Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Взаимодействие биополимеров в растворе и их молекулярная подвижность

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Взаимодействие биополимеров в растворе и их молекулярная подвижность"

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА, ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ И ОРДЕНА ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им. М.В.ЛОМОНОСОВА

Физический факультет

На правах рукописи УДК 577.16

Петрусевич Юрий Михайлович

Взаимодейстбие биополимеров в растворе и их молекулярная подбиЖность

03.00.02 - биофизика

АВТОРЕФЕРАТ

ДИССЕРТАЦИИ на соискание ученой степени доктора физико-математических наук

Москва 1992 г.

Работа выполнена на кафедре физики ш'зких температур и сверхпроводимости физического факультета Московского Государственного, университета им. М. Е Ломоносова.

Официальные оппоненты: доктор физико- математических наук

проф. Рууге Э. К.

- доктор химических наук проф. Батюк К А.

- доктор физико-математических наук проф. Шайтан К. В.

Ведущая организация: Институт Химической физики АН России.

г I

Защита состоится "'/" июНЛ 1002 г. 'в /гг: час, на заседании специали-ированного Ученого Совета Л 053.05.53 при Московском государственном университете. Адрес: 119899 ГСП, Москва, Ленинские горы, МГУ, Биологический факультет, 1сафедра биофизики.

С диссертацией мохно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ.

Автореферат разослан "_" 1902 г.

Ученый секретарь специализированного Совета доктор биологических наук

Т. Е. Кренделеиа

-1 "1. 'ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

1. 1

тдел \ АКТУАЛЬНОСТЬ ТЕМЫ

Взаимодействие биологически важных молекул в растворе и их тепловое молекулярное движение играют чрезвычайно важную роль в функционировании различных биосистем, физико-химических и биофизических явлениях. Исследование структурных и динамических свойств биологически важных молекул, молекул воды и ионов в растворах является актуальной задачей в процессе изучения механизмов взаимодействия биологически важных макромолекул с растворителем. Параметры теплового движения макромолекул биополимеров в водной среде могут определять особенности протекания процессов с их участием.

Макромолекулы белков, находясь в структуре биологических мембран, могут определять процессы сорбции малых молекул, на поверхности макромолекул, кроме того необходимо учитывать при этом их трансляционную и вращательную подвижность .

Вопросы взаимодействия молекул в растворе с молекулами растворителя представляют большой научный и практический интерес. Это связано с тем значением, которое имеет вода как растворитель в функционировании живых организмов.

Особенности структуры и динамики молекул воды обусловливают ее непосредственное участие в формировании биологически активной структуры биополимеров и мембран, играют значительную роль в процессах функционирования биологических молекул и надмолекулярных структур. Знание особенностей состояния воды в биологических объектах, в частности гидратации макромолекул, мембран, клеточных структур, дает возможность следить за состоянием биоструктур при различного рода воздействиях, разрабатывать способы диагностики различных заболеваний при помощи физических методов.

Вращательная и трансляционная подвижность биологически важных молекул в растворе зависит от многих параметров среды и особенностей структуры и формы молекул. Применение комплекса современных методов исследования, как оптических, так

и радиоспектроскопических, позволяет проследить связь указанных молекулярных движений с такими свойствами среды как рН, ионная сила, температура, диэлектрическая.проницаемость, а также с зарядовым состоянием молекул, их формфактором, молекулярным весом и т. д. Указанные выше параметры претерпевают существенные изменения в условиях функционирования живого организма. На примере развития такого биологического процесса, как канцерогенез, возможно рассмотреть изменение молекулярных параметров биологически важных молекул , таких как белки, липиды, витамины й т. д.

ЦЕЛЬ РАБОТЫ состояла в установлении закономерностей характеризующих молекулярно-динамические свойства биологически важных молекул в растворе, включающие вращательное и трансляционное движени заряженных макромолекул, а также особенности молекулярной подвижности воды связанной на поверхности макромолекул.

При этом ставилась задача разработать методики измерения ЯМР релаксации растворов заряженных молекул и макромолекул, изучить процессы сорбции малых молекул на поверхности макромолекул в растворах, изучить влияние на эти процессы ряда физико-химических параметров раствора.

Ставилась задача изучить связь вращательной подвижности макромолекул с их характеристической еязкостыо и связь трансляционной подвижности макромолекул с параметрами межмолекулярного взаимодействия. . ■

Отдельная задача состояла в исследовнии биофизических характеристик тканей и плазмы крови при развитии канцерогенеза, включая исследование изменение спектров ЯМР выделенных липидов из плазмы крови животных при канцерогенезе.

Для выполнения поставленных задач в работе использовались импульсные методы ядерного магнитного резонанса( ЯМР). которые являются весьма информативными при изучении динамики молекул воды и растворенных молекул, методы ЭЛР, люминесценции и хемилюминесценции, метод диэлектрической релаксации и

вискозиметрии.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА РАБОТЫ.

В диссертационной работе впервые систематически исследовано влияние электростатического взаимодействия биополимеров в водных растворах на их вращательную и трансляционную подвижность. Одновременное исследование ЯМР релаксации, диэлектрического поглощения и вязкости растворов белков показало существование характерного минимума времени вращательной корреляции биополимеров в зависимости от концентрации ионов водорода. а также с изменением концентрации биополимера,чему дано теоретическое обоснование.

Развитие теории сорбции малых молекул на поверхности макромолекул в растворах применительно к методу ЯМР квадру-польных ядер впервые позволило однозначно рассчитать как динамические параметры макромолекул, так и статические характеристики. При этом дано объяснение тому, что связывание отрицательных однозарядных ионов белком возрастает пропорционально увзличению их ионного радиуса.

Впервые методом ЭПР обнаружено аномальное связывание иминоксилыюго радикала.в плазме крови при развитии канцерогенеза Установлено, что обнаруженная аномалия определяется, с одной стороны изменением числа мест связывания зонда на поверхности альбумина, а также степенью ненасыщенности жирно-кислотного состава липидного компонента липопротеина.

Обнаружено и детально исследовано неизвестное ранее сверхслабое радикало-рекомОинацийнное свечение в растворах биологически-важных молекул. Предложены модели определения антирадикальной активности как водорастворимых веществ, так и веществ липидной природы. Изучены факторы влияющие на чувствительность моделей при определении антирадикальной активности. При исследовании ингибиторов методами радикало-ре-комбинационной люминесценции установлена связь активности ингибиторов с квантово-механическими параметрами их электронных

состояний.

На основании полученных в работе экспериментальных и теоретических данных предложен физико-химический подход к пониманию механизма канцерогенеза, сопровождающегося изменениями молекулярных параметров белково-липидных систем и характера их молекулярной подвижности.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ РЕЗУЛЬТАТОВ РАБОТЫ

Полученные в диссертационной работе результаты способствуют дальнейшему развитию представлений о молекулярных механизмах динамических процессов в растворах,' вносят вклад в понимание молекулярных механизмов взаимодействия биологически важных молекул в растворах, процессов сорбции малых молекул на поверхности заряженных макромолекул, а также в понимание механизма их вращательного и трансляционного движения.

Установление связи между параметрами, измеряемыми различными методами, применявшимися в работе, позволяет сопоставлять информацию о молекулярных процессах, полученную этими методами.

Исследованное в работе влияние электростатических взаимодействий на молекулярно-динамические свойства растворов малых молекул и молекул биополимеров позволяет прогнозировать поведение ряда параметров при различных физико-химических воздействиях, оптимизировать условия проведения измерений с целью получения отдельных микроскопических характеристик,

Кроме того, обнаруженные в работе эффекты изменения времени вращательной корреляции белков при вариациях электрического состояния макромолекулы,изменения'гидратации , а также предлагаемый механизм этих изменений дахгг основу для интерпретации на молекулярном уровне патологических изменений в биологических объектах, позволяют оптимизировать параметры физических методов их диагностики.

Данные исследования могут найти практическое применение в лабораториях биофизического, физико-химического и медицинского профиля, в которых исследуются процессы действия анти-оксидантов, витаминов и ряда других биологически важных веществ в биологии и медицине при разработке методик раннего обнаружения злокачественного роста.

Материалы диссертации использовались при создании физических методов диагностики распространенных заболеваний, включая онкологические.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ

Основные результаты диссертационной работы докладывались на ряде международных биофизических конгрессов, на Всесоюзных конференциях по биофизике, люминесценции и канцерогенезу в период с 1963 г. по 1989 г. За последние 5 лет сделаны доклады на Всесоюзной конференции по магнитному резонансу в конденсированных средах (Казань, 1984); Международной школе по магнитному резонансу (Новосибирск, 1987); Международном симпозиуме "Гидратация биополимеров" (Пущино, 1988); Всесоюзном семинаре "Молекулярная физика и биофизика водных систем" (Ленинград, 1989). Международном симпозиуме "Применение лазеров в науке о кизне" (Москва, 1990).

ПУБЛИКАЦИИ: По результатам диссертации опубликовано более пятидесяти печатных работ.

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ ДИССЕРТАЦИИ'

Диссертация состоит из введения, шести глав, заключения и выводов, а также списка цитируемых работ и собственных работ автора по теме диссертации, содержит 210 страниц машинописного текста, включая рисунки и графики.

Глава I. ЯМР и молекулярная подвижность в растворах

Ядерный магнитный резонанс (ЯМР) является одним из эффективных методов исследования молекулярной подвижности в растворах молекул и макромолекул.При этом измерение скорости протонной магнитной релаксации Ri и R» позволяет сделать заключение о характерных временах корреляции и связанных с ними диффузионных коэффициентов.

Скорости ЯкР-релаксации определялись с помощью прибора "MLnupec рс-го"<Ва1кег> на частоте го МГц и"СХР-зоо"<Вгикег> по стандартным импульсным программам"инверсия-восстановление" (R.) и КПНГ (R,). |1ри атом из трехэкспоненциальной релаксационной кривой нами выделялась компонента, соответствующая группе СНа, поскольку скорость релаксации протонов этой группы удовлетворительно описывается вращением макромолекулы как целого. Ошибка в определении скоростей релаксации составляла I!!! , что достигалось 900-кратным накоплением для каждой экспериментальной точки.

Для определенных таким образом величин Ri н R» справедливы соотношения Соломона-Бломбергена, связывающие их с молекулярным временем корреляции. Отношение Rа/Вt=Ti/Tа зависит при атом только от,времени корреляции *С и частоты наблюдения U) и равно

где Х=((л)*С)а. В области ШТ >0.2 эта зависимость позволяет однозначно определять "С из экспериментально изыеренно

На рис. I приведены зависимости времени корреляции

1» Rt

I2X* ♦ 37Х ♦ 10 2(81 ♦ 5)

(I)

го отношения Rj/Ri.

•С г, рассчитанного по изиервннымскоростяч ЯМР-релаксации с помощью соотношения (4), от рН раствора для лиэоцима и БСА.

Полученные результаты аппроксимированы параболической функцией

«с = тг-ш [ I ♦ а(рн-рни1п)а] ею

При этой для лизоцииа а =1.07, ТГИ|„= 3.6, рН„»„= 3.5 . а для БСА О = 0.18, «С„|„= 17.4 , рНт»„= 7.05.

Рис.1 рН-завасимостъ времени вращательной корреляции по данным ЯМР-релаксация белков в растворе В ;.0 при Т=40°С на частоте 20 ..¡Гц. а/ - лизощ"! \ б/ - альйумин.

Динаиические характеристики бочковых иакроиолекул - их подвижность,коэффициенты диффузии и др. - определяются статическими параметрами.такими как молекулярная масса,форма, поверхностный заряд,потенциал межмолекулярного взаимодействия. Наиболее эффективным методом определения большого числа статических характеристик макромолекул является метод рэлеев-ского рассеяния света.

Для иеидеальных растворов, при условии, что осмотическое давление < Р ) южно представить в ьиде вирцаль.чого разложения по степеням концентрации можно записать:!

CHK/Ro = (RT)"1 (dP/dc) = I/M Л I » 2Й1С ♦ ...)

( формула Дебая) . . \ , .••, ,

В водных растворах макромолекулы бедкоз являются заряженными, поэтому вириальное разложение применимо в случае сильно разбавленных растворов, когда дебаевский радиус экранирования много больше среднего расстояния .между макроиона-ыи.Добавление в раствор небольших количеств соли - сильного электролита- приводит к тому,, что вокруг заряженных молекул белка создается облако противоконов, экранирующее кулоновское взаимодействие. Выражение для параметра В . применимое к разбавленный растворам при наличии третьей компоненты - сильного электролита имеет вид :

В » I/2l1aa.{ZV2H,* dto К a/dH3. ^ :

♦ [«МИК з/<М,М 2 /dfhX ,/di1,3) „ '

(индекс 2 - относится к макромолекулам, 3 - к молекулам соли, X i - молярный коэффициент активности, Hi - концентрация (моль/кг), Ъ - суммарный заряд макромолекулы белка, который может достигать очень больших величин, с чем связано

- g -

также аномально высокое значение ее дипольного момента.

От заряда на поверхности белка зависит не только параметр В, но и dn/dc, поляризуемость СХ, и коэффициент деполяризации Л у.

В нашей работе впервые произведено одновременно измерение зависимости всех перечисленный параметров от величины суммарного заряда на поверхности белка.

v

Основные эксперименты были проведены с сывороточным альбумином (BSA) и К - глобулином С Sezua- ). Эксперименты проводились с разбавленными растворами ( концентрации - 0,05 , 0.1 , 0,25 , 0,5 if II ).

Исследование ••] зависимости величины второго вири-ального коэффициента в BSA и X-глобулине от рН,"показало что-; ■ . коэффициент В зависит от рН существенно нелинейным обрч-эом с ПШ в иэозлектрических точках.

Трансляционная диффузия макромолекул в растворе также может быть связана с разложением по концентрации в соответствии с уравнением Дебая:

Dtr = (d этг/d c)H/N0 ? - De(i ♦ KdC)

Здесь D,, = кТ/i,, = Co(I » KfC) - коэффициент трения.Таким образом коэффициент Kj зависит как от межмолекулярного взаимодействия через второй вириальный коэффициент, так и от значения коэффициента трения, связанного линейным соотношением с вязкостьи раствора макромолекул.

Одним из прямых способов изучения трансляционного движения растворов макромолекул (к которым можно отнести и белковые молекулы) является метод корреляции Фотонов.В этом методе исследуется функция корреляции вида:

C(t) = C.d . еих-20»РчЧ)

В нашей работе un использовали коррелометр фирмы"Мо£иВ2П"для изучения трансляционного движения глобулярных белков в разбавленных растворах.

Эксперименты по измерении Dtr в растворах альбумина и J" глобулина при изменении рН и концентрации белка приведены на рис.? .

Видно , что минимум коэффициента трансляционной диффузии наблидмотся в изоэлектрической точке белка.

Рис. г И:змг>ненио кочЗДшшип'а трансляционной диф-ФУЙИИ ftcjncor.: 1 - альбумин . -^-глобулин.

Глава 2, Вязкость и вращательная диффузия макромолекул.

Для измерения вязкости растворов маки был разработан высокочувствительный вискозиметр вибрационно-резонаторнного типа, В этом вискозиметре в исследуемую жидкость погружается плоская тонкая пластинка, прикрепленная к акустическому резонатору (камертону) с добротностью 0 > 1000. При этом основный источником потерь при колебательном движении камертона является трение пластинки в исследуемой жидкости, что позволяет измерять вязкость с. высокой точностью ( до 1% ). Возбуждение колебаний камертона осуществляется дросселем, приемником колебаний является пьезоэлектрический датчик. Использование автоколебательного режима системы позволяет обеспечить работу строго на резонансной частоте камертона и исключить изменение амплитуды колебаний, связанное с техническими уходами частоты.

Концентрационную зависимость вязкости в диапазоне концентраций от 0 до Ъ-10% аппроксимировали формулой Хаггинса

п / п . = I ♦ [а ]с . к[п Гс* 2.1

откуда получали Сп 1 и К.

Связь времени вращательной корреляции и характеристической вязкости раствора [п ] имеет вид:<

п Лп Ш

= кТ Ид V 2-2

где М - молекулярная масса белка, Иа - число Авогадро, V - коэффициент, зависящий от формы (У=2.5 для сферы).

На рис ¿{¡^представлены зависимости характеристической вязкости [п ](Д)и константы Хаггинса К (^растворов БСА при Т=25 С от рН. Аппроксимация Сп 1 функцией, аналогичной (ЕЛ) Ы = [п]—[ I * а(рН-р!1„,п) г] . дает [п ]-ш= 5.2,

« I

,Глава 3. Диэлектрическая проницаемость растворов заряженных мак; омолокул.

Одним из наиболее информативных методов изучения кинетических процессов в растворах является метод диэлектрической релаксации. Это связано с тем. что частотная зависимость комплексной диэлектрической проницаемости системы в широком частотной диапазоне определяется спектральной плотностью ориентационного движения молокул. имеющих дипольный момент:

е" (оо)=е '(ю)-1 е "(ц))= = е„ . (кТГ1 (<м; > : 1е?<М,(о> МЛ> >

о

х ЮСР(4ц))<Й}

3.1

где С и е действительная и мнимая части диэлектрической проницаемости, £ — - ее значение в пределе больших чэстот.М; - проекция полного дипольного момента системы М на направление внешнего поля Е И

Известно, что экспериментальные зависимости С и

е» ''

Б для растворов биополимеров обычно плохо согласуются с соотношениями { ЗЛ] . Это принято объяснять, привлекая гипотезу о существовании целого спектра различных времен корреляции. Физические причины существования такого спектра времен остаются, однако, неясными.

Специфика молекулярного движения в растворах биополимеров связана с аномально большим значением дипольного момента макромолекулы, который, согласно литературным данным, составляет 10 * - 10* Д,

. Вследствие этого, даже при небольших концентрациях белка (начиная примерно с 5% объемной концентрации) энергия диполь-дипольного взаимодействия становится сравнимой с КТ. Взаимодействие частиц приводит к существенным отклонениям спектральной плотности ориентационного движения макромолекул от лоренцевской , 'и, следовательно, к отличным от 3.1 дисперсионным соотношениям:

е ¿(соьв г~><е »«-в Г а-1(и)Г 8-' -Ы^а .»((О Те .1 - а - А2% Ч )1 г д

(ьА,* , . , )* ♦ (олгв., - -

в ¿(ш)=(в л-е «„)х

г олга.»(1 > А>х, . )_^ ^

(1.А,х 1 . А,%э )' .(ил:в.»- А,х2 - кгХч)* '

Расчеты, проведенные по формулам {3.2)-{3.3} показали, что взаимодействия броуновских частиц приводит к существенному изменение вида частотных зависимостей С ' (10) и В (СО) раствора по отношении к обычным лоренцевским. При постоянной концентрации раствора белка по мере увеличения заряда и дипольного момента макромолекулы с гидратной "ау-бой", максимум зависимости 6 " (Ш)сиевдется в сторону больших частот и становится более резким. Аналогично смещается точка перегиба на зависимости В* (10). Наблвдается

и

также заметная деформация диаграммы Коула-Коула.

Расчетные частотные зависимости , для раствора биополимеров для ряда значений параметров приведены на рис. 4и5 '•совместно с результатами эксперимента.

Экспериментальные частотные зависимости <. снимались при помощи моста переменного тока типа "Тбб1а ВИ-431Е " с термостатируемой кюветой. Измерения проводились для раствора белка альбумина фирмы -Бегисг при малой ионной силе /1=0.01 иольД и различных значениях рН раствора. Результаты эксперимента, приведенные на рис.4и5 отвечают значениям рН=5.5 и рН=7. Заряд белковой макромолекулы при этом равен 0=4 и 0=12 соответственно. Объемная концентрация белка составляла 10% . Столь высокая концентрация биополимера выбрана с одной стороны для максимального проявления взаимодействия частиц, с другой - для повышения точности измерений. Тем не менее, следует отметить, что при такой концентрации должно сказываться как гидродинамическое взаимодействие частиц, так и наведенная корреляция во взаимной ориентации макромолекул. Эти факторы не учитываются в приведенной теории, поэтому можно говорить лишь о качественных закономерностях, которые правильно отражает модель.

Действительно, при увеличении заряда белка наблюдается существенное смещение в сторону больших частот макси-

« »

иуиа экспериментальной зависимости С (Ш) и точки перегиба зависимости 8 ((л))/см. рис. 4, и 5- Необходимое для построения теоретических кривых значение дилольного момента макромолекулы в гидратной "шубе" принималось равным Р = 500Д.

Эффективный радиус~ал*оуиина, который представляет собой эллипсоид с соотношением осей 0/ё=6 . определяется по эквиобъемной сфере. При этом В=28А° . Для остальных параметров, необходимых при расчетах, использовались стандартные справочные значения.

I

Рис.4 Зависимость действительной части диэлектрической проницаемости от частоты ЫТГо.» Расчетные зависимости: I,- 0=0; Ф=0 (кривая Дебая) 2.- 0=4; М=500Д; Ф=0.1

а' = <е '5<Ш-е а- )/<е « <0)-8 »^3. - 0=12; Р=500Д; Ф=0.1

Н

Рис.0 Зависимость мнимой части диэлектрической проницаемости у" -- С I (СО)/(С л (0)- е 5«, )от частоты. Экспериментальные данные: ♦ - рН=5.5; 0=ч; Ф=0.1

о- рН=7; 0=12; Ф=0.1

Глава '¡.Сорбция и свободная энергия взаимодействия.

Ота глава ; диссертации посвящена исследованию процесса ,:ор6ции малых молекул в растворе макромолекул.В работе развита идея Ленгмюра расчета констант сорбции, которая адекватно описывает простейшую кинетику сорбции в разбавленных растворах.При этом устанавливается сложное равновесие между адсорбированными молекулами на поверхности макромолекул и их концентрацией в растворе.Соответствующие константы равновесия определяются энергией взаимодействия малых молекул с макромолекулами и их равновесная относительная концентрация подчиняется уравнен».л), аналогичному изотерме Ленгмюра:

г = Ко [A] n/ü . кЛА]) =[РА]/С» (:4i)

Здесь [А] -концентрация малых молекул в растворе, [РА] -концентрация сорбированных молекул. С» -концентрация макромолекул, П -число мест сорбции на поверхности макромолекул, Ка-константа адсорбции, определяемая соотношением;

Ка = V ехр(-Еа/кТ) (4.2)

В этой формуле Еа характеризует энергию взаимодействия малой молекулы с центром сорбции на поверхности макромолекулы.

В данной работе рассмотрены процессы сорбции в водных растворах заряженных макромолекул - белков таких малых молекул как однозарядные ионы, включая парамагнитные, иминок-сильные радикалы и другие низкомолекулярные вещества.

В качестве основных методов исследования процессов сорбции выбраны современные радиоспектроскопические методы ЭПР и ЯМР. В кинетических исследованиях для расчета числа и типа мест сорбции используется модификация уравнения {41} предложенная Скэтчардом:

Это уравнение устанавливает линейную связь между величиной 2/ [А] и относительным числом сорбированных молекул 1, что графически позволяет легко определить константу Ка и число мест связывания П.

В случае наличия различных типов центров сорбции, имеющих разное значение энергии Е„ в эксперименте наблюдается сумма гипербол типа и в координатах Скэтчарда на экспериментальном графике обнаруживается несколько прямолинейных участков, каждый из которых описывается уравненинем Й.,з}.

В нашей работе мы исследовали процессы сорбции иминок-сильиых радикалов в водных растворах белков методом -ЭПР, а также методом ЯМР релаксации.При исследовании сорбции методом ЭПР было показано, что в случае растворов альбумина основной тип центров сорбции характеризуется энергией в 31кДж/моль, и при этом происходит связывание одной молекулы иминоксильного радикала на одну ыолекулу белка.

При исследовании сорбции методом ЯМР релаксации основным параметром является Р=[РА]/[А], характеризующим относительное количество связанного на поверхности макромолекулы низкомолекулярного вещества к его общей концентрации в растворе. При этом для одного типа центров сорбции справедливо соотношение, аналогичное изотерме Ленгмюра:

р-с, к„ п(ька [А])"1 {4.4)

Для измеренных методом ЯМР скоростей релаксации в условиях быстрого обмена справедливо следующее соотношение:

дВ = - (1 - р)П„ = рВ(ш<с) {4.5)

В уравнении {^.5) величина Я(ЦЛ;) характеризует скорость релаксации ядер, входящих в состав малых молекул или ионов, которые счрОируются на поверхности иакромолекул.

Посколъко между величиной р и параметром Скэтчарда 2 существует соотношение:

г = р[А]/с» ; • {4.б)

постольку справедливо следующее выражение, связывающее формулы С4.5) и (16):

р"1 = ([А] . ка-1 ¡<а п)"1 =В(и)<с)/дВ (4.?)

/

X

л

"Й—I—П—¡3 21—Й—ЙХГ"1

Рис.6

На рис.6 показано изменение скорости ЯМР-релаксации раствора альбумина в присутствии парамагнитных ионов кобальта.

Кривая I получена в условиях отсутствия в растворе белка. При этом наблюдается линейная зависимость скорости релаксации от концентрации. Кривая 2 соответствует 5 X концентрации альбумина в растворе. Наблюдается плато в начальной части кривой, что связано с компенсацией .процесса релаксации по Формуле 9.4 и 4.5, дающих противоположный код зависимости скорости релаксации от концентрации парамагнитного иона.

Глава 5, Хемилюминесценция и кинетика радикалорекомбина-ционных процессов в растворах.

В этой главе диссертации рассмотрена физика процессов соударения молекул и макромолекул в растворах. При этом исследованы процессы соударения биологически важных молекул, сопровождающиеся рекомбинациошшй люминесценцией.Показано, что процесс включает в себя две стадии: соударение с образованием электронно-возбужденного комплекса и процесса диссипации энергии в виде тепла или флуоресцентного излучения.Последнее излучение получило название сверхслабой хемилюминес-

ценции, так как квантовый выход в большинстве изученных нами

.„ - ю

систем не превышал величины 10

Кинетические исследования сверхслабых изл.' .¿ний показали. что интенсивность свечения растет как квадрат концентрации образующихся в системе радикалов и уменьшается пропорционально концентрации их активных ингибиторов. Автором были определены характерные времена жизни радикалов в различных системах инициирования, измерены также константы соударения радикалов. На рис.7 приведена характерная кинетическая кривая для интенсивности хемилюминесценции водного раствора тирозина при инициировании радикалов электрическим током.В начальный момент времени был введен ингибитор радикалов СХ - токоферол. Из рисунка ридно существований определенного времени индукции ТИ1 при котором реакция удерживается на низком стационарном уровне. При этом:

*И-Д1п]й/Ш,( 1-1/1 „) [5 .т}

Изменение интенсивности свечения в процессе расходования ингибитора радикалов нозьолило рассчитать скорость инициирования Ш , : Ю,.-.!5д1/1вРд1 {5.2)

I/I„

Рис.7 Изменение интенсивности хемилшннес.ленции системы малеиноьая кислота-хлороформ-ацетон после введения различит концентраций токоферола /в моль/л/. I- '¿~

8-10

rt>

a t

мин.

Величина fi в этой формуле характеризует антирадикальнуы активность ингибитора, которая определяется характерной константой взаимодействия радикал-ингибитор К7 и вреиенем жизни радикалов *СЯ, а также константой взаимодействия радикал-радикал К6 и скоростью инициирования Ы» : £=К,«С„; *Сж=(Кб ti j)~°'s {S".3} Простейшая кинетика ингибированной хемилгшинесценции приведенной на рис.Т может быть описана следующими соотноше-' нияии: dR/dt=urK^J-K7InR; dIn/dt=-K7InR (5:4}

(IЛ)0 •s-(I/I.)0 • S--K 7Ií\(K6 И,) *= pin

По приведенный выше формулам были определены характерные времена жизни радикалов в различных системах инициирования, которые составляли величины от 3 10"3 сек до I сек

. Были определены также константы соударения радикалов К« и рассчитаны скорости инициирования радикалов 4J i в изученных хемилюминесцентных системах.

Глава 6. Биофизические аспекты канцерогенеза.

Шестая глава диссертации посвящена иллюстрации использования различных физических методов, приведенных в предыдущих главах для изучения процесса канцерогенеза. В этом исследов-нии ьи использовали такие современные методы как импульсная Оурье ЯМР спектроскопия, ЭПР спектроскопия, хемилюминесценция и флуоресценция и другие физико-химические методы .

В наших работах было показано, что в случае химического канцерогенеза наблюдается циклическое изменение радикало-ре-ко1. "инационной люминесценции как в плазме крови, так и в ли-пидной фракции различных органов и тканей животных.

Проведенные эксперименты показали, что доза канцерогена существенно меняет временные зависимости АРА, однако все. кривые имеют колебательный характер. Средние дозы канцерогена вы-зыват наибольшие изменения АРА, при этом выход опухолей пре-выиает 90Х

Исследование флуоресценции липидов из плазмы крови показало также циюшческое изменение интенсивности свечения Спектральное исследование этой люминесценции позволило заключить, что флуоресцирующим веществом является витамин А, который расходуется в автокаталитическом процессе при канцерогенезе. Поэтому был поставлен эксперимент по гипервитаминозу А, когда до введения однократной дозы канцерогена животные предварительно несколько дней получали повышенные дозы витамина А. Было установлено, что в этом случае прекращается циклическое изменение большинства измеряемых физико-химических параметров и образование злокачественных опухолей у животных п ракт и чес ки про краппе тс я.

Все эти эксперименты позволили нам создать физико-химическую модель первичных процессов канцерогенеза. По этой модели начальная стадия канцерогенеза проходит в печени животного, гдр появление канцерогена вызывает всплеск микросомаг'.-ной ферментативной активности, результатом которой является образование водорастворимых продуктов канцерогенеза с последующем их уд:ионном из организма. Роль гипервитаминоза А в

этом процессе сводится к ускорению указанного ферментативного процесса, при этом происходит замедление цепного автоокислительного процесса, в котором образуются высокотоксичные производные канцерогена.

Развитие цепного автоокисления в липидной фазе клеточных мембран и в липидной фазе транспортных белков плазмы крови было показано непосредственным изучением ЯМР спектров высокого разрешения. Было обнаружено изменение в спектре в области ненасыщенных жирных кислот, а также существенное изменение в области спектра витамина А, витамина Е и холестерина Эти жирорастворимые витамины определяют скорость нефетиентативного свободнорадикального окисления первоначально развивающегося в микросомах печени. Присутвие сильного канцерогена в организме животного приводит к итенсивному автоокислению прежде всего ненасыщенных жирных кислот, что удалось показать сравнительным исследованием 20-ЯМР спектров липидов из плазмы крови. Было установлено, что характерные группы этих липидов существенно изменяют время Т1 с 0.33с до 0.16с.

В 4-ой главе нами было показано, что исследование процессов сорбции парамагнитных зондов на белке в растворах позволяет определить такие параметры как число центров сорбции и величины констант сорбции при обработке экспериментальных кривых в соответствующих координатах.

Исследование процессов сорбции парамагнитных зондов в плазме крови животных в условиях канцерогенеза показало существенное различие в кривых сорбции при сравнении с контролем (рис. 8). Обработка этого эксперимента в координатах Скэт-чарда показывает существенное изменение как числа центров сорбции зонда на белке, так и изменение в константах сорбции. Из этого рисунка видно, что число центров сорбции липид-ного 'зонда при канцерогенезе изменяется достаточно существенно ( от п=0.3 до п=0.8 ). Заметно меняется также и константа связывания. Все эти и многие другие эксперименты позволили нам разработать физические методики для раннего обнаружения процесса злокачественного изменения в организме животного.

Г/[А]

Рис.. 8

График Скэтчарда при сорбции иминоксильного ради!«ала на альбумине в норме (N5 и при канцерогенезе (СЮ.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Приведеннные в данной работе экспериментальные данные по молекулярной подвижности биополимеров в растворе позволяют сделать заключение о важной роли их электростатического взаимодействия. Исследование ЯМР релаксации растворов белков при малой ионной силе показало значительное изменение времен релаксации в зависимости от рН раствора. При этом наблюдаемое изменение вращательной подвижности глобулярных белков более чем на 100Х при изменении рН на 2 - 3 единицы можно интерпретировать либо как увеличение эффективного! обьема белка аа счет "присоединенного" гидратного слоя, либо как увеличение локального значения вязкости возле поверхности макромолекулы за счет поляризации молекул растворителя в результате электростатических взаимодействий. Последнее подтверждается данными по изменению характеристической вязкости и изменению времени корреляции молекулярной поляризуемости растворов глобулярных белков в экспериментах по измерению диэлектрической проницаемости. Прямая связь мевду спектром вра'шательного броуновского движения заряженных макромолекул и спектром движения "гидратного слоя"следует из данной работы при измерении скоростей ЯМР релаксации растворов белков в Н20 и ИйО при изменении рН раствора. Наличие низкочастотной компоненты в спектре движения растворителя целиком зависит от диффузионных характеристик биополимеров, которые в свою очередь определяются тасими параметрами как поверхностный заряд, ди-польный момент, форма и масса макромолекулы. С другой стороны молекулярная подвижность определяется и свойствами растворителя (вязкостью, температурой, диэлектрической проницаемостью, ионной силой и значением рН).Эти параметры могут изменятся в реальной биологической системе и влиять на ее функционирование.

ВЫВОДЫ

1. Методами ЯМР релаксации и диэлектрической спектроскопии впервые проведено многопараметрическое исследование вращательной подвижности заряженнных макромолекул в растворе. Обнаружена в определенной области концентраций и рН аномалия врадательной диффузии заряженных макромолекул, связанная с их сильным электростатическим взаимодействием. Это явление может играть важную регулирующую роль в процессах взаимодействия белков при малом изменении их заряда и концентрации.

2. Ддя исследования вязкости разбавленных растворов биополимеров впервые создан высокочувствительный вискозиметр ре-зо ясного типа. Установлена связь характеристической вязкости растворов макромолекул с их вращательной подвижностью. Пэказа-ио, что изменение заряда макромолекулы приводит как к изменению коэффициента вязкости, так и гремени вращательной корреляции, что проявляется в процессах сорбции и особенностях кинетики варяизнных полимеров в биологических системах.

3. При исследовании трансляционного движенья макромоле кул в растворе методом корреляции фотонов и ЯШ5 в градиенте поля показано увеличение коэффициента диффузии исследованных белков при возрастании их концентрации, и поверхностного заряда белка Получена однозначная связь молекулярных параметров болковых растворов, таких как вириальный коэффициент и коэффициент трансляционной диффузии измеренных методами релеевско-го рассеяния и корреляции фотонов.

4. Впервые обнаружено и исследовано диэлектрическое трение растворов биологически важных молекул методами ЯМР и ЭПР спектроскопии. В соответствии с предсказаниями теории наблюда-еся рост коэффициента трения с уменьшением диэлектрической проницаемости окружающей молекулу среды. Это явление может играть существенную роль в биофизике мембран и кинетики реакции при электростатическом взаимодействии малых молекул с поверхностью заряженных белков и других биополимеров.

5. Показано,что процессы сорбции малых молекул на поверхности макромолекул в разбавленных растворах могут быть описаны в рамках класической теории Ленгмюра Впервые опреде-

лены константы сорбции и времена вращательной корреляции пс ЯМР релаксации квадрупольных ядер. Установлено, что связывание отрицательных однозарядных ионов белком возрастает пропорционально увеличении их ионного радиуса. Полученные результаты позволяют обьяснить существование известного ряда активности биологически важных ионов.

6. Методом ЭПР обнаружено изменение характера связывания иминоксильного радикала в плазме крови при развитии канцерогенеза. Показано, что этот процесс приводит к существенному изменение числа центров сорбции на белках плазмы крови. Установлено, что обнаруженная аномалия определяете^, как изменением числа мест связывания зонда на поверхности! альбумина, так и степенью ненаеыщеннооти жирнокислотного состава липидного компонента лилопротеина Эти данные имеют важное практическое значение при решении проблемы диагностики онкологических заболеваний.

7. Обнаружено и детально исследовано сверхслабое радика-ло-рекомбинационное свечение в растворах биополимеров. Методами инициирования этого свечения впервые были определены характерные времена жизни радикалов и константы их соударения в различных системах. Исследованы модели определения антирадикальной активности водорастворимых веществ и гидрофобных соединений. Разработан метод для определения активных антиокси-дантов с предельной концентрацией до 0.1нм/л, что позволило исследовать процесс канцерогенеза по анализу антиокислителей в органах, тканях» в плазме крови.

8. При исследовании липидов биологического происхождения показано, что наблюдаемая рекомбинационная хемилюминесценция отражает цепной автокаталитический процесс в тканях и клетках, скорость которого определяется концентрацией и активностью биоантиоксидантов. Исследование химического канцерогенеза на животных с использованием хемилюминесцентной методики позволило установить колебательный характер изменения антирадикальной активности липидов, выделенных из различных тканей животных. Исследование спектров ЯМР липидов выделенных из

- 87 т.

плазмы крови животных при канцерогенезе,показало существенное изменение в спектре ненасыщенных жирных кислот, а также в спектре витамина А, витамина Е и холестерина, что подтверждает их активное участие в автокаталитическом окислении.

9. Приведенные в работе данные о молекулярной подвижности заряженных биополимеров методами ШР, ЭПР и диэлектрической спектроскопии, оптическими методами хемилшинесценции и светорассеяния, а также вискозиметрии находятся в достаточно хорошем согласии с теоретическими представлениями о зависимости вращательной и трансляционной подвижности биополимеров от к01.л.ентрации, молекулярного веса, Форш, заряда и дипольного момента макромолекулы, а также от вязкости, диэлектрической проницаемости, ионной силы и температуры. Изменение этих параметров существенно влияет на функционирование реальных биологических систем.

Основное содержание диссертации Ю. М. Петрусевича отражено в следующих публикациях:

1. Петрусевич Ю. М., Иванов И. И. Исследование спектров сверхслабой хемилюминесценции в процессах электролитического окисленияаминокислот. Биофизика, 10, 4, 698, 1965 г.

биологических системах", Тр. ШИП, стр. 211, М. 1966г.

2. Тарусов Б. IL , Иванов И. И., Петрусевич 1й М. Сверхслабое свечение биологических систем. Изд. МГУ, М. 1967г.

3. Петрусевич КХМ. Славянский Я. С. Определение активности биоантиоксидантов в системе цитрат-метанол злект-рохемилюминесцентным методом. Биофизика No 4, 4.720, т. 14, 1969г.

4. Славянский Я. С., Петрусевич IQ М. Спектральное исследование сверхслабого свечения некоторых биологическ-важных хинонов. Научные Доклады Высшей Шгады, No 5, стр.69, 1969г.

5. Tarusow B.N. , Petrusewicz J. M., Iwanow 1. I.

Ultra slaba chemiluminescencja ukladow

biologicznich. Materialy II , ogolnopolskiego

simp, biofiziki. 1969. p72.

6. Buzas S. К.,Goldstain N. I. , Ivanov I. I. .Petrusevich Yu. M. , Tarusov В. N. The role of tocopherols in radiosensetlvity of enimals. IV International congress of radiation research. Evian. Livre de resumes. 1970. p37.

7. Тарусов Б. H, Кожанов IL Г., Петрусевич Kl M. Исследование взаимодействия 20-метилхолонтрена с биолипидами методом люминесценции и электролюминесценции. Биофизика, 2, стр. 319-320, 1972г.

8. Тарусов Б. Н., Петрусевич Ю. М. , Кожанов Н. Г. , Макеев Д. А. , Новиков Е Э. Взаимодействие липидов и канцерогенов. Тезисы докл. 5-го Международного Биофизического Конгресса, .4 1972г.

9. Тарусов Б. Н. , Новиков В. Э. , Петрусевич Ю. М. Изменение стационарных окислительно-восстановительных потенциалов липидов печени животных при канцерогенезе. Биофизика, т. 14, вып. 1, стр. 112-115, 1974г.

10. Левина Н. В., Новиков Е Э. , Есакова Т. Д., Петрусевич Ю. № , Тарусов Б. Н Изучение вспышки хемилюминесценции и перикисного окисления липидов в мембранах эритроцитов. Биофизика т. 20, вып. 5, 1975г., стр. 944-S45.

И. Левина ЕЕ, Орлов С. Н., Петрусевич Ю. М., Тарусов Б. Н. Хемилюминесценции в модельных системах Оелок-ли-пид иод воздействием формалина. Биофизика, т. 21, вып. 3, 1976, стр. 420-423.

12. Кхандудка К., Есакова Т. Д., Петрусевич Kl Ii , Тарусов Б. Н. Перекисное окисление липидов микросом при химическом глнцерогенезе в условиях гипервитаминоза А. Шт. симп. "Свободнорадикальные процессы в липидах", 1976, стр. 128-130.

13. Петрусевич Ю, М. Сравнительная оценка чувствительности определения биоантиоксидантов хемилюминесцентными методами. Сб. "Хемилюминесцентный метод в биологии и медицине". Стр. 84.

14. Khandudzja К. К. .Petrusevich Yu.M. .Tarusov В. N. Changes in metabolism of 7.12DMBA under Influence'of vitamin A. International Cancer Research Data Bank 1979, p41.

15. Ревокатов 0. IL, Петрусевич lü M., Тихонов А. И. Способ диагностики злокачественных новообразований. А. С.

N 1319705, 1984.

16. Цыб А. Ф., Слесарев Е Г., Ревокатов 0. П. , Пэтрусевич lü М. Способ диагностики злокачественных новообразований. A.C. N 1238568,1984.

17. Петрова Г. П. , Петрусевич Ю. М., Ширкова И. И., Ревокатов 0. П. Взаимодействие сывороточного альбумина с водой при различных концентрациях водородных ионов. Вестник МГУ сер. 3,Физика, Астраломня,1986,т. 28,N2,ст. 59-63.

18. Brill lantov N. V. ,Kvytcevich A. I. .Petrusevich Yu. M. .Rovokatov 0. P. NMR and dielectric relaxation of polar macromoleculesin solutions. //Abstracts of 9-th AMPERE summer school, Novosibirsk, 1987, p 81.

19. Бриллиантов H. E .Квяткевич А. И. .Петрусевич КХМ.,Рево-

катов О. П. Врашательное броуновское движение полярных макромолекул в растворах. ДАН 1089, 304С ст. 340-344.

20. Вострикова Н. Г., Денисов а И , Петрусевич Ю. К , Рево-катов 0. П. , Взаимодействие воды с аминокислотами и белками, изученное методами ЯМР-релаксации. // Вестник ЫГУ, Сер. 3, т. 27, N.5, стр. 76-78, 1986.

21. Кулевацкий О. Г. , Зацепина Г. а , Петрусевич Ю. М., Ре-вокатов 0. П. Изменение ЯМР релаксации протонов плазмы крови животных при экспериментальном канцерогенезе. Биофизика, 1986, 31, 4, с. 676-680. |

22. Бриллиантов Н. К , Квяткевич А. И. , Петрусевич КХ М., Ревокатов О. П.' ЯМР и диэлектрическая релаксация полярных макромолекул в растворах: Тезисы докладов.

9 Международная школа по магнитному резонансу,1987,с. 19.

23. Ревокатов О. П. , Петрусевич 1й М Способ диагностики злокачественных новообразований.- Заявка на изобретение N 4365110, 1988.

24. Бриллиантов а К , Квяткевич А. И., Петрусевич Ю. М., Ревокатов О. П. Влияние полярного момента макромолекул на частотную зависимость времен ЯМР релаксации биополимеров в растворах. Сб. "Радиоспектроскопия", Пермь. 1388, с. 154-156.

25. Петрова Г. П., Петрусевич К1 Ы., Ширкова И. И. , Ревокатов 0. П. Взаимодействие сывороточного альбумина с водой приразличных концентрациях водородных ионов по данным релеевс-кого рассеяния. Вестник МГУ,

Сер. 3,'1987 , 28, 2, с. 59-63.

26. Денисов Е П., Петрусевич Ю. М., Ревокатов О. П. Исследование вращательного трения молекул белков в водном растворе при различных концентрациях ионов водорода. Влияние заряда биополимеров на молекулярное движение

в растворах. Отчет за 1986-1987 гг по программе сотрудничества стран-членов СЭВи СФРЮ по проблеме "Исследования в области биологической физики", с. 171-172.

27. 'ОеШБОУ V. Р. , РеЬгизеу1с11 Уи. М., РеуокаЬоу О. Р.