Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние первичной структуры Cro-белка на термодинамические свойства частично-структурированного надмолекулярного состояния

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Замяткин, Дмитрий Федорович

I. ВВЕДЕНИЕ

II. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 7 II. 1. Сворачивание (самоорганизация) белков 7 II. 1.1. Развернутое (денатурированное) состояние 10 II. 1.2. Состояние «расплавленной глобулы»

11.3. Тепловая денатурация небольших глобулярных белков происходит по принципу "все-или-ничего".

11.4. Промежуточные состояния, наблюдаемые при денатурации и ренатурации белков.

II. 4.1. Кинетические интермедиаты.

II. 4.2. Равновесные интермедиаты

11.4.2.1. Равновесные промежуточные состояния, реализующиеся в процессе тепловой денатурации мультидоменных белков.

11.4.2.2. Промежуточные состояния, возникающие в процессе тепловой денатурации однодоменных белков

11.5. Сго репрессор бактериофага X. Общие сведения

11.5.1. Характеристика Сго дикого типа и его мутантных форм

11.5.2. Мономерные формы Сго репрессора фага X

11.6. Применение сканирующей микрокалориметрии для изучения энергетики самоорганизации белков

11.6.1. Кооперативная денатурация малых глобулярных белков (принцип "все-или-ничего").

11.6.2. Многостадийные денатурационные переходы (мультидоменные белки).

III. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

III. 1. Материалы и реактивы

III. 1.1. Подготовка штаммов - суперпродуцентов

III. 1.2. Выделение и очистка исследуемых белков

III. 1.2.1. Выделение и очистка белков CroV55C и Cro mQl 6L

III. 1.2.2. Выделение и очистка белка CrojmDG 5 0 III. 1.2.3. Модификация и расщепление полипептидных цепей исследуемых белков

III.2. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

111.2.1. Сканирующая микрокалориметрия

111.2.2. Оптические методы

111.2.3. ЯМР-спектроскопия

111.2.4. Гидродинамичекие методы

III.3. Методы анализа калориметрических данных

IV. РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

IV .1. Исследование влияния экспериментальных условий на процесс денатурации Сго.

IV .1.1. Влияние ионной силы на стабильность конформационных состояний CroV55C

IV. 1.2. Исследование фрагментов различных форм белка Сго

IV. 1.3. Влияние соли на стабильность надмолекулярного

• комплекса, образуемого BrCN-фрагментом CroV55C

IV.2. Исследование мономерной формы белка Сго

IV.2.1. Исследование вторичной структуры CrojnDG методом КД-спектроскопии.

IV.2.2. Калориметрические исследования мономерных форм Сго

IV.2.3. Влияние соли на параметры денатурационных переходов белка CromDG

IV.2.4. Исследование денатурации белка CromDG методом ковалентных сшивок

IV.3. Структурные исследования надмолекулярных комплексов, образуемых различными формами белка Сго

IV.3.1. Данные о структуре интермедиата, полученные с использованием ИК-спектроскопии с Фурье-преобразованием. 89 IV.3.2. Структурные исследования мономерной формы Сго 95 IV.4. Влияние точечных аминокислотных замен на поверхности структуры репрессора на термодинамику ее денатурации

IV.4.1. Исследование влияния стабилизирующей замены

Q16L на формирование надмолекулярного комплекса различных форм Сго

IV.4.2. Структурные аспекты стабилизирующего влияния мутаций на нативную структуру

ВЫВОДЫ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Влияние первичной структуры Cro-белка на термодинамические свойства частично-структурированного надмолекулярного состояния"

Одной из главных проблем современной молекулярной биологии является проблема самоорганизации белков. Согласно наиболее распространенной концепции, нативная структура белка определяется в большей степени термодинамикой, чем кинетикой процесса сворачивания полипептидной цепи. То есть, нативное состояние соответствует глобальному минимуму свободной энергии и при оптимальных условиях этот минимум достижим за сравнительно короткое время.Однако как т vitro, так и in vivo белки могут принимать конформации, отличные от нативной. В одних случаях такие конформеры имеют функциональное значение: они образуются при связывании лигандов или при воздействии других факторов. Эти конформеры, как правило, не сильно отличаются от нативной структуры по свободной энергии и не отделены от нее высоким активационным барьером.Другой обширный набор альтернативных структур представлен нефункциональными промежуточными состояниями, возникающими на пути процесса сворачивания (наиболее известными из них являются «расплавленные глобулы»). Чаще всего возникновение таких структур обусловлено наличием на энергетическом ландшафте белка локальных минимумов, ограниченных высоким активационным барьером, и в таком случае - это переходные или метастабильные состояния. Однако, в зависимости от условий и, в особенности, от концентрации белка, эти интермедиаты способны образовывать надмолекулярные структуры, вплоть до нерастворимых агрегатов, таких, например, как тела включения.Чрезмерное накопление неправильно сверннутых белков сказывается на жизнедеятельности клеток или целого организма негативно: накопление агрегированного белка в нейронах животных и человека приводит к таким заболеваниям как «коровье бешенство» и болезнь Альцхеймера. Для предотвращения этого явления клетки имеют две системы: молекулярных шаперонов - катализаторов сворачивания белков, понижающих активационные барьеры на пути к нативной конформации, и убиквитиновую систему, предназначенную для деградации неправильно свернутых полипептидных цепей.Образование нерастворимых агрегатов является наиболее распространным последствием склонности промежуточных состояний к ассоциации,- но изучение всех аспектов этого процесса, включая термодинамику, крайне затруднено. Однако, в некоторых случаях ассоциацию удается остановить на уровне димеров или небольших растворимых олигомеров, образование которых происходит обратимо и равновесно.Исследование термодинамики образования таких альтернативных надмолекулярных структур является актуальной задачей, поскольку до сих пор остается неясным, почему при определенных условиях эти лишь частично упорядоченные комплексы становятся стабильней высокоупорядоченной нативной структуры. Последующие структурнотермодинамические соотнесения должны способствовать более детальному пониманию механизмов самоорганизвции белков.Диссертация состоит из двух основных частей. Первая - обзор литературы - посвящена рассмотрению существующего состояния исследований интермедиатов сворачивания белков и строению и свойствам объекта наших исследований - Сго репрессора фага 1. Вторая часть экспериментальная - содержит описание применявшихся в работе материалов и методов, результаты и их обсуждение, а так же выводы.Автор выражает глубочайшую признательность своим научным руководителям и учителям: Владимиру Васильевичу Филимонову и Владимиру Витальевичу Рогову за всестороннюю помощь и содействие в выполнении работы, а так же благожелательное отношение к автору этих строк.Автор благодарен всем сотрудникам Института белка РАН, оказывавшим помощь в работе, и в особенности Ивану Андреевичу Кашпарову.Огромное спасибо нашим немецким коллегам: директору Института биофизической химии при университете им. Гете профессору Хайнцу Рз^^ерьянцу и доктору Хайнцу Фабиану за сотрудничество, техническую и материальную поддержку.Автор так же благодарит Фонд Хавемана за годовую стипендию, выданную на завершение диссертационной работы и Фонд Дж. Сороса за годовую стипендию соросовского аспиранта.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Замяткин, Дмитрий Федорович

V. выводы.

1. Показано, что мономерный вариант белка Сго может образовывать в процессе денатурации равновесный надмолекулярный интермедиат.

2. Для белка CroV55C найдены условия, при которых заселенность промежуточного состояния максимальна. При значениях рН 3,03,5 и ионной силе 225 мМ заселенность промежуточного состояния близка к 1 уже при 25 °С. Показано, что BrCN-фрагмент CroV55C в растворе представлен надмолекулярным комплексом. Свойства фрагмента и надмолекулярного интермедиата CroV55C близки.

3. По данным ИК-спектроскопии надмолекулярные интермедиаты всех изученных форм Сго образуются за счет остаточной (3-структуры. Спектры BrCN-фрагмента CroV55C и надмолекулярного интермедиата демонстрируют высокую степень подобия, что указывает на их структурное сходство. Методом ЯМР показано, что в надмолекулярный интермедиат, образуемый мономерной формой Сго, входят его (3-2, (3-3 и (3-4 участки нативной структуры.

4. Замена Глн-16 на Лей приводит к стабилизации как нативного, так и промежуточного состояния. Замена Тир-26 на Асп приводит к стабилизации нативного состояния. Аддитивное влияние этих замен приводит к сильной стабилизации нативного состояния, в результате чего промежуточное состояние не реализуется.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Замяткин, Дмитрий Федорович, Пущино

1. Маниатис, Т., Фрич.Э., Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование. Москва, Мир, 1984

2. Пташне, М. "Переключение генов. Регуляция генной активности и фаг X",

3. Москва, "Мир", 1988; Рогов, В.В., Грико, Ю.В., Калориметрическое исследование влияния аминокислотных замен 16Gln-Ley и 26Tyr-Asp на структурную организацию и стабильность Сго-репрессора фага X. Мол. Биол., 1993, т. 27. стр. 798 804

4. Altaian M., Lee P., Rich A. and Zhang S. Conformational behavior of ionic selftcomplementary peptides, Prot. Sci., 2000, 9: pp. 1095-1105. Anderson, W.F., Ohlendorf, D.H., Takeda, Y.,and Matthews, B.M. Structure of the

5. Brands, J.F. The thermodynamics of protein denaturation. II. A model of reversible denaturation and interpretation regarding the stability of chymotripsinogen. J. Am. Chem. Soc., 1964, v. 86, 20, pp. 4302-4314.

6. Brent, R., and Ptashne, M. Mechanism of action of lexA gene product. Procl. Natl.

7. Sci. USA, 1981, v.78, pp. 4204-4208 Bryngelson J.D., Onuchic J.N., Socci N.D., Wolynes P.G. Funnels, pathways, and the energy landscape of protein folding: a synthesis. 1995, Proteins, v. 3, pp. 167-195.

8. Dobson, C.M. Characterization of protein folding intermediates.

9. Curr.Opin.Struct.Biol., 1991, v. l,pp. 22-27 Doig, A.J., Williams, D.H., and Sauer, R.T. Surface areas of unfolded proteins.

10. Nature, 1990, v. 348, p. 397 Donovan, J.W., and Mihalyi, E. Conformation of fibrinogen: calorimetric evidence for a three nodular structure. Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1974, v. 71, 10, pp. 4125-4128

11. Gitelson, G.I., Griko, Yu.V., Kurochkin, A.V., Rogov., V.V., Kutyshenko, V.P., Kirpichnikov, M.P., Privalov, P L. Two-state thermal unfolding of Cys-55.-substituted Cro repressor from bacteriophage X. FEBS Lett. 1991, v. 289, pp. 201 204

12. Griko, Yu.V., Rogov, V.V., and Privalov, P.L Domains in Cro repressor. Acalorimetric study. Biochemistry, 1992, v.31, pp.12701-12705 Griko Yu.V., Privalov, P.L. Thermodynamic puzzle of apomyoglobin unfolding. J.

13. Mol. Biol. 1994, v. 235, pp. 1318 -1325 Griko, Yu.V., Privalov, P.L., Venyaminov, S.Yu., & Kutyshenko, V.P. Thermodynamic study of the apomyoglobin structure. J.Mol.Biol. 1988, 202, 127-138.

14. Guex, N. and Peitsch, M.C. SWISS-MODEL and the Swiss-PdbViewer: An environment for comparative protein modeling. Electrophoresis, 1997, v. 18, pp. 2714-2723.

15. Hecht, M.H., Hehir, K.M., Nelson, H.C.M., Sturtevant, J.M., and Sauer, R.T. Increasing and decreasing protein stability: effects of revertant substitution on the thermal denaturation of phage repressor. J. Cell. Biochem., 1985, v. 29, pp. 217-224

16. Hsiang, M.W., Cole, R.D., Takeda, Y., and Echols, H. Amino acid sequence of Cro regulatory protein of bacteriophage. Nature, 1977, v. 270, 7634, pp. 275-277

17. Medved', L.V., Gorkun, O.V., and Privalov, P.L. Structural organization of C-terminal parts of fibrinogen A -chains. FEBS Lett., 1983, v. 160, 1, pp. 291295

18. Meyer, B.J., Ptashne, M. III. repressor directly activates gene transcription. J. Mol.

19. Biol. 1980, v. 139, pp. 195-205 van Mierlo C.P., van den Oever J.M., Steensma E. Apoflavodoxin (un)folding followed at the residue level by NMR. Protein Sci. 2000 Jan; 9 (1): pp. 145157

20. Minor D.L. Jr., Kim P.S. Context is a major determinant of beta-sheet propensity.

21. Pakula, A.A., and Sauer, R.T. Reverse hydrophobic effects relieved by amino-acid substitution at a protein surface. 1990, Nature, v. 344, pp. 363-364.

22. Privalov, P.L., and Potekhin, S.A. Scanning microcalonmetry in studying temperature induced change in proteins. Methods Enzymol., 1986, v. 131, pp. 4-51

23. Privalov, P.L. Thermodynamic problems of protein structure. Annu. Rev. Biophys.

24. Biophys. Chem., 1989, v. 18, pp. 47-69 Privalov, P.L. Thermodynamic bases of the stability of protein structure.

25. Thermodynamica Acta., 1990, v. 163, pp. 33-46 Privalov, P.L. Intermediates in protein folding. 1996 J. Mol. Biol. 258, 707-725 Ptashne, M., Johnson, A.D., and Pabo, C.O. A genetic switch in a bacterial viruses.

26. Sci. American, 1982, v. 247, 5, pp. 106-120 Ptitsyn,O.B. Protein Folding, Ed.by Creghton T. 1992, New York: WH Freemanand Company, 243-300. Ptitsyn, O.B. Molten globule and protein folding, Adv. Protein. Chem. 1995, v. 47, pp. 83-229

27. Rupert P.B., Mollah A.K., Mossing M.C., Matthews B.W. The structural basis for enhanced stability and reduced DNA binding seen in engineered second-generation Cro monomers and dimers. J. Mol. Biol., 2000; v.296(4): pp. 1079-1090

28. Sambrook, J., Fritsch, E.F., Maniatis, T. Molecular cloning. A laboratory manual. Second edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989

29. Schievano E., Mammi S., Silvestri L., Behar V., Rosenblatt M., Chorev M., Peggion E. Conformational studies of parathyroid hormone (PTH)/PTH~ related protein (PTHrp) chimeric peptides. Biopolymers, 2000; v.54 (6): pp. 429-447

30. Takeda, Y., Folkmanis, A., and Echols, H. Cro regulatory protein specified by bacteriophage . J. Biol. Chem. 1977, v. 252, pp. 6177 6183118

31. Uversky V.N., Ptitsyn O.B. Further evidence on the equilibrium "pre-molten globule state": four-state guanidinium chloride-induced unfolding of carbonic anhydrase В at low temperature. J. Mol. Biol. 1996, 12;255(1): pp. 215-228