Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Компьютерное моделирование ЭПР-спектров спин-меченых макромолекул

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Компьютерное моделирование ЭПР-спектров спин-меченых макромолекул"

Московский Государственный Университет Биологический факультет

иа правах рукописи

САМАРЯНОВ 1 пит Борис Александрович

КОМПЬЮТЕРНОЕ МОДЕЛИРОВАНИЕ ЭПР-СПЕКТЮВ СПИН-МЕЧЕНЫХ МАКРОМОЛЕКУЛ

03.00.02- Биофизика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

Москва 1998 г.

Работа выполнена в Лаборатории Конформационной Стабильности Белка и Физических Методов Анализа Института Молекулярной Биологии РАН

Научные руководители

Доктор физико — математических наук

В.П.Тимофеев

Доктор биологических наук

А. А. Макаров

Оффициальные оппоненты:

Доктор физико-математических наук, профессор М.А,Лившиц

Кандидат биологических наук, доцент К.Н.Тимофеев

Ведущая организация:

Институт Химической Физики РАН

Защита состоится:

29 октября 1998 года в 15 часов 30 минут на заседании Диссертационного Совета К.053.05,68 при Московском Государственном Университете им. М.В.Ломоносова по адресу: 119699, Москва, Воробьевь горы, МГУ, Биологический факультет

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ

Автореферат разослан 24 сентября 1998 г.

Ученый секретать Диссертационного совета доктор биологических наук, профессор

Б.А.Гуляев

Актуальность проблемы

Одна из главных причин отсутствия однозначной расшифровки спектров ЭПР спин—меченых макромолекул в растворе заключена в вырожденности формы линии ЭПР спектров по многим магнитным и динамическим параметрам, от которых она зависит для данной выбранной модели движения нитроксильного радикала. Проблема усугубляется тем, что и выбор модели движения радикала не является однозначным. К настоящему моменту необходимо рассматривать две основные модели: одна из них предложена В.П.Тимофеевым в 1972 г., которая состоит в том, что радикал, связанный с макромолекулой, участвует в двух формах движения: медленном, диффузионном вместе с макромолекулой и быстром, стохастическом в процессе переориентации относительно макромолекулы, а другая предложена Дж.Фридом в 1974 г., которая используется в большинстве работ по "расшифровке" гпектров ЭПР. Можно здесь упомянуть формулу Кивельсона, однако, поскольку она справедлива только для :лучая изотропного вращения радикала, в данной работе зна не используется.

В модели Дж.Фрида рассматривается диффузионное зращение нитроксила, как эллипсоида вращения, и для его описания вводится двухкомпонентный тензор диффузии. !ри этом молекулярная система координат (МСК) штроксила не совпадает с диффузионной системой соординат. Одна из компонент тензора диффузии (£>Л) в этой модели связывается с изотропным движением юсителя, а другая (ОН) связана с вращательным движением радикала относительно носителя. Однако 5ыетрое хаотическое движение метки никак не зависит от {зотропного движения ее носителя, более того, они шличаютея по своей природе, поэтому данные сомпоненты не могут быть объединены в один тензор. Сроме этого, основываясь на данной модели, трудно >бъяснить изменение формы спектров при изменении

вязкости среды при постоянных температурах ил: ковалентном связывании носителя с адсорбентам: (сефароза, целлюлоза). Другой недостаток указанног подхода состоит в том, что всем молекулам (а их не мене 1014) в спин—меченом образце приписывался один и тот ж набор параметров (угол несовпадения 2 — осей в обои: координатных системах и величина ОН)

Модель, предлагаемая В.Тимофеевым и развитая ] 1977 и в 1986 гг., в которой быстрое хаотическое I медленное изотропное вращение радикала рассматриваете; независимо, позволяет избежать этих противоречий Однако в этом случае необходимо правильно предложит] модель для быстрой переориентации нитроксил< относительно макромолекулы, которая в 1986 г предлагалась, как аксиально — симметричная.

Цель работы

Разработка математической модели, адекватнс описывающей динамическое поведение нитроксильногс радикала, ковалентно связанного с макроносителем.

Создание соответствующего алгоритма и програмногс обеспечения для теоретического моделирования ЭПР — спектров спин—меченых биомолекул как решения обратной задачи ЭПР спектроскопии — воссоздания просранственной структуры ближайшего молекулярного окружения нитроксильного радикала.

Основные задачи работы

1. Используя ранее разработанный подход для описания медленного изотропного движения носителя спин —метки, найти наиболее простую -модель, наиболее адекватно описывающую быструю переориентацию метки относительно своего носителя;

2. Разработать математическое описание созданной модели для процесса быстрой угловой переориентации маркера относительно носителя.

3. Создание комплексного програмного обеспечения йдя моделирования спектров ЭПР спин — меченых макромолекул согласно разработанной математической модели.

4. Произвести сравнительный анализ разработанного способа моделирования спектров с уже существующими на эснове ряда широко известных примеров и полученных яовых экспериментальных результатов.

Научная новизна работы

Создан новый универсальный подход в решении обратной задачи ЭПР — спектроскопии, который позволяет соличественно получать в эффективных параметрах максимально возможную однозначную информацию, юдержагцуюся в спектрах ЭПР спин —меченых биологических образцов.

Впервые в практику моделирования ЭПР —спектров зведено понятие кластера спин —меток — условных 'объединений" спин —меток в образце по сходным динамическим параметрам.

Получены новые данные по применению )азработанного подхода для разных типов макромолекул:

1. Впервые для молекулы лизоцима было показано, что ¡ремя вращательной корреляции макромолекулы >пределяется не мономерной формой белка при рН4.7 и не химерной формой при рН7.1, а подвижностью истидинсодержагцего домена. Количественная оценка ¡ремени корреляции домена составила около 2 не.

2. Для синтетического полимера полиоктилизоцианата )ыло показано различие в динамическом поведении в »астворе и гелях (для двух растворителей — циклогексана с изооктана}. Зависимость гибкости полимерной цепи от емпературы в изооктане оказалась намного более ярко .ыраженной, чем в циклогексане.

Практическая значимость

Созданные алгоритмы расшифровки спектров ЭПР спин —меченых биомакромолекул имеет универсальное применение к различным состояниям спин — меченных образцов : квази — порошковым и порошковым состояниям, в различных растворах и кристаллах.

Публикации

По Материалам диссертации опубликовано 6 работ

Апробация работы

Результаты исследований докладывались на конференции "Молекулярная биология на границе XXI века" (Москва, 1994), в виде стендового доклада на 28 ежегодной международной конференции по ЭПР спектроскопии радикалов в органических и биоорганических системах (London — Surrey, 1995), Международной конференции "Микроструктуры и самоорганизация в полимерных системах" (Санкт-Петербург — Москва, 1995)

Объем и структура работы

Работа состоит из вступления, 6 глав, заключения и выводов, написана на 80 страницах, содержит 42 формулы, 35 рисунков и 4 таблицы.

Краткое содержание работы

Глава 1. ОПИСАНИЕ БЫСТРОЙ ХАОТИЧЕСКОЙ ПЕРЕОРИЕНТАЦИИ РАДИКАЛА ОТНОСИТЕЛЬНО МАКРОНОСИТЕЛЯ

Описание хаотической, быстрой переориентации метки относительно макромолекулы, приводящей к частичному усреднению главных значений компонент обоих тензоров радикала, можно проводить различными

способами согласно различным моделям вращения радикала.

Однако в любой модели, для получения частичного усреднения магнитных тензоров, необходимо математически выполнить операцию усреднения по времени следующего выражения (в дальнейшем все математические выкладки будут получены только для

л

гензора А, которые для тензора § абсолютно аналогичны, ;читается, что главные оси обоих тензоров совпадают):

А = Т~1А Т , (1)

где: А — диагональная матрица, след которой ао = (А^ + Ауу + Ахг)! 3 сохраняется при любых унитарных треобразованиях, а Т — оператор перехода из одной :истемы координат в другую для какого —то вполне определенного закона переориентации. В общем случае шератор Т состоит из 9 направляющих косинусов, определяющих положение системы координат относительно Х',У,Т '■

(с 41 С12 С Л пз

г = ^22 сгъ

4.^31 С32 сзз у

Стохастичность переориентации нитроксила фоявляется в зависимости направляющих косинусов от фемени. Усреднение по времени заменяется усреднением ю угловому пространству, если выбирается конкретный характер движения нитроксила. Многие авторы, например, Зилиг, Гриффит, рассматривают такие случаи быстрой юреориентации нитроксила, которые приводят оба тензора с аксиальной симметрии. Способ переориентации не сонкретизируется, важно только то, что ось 2 упорядочивается в некотором направлении, задаваемым

средними величинами направляющих косинусов. Это может быть, например, вращение оси 2 нитроксила относительно одной из осей Х',У, или Т (тогда один из косинусов не зависит от времени, а два других приобретают некие средние значения) при беспорядочной переориентации двух других осей (Рис.1).

Рис.1. Вращение оси Т Системы Координат Нитроксила относительно Системы Координат Макроносителя Х'УТ. Н— направление магнитного поля.

Математически это означает, что формула (3) даст следующее выражение для параллельной компоненты

л

тензора А, в котором участвуют только три направляющих косинуса: сп,с32,с23, оси Т нитроксила по отношению к осям

Т

и

'У

У

X' X

X', Г , Г :

(3)

при необходимом условии:

С31 С32 С33 ~~ 1 •

(4)

Перпендикулярная компонента находится из условия уществования аксиальной симметрии и из условия охранения следа тензора:

(Ает+Ат+Аи)'3-«, (5)

при преобразованиях типа (5):

А. = - (1 - 4)-А«+(1-4)-Ау+(1-4)-А* (6)

Выражения (4) и (в) удобно переписать в параметрах зорядочэнности Зх, Зу.

'V2 ~1 3с2 -1 Зс2 -1

Г — 1 О ... ^'.2 1 С — 33 1 ¡п\

2 г 2

подчиняющихся уравнению:

+ (8) то есть:

о

где: АА = М-5,2-й4-(1-52)-к- и

Л + Л Л — л

^-Ан———, М = ———, если вводить

зисимость и Б у от и вспомогательного параметра 5 виде:

Такой подход приводит к тому, что экспериментально определенному параметру упорядоченности оси X нитроксила:

5= = А^£>-> (10)

Аг — Ах Аг — а0

ставится в соответствие величина теоретического параметра упорядоченности согласно выражению (7).

Рассмотрим второй случай, в котором процесс переориентации нитроксила можно полностью конкретизировать. Для этого возьмем конкретную модель: колебание нитроксила (т.е. его молекулярной системы

координат) на угол ос вокруг произвольной оси Л.

z

Рис.2. Вращение СКН ХУТ относительно некой гространственной оси К. ХУ2 — Система Координат 1итроксила.

Для этого случая оператор вращения молекулярной истемы координат на угол 8 имеет вид:

'1 0 0 fclc1 csc2 с, с/ ( 0- с3 с2

T~cos5- 0 1 0 + (l-cos8)- с2с, С2С2 с2с3 + sinS- 0-с,

кО 0 1} с3с2 C3Ci с, 0)

где с, = cos а, с2 = cos (3, с3 =rcos у есть направляющие

осинусы оси вращения R с соответствующими араметрами упорядоченности для нее:

Я* =1^-1 (12)

Используя оператор вида (11), который представляв' собой сумму матриц: единичной, симметричной * кососимметричной, нужно иметь ввиду, что система (2

ортогональна поэтому обратная .матрица Т 1 равш транспонированной Т и если Г представлена в виде суммь матриц, то Т'1 сводится к сумме таких лее, ко ул<е транспонированных матриц, Кстати яаправлящие косинуса с& матрицы (2) для этой модели связаны с направляющими

косинусами оси вращения К и углом 6 следуюшишз соотношениями:

1 2 гипг 3 2вш5 2у 11 23 33 ;

В результате операции (1) для оператора (11) получаем следующие усредненные по углу 8 яри колебании нитроксила от —а до а диагональные элементы матрицы

л

А:

Аж =со82 <5-Аж + соб 8 • (1 - соз 8) • 2с* • +

+ (1 - соэ 8)2 ■ [с] • + с22 • Ап + с32 • А^) • с\ + (14)

+ (1-СО825)-(С22-42+С32-АУУ) ,

Ап =СОБ2 8-Ап + со8с>-(1--со8<5)-2с2 • Ап +

+ (1 - соей)2 • (с?• + с2 • А^ + с32 • А,) • 4 + (15)

+ (1-со82<5)-(с32-Ахх+с12-А2) ,

Агг = со823-А^ + со8<5-(1-со8<5)-2с32 • А^ + + (1 - соэд)2 ■ (с2 ■ Ахх А-с] ■ ЛГу + с2-Л22)- с32 + + (1-соз28)-(с22-Ахх+с1-Ауу) .

После интегрирования из 9 коэффициентов 5 обращаются в ноль, а оставшиеся 4 равны:

„ —Г? 1 Г 2 е .г 1 (-, $т2оЛ

К. = соя 8 =--соя <5-¿<5 = -- 1+-

2а 3„ 2 12а )

К2 = С08<)-(1-С08<5)

вша 1 а 2

1 +

зт 2 а 2а

У

(17)

„ ,л ™ч2 . „это; 1

К3 =(1- сое 8) =1-2-+ -■

сх 2

1+

ът2а 2а

8т2оЛ 2а )'

Формулы (14—16) можно переписать через параметры торядоченности в соответствии с полученными ээффициэнтами. Из этой общей модели усреднения

1 атональных компонент тензоров А и §, легко получить 1стные случаи.

Рассмотрим первый случай — случай полного

злебания нитроксила от —л до + тс, что соответствует

к.учаю полного оборота вокруг оси Я или модели быстро эащающегося волчка на медленно вращающейся сфере. ?гда формулы (14—16) с учетом (7) можно записать .едуюхцим образом:

Л« = ■ А« + ^• + 52в" = +|.М* ,

А, + # = а0+|-ЛЛ'Л* , (18)

Л* = «0 + | ■ А„ + • = ав+|-ДА*.

Все входящие сюда величины выражаются также с подстановкой вместо параметра упорядоченности оси 2

нитроксила параметра упорядоченности Я* оси К, например:

ДА* = ДА <54 •(!-£*)• к (19)

Как мы видим из (13) колебание нитроксила от — п до ж не приводит магнитные тензора к аксиальной симметрии и только при одном условии к = 0, когда согласно (6) и (7):

(20)

формулы (14—16) сводятся к аксиально — симметричному виду:

Ах=а0-\.МЩ2.

(21)

Из формул (10) и (21) следует, принимая во внимание, 2

что — • Ак- Аг~а0, формула для параметра упорядоченности 5 может быть записана как:

¿г ~А±

т.е. во второй модели усреднения в аксиально имметричном случае экспериментально определенному араметру упорядоченности 5 уже ставится в соответствие еличина теоретического параметра упорядоченности оси

! в квадрате, т.е. (^х)2-

Рассмотрим второй частный случай — колебания •гстемы координат Х,У,Т вокруг осей X', У ,Т , т.е. при с, = 1 т.д., соответственно.

Тогда формулы (14—16) при с, =1 или =1

(22)

(23)

При с3 = 1 или = 1 в:

эеобразуются в хорошо известные формулы :

АХХ=(К1+2К2 + КЭ)-АЯХ=АХХ

Ап = К1 ■ АуГ + К4-Агг = Агг + ^ +

2 2 2о>

Т - V А ¿-V Л - + АУУ I ~ Ат

л77. - Л1' + 4' _ 2 2 2а~

При с2 = 1 или = 1 в :

Т - 4 л. V л _ Аиг + Лге , Лух ~ ^22 вт2а

ЛХХ - Л1 ' ЛЖ + 4-' Л72 - 2 2 2а~

=(7Г1 + 2А:2 + АГз)-Л1Т=Лку

А^г + Ауу . Ауг-Ауу вт2а

4 ' ™ХХ

2 2 2а

~Т _ тг , V Л _ ^XX ^УУ ^ХХ ^УУ ^ ^СС

Ахх ~ К1'лхх+КА'луу--2 + 2 2С(~ '

' Ауу = Кх ■ Ауу + КА ■ А^ = + 4т , (24)

Аг2={К1+2К2 + Къ)-А2г = Аг2 .

Соответствие теоретических величин Б2 или (З*)' экспериментально полученной величине 5 выявляется е том, что лишь экстремумы КШП совпадают в обоих спектрах теоретическом и экспериментальном. Это наиболее вероятное состояние (кластер) для нитроксила спин—метки, дающее моноспектр ЭПР с КШП. В этом случае расстояние (2А ) соответствует (2А )

■> с V /теор V. 'эксп

Таким образом, все многообразие теоретических моделей сводится к выбору двух основных представленных выше моделей. Но в любой модели сдвиг КШП в спектрах ЭПР из — за быстрой переориентации метки равен:

А5 =2Аг -2А (25)

Это означает, что большое количество скачков оси Ъ нитроксила из —за рельефа на поверхности биополимера и химической структуры спин —метки группируется в некотором направлении, фактически задавая наиболее вероятное направление псевдооси преимущественного вращения оси Ъ нитроксила (директор) или всей молекулы нитроксила. Переключатели (параметры упорядоченности) Б и к служат для математического описания существования других возможных направлений "псевдоосевых вращений" нитроксила, принимая во внимание весь ансамбль спин — меченых макромолекул.

Равномерное распределение скачков вокруг директора обуславливает за временные ворота метода аксиальную симметричность частично усредненных тензоров. Временные ворота, как известно, задаются анизотропией А

и д тензоров, что схематически можно представить прямоугольным окном со сторонами ДА = А2 - Ах и &8~8х ~ 8г< переведенными в шкалу времени, как 10 и 30 не соответственно для X—диапазона и для 2 —мм диапазона 10 и 2 не,

Таким образом, быстрая хаотическая переориентация зитроксила относительно молекулы белка такова, что оставшаяся после частичного усреднения тензоров их шизотропия фактически является тем инструментом временные ворота), с помощью которого определяется т макромолекулы. Чем больше компоненты тензоров будут усреднены (или чем больше величина 5 будет отличаться от I), тем меньший диапазон т, отсчитывая от предельной юличины, доступен измерению. На рис.7 приведены •еоретические "температурно — вязкостные" зависимости )асстояния между КШП (2А'} в иммобилизованных :пектрах, симулированных на ЭВМ. Постоянная величина гараметра 5 соответствует постоянной температуре в 1кспериментальных спектрах. Время корреляции х юняется при изменении вязкости г| в растворе. Из дасунка виден диапазон изменений величин т и Б, в :отором существуют оба крайних широких пика, фактически во всех экспериментальных работах оказывается, что получение зависимости величины 2А' от язкости при постоянной температуре, необходимой сновой для расшифровки спектров. В принципе евозможно теоретически предсказать вклад в частичное среднение тензоров от величины % или от величины 5.

Осевое вращение радикала приводит фактически к вухкомпонентному тензору. Либрационное движение итроксила, как частный случай, может включать олебательное движение, приводящее к

рехкомпонентному тензору. Самое простое из таких вижений это вращение вокруг осей молекулярной ястемы координат. В этом случае формулы усреднения удут следующими (см. также формулы (26)):

1 ■ А. А, _

где:

о

Р = (27)

2а

\0

Таким образом, эти обе модели частичного усреднения компонент тензоров представляются, как частный случай более: общей модели поведения нитроксила, соверщающегс колебания на угол ±а вокруг оси преимущественного

вращения Е, направление которой задается ее направляющими косинусами или параметрами 5 и к (см, рис. 4).

Из формулы (30), приведенной ниже, видно, каким образом вводится в рассмотрение разброс в величине Б по ансамблю спин—меченых макромолекул. Разброс характеризуется числом возможных быстрых переориентации спин —метки, ограниченных временными воротами, задаваемых анизотропией СТС и д —фактора радикала, который и приводит к различию в характере усреднения компонент обоих тензоров.

Оба процесса происходят одновременно и ввиду их независимости аддитивно влияют на сдвиг КШП в спектрах ЭПР. Следовательно, суммарный сдвиг КШП будет равен:

А = 2А2-2А=(2Аг-2А)+(2А-2А) = А5+Ат (28)

где: Л5 и Ат есть выражения, полученные выше, при рассмотрении влияния каждого из двух стохастических фоцессов на сдвиг КШП.

Подстановка частично усредненных, аксиально :имметричных тензоров д и А в уравнения, описывающие медленное движение нитроксила, приводит при юблюдении постоянства шпура для обоих тензоров А и д к ;ледуюгцей функциональной зависимости для определения ; макромолекулы:

= (29)

где: 5 = 5ЭКСП

5 = Д|~Д|. = А|~ао = \~ао

А А2~ао А±~ао

Модель количественно точно описывает положения Ш1П в спектрах ЭПР, а также качественно выявляет [екоторые основные особенности формы линии ;ентральной части спектра при определенных условиях, егко осуществляемых на практике.

Рис. 3. а —в наглядно показывают динамику , и характер среднения компонент магнитных тензоров нитроксильного одикала со значениями магнитных тензоров А = ( 8, 6, 7.25), д = (2.0063, 2.0082, 2.0023) в зависимости от угла олебания а.

Pres» <Cnt«r) to Se* G lwnsoi-s U«lu«»

ao'V./ieo у >гоею;эро \ *эо. ущиizci/i&&

pfees <ESC> to öwtt tha Ргодгяп

Рис.3.а Картина усреднения компонет магнитных тензоров при S=-0.5, k=0.

Ргивз <Сп*-ег> 5ее 0-*еп»ог« Иа1иеэ

\

\ А

V. А ,:■, X V ::

ГУ} 160 270 . зот . чщ ¿30 ею ж-. ззо

Ш'О 17.'» 1^0 !»«:>

РГМЛ: <Г. 5С) |о *Ьв

У У"

;'йо V юсо иго пчо то

Рис.3.б. Картина усреднения компонет магнитных тензоров при 3=—0.5, к=1. (Вращение вокруг оси X)

Prmi&s (EriteO to See C-tensars Ualues

90 ISO 2?0 Э«0 5-tO 430 510 SOO 930 IQ&O НТО 12i0 1350 HtQ

Pres» <CSC) to Quit the Progreii

■K / x ✓

Рис.З.в. Картина усреднения компонет магнитных тензоров при S=0, к =1.

Глава 2. ВВЕДЕНИЕ ТЕРМИНОВ СПЕКТРАЛЬНАЯ МОДА И КЛАСТЕР В ТЕОРИЮ МОДЕЛИРОВАНИЯ СПЕКТРОВ ЭПР

Введение понятия КЛАСТЕР подробно было описано в заботе [5]. Неизвестный хаотический процесс ¡ереориентации нитроксила относительно носителя ¡аменяется набором простых моделируемых процессов — в [астности вращением оси Ъ СКН вокруг некой

фостранственной оси Я1 (Л на Рис.1) или колебанйем СКН

¡округ некой оси II11 на угол а (Л Рис.2). Таким образом, данный хаотичекий процесс во времени (за временные юрота метода) будет представлен стационарной картиной фи которой часть меток совершит вращения вокруг оси Р.1, I другая часть — колебания относительно оси Яп. Соответственно, у всех этих этих меток будут различные компоненты тензоров, в зависимости от выбранной модели осреднения. Кластером называется группа (множество) штроксильных радикалов со схожими динамическими характеристиками, а именно — с одинаковым характером осреднения компонент магнитных тензоров. Соответственно, каждый КЛАСТЕР имеет свой юбственный набор частично усредненных компонент ■ензоров А и д и характериуется соответствующим :пектром ЭПР. Группа КЛАСТЕРОВ со своими спектрами тогут образовывать более сложную группу, юответствующий ЭПР спектр которой является :уперпозицией спектров ЭПР КЛАСТЕРОВ и описывает гекую черту экспериментального спектра ЭПР (расстояние СШП, форму центрального пика, и т.д.). Данный сложный :пектр называется спектральной МОДОЙ. Наконец, гесколько спектральных МОД образуют моделируемый :пектр ЭПР Бррез, описывающий все особенности •кспериментального спектра.

В предыдущем разделе был подробно описан механизм усреднения компонент магнитных тензоров Аид. Ниже будет целесоообразно суммировать все вышеизложенные выводы и описать всю процедуру моделирования ЭПР спектров — с момента регистрации экспериментального ЭПР сигнала до получения искомых данных о пространственной сруктуре макроносителя и пространственно — конформационных чертах того исследуемого участка макромолекулы, куда была помещена спин — метка.

Глава 3. АЛГОРИТМ И ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ ДЕЙСТВИЙ ПРИ МОДЕЛИРОВАНИИ СПЕКТРОВ ЭПР

Ниже приведены основные шаги процесса моделирования ЭПР спектров в соответствии с новым подходом:

1. Оценка главных значений магнитных тензоров Аид для выбранного типа нитроксильного радикала;

2. Оценка времени вращательной корреляции медленного изотропного вращения макромолекулы (г— 5 — 2000 не};

3. Оцека параметра упорядоченности Б для быстрой переориентации нитроксила по отношению к носителю (г <0.1 тес);

4. Выбор модели усреднения компонент тензоров Аид и соответствующего моделированного процесса переориентации меток путем подсчета нескольких единичных ЭПР спектров с выбранными параметрами тензоров Аид для различных моделей усреднения меток с целью совпадения расстояния КШП и общей формы спектра;

Все последующие выводы основаны на предположении, что каждый кластер со своим спектром !

вносит свой вклад с определенным весом в результирующий моделируемый спектр. Данный вес пропорционален вероятности для спин —метки в данных условиях совершать выбранный тип движения и иметь определенные частично усредненные компоненты магнитных тензоров.

Таким образом, кластер будет записан как: Sp(SrKj)

- для врашательной модели усреднения (а=const) или Sp(ccn) — для колебательной модели усреднения (S = const, с= const).

5. Расчет наборов ЭПР спектров для выбранной юдели усреднения. Каждый спектрв наборе 'оответствует кластеру макромолекул со своими гсредненными значениями Аид тензоров.

Соответственно, следует расчитать либо {i+j) спектров :сли была выбрана вращательная модель или п спектров в лучае колебательной модели.

6. Определение первой спектральной моды Sp\х— для ращательной модели либо Splosc — для колебательной юдели.. Данный шаг производится как определение 'ауссовой плотности вероятностей для всех кластеров в аборе:

SCSo

2

,сг -л/2

Ра~е ^ } -е

одели

Kj-KQ

(7 -л/2

I К

для вращательной (30)

Рп-б

аа42

— для колебательной модели (31)

где р- или Рп — вес каждого кластера в

результирующем моделированном спектре, или вероятность спин —метки находиться в данном кластере с о своим типом реориентации и усредненными значениями тензоров:

7. Определение других спектральных мод 8р'ах или Соответственно, моду можно записать как:

= ЕРу^Ж^у) (32)

и

или

2>. •#(«»)■ (33)

8. Моделирование наилучшего сходства с экспериментальным спектром путем придания весов Н7^ расчитанным модам и, соответственно, нахождения их суперпозиции, где

Результирующий спектр может быть записан как:

Sp„=ZwrSpL (34)

I

или

Spm = Zwm'SPcsc (35)

в зависимости от выбранной модели усреднения. 9. В случае, если потребуется достижение более лучшей сходимости, шаги 5—8 могут быть повторены для другой модели усреднения тензоров Аид.

Результирующий ЭПР спектр, таким образом, может быть выражен как:

SPres = $Pl +^Lvvm.ty^, (36)

f m

где A + = I-

10. Извлечение динамических и структурных гараметров, характеризующих спектр ЭПР

Глава 4. ОПИСАНИЕ ПРОГРАМНОГО ЗБЕСПЕЧЕНИЯ ДЛЯ МОДЕЛИРОВАНИЯ СПЕКТРОВ ЭПР

Для моделирования спектров ЭПР согласно новому гетоду, а также для обработки получаемых кспериментальных спектральных данных в течение лительного срока создавались различные программы, оторые впоследствии были объединены в один пакет IMULT2. В качестве основного языка программирования ыл использован BORLAND PASCAL (5 — 7), ряд системных одулей был написан на языках BORLAND С++ и SSEMBLER. Форматом обрабатываемых спектров ЭПР был ыбран ASCII текст с 240 точками (с точностью до 10~б). яд вспомогательных модулей осуществлял конвертацию тектров в разные форматы (получаемые после машинной сстраполяции, других программ моделирования или Зработки спектров ЭПР).

Программа SIMULT является совокупностью 4-х эдулей, каждый из которых выполняет ряд аналогичных )уг другу функций: системный модуль, модуль обработки, эдуль моделирования и модуль расчета спектров ЭПР »ответственно.

Системный модуль, как это следует из названия, гаолняет системные функции (смену логических дисков, ■реход в другие директории, временный выход в .ерационную систему и т.д.).

Модуль обработки позволяет производить различные ерации со спектрами ЭПР: загрузку и графический [вод на экран, сглаживание, масштабирование, |рмировку и сдвиг по полю.

Третий модуль позволяет производить моделирование спектров двумя способами. С помощью первого можно осуществлять загрузку в программу до пяти подсчитанных для разных моделей усреднеения компонент магнитных

тензоров спектральных мод ( ^ ~ Х^/ ' ^Рт и

I

Зр^ = Х^и ' ЗРюс) и производить операции сложения и

т

вычитания (с задаваемыми козффициэнтами) спектров и сравнение результатов с экспериментальным спектром. Второй способ позволят загрузить в программу один из двух типов наборов спектров, подсчитанных для одной из

выбранной модели усреднения компонент тензоров А и § (п.5, Глава 3). В случае вращательной модели набор спектров состоял из (1+])=155 и в случае колебательной модели п=180 спектров соответственно. После загрузки одного из наборов производится непосредственное моделирование спектра (п.6 —8, Глава 3). Это достигается путем определения спектральных мод 5р1ах или Бр™с в соответствии с (30 — 33). На последнем этапе производится моделирование наилучшего сходства с экспериментальным спектром путем придания весов \\гп расчитанным модам и, соответственно, нахождения их суперпозиции, где ^ЛГ1+\У2 + ..ЛЛГП=1 - Рис. 4.

Модуль расчета спектров ЭПР позволяет также устанавливать следующие параметры для расчета спектров ЭПР — значения компонент магнитных теензоров Аид, значение величины магнитного поля (Г), индивидуальную ширину линии (Г), время вращательной корреляции носителя (не), величину угла колебания а СКН вокруг некой пространственной оси Я", а также значения параметров упорядоченности Я, к . Расчет спектров производится либо для набора из не более 5 спектров в диалоговом режиме (т.е. существует возможность изменяя один из параметров мгновенно отслеживать влияние данного изменения наа форму спектра) — Рис.5, либо для

набора из (1+)}~155 или в п=180 в зависимости от выбранной модели усреднения. Помимо динамических спектров (спин — меченый раствор исследуемого образца), предусмотрена опция расчета порошковых спектров для

образцов в кристаллическом состоянии (при ).

t:\3_mULT\HHlC.SK

ТЪеог. О.Н.Р. » «1.22 < 6 >

—>| 3250 < в >

РЯКШК» № ш. ОРЕСТМ

<170 < 0Л1>Ь- -1.0 < 0.05)Зил-» 0.30

2:3=-0.45 ( 0.29 )к= 1.0 < 0.05 >8им= 0.29

3:$- 0.И0 < 0.01 0,0 ( 0.05 ) Зиш-ГоиТ]

■(!»■ 0,00 < 0.01 С,0 ( а.05 )3и«р 0.00

&5» 0.00« 0.01 Ус С.О ( 0.С5 >8ил» 0,00

МТЕСМГЕО яшпин

-Л.

з - шэтивипда

изЕ гоиданю кто,-

< ствол ют > -

ОЕХЕЕТ ОКШЕТЕЙ

< РдЦр / Рфп > -ЯТНЕ ИНЛПЕТЕЯ

¡'ЙШЕ

< ЗРЛСЕК / Ш > -

иш «виитаг, агатам

< Ков» / ЕГК) > -ЮТ ЕХРЕИНЕНТ

зтатшч игт/гаенг

< 01г - 8 > -ВАК 5РЕСТЯШ ОН ЕХ1Т

каРРй-МЭТИНШОМ

Рис,4. Диалоговое окно режима моделирования спектров ЭПР.

Thfor. O.H.P. « ¿6.31 < 6 ■>

ft -> ( 7.89, 7.82, 35.54 > g -> < 2.00901,2.0062i,2.00243 ) —3250 ( S >

USE FOILOUING KEYS.'

< CURSOR KEYS > -SELECT PARAMETER

< PgUp y PgBri Mine

< + / - > rough -PARAMETERS DEFINE

< SPACER / INS > -UIEU RESULTING SPECTRUM

< Home / End > -t*HC EXPERIMENT SPECTRUM LEFT/RIGHT

< Mt - S > -

SAUE SPECTRIN ON EXIT

cutmrr mem STATUS I SETTING up PARAMETERS of THE EPR SPECTRA _

Ax* 3.00 Aij* 6.00 te»3?.25 Gx=.0093 Gy*.0062 Gz=.0022 1» 26.0 L° 2.0 An*) 39|S* 0.44 к».-1.00 11= 1.00

Ах» 8.00 Ay3 ¿.00 to» 37.25 Gx= .0033 Gy=.0062 Gz=.0022 <= 26.0 1= 2.0 ftn= 0 S= 0.00 k« 0.00 H= 0.00

Ax» 8.00 Ay= 6.00 to» 37.25 Gx=.0093 Gy»,0062 Gz=.0022 t= 26.0 L= 2.0 An= 0 S= 0.00 k= 0.00 U= O.OO

Ах» 8.00 Ач= 6.00 flz=37.25 Gx= .0093 6y*.0062 Gz=.0022 te 26.0 L* 2.0 An= 0 S=° Q.OO k= 0.00 H= 0.00

Ax= 8.00 Ач= 6.00 Az= 37.25 6x=.0093 й/=.0062 Gj=.0022 t» 26.0 L= 2.0 An= 0 S= 0.00 к* Л00 14= 0.00

Рис.5. Диалоговое окно модуля расчета спектров ЭПР.

Глава 5. ИССЛЕДОВАНИЕ ДИНАМИЧЕСКОЙ ПОДВИЖНОСТИ ГИСТИДИНСОДЕРЖАЩЕГО ДОМЕНА СПИН-МЕЧЕНОГО ЛИЗОЦИМА

Как уже было выше сказано, по величине сдвига КШП вполне можно оценить пространственную структуру макромолекулы — носителя. Однако, намного более ценную информацию представляет собой пространственная структурная картина ближайшего окружения спин —метки. С помощью созданного програмного обеспечения удалось для "каждого моделированного спектра в случае вращательной модели получать картину распределения спин —меток по пространственным углам переориентаций

Ф и (В) (Рис.2.} Получив такую картину, легко оценить динамику нитроксила, а следовательно, подвижность самого бокового остатка. Помимо этого, легко прослеживать конформационные изменения в случае исследования

аких —либо биомолекулярных взаимодействий типа елок — белок, фермент — субстрат, антиген — антитело и т.п.

Рассмотрим как реализуется данное утверждение в риложении к исследованным макромолекулам. Одним из эъектов исследований был лизоцим белка куриных яиц, а эчнее — его гистидинсодержащий домен [3]. На Рис.б.а. эказан пример моделирования ЭПР спектра спин — еченого лизоцима при 23% сахарозы по его гстидинсодержащему домену, . а на Рис.б.б. — ютветствуюгцая моделированному спектру картина определения спин —меток по пространственным углам

вреориентаций Фи®.

Рис.б.а. Моделирование ЭПР спектра спин—меченого оцима по его гистидинсодержащему домену, делированный спектр приведен снизу. Параметры ктра, состоящего из 2-х мод: S¡— 0.60 (0.14), к —1.00 15), W,—0.36; S2—0.14 (0.4), к2=0.6 (0.25); Wf=0.64. -Персия распределения по параметрам указана в скобках

;

ГЧ.Г!

-•С, Ш.V:.;.;;:.й х.:: ; <

I Ч 1 * 1

'{ ' / "Л-'Г: ''

«5 ао а о 4«

Рас.о.о. Г/роспгрснапвекяая картина ршмоеделъшй -пометок .ао пространственным углам переориентации Ф ч & пая гистидинссдержащего домена молекулы лиэоциг

има.

Глава 5. ИССЛЕДОВАНИЕ ДИНАМИЧЕСКОЙ ПОДВИЖНОСТИ СПИН-МЕЧЕНОГО ПС^^Л»

ИЗОЦИАНАТА.

гпд„В качестве следующего примера возьмем полимер юлл--октил-изсцкаката растворенного в Ьехапе (30 пд/ш1). Полимер в данном растворителе существует в виде легка гибкого стержня. Интересные вывоД мс^но

Гео™3 ИС-7'В- ВвС Н6РВ0Й МОАЫ быстрой переориентации нитроксила равен 0.5, а остальных ¿ух Ло

•25. Мы интерпретируем этот результат следующим

бразом. Известно, что POIC в растворе- находится в инамическом равновесии между формами trans — cys. [ммобилизованный спектр ЭПР , т.е. имеющий КШП, эзникает от первой моды и мы его связываем с trans — юрмой полимера. То есть в этой форме нитроксил, рисоединенный к амидной группе в составе остова олимера, ограничен в амплитуде угловых переориентаций. асторможенный спектр без КШП возникает от второй и эетьей мод, где величины S ~ 0.35 и S =—0.30 т.е. ддественно меньше 1, при этих величинах S КШП не эзникают, соответственно, мы его связываем с cys — ормой полимера.

гс.7.а. Пример моделирования ЭПР спектра для спин—меченого РОЮ растворенного в гексане при комнатной температуре, оделированный спектр изображен снизу. Параметры спектра, стоящего из 3-х мод: Б,=0.7 (0.1), к,=-0.5 (0.1), \¥,=0.5; 52=0.35 .2), к2—1 (0.1), VI2=0.25; 53=-0.3 (0.25), к3=0 (0.05), Ш3=0.25. В

20

о Ю 20 30 40 ЗО 60 70 80 ЭО

Рис. 7.б. Картина распределения спин—меток по пространственным углам переориентации Фи & для молекулы РОЮ раствореной в гексане.

Заключение

Созданный набор компьютерных программ позволяет применять его для моделирования ЭПР спектров широкогс типа исследуемых образцов — от растворов биомолекул дс кристаллических образцов,

Основные выводы

1. Предложена и апробирована новая модель описания ыстрого хаотического движения нитроксила относительно ;акроносителя. Неизвестный хаотический процесс ереориентации нитроксила относительно носителя аменяется набором простых моделируемых процессов — в астности вращением оси Ъ СКН вокруг некой

ространственной оси /? или колебанием всей СКН вокруг

екой оси Я на угол а.

2. Впервые в практику моделирования спектров ЭПР ведено понятие кластера спин —меченых макромолекул ак "объединения" спин —меток по схожести их янамических характеристик. Весь спектр ЭПР в редложенном методе представлен как суперпозиция тектров (спектральных мод) от всех кластеров в образце, родемонстрирована необходимость введения определений (Гаусса) по кластерам спин —меток при оделировании.

3. Согласно предложенной модели создан пакет эмпьютерных программ, позволивший произвести завнение теоретических спектров с экспериментальными, 1к на основе уже существовавших и ранее 1убликованных, так и на основе новых, представленных в гссертации, данных. Полученные данные свидетельствуют

преимуществах нового метода анализа ЭПР спектров [ин — меченых макромолекул.

4. Созданный пакет программ обладает широкой шверсальностью и позволяет призводить исследования [ин —меченых образцов в различных средах: идкофазных, кристаллических и порошковых змороженных).

Список публикаций

1.V.P.Timofeev, B.A.Samarianov "About new universe approach to the EPR—spectra simulation of the spin —labele macromolecules." Appl. Magn. Reson. v.4, 523 — 539, 1993.

2.В.П.Тимофеев, В.А.Лапук, Б.А.Самаряно "Дифференциация пространственной подвижност: остатков лизинов в иммуноглобулинах G методом спин-метки." Молекулярная биология, том 28, N б, 1315—132С 1995.

3.Р.И.Артюх, Г.С.Качалова, Б.А.СамаряноЕ В.П.Тимофеев "Динамическая подвижность гистидин-содержащего домена спин — меченого лизоцима. Молекулярная биология, том 29, N1, 149—158, 1995.

4.T.Turunen, H.Tenhu, B.A.Samarianov, V.P.Timofee1 "Solutions and gels of spin —labelled poly(octyl isocyanate) ii nonpolar hydrocarbon solvents." Polymer, v.35, 1678—1681 1995.

5.V.P.Timofeev, B.A.Samarianov "Dynamics о macromolecule spin —labelled Side —chain groups by EPI spectra simulation" J. Chem. Soc. PERKIN TRANS., v.2 1345-1353, 1995.

6.H.Tenhu, J.Rantala, B.Samarianov and V.Timofee^ "Phase transitions of poly(octyl isocyanate). Simulation of the EPR spectra of a dry spin — labelled polymer" Polymer, v.39 4057-4063, 1998.