Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Конформационные особенности молекулы рибулозо-1,5-дифосфаткарбоксилазы и её активного центра, модифицированных спиновой меткой

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Содержание диссертации, кандидата физико-математических наук, Муллокандов, Эдуард Ашерович

ВВЕДЕНИЕ

Глава I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Физико-химические свойства рибулозо-1,5-дифосфат-карбоксилазы

1.2. Каталитические свойства РДФ-азы

1.3. Химическая природа групп активного центра РДФ-азы.

1.4. Особенности метода спиновых меток

1.5. Зависимость параметров спектров ЭПР иминоксильных радикалов от полярности окружения

1.6. Исследование белков с помощью метода спиновых меток

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Выделение белка и его модификация спин-меткой

2.2. Получение спин-меченых субьединиц рибулозо-I,5-ди-фосфаткарбоксилазы

2.3. Методика обработки носителей для иммобилизации рибулозо-1,5-дифосфаткарбоксилазы

Глава 3. ИССЛЕДОВАНИЕ СПИН-МЕЧЕНОЙ РИБУЛ030-1,5-ДИФОСФАТ

КАРБОКСИЛАЗЫ

3.1. Идентификация места присоединения спин-меток на молекуле РДФ-азы

3.2. Анализ спектра ЭПР спин-меченой РДФ-азы. Измерение времени корреляции макромолекулы РДФ-азы

3.3 Изменение конформации молекулы РДФ-азы при взаимодействии с субстратами и активатором

3.3.1. Изменение конформации РДФ-азы при взаимодействии с рибулозо-I,5-дифосфатом (РДФ)

3.3.2. Изменение конформации молекулы РДФ-азы при взаимодействии с NaHCOg

3.3.3. Изменение конформации молекулы РДФ-азы при взаимодействии сМдС^

3.4. Изменение конформации субьединиц РДФ-азы при взаимодействии с субстратом и его аналогом

3.5. Избирательная модификация SH-групп РДФ-азы спин-меткой

3.5.1. Окисление нитроксильных радикалов на молекуле фермента после удаления восстановителя

3.5.2. Модификация активного центра РДФ-азы спин-меткой

3.5.3. Модификация РДФ-азы N-этилмалеинимидом с последующим спин-мечением

Глава 4. ИССЛЕДОВАНИЕ РИБУЛ030-1,5-ДИФ0СФАТКАРБ0КСИЛАЗЫ

ИММОБИЛИЗОВАННОЙ НА НЕОРГАНИЧЕСКИХ НОСИТЕЛЯХ

4.1. Исследование спин-меченой РДФ-азы иммобилизованной на силикагеле, активированном глутаровым альдегидом

4.2. Использование иммобилизованных препаратов РДФ-азы для поглощения COg из воздуха

Введение Диссертация по биологии, на тему "Конформационные особенности молекулы рибулозо-1,5-дифосфаткарбоксилазы и её активного центра, модифицированных спиновой меткой"

Центральную роль в процессе фиксации углекислого газа при фотосинтезе, как известно играет рибулозо-1,5-дифосфаткарбоксила-за ( РДФ-аза, КФ.4Л.1.39 ) - фермент осуществляющий две важнейшие реакции в метаболизме растений : реакцию карбоксилирования рибулозо-I,5-дифосфата ( РДФ ) до 2-х молекул 3-фосфорноглицери-новой кислоты ( 3-ФГК ) ( фотосинтез )-и окисление РДФ до одной молекулы 3-ФГК и одной молекулы 2-фосфогликолата ( фотодыхание )■ (9).

Изучение структуры активного центра РДФ-азы и механизма его действия позволит целенаправленно воздействовать на соотношение карбоксилазной и оксигеназной реакций этого бифункционального фермента. Несмотря на интенсивное изучение структурной организации РДФ-азы различными методами, до сих пор не выяснена роль малых субьединиц в ферментативной реакции (42). Остается неясным вопрос о конформационных изменениях активного центра в процессе катализа, то есть неизвестно изменяется ли структура активного центра при изменении четвертичной структуры РДФ-азы. Совершенно неисследовано взаимодействие субьединиц фермента с субстратами.

Исходя из этого, целью данной работы явилось :

1. Исследование поведения РДФ-азы в растворе и в комплексе с субстратами и активатором, измерение времени корреляции макромолекулы фермента.

2. Изучение конформационной подвижности субьединиц РДФ-азы при взаимодействии с субстратами и активатором.

3. Селективная модификация S Н -групп белка спин-метками и определение с помощью метода ЭПР их чувствительности к связыванию субстрата и активатора ферментом.

4. Модификация активного центра РДФ-азы спин-меткой и изучение конформационных изменений в каталитическом центре при взаимодействии фермента с субстратом и активатором.

Для решения поставленных задач использовали метод спиновых меток (I), позволяющий следить за микроокружением модифицированных групп, а также за поведением самой макромолекулы.

Использованный метод позволил получить информацию о конформационных изменениях в макромолекуле РДФ-азы и её субьединиц при взаимодействии с субстратами и активатором. С помощью спин-меток было выявлено два типа SH~rPynn> отличающихся характером белкового окружения. По зависимости параметров спектров ЭПР спин-меченой РДФ-азы от вязкости среды было определено время корреляции белка. Показано, что отсутствие малых субьединиц приводит к образованию высокомолекулярных агрегатов больших субьединиц, что позволяет судить о роли малых субьединиц, как стабилизаторов четвертичной структуры фермента.

С помощью спин-метки, введенной в активный центр фермента были зарегистрированы конформационные перестройки активного центра РДФ-азы при взаимодействии фермента с субстратом и ионом М д^* результатом которых явилось изменение электронной структуры фрагмента иминоксильного радикала.

При анализе спектров ЭПР использовали модель анизотропного быстрого вращения радикала относительно макромолекулы белка или сравнивали экспериментальные спектры с расчетными теоретическими спектрами (б, 92). Использование модели анизотропного быстрого вращения радикала относительно макромолекулы белка позволило получить количественные характеристики, такие как угол переориентации нитроксильного радикала и время корреляции белка.

Изучение структуры и функции РДФ-азы имеет важное практическое значение, в связи с возможностью использования этого фермента, как активного элемента систем очистки воздуха от углекислого газа. Исходя из этого, исследовались с помощью метода спин-метки иммобилизованные на неорганическом носителе препараты РДФ-азы. Был подобран оптимальный носитель и условия для иммобилизации РДФ-азы и на основе иммобилизованного фермента создана долговременная система очистки воздуха от углекислого газа.

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Муллокандов, Эдуард Ашерович

ВЫВОДЫ

1. Молекула РДФ-азы при связывании с субстратами и активатором, изменяет свою конформацию. Эти изменения коррелируют с кинетикой активации и катализа фермента.

2. Время корреляции молекулы РДФ-азы, найденное из зависимости параметров спектров ЭПР спин-меченого фермента от вязкости и температуры раствора, используя модель анизотропного быстрого вращения спин-метки относительно макромолекулы белка, соответствует времени корреляции макромолекулы с жесткой структурой.

3. Сравнение экспериментальных спектров ЭПР спин-меченой РДФ-азы с теоретическими спектрами, позволило определить эффективные углы переориентации спин-меток связанных с различными типами S Н -групп. Спин-метки, дающие расторможенный спектр ЭПР, вращаются в эффективном конусе с углом полураствора о(^50°, а спин-метки, дающие сильно иммобилизованный спектр ЭПР,- в конусе с углом полураствора d = 25°. Следовательно, с помощью метода спин-метки, в молекуле РДФ-азы выявлено два типа сульфгидрильных групп, отличающихся по своему локальжщу окружению.

4. Обнаружены и исследованы изменения конформации больших и малых субьединиц РДФ-азы при связывании с субстратми, ингибитором и активатором. Большие субьединицы в отсутствии малых образуют высокомолекулярные агрегаты сравнимые по молекулярной массе с макромолекулой фермента. Показано, что связывание субстрата ( РДФ с большими субьединицами способствует этому процессу, но при повышении концентрации РДФ агрегаты теряют свою жесткость и становятся внутренне подвижными.

5. Из сравнения экспериментальных спектров ЭПР больших и малых субьединиц с теоретическими спектрами, были определены параметры Z6 и о , характеризующие вращение молекул ;белка. Время корреляции больших субьединиц оказалось равным ^£400 нсек,а локальное окружение спин-меток таким, что они вращаются в конусе с углом полураствора cfe80°. В случае малых субьединиц, время корреляции равно £=40 нсек,а угол полураствора конуса вращения метки о(~70°.

6. Показано, что малые субьединицы выполняют роль стабилизаторов четвертичной структуры РДФ-азы, а также выполняют функции регу-ляторных центров.

7. Проведена модификация активного центра РДФ-азы спин-меткой и обнаружено значительное изменение конформации активного центра при изменении конформации всей макромолекулы белка при связывании его с субстратом и активатором. Таким образом выявлен третий тип^Н-групп локализованных в активном центре фермента.

8. Теоретическое моделирование изменений, происходящих в спектрах ЭПР спин-метки в активном центре фермента при связывании фермента с субстратом и активатором показало, что эти изменения вызваны появлением сильного электронно-акцепторного окружения метки, что приводит к переходу неспаренного электрона фрагмента радикала с я-разрыхляющей орбитали на о-разрыхляющую орбиталь и проявляется в появлении нового сигнала ЭПР с меньшей изотропной константой СТС и с меньшим изотропным 5-фактором.

9. Получены иммобилизованные на 5-ти неорганических носителях препараты РДФ-азы. Подобраны оптимальные условия иммобилизации РДФ-азы и показана конформационная стабильность иммобилизованного фермента. Разработан способ поглощения углекислого газа на основе иммо билизованной на неорганических носителях РДФ-азы. Исследовано влияние иммобилизации на параметры спектров ЭПР спин-меченой РДФ-азы. Показано, что иммобилизация приводит к разрыхлению непосредственног окружения спин-меток.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Хорошо известно, что рибулозо-I,5-дифосфаткарбоксилаза обладает сложной четвертичной структурой и является ключевым в процессе фиксации углекислого газа при фотосинтезе. Основная трудность в получении подробной информации о строении и механизме действия РДФ-азы по-видимому заключается в сложности организации самого фермента и ограниченности биохимических методов, применяемых для его исследования. Сложный характер кинетики активации и катализа РДФ-азы, вероятно объясняет тот факт, что до настоящего времени не выяснена роль малых субьединиц в активации фермента.

Используемый в настоящей работе метод спиновых меток позволил получить такие количественные характеристики описывающие кон-формационные свойства макромолекулы белка, как время корреляции макромолекулы и конкретные углы переориентации спин-меток, зависящие от их локального окружения. Для этого использовалась схема анализа спектров ЭПР спин-меченых белков и экспериментальная методика описанная в работах ( 5,6 ) и основанная на модели быстрого анизотропного движения спин-метки относительно макромолекулы белка. В рамках этой модели вводится три динамических параметра >

S и , которые описывают динамические свойства системы.

Для экспериментального определения значений параметров Тв и S макромолекулы РДФ-азы мы использовали зависимости параметров спектров ЭПР от вязкости растворов. В случае изучения субьединиц фермента, когда такая методика неприменима, сравнивали экспериментальные спектры спин-меченых субьединиц с теоретическими спектрами, рассчитанными для различных значений Tg- и S . При этом, время вращательной корреляции макромолекулы дает информацию о кон-формационной подвижности общей структуры белка, а параметр S о локальной структуре белка в районе присоединения спин-метки.

Выполненные экспериментальные исследования показали, что молекула РДФ-азы при связывании с субстратами и активатором ферментативной реакции претерпевает значительные конформационные изменения, коррелирующие с кинетикой активации фермента.

Связывание РДФ-азы с субстратом ( РДФ ) приводит к тому, что макромолекула фермента становится более "рыхлой". В результате, часть спин-меток, вращающихся в эффективном конусе с углом полураствора oi = 25 градусов, начинают вращаться в конусе с углом полураствора d ^ 50 градусов. Это соответствует неактивной конформации фермента ( 15,16,24 ). Связывание РДФ-азы с NC1HCO3 и 2+

М g приводит к совершенно противоположному эффекту. При связыл вании с NaHCO^nMg + структура белка становится "жесткой" и количество спин-меток, вращающихся в конусе с углом полураствора cL = 25 градусов увеличивается по сравнению с исходным состоянием, то есть локальная подвижность полипептидов в непосредственном окружении спин-меток изменяется одновременно с конформацион-ным изменением всей макромолекулы РДФ-азы. Эти экспериментальные данные коррелируют с кинетикой активации фермента, а именно с пе

9 + реходом макромолекулы РДФ-азы при связывании с N a Н С О3 и М gz в активную форму ( 54 ).

Как показало исследование зависимостей параметров спектров ЭПР 2 А,| спин-меченой РДФ-азы от вязкости раствора, время корреляции макромолекулы оказалось равным 400 нсек , что соответствует расчетному времени корреляции по соотношению Стокса-Эйнштейна, а это, в свою очередь, свидетельствует о жесткой структуре макромолекулы.

Измеренное время корреляции больших субьединиц РДФ-азы ( при-i близительно равное 400 нсек ) и исследование взаимодействия больших и малых субьединиц с субстратом, его аналогом и активатором, позволяет сделать заключение, что большие субьединицы в отсутствии малых субьединиц агрегируют и образуют высокомолекулярные конгломераты по размерам близкие к нативному ферменту. Отсюда можно сделать вывод о роли малых субьединиц, как стабилизаторах четвертичной структуры РДФ-азы, а обнаруженное изменение конформации малых субьединиц при взаимодействии с субстратом свидетельствует в пользу предположения о регуляторной роли малых субьединиц в ферментативной реакции ( 66 ).

Избирательная модификация сульфгидрильных групп РДФ-азы спин-меткой, позволила выявить два типа SH -групп, отличающихся по своему белковому окружению. Путем избирательной блокировки SH -групп иминоксильным радикалом с последующим его восстановлением обнаружен факт частичного повторного окисления восстановленных спин-меток за счет белкового окружения. После блокировки, в присутствии субстрата ( РДФ ) и активатора была проведена модификация активного центра РДФ-азы спин-меткой. Оказалось, что при изменении конформации всей макромолекулы РДФ-азы, активный центр претерпевает значительные перестройки. Это в свою очередь вызывает изменения в электронной структуре ^N-0' фрагмента иминоксильного радикала связанного в активном центре фермента. При этом, наблюдается уменьшение константы сверхтонкого расщепления от величины а0 = 17,1 гс до величины 16,0 гс и уменьшение g - фактора на величину Дд = 0,0021. Это вероятно объясняется тем, что при связывании РДФ-азы с РДФ и МдС12 фрагмент спин-метки оказывается в сильном электронно-акцепторном окружении и неспаренный электрон переходит с jTT-связывающей ор-битали на rf -разрыхляющую ( 9 ). Следовательно, это значит, что в данном случае спин-метка выступает в роли субстрата оксигеназной реакции РДФ-азы. Таким образом, при изменении конформа-ции всей макромолекулы фермента, активный центр изменяет свою структуру так, что создаются условия близкие к условиям разрыва

N-0' связи. Такие же эффекты наблюдаются и в том случае, когда в качестве блокирующего S Н -группы реагента использовали

N - этилмалеинимид. Все эти экспериментальные данные показывают, что при изменении конформации всей макромолекулы РДФ-азы происходит сильное изменение конформации её активного центра и имеет место связь между структурой фермента и его функцией.

Для того, чтобы непосредственно из эксперимента определить, характеризующие вращение белка, величины параметров спектров ЭПР спин-меченой РДФ-азы 2АП- 2АМ и 2 Azz - 2 А„ , получали иммобилизованные на неорганических носителях препараты фермента. Оказалось, что при связывании с носителем, угол полураствора эффективного конуса вращения радикала увеличивается приблизительно на 7 градусов по сравнению с белком в растворе. Однако, спектр ЭПР спин-меченого фермента при иммобилизации трансформируется в спектр сильно заторможенной спин-метки. Иммобилизованная РДФ-аза оказалась конформационно стабильной. Это следует из того факта, что при замене окружающей среды от водного буфера до толуола, спектр ЭПР спин-меченой РДФ-азы, иммобилизованной на носителе, претерпевает незначительные изменения.

Иммобилизованные на неорганических носителях препараты РДФ-азы сохранили способность фиксировать углекислый газ, но естественно с меньшей эффективностью. Активность фермента, иммобилизованного на пористом стекле, активированном глутаровым альдегидом, составляла 13 % от активности фермента в растворе. Этот факт, наряду с высокой стабильностью иммобилизованного фермента к изменению окружающей среды, позволил исследовать возможность использования иммобилизованной РДФ-азы в качестве активного элемента системы очистки воздуха от углекислого газа. Как показали результаты этих экспериментов, наилучшей активностью и кинетикой карбок-силазной реакции обладают препараты РДФ-азы иммобилизованной на пористом стекле, активированном глутаровым альдегидом.

Испытания иммобилизованной на этом носителе РДФ-азы на поглощение углекислого газа из воздуха, показали достаточно высокую эффективность поглощения С0<р. При прокачке через реактор атмосферного воздуха ( 0,03 объемных % С0£ ) со скоростью 30 литров в час, поглощалось 20 % углекислого газа.

Система очистки воздуха от С0^ на основе иммобилизованной РДФ-азы имеет ряд важных, на наш взгляд, преимуществ, по сравнению с используемыми системами. Активный элемент системы не расходуется, не нуждается в регенерации и не выделяет при работе токсичных веществ. Испытания этой системы в лабораторных условиях показали, что она работает с практически неизменной эффективностью в течение 12 месяцев. Это дает возможность рекомендовать разработанный способ поглощения С0£ к использованию в качестве подсистемы очистки воздуха в различных устройствах.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата физико-математических наук, Муллокандов, Эдуард Ашерович, Москва

1. Берлинер Л. Метод спиновых меток. Теория и применение. - М.: Мир, 1979. - 639 с.

2. Бучаченко А.Л., Вассерман A.M. Стабильные радикалы. М.: Химия, 1973. - 408 с.

3. Голубев В.А., Розанцев Э.Г., Нейман М.Б. 0. некоторых реакциях свободных иминоксильных радикалов с участием неспаренного электрона. Изв. АН СССР, сер. хим., 1965, № II, с. 1927-1936.

4. Диксон М., Уэбб Э. Ферменты. М.: Мир, 1966. - 816 с.

5. Дудич И.В. Исследование динамических и структурных свойств глобулярных белков методом спиновой метки. Дис. . канд. физ.-мат. наук. - Москва, 1979. - 145 с.

6. Дудич И.В., Тимофеев В.П., Волькенштейн М.В., Мишарин АЛО. Измерение времени вращательной корреляции макромолекул методом ЭПР в случае ковалентно связанной спин-метки. Молекулярная биология, 1977, т. II, с. 685-693.

7. Керрингтон А., Мак-Лечлан Э. Магнитный резонанс и его применение в химии. М.: Мир, 1970. - 447 с.

8. Кузнецов А.Н. Метод спинового зонда. М.: Наука, 1976. -210 с.

9. Ленинджер А. Биохимия. М.: Мир, 1976. - 957 с.

10. Лихтенштейн Г.И. Метод спиновых меток в молекулярной биологии. М.: Наука, 1974. - 256 с.

11. Мишарин А.Ю., Ажаев А.В., Поляновский О.Л. Спин-меченые производные витамина Bg. Изв. АН СССР, сер. хим., 1975, № 5,с. II85-II88.

12. Розанцев Э.Г. Свободные иминоксильные радикалы. М.: Химия, 1970. - 216 с.

13. Романова А.К. Биохимические методы изучения автотрофии у микроорганизмов. М.: Наука, 1980. - 159 с.

14. Торчинский Ю.М. Сульфгидрильные и дисульфидные группы белков.- М.: Наука, 1971. 229 с.

15. Andrews T.J., Badger M.R. and Lorimer G.H. Factors affectinginterconvertion between kinetic forms of ribulose diphosphate carboxylase-oxygenase from spinach. Arch. Biochem. Biophys., 1975, v. 171, p. 93-103.

16. Bahr J.T. and Jensen E.G. Ribulose diphosphate carboxylase from freshly ruptured spinach chloroplasts having in vivo Km(C02). Plant Physiol., 1974, v. 53, p. 39-44'.

17. Baker T.S., Eisenberg D., Eiserling E.A. and Weissman L. The structure of form I crystals of D-ribulose I,5-diphosphate carboxylase. J.Mol. Biol., 1975, v. 91, p. 391-399.

18. Berliner L.J., Wong S.S. Spin labeled sulfonyl fluorides as active site probes of protease structure. Comparison of the active site environments in A-chymotrypsin and trypsin. -J. Biol. Chem., 1974, v. 249, p. 1668-1677.

19. Berliner L.J. Applications of spinlabeling to structure-conformation studies of Enzymes. Prog. Bioorg. Chem., 1975, v. 3, p. 1—80.

20. Berliner L.J. A 6 5 Crystallographyc study of a spin-labeled Inhibitor Complex with Lysozyme. J. Mol. Biol., 1971,v. 61, p. 189-194.

21. Birchmeier W., Wilson K.J. and Christen P. Cytoplasmic Aspartate Aminotransferase: Syncatalytic Sulfhydryl Group Modification. J. Biol. Chem., 1973, v. 248, p. I75I-I759.

22. Branden R. Ribulose I,5-diphosphate carboxylase and oxygenase from green plants are two different enzymes. Biochem. Biophys. Res. Commun., 1978, v. 81, N 2, p. 539-546.

23. Chollet R., Anderson L.L. and Hovsepian L.C. The absence oftightly "bound copper, iron and flavin nucleotide in cristalline ri"bulose 1,5-bisphosphate carboxylase-oxygenase from tobacco. Biochem. Biophys. Res. Commun., 1975, v. 64, p. 97—107.

24. Chu Б.К. and Bassham J.A. Regulation of ribulose 1,5-diphos-phate carboxylase by substrates and other metabolites. Plant Physiol., 1975, v. 55, p. 720-726.

25. Chu Б.К. and Bassham J.A. Activation of ribulose' 1,5-diphos-phate carboxylase by nicotinamide: adenine dinucleotide phosphate and other chloroplast metabolites. Plant Physiol., 1974, v. 54, p. 556-559.

26. Cleland Yf.W. Bithiothreitol, a new protective reagent for sulfhydryl groups. Biochemistry, 1964, v. 3, p. 480—481.

27. Christen R. and Riordan J.P. Syneatalitic Modification of a Functional Tyrosyl Residue in Aspartate Aminotransferase. -Biochemistry, 1970, v. 9, p. 3025-3034.

28. Ellman G.L. Tissue Sulfhydryl Groups. Arch. Biochem. Biophys., 1959, v. 82, N I, p. 70-81.

29. Preiden C. Kinetic aspects of regulation of metabolic processes. The hysteretic enzyme concept. J. Biol. Chem., 1970, v. 245, p. 5788-5799.

30. Preer S.T., Kraut J., Robertus J.В., Wright H.T. and Xuong N.H. Chymotrypsinogen. 2.5 Ang. crystal structure, comparison with A-chymotrypsin and implications for zymogen activation» Biochemistry, 1970, v. 9, p. 1997-2009.

31. Preed J.H., Bruno G.Y., Polnaszek C.F. Electron spin resonance line shapes and saturation in the: slow motional region. —

32. J. Phys. Chem., 1971, v. 75, p. 3385-3399.

33. Gordon G.L.R., Lawlis V.R. and McPadden B.A. 2-Carboxy-D-he xito! 1,6-bisphosphate: an inhibitor of B-ribulose I,5-bisphosphatecarboxylase/oxygenase. Arch. Biochem. Biophys., 1980, v.199, p.400-412.

34. Goldman S.A., Bruno G.V., Polnaszeck C.F. and Freed J.H. Electron spin resonance study of anisotropic rotational reorientation and slow tumbing in liquid and frozen media.- J. Сhem. Phys., 1972, v. 56, p. 716-735.

35. Goldman S.A., Bruno G.V. and Freed J.H. Estimating slow motional rotational correlation times for nitroxides Ъу electron spin resonance. J. Phys. Chem., 1972, v. 76, p. 1858-I860.

36. Green D.W., Ingram V.M. and Perutz M.K. The structure of haemoglobin. IV. Sign determination by the isomorphous replacement method. Proc. Roy. Soc. Lond., 1954, v. 225, N II24,p.287-296.

37. Griffith O.H., Dehlinger P.J. and Van S.P. Shape of the Hydrophobic Barrier of Phospholipid Bilayer (Evidence; for VJater Penetration in Biological Membranes). J. Membrane Biology, 1974, v. 15, p. 159-19:2.

38. Griffith O.H., Cornell D.W. and McConnel H.M. Nitrogen hyper-fine tensor and g-tensor of nitroxide radicals. J. Chem. Phys. 1965, v. 43, p. 2909-2910.

39. Haselkorn R., Fernandez-Moran H., Kieras F.J. and van Bruggen E.F.J. Electron microscopic and biochemical characterization of fraction I protein. Science, 1965, v. 150, p.I598-I60I.

40. Hartman F.C., Welch M.H. and Norton J.L. 3-bromo-2-butanone-I,4-bisphosphate as a affinity label for ribulose bisphosphate carboxylase. Proc. Nat. Acad. Sci. U.S., 1973, v. 70, N 12,p. 3721-3724.

41. Hsia T.C. and Piette L.H. Spin-labeling as a general methods in studing antibody active-site. Arch. Biochem. Biophys.,1969, v. 129, p. 296-307.

42. НиЪЪе1 W.L. and McConnell H.M. Molecular motion in spin labeled phospholipids and membranes. J. Am. Chem. Soc., 1971, v. 93, p. 314-326.

43. Jensen R.G., and Bahr J.T. Ribulose I,5-bisphosphate carboxylase-oxygenase. Ann. Rev. of Plant Physiology, 1977, v. 28, p. 379-400.

44. Kawashima N. Comparative studies on fraction I protein from spinach and tobacco leaves. Plant and Cell Physiol», I969-, v. 10, p. 31-40.

45. Kawashima N. and Wildman S.G. Fraction I protein. Ann. Rev. of Plant Physiology, 1970, v. 21, p. 325-358.

46. Kornberg R.D. and McConnell H.M. Inside-outside transitions of phospholipids in vesicle membranes. Biochemistry, 1971, v. 10, p. IIII-II20.

47. Kung S.D. Tobacco fraction I protein: A unique genetic marker.- Science, 1976, v. 191, p. 429-434.

48. Kuznetsov A.N., Wasserman A.M., Volkov A.U. and Korst N.M. Determination of rotational correlation time of nitric oxide; radicals in a viscous medium. Chem. Phys.Lett., 1971, v. 12, p. 103-106.

49. Lawlis V.B. and McFadden B.A. Modification of ribulose bispho-sphate carboxylase by 2,3-butadion. Biochem. Biophys. Res. Commun., 1978, v. 80, p. 580-585.

50. Laskowsky M. Mesurement of accessibility of protein chromopho-res by solvent perturbation of their ultraviolet spectra.- Fed. Proc., 1966, v. 25, p. 20-27.

51. Lee; J.C., Frigon R.P., Hirsh J., Thomas J. and Timasheff S.N. Mechanism of protein stabilization by sucrose. Fed. Proc.,1973, v. 32, p. 4961973, v. 32, p. 496-499.

52. Libert ini L.J. and Griffith O.H. Orientation dependence of the the electron spin resonance of di-tret-butylnitroxide .

53. J. Ghem. Phys., 1970, v. 53, p. 1359-1367.

54. Livshits V.A. Slow anisotropic tumbling in the ESR spectra of nitroxyl radicals. J. Magn. Res., 1976, v. 24, p.307-313.

55. Lorimer G.H. and Miziorko H.M. Carbamate formation on the-aminogroup of a lysyl residue as the basis for the acti2+vation of ribulosebisphosphate carboxylase by COg and Mg .- Biochemistry, 1980, v. 19, p. 5321-5328.

56. Lorimer G.H., Badger M.R. and Andrews T.J. The activation of ribulose If 5-bisphosphate carboxylase by carbon dioxide' and magnesium ions. Ibid., 1976, v. 15, p. 529-536.

57. Mason R. and Freed J.H. Estimating microsecond rotational correlation times from lifetime broadening of nitroxide electron spin resonance spectra near the rigid limit. — J. Phys. Chem., 1974, v. 78, p. 1321-1323'.

58. McFadden B.A. and Tabita P.R. D-ribulose I,5-diphosphate carboxylase and the evolution of autotrophy. Biosystems, 1974, v. 6, P. 93-112.

59. McConne11 H.M. and McFarland B.G. Physics and chemistry of Spin Labelis. — Quart. Rev. Biophys., 1970, v. 3, N I,p. 91-136.

60. McCalley R.C., Shimshick E.F. and McConnell H.M. Effect of slow rotational motion on paramagnetic resonance spectra.- Ghem. Phys. Lett., 1972, v. 13, p. II5-II9*

61. Zaborsky 0. Immobilized Enzymes. Cleveland, Ohio : GRS Press. 1973, - 232 p.

62. Miziorko Н.М. and Mildvan А.С. Electron Paramagnetic reso1. T ТЯnance, H, and С Nuclear Magnetic Resonance Studies of the Interaction of Manganese and Bicarbonate with Ribulose I,5-Diphosphate Carboxylase. J. Biol. Chera., 1974, v. 249, p. 2743-2750.

63. Morriset J.D. and Broomfield G.A. Comparative study of spin labeled serine enzymes. Acetyl cholin esterase, trypsin, A-chymotrypsin, elastase and subtilisin. J. Biol. Chem», 1972, v. 247, p. 7224-7231.

64. Morriset; J.D* and Broomfield C.A. Active site spin labeled A-Chymotrypsin. Guanidine hydro chloride denaturation studies using electron para magnetic resonance and circular dichroism. J. Am. Chem. Soo., 1971, v. 93, p. 7297-7304.

65. Morriset J.B. and Brott H.R. Oxydation of the sulfhydryland disulfide groups by the nitroxyl radical. J. Biol.Chem,, 1969, v» 244, p. 5083-5084.

66. Nishimura M. and Akazawa T. Puther proof for the catalitic role of the larger subuni.fr in the spinach leaf ribulose 1,5-diphosphate carboxylase, Biochem. Biophys. Res. Commun,,1973, v. 54, p. 842-848.

67. Nishimura M. and Akazawa T. Re constitution of spinach ribulose I,5-diphosphate carboxylase from separated subunits.- Biochem. Biophys. Res. Commun., 1974, v. 59, p. 584-590.

68. Ogren W.L. and Bowes G. Ribulose diphosphate carboxylase regulates soybean photorespiration. Nature, 1971, v. 230,p. 159-160.

69. Paech C., Ryan P.J. and Tolbert N.E. Essential primary amino groups of ribulose bisphosphate carboxylase/oxygenase indicated by reaction with pyridoxal-5'-phosphate. Arch. Biochem. Biophys., 1977, v. 179, p. 279-288.

70. Paulsen J.M. and Lane M.D. Spinach ribulose diphosphate carboxylase. I. Purification and properties of the enzyme.: -Biochemistry, 1966, v. 5, p. 2350-2357.

71. Polnaszek G.F., Bruno G.Y. and Freed J.H. Electron spin resonance line shapes in the slow motional region. Anisotropic liquids-. J. Chem. Phys., 1973, v. 58, p. 3185-3199).

72. Polgar L. and Bender M.L. Reactivity of thiol-subtilisin, enzyme containing a synthetic functional group. Biochemistry, 1967, v. 6, p. 610-620.

73. Robinson P.D. and Tabita F.R. Modification of ribulose bis-phosphate carboxylase from Rhodospirillum rubrum with tetra-nitromethane. Biochem. Biophys. Res. Commun., 1979, v. 88, p. 85-91.

74. Rosen G.M. and Rauchman E.J. Formation and reduction of nit-roxide radical by liver microsomes. Biochem. Pharmacol., 1977, v. 26, p. 675-678.

75. Rutner A.C. and Lane M.D. Nonidentical subunits of ribulose diphosphate carboxylase. Biochem. Biophys. Res. Commun.,1967, v. 28, p. 531-537.

76. Saluia A. and McFadden B.A. Modification of histidine at the active site of spinach ribulose diphosphate carboxylase. -Biochem. Biophys. Res. Gommun., 1980, v. 94, p. Ю91-Ю97.

77. Saluia A. and McFadden B. Inhibition of ribulose bisphosphate carboxylase/oxygenase by sedoheptulose-I,7-bisphosphate. -FEBS Latt., 1978, v. 96, p. 361-363.

78. Schloss 1.У. and Hartman P.O. Reaction of ribulose bisphosphate carboxylase from Rhodospirillum rubrum with the potential affinity label 3-bromo-I,4-dihydroxy-2-butanone 1,4-bisphosphate. Biochem. Biophys. Res. Commun., 1977, v. 75, p. 320-328.

79. Shapira J., Wanson C.L. and Lyding J-M. Properties of Ribulose Diphosphate Carboxylase Immobilized on Porous Glass. -Biotechnology and Bioengineering, 1974, v. 16, p.I507-I5I6.

80. Siege 1 M.J. and Lane M.D. Interaction of Ribulose diphosphate carboxylase with 2-carboxyribitol diphosphate, an analoque of the; proposed carboxylated intermediate in the C02 fixation reaction. Biochem. Biophys. Res. Commun., 1972, v. 48, p. 508-516.

81. Smith J.C.R. Study of the conformational properties of bovine pancreatic ribo nuclease a by electron paramagnetic resonance. Biochemistry, 1968, v. 7, p. 745-757.

82. Stier A. and SackmanE. Spin-labels as enzyme substrates.

83. Heterogenous lipid distribution in liver microsomal membranes. Biochim. Biophys. Acta, 1973, v.311, p. 400-408.

84. Stier A. and Reitz I. Radical production in amine oxidation by liver microsomes. Xe;nobiotica, 1971, v.I, p.499-500.

85. Sugiyama T. and Akazawa T» Structure and function of chloroplast proteins. I. Subunit structure of wheat fraction I protein. J. Biochem., 1967, v. 62, p. 474-482.

86. Tabita P.P. and McPadden B.A. B-ribulose I,5-diphosphate carboxylase from Rhodospirillum rubrum. II. Quarternary structure, compasition, catalitic and immunological properties. J. Biol. Chem., 1974, v. 249, p. 3459-3464.

87. Tabita P.P., McPadden B.A. and Pfenning N. B-ribulose 1,5-diphosphate carboxylase in Chlorobium thiosulfatophilum Tas-sajard. Biochim. Biophys. Acta, 1974, v.341, p.187-19'4.

88. Takabe T. and Akazawa T. Molecular evolution of ribulose I,5-bisphosphate carboxylase. Plant Cell Physiol., 1975, v. 16, p. 1049-1050.

89. Tanford C.J., Buckley C.E. and De P.K. Effect of ethylene glycol on the conformation of A-globulin and B-lactoglobu-lin. J. Biol. Chem., 1962, v. 237, p. II68-II7I.

90. Timofeev V.P., Dudich I.V., Sykulev Y.K. and Ifezlin R.S. Rotational correlation times of Ig G and its fragments spin-labeled at carbohydrate or protein moieties. PEBS Lett.,1978, v. 89, p. I9I-I95.

91. Weissbach A., Horecker B.L. and Hurwitz I. The enzymatic formation of phosphoglyceric acid from ribulose diphosphate and carbon dioxide. J. Biol. Chem., 1956, v. 218, p.795-810.

92. Weber G. Polarization of the Fluorescence of labelled Protein Molecules. Discuss. Faraday Soc., 1953, N13, p. 33-39.

93. Wildman S.G. and Bonner I. The properties of green leaves.

94. Isolation, enzymic properties and auxin content of spinach cytoplasmic proteins. Arch. Biochem., 1947, v.14, p.381-413.

95. Wishnick M., Lane M.D., Scrutton M.C. and Mildvan A.S. The;presence of tightly bound copper in ribulose diphosphate carboxylase from spinach. J. Biol. Chem., 1969, v. 244, p.5761-5763.

96. Wishnick M., Lane M.D. and Scrutton M.C. The interaction of metall ions with ribulose I,5-diphosphate carboxylase from spinach. J. Biol. Chem., 1970, v. 245, p. 4939-4947.

97. Wildner G.F. and Henkel J. The effect of divalent metal ions on the activity of Mg depleted ribulose I,5-bisphosphate oxygenase. Planta, 1979, v.146, p. 223-228.

98. Willan K.J., Marsh D„,Sunderland C.S., Sutton B.J., Wain

99. Hobson S., Dwek R.A. and Givolt B. Comparison of the dimensions of the combining sites of the di-nitrophenyl-bin-ding immunoglobulin A myeloma proteins MOPC 315, MOPC 4:60 and XRPC 25 by spin-label mapping. Biochem. J., 1977, v. 165, p. 199-206.

100. Withman J.K., Edelman C.M. and Wettman J.K. Fluorescence polarization of human gamma G—immunoglobulins. Biochemistry, 1967, v. 6, p. 1437-1447.

101. Y/hitman Y/.B. and Tabita F.R. Modification of Rhodospirillum rubrum ribulose bisphosphate carboxylase with pyridoxal phosphate. 2. Stoichiometry and kinetics of inactivation. Biochemistry, 1978, v. 17, p. 1282-1287.