Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Определение последовательности разрушения элементов структуры зеленого флуоресцентного белка при его тепловой денатурации

ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Определение последовательности разрушения элементов структуры зеленого флуоресцентного белка при его тепловой денатурации"

005059557

на правах рукописи

ПОВАРНИЦЫНА ТАТЬЯНА ВЛАДИМИРОВНА

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ РАЗРУШЕНИЯ ЭЛЕМЕНТОВ СТРУКТУРЫ ЗЕЛЕНОГО ФЛУОРЕСЦЕНТНОГО БЕЛКА ПРИ ЕГО ТЕПЛОВОЙ ДЕНАТУРАЦИИ

03.01.03 - молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

ПУЩИНО-2013

005059557

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте белка Российской академии наук.

Научный руководитель:

кандидат физико-математических наук

Мельник Богдан Степанович

Официальные оппоненты:

Никонов Станислав Владимирович - доктор биологических наук, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт белка РАН, заведующий группой структурных исследований рибосомных белков.

Пермяков Сергей Евгеньевич - кандидат физико-математических наук. Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биологического приборостроения РАН, руководитель группы исследования белков лаборатории новых методов в биологии.

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН.

Защита диссертации состоится 16.05. 2013 г. в 15 час. 30 мин. на заседании Диссертационного совета Д 002.038.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте биофизики клетки Российской академии наук по адресу: 142290, г. Пущино, ул. Институтская, д. 3.

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной библиотеке Путинского НЦБИ РАН по адресу: 142290, г. Пущино, ул. Институтская, д. 3.

Автореферат разослан г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы. В последнее десятилетие одним из наиболее приоритетных направлений в биологии и медицине стало развитие методов прижизненной визуализации процессов, происходящих в клетке и организме, с помощью флуоресцентных красителей. Исключительное место среди флуоресцентных маркеров занимает зеленый флуоресцентный белок, а также его варианты и гомологи. Зеленый флуоресцентный белок (GFP) медузы Aequorea victoria был впервые описан более 40 лет назад, но широкую известность получил только в 90-е годы после того, как удалось клонировать ген GFP и показать, что этот белок становится флуоресцентным при его синтезе практически в любом организме.

Сегодня GFP широко используется для флуоресцентного мечения белков, органелл и клеток в различных видах прокариот и эукариот. Но, несмотря на широкое применение GFP в клеточной биологии, работ по изучению физико-химических свойств этого белка мало, к тому же литературные данные имеют противоречивый характер. Например, существует распространенное мнение, что этот белок разворачивается только при высоких температурах. При этом, известно, что не получается использовать GFP как маркер в термофильных организмах. Такого рода противоречия возникают из-за недостатка исследований стабильности, скоростей сворачивания и последовательности формирования различных промежуточных состояний этого белка. В данной работе мы исследовали стабильность и скорости разрушения белка GFP-cycle3 (мутантная форма GFP с тремя заменами аминокислотных остатков), а также использовали совершенно новый подход, с помошью которого сумели выяснить последовательность разрушения элементов вторичной структуры GFP-cycle3.

Такого рода исследования важны не только для определения физико-химических свойств зеленого флуоресцентного белка. Выяснение механизмов формирования/разрушения промежуточных состояний многостадийно сворачивающихся белков - одна из важнейших задач биофизики. Решение этой задачи становится в последнее время все более актуальным, поскольку все более сложные белки и их комплексы используются в медицине и биоинженерии. Многие свойства этих сложных белковых систем, таких как способность образовывать амилоидные фибриллы, связывать лиганды и участвовать в их транспортировке определяются как раз свойствами их промежуточных состояний. Однако исследования многостадийно сворачивающихся белков затруднены, поскольку сложно подобрать методы и подходы, позволяющие исследовать нестабильные промежуточные состояния. В особенности, сложно понять последовательность разрушения элементов вторичной структуры при разворачивании белка. Метод, примененный в этой работе,

достаточно универсальный и позволяет экспериментально проанализировать, на какой стадии разворачивания белка происходит разрушение разных элементов его структуры.

Цель и задачи исследования. Основной целью исследования является определение последовательности разрушения элементов структуры GFP-cycle3 при его тепловой денатурации.

В задачи исследования входило:

1. выбор оптимального метода и условий исследования GFP-cycle3;

2. определение стабильности и температурных зависимостей констант скоростей денатурации GFP-cycle3;

3. изучение влияния одиночных замен аминокислотных остатков и введения ss-связен в разных элементах вторичной структуры GFP-cycle3 на константы скоростей его разворачивания.

Научная новизна работы. Подобраны и оптимизированы методы исследования физико-химических свойств GFP-cycle3. Впервые, на примере GFP-cycle3, разработан метод, позволяющий определить последовательность разрушения элементов структуры белка, используя два вида мутаций: одиночные замены гидрофобных аминокислотных остатков и введение цистеиновых мостиков.

Практическая значимость работы. Исследования физико-химических свойств GFP-cycle3 позволят более рационально использовать этот белок в прикладных задачах. Разработанный и использованный в этой работе подход позволит глубже понять процессы разрушения белков с нескольким! промежуточными состояниями, что в свою очередь, может быть использовано в конструировании белков de novo с заранее заданными свойствами, для разработки лекарственных средств.

Апробация работы. Материалы работы были представлены на российских конференциях: 15-ая Международная Путинская конференция молодых ученых (Пущино, Московская область, 2011), XXI зимняя молодежная научная школа "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии" (Москва, 2009), Ежегодная Институтская конференция ИБ РАН (Пущино, 2009, 2010, 2012), IV Съезд Биофизиков России (Нижний Новгород, 2012).

Публикации. Основные результаты диссертации опубликованы в 11 печатных работах, в том числе 6 статьях.

Структура диссертации. Диссертация состоит из "Введения", четырех глав, посвященных описанию и обсуждению экспериментальных данных, "Заключения", "Выводов" и "Списка литературы". Работа содержит 25 рисунков и 4 таблицы.

Результаты и обсуждение

По литературным данным принято считать, что флуоресценция хромофора GFP строго связана с нативностью структуры этого белка. Такое убеждение связано с тем, что при исследовании этого белка in vivo было показано, что формирование хромофора происходит после принятия белком нативной информации (Heim et al., 1994). Также считается, что этот белок очень стабильный к воздействию температур и денатурантов. Однако, величина середины денатурационного перехода GFP, измеренная по флуоресценции его хромофора, сильно колеблется по данным различных авторов (Andrews et al., 2007; Enoki et al., 2006 и др.). Поскольку существует неоднозначность в оценках стабильности и скорости денатурации GFP, мы предположили, что эти расхождения могут быть связаны с тем, что основная часть исследований выполнена с использованием флуоресценции хромофора. Возможно, при денатурации флуоресценция хромофора GFP не в полной мере отражает изменения в его структуре. Иными словами, мы задались вопросом, в какой мере флуоресценцию хромофора GFP можно отождествлять с его структурой.

В этой работе мы исследовали белок GFP-cycIe3, который чаще всего используется в качестве белкового маркера и отличается от белка GFP из медузы Aequorea victoria тремя одиночными заменами аминокислотных остатков (F99S-M153T-VI63A; Crameri et al., 1996).

Эксперименты по ограниченному протеолизу GFP-cycIe3. Для того чтобы понять, насколько флуоресценция хромофора GFP-cycle3 связана со структурой белка, мы провели эксперименты по ограниченному протеолизу GFP-cycle3 в условиях, когда белок дестабилизирован щелочными значениями рН. На рисунке 1 представлен результат SDS-электрофореза. На электрофореграмме: в первом слоте - белок до обработки протеиназой К, во втором - после инкубации с ферментом в течение 30 минут, в третьем - после 3 часов инкубации. Видно, что с ростом инкубационного времени размер и интенсивность окраски полосы, соответствующей полноразмерному белку GFP-cycle3, снижается, т.е. структура GFP-cycle3 все больше подвергается разрушению. При этом спектры флуоресценции образцов GFP-cycle3 без добавления протеиназы и в её присутствии практически совпадают (рисунок 2). То есть, в условиях, когда структура GFP-cycle3 дестабилизирована и достаточно подвижна, чтобы проходил протеолиз, спектральные свойства его хромофора практически не меняются. Таким образом, можно сделать вывод о том, что флуоресценция хромофора GFP-cycle3 не всегда дает нам достоверную информацию о структуре самого белка. Этот вывод подтверждается дальнейшим исследованием равновесного разворачивания GFP-cycle3.

Рисунок 1. БОЗ-злектрофореірамма СЬР-сусІеЗ до и после протеолиза. Белок в 20 мМ Тгіз-НСЬ, рН=9. 20"С. 15% ПААГ.

Рисунок 2. Спектры флуоресценции хромофора СРР-сусІеЗ до и после протеолиза. Белок в 20 мМ Тш-НСЬ, рН=9. 20°С.

Равновесное разворачивание СГР-сус1еЗ в различных концентрациях мочевины.

На рисунке 3 приведен график зависимости молярной эллиптичности раствора С1"Р-сус1еЗ от длины волны при различных концентрациях мочевины. Для достижения равновесия белок инкубировался в соответствующих концентрациях мочевины в течение 4 дней. Видно, что спектр ОИР-сусЬЗ в водном буфере имеет вид, характерный для |3-структурных белков. При повышении концентрации денатуранта вплоть до 3.1 М, характер спектров практически не меняется, т.е. белок имеет нативную структуру. В 3.6 М мочевины график КД изменяется в основном в коротковолновой части спектра, что может свидетельствовать о разрушении нативной структуры и присутствии доли денатурированного белка. Начиная с 4.5 М мочевины, спектры КД имеют форму, характерную для денатурированного белка. При этом спектры флуоресценции хромофора ОРР-сус1еЗ в 0 М и 4.5 М мочевине практически совпадают (рисунок 4). Это ещё раз подтверждает тот факт, что флуоресценцию хромофора нельзя однозначно связывать со структурой белка.

По спектрам кругового дихроизма растворов ОРР-сус1еЗ в различных концентрациях мочевины, мы построили график денатурациоиного перехода (рисунок 5). Видно, что

Рисунок 3. Спектры кругового дихроизма в дальней ультрафиолетовой области СРР-сус1еЗ (рН=6.2, 20°С) при нескольких концентрациях мочевины (указаны на рисунке).

Дпииа волны, ни

Рисупок 4. Спектры флуоресценции хромофора ОНР-сус1еЗ в 0 М и 4.5 М мочевине, рН=6.2. 20ПС. Длина волны возбуждения 395 нм

разворачивание GFP-cycle3 представляет собой S-образный переход с высокой степенью кооперативное™. Середина перехода соответствует 3.6 М мочевины. Для подтверждения того, что полученные спектры КД действительно отражают изменение конформации GFP-cycle3, мы провели электрофорез исследуемых образцов GFP-cycle3 в градиенте мочевины. На рисунке 5 показана электрофореграмма в градиенте мочевины от 0 до 6 молей мочевины. В каждый слот нанесен образец GFP-cycle3 в буфере с соответствующей концентрацией мочевины. Образцы предварительно инкубировались в течение четырех суток для того, чтобы добиться равновесных условий проведения эксперимента. Видно, что при концентрациях мочевины, меньших 3 М в геле присутствуют три пятна с подвижностью, характерной для нативного белка GFP-cycle3. Однако их интенсивности заметно снижаются при концентрациях мочевины выше 2.7 М. При этом, в верхней части геля появляется полоса с подвижностью, характерной для денатурированного белка (начиная с 4 М мочевины). Таким образом, по данным электрофореза можно с уверенностью заключить, что до 2.7 М мочевины GFP-cycle3 находится в нативном состоянии, а, начиная с 4.5 М мочевины, - в развернутом. Данные, полученные методами электрофореза в градиенте мочевины и КД, хорошо согласуются друг с другом, что видно на рисунке 5, где график равновесного перехода, полученный методом КД, наложен на электрофореграмму. Три четко различимые пятна белка на электрофореграмме при низких концентрациях мочевины можно объяснить наличием изоформ GFP-cycle3 (Chiang et.al., 2001). По литературным данным известно, что на С-конце зеленого флуоресцентного белка расположена последовательность His-Gly-Met-Asp-Gl u-Tyr-Lys. В отличие от самого белка, который очень устойчив к протеолизу, этот «хвост» довольно чувствителен к действию карбоксипептидазы и неспецифических протеаз, что приводит к появлению изоформ при частичном протеолизе. Кроме того, в аминокислотной последовательности GFP-cycle3 присутствуют два остатка цистеина, которые при выделении белка могут модифицироваться и нести разные заряды. Что в свою очередь влияет на подвижность в геле.

ъ Рисунок 5, Элекгрофоретичеснпй анализ в градиенте

о.;™ мочевины от 0 до 6 М с наложенным на него

^ графиком денатурациинного перехода, построенным

ё по изменению молярной эллиптичности в

оо | зависимости от концентрации мочевины (рН=6.2,

0 0

0.0

I.B 2.7 3.6 4.5 5.4 6.3 Концентрация мочевины, М

Флуоресценция хромофора СЕР-сус1еЗ. В результате вышеописанных экспериментов следует, что интерпритация данных по флуоресценции хромофора неоднозначна, ее нельзя использовать для структурных исследований белка. Такой вывод очень «не приятный», поскольку флуоресценция - это удобный и чувствительный метод. Однако, если действительно основная «проблема» в хромофоре, то за структурой белка можно попытаться проследить по переносу энергии между ароматическими аминокислотными остатками и хромофором. При изучении разворачивания белков довольно часто используется метод, при котором исследуется перенос энергии между белком и различными красителями. Такой подход можно использовать и при изучении ОРР-сус!еЗ, но в роли красителя при этом выступает его собственный хромофор. Т.е. при возбуждении СРР-сус1еЗ на длине волны 395 им энергия поглощается непосредственно хромофором, и спектры флуоресценции дают информацию только о хромофоре. Выше описано, что такие спектры не информативны для исследования структуры ОРР-сус1еЗ. Однако если использовать длину волны возбуждения 280 нм, то энергия излучения поглощается ароматическими аминокислотными остатками, затем передается на хромофор и после излучается хромофором. В этом случае спектры флуоресценции должны нести информацию о структуре белка. Мы проверили такое предположение. На рисунке 6А показаны спектры флуоресценции растворов СРР-сус1еЗ с различными концентрациями мочевины, полученные при возбуждении на 395 нм. Видно, что эти спектры практически совпадают. На рисунке 6Б, показаны спектры тех же растворов белка, но измеренные при возбуждении на длине волны 280 нм. Видно, что интенсивность спектров зависит от концентрации мочевины. Таким образом, флуоресценция с возбуждением на 280 нм вполне может быть использована как инструмент для исследования ОРР-сус1еЗ.

Рисунок 6. Спектры флуоресценции растворов СРР-сус1еЗ в 50 мМ фосфатном буфере, рН=7, 20°С. с различными концентрациями мочевины (указаны на рисунке). (А) Возбуждение на 395 нм. (Б) Возбуждение на 280 нм.

ем

длина волны, нм

длина Волны.

Из описанных выше исследований можно сделать следующие выводы. 1) При денатурации флуоресценция хромофора GFP-cycle3 слабо зависит от изменений в структуре белка, поэтому не подходит для исследования разворачивания GFP-cycle3. 2) При возбуждении флуоресценции GFP-cycle3 в области 280 им спектры флуоресценции хромафора можно использовать как инструмент для исследования структуры GFP-cycle3. Такой поход позволяет следить не за хромофором, а за переносом энергии между ароматическими аминокислотами и хромофором этого белка. 3) При рН 6.2, 20"С середина денатурационного перехода GFP-cycle3 соответствует 3.6 М мочевины, то есть стабильность этого белка вполне сравнима со стабильностью других глобулярных белков.

Калориметрическое плавление GFP-cycle3. Исследования, описанные в предыдущей главе, безусловно, позволили выяснить насколько стабилен GFP-cycle3. Однако методы, которыми мы это определили, не совсем подходят для дальнейших исследований GFP-cycle3 и его мутантных форм. Например, электрофорез в градиенте мочевины - замечательный метод чтобы оценить стабильность белка, однако его низкая точность (сложно контролировать концентрацию мочевины в геле) не позволяет проводить сравнительный анализ белка дикого типа и его мутантных форм. Использовать метод кругового дихроизма так же оказалось весьма затруднительным, поскольку спектры КД этого белка в дальней ультрафиолетовой области имеют низкую интенсивность (см. рисунок 3), что влияет на точность измерений. Поскольку, мы предполагаем в дальнейшем исследовать мутантные формы GFP-cycle3 (которые могут быть дестабилизированными, что приведет к еще большему уменьшению интенсивности спектров), то этот метод, к сожалению, неудобен. Можно использовать метод флуоресценции, используя перенос энергии при возбуждении на 280 нм (как описано выше). Однако и этот метод не может быть использован без дополнительных проверок, поскольку при переносе энергии между ароматическими аминокислотными остатками и хромофором невозможно отличить процессы, которые происходят со структурой белка, от процессов, происходящих с хромофором.

Все эти экспериментальные противоречия помог решить метод дифференциальной сканирующей микрокалориметрии. На рисунке 7 приведены кривые плавления GFP-cycle3 при рН 7.2, полученные при разных скоростях сканирования. Видно, что положение и форма пика теплопоглощения заметно меняется в зависимости от скорости прогрева. Это, безусловно, свидетельствует о неравновесных условиях проведения эксперимента в диапазоне выбранных нами скоростей прогрева. Из рисунка также видно, что на кривых повторного прогрева нет пиков теплопоглощения. Это означает, что процесс денатурации при заданных условиях или в принципе необратим, или скорости прогрева слишком

высоки, для того чтобы можно было считать данный процесс равновесным. Из таких кривых неравновесного плавления белка нельзя получить значения термодинамических функций тепловой денатурации, но зато можно рассчитать константы скоростей теплового разворачивания, и что не маловажно точно определить последовательность разных стадий плавления белка. Для того чтобы из таких неравновесных пиков плавления получить информацию о скоростях тепловой денатурации белка, необходимо определить, какой математической моделью можно описать плавление СРР-сус1еЗ.

1.0 1

П /Л |Ц

1 ///

Рисунок 7. Кривые плавления зеленого флуоресцентного белка в 20 мМ фосфатном буфере. рН=7.2, при разных скоростях прогрева. На рисунке представлены кривые первого и второго прогрева, скорости сканирования указаны на рисунке в К/мин.

Для анализа полученных зависимостей избыточной теплоемкости СРР-сус1еЗ от температуры, мы использовали модели, описывающие необратимую денатурацию. Схемы рассмотренных моделей следующие: Одностадийная необратимая денатурация

N—1—>0 (1)

Модель Ламри-Эйринга с быстро устанавливающимся равновесием на первой стадии денатурации

(2)

<-

Двухстадийная необратимая денатурация

N—-—>1 >В (3)

N,1,0- нативное, промежуточное и денатурированное состояния белка, соответственно; к,-константы скоростей разворачивания белка; К - константа равновесия.

На рисунке 8А символами показаны экспериментально полученные зависимости избыточной теплоемкости от температуры, а линиями их фитинг с использованием модели одностадийной необратимой денатурации (1). Параметры аппроксимации представлены в таблице 1. Для увеличения точности расчетов для трех кривых плавления была проведена совместная аппроксимация. Поскольку каждая из трех кривых отражает переход между двумя одними и теми же состояниями, следовательно, кривые должны описываться уравнениями с одинаковыми энергиями активации (£а) и температурными параметрами (7"*).

Форма кривой плавления для одностадийной необратимой модели денатурации (1) описывается уравнением:

г

1

^ '« АН I,) Ср =-ехр(/с)-ехр

-— \к dT

vi

где к= ехр[-Еа /Д (1/Г -1 /Г*)].

(4)

Из рисунка 8А видно, что рассчитанные кривые плохо описывают экспериментальные данные. Особенно большие отличия наблюдаются между теоретически рассчитанной и экспериментальной кривой, полученной при скорости прогрева 0.25 К/мин. Такое расхождение свидетельствует о неправильно выбранной модели денатурации для описания плавления белка.

На рисунке 8Б показана совместная аппроксимация трех экспериментальных кривых плавления моделью Ламри-Эйринга (2) с быстро устанавливающимся равновесием на первой стадии денатурации (параметры аппроксимации представлены в таблице 2), т.е. аппроксимация с одинаковыми параметрами энергии активации £„ и температурами I'm и Т* используя следующее уравнение:

К АН,,

С" =

к АН А дц 1 к К

. -.,,--h-1Ч + ДЯ,--ехр

(ЛГ + lKv RT1) 'vK + l

где К = ехр[-ДЯ.О/Г-!/^)/«];

1|Н

' v\ /Г + 1

dT.

(5)

к = ехр [- АЕ, (\/Т - 1/7"*)/ ¡{\-

Как и в случае предыдущей модели, рассчитанные кривые плохо описывают экспериментальные данные. Особенно большие отличия наблюдаются между теоретически рассчитанной и экспериментальной кривой, полученной при скорости прогрева 0.25 К/мин (рисунок 8Б). Такое расхождение свидетельствует о неправильно выбранной модели.

Следующая рассмотренная нами модель, это модель последовательной двухстадийной необратимой денатурации (3). На рисунке 8В показана совместная аппроксимация (т.е. с одинаковыми параметрами Еа\,Т*\, Еа2, Т*2,) трех экспериментальных кривых плавления следующим уравнением:

С,, = ДЯЛ

ехр

-- (к,ОТ vi

АНЛ, н--—— ехр

\kzdT х[ i:, ехр - ]"(£, -kt)dT

V т г V ...

dT, (6)

где ¿1 = ехр[-£а1 /К (1/Г-1/Т1*)] и ¿2=ехр[-£а2/Л(1/Г-1/Г1*)]).

Видно (рисунок 8В), что теоретически рассчитанные кривые отлично описывают три экспериментальные кривые плавления. Таким образом, используя модель двухстадийной необратимой денатурации можно описать экспериментальные данные и, соответственно, рассчитать значения энергий активации £„ь £„2 и температурных параметров Т:*. Т2*. Поскольку константа скорости к связана с энергией активации £„ уравнением

к = ехр[-Еа /Л (1 /Г -1/7*)] то, таким образом, зная энергии активации и температурные параметры, мы можем построить зависимость логарифма констант скоростей к} и от обратной температуры Т. Наклон таких зависимостей определяется энергиями активации, а сдвиг - температурными параметрами. На рисунке 9 линиями показаны эти зависимости (значения энергий активации и параметров Т* представлены в таблице 3).

а

345 350 355 Э60 34 & 345 3&5 365 360 ЗЛО 345 350 355 360

т. К т, к т. к

Рисунок 8. Зависимости избыточной молярной теплоемкости от температуры для СРР-сус1сЗ, измеренные при трех скоростях сканирования (1.0, 0.5, 0.25 К/мин). Символами показаны экспериментальные данные, линиями - рассчитапшле с использованием (А) одностадийной модели (1), (Б) модели Ламри-Эйринга с быстроустапавливающимся равновесием на первой стадии денатурашт (2) и (В) двухстадийной необратимой модели денатурации (3). Энергии активации и температурные параметры, полученные при аппроксимации, показаны в таблицах 1, 2 и 3. Максимальное отклонение кривой аппроксимации от экспериментальной кривой при фитинге двухстадийпой моделью -1 кДж/моль.

Таблица 1. Параметры аппроксимации кривых плавления уравнением (4) для одностадийной необратимой денатурации (1)._

Скорость сканирования. /Г/мин ДН. кДж/моль Еа. кДж/моль Т*,К

0.25 557+7 432± 4 364.2+0.2

0.5 641

1 655

Таблица 2. Параметры аппроксимации кривых плавления уравнением (5) модели Ламри-Эйринга с быстро

Скорость сканирования. К!мин ДН„. кДж/моль ДНн кДж/моль Тщ, К Еа. кДж/моль Т*,А:

0.25 102+5 522+6 352.9± 0.2 344± 2 365.1± 0.1

0.5 167 492

1 321 297

Таблица 3. Параметры аппроксимации кривых плавления уравнением (6) для двухстадийной необратимой денатурации (3).___ ._

Скорость сканирования, ЛГ/мин ДН„ кДж/моль ДН,, кДж/моль Еа,, кДж/моль Еа,, кДж/моль Т,*, К Т2*. К

0.25 201 + 5 440+6 315+4 438+ 2 366.4+ 0.2 363.8+0.1

0.5 136 513

1 124 502

Рисунок 9. Зависимости логарифма констант скоростей разворачивания СРР-сусЧеЗ от обратной температуры при рН=7.2. Константы скоростей, получешше методом флуоресценции, показаны символами. Константы скоростей, полученные из калориметрических экспериментов (из аппроксимации кривых плавления, рисунок 8В, таблица 3), показаны линиями.

1ГТ, к

Прямой кинетический эксперимент по разворачиванию СГР-сус1еЗ температурой. Чтобы убедиться, что константы скоростей, полученные из пиков плавления, действительно относятся к фазам разворачивания ОРР-суЫеЗ, мы провели прямой кинетический эксперимент (рисунок 10). Кинетики разворачивания СРР-сус1еЗ при разной температуре были измерены методом флуоресценции (возбуждение 280 нм, испускание 510 нм). Кривые зависимости интенсивности флуоресценции от времени аппроксимировались суммой экспонент:

/=А*ехр(-ад + В*ехр (-&) + С*ехр(-Ы) -Ш, (7)

где I - интенсивность флуоресценции; / - время; А, В, С, И, к\, кг - параметры аппроксимации.

Это позволило рассчитать три константы скорости разворачивания СРР-сус1еЗ в диапазоне температур от 73 до 80°С. На рисунке 9 символами показаны логарифмы констант скоростей разворачивания при разных температурах, рассчитанных из прямых кинетических экспериментов.

Рисунок 10. Кинетические кривые разворачивания зеленого флуоресцентного белка (СКР-сусіеЗ) при разных температурах (конечная температура растворов показана па рисунке) в 20 мМ фосфатном буфере, рН=7.2.

Сравнение констант скоростей, рассчитанных нз калориметрических данных и из прямого кинетического эксперимента. На рисунке 9 показаны логарифмы констант скоростей разворачивания СРР-сусІеЗ, полученные методом флуоресценции (символы) и методом калориметрии (линии). Видно великолепное согласие между данными, полученными из калориметрии и данными, полученными из прямых кинетических экспериментов. Прямые линии (сплошная и пунктирная), параметры которых рассчитаны из кривых плавления, великолепно ложатся на символы (квадратики и треугольники), построенные по результатам кинетических

экспериментов методом флуоресценции. На рисунке 9 также видно, что из кинетических кривых, измеренных методом флуоресценции, кроме констант скоростей двух медленных фаз разворачивания, мы получили константы скоростей быстрой фазы разворачивания СРР-сус1еЗ (кружочки на рисунке 10), которые не могут быть рассчитаны из калориметрических кривых. Вполне вероятно, что быстрая фаза разворачивания отражает процесс, который проходит без выделения или поглощения тепла, поэтому такой процесс «не виден» методом калориметрии.

Таким образом, мы выбрали достаточно удобный «инструмент» для дальнейших исследований СРР-сус1еЗ - это метод дифференциальной сканирующей калориметрии.

Теоретический анализ кристаллической структуры зеленого флуоресцентного белка и выбор аминокислотных замен. Единственный, на сегодняшний день, способ изучить влияние разных участков полипептидной цепи белка на его стабильность, скорость и последовательность сворачивания - это мутационный анализ. Поэтому мы решили исследовать влияние двух видов мутаций (замена гидрофобного аминокислотного очтатка и введение вБ-связи) на элементы вторичной структуры СРР-сус1еЗ (теоретические объяснения см. в следующей главе). Мы выбрали в СРР-сус1еЗ отдельные структурные элементы, которые вероятнее всего формируются на разных стациях сворачивания этого белка. Также, рассчитали количество контактов каждого аминокислотного остатка в структуре СРР-сус1еЗ. Затем, в каждом структурном элементе выбрали гидрофобный аминокислотный остатол с большим количеством контактов, а рядом с ней пару сближенных аминокислот (на поверхности белка), которые при замене на цистеины могут образовать 55-мостик. Такие мутации позволят нам проанализировать последовательность разворачивания разных структурных элементов СРР-сус1еЗ. На рисунке 11 показана трехмерная модель СРР-сус1еЗ, и отдельные структурные элементы, в которых были сделаны замены аминокислотных остатков. Также на рисунке 11Ё показана диаграмма количества остаток-остаточных контактов каждой аминокислоты. На рисунке 11Ё показано положение замененных аминокислот. Выбранные для замен гидрофобные остатки погружены внутрь СРР-сус1еЗ (рисунок 11 А) и имеют большое количество остаток-остаточных контактов (рисунок НЕ). На участках белковой цепи 160-190 а.к. и 200-230 а.к. для замены на аланин выбраны остатки 1161 и Ь201, аминокислоты с самым большим количеством контактов среди гидрофобных аминокислот на этих участках. На участке 90-115 а.к. для замены выбрана аминокислота VI12. На участке белковой цепи 10-40 а.к. был выбран 114, поскольку эта аминокислота расположена ближе к концам Р-шпильки (рисунок 11Е). Для замены на цистеины выбирались пары аминокислотных остатков, удовлетворяющие трем критериям. Во-первых, взаимное положение и ориентация этих остатков должны быть такими, чтобы при замене их

на цистеины могла завязаться 8.ч-связь. Во-вторых, они должны быть расположены как можно ближе к аминокислотам, которые будут выбраны для замены на аланин. В-третьих, «.ч-связь должна «скреплять» концы р-шпильки. Все вышесказанное достаточно наглядно видно на рисунке 11.

А Б В Г Д Е

Номер а.к. остатка

Рисунок 11, Вид с торца (А) и с боку (Б) на объемную модель 01:Р-6очонка. Отдельно показаны четыре структурных элемента: р-шпилька (В) и три р-листа (Г, Д, Е). Шариками показаны аминокислотные остатки, которые были заменены на аланин (114, VI12, 1161, 1.201) и пары аминокислотных остатков, которые были замены на цистеины (VII и 036, У93 и 0111, К162 и 0184, Б202 и Т225), На графике (Ё) показано количество остаток-остаточных контактов каждого аминокислотного остатка (расстояние контакта 6А). Темными столбцами выделены гидрофобные аминокислоты. Цветные линии внизу графика Ё показывают положение р-стрендов структурных элементов В, Г, Д, Е. Цветными кружочками на графике Ё отмечены столбцы, относящиеся к аминокислотам, замененным на аланин. цветными кружочками, соединенными линией, (внизу графика) отмечены пары аминокислот, замененные на цистеины.

Влияние замены гидрофобных аминокислотных остатков с большим количеством контактов и введения вв-мостиков, на энергетический ландшафт многостадийно сворачивающихся белков. Попытаемся понять, как замены гидрофобных аминокислотных остатков с большим количеством контактов и йй-мостики повлияют на энергетический ландшафт белка, разворачивание которого происходит в несколько стадий. На рисунке 12 схематично изображена последовательность состояний при разворачивании белка с двумя промежуточными состояниями. Предположим, что мы заменили гидрофобную аминокислоту в структурном элементе, который разворачивается первым (рисунок 12 схема А). Очевидно, что такая замена повлияет только на первый этап разворачивания и никак не

повлияет на остальные, поскольку уже после первой стадии разворачивания эта аминокислота находится в «разрушенной», не структурированной части белка. На энергетической схеме, (рисунок 12А) видно, что такая мутация должна повлиять только на скорость разворачивания нативного состояния (к\). Напротив, если замененный остаток стабилизирует структурный элемент, который разворачивается последним (сворачивается первым), то такая мутация должна повлиять на все стабильные состояния белка, как это показано на рисунке І2Б. Поскольку каждое следующее (при сворачивании) состояние белка включает в себя предыдущее. Такая замена приведет к изменению всех скоростей разворачивания (рисунок 12Б). На рисунке 12 также показано как подействует на белок введение ss-связи. в случаях, когда она «скрепляет» структурный элемент, сворачивающийся последним (рисунок 12В) или первым (рисунок 12Г). Видно, что введение ss-связи должно повлиять на разные этапы разворачивания белка противоположным образом, по сравнению с одиночными мутациями. То есть, если мы «скрепили» ss-связью структуру, которая разворачивается последней (сворачивается первой), то мы повлияем только на один этап разворачивания (рисунок 12Г). А вот если мы «закрепили» структурный элемент, который разворачивается первым (сворачивается последним), то очевидно, что такая мутация изменит весь путь сворачивания/разворачивания (рисунок 12В), поскольку, «заставит» нестабильный структурный элемент сохранять компактную конформацию на всех этапах разворачивания.

Т.е. одиночная замена гидрофобных аминокислотных остатков и введение ss-связи действуют на путь сворачивания белка противоположным образом.

Рисунок 12. Схематичное изображение последовательности состояний при разворачивании белка. N. 1Ь I . D. - нативное. промежуточные, и денатурированное состояния, соответственно. Замененные аминокислотные остатки (мутации) изображены черными кружочками (подробные объяснения в тексте).

Исследования мутантных форм GFP-cycIe3.

Поскольку методом калориметрии нам удалось рассчитать константы скоростей разворачивания белка «дикого» типа GFP-cycle3. мы применили аналогичный подход для исследования мутантных форм этого белка.

Были получены кривые плавления всех мутантных форм GFP-cycle3 (I14A, V112A. 1161 А, L201A, VI1C-D36C, Q111C-V93C . K162C-Q184C, S202C-T225C) при трех скоростях прогрева (1.0. 0.5. 0.25 К/мин), что позволило рассчитать константы скоростей

n — i, —i- i, -=- d n -ь- i, 12 — d

в 0„Ю Ф

n -L і, J2- і, — о » І h - Ь « D

разворачивания медленных фаз.

На рисунке 13 показаны кривые плавления мутантных белков с одиночными заменами аминокислотных остатков, введенной дисульфидной связью и с модифицированными ЭИ-группами. Видно, что мутантные белки, также как и белок дикого типа, плавятся неравновесно, то есть форма, и положение кривой плавления зависит от скорости прогрева в калориметре. Проведя совместную аппроксимацию кривых плавления (как показано выше при исследовании плавления белка дикого типа) каждого мутантного белка, были рассчитаны зависимости констант скоростей разворачивания от температуры (формулы и метод см. кинетические исследования вИР дикого типа).

Рисунок 13. Зависимости избыточной молярной теплоемкости от

температуры для GFP-cycle3 и его мутантных форм: с одиночными заменами аминокислотных остатков (слева), с двойными (по центру) и с модифицированной ss-связью (справа),

измеренные при трех скоростях сканирования (1.0, 0.5. 0.25 К/мин) в 20 мМ фосфатном буфере рН=7.2. Символами

показаны

экспериментальные данные, линиями - рассчитащше с использованием двухстадийной модели денатурации.

На рисунке 14 представлены зависимости констант скоростей разворачивания от температуры. Из рисунка видна интересная особенность. Одиночные замены аминокислотных остатков не повлияли на наклон зависимостей логарифма констант скоростей от обратной температуры, а лишь - на их сдвиг, а введение дисульфидной связи влияет на наклон этой зависимости. Предварительная интерпретация этого факта весьма интересна и заключается в том, что одиночные замены аминокислотных остатков влияют в основном на энтропийную составляющую энергетического барьера, а введенные дисульфидные связи, в основном, - на энтальпийную составляющую. Поскольку из

уравнения ґ[ М = АН ^ - Д5, очевидно, что изменение энтропии повлияет на сдвиг

«ветки разворачивания», а изменение энтальпии - на её наклон.

Рпсупок 14.

Зависимость логарифма медленных констант скоростей разворачивания СРР-сус!еЗ от обратной температуры для белка дикого типа (серым цветом) и его мутантных форм (черным цветом) при рН=7.2. На всех графиках «ветки разворачивания» белка дикого типа показаны серым цветом.

Аналогичные зависимости констант скоростей разворачивания от обратной температуры были построены для модифицированных форм белка с двойными заменами (рисунок 14, нижний ряд), т.е. это белки, в структуре которых ss-связь разорвана и цистеины модифицировны присоединением йодацетомида. На рисунке 14 видно, что зависимости констант скоростей разворачивания от температуры для белков с разорванной дисульфидной связью ведут себя также как для белков с одиночными заменами гидрофобных аминокислот, т.е. влияют только на параллельный сдвиг «ветки разворачивания».

Анализ влияния мутаций на GFP-cycle3. Тот факт, что замена II4А повлияла на две первые стадии разворачивания GFP-cycle3 намного слабее других мутаций (исходя из величин сдвига зависимости констант скоростей от температуры, см. рисунок 14), свидетельствует о том. что участок белка, где сделана эта мутация, разворачивается гораздо позже остальных. Влияние мутации I14A можно сравнить с влиянием гипотетической мутации описанной на схеме рисунка 12Б. То есть, мутация II 4А повлияла слабо, но на все стадии разворачивания. Влияние мутаций V112A, 1161А и L201A на белок, можно описать схемой на рисунке 12А, с той лишь разницей, что эти мутации подействовали на первые две стадии разворачивания, а не только на самую первую стадию как на рисунке 12А. Таким образом, вывод, из анализа влияния одиночных мутаций на GFP-cycle3, следующий: при разворачивании GFP-cycle3 участок белковой цепи в области аминокислотного остатка

114 разворачивается позже, чем в области аминокислотных остатков V112, 1161 и L201.

Далее обратим внимание на графики, построенные для мугантных белков, в которых цистеины модифицированы нодацетамидом (рисунок 14), то есть, ss-связи «не завязаны». Видно, что для таких белков линии на графиках (1п(£) от 1/7) либо совпадают с линиями для белка дикого типа, либо отличаются небольшим сдвигом. То есть, модифицированные цистеины не повлияли на наклон зависимостей констант скоростей разворачивания от температуры. В то же время на рисунке 14 видно, что окисленные ss-связи («завязанные») повлияли на наклон зависимостей (1п(£) от 1/7). Проанализируем исключительно изменение наклона, поскольку, как видно из сопоставления графиков для мутантов с «завязанными» и «развязанными» ss-связями (рисунок 14) именно наклон зависимостей (ln(k) от 1/7) связан с влиянием ss-мостика на белок. Видно, что все мутации повлияли на наклон зависимости ln(A'i) от обратной температуры, и только мутация V93C-Q111C повлияла как на наклон зависимости 1п(Ач), так и на 1п(Л'2). Вспомним теоретические рассуждения (см. рисунок 12В, Г) о том, что чем раньше разворачивается структурный элемент, в котором введена ss-связь, тем на большее количество состояний подействует такая мутация. Следовательно, можно сделать вывод, что раньше всего разворачивается «желтая» бета-шпилька (см. рисунок 11) скрепленная ss-связыо .между V93 и Q111. Поскольку именно эта мутация повлияла на обе константы скорости ki и ki, а три других мутации повлияли только на ki. Таким образом, даже поверхностный анализ экспериментальных результатов позволяет нам, в первом приближении, предположить порядок разворачивания структурных элементов GFP-сусІеЗ. На рисунке 11 разные структурные элементы GFP-сусІеЗ выделены четырьмя цветами. Запишем, согласно этим цветам и номерам бета-стрендов, порядок разворачивания структурных элементов GFP-сусІеЗ:

Нативный белок (желтый (4-6)) (зеленый, голубой (7-10)) (красный (1-3)).

Следует вспомнить, что сдвиг зависимости ln(k) от обратной температуры при неизменном наклоне (одинаковое значение энергии активации для GFP-сусІеЗ и его мутанта) означает, что мутация подействовала только на энтропийную составляющую энергетического барьера, а влияние на наклон (1п(&) от 1/7) - это влияние на энтальпийную составляющую энергетического барьера. Таким образом, из рисунка 14 можно сделать удивительный вывод - все ss-связи повлияли на энтальпийную составляющую первого (при разворачивании) энергетического барьера. Получается, что любая ss-связь, независимо от ее положения на поверхности GFP-сусІеЗ влияет на некий процесс, который происходит первым при разворачивании. Другими словами, первым, при разворачивании, происходит какое-то изменение в структуре GFP-сусІеЗ, которое затрагивает весь белок. Вряд ли это

изменение упаковки гидрофобного ядра. Ведь замены гидрофобных аминокислот по-разному повлияли на первый этап разворачивания (рисунок 14, верхний ряд). Скорее всего, это процесс окончательной упаковки (при сворачивании) и взаимной ориентации аминокислот на поверхности белка. Только такой процесс может происходить самым последним при сворачивании и первым при разворачивании по всей поверхности белка. Почему при этом происходят изменения именно энтальпийной составляющей энергетического барьера? Можно предположить, что 5!>-связи «замораживают» вокруг себя взаимодействия аминокислот, как если бы часть аминокислот перестала участвовать в процессе разворачивания, поэтому и происходят изменения энтальпийной составляющей свободной энергии переходных состояний. При этом яэ-связь «скрепляет» участок белка и «заставляет» окружающие её аминокислоты быстрее или медленнее (в зависимости от удачной или неудачной конструкции 55-связи) «реагировать» на увеличивающуюся подвижность белка при разворачивании, следовательно, самая первая стадия при разворачивании СРР-сус1еЗ действительно может быть связана с нарушением взаимной упаковки аминокислот на поверхности белка. Учитывая сделанные выше выводы о влиянии одиночных замен аминокислот и бз-мостиков можно составить последовательность разрушения структурных элементов при разворачивании СРР-сус1еЗ. На рисунке 15 показана последовательность разворачивания СРР-сус1еЗ.

Рисунок 15. Последовательность разворачивания ОРР-сусІеЗ. Оттенками серого показаны различные структурные элементы белка, символами - различные состояния на пути разворачивания (М-нативное, І,, 12 -промежуточные и О - денатурированное). На второй стадии разворачивания (к,) разворачиваются бета-стренды 4-6, а затем бета-стренды 7-10. Бета стренды 1-3 остаются структурированными и в денатурированном состоянии

Следует добавить, что наличие первой стадии, на которой не происходит разворачивания полипептндной цепи ОРР-сус1еЗ, а происходит нарушение упаковки аминокислот или элементов вторичной структуры, подтверждается исследованиями ЯМР (Меіпік И а1., 2011). Было показано, что из-за присутствия молекул воды внутри ОРР-бочонка на ранней стадии плавления этого белка происходит «разлом» его структуры, и эта «сломанная структура» отличается от развернутой полипептидной цепи, то есть не появляется подвижных участков белка с увеличенной степенью взаимодействия с водой. Конечно, не совсем понятно в какую конформацию при этом переходит С1гР-сус1еЗ.

N

I

і

О

Экспериментальные факты говорят только о том, что изменения затрагивают весь белок (Melnik et al., 2011), но при этом нет развернутых участков. Некоторые этапы разворачивания структурных элементов GFP-cycle3, показанные на рисунке 15 подтверждаются также литературными данными. В нескольких работах (Enoki et al., 2004; Huang et ah, 2008), методами КД и водородно-дейтериевым обменом показано, что р-стрэнды 1-3 (красные на рисунке 15) либо разворачиваются самыми последними, либо остаются структурированными даже в развернутом состоянии. Также есть данные (Enoki et ah, 2004; Enoki et ah, 2006), которые подтверждают, что промежуточное состояние GFP-cycle3 (Ь на рисунке 15) достаточно компактное, содержит большое количество вторичной структуры и очень подвижно. Авторы полагают, что это состояние обладает свойствами состояния расплавленной глобулы, что также согласуется с результатами этой работы.

Выводы

1. При денатурации GFP-cycle3 in vitro нельзя на прямую связывать флуоресценцию

хромофора с изменениями в структуре белка.

2. Показано, что белок GFP-cycle3 не обладает высокой стабильностью. GFP-cycle3 полностью разворачивается в присутствии 4.5 М мочевины, что вполне сопоставимо со стабильностью многих глобулярных белков.

3. Показано, что денатурация GFP-cycle3 - это медленный процесс. Тепловая денатурация GFP-cycle3 длится до нескольких часов, а денатурация мочевиной - до 2 суток.

4. Одиночные замены гидрофобных аминокислотных остатков повлияли только на энтропийную составляющую, а введенные ss-мостики - в основном на энтальпийную составляющую энергетических барьеров при тепловом разворачивании GFP-cycle3.

5. На основе мутационного ан&чиза определена последовательность разрушения элементов

структуры GFP-cycle3. Показано, что на первой стадии денатурации GFP-cycle3 изменения в структуре затрагивают всю молекулу но, при этом не возникает развернутых участков полипептидной цепи, затем происходит разворачивание 4,5 и 6-ого бета-стрендов, затем разворачиваются 7-10 бета-стренды. Бета стренды 1-3 остаются структурированными в денатурированном состоянии.

Основные результаты диссертации опубликованы в работах:

1. Melnik В., Povarnitsyna Т., Glukhov A., Melnik Т. and Uversky V. (2012) SS-stabilizing proteins rationally: Intrinsic disorder - based design of stabilizing disulphide bridges in GFP. Journal of Biomolecular Structure & Dynamics, 29(4), 817-24.

2. Melnik T., Povarnitsyna T., Glukhov A., Melnik B. (2012) Multi-state proteins. Approach allowing experimental determination of the formation order of structure elements in the green fluorescent protein. PLoSOne, 7(ll):e48604. doi: 10.1371/joumal.pone.0048604.

3. Melnik T., Povarnitsyna T., Solonenko H., Melnik B. (2011) Studies of irreversible heat denaturation of green fluorescent protein by differential scanning microcalorimetry. Thermochimica Acta., 512, 71-75.

4. Melnik T., Povarnitsyna T., Glukhov A., Uversky V., Melnik B. (2011) Sequential melting of two hydrophobic clusters within the green fluorescent protein GFP-cycle3. Biochemistry, 50 (36), 7735-7744.

5. Melnik В., Povarnitsyna T., Melnik T. (2009) Can the fluorescence of green fluorescent protein chromophore be related directly to the nativity of protein structure? Biochem Biophys Res. Commun., 390, 1167-1170.

6. Мельник Т.Н., Солоненко Е.В., Поварницына Т.В., Мельник Б.С. (2009) Исследование тепловой денатурации зеленого флуоресцентного белка методом дифференциальной сканирующей микрокалориметрии. Вестник СПбГУ, сер.4, вып.З, стр. 136-140.

7. Поварницына Т.В., Котова Н.В., Солоненко Е.В., Мельник Б.С. Исследование стабильности зеленого флуоресцентного белка и его мугантных форм. XXI зимняя молодежная научная школа ", Москва, 9-11 февраля 2009 г., с.5.

8. Мельник Б. С., Поварницына Т. В., Солоненко Е.В., Мельник Т.Н. Мифы и реальность о GFP. Исследование стабильности и скорости формирования нативной структуры зеленого флуоресцентного белка. Ежегодная Институтская конференция ИБ РАН, Пушино, 8-9 июня 2009 г., с. 21.

9. Мельник Т. Н., Поварницына Т. В., Евдокимов С.Р., Дудина М.А., Мельник Б.С. р-анализ - хорошо, ср-анализ — плохо, или почему некоторые экспериментальные подходы не применимы при исследовании многостадийно сворачивающихся белков. Ежегодная Институтская конференция ИБ РАН, Пущино, 8-9 июня 2010 г., с. 21.

10. Поварницына Т.В., Мельник Т.Н., Глухов А.С., Мельник Б.С. Неравновесное плавление мутантных форм GFP. 15-ая Международная Пущинская конференция молодых ученых, Пущино, 18-22 апреля 2011 г., с. 42.

11. Мельник Б.С., Поварницына Т.Н., Глухов А.С., Мельник Т.Н. Как найти «слабое место» в глобулярном белке и увеличить его стабильность? IV Съезд Биофизиков России, Нижний Новгород, 20-26 августа 2012 г., симп.1 с. 201.

Подписано в печать 13.04.2013г.

Усл.п.л. - 1.0 Заказ №13511 Тираж: 75экз.

Кошшентр «Чертеж.ру» ИНН 7701723201 107023, г.Москва, ул.Б.Семеновская 11, стр.12 (495) 542-7389 www.chertez.ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Поварницына, Татьяна Владимировна, Пущино

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт белка

Российской академии наук

На правах рукописи

04201355926

Поварницына Татьяна Владимировна

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ РАЗРУШЕНИЯ ЭЛЕМЕНТОВ СТРУКТУРЫ ЗЕЛЕНОГО ФЛУОРЕСЦЕНТНОГО БЕЛКА ПРИ ЕГО ТЕПЛОВОЙ ДЕНАТУРАЦИИ

03.01.03-молекулярная биология

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: кандидат физико-математических наук Мельник Богдан Степанович

Пущино 2013 г.

Содержание.

Введение...................................................................................................................4

Глава I. Литературный обзор

1. Проблема сворачивания белка...........................................................................6

1.1. Одностадийно сворачивающиеся белки.....................................................8

1.2. Многостадийно сворачивающиеся белки.................................................10

2. Характеристика объекта исследования...........................................................13

2.1. Особенности структуры зеленого флуоресцентного белка....................13

2.2. Механизм формирования хромофора.......................................................15

2.3. Спектральные характеристики ОБР..........................................................19

2.4. Гомологи ОБР..............................................................................................21

2.5. Олигомеризация ОБР-подобных белков...................................................22

2.6. Сравнение физико-химических свойств ОБР дикого типа и ОГР-сус1е3.23

2.7. Денатурационные переходы ОБР-сусІеЗ..................................................25

3. Калориметрические исследования...................................................................31

3.1. Модель Ламри-Эйринга..............................................................................31

3.2. Модель одностадийной необратимой денатурации.................................33

3.3. Модель денатурации белка, включающая две последовательно протекающие необратимые стадии..................................................................35

3.4. Модель Ламри-Эйринга с быстро устанавливающимся равновесием на первой стадии......................................................................................................36

3.5. Критерии для одностадийной необратимой денатурации......................38

4. Мутационный анализ........................................................................................42

4.1. Исследование переходного состояния белка методом................................

ф- анализа............................................................................................................42

4.2. Влияние одиночных замен аминокислотных остатков на кинетические параметры процессов сворачивания/разворачивания различных белков. ...44

5. Дисульфидные связи.........................................................................................47

Глава II Материалы и методы..........................................................................54

Глава III. Результаты и обсуждение................................................................63

1. Исследование физико-химических свойств GFP-cycle3............................63

2. Калориметрическое плавление GFP-cycle3.................................................73

3. Прямой кинетический эксперимент по разворачиванию GFP-cycle3 температурой.......................................................................................................80

4. Сравнение констант скоростей, рассчитанных из калориметрических данных и из прямого кинетического эксперимента........................................80

5. Теоретический анализ кристаллической структуры зеленого флуоресцентного белка из A.victoria................................................................82

6. Влияние замены гидрофобных аминокислотных остатков с большим количеством контактов и введения ss-мостиков на энергетический ландшафт многостадийно сворачивающихся белков.......................................................85

7. Кинетические исследования мутантных форм GFP-cycle3.......................88

8. Анализ влияния мутаций на GFP-cycle3......................................................92

Заключение...........................................................................................................96

Выводы..................................................................................................................97

Список литературы.............................................................................................98

Введение.

В последнее десятилетие одним из наиболее приоритетных направлений в биологии и медицине стало развитие методов прижизненной визуализации процессов, происходящих в клетке и организме с помощью флуоресцентных красителей. Исключительное место среди флуоресцентных маркеров занимает зеленый флуоресцентный белок, а также его варианты и гомологи. Зеленый флуоресцентный белок (GFP) медузы Aequorea victoria был впервые описан более 40 лет назад, но широкую известность получил только в 90-е годы после того, как удалось клонировать ген GFP и показать, что этот белок становится флуоресцентным при его синтезе практически в любом организме.

Сегодня GFP широко используется для флуоресцентного мечения белков, органелл и клеток в различных видах прокариот и эукариот. Но, несмотря на широкое применение GFP в клеточной биологии, работ по изучению физико-химических свойств этого белка мало, к тому же литературные данные имеют противоречивый характер. Например, существует распространенное мнение, что этот белок разворачивается только при высоких температурах. При этом, известно, что не получается использовать GFP как маркер в термофильных организмах. Такого рода противоречия возникают из-за недостатка исследований стабильности, скоростей сворачивания и последовательности формирования различных промежуточных состояний этого белка. В данной работе мы исследовали стабильность и скорости разрушения структуры белка GFP-cycle3 (мутантная форма GFP с тремя заменами аминокислотных остатков), а также использовали совершенно новый подход, с помощью которого сумели выяснить последовательность разрушения элементов вторичной структуры GFP-cycle3.

Такого рода исследования важны не только для определения физико-химических свойств зеленого флуоресцентного белка. Выяснение механизмов формирования/разрушения промежуточных состояний многостадийно сворачивающихся белков - одна из важнейших задач биофизики. Решение этой

4

задачи становится в последнее время все более актуальным, поскольку все более сложные белки и их комплексы используются в медицине и биоинженерии. Многие свойства этих сложных белковых систем, таких как способность, образовывать амилоидные фибриллы, связывать лиганды и участвовать в их транспортировке определяются как раз свойствами их промежуточных состояний. Однако исследования многостадийно сворачивающихся белков затруднены, поскольку сложно подобрать методы и подходы, позволяющие исследовать нестабильные промежуточные состояния. В особенности, сложно понять последовательность разрушения элементов вторичной структуры при разворачивании белка. В этой работе применен подход с использованием двух видов мутаций, который позволил определить, на каких стадиях разворачивания происходит разрушение разных элементов вторичной структуры зеленого флуоресцентного белка. Этот подход применим для исследования сворачивания/разворачивания любых белков с несколькими промежуточными состояниями.

Глава I. Литературный обзор.

1. Проблема сворачивания белка.

Сворачивание белка in vivo происходит в многокомпонентном окружении, содержащем множество различных молекул и ионов. Имеется много свидетельств тому, что в клеточном процессе сворачивания белка могут участвовать разнообразные катализаторы сворачивания и шапероны. Различные факторы вовлечены в процессы контроля биосинтеза и внутриклеточной локализации белка (Ellis, 1999), но ни один из этих факторов не несет той структурной информации, которая требуется вновь синтезированной полипептидной цепи для приобретения уникальной третичной структуры. В экспериментах, следящих за образованием белковой структуры in vivo, очень трудно увидеть структурные превращения полипептида на фоне всех клеточных процессов. Для выяснения механизма спонтанной самоорганизации белка необходимо проводить эксперименты in vitro. В 1961 году Анфинсен обнаружил, что денатурированный белок бычьей рибонуклеазы А может спонтанно свернуться в свою нативную пространственную структуру без какой-либо помощи других макромолекул или клеточных органелл (Anfinsen, 1973). Это открытие впоследствии было подтверждено на множестве других белков. Более того, известно, что небольшую белковую цепь можно химически синтезировать in vitro (и притом с С-, а не с N-конца), и она, с хорошим выходом, свернется в правильную пространственную структуру (Merrifield, 1965). Таким образом, было установлено, что для построения трехмерной структуры белка не требуется дополнительной информации кроме той, что заложена в его аминокислотной последовательности. Отсюда и вытекает фундаментальный вопрос в изучении сворачивания белка - как аминокислотная последовательность кодирует структуру белка? И так называемый парадокс Левинталя, сформулированный Сайрусом Левинталем в 1968 году (Levinthal, 1968) - как последовательности белка удается свернуться в нативную структуру

за секунды, несмотря на то, что число конформаций полипептидной цепи астрономически велико?

Левинталь предположил, что самоорганизующийся белок следует по какому-то специальному «пути сворачивания», и та структура, где этот путь заканчивается, и является его нативной структурой. Иначе говоря, нативное состояние белка определяется не стабильностью, не термодинамикой, а кинетикой, то есть оно соответствует не глобальному, а просто быстро достижимому минимуму свободной энергии цепи.

Однако на сегодняшний день мы не можем предсказать трехмерную структуру белка, основываясь лишь на знании его аминокислотной последовательности. Сейчас для решения данной задачи используется два подхода. Во-первых, теоретические расчеты по минимизации свободной энергии белковой структуры. Во-вторых, экспериментальное исследование процессов сворачивания/разворачивания белков.

1.1. Одностадийно сворачивающиеся белки.

Прогресс в понимании процесса сворачивания белка был достигнут при изучении маленьких (50-100 остатков) одностадийных белков, которые, стартуя из полностью развернутого состояния, сворачиваются напрямую в нативное состояние без накопления промежуточных состояний, без цис-транс пролиновой изомеризации, без формирования S-S связей. Кинетика сворачивания в этом случае выглядит очень просто - все свойства нативного белка восстанавливаются синхронно, а сам кинетический процесс описывается одной временной экспонентой (Kragelund et al., 1995). Для некоторых белков такие простые кинетические процессы наблюдаются в широком диапазоне условий как в области перехода, т.е. в области термодинамического равновесия между нативным и денатурированным состояниями, так и вдали от нее, при «биологических условиях», т.е. в отсутствие или при малых концентрациях денатурирующего агента. Взаимное расположение энергетических уровней белка может быть рассчитано при исследовании кинетик ренатурации и денатурации в зависимости от различных концентраций денатуранта. При этом измеряется видимая константа реакции сворачивания и разворачивания &арр = в + ^в—>а (Финкелыптейн, Птицын, 2005). Она равна сумме констант скоростей прямой (£а-+в) и обратной реакций. Эта скорость (карр) зависит

только от условий, в которых протекает релаксация, и не зависит от исходного распределения белковых молекул между нативным и денатурированным состояниями. В этой суммарной скорости карр доминирует более быстрая реакция, если сворачивание/разворачивание проходит вдали от точки термодинамического равновесия. Если условия отвечают большей устойчивости нативного состояния, — то в карр = + доминирует

&u_>Nj скорость сворачивания. Если более устойчиво денатурированное состояние, — то в + доминирует скорость разворачивания.

Экспериментально измерив &арр, можно построить так называемые «шевронные графики», зависимости карр от концентрации денатуранта. Шевронный график

позволяет рассчитать свободную энергию нативного, денатурированного и переходного состояния. По наклону веток сворачивания и разворачивания можно судить о компактности (экспонированности на растворитель гидрофобных групп) переходного состояния.

Что же мы можем получить, исследуя процесс сворачивания или разворачивания одностадийных белков, сворачивание которых происходит без накопления каких-либо промежуточных состояний? Оказывается, мы можем косвенно зарегистрировать нестабильное переходное состояние (TS), свободная энергия которого определяет скорость сворачивания и разворачивания белка (Jackson, 1998; Fersht, 1995; Dobson and Karplus, 1999; Fersht, 1997). В результате исследования мутантных форм белка мы можем выделить структурированную часть переходного состояния, т.е. «ядро сворачивания» белковой структуры - оно нестабильно и соответствует максимуму свободной энергии на пути сворачивания/разворачивания белка.

В настоящее время существует только один, очень трудоемкий экспериментальный метод определения ядра сворачивания в белках, разработанный А. Ферштом (Fersht et al., 2004) - ^-анализ. Вводя множество точечных мутаций, и анализируя соответствующие им изменения в шевронных графиках относительно шевронного графика белка дикого типа, можно узнать, какие именно остатки вовлечены в нативоподобную часть переходного состояния, а какие — нет.

Методом ф - анализа были исследованы структуры переходных состояний многих белков, например, СНЗ домена спектрина (Viguera et al., 1994), барназы (Oliveberg, Ferst, 1996), белка холодового шока CspB (Schindler, Schmid, 1996). Из проведенных исследований был сделан вывод о том, что переходное состояние является нативоподобным по компактности и степени экспонированности гидрофобных групп. Однако средняя степень структурированности переходного состояния является различной для каждого конкретного структурного подкласса белков.

1.2. Многостадийно сворачивающиеся белки.

Одностадийный механизм сворачивания свойственен достаточно небольшим белкам. Большинство же белков сворачивается с образованием промежуточных состояний. Выяснение природы промежуточных конформационных состояний белков проводят с использованием многопараметрического подхода (Котова, Семисотнов, 1998). Чаще всего это измерения оптических свойств, таких как круговой дихроизм, триптофановая флуоресценция или поглощение, в зависимости от концентрации денатуранта. Использование различных методов позволяет исследовать различные уровни организации белка. Так спектры кругового дихроизма в дальней УФ области, несут информацию о содержании вторичной структуры, в ближней УФ области - информацию об упаковке боковых групп. Так, например, при равновесном разворачивании миоглобина было показано, что плотная упаковка боковых групп нарушается при меньших концентрациях денатуранта, чем вторичная структура (Бо^кЪ е1 а1., 1981). Из этого факта был сделан вывод о существовании промежуточного состояния с нарушенной третичной структурой, но почти полностью сохраненной вторичной. Для этого промежуточного состояния было так же показано сохранение местоположения вторичной структуры (ЯМР) (Ваиш, 1989), отсутствие кооперативного плавления (микрокалориметрия) (Рпуа1оу, 1996), сохранение некоторых нативноподобных специфических внутримолекулярных контактов (Бо^кИ е1 а1., 1981; Бо^кЪ е1 а1., 1985) и увеличение гидродинамического объема на 50% относительно нативного белка (малоугловое рентгеновское рассеяние) (ВусЬкоуа е1 а1., 1993 а; ВусЬкоуа е1 а1., 1993 б). Позже состояния с набором таких свойств получило название расплавленной глобулы. Его название отражает суть этого состояния, т.е. глобулярность (компактность и наличие гидрофобного ядра) и расплавленность (отсутствие кооперативного плавления). Также, было обнаружено, что денатурация бычьего и человеческого а-лактальбуминов гуанидингидрохлоридом по-разному проявляется в изменении

спектров кругового дихроизма белков в области поглощения пептидных связей и ароматических групп (Kuwajima et al., 1976; Nozaka et al., 1978). Спектры кругового дихроизма в области поглощения ароматических групп (жесткость третичной структуры белка) исчезали при существенно меньших концентрациях гуанидингидрохлорида, чем спектры в области поглощения пептидных связей (содержание вторичной структуры). Сходный результат был получен при исследовании денатурации бычьей карбоангидразы (Wong et el., 1974; Wong et el., 1973), гормонов роста (Holladay et al., 1974) и лактамазы (Robson et al., 1976). Эти данные с очевидностью демонстрировали то, что разворачивание белков не является процессом «все или ничего», а происходит с накоплением термодинамически стабильного промежуточного состояния, у которого отсутствует жесткая третичная структура, но сохранено большое количество элементов вторичной структуры.

Экспериментально так же было обнаружено состояние, называемое предрасплавленная глобула, образующееся при низкой температуре, промежуточных концентрациях гуанидинхлорида, а также при исследовании фрагментов белков. Оно характеризуется ещё меньшей структурной упорядоченностью, большими размерами, отсутствием гидрофобного ядра, но оно по-прежнему содержит стабильные элементы вторичной структуры (Chaffotte et al., 1997).

Исследование равновесной денатурации глобулярных белков выявило,