глобулярных белков.

Таблица 1 демонстрирует характеристики различных кинетических стадий в самоорганизации 6-ти наиболее подробно исследованных глобулярных белков. Видно, что самоорганизация всех глобулярных белков проходит через одну и ту же последовательность основных событий, имеющих свои характерные времена. Первым событием является сверхбыстрое (неизмеримое) формирование значительного количества элементов вторичной структуры и, следовательно, гидрофобных кластеров (частичное связывание гидрофобного зонда АНС).

Вторым событием является коллапсирование сформированных ранее гидрофобных кластеров и, следовательно, элементов вторичной структуры с формированием нежесткого гидрофобного ядра глобуляризация всей или части полипептидной цепи (формирование промежуточного конформационного состояния типа "расплавленная глобула").

Третьим событием является формирование жесткой третичной структуры белка. Этот процесс для некоторых белков может быть

разделен во времени на жесткую упаковку гидрофобного ядра и жесткую упаковку поверхности белковой молекулы (см. данные для карбоангидразы и /3- лактамазы).

2. 4. 7 $акторы, лимитирующие скорость сворачивания белков.

Данные приведенные в таблице 1 указывают еще на одну интересную деталь. Скорости приобретения белками жесткой третичной структуры значительно различаются. Так процесс формирования жесткой третичной структуры всей молекулы в целом в случае а-лактальбумина характеризуется полувременем 7x10"2 сек, фосфоглицераткиназы -140 сек, а карбоангидразы В - 600 сек. Что же может ограничивать скорость (или вероятность) приобретения белком жесткой пространственной структуры в процессе его самоорганизации? Первым внутримолекулярным фактором является известная цис-транс изомеризация "существенных" пролиновых остатков. Ярким примером ограничения скорости сворачивания по этому механизму является карбоангидраза В. Правильные (нативные) изомеры "существенных" для сворачивания белка пролиновых остатков фиксированы жесткой третичной структурой. Однако, если белок перевести в клубкообразное состояние (убрав тем самым стерические ограничения на изомеризацию пролиновых остатков) существенные пролиновые остатки начнут медленно (с полувременем - 20 сек при 23°С) изменять свои нативные изомеры. Если белковую цепь сразу ( не инкубируя) перевести в нативные условия, то белок свернется в нативную конформацию быстро (с присущей ему скоростью). Чем дольше белковая молекула будет находиться в денатурирующих условиях, тем меньшая фракция белка будет сворачиваться быстро. Эту особенность пролин-лимитирующего фактора демонстрирует рис. 17. Надо отметить, что далеко не все глобулярные белки, имеющие в своей первичной структуре пролиновые остатки, при своем сворачивании чувствительны к пролиновой изомеризации. Примером могут служить а-лактальбумин человека и апомиоглобины кашалота и лошади, которые приобретают свою жесткую структуру в субсекундном временном интервале. Тем не менее, цис-транс изомеризация пролиновых остатков может сильно усложнять кинетику самоорганизации глобулярного белка, приводя к множественности кинетических процессов, характеризующихся различными амплитудами и временами (скоростями). На рис.18 приведен результат расчетов амплитуд и времен кинетических процессов при

А (%')

100 80 60 40 20

(з) 500

400

300 200

100

0 5 10 15 20

ЫишЬег о£ евзеп^а! trans-isoшers

Рис. 18 Влияние одновременного перехода в транс-изомер "существенных" для сворачивания белка пролиновых остатков на амплитуду (А) и полувремя пролин-контролируемых процессов

сворачивания. Расчет произведен для 2х значений населенности транс-изомеров (90% и 80%) и для двух значений констант скорости

цис-транс изомеризации К^О, 035 сек 1 ( - ) и К2=0,07 сек

( - - - ) пролиновых остатков в развернутой белковой цепочке.

\

пролин-контролируемых реакциях сворачивания глобулярных белков. Видно, что, в зависимости от того сколько пролиновых остатков являются "существенными" для сворачивания белка в определенную конформацию, времена к амплитуды соответствующих кинетических процессов могут значительно различаться. Так в случае бычьей карбоангидразы оба медленных кинетических процесса (с полувременами 140 и 600 сек), приводящие к формированию жесткого гидрофобного ядра и жесткой третичной структуры белка в целом, являются пролин-зависиными (рис.16 и 17). То же самое относится и к медленным кинетическим процессам в самоорганизации /3 - субъединицы триптофансинтазы (табл. 1). Вместе с тем, быстрые ( в субсекундном временном интервале) кинетические процессы формирования элементов вторичной структуры и их коллапсирование с формированием гидрофобного ядра (глобуляризация), по-видимому, не могут быть осложнены цис-транс изомеризацией пролиновых остатков, скорость которой на порядки ниже скорости этих кинетических процессов. Таким образом, ранние кинетические промежуточные состояния на пути сворачивания белков имеют, по-видимому, такие же беспорядочные изомеры пролиновых остатков как и клубкообразное состояние, т. е. в отсутствие жесткой третичной структуры пролиновые остатки не могут быть зафиксированы в определенном изомере. Действительно, рис. 19 демонстрирует практически одинаковую скорость изомеризации пролиновых остатков бычьей карбоангидразы в клубкообразной конформации (8М мочевины) и в состоянии "расплавленной глобулы" (кислая форма при рН 3,3), моделирующем раннее глобулярное кинетическое промежуточное состояние без жесткой третичной структуры.

Второй не известный ранее внутримолекулярный фактор, способный существенно замедлять приобретение белком жесткой третичной структуры, демонстрирует фосфоглицераткиназа из дрожжей. Жесткая пространственная структура этого белка формируется с характерным временем (140+40) сек (см. табл.1). Данные, представленные на рис. 20, показывают, что скорость сворачивания этого белка не зависит от времени инкубации белка в клубкообразном состоянии, т. е. его самоорганизация не контролируется цис-транс изомеризацией пролиновых остатков. Вместе с тем, половина вторичной структуры белка не стабилизируется на ранних стадиях сворачивания, а формируется на последней стадии одновременно с

100 200 0е1ау -Ь:1те, э

Рис. 19 Уменьшение фракции быстросворачивающихся молекул белка

(Г) в реакции сворачивания бычьей карбоангидразы в зависимости от

времени инкубации белка в состоянии "расплавленной глобулы" (рН

3,3) ( О ) ив полностью развернутом состоянии (6М Си-НС1) при рН

8,0 ( О ) и при рН 3,3 ( Э ). Во врезке реакция представлена в

полулогарифмичесом масштабе, отражающем моноэкспоненциальный

- 2 - 1

процесс с константой скорости 2,8(±0,3)х10 сек , совпадающей с константой скорости свободной цис-транс изомеризации пролиновых остатков. Температура - 23 °С.

200

150

100

т native enzyme activity

0.3

0.2

100 200 Time, s

300

QJ

a.

0.1

Рис. 20 Кинетика сворачивания дрожжевой фосфоглицераткиназы (регистрируемая по восстановлению ферментативной активности и интенсивности триптофановой флуоресценции при 20°С) в зависимости от времени инкубации белка в полностью развернутом состоянии ( 5М Gu-HCI, 4°С ) : х -30 сек, О - 180 сек, • - 660 сек, □ - 960 сек и А - 2700 сек.

жесткой структурой (рис. 11, 14, 15 и табл.1), т.е. нуждается для своей стабилизации в специфических короткодействующих внутримолекулярных взаимодействиях- (например, ван-дер-ваальсовых). Этот процесс лимитирует и окончательную глобуляризацию белковой молекулы, что отражает медленная фаза в восстановлении миграции энергии и интенсивности малоуглового рассеяния рентгеновских лучей, практически совпадающая по времени с медленным формированием полной вторичной структуры (см. рис. 11, 14, табл. 1). Таким образом, отсутствие на ранних этапах сворачивания белка значительной части стабильной вторичной структуры может быть фактором, лимитирующим скорость приобретения белком жесткой пространственной структуры. Это ещё раз подтверждает роль вторичной структуры как главного инициатора дальнейшего сворачивания белка.

Третий фактор носит межмолекулярный характер. Формирующееся на ранних стадиях самоорганизации белка промежуточное конформа-ционное состояние типа "расплавленной глобулы" характеризуется повышенной гидрофобностью и при определенных условиях (например, при повышенных концентрациях) может легко образовывать различные ассоциативные формы от растворимых до осадка. Неспецифическая ассоциация белка на ранних стадиях его сворачивания ножет существенно замедлять и часто просто блокировать дальнейшее приобретение белком нативной структуры.

2.5 Влияние молекулярного шаперона вго-ЕЬ на кинетику сворачивания глобулярных белков.

Неспецифическая ассоциация промежуточных конформационных состояний является основной причиной необратимости ренатурации (спонтанного сворачивания) многих зрелых глобулярных белков. В этой связи, интересна роль таких клеточных факторов как молекулярные шапероны. Со времени их открытия этим белкам часто приписывалось "чудодейственное" свойство узнавать "неправильно" свернутые конформационные состояния внутриклеточных белков (из которых они сами не могут "выйти") и исправлять "ошибки" сворачивания , приводя тем самым белок в нативное состояние. Это противоречило основному физическому принципу самоорганизации белков, что вся необходимая и достаточная информация о пространственной структуре белка заложена в его аминокислотной последовательности. В настоящей работе проведено исследование

влияния одного из представителей класса молекулярных шаперонов -олигомерного белка GroEL из Е. Coli на кинетику самоорганизации ряда глобулярных белков. Было обнаружено, что GroEL не только не ускоряет, но существенно замедляет приобретение белком жесткой третичной структуры. На рис.21 приведены кинетики приобретения жесткой третичной структуры фосфоглицераткиназой и а-лактальбумином при отсутствии и в присутствии GroEL. В качестве параметра, характеризующего формирование жесткой третичной структуры, использовалось восстановление нативной интенсивности флуоресценции триптофановых остатков белков (см. табл. 1). Видно, что в присутствии GroEL формирование жесткой третичной структуры белков значительно замедляется. Причем, это замедление тем больше, чем больше молярный избыток GroEL над сворачивающимся белком (Рис.21А). Это свидетельствует о том, что GroEL эффективно взаимодействует с кинетическими промежуточными состояниями белков, формирующимися на ранних стадиях их самоорганизации. При добавлении избытка Мд**-АТФ, который как известно значительно ослабляет комплекс GroEL с ненативными конформациями белков, замедление формирования жесткой третичной структуры снималось в случае фосфоглицераткиназы (как и в случае других медленно сворачивающихся белков - БКА и ТС, см. табл. 1) и сохранялось в случае а-лактальбумина. Приведенные экспериментальные данные наводят на несколько интересных заключений. Во-первых, по-видимому, белок сворачивается не на поверхности GroEL (как многие считают в настоящее время), а в свободном (вне комплекса с GroEL) состоянии. В пользу этого свидетельствует зависимость скорости сворачивания белка от молярного избытка GroEL (рис. 21А). Во-вТорых, Mg**-АТФ только уменьшает время пребывания ненативного белка в комплексе с GroEL, но не разрушает полностью комплекса. В пользу этого свидетельствует отсутствие влияния Мд**-АТФ на замедление кинетики сворачивания а-лактальбумина в присутствии GroEL (рис. 21В). Как известно, GroEL является слабой АТФ-азой с каталитической константой скорости расщепления АТФ около 1 сек"'. Если предположить, что в присутствии АТФ время пребывания несвернувшегося в жесткую структуру белка в комплексе с GroEL контролируется актом АТФ-азной реакции, т. е. составляет примерно 1 сек, то становится понятным, почему в случае фосфоглицераткиназы АТФ снимает замедление сворачивания в

10 20 30

ТХМЕ (5)

Рис. 21 Кинетика сворачивания 10 6М дрожжевой фосфоглицераткиназы (А) и человеческого а-лактальбумина (В) в отсутсвие - О и в присутствии сго-ЕЬ: 1 - ю"6м вго-ЕЬ, 2 - 2х10~6М йго-ЕЬ, 5 -5х10~6М Сго-ЕЬ. В случае ФГК (А) добавление 10~3 К Нд - АТФ (показано стрелкой) существенно ускоряет кинетику сворачивания белка в присутствии 5-кратного молярного избытка вго-ЕЬ. В случае ЧЛА (В) присутствие в растворе 10"3М Мд-АТФ не изменяло кинетики сворачивания белка при 2-кратном молярном избытке Сго-ЕЬ. Врезка представляет быструю реакцию сворачивания ЧЛА в отсутствие вго-ЕЬ.

присутствии GroEL, а в случае ос-лактальбумина этого не происходит. Из данных, приведенных в таблице 1 видно, что характерное время спонтанного формирования жесткой структуры в случае фосфоглицераткиназы составляет 140 сек, а в случае а- лактальбумина - 0, 15 сек. Таким образом, если белки в присутствии избытка Мд++-АТФ находятся в комплексе с GroEL только 1 сек, то это практически не будет сказываться на скорости сворачивания фосфоглицераткиназы (т.к. 120 сек » 1 сек), в то время как скорость сворачивания а-лактальбумина будет

значительно замедлена (т.к. 0.15 сек « 1 сек) до секундного временного интервала, что и наблюдается в действительности (рис.21). Таким образом, GroEL даже в присутствии Мд**-АТФ вряд ли непосредственно "участвует" в сворачивании белков. Какую же функцию он выполняет все-таки способствуя процессу созревания белков в клетке? Одно свойство GroEL (как впрочем и других молекулярных шаперонов) не подлежит сомнению - он эффективно взаимодействует с промежуточными конформационными состояниями на пути сворачивания белков (которые могут накапливаться в клетке как в результате биосинтеза, так и при различных стрессах, например, при тепловом шоке), удерживая тем самым их около себя даже в присутствии Мд+*-АТФ и не давая им эффективно неспецифически ассоциировать при экстремально больших концентрациях в клетке. В пользу этого механизма можно привести следующий экспериментальный результат. Кислая форма карбоангидразы В, реализующаяся при рН 3.3-3.6 (см. рис. 1,4-6), по своим физико-химическим свойствам очень похожа на кинетическое промежуточное конформационное состояние типа "расплавленной глобулы", формирующееся на ранней стадии сворачивания белка (см. табл.1). При резком изменении рН от 3,6 до нейтральных (рН7-8) карбоангидраза В эффективно ассоциирует вплоть до выпадения в осадок даже при невысоких концентрациях 0.01 мг/мл). Процесс неспецифической межмолекулярной ассоциации белка легко регистрируется по изменению светорассеяния (рис.22А). После этого белок может свернуться в нативное состояние только после разворачивания мочевиной и обратной ренатурации при нейтральных рН, поскольку ассоциация белка в состоянии "расплавленной глобулы" полностью блокирует возможность дальнейшего приобретения белком жесткой третичной структуры. Если же изменение рН

/

о ю 20 т1

Х/ОШМЕ

Рис. 22 рН-скачок (рН 3,6 —> рН 7,5) для бычьей карбоангидразы (ВСАВ) в отсутствие и в присутствии Сго-ЕЬ и Мд-АТФ: А изменение светорассеяния на 293 нм в отсутствие Сго-ЕЬ (1) и в

„з

присутствии 2-кратного молярного избытка Сго-ЕЬ и 10 М Мд-АТФ (2); В - профили РРЬС после рН-скачка в присутствии 2-кратного

- 3

молярного избытка Сго-ЕЬ без Мд-АТФ - 1 и в присутствии 10 М Мд-АТФ - 2 и 3 через 300 сек (1 и 2) и через 5000 сек (3)

инкубации белка с Сго-ЕЬ. ( - ) - регистрация поглощения на

230нм, (О) - регистрация эстеразной активности ВСАВ.

производить в присутствии 2-кратного молярного избытка СгоЕЬ и избытка Мд**-АТФ ассоциации не наблюдается (см. рис. 22А), поскольку ОтоБЬ взаимодействует с промежуточным состоянием белка, удерживая его около себя даже в присутствии Мд*+-АТФ и не давая ему ассоциировать. Если следить за выходом мономерного нативного белка с помощью колоночной хроматографии и ферментативной активности (рис. 22В), то видно, что сворачивание белка в жесткую структуру происходит примерно с той же скоростью, что и при спонтанном сворачивании из развернутого состояния при нейтральных рН ( см. табл. 1).

Таким образом, роль (или участие) СгоЕЬ в сворачивании белков заключается не в том, что он "знает" как правильно свернуть тот или иной белок, а в устранении факторов, блокирующих спонтанное сворачивание белка в нативную конформацию (в частности, неспецифической ассоциации ненативных промежуточных

конформационных состояний белков).

3. ВЫВОДЫ

1. На основе известных явлений - миграции энергии между флуоресцирующими группами, уменьшения внутримолекулярной подвижности спиновых меток при их иммобилизации в глобулярной структуре белков и увеличении интенсивности флуоресценции гидрофобного зонда (АНС) при связывании его с доступными гидрофобными областями белковой молекулы - разработаны новые методические подходы к исследованию процессов глобуляризации и формирования гидрофобного ядра белковых молекул при их самоорганизации.

2. Экспериментально установлено, что интегральная интенсивность рассеяния рентгеновских лучей в области небольших углов для глобулярной полипептидной цепи значительно выше, чек для неглобулярной. Это позволило впервые использовать глобальный метод малоуглового рентгеновского рассеяния для изучения глобуляризации белковых цепей в процессе их самоорганизации.,

3. Исследован процесс равновесного разворачивания ряда глобулярных белков с использованием мультипараметрического подхода. Установлено, что, при определенных условиях (например,

при повышенных температурах), на пути равновесной самоорганизации глобулярных белков могут накапливаться два основных промежуточных термодинамически стабильных конформационных состояния: а) неглобулярное со значительным содержанием элементов вторичной структуры и б) глобулярное с выраженной вторичной структурой, но без жесткой упаковки большинства белковых групп.

4. С использованием мультипараметрического подхода исследован кинетический процесс самоорганизации глобулярных белков. На примере самоорганизации шести мононерных глобулярных белков показано, что последовательность основных событий, приводящих развернутую белковую цепь к нативной пространственной структуре, включает в себя: а) сверхбыстрое (в субмиллисекундном временном интервале) формирование элементов вторичной структуры, имеющих на своей поверхности протяженные гидрофобные кластеры; б) коллапсирование сформированных элементов вторичной структуры с образованием неплотно упакованного гидрофобного ядра (глобуляризация белковой цепи); в) формирование жесткой третичной структуры белка, которое в некоторых случаях может осуществляться в два этапа: сначала плотно упаковывается гидрофобное ядро белка и его ближайшее окружение, а затем плотно упаковываются поверхностные белковые группы.

5. Установлен неизвестный ранее внутримолекулярный фактор, способный лимитировать скорость приобретения белком жесткой третичной структуры - отсутствие на ранних этапах сворачивания части стабильной вторичной структуры белка.

6. Получены экспериментальные данные, указывающие на то, что основным механизмом влияния молекулярных шаперонов (в частности, GroEL) на сворачивание глобулярных белков является предотвращение неспецифической межмолекулярной ассоциации ранних промежуточных конформационных состояний, у которых отсутствует жесткая упаковка третичной структуры, но сформированы гидрофобные поверхности.

СПИСОК ОСНОВНЫХ ПУбЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

1. D.A.Dolgikh, R.I.Gilmanshin, Е.V.Braznikov, V.E.Bychkova, G.V. Semisotnov, S.Yu.Venyaminov, O.B.Ptitsyn "a-lactalbvmin: Compact state with fluctuating tertiary structure." FEBS Lett., vol. 36,

2, pp. 311-315 (1981)

2. Р. И. Гильманшин, В.Е.Бычкова, С. Ю. Веньяминов, Г. В. Секисотнов, Е. И. Тиктопуло, О. Б. Птицын "Человеческий ос-лакталъбумин: различные компактные формы без уникальной постранственной структуры". Тезисы докладов I Всесоюзного биофизического съезда , Москва, 1982, т. I, с. 19

3. Г. В. Семисотнов, Р. И. Гильманшин, Н.А.Родионова, С. Ю. Веньяминов, О. Б. Птицын, "Кинетика сворачивания дрожжевой фосфоглицерат-киназы", I Всесоюзный Биофизический Съезд. Тезисы докладов. Москва, 1982, с. 19-20

4. Семисотнов Г.В., Лукьянова И.Д., Кутышенко В.П., "Динамика карбоангидразы В в состоянии "расплавленной глобулы", V Всесоюзная конференция по спектроскопии биополимеров. Тезисы докладов. Харьков 1984, с. 203

5. Семисотнов Г.В., Кутышенко В.П., "Исследование процесса разворачивания карбоангидразы В методами 'н-ЯМР, спектроскопии, КД, и флуоресценции Тгр остатков", V Всесоюзная конференция по спектроскопии биополимеров. Тезисы докладов. Харьков 1984, с.204

6. Родионова H.A., Семисотнов Г. В., "Перенос энергии между люминисцирующими группами и компактность белковых макромолекул", V Всесоюзная конференция по спектроскопии биополимеров. Тезисы докладов. Харьков 1984, с. 189-190

7. D.A. Dolgikh, L.V. Abaturov, I.A. Bolotina, E.V. Brazhnikov, V.E. Bychkova, V.N. Bushuev, Yu.O. Lebedev, G.V. Semisotriov, E.I. Tiktopulo, O.B. Ptitsyn, "Compact state of a protein molecule with pronounced small-seall mobility: bovine a-lactalbumin.", European Biophysics Journal, vol.13, 2, 10Э-121, (1985)

8. Г. В. Секисотнов, P. И. Гильманшин, Д.А.Долгих, А. П. Колонией, В. П. Кутышенко, н. А. Родионова, "Стадийность разворачивания и сворачивания карбоангидразы В", VI Всесоюзный симпозиум по конформационным изменениям биополимеров в растворах, Тбилиси, 1985, материалы симпозиума, с. 11

9. Родионова H.A., Семисотнов Г. В. , "Перенос энергии между люминисцирующими группами и компактность белковых макромолекул", Тезисы докладов конференции молодых ученых (БФ АН СССР), Уфа, 1985, с. 101

10. Г. В. Семисотнов, H.A. Родионова, Б. Эберт, "Кинетика компак-тизации карбоангидразы В". Сипозиум СЭВ и СФРЮ Физико-химические свойства биополимеров в растворах и клетках, тезисы докладов,

Пущино, 1985, с. 59-60

11. Р. И. Гильманшин, О.Б.Птицын, Г. В. Семисотнов, "Равновесное и кинетическое исследование денатурации и ренатурацми сх-лакталь-бунина коровы", препринт, Пущино 1986, с. 1-20

12. Semisotnov, G.V., Rodionova, N.A., Kutyshenko, V.P, Ebert,B., Blank, J., Ptitsyn, O.B. "Sequential mechanism of refolding of carbonic anhydrase B." FEBS Letters, 224, 9-13 (1987)

13. P. И. Гильманшин, О.Б.Птицын, Г. В. Семисотнов "Кинетика ренату-рации а-лактальбумина коровы". Биофизика, 1988, 33, N2, с. 204-207

14. Н. А. Родионова, Г. В. Семисотнов, В. П. Кутыщенко, В. Н. Уверений, И. А. Болотина, В. Е. Бычкова, О. Б. Птицын "Стадийность разворачивания карбоангидразы В сильными денатурантами". Мол. биология, 1989, 23, N3, с. 683-692

15. Г. В. Семисотнов, В. П. Кутышенко, О.Б.Птицын "Внутримолекулярная подвижность белков в состоянии расплавленной глобулы. Исследование карбоангидразы В методом 1Н-ЯМР". Мол. биология, 1989, 23, N3, с. 808-813

16. О.В. Ptitsyn,, R.H. Pain, G.V. Semisotnov, E. Zerovnik, O.I. Razgulyaev "Evidence for a "molten globule " state as a general intermediate in protein folding." FEBS Lett., 262, 20-24 (1990).

17. M.E. Goldberg, G.V. Semisotnov, B. Friguet, K. Kuwajima, O.B. Ptitsyn, S. Sugai "An early immunoreactive folding intermediate of the tryptophane synthase 2-subunit is a "molten globule." FEBS Lett., 263, N1, 51-56 (1990)

18. G.V. Semisotnov, V.N. Uversky, I.V. Sokolovsky, A.M. Gutin, O.I. Razgulyaev, N.A. Rodionova, "Two slow stages in refolding of bovine carbonic anhydrase В are due to proline isomerization." J.Molecular Biology, 213, 561-568 (1990)

19. M. Vas, M. Sinev, N.V. Kotova, G.V. Semisotnov, "Reactivation of 3-phosphoglycerate kinase from its unfolded proteolytic fragments." Eur. J. Biochemistry, 189, 575-579 (1990)

20. B. Ebert, G.V. Semisotnov and N.A. Rodionova "Studies on globular protein refolding kinetics by ESR stopped flow spectroscopy". Stadia biophysica, V.137, N1-2, p.125-132 (1990)

21. O.B. Ptitsyn, G.V. Semisotnov, "The mechanism of Protein Folding." In "Conformations and Forces in Protein Folding", Nail, B.T. and Dill, K. A. Editors, AAAS Publisher, Washington, D.e. 20005, 155-168 (1991)

22. G.V. Semisotnov "The study of protein refolding intermediates as a clue to the investigation of protein folding during biosynthesis". Abstract of international conference protein biosynthesis. Pushchino, 1991, p.40

23. G.V. Semisotnov, N.A. Rodionova, O.I. Razgulyaev, V.N. Uversky, A.F. Gripas' and R.I. Gilmanshin "Study of the "molten globule" intermediate state in protein folding by a hydrophobic fluorescent probe" Biopolymers, Vol. 31, 119-128 (1991)

24. Сенисотнов Г. В. "Спектральные характеристики промежуточных состояний глобулярных белков". VII конференция по спектроскопии биополимеров. Тезисы докладов. Харьков 1991, с. 216

25. G.V. Semisotnov, М. Vas, V.V. Chemeris, N.J. Kashparova, N.V. Kotova, O.I. Razgulyaev, M.A. Sinev "Refolding kinetics of pig muscle and yeast 3-phosphoglycerate kinases and of their proteolytic fragments" Eur.J.Biochem, 202,1083-1089 (1991)

26. V.N. Uversky, G.V. Semisotnov, R.H. Pain and O.B. Ptitsyn "All-or-non" mechanism of the "molten globule" unfolding." FEBS Lett., V.314, 89-92 (1992)

27. Semisotnov, G.V., Kotova, N.V., Kuwajima, K., Chiba, K., Nikaido, K., Kimura, K., Amemiya, Y., Wakabayasi, K. and Kihara, H. "Application of Synchrotron X-ray Scattering to the study of Protein Folding: Process of Protein Globularization". Abstract of the 4th International conference on Biophysics and synchrotron radiation. Tsukuba, Japan (1992).

28. K. Kuwajima, G.V. Semisotnov, A.V. Finkelstein, S. Sugai, O.B. Ptitsyn "Secondary structure of globular proteins at the early and the final stages in protein folding". FEBS Lett., V.334, N3, p.265-268 (1993)

29. Уверский B.H. , Семисотнов Г. В. , Птицын О. Б, "Разворачивание расплавленной глобулы сильными денатурантами протекает по принципу "все-или-ничего". Биофизика, т. 38, вып. 1, с. 37-46 ( 1993)

30. Yu.B. Alakhov, L.P. Motuz, A.N. Plotnikov, K.V. Korotkov, N.V. Kotova and G.V. Semisotnov "Formation of a three-dimensional structure in the EF-2 N-terminal fragments with the growth of their polypeptide chain". Abstract of 9th symposium on chemistry of peptides and proteins. Russia-Germany, Pushchino (1994), p.3