Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Спин-решеточная релаксация радикалов в исследовании структуры биологических систем

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Спин-решеточная релаксация радикалов в исследовании структуры биологических систем"

г

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА, ОРДЕНА ОКТЯБРЬСКОЙ / РЕВОЛЮЦИИ И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им. М. В. ЛОМОНОСОВА

БИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ ~

На правах рукописи

КУЛИКОВ Александр Васильевич

УДК 577.366

СПИН-РЕШЕТОЧНАЯ РЕЛАКСАЦИЯ РАДИКАЛОВ В ИССЛЕДОВАНИИ СТРУКТУРЫ БИОЛОГИЧЕСКИХ

СИСТЕМ

03.00.02 — Биофизика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора физико-математических наук

Москва 1989

Работа выполнена в Отделении ордена Ленина Института химической физики АН СССР.

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор Я. С. Лебедев,

доктор биологических наук, профессор А. А. Кононенко, доктор физико-математических наук, профессор Э. К. Рууге

Ведущая организация: Институт фотобиологии АН БССР

Защита состоится «_,» „_ 1989 г. в _час.

на заседании Специализированного Совета Д 053.05.53 по биофизике при Московском государственном университете им. М. В. Ломоносова по адресу: 117234,Москва, Ленинские горы, МГУ, биологический факультет.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ.

Автореферат разослан «--» - 198 г.

Ученый секретарь Специализированного совета

доктор биологических наук Т. Е. Кренделева

© Московский государственный университет им. М. В. Ломоносова

Актуальность темы» Изучение механизма действия биологических систем на субклеточном уровне невозможно без исследования их строения. Выявление активных центров и функциональных групп, определение расстояний меиду ними, изучение локализации этих центров относительно водной фазы или поверхности мембраны, оценка степени экранирования активных центров белковыми группами и т.п. является необходимым этапом исследования биологических систем. Например, в таких биологических системах, как фотосистема П растений, реакционные центры фотооинтезирующих бактерий, монооксигеназная система микросом, система энергетического сопряжения гидролиза АТФ и восстановления азота в нитрогеназе, важную роль играют процессы электронного переноса. Направление и скорость переноса критически зависят от расстояния между центрами переноса. Если перенос электрона происходит между белками е водной фазе, скорость переноса существенно зависит от стерических факторов активных центров. Если в процессе переноса электрона принимают участие мембранно-связанные белки, важно знать локализацию активных центров относительно поверхности мембраны, Определение геометрических параметров исследуемых объектов является решающим фактором при постулировании тех или иных механизмов действия.

Для исследования строения биологических объектов используются различные методы, отличающиеся по точности, трудоемкости, характеру измеряемых величин и области применения (электронная микроскопия, рентгеноструктурный анализ, ЕХАГЗ , ЯМР, ЭЛР и т.п.). В настоящее время метод ЭПР обладает самой широкой областью применения* от макромолекул до целых клеток и организмов. Сравнительно небольшое число парамагнитных центров (ПЦ) в биологических объектах облег« чает интерпретацию спектров» Введение в биообъекты спиио-вых метзк и парамагнитных ионов позволяет исследовать биообъекты, не содержащие собственные парамагнитные центры, .

Однако обычный, широко распространенней вариант метола ЭПР, основанный яа регистрации формы линии * слабых СВЧ полях, позволяет в лучшем случае определять расстояния между парамагнитными центрами не более 2-3 нм, чтч мяяпста»-

/

точно для исследования большинства белков, тем более надмолекулярных структур. Кроме того, отсутствуют методы определения глубины погружения и стерических факторов парамагнитных центров и других геометрических параметров. Это обстоятельство существенно ограничивает возможности метода ШР в изучении биологических систем.

Целью работы является создание теоретических и экспериментальных основ метода исследования строения биологических систем, основанного на использовании явления спин-решето :но£ релаксации радикалов, и последовательное применение этого метода для исследования структурно-функциональных связей в биологических системах, играющих вах-шую роль в функционировании организмов: фотосистема П растений, реакционные центры фотосинтезирущих бактерий, монооксигеназная систег,а макросом, ферменты шггрогеназа и миозин.

Научная новизна. Созданы теоретические и экспериментальные основы комплекса методов исследования строения биологических систем, основанных на использовании явления. . спин-решеточной релаксации радикалов и достаточно простых для их осуществления на серийных радиоспектрометрах. Эти методы впервые позволяют в рамках метода ШР определять расстояния меаду радикалами и ПЦ до 10 нм, глубшу погружения радикалов в биологические матрицы до 4 нм, диаметры микрофкбрнлл ц глобулярных белков, стерические факторы бел-■ ков с парамагнитным активным центром, детектировать молекулярный кислород в мембранах.

В фотосистеме П из листьев.гороха впервые определены расстояния мевду марганец-содержалдаы центром разложения воды и динаром хлорофилла Р680 и феофитином Фф, глубины погружения Ре80 , Фф и промежуточного донора г , доказано кластерное строение марганец-содеряащего центра.

' В реакционных центрах из Н.гиЪгша впервые определены ' расстояния мевду димером бактериохлорофшша и первичным акцептором (комплексом железа о убихинойом) и глубина погружения Рдгду в изолированных реакционных центрах и в

Хроматофорах. На основе получении* и литературных данных предложена схема строения реакционных центров. Предложен механизм фоторазделения зарядов в результате серии туннельных' прыжков между центрами переноса.

В молекуле миозина впервые определены расстояния между 5Н-группой класса и центрами связывания АТФ и ионов двухвалентных металлов. На основе большой величины этих расстояний выдвинуты представления об аллостерическом характере взаимного влияния этих центров и ЭН-групп.

Впервые экспериментально определена локализация гема цитохрома Р-450 в микросомальных мембранах относительно водной и пипидной фаз. На основе полученных и литературных данных конкретизированы пути переноса электрона между компонентами монооксигеназной системы.

При исследовании нитрогеназы впервые показано, что АТФ-азный центр расположен рядом с железо-серными кластерами, что подтверждает гипотезу о принудительном протонирова-нии этих кластеров в процессе работы нитрогеназы. Показано, что сверхвосстановленное состояние нитрогеназы можно получить с помощьи сольватированных электронов, н что в качестве белковых лигандов кофактора могут выступать ЭН-группы, и что изломы на аррениусовских зависимостях для скорости выделения аммиака и водорода обусловлены конформвционным переходом в нитрогеназе при 19°С.

Практическая ценность работы. Разработанный комплекс методов существенно расширяет возможности метода ЭПР в изучении строения биологических систем на субклеточном уровне. Эти методы могут быть использояанн при исследовании самого широкого круга биологических объектов, от макромппекуп до сложных надмолекулярных образований. Результаты, полученное при исследовании конкретных биопогических систем, способ-ствуит установление их механизма действия и могут бчть использованы при создании новых промышленных кятапиззюров . твких процессор, как взотфиксация, окисление у ''лпводпрплоя', фотораэложение годы и фоторазделение зарядов.

Апробация работы. Материалы диссертации локчвлчролиоь на 1У Международном биофизическом конгррг.се (Моок^ч, Г97?).

XI Европейском конгрессе по молекулярной спектроскопии (Таллин, 1973), Всесоюзном симпозиуме " Биофизика и биохимия мышц" (Тбилиси, 1974), Советско-американском симпозиуме по химии и физике белка (Рига, 1976), XX Амперовском конгрессе (Таллин, 1978), 1У Специализировались: Амперовском коллоквиуме (Лейпциг, 1979), Симпозиуме по нитроксильным радикалам (Венгрия, 1979), Всесоюзных совещаниях "Современные методы ЯМР и ЭПР б химии твердого тела" (Черноголовка, 1979,1981), Всесоюзных симпозиумах "Магнитный резонанс в б.-ологии и медицине" (Звенигород, 1977,1981,1984, Одесса, 1986), Всесоюзной конференции по нитроксильным радикалам (Черноголовка, 1982), I Всесоюзном биофизическом съезде (Москва, 1982), Всесоюзной школе по магнитному резонансу (Кобулети, 1985), Всесоюзной конференции "Цитохром Р-450 и охрана окружающей среды'ЧНовосибирск, 1987), Международном симпозиуме "Химическая физика ферменгативного катализа" (Таллин, 1987) , и других конференциях и симпозиумах.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 31 печатная работа.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, литературного обзора, методической главы, восьми глав с изложением экспериментальных данных и их обсуждением, заключения, выводов и списка цитируемой литературы из 325 названий. Диссертация включает также список принятых обозначений, формулы и обозначения используемых нитроксиль-■ных радикалов и три приложения. Диссертация изложена на 250 страницах машинописного текста, содержит ИЗ рисунков и 33 таблицы.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ . Во введении обоснована актуальность темы, изложена структура диссертации по главам. Во введении отмечено, что большая чувствительность времени опин-решеточной релаксации радикалов Tj по сравнению с временем спин-спиновой релаксации. Tg объясняется тем, что в случае заторможенного вращения радикалов ( замороженные растворы и вязкие среды)

- 4 -

j

cn-r

I/Tj<< 1/1g , а различные взаимодействия (спиновый обман, диполь-диполь но а взаимодействие я т.п.) вносят приблизи-тально одинаковые вклады в I/Tj и l/T2 : I/Tj = I/Ij +. + Aj , I/T2 = I/Tg + Д2 . Здесь индекс "о" указывает иа отстутствие взаимодействия.

В автореферате использованы следующие обозначения игроке ильных радикалов: о

R-OH Ог.ц£)-ОН С17 C17H35-G-0-^^Ni0

н=о i сн3-(сн2)т^-(он2)п_сгон

. х-ч 9 Pi0 о

0-1ТГ^>-СИ О 1-f-

го-с-(сн2)14-сн3

l сн3-(сн2)3-0-(сг12)12-с-0-| +

f° Lo-rar(gii2)2-h-.cgh3)3

Ш - R - спинмеченая АТЗ>, ЙАА-R , M-R , ЙА-R и ПЫБ-R -соответственно метки на основе иодацетамида, мальимада, йодатцетата и парахломеркурийбензоата.

I. СПИНОВАЯ РЕЛАКСАЦИЯ ЩТРОКСШЬШХ РАДИКАЛОВ В РАСТВОРАХ И СТЕКЛАХ, (ли.обзор)

В этой главе рассмотрены экспериментальные методы исследования спиновой релаксации, их преимущества и недостатки , а также факторы, влияющие на процессы спиновой релаксации и механизмы спиновой релаксации. В конце главы рассмотрено использованйе явления спиновой релаксации для исследования структуры и динамики физико-химических и биологических систем. 3 этой главе для полноты кратко приведены й собственные результаты.

Импульсные методы (импульсное насыщение и особенно спиновое эхо) гораздо более информативны, чем различные варианты метода непрерывного насыщения (НН), однако реализация преимуществ импульсных методов в физико-химических и биологических 'экспериментах часто невозможна по ряду технических причин (недоступность импульсной техники, малая чувствительность и т.п.). Для практических целей наибольший интерес '

ч

представляют методы огадионарного насыщения, т.к. эта эксперименты можно проводить на серийных радиоспектрометрах о большой чувствительностью в более широком диапазона величин Тд- в Т^. В ю же время стационарные метода достаточны грубы, т.к. необходимо принимать некоторые предположзния, например, допускать справедливость модели невзаимодействующих - блоховских пакетов. По нашему мнению, в настоящее время врв исследовании биологических систем наиболее плодотворен > метод НН с контролем, где это возможно, импульсными методами. Именно такой подход осуществляется в данной работе.

П. МЕТОДИКА ИЗМЕРЕНИЙ МЕТОДОМ ЭПР

В этой главе изложены споообы определения относительных в абсолютных значений амплитуды СВЧ поля в резонаторе Нр а также требования к размерам образид и его расположению в резонаторе при регистрации кривых насыщения - зависимостей амплитуды сигнала ЭНР от Нр Приведены значения % для использованиих в работе радиоспектрометров: ШР-2, ЭДР-З ("Сибирь") и Вариан В-104А. В этой главе изложены также способы стабилизации температуры образца в диапазоне 10-200 К и 90250 К и -100 ~ +Ю0°С. Биохимические методики, относящиеся " к конкретным биосистемам, даны в соответствующих разделах.

Ш. СПИНОВАЯ РЕЯАКСАЦИЯ ЗАСТШОВШШХ. РАСТВОРОВ . . НЙТРОКСЙЯОВ И ПАРАМАГНИТНЫХ ИОНОВ

Исследование модельных систем - застеклованных растворов радикалов и парамагнитных ионов - является важным этапом •' в использовании спин-решеточной релаксации радикалов для изучения биосистем. Во-первых, сравнительно большая концентрация радикалов в модельных системах позволяет применять различные метода определения величин Т^ и Т2 и проверить, таким образом, точность определения отих величин методом.НН, Во-вторых, исследование модельных систем пЯшоляет получить некоторые параметры ионов, которые необходимо знать при изучении био-свстем.

В данной главе опин-решеточная и спин-спиновая релаксация эаморояенных растворов нитрокоилов исследуется мето-

М £

дами НН, июульсного насыщения и спинового эха. Измерения методом импульсного насыщения проведены совместно с С.Н.Саф-ройовым, В.Г.Чередынцевым и З.И.Ыуромцевим (НШКш им. Л.Я. Карпова, Москва), методом спинового эха - совместно о А.Д. Миловш (ИХКиГ, Новосибирск).

При определении величин Т^ и Т^ методом Ш1 применялся алгоритм, предложенный Сафронсвшл, Муромцевым и' др. для случая неоднородноуширенной линии и быстрого прохождения. Кривая насыщения центрального сигнала ШР нитроксила характеризовалась двумя параметрами Ы^ и Н^* - величинами Нр при которых амплитуда сигнала ШР равна половине максимальной. Зная ширину центральной компоненты, параметры Н^ и = Нр/Н| >1, с помощью таблиц мочено определить величину и ширину спин-пакета ДН^!/^'.!^, где £-гиромагнитное отношение. В диапазоне температур 10-120 К величины Тр полученные методом НН, отличаются от величин Тр полученных методом импульсного насыщения, не более чем на 30$. Отличия величин Т21 полученных методами НН, и спинового эха, могут достигать трех раз. В данной работе величина Т2 не используется для определения расстояний, за исключением случая гемоглобина, где были полученые разумные значения расстояний.

Для застеклованных растворов нитроксилов при 77к Т-^ Ю-4 с, Т^^КУ"6 с. Спин-решеточная релаксация нитроксилов при 10-120 К вызывается ориентациошшми колебаниями радикала как целого, которые модулируют анизотропные члены сверх-тоикого взаимодействия неспаренного электрона с ядром азота. Спян-спиновая релаксация нитроксилов в значительной мере вызывается взаимодействием с протонами растворителя.

Перейдем к рассмотрению влияния диполь-дшолького взаимодействия между нитроксилами и парамагнитными Ионами(Щ) на релаксационное свойства нитроксилов. Взаимодействия налу радикалами и ПИ можно разделить на четыре типа: взаимодействия радикалов друг с другом в паре и объеме и взаимодействия 'радикалов' с ИИ в паре и объеме. В отличие от пар (бирадикалы, спин-меченые белки), в объеме (застеклованные ■ растворы радикалов и ГШ) имеется набор расстояний между па-

_ 7 _ '

рамагнитныш центрами. Было показано, что параметр Н| для трех типов взаимодействий, за исключением парных взаимодей-, ствик радикала с радикалом, более чувствителен, чем параметры форш линии. Так, феррицканпд ршия не влияет на параметр формы линии ¡IIP cij/o(, отношение сумш ашлигуд крайних пиков к амплитуде центрального, датаз при концентрации I М, в , •' то время как заметное изменение параметра н| наблюдается уже при концентрации Ю-3 ГЛ. В случае взаимодействия радикалов з паре относительные изменения параметров К* и d-^/d

■ приблизительно равны.

Зависимости параметра кривой насыщения cj, от расстояния различны для разных типов взаимодействия. При уменьше-

■ шш расстояния параметр уменьшается в случае взаимодействия радикал-радикал в объеме, увеличивается в случае взаимодействия радикал ИИ в объеме и практически не изменяется в случае бирадшаиюв и в большинстве случаев парных взаимо. действий радикал НИ. В принципе одновременное измерение параметров dj/d, , Нт и CJ, позволяет установить, если это не известно заранее, тип взаимодействия.

Ь случае взаимодействия радикалов в паре дошоль-диполь-ное взаимодействие модулируется тепловыми колебаниями решетки. В- случае взаимодействия радикалов в объеме проявляется, . вероятно, спиновая диффузия в объеме. Наиболее прост случай

■ парного взаимодействия радикал-ИИ. Парамагнитный ион влияет На спиа-решеточнув и спин-спиновую релаксацию радикала через диполь-дкпрлыюе взаимодействие, которое модулируется

•■ спин-решеточной релаксацией ионов. Несколько сложнее случай взаимодействия радикалов и ПИ в объеме. В.отом случае увеличение параметра CJ, при уменьшении среднего расстояния между радикалами и Ш объясняется тем, что имеется распределение величин Tj радикалов вследствие хаотичного расположения ра-.дик'алов и ионоз друг относительно друга. Вследствие этого

■ наблвдаеше кривые насыщения спектра 2ПР нитроксила представляют-собой' сумму кривых насыщения, сдвинутых на различ-

' ' шё-величины по отношению к кривой насыщения в отсутствии - ПИ, Такое суммирование кривых насыщения было проведено с ' ." ' - 8 -

\

помощью ЭВМ. Сравнение теоретических и экспериментальных кривых насыщения, позволило определить дая рада ПИ их радиус г»£ , а также параметр с£ . Если иска релаксируют быстро, так что их время сиин-решеточной релаксации меньше обратной ларморовской частоты (^ИТ*11 с), величина определяется выражением: .

, сиРс-1/2 (I)

где ¿X ъ <Ъ - соответственно магнитный момент и время спин-решеточной релаксации ПИ. Величины е*. и /"2 Д®? РОДа 2И» используемых в дальнейшем при исследования биологических систем, приведены в таблице I.

Таблица I

Величины (А и для различных парамагнетиков при 77 К

Парамагнетик Растворитель см3«-1/2 +20% п нм +Ш

Со(АА)2.2Н20 этанол 0,5 0,6

^1*С12-6Н20 этанол 0,6 о.э

СоС12'6Н20 глицерин-вода (1:1) 1,0 1,1

этанол 1,2 1,0

цысы )6 глицерин-вода (1:1) 1,3 1,0

Со(ЕДТА)2 0,9 1.1

М(ВДТА)2 0,2 0,8

Ре2Сов1у е 2,5 1,4

АА - адатилацетонат,а1у -глицин 1

1У. СПИНОВАЯ РЕЛАКСАЦИЙ РАСТВОРОВ НКТР0КС11Л0В И ПАРАМАГНИТНЫХ ИОКОВ Линия ШР растворов нитроксилов неоднородно уширена за счет СТВ неспаренного электрона с протонами нитроксилыюго кольца. В случае заторможенного вращения радикалов» харакг терного для большинства спин-мечекнх биообъектов, кследст-

- 9 -

вне большой ширины спин-пакета степень неоднородности мала, В связи с З'гш/. в большинстве случаев величины Tj и Т2 определялись следующим "гибридным" способом. При определении ширины спин-пакета ДНд и величины Tg линия SP считается неоднородно-уширенной. Ширина спин-пакета определялась либо сравнением экспериментальных спектров с теоретическими, рас-■ считанными на Л1.:.; по известны;,: константам СТО от протонов кольца, либо по формуле, предложенной Добряковж и Лебедевым для свертки лоренцввой к гауссовой линии. При определение. величины Tj линия считается однородно-уширенной, и величину Т- определяли по формуле, справедливой в случае кед-ленного прохоздения:.

Tj » 1/23,87 f'i2 (iif)2 (2)

Проверка "гибридного" способа определения Tj была осуществлена на примере радикалов К-ОК и В=0, растворенных во втор-бутидбензоле при температурах -oü - +3t>°C. Величины Tj, полученные таким способом, отличамтся от величин Tj, полученных Персивалем и Хайдом метбдом импульсного насыщения, в 1,5 - 2,5 раза, ¿so различие, с точностью 30;», объясняется влиянием спиновой релаксации ядер азота нитроксила, т.к. в отличие от метода Щ метод импульсного насыщения дает "истинные величины времени спин-решеточной релаксации Tje. Согласно теории, величины Tj и Tje -для центральной компоненты связаны следующими соотношениями : ; ..;

' 4 ± i+3 6 ...

1 Tj'Tie <3)

• где ¿t)n=2,7'llß с"* , TTr -время корреляции вращательной

• диффузии нитроксила.

В умеренно-вязких растворах Tj«vI0"*7 с, Tg'WO-8 0 , ' причем при затормаживании вращения радикала величина Tj ' увеличивается, а величина Т2 уменьшается. Модуляция анизо-

v" ; - w - :

тропных членов СТВ вращением и спиновый обмен являвгея

главными механизмами спиновой оелаксаши. >

Вследствие эффектов ядерной релаксации спиновый обмен радикалов друг с другом а спиновый обмен радикалов с III! отличаются. В вязких средах, когда эффект ядерной релаксации наиболее силен, спиновый обмен радикалов друг с другом практически не влияет на величину Тр Метод НН особенно эффективен при изучении спинового обмена нитроксилов с Ш1 в вязких средах, уменьшая более чем на порядок концентрацию ПИ, с которой начинает обнаруживаться спиновый обмен. В этом случае справедливы формулы:

Кеэ|ф = I I 368 Ке (6)

где Ке и КеЭфф ~ истиная и эффективная константы спинового обмена, С - концентрация ПИ. Формула (6) была проверена в опытах по спиновому обмену нитроксила с феррицианидом в средах с различной вязкостью.

У. ИССЛЕДОВАНИЕ СТРОЕНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИХ СИСТЕМ МЕТОДОМ

НЕПРЕРЫВНОГО НАСЫЩЕНИЯ СПЕКТРОВ ШР СПИНОВЫХ МЕТОК . И 2СНД0В

Эта глава в значительной мере косит методический характер. На примере биообъектов с известной структурой путем сравнения результатов, полученных различными методами, проверяются возможности метода НН в определении геометрических и динёшических характеристик биообъектов.

Методы определения расстояния между радикалом и ПИ в паре проверялись на примере спин-меченого гемоглобина человека. Две симметричные /3-93 ЭН-группн гемоглобина модифицировались метками на основе йодацеташада (11АА-Ю, йодацв-тата (ЙА-Й), мальимцца (1Л—В) и парахлормеркуркйбензоата ШХМБ-Ю. Измерение расстояний основано на определении величины магнитного диполь-дипольного взаимодействия между "

- II - .

спинаш метки и гема. Для определения величины этого взаимодействия необходимо иметь два образца-с взаимодействием и без взаимодействия. В оксигемоглобине гем находится в диамагнитном состоянш!, и, взаимодействие отсутствует. Измерения проводили в замороженных растворах, чтобы исключить усредняющее действие молекулярного движения. Результаты измерений расстояний шестью способами приведены в таблице 2.

Таблица 2

Расстояния мезду спинами ¡жтки и гема в гемоглобине, полученные различными'методами

Метка .Метод ,

д2 тех

Расстояние, X

ЙАА-В ЙА-Н Я-В. ШБ-Н > 13,6 17,0+1,1 15,2+1,1 16,5+2,0 13,7+0,4 15,1+1,2 15,2+1,2 15,1+1,2 Ь 15,2 15,9+0,0 15,2+0,8 16,8+1,1 17,3+1,0 17,1+1,5 15,1+1,5 20,2+1,1 18,6+0,£ 16,3+0,5 17,3+0,?

.Первые четыре способа основаны на измерении вкладов диполь-дипольного взаимодействия между ¡летками и гемом в скорости спин-решеточной (Д|) и спин-спиновойСДрелаксации. Согласно теоретически!,; вычислениям, эти вклады (после Усреднения по различным ориентация*-! молекулы гемоглобина относительно внешнего магнитного поля) имеют вид:

л ¿/»У Г ъ . зг , , 6 у 1 /7ч Г 15Н! 1+{и+и0)2Хг}

где ¿л. и ¿0 -магнитный момент, время спин-решеточной ре. лаксации и резонансная частота -резонансная частота радикала, Ц -гиромагнитное отношение. Предполагается, что

- 12 -

времена спин-решеточной и спин-спиновой релаксация ПИ равны. Формулы (7) и (8) справедливы при условии л*****/*-6*!.

Для вычислений расстояний по формулам (7) и (8) необходило знать величины а , Т и 10 . При измерении расстояний по величинам Д ^ а "2 использовался фторид ферригемоглобина, для которого /< =5,8/<^, а величины М и Т южно оценить по ф -фактору и ширине линии ЭПР гема. Измерения в этом случае проводились при 77 К.

. Во многих случаях, однако, величина 7Г неизвестны. В этих случаях ьшио применять следующий общий подход, основанный на измерении величины Д ^ в широком температурном диапазоне. При изменении температуры величина Т также изменяется; согласно формуле (7), если Цо-Ыа!«Шо , величина Д £ имеет максимум при '

По величине этого максимума мокно определить Г" , не зная величины ?Г .

Такой подход был применен к цианиду ферригемоглобина, модифицированного меткой ЙАА-И , и был обнаружен максимум велич1шы Д^- при 80 К.

Имеется еще одна интересная возможность определения расстояния'Г" , не знал величины Т . Для фторида ферригемоглобина при 77 К выполняется условие ; при этом условии из формул (7) и (8) следует, что произведение Д не зависит от .

В двух последних колонках таблицы 2 приведены расстояния, полученные методам!, основанными на анализе формы линии ЗПР метки. Для цианида ферригемоглобина расстояние оп- -ределяли при 10 К по параметру Ы^/Ы -отношению суммы крайних пиков к:центральному. Для ферригемоглобина расстояние было оценено при 77 К по методу, основанному на измерении уменьшения сигнала ШР вследствие диполь-дшольного •. взаимодействия. Для гемоглобина этот метод сводится к измерению отношений амплитуд сигналов ЭПР спин-меченых фторида, и цианида ферригемоглобина , Ар/А^ .

2*2 ^

(3)

Расстояния, получешше различный! методами, хорошо согласуются друг с другом (табл. 2). Метод НН более чувствителен, чём методы, основанные на анализе формы линии. Так, в случае цианида ферригешглобнна при 77 К только метод НН чувствует взаимодействие между меткой и гемом.

Перевей к методу определения глубины погружения радикала в матрицу. Метод основан на влиянии диио.'лз-дшолыюго взаимодействия медцу радикалом и парамагнитными ионш.ш, равномерно распределенными в объеме застеклованнзго образца, на кривые насыщения спектров й!Р радикала. В качестве ионов попользуются ионы с быстрой спиновой рела:ссащ:ей, которые влияют на величину Тт радикала и практически не измелют величину 2*2 . Спектры ШР таких коное не накладываются на спектры ШР радикалов вследствие их большой ширины и малой амплитуды. Спин-решеточная релаксация радикалов определяется сум/арным днполь-д;шолышм взаимодействием радикала со всеш ионами:

и/-ГА - тгОм^ъС

где I* - глубина погружения радшсала, Г^ -радиус парамагнитного лона, С -фактор, зависящий от геог^трии поверхности, препятствующей сближению радикала и ионов. Если радикал упрятан под плоскость (случай мембран), Если радикал находится на расстоянии Г от поверхности сферы радиуса Я ,

Экспериментально регистрируются зависимости увеличения скорости спин-репеточной релаксации радикалов № от концентрации, парамагнетиков С. Прикури тагах зависимостей приведены на рис. I. Глубину погружения можно вычислитыю формуле:

Г - 1,44-Ю14-7-Т^ Л (12) , - т т

.■ где, с^Ч* -тангенс угла наклона прямых С , в 1/1 с ; величины еС и ^ даны в таблице I. Б случае сферы нахозде-

- 14 -

Рис Л. Зависимость увеличения скорости спин-решеточной релаксации нигроксилов от кониен-транки феррицианзда. I- радикал Й-ОН; 2- ли-зоцим, меченый меткой ЙАА-К; 3- зонд С1? в мембранах хроматофоров из И.гиЬгит ; 5- зонд ь в зтих яе мембранах. Растворитель-смесь тли-

«и о.3 « м 11 77 к-

ние величины Г* по формуле (12) сводится к решению квадратного уравнения. Результаты для ряда модельных систем приведены в таблице 3.

Таблица 3

Результаты экспериментов но определению глубины погружения нитроксилоз в различные биологические матрицы

Объект Добавки к водно-глиц. смеси Парамагнетик tyt.Hr5 М^с"1 Г 0 А

ЯизрцимД метка ИАА-Н М|И2 К3Ы0Ы)6 6,2 -2,5

эдтл №С12-о1120 1,0 -I

йизоцим, 3 метки 11АА-Н — Ре2Со51у 32,0 ■ 0

ХроматосЬоры, зонд Ст7 Храматофоры, зонд и - КдРе(СЫ )6 0,65 0,18 ? 20

ХроматоФоры, ЗОНД 1^3 - — и— 0,15 22 .

Глубины погружения, приведенные в этой таблице, близки к олсидаемым. В дизощгие ■ метки должны находиться на поверх—

- 15 -

кости. Иитроксильный фрагмент зонда С^у, согласно его химической формуле, должен находиться вблизи поверхности мембраны. Величины Г* для зовдов ¿» и з Б хроматофорах с точностью 1-2 X согласуются с моделями'Стюарта-Бриглеба для вытянутых конформаций этих зондов. Добавки необходимы в некоторых случаях для предотвращения сорбции ПИ на поверхности объектов.

Для всех типов поверхностей, препятствующих сближению радикала и ПИ, 1сроме плоскости, фактор 0 зависит от соот-нс 7ения мезду величинами Г" гГ^ и Я + Г/ (см., наиршлер, формулу (II)). Использование дЕ'ух ионов с различными Г( дозволяет одновременно определять величины I" и Я . Так, для спин-меченого хлопка было определено, что спиновые метга! находятся на поверхности микрофибрилл радиусом 2,2 ни.

Перейдем к изученкд спинового обмена в бносистемах методом 1Ш. В этой главе исследовали два объекта. Во-первих, изучали сшшовил обмен нктроксгмиих зондов, те.цеиних в фосфолишщные лшосомы на различные расстояния от поверхности, с молекулами кислорода, растворенными в липицной матрице. Методом НИ било показано, что при 20°С величина КеСОз"! увеличивается от 7-Ю5 до 2,4* 1С'3 с"* при погружении нитроксильиого фрагмента с поверхности липосом (зонд II ^ в се№'&тУ фюсфолипвдкого бислоя (зоцц 1|4 }•). Для зонда ^ величина • полненная" методом НЙ, близка

к величине, полученной Хайдом и др. методом импульсного йасыцения. .

Методом Ш1 мы изучали также спиновый обмен спин-мечено-Г.о лнзоцима с гем-содержащими белками. Экспериментально регистрировали зависимость скорости спин-решеточной релаксации меток от концентрации гем-содержащих белков. В согласии о формулой (5) эти зависимости были линейны. При вычислении величины Ке из величины Кеэ,^ учитывали» параду с эффектом йдерной релаксации азота, внутримолекулярный обман нитрок-силов б лизоциме, модифицированном треш метками. Анализ полученных результатов ( с учетом эффектов повторных ток-тактов) позволил вычислить геометрические стерические фак-' Г'■ •. - 15 -

Торы гем-содержащих белков - отношения площади поверхности ' тема, доступной водной фазе, к площади поверхности всего белка. Для гемоглобина (в пересчете на один гем), цктохрома с, цитохроыа ъ 5 и миоглобина эти факторы равна соответственно 0,01 ; 0,016 ; 0,18 и 0,04 . Для цитохрома с величина этого фактора близка к величине 0,01 0,04 , оцененной Сутиным по рентгеноструктурной модели цитохрома с.

У1. Ф0Т0СИС1КЛА П ЛИСТЬЕВ ГОРОХА Б этой главе исследуются хлоропласты и частицы, полученные из хкоропластов обработкой детергентами к центрифугированием. По сравнению с хлоропластами, частицы обогащены фотосистемой П, в состав которой входит марганец-содержащий центр окисления' воды. В донорной части фотосистемы П перенос электрона осуществляется в последовательности

(Мл) -»г —»■ Г580~*" ♦ ^ значительной мере успех исследования обусловлен тем, что в частишх в опред^Лных условиях спектры ЗОР дают только анион-радикал феофитина (Фф~), катион-радикал хлорофилла (Р|а0 ) или катион-радикал промежуточного донора, тирозина или хинона ( ).

По ряду причин марганец в активном центре фотосистемы П трудно наблюдать. Информацию о строении марганец-содер-г.ащего центра удалось получить при изучении влияния Мл, добавляемого к полностью отмытым от Мп частицам, на величину для Фф~ а на величину фотоиндуцированных изменений выхода флуоресценции хлорофилла &<£> (рис.2). Изменения величины свидетельствуют об изменении диполь-дипольного взаимодействия между Мп и Фф~ , увеличение АФ сввдетельству-ет о появлении потока электронов через фотосистему П. Если к частицам добавляется только Мп (без Мд ), зависимость Н| от отношения Мл/РЦ имеет характерный вид с двумя минимумами при ;»!и/РЦ=1 и Мп/РЦ=3 (рис.2, кривая I). Измерения величины ДФ показывают, что в этом случае для реактивации до-иорной части фотосистемы П необходимо добавить 4 атома Мп* на РЦ (кривая 2). Наличие двух минимумов на кривой I можно объяснить магнитным взаимодеНегоден Фф~ либо с двумя бгоэдер-икот! центрами, либо с одним тетраядеряим мартам

- 17 -

"Рис.2. Зависимость 10 величин Iij (кривые I и 2) к величины ДФ (кривые 3 и 4) от отношения Мп/РЦ. 1,3- kinCIg добавлялся без Mg С12 : 2,4-MnGIg добавлялся в о присутствии Mg С12. Три ша точек на криво!: I - результаты трех независимых экспериментов. Величины Н| для измерялись при 70 К.

щим центром. Если атомы i.ln находятся в одинаковой степени окисления, центры с двумя или четырьмя атомами Мп должны .быть диамагнитными вследствие спаривания спинов. Исследование зависимости эффекта от температуры приводит к выводу, что центр является теграядерным.

Если ГЛп добавляется в присутствии М g, величина Н* не изменяется (кривая 2), а измерение величины ДФ показывает, что для реактивации фотосистемы П необходимы 2 атома Мп на РЦ (кривая 4). Эти факты можно объяснить тем, что в присутствии Mg атомы Мп встраиваются попарно: Основной результат этих экспериментов состоит в том, что в центр разложения воды входит кластер из четырех атомов Мп, два из которых •могут быть заменены на % или другой двухвалентный металл.

Методом НИ был определен ряд расстояний и глубин погружений. Расстояния Мл-Фф" (2,9 нм) и Mn-PggQ (3,4 км) были определены для РЦ, содержащих I атом Мп, при этом величину Z для to оценивали из зависимости величины эффекта от температуры в диапазоне 20-200 К. При определении глубин погружения Фф~ (0,7 нм), Pg8Q (0,2 нм) и z* (1,7 нм) измерения велись при 77 К, причем для Pggg и в качестве ПИ использовался феррицианвд, а для Ф}" -- 0о2+ . Принималось,

- 18 -

г

что поверхность, препятствующая сближению радикалов и ПИ, является плоскостью.

Процесс ввделения кислорода в хлоропластах при комнатных температурах изучали с помощью нитроксильных зондов, введенных на различные расстояния от поверхности мембраны. При освещении зонды в хлоропластах восстанавливаются. Умэнь-ше!ше сигнала £¿1? во времени делает невозможны],! определение величины Т^ зонда обычным способом по кривым насыщения спектров ЗПР. Б ото:! главе для регистрации епшювого обмена шга-роксила и кислорода в хлоропластах использовался подход, основанный на измерении кинетики гибели нитроксилов под действием света при двух СЬЧ мощностях. При большой СВЧ мощности, когда спектр УЬР зонда насыщен, включение света приводит к увеличению амплитуды спектра сразу :;;е после начала освещения, что объясняется уменьшением насыщения спектра вследствие епшювого обмена нптрокешшшх зондов с выделяющимся под действие!,1 света кислородом. По этому увеличению амплитуды можно оценить величину К • При 20°с в Центре мембраны (зонд 5 эта величина равна 1,2*10^ с"*, а в

приповерхностной слое (зонд К [02]<1.(/* с"1 . Было

обнаружен«, что в отличие от липосом, внутри мембран хло-ропластов н темноте кислорода нет, вероятно вследствие темповых реакций поглощения кислорода.

УЛ. РЕАКЦИОННЫЕ ЦЦ1ТРЫ ФОТСШПЖЗИРУЩИХ БАКТЕРИЙ Ш10М8Р1К1ЬШМ швким

В этой главе исследуются реакционные центры (РЦ) как в изолированном виде, так и в составе мембранных образований, так называемых хроматофоров» В опытах при низких температурах нам удалось определить расстояние мевду донором электрона Р^уд , представляющим собой димер бактериохлоро-филла (Бхл),, , и первичным акцептором Яд , представляющим собой комплекс убихинона с атомом аелеза. Была определена также глубина погружения в РЦ и хроматофоры. Эти расстояния, а такке расстояния, полученные в результате анализа литературные данных, позволяй построить структурную мо- 19 -

дель РЦ (рис. 3).

........ 45* --------

(Бхл)2 БХЛ Бф

Рис.3. Схема пространственного расположения компонент РЦ. Молекулы хлорофилла, феофитина и убихинона изображены дисками, которые с торца имеют ввд прямоугольников. Расстояния между "проводящими" частями молекул условно изображены как расстояния в горизонтальных направлениях мезду краями молекул хромофоров.

Определение расстояния иезду Р87д и основано на регистрации температурной зависимости скорости спин-решеточной релаксации катион-радикала Рв различных препаратах хроматофоров и РЦ. Экспериментальные данные для РЦ приведены на рис. 4.

____________ _______ Рис.4. Температурные зависимости скорости спин-решеточной релаксации Р+ в РЦ. Кривые 1-4 - Р+ получен непре-/Ч, 5 / рквнкы освещением образца, данные четырех экспериментов ; 5- Р+ получен замораашзанием на свету, представлены данные трех экспериментов. Растворитель - смесь буфера и глицерина , 1:1.

0,5

Дня определения расстояния нужно иметь два образца, с взаимодействием ыелду Рд7у и

ю » » ^ тк

Яд и без этого взаимодействия. В качестве образца с взаимодействием использовали

образца, в которых Р

получен непрорлвн'. - 20 -

остемением замо-

роженного образца. В этом случае образуется два парамагнитных центра, Р+ и . При выключении света разделенные за-' ряды быстро рекомбинируют, поэтому необходимо непрерывное освещение. В качестве образцов без взаимодействия использовали образцы, в которых Р+ получали либо замораживанием на свету, либо окислением феррицианидом. В этих образцах Яд находится в окисленной, диамагнитной форме.

Для образцов с взаимодействием на зависимости Г/Т-^ от температуры были обнаружены максимумы при 25 и 60 К, причем максимум при 60 К в некоторых образцах отсутствует. Максимум при 25 К бил приписан взаимодействию Р+ с Яд , т.к., во-первых, этот максимум обнаруживается во всех образцах, во-Еторых, наблюдение этого максимума при низких температурах согласуется с коротким временем спин-решеточной релаксации Яд (см. формулу (.9) ). Максимум при 60 К обусловлен, вероятно, вторым акцептором Я^ . Расстояние между Р+ и Яд вычислялось по формуле (9). В хроматофорах это расстояние равно 30-31 8 , в РЦ - 32-31 2 .

Глубина погружения Р+ в РЦ и хроматофорах определялась по влиянию ионов феррицианида на кривые насыщения спектров ЭПР Р+ в смеси х'лицерин-вода при 77 К. Глубину погружения вычисляли по формуле (12), причем для хроматофоров принималось й =2, т.е. поверхность мембран считалась плоскостью, а для изолированных центров для в использовали выражение (II), т.е. РЦ считали сферой. Было найдено, что как в РЦ , так и в хроматофорах глубина погружения равна I нм.

Анализ литературных данных по обменным взаимодействиям мевду компонентами РЦ и по тушению люминесценции позволил определить ряд других расстояний, приведенных на рис. 3. Следует отметить, что различные методы дают расстояния между различными участками хромофоров. Оценка расстояния по величине обменннх взаимодействий дает расстояния между краями так называемых "проводящих" участков, т.е. участков с сопряженными химическими связями. Эксперименты по тушению люминесценции и наш эксперименты по спин-решеточной релаксации дают расстояния меяду центрами хромофоров.

- 21 -

Особенностью схемы, представленной на рис. 3, является чередование проводящих зон (сопряженные связи в молекулах хлорофилла и хинона) и непроводящих зон, причем ширина непроводящих зон не превышает I нм. По нашему мнению, фоторазделение зарядов осуществляется в серии коротких туннельных прыжков. Часть своего пути электрон проходит по проводящим зонам, а после каждого прыжка электрон, прежде чем реком-бинировать, успевает опуститься на нижний энергетический уровень. Роль промежуточных акцепторов заключается в том, что с их помощью конструируется эффективный треугольный энергетический барьер для процесса переноса электрона от Р к Таким образом, ширина барьера для процесса рекомбинации разделенных зарядов велика и скорость рекомбинации мала. Схема, приведенная на рис. 3, была позднее подтверждена в основных чертах рентгеноструктурными исследованиями ДаЙзенхофера, Михеля и др.

УШ. М И 0 3 И Н В данной главе методом спиновых меток исследуется строение молекулы миозина, играющей важную роиь в мышечном . сокращении. Основой биохимии мыцц является АТФ-азная активность миозина. Молекула миозина с молекулярным весом 500 нд состоит из длинной прямой части, называемой стержнем, и двух идентичных глобулярных головок, называемых субфрагмен-» тами I. В данной главе нас интересовали сульф-гидрильные группы типа В HI, центр связывания АТФ и центр связывания двухвалентных металлов. Эти центры и группы расположены в головках миозина. Схема строения головок, а такта расстояния, измеренные нами, приведены на рис. 5.

Расстояние между меткой ЙАА-R, присоединенной к SHI-группе, и Мп2+ в центре связывания металлов определили по кривым насыщения спектров ШР метки при температурах 20100 К, Для получения образца без взаимодействия Мп2+ заменяли диамагнитным ионом Са^+, В случае Са2+ обращает на себя внимание большая величина параметра ч : 100 при 77 К и 320 при 20 К . В случае величина q имеет значение,

Рис.5. Схема строения субфрагмента С-1, На схеме указаны расстояния, измеренные методом спиновых меток.

нормальное для спин-меченых белков : 60 при 20-100 К. Это можно объяснить тем, что в случае Са^+ наблюдаемая кривая пасите ния представляет собой сумму двух кривых насыщения с нормальными величинами д , но различными величинаш Н* . При температурах 20 и 40 К составной характер кривой насыщения проявляется явни;.^ образом. Составной характер кривых насыщения в случае Са^+ можно объяснить тем, что метки, присоединенные к вШ-группам, по одной на кадцой головке'миозина, имеют различные величины Т^ вследствие различий в конформа-ции этих головок. Б случае взаимодействие меток с ионами марганца настолько сильное, что различие величин Т| для меток в двух конформациях становится несудествеиным по сравнению с большим приращением Др При этом предполагается, что расстояния мевду меткой и 1/д в обеих головках одинаковы.

Величина Тг для Мп2+ оценивалась по ширине линии ЗПР, а также по температурной зависимости величины Д р Вели-, чина расстояния мевду меткой и Мл2+ приведена на рис. 5.

Влияние двухвалентных катионов на АТЬ-азную активность изучали с помощью спин-меченой АТФ, АТФ-Н . Известно, что в отсутствие Ме миозин имеет некоторую АИ-азную активность, причем добавление различных катионов ингибирует или активирует эту активность при малых концентрациях катионов («'КГ5 М). Анализ кривых насыщения спектров ЗПР смеси мио-зин-АТФ-Я - Ме2+ в соотношении 1:2:2 при 77 К позволил определить расстояние А'ГФ-Я - Мл^*" (рис.5). Как и в случае

50 М

метки ЙАА-Л, присоединенной к БН1-группам, кривая насыщения АТФ-Н в случае диамагнитных катионов обнаруживает составной характер, что также объясняется неэквивалентностью головок миозина.

Перейдем к изучению роли 8н1-групп в АТФ-азной активности миозина. Блокирование БЫ-групп увеличивает АТФ-аз-ную активность, блокирование- ВН2-групп приводит к ингибиро-вайию этой активности. Сильное влияние блокировки этих групп на АТФ-азу миозина побудило некоторых ученых предположить их непосредственное участие в связывании АТФ. Расстояние между спин-мечёной АТФ в АЗФ-азяом центре и спиновой меткой ПАА-И , присоединенной к БК1-группе, было определено по па-ранетру формы Линии ЭПР при 77 К й^/М (рис. 5).

На основе большой величины расстояний мезду А1Ф-Й , и ЙАА^Н ((№ 'до -5 нм) был сделан вывод об аллостери-ческом харйШЩ&з ШияНйя Друг на друга БН-групп и центров связывания А№ Ш 'Дйуйзалентных металлов.

' IX. НИТРОГЕНАЗА. ИЗ А20Т0ВАСТЕЯ У1Ш2М№11 НитрогенаЗа - фермент, катализирующий восстановление молекулярного азота в аммиак,. Молекула нитрогеназы может быть разделёНа;йа два белка, Ре-белок с молекулярным весом 60 'Кд, 'И Мо-Ре-белок с молекулярным весом 220 кд. Названия - беЛКбй отражают содержание в белках атомов Мо и Ре. Мо-Ре» Ьелбк содарйсит Два йизкомолекулярных кофактора, в состав 'Ко'тОрыЗс'ЁХОДйт Мо и Ре. Для работы нитрогеназы в изолированном ¡вИде необходима донор электронов дитионит натрия, 'АТФ 'й 'Двухвалентные ионы.

'Расстояние от '8Н-группы в АТФ-азном центре до железо-'сойёржещего парамагнитного центра было определено в опытах 'йрй 77 !К с помощью меТки ПХМБ-К. К одной молекуле нитроге-!й&&ы Присоединялось ;Дйе'Метки, при этом полностью ингибиро-:й&лабь'азотфйксйрующай 'И АТФ-азная активность. Параметры ' сЬбкз»ров Й1Р 'и 'Их 'Крййшгнасыщения для спин-меченой нитроге-'назы ;Н для'модельных систем приведены в таблице 4.

ПарёйеТрЫ сшзктров :спин-меченой нитрогеназы иэме— - 24 -

Таблица 4

Параметры спектров ОТ? при 77 К и их 1фивых насыщения для нитрогеназы , модифицированной меткой ПШБ-Н, и для модельных систем

Образец ¿р/с! +0,01 Н1-102, э <1

Лодифиц. нитрогеназа 0,53 1,3 100

Го же, + ПХМБ 0,41 0,8 50

Го же, + феррицианид 0,43 1,3 100

Радикал Н-ОН + 0,2 М МС12 0.54 1,4 100

Радикал Н-ОН + 0,2 М СоС12 0,54 30 -

Нитрогеназа растворялась в трис-НС1 буфере, радикал Д-ОН -в смеси'глицерин-вода (1:1).

няются при действии ГШ® и при окислении феррицианвдом (с последующим удалением избытка феррицианида). ПХМБ вытесняет атомы железа из нитрогеназы, а окисление нитрогеназы изменяет спектры ЭПР самой нитрогеназы. Таким образом, опыты с ПХМБ и феррицианвдом показывают, что параметры спектра' ЭПР спин-маченой нитрогеназы отражают взаимодействие нит-роксила с парамагнитным центром нитрогеназы.

По нашему мнению, особенности спектра ЭР спин-меченой нитрогеназы наиболее полно объясняются в предположении, согласно которому в спин-меченой штрох'еназе имеется набор расстояний мезду нитроксильной группой матки и парамагнитным центром нитрогеназы, причем ПЦ нитрогеназы обладает столь коротким временем спин-решеточной релаксации, что основную роль играют обменные, а не дипольные взаимодействия. О коротком времени свидетельствует тот факт, что при 77 К нитрогеназа спектра ЗПР не дает. Большая величина ч указывает на существование набора расстояний.

Опыты с модельными системами подтвервдают это предположение. Добавление ионов к водно-глицериновому раствору радикала Й-ОН дает спектр ШР, по всем параметрам

- 25 -

весьма близкий к спектру ЭПР спин-меченой нитрогеназы (таб. 4). В модельной системе набор расстояний реализуется вследствие хаотичного расположения ионов никеля и молекул радикала в застенлованной матрице, а вследствие малой величины

1г для ионов никеля можно думать, что преобладать будут обменные, а не дипольные взаимодействия. О том, что не да-польные взаимодействия определяют форму линии в модельной системе, свидетельствуют результаты экспериментов с (табл.4). Эти ионы приводят к такому же искажению формы линии, как и ионы никеля, хотя ионы имеют значительно большие величины и 1Т . Величина н| для модельной сж> теш с Со2+ определяется дипольным взаимодействием.

Таким образом, проведенный выше анализ показывает, чт< нитроксильный фрагмент метки на нитрогеназе может для неко торых конформаций метки близко приближаться к парамагнитно му центру нитрогеназы, так что могут проявляться обменные взаимодействия. Чтобы такое сближение было возможно, необходимо, чтобы БН-группа, к которой присоединяется метка ПХМБ-Я, находилась не дальше длины метки,1,2 нм, от ПЦ.

Вывод о близости АТФ~азного и железо-содеркащего центров следует и из гипотез четырех-электронного механизма и принудительного протонирования, предложенных Лихтенштейном Шилгоеш, Сырцовой и др.

С Помощью спиновых меток ЙАА-Е и М-Я был обнаружен конформавдонный переход в молекуле нитрогеназы при 19°С. Этот переход является причиной изломов в аррениусовых К001 динатах для скорости гидролиза АТФ, выделения водорода и аммиака.

Кластерное расположение атомов железа в нитрогеназе было Показано с помощью метки на основе цианида, СЫ-Б. Э] метка присоединялась к атомам железа без их вытеснения с ингибироваяием азотфиксирунщей активности. Как при комнатной температуре, так и при 77 К спектр ЗГЕР представляет с< 'бой синглетную линяю, что свидетельствует о кластерном ря! ■положении атомов, железа.

Природу белковых лягандов "кофактора нитрогеназы кзуч - 26 -

ш с помощью метки ПХМБ-Й. Било обнаружено, что в дефектном lo-Ре-белке, не содержащем кофактора, модифицируется на 15 sH-групп больше, чем в обычном белке, т.е. кофактор "экра-шрует" эти 15 sH—групп. Возникает естественное предположе-ше, что эти sH-группы участвуют в связывании кофактора.

Перейдем к изложению эксперимента по получению "сверх-зосстановленного" состояния I/ю-Ре-белка с помощью тершли-зованных электронов. При функционировании нитрогенаэы про-юходит сопряженный с пиролизом АТ1> перенос электрона на зосстановленный дитиоиитом Мо-Ре-белок, что приводит к образованию "сверхвосстановленпого" Mo-Fe-белка, не дающего зигнаяа SÍÍP. Согласно гипотезе о принудительной протониро-зании, роль ATO заключается только в содействии восстановив нию кофактора до потенциала ниже -0,6 -0,8 В. Следствием otoü гипотезы является возможность получения сверх-зосстановлеиного состояния без участия АТЬ. Для этого достаточно использовать восстановитель с потенциалом ниже-0,8 3 в условиях, когда перенос электронов со сверхвосстанов-иенного центра на субстрат ш протоны воды невозможен и этот центр стабилизируется. £ти условия соблюдаются при У-облучении замороженных при 77 К образцов. Об образовании сверхвосстаповлещюго состояния судили по уменьшению сигнала ЗПР белка, регистрируемого при 25 К,

- X. ЦЙТ0ХР0М Р-450

В этой главе методом ЗПР изучается расположение гема цитохрома Р-450 относительно водной и липидной фаз как в изолированном виде, так и в микросомах из печени 1фолика. Цитохром Р-450 катализирует окисление гидрофобных ядов, канцерогенов и т.п. и выполняет таким образом защитную функ- , цию. В состав монооксигеназной системы микросом, кроме ци-гохрома Р-450 с молекулярным весом 50 кд, входят цитохром ■ Ъ5 (17 кд) и два флавопротеида, ФП} (79 вд) и ФП2 (45 кд). Расположение компонент системы в мембране указано на рис.6.' íía этом рисунке изображены также наши экспериментальные подходы и полученные результаты. Для изучения расположения

ЛмайЛ

'у Л'

Нин шп \ \

Рис.6. Схема расположения основных компонент микросомальной монооксигеназной системы.

гемов цитохромов и Р-450'относительно водной и липидной фаз использовали два типа экспериментов, при комнатной температуре и при 30 К. При комнатной температуре изучали методом НН спиновый обмен спин-меченого лизоцима с микросомами, содержащими различное количество цитохромов Ъ^ и Р-450. Выло обнаружено, что гем цитохрома Ъц доступен спин-шче-йоМу лизоциму, а гем цитохрома Р-450 - нет, т.е. в отличие от гема цитохрома Р-450, гем цитохрома экспонирован в водную фазу. Для количественного определения локализации гема цитохрома Р-450 были проведены измерения при 30 К влияния парамагнетиков К^СеССн )б и СоСАА)-, на кривые насыще-,. ная второй гармоники спектров ШР гема цитохрома Р-450. Регистрация второй гармоники позволяет избавиться от наложения спектров ЭПР парамагнетиков.

В опытах с феррицианидом определили удаление гема цитохрома Р-450 от водной фазы как для изолированного цитохрома, так п для макросом. Глубину погружения определяли по формуле (12). В микросомах принимали & =2, в изолированных частицах в зависит от радиуса частиц. В случае частиц ^счисление глубины погружения сводится к решения квадратного уравнения. Это квадратное уравнение имеет решение при радиусах чаотицы более 7,5 нм, а глубина погружения гема в этих частицах равна 2,8 + 7,5 нм , в зависимости от радиуса частиц. Таким образом, наши данные подтверждают олвгомерное строение

- 28 -

этих частиц, известное по литературным данным. В микросомах, гем удален от ($одной фазы на 1,4 шл (рис.6).

Перейдем к изложению эксперимента с Со(АА)2. В предварительных экспериментах с помощью нитроксильшх зондов, введенных в мембрану на различные расстояния от ее поверхности, было показано, что молекулы Со(АА)2 расположены в мембране на расстоянии ^0,5 нм от ее поверхности.

Главный результат опытов с Со(АА)2 заключается в том, что при одинаковом количестве добавленного Со(АА)2 , увеличение скорости спин-решеточной релаксации (IV ) для тема цитохрома Р-450 лишь немного меньше этой величины для зонда | , введештго в меглбраны микросом. Из этого наблюдения был сделал вивод, что центр гема цитохрома Р-450 удален от липидкоы фазы приблизительно на расстояние, равное расстоянию минимального сближения Со(АА)2 и нитрокоида, т.е. на расстояние I нм.

Как в опытах с феррицнанвдом, так и е опытах с Со(АА)2 было обнаружено, что изменение содержания глицерина в образцах, а_также озвучивание образцов приводит к изменению величины V/ для цитохрома Р-450. Эти факты могут быть объяснены ассоциацией цитохрома г-450 с другими белками.

На основании наших и литературных данных была предложена схема расположения основных компонент монооксигеназной системы в :.'Л1.аране микросом (рис. 6). При построении схеш были учтены следующие три обстоятельства. I) Согласно работам Рича и др., гем цитохрома Р-450, в отличие от гема цитохрома Ъ-, расположен параллельно плоскости мембраны.

2) Так как удаление от лкпидной фазы гема цитохрома Р-450 было получено нами в опытах с Со(АА)2, молекулы которого расположены почти на поверхности мембран, можно утверждать, что плоскость гема близка к плоскости поверхности мембраны.

3) Расстояние между краями гемов цитохромов Р-450 и Ъд не должно превышать 1,5 нм из-за сильной зависимости скорости переноса электрона от расстояния. На схеме приблизительно выдержаны соотношения между размерами белков, липвдов,

- 29 -

ферригшанида и ацетилацетоната кобальта. В эту схему легко вписывается допущение, что камфорный цитохром Р-450, для .которого известна рентгеноструктурная модель,' имеет строение , близкое микросомальному цитохрому Р-450. В схеме субстрат присоединяется к цитохрому Р-450 сверху, а электроны от цитохрома и флавопротевдов передаются сбоку , Небольшое погружение гема цитохрома Р-450 (I * 1,4 нм) играет функциональную роль. Это погружение приводит к тому, что скорость переноса электрона мевду цитохромом Р-450 и неспецифическими переносчиками мала вследствие этого погружения, так как центры переноса удалены друг от друта. В случае специфических переносчиков, цитохрома Ъ5 и флавопротевдов, скорость переноса достаточно велика вследствие долгого времени жизни комплексов цитохрома Р-450 с переносчиками.

ВЫВОДЫ

1. Созданы экспериментальные и теоретические основа методов исследования строения биологических систем на субклеточном уровне, основанных на использовании явления спин-ренгегочной релаксации радикалов. Эти методы позволяют определять расстояния между радикалами и парамагнитными центрами '(до 10 нм), в том числе при неизвестных временах спин-решеточной релаксации этих центров, глубины погружения ради'" калов в биологические матрицы (до '4 нм), диаметры фибрилл

и глобулярных белков (до 5 нм), стерические факторы белков с парамагнитными активны!® центрами (0,005 * I), детектировать молекулярный кислород внутри фосфолипидных мембран.

2. Изучено строение фотосистемы П из листьев гороха с. помощью предложенных методов. Показано, что в центр разложения воды входит кластер из четнрех атомов марганид, два из которых югут быть заменены на другие двухвалентные ионы. Определены расстояния между марганцем и феофитином (2,9 нм), ■между марганцем и хлорофишюй парой Р680 (3,4 нм), глубины погружения феофитина (0,7 им), промежуточного донора z , тирозина или хинона (1,7 нм), и Р680 '(0,2 нм). С помощью нитроксильных зондов-, введенных в мембраны хлоропластов на

- 30 -

юзличные глубины, показано, что в темноте внутри мембран лоропластов кислород практически отсутствует вследствие »го потребления в темновых процессах, а на свету величина ;еС021, где Ке - константа спинового обмена, максимальна в ;ентре мембраны хлоропластов,

3. Изучено строение реакционных центров фотосинтезиру-адих бактерий й.гиЪгшп по кривым насыщения-спектров 31Р этих центров. Определены расстояния между бакгериохлорофил-п>ноЙ парой Р870 и комплексом железа с убихиноном (3,2 нм) I глубина погружения-(1,0 нм), На основе полученных и 'Штературных данных предложена схеш строения реакционных дентров. Предложен механизм фоторазделения зарядов в резуль-еате серии туннельных прыжков мевду центрами переноса,

4. Методом спиновых меток изучено строение молекулы ииозина, По форме линии ЭПР меток и их кривым насыщения Зыли определены расстояния мевду БН-группой класса б1 а АТ&-азным центром (3,5-4 нм), медду АТФ-азным центром и центром связывания двухвалентных металлов (4-4,5 нм), мезду

БН-группой класса и центром связывания двухвалентных металлов (4,5-5 им). На основе большой величины этих расстояний выдвинуты представления об аллостерическом характере взаимного влияния этих центров и зН-групл.

5. Изучено строение нитрогеназы с помощью различных ва-. риантов метода ШР. Методом спиновых меток показано, что

ЗН-группы Ай-азного центра расположены рядом с яелезо-серными кластерами нитрогеназы (не далее 1,2 нм), что подтверждает гипотезу о принудительном протонировании этих кластеров в результате гидролиза АТ&; кофактор Ыо-Ре-белка экранирует около 15 ВК-групп, которые могут выступать в качестве белковых лигавдов этого кофактора; изломы на арре-' ниусовых зависимостях для скорости гидролиза АТФ и выделения водорода и аммиака обусловлены конформационным. переходом в молекуле нитрогеназы при 19°С ; атомы железа в аеле-зо-серных центрах расположены кластерами. По снектршл ЗПР нитрогеназы при 25 К показано, что сверхвосстановленное состояние нитрогеназы, в котором происходит восстановление

- 31 -

азота, можно получить с помощью сольватированных электронов.

6. Изучена локализация гема цитохрома Р-450 в микросо-мальных мембранах по кривым насыщения спектра ЭПР гема при 30 К. Показано, что атом железа этого гема лежит приблизительно в плоскости поверхности мембраны, удален от водной фазы на 1,4 нм и "от липвдной фазы на I им. На основе полученных и литературных данных предложена схема расположения молекулы цитохрома Р-450 в мембранах микросом, конкретизированы пути переноса электрона между компонентами моноокси-генаэной системы.

Основное содержание диссертации изложено в следующих работах:

1. Сырцова Л.А., Назарова И.И., Писарская Т.Н., Куликов A.B. и др. Исследование сульфгидрильных групп нитроге-назы азотобактера Aa.vinelondii //Механизм биологической фиксации азота. Сб.научных трудов. Черноголовка. 1973.

С, -20-23.

2. Куликов A.B., Сырцова Л.А., Лихтенштейн Г.И. и др. Исследование нитрогеназы Az.vinelandii методом спиновых меток // Молек.биология. 1975. Т.9. JÉ2. С.203-212.

3. Куликов A.B. Определение расстояний мевду спинами метки и парамагнитного центра в спин-меченых белках по параметрам Кривых насыщения спектра-ЗГЕР метки при 77 К//Молек.

> биология. 1976. Т.10. Я. C.I32-I4I.

4. Куликов A.B., Лихтенштейн Г.И. Использование кривых насыщения для оценки расстояний в биологических объектах но методу двойных спиковых меток // Биофизика, IS74. Т.39. №3. С.420-424.

5. Kulikcrv А.V., Likhtenstein G.I. The use of spin relaxation phenomena In the investigation of the structure of model and biological systems by the method of spin labels// Adv.Mol.Relax.Interaction Processes. 1977. V.10. i.47-73.

6. Куликов A.B., Мельников A.B., Богатыренко В.Р. и' др. Определение расстояния мезду зарядами после их фоторазделения в хроматофорах из к.rubrum // Биофизика. 1979.

- 32 -

.24. №2. С.337-340.

7. Куликов А.В.> Зданов Р.И., Чарквиани Г.Г,, Эриста-а Т.М. Оценка расстояния между сульфгидрнльными группаш ласса Sj миозина и его АТФ-азноактивными центрами//Докл, H ССОР. 1979. Т.248. Н. С.982-984.

8. bikhtenstein G.I., Kulikov A.V., Kotalnlkov A.I. t al. The use of spin-spin interactions in investigation

f biological and model systeras/Aiagnetic resonance and re-ated phenomena. Proceedings of XXth Congress А1.ШЖЕ. allinn.1978. f.559.

9. Likhtenctoin G.I., Kotelnikov A.I,, Kulikov A.V., yrtsova L.A. et al. Some peculiarities of olectron trans-er in redox snzymos// Interl.J.Quant.Chem. 1979, V.16. '.419-^35.

10. Лихтенштейн Г.И., Котельников А,И., Куликов A.B. строении и механизме функционирования реакционного центра

отосинтезирувдих бактерий // Докл. АН СССР, 1981, Т.257, 3. C.733-73Ô.

11. Куликов A.B., Черепанова Е.С., Богатыренко В,Р. пределение расстояния минимального сближения радикала и арамагнитного иона // Теорет.эксперим.химия, 1981. Т. 17. 6. С. 787-797.

12. Чарквишш Г.Г., Куликов A.B., Эристави Т.М., Дцанов .И. Исследование взаимного расположения активных центров ульфгидрильних групп типа Sj и специфичных к ионам.двух-алентных металлов металлоактивных центров в миозине // труктурные основы и регуляция биологической подвижности, б.научных трудов. Наука. M. 1980. С.164-167.

13. Чарквиани Г.Г., Куликов A.B., Эристави Т.М,, Джа-аридзе 3.0. Оценка расстояния между сульфгидрильными груп-ами S J и центрам специфического связывания ионов двух-алентных металлов в миозине // Биофизика. 1981. Т.26. lïô,

. 920-923.

14. Куликов A.B., Сырцова Л.А., Лихтенштейн Г.И. и др. олучение сверхвосстанонленного состояния Mo-Ре.-белка нитро-

- 33 -

геназы азотобактера с помощью термолизованных электронов// Докл. АН СССР. 1982. Т.262. К5, С. II77r-II79.

15. Куликов A.B., Лихтенштейн Г.й. Использование кривых насыщения спектров 3üP радикалов для изучения структуры а динамики модельных и биологических систем// Современные методы ЯМР и ШР в химии твердого тела. Сб.научных трудов. Черноголовка. 1982. С. 173-176.

Î6. bikhtenstein бЛ», Eulikov A.V., Kotelnikov АЛ«* Bogatyrenko V.R.Structure and action mechanism of reaction center8//Photobiochem.l'hotobiOjphys» 1982. V.3. Р.327-344.

17. IdkhteaBtein G.I., Kotelnikov A.I.,Kulikov A.V.New Approaches to etudieB of water-protein and water-membrane tnteractione//Studia Mophysica. 1982. 1?1. P.2J-27.

18. Куликов A.B. Новые методы исследования строения шогоядерных металлоферментов методом ШР//Окислительно-восстановителыше металлоферменты и их модели. Сб.научных ewael, Черноголовка. 1982 . 4.2. С.74-80.

19. Куликов A.B., Ццанова Е.И., Мельников A.B., Лихтен штейн Г.И. Исследование спинового обмена нитроксильных радикалов методом непрерывного насыщения спектров ЗПР//Ж.физ. химии. Ï982. Т.56. №12. С.2982-2986.

20. Юданова Е.И., Куликов A.B. Определение констант ос мена нитроксильного радикала с кислородом на основе анализ?

, формы ЛИНИИ ШР// 1.физ.хиыии. 1983. Т.57. М. С.205-206.

21. Куликов A.B., Богатыренко В.Р., Лихте1шггейн Г.И. И др. Магнитное взаимодействие марганца с анион-радикалом феофитина и катион-радршалом хлорофилла в РЦ фотосистемы П // Биофизика. 1983. Т.28. №3. С.357-363.

22. Иванова Е.И., Куликов A.B. Определение частоты сп: нового обмена нитроксильных радикалов и кислорода методом непрерывного насыщения спектров ШР радикалов // Биофизика 1984. Т.29. Кб. С.925-929.

23. Yudanova Е., Meckler V., Fogel V.,Kulikov A. et.в Haem licalization in haemoproteine by spin and triplet tools// Bur.J.Biochem. 1986. V.156. P.

24. Likhtenstein G.I., Kulikov A.V., Kotelnikov A.I.,

- 34 -

vchenko L.A. Method, of physical labels-a combined ap-oach to the study of microstructure and dynamics in bio-gical systems//J,Biochem.Biophye.Methods.1986.V,12.P.1-28,

25.- Куликов A.B.1, Котельников А.И., Фогель В.Р. и др. следование строения активных центров металлоферментов тодами 3IP и люминесцентных меток//Проблемы современной онеорганической химии. Сб,научных трудов. Наука. Новоси-рск. 1986. С.31-36.

26. Лихтенштейн Г.И,, Куликов A.B., Котельников А.И. пользование релаксационных процессов с участием нитроксидь-х радикалов в молекулярной биологии//Метод спиновых меток зовдов. Сб.научных трудов. Наука.Москва.1986.С.41-61.

27. Сырцова I.A., Куликов A.B., Дружинин С.Ю,, Лихтен-ейн Г.И. Определение' природы белковых лигандов Мо-Ре-ко-ктора нитрогеназы методом спиновых меток//Биохимия. 1985. 50. №4. С.634-638.

28. Куликов A.B., ¡Оцанова Е.И. Изучение спинового обме-, нитроксилов методом непрерывного насыщения спектров ШР// троксильные радикалы. Сб.научных трудов. Наука. Москва. 87. С.211-222.

29. Куликов A.B., Черепанова Е.С., Богатыренко В.Р, и

'. Определение глубины погружения радикалов в биологические .трицы методом ШР//Изв.АН СССР,сер.биол. 1987Jiö.С. 762-769.'

30. Куликов A.B., Лихтенштейн Г.И., Черепанова Е.С., аров В.Ю. Определение глубины погружения гема питохрома 450 в микросомах и в олигомерах методом ЭОР//Тезисы Всесо-ной конференции "Цитохром Р-450 и охрана окружающей среды, восибирск. 1987. С.68.

31. Куликов A.B., Юданова Е.И., Лихтенштейн Г.И. и др. ¡учение процесса ввделения кислорода в хлоропластах гороха тодом спиновых шток//Биофизика.1988.Т.ЗЭ.№6.С.984-989.'