Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Экспериментальные и теоретические исследования консервативных структурных мотивов в НАД-зависимых дегидрогеназах

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Экспериментальные и теоретические исследования консервативных структурных мотивов в НАД-зависимых дегидрогеназах"

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА ОРДЕНА ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИ о? И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ 5? ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

о им. М.В.ЛОМОНОСОВА

$

чс

Со Физический факультет

/

На правах рукописи

КУЦЕНКО АЛЕКСЕЙ СТАНИСЛАВОВИЧ

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ И ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ КОНСЕРВАТИВНЫХ СТРУКТУРНЫХ МОТИВОВ В НАД-ЗАВИСИМЫХ ДЕГИДРОГЕНАЗАХ

Специальность 03.00.02 — биофизика

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

Москва - 1998

Работа выполнена в лаборатории компьютерного и структурного анализа

биополимеров Института молекулярной биологии им. В.А.ЭнгельгардтаРАН.

НАУЧНЫЕ РУКОВОДИТЕЛИ:

доктор физико-математических наук, профессор В.Г.Туманян, доктор химических наук, профессор В.ОЛопов.

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

доктор физико-математических наук, профессор В.ИЛобышев, доктор физико-математических наук В.Р.Мелик-Адамян.

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ:

Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН (г.Пущино)

Защита состоится 16 апреля 1998 года в 16.30 часов в аудитории ЮФА на

• заседании Диссертационного совета К 053.05.77 в Московском

государственном университете им. М.В.Ломоносова по адресу:

119899, ГСП, г.Москва, Воробьевы горы, МГУ им. М.В.Ломоносова, физический факультет.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке физического факультета

МГУ им. М.В.Ломоносова.

Автореферат разослан 16 марта 1998 года.

Ученый секретарь Диссертационного совета,

• кандидат физико-математических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы.

Проблема укладки полипептидной цепи в уникальную пространственную структуру является актуальной уже несколько десятилетий и до сих пор, по-видимому, достаточно далека от своего решения. Тем не менее, теория белковых структур развивалась довольно эффективно. В значительной мере это связано с развитием стереохимического анализа белковых структур, опирающегося на идею о существовании так называемых стандартных структур полипептидной цепи или, иначе, супервторичных структур, то есть одинаковых структурных единиц, повторяющихся в различных белках и определяющих основные иерархические модули пространственного ансамбля белковых макромолекул.

В ходе исследования трехмерной структуры белков возникла проблема определения взаимосвязи между структурой и биологической и химической функциями биополимеров, иногда имеющих различные .функции при одинаковой структуре, а иногда строго подчиняющихся закону, структура — функция.

Среди последних долгое время наиболее ярким примером была пространственная организация так называемого кофермент-связывающего домена в НАД-зависимых дегидрогеназах, открытая более двух десятилетий назад. Пространственная организация такого типа явилась, по сути, первым примером супервторичной структуры — укладки Россмана или, иначе, нуклеотид-связывающего домена — структуры, связывающей нуклеотиды, находящиеся в составе различных химических соединений. На сегодня уже имеется достаточное число примеров, когда подобного рода домены имеются в белках, не обладающих ни НАД-, ни нуклеотид-связывающими свойствами, а данная функция может поддерживаться и другой' третичной структурой. Однако вопрос о том, как конкретная структура поддерживает данную функцию, остается нерешенным, правда, на фоне более общей проблемы: соотношения трехмерной структуры белка и активного центра, достаточного для проявления функции.

НАД и НАДФ являются кофакторами большого количества ферментов, которые при всем многообразии катализируемых ими реакций, имеют ряд консервативных свойств, определяемых природой используемого кофермента. Эта особенность, сочетающаяся с древностью использования живыми организмами молекулы НАД в окислительно-восстановительных реакциях, выделяет эти ферменты как уникальный объект для изучения происхождения и эволюционирования ферментов, использующих сложные кофакторы.

Вторая проблема, важная для понимания механизмов функционирования и структурообразования в мультидоменных ферментах —

проблема регуляции. Она тесно связана с проблемой симметрии доменной и субъединичной организации белков. Наиболее характерные примеры такой организации выявляются при рассмотрении класса дегидрогеназ.

В настоящей работе изучены закономерности структурной организации ряда нуклеотид-связываюхцих ферментов, в основном НАД-зависимых дегидрогеназ 2-оксикислот, а также на примере формиатдегидрогеназы определены вклады во внутримолекулярные взаимодействия некоторых классических супервторичных структур и новой, найденной нами в D-специфических дегидрогеназах, супервторичной структуры типа а-спираль — укладка Россмана—а-спираль.

НАД-зависимая формиатдегидрогеназа (ФДГ) метилотрофных бактерий Pseudomonas sp.101 катализирует последнюю стадию метаболизма метанола — окисление формиата до СО2 при сопряженном восстановлении никотинамидадениндинуклеотида НАД в НАД «II. Проведенные к настоящему времени физико-химические исследования ФДГ показали, что данный фермент является весьма интересным объектом для изучения собственно НАД-зависимого дегидрирования. В отличие от хорошо изученных к настоящему времени дегидрогеназ, ФДГ обладает достаточно простым субстратом, а в катализируемой ферментом реакции отсутствует стадия переноса протона с субстрата на фермент, что позволяет существенно расширить представления о движущих силах реакции. ФДГ обладает нетипичной для большинства дегидрогеназ пространственной организацией субъединицы фермента, когда оба домена субъединицы — каталитический и кофермент-связывающий — имеют одинаковую топологию.

В виду того, что НАД как кофактор работает с огромным числом различных ферментов, все типы стандартных структур, встречающиеся в дегидрогеназах, могут играть важную роль в механизмах структурообразования и каталитических функциях этих ферментов, и, следовательно, исследования супервторичных структур сохраняют свою актуальность.

Цели и задачи исследования.

• Исследование внутренней симметрии белковых субьединиц в пространственных структурах D-специфичных дегидрогеназ.

• Анализ пространственной гомологии доменов D- и L-специфичных дегидрогеназ на основе выделенного консервативного структурного мотива.

• Поиск новых типов супервторичных структур в D-специфичных дегидрогеназах.

• Анализ физико-химических свойств формиатдегидрогеназы, определяемых конкретными супервторичными структурами.

Научная новизна работы.

Проведен исчерпывающий анализ распределения конформаций по

пространственной структуре формиатдегидрогеназы из Pseudomonas sp. 101.

Впервые найдена третья укладка Россмана, расположенная в каталитическом

домене, что означает, что каталитический центр ФДГ частично формируется

за счет вторичных структур, принадлежащих укладке Россмана. Показано, что

в структуре ФДГ имеется дополнительная к двум осям симметрии: оси

симметрии второго порядка, связывающей субъедшшцы фермента, и оси

псевдосимметрии, связывающей классические укладки Россмана в

кофермент-связывающем домене, — ось псевдосимметрии, связывающая

между собой домены, принадлежащие к каждой из субъедипиц. Поэтому

результирующая внутренняя симметрия фермента выглядит как

77 7 ^псевдо-псевдо-

Проведен подробный анализ пространственных гомологий в классе D-специфичных дегидрогеназ. Показано, что внутренняя симметрия, обнаруженная на примере ФДГ, свойственна всем D-специфичным дегидрогеназам. Таким образом, дегидрогеназы 2-оксшшслот разбиваются на два структурно различных класса: D- и L-специфичные дегидрогеназы. Поиск гомологий в дегидрогеназах проведен с использованием нового консервативного структурного мотива на уровне супервторичной структуры, выявленого в НАД-зависимых дегидрогеназах. Пространственные гомологии впервые обнаружены и в каталитических, и в кофермент-связывающих доменах дегидрогеназ, что позволяет классифицировать домены дегидрогеназ в банке структурной классификации белков SCOP на соответствующем уровне доменной организации.

Впервые найден новый тип супервторичной структуры, наблюдающийся во всех D-специфичных дегидрогеназах: а-спираль — укладка Россмана —а-спираль. Эта стандартная структура обнаружена в восьми доменах дегидрогеназ. Новые супервторичные структуры включают в вышеназванных дегидрогеназах классическую супервторичную структуру Россмана.

Проанализирована роль новой супервторичной структуры в свойствах кофермент- и субстрат-связывающих центров ФДГ: примыкающие к укладке Россмана длинные а-слирали создают естественные каналы для недиффузионного дрейфа кофакторов и субстратов в зоны активных центров фермента. Экспериментально установлена роль длинных а-спиралей в пространственной структуре дегидрогеназ.

Практическая значимость работы.

Детальное изучение нового типа пространственной укладки полипептидных цепей в ряде глобулярных белков может помочь при компьютерных разработках лекарственных препаратов, в том числе для

ингибирования дегидрогеназ и других нуклеотид-связывающих белков, что важно, в частности, при создании новых противораковых препаратов. Этот тип укладки можно использовать в качестве стабильного белкового модуля при белковой инженерии дегидрогеназ и создании химерных белков.

Достоверность результатов.

Все полученные результаты опираются на данные рентгеноструктурного анализа с высоким разрешением. Поэтому они составляют серьезную основу для оценки полной обоснованности основных научных результатов.

Апробация работы.

Результаты диссертации докладывались на Втором съезде биохимического общества Российской Академии наук, Москва, 19 — 23 мая, 1997г. и на Третьей международной Энгельгардтовской конференции (ТЬе 3rd international Engelhardt conference on molecular biology, Volga), 9—14 июня, 1997г.

Публикации.

По материалам работы опубликованы три статьи и тезисы.

Основные положения, выносимые на защиту:

• Внутренняя симметрия в третичных структурах в D-специфичных дегидрогеназах.

• Структурная классификация доменов D- и L-специфичных дегидрогеназ на основе пространственной гомологии выделенного консервативного структурного мотива.

• Новый ' тип супервторичной структуры в D-специфичных дегидрогеназах и его свойства.

Структура и объем работы.

Диссертация изложена на 115 страницах и включает 28 рисунков и 13 таблиц. Список цитированной литературы состоит из 107 наименований. Диссертация состоит из введения, шести глав и заключения.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во Введении обоснована актуальность темы диссертации, определены цели и задачи исследования.

В первой главе дан критический обзор литературы. Изложены основные принципы структурной организации НАД-зависимых дегидрогеназ и физико-химические основы их функционирования. Подробно рассматриваются пространственное сходство и результаты проведенных на данный момент пространственных сравнений структурно общих для данного класса белков кофермент-связывающих доменов и лежащих в их основе

укладок Россмана, анализируются гомологичность последовательностей этих структур и характерные для дегидрогеназ диполь—зарядовые взаимодействия a-спиралей укладок Россмана с кофактором. Дано описание стереоспецифичности дегидрогеназ, приведены данные об известных структурных гомологиях в классах D- и L-специфичных дегидрогеназ. В обзоре представлены данные структурных и этимологических исследований формиатдегидрогеназы, излагается предполагаемый молекулярный механизм действия фермента.

Во второй главе излагаются материалы и методы, использованные в

работе. Приводится список пространственных структур анализируемых в

•к

работе белков из банка структур (Protein Data Bank): ФДГ , ano- и холо-формы (PDB-коды 2пас и 2nad), ОГДГ (lgdh), ФГДГ (lpsd), ВЛДГ (2dld), ЛДГ (lldm), МДГ (4mdh), АДГ (8adh), ГАФДГ (2gdl), ГЛР (3grs), ДГФР (8dfr), ФД (2fcr). Излагается алгоритм Pao и Россмана сравнения трехмерных структур белков, по которому организуется итеративный процесс вычисления матрицы вращения и вектора переноса, которые ориентируют одну молекулу подобно другой. Число N пространственно эквивалентных пар Са-атомов в совмещенных структурах и среднеквадратичное расстояние R по N парам атомов рассматривались как показатели подобия при сравнении.

В части, посвященной экспериментальной работе, приводятся условия выделения белка из биомассы дикого штамма метилотрофных бактерий Pseudomonas sp. 101 и условия, при которых были получены спектры кругового дихроизма (КД). Спектры КД получали в интервале длин волн от 195 до 250 нм.

Описывается процедура определения по данным КД относительного содержания а-спиралей, ß-структур, ß-изгибов и неупорядоченных структур в белке модифицированным методом Болотиной и соавторов [Морозов и соавт., 1995] с автоматическим учетом вклада ароматических аминокислотных остатков.

Приводится способ расчета дипольных моментов в белке, реализованный в использовавшейся нами программе Федорова [Макаров и соавт., 1993]. Дипольные моменты фрагментов белка вычисляли как сумму векторов дипольпых моментов пептидных групп и дипольных моментов боковых радикалов в предположении электронейтральности молекулы.

Здесь и далее использованы следующие сокращения названий белков: ФДГ — формиатдегидрогеназа, 1)ГДГ — О-глицератдегидрогеназа, ФГДГ — О-фосфоглицератдегидрогеназа, Г) ЛДГ — П-лактатдегидрогенаад, ЛДГ — лактатдепщрогеназа, МДГ — малатдегидрогеназа, ЛДГ — алкогольдегидрогеназа, ГАФДГ — глицеральдегид-З-фосфатдегадрогеназа, ГЛР — глутатионредуктаза, ДГФР — дигидрофолатредуюгаза, ФД — флаводоксин.

*

В третьей главе приведены результаты поиска пространственных гомологий в структуре НАД-зависимой формиатдегидрогеназы из Pseudomonas sp.101. Как отмечалось во Введении, отличительной чертой ФДГ является близость топологии каталитического и кофермент-связывающего доменов. В основе каждого из доменов лежит так называемая Россман-подобная структура (Rossmann-like domain), которая образуется укладками Россмана. С целью выявления укладки Россмана в субстрат-связывающем домене проведено сравнение участка ß5 — аЗ — ß7 — а4 — ß8 этого домена с двумя классическими укладками Россмана из НАД-связывающего домена: с никотинамид-связывающей укладкой ßD — аЕ — ßE — aF —ßF и аденозиндифосфат-связывающей укладкой ß А—aB — ßB — аС — ßC. Попарное сравнение перечисленных структур друг с другом и с другими фрагментами вторичных структур ФДГ позволило выявить степень трехмерной гомологии данных укладок Россмана и отсутствие в структуре белка иных гомологичных супервторичных структур типа укладки Россмана. Так, последовательность ßE—aF— ßF—aG — ßG, имеющая общий для укладок Россмана тип чередования элементов вторичной структуры ßaßaß, не гомологична по пространственной структуре с указанными классическими и новой укладками Россмана.

Наилучшим является совпадение новой укладки с хорошо охарактеризованной никотинамид-связывающей укладкой из кофермент-связывающего домена, их длины равны 52 и 60 остаткам соответственно (номера остатков 90—141 и 248 — 307). Более половины этих остатков оказались пространственно эквивалентными, среднеквадратичное расстояние варьирует от R=0,43 Ä до R=0,93 Ä при совмещении только ß-цепей или только a-спиралей. При совмещении укладок целиком по всем пяти элементам вторичной структуры среднеквадратичное расстояние R=l,40 к между 34 эквивалентными парами. Следует отметить, что полученные цифры показывают лучшее совпадение данных участков, чем при совмещении классических укладок Россмана: R=l,58 Ä между 18 эквивалентными парами. Даже несмотря на небольшой поворот двух а-спиралей относительно ß-листа, общее совпадение всего структурного элемента остается достаточно высоким по сравненшо с данными пространственного сравнения других структур. Вторая укладка Россмана в кофермент-связывающем домене ФДГ ßA — aB— ßB — аС — ßC (остатки 193—238, длина 46) также совпадает с укладкой ß5 — a3 — ß7 — а4 — ß8, но несколько хуже. Пространственно эквивалентными являются только ß-цепи: R=0,69 Ä между 19 парами, а соединяющие их a-спирали расходятся далеко и совпадение отсутствует: R=8,00 Ä.

В проводившихся ранее определениях гомологичных структур во всем классе дегидрогеназ сравнивались либо кофермент-связывающие домены по эквивалентным позициям в ß-листах, либо первые ßaß-элементы

аденозиндифосфат-связывающих укладок Россмана. Чтобы определить родственность структуры ФДГ структурам дегидрогеназ на основе укладок Россмана — главного пространственного элемента этих белков, нами было также проведено сравнение новой укладки Россмана из ФДГ с другими классическими нуклеотид-связывающими укладками Россмана из трех дегидрогеназ: алкоголь-, малат- и глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы. Совпадение укладки из каталитического домена ФДГ с классическими структурами оказалось меньшим, чем с PD — аЕ — (ЗЕ — aF— [3F укладкой в ФДГ. Количество пространственно совпадающих атомов основной цепи ниже, от 14 до 19, R=0,69-^0,89 А и совпадающими оказываются только р-цепи, в то время как связывающие их участки, в отличие от ФДГ, различны.

Для проверки значимости полученных результатов проведено сравнение новой укладки с укладкой Россмана фермента глутатионредуктазы. Глутатионредуктаза принадлежит к классу НАД-связываюших ферментов, но не относится к группе дегидрогеназ. Сравнение проведено с НАД-связывающей укладкой Россмана РСЗ — РС4 — рС5 (домен 2). При этом удалось совместить только р-цепи, причем отклонение намного больше: R=l,44 А между 17 эквивалентными парами, а соединяющие участки расходятся.

Таким образом, установлено, что в каталитическом домене ФДГ имеется структурный мотив типа укладки по Россману, Р5 — a3 — Р7 — а4 — р8, который, однако, не связывает нуклеотид. Укладка Россмана, находящаяся в каталитическом домене ФДГ, . совпадает по своей пространственной структуре с известной никотинамид-связывающей укладкой Россмана ФДГ в большей степени, чем с адениндифосфат-связываюгцей или с укладками Россмана в других дегидрогеназах. Следует отметить, что гомология по первичной структуре в указанных структурах и в целом между доменами ФДГ не наблюдается.

Сходство пространственных структур двух доменов акцентируется их симметричным расположением (рис.1). Таким образом, в структуре ФДГ появляется дополнительная ось симметрии второго порядка. В целом пространственная структура формиатдегидрогеназы обладает высокой степенью внутренней симметрии типа 22псеВдо2т:евдо- Она характеризуется тремя взаимоперпендикуляркыми осями симметрии. Одна ось симметрии второго порядка — ось точной молекулярной симметрии субъединиц в димерной молекуле белка. Две других — псевдооси. Первая — ось симметрии двух укладок Россмана в кофермент-связывающем домене, которые, как видно из рис.1, совмещаются поворотом на 180° вокруг оси, лежащей в плоскости Р-листа между третьей и четвертой Р-цепями (рА и PD). Вторая, новая, ось лежит между доменами формиатдегидрогеназы (перпендикулярно плоскости рисунка) и определяет симметрию новой

Рис.1. Стереоизображение структуры субъединицы: ФДГ. Выделены укладки Россмана Р5 — аЗ — (57—а4 — (38 из каталитического домена ФДГ (остатки 90—145, темная цепь), РЭ — аЕ — рЕ—аБ — рБ (остатки 248 — 307, темная цепь) и рА—оВ — рВ—аС —рС (остатки 193—238, светлая цепь) из НАД—связывающего домена ФДГ. Ось симметрии р5-аЗ-р7-а4-р8 и рв - аЕ - рЕ - ар - рр обозначена

укладки Россмана в каталитическом домене и классической никотинамид-связывающей укладки Россмана в кофермент-связывающем домене.

В четвергом главе проанализирована внутренняя симметрия пространственных структур всего класса 1>спсцифичных

дегидрогеназ, в который входит формиатдегидрогеназа.

Ранее, . на основании сравнения последовательностей, ФДГ была отнесена к классу О-специфичных дегидрогеназ. Поэтому следующим этапом нашей работы было сравнение пространственных структур четырех известных дегидрогеназ этого класса (ФДГ, ИГДГ, ВГДГ и ОЛДГ) между собой. На основе суперпозиции субъединиц белков целиком можно сделать вывод о хорошем совпадение структур (табл.1). Около 70% структуры Б-глицератдегидрогеназы (223 остатка из 320) накладываются на ФДГ со среднеквадратичным

Табл.1. Наложение субъединиц D — специфичных дегидрогеназ друг на друга. В верхней половине таблицы приведены числа эквивалентных пар атомов N и среднеквадратичные расстояния R,A в виде N/R, в нижней — соответствующие параметры вида: среднеквадратичное расстояние/число пар — (R/N), Ä.

ФДГ ОГДГ ФГДГ олдг

ФДГ * 223/2,3 192/2,2 -6,0

ОГДГ 0,01 232/1,4 216/1,7 (186/1,3)

ФГДГ 0,011 0,006 201/1,5 (151/0,9)

олдг — 0,008 (0,007) 0,007 (0,006)

В скобках даны результаты с наименьшим расстоянием.

расстоянием 2,3 А. Соответствующие значения для пар БГДГ—ФГДГ, Dr ДГ — 13ЛДГ и ФГДГ — Т)ЛДГ выглядят еще лучше. Однако, не совмещаются структуры субъединиц формиатдегидрогеназы и D-лактатдегидрогеназы (R~6,0 Ä). Причина этого в различной взаимной ориентации каталитического и кофермент-связывающего доменов в этих белках. Угол поворота одного домена вокруг оси псевдосимметрии второго порядка при совмещении с другими доменами составляет для ФДГ, 0ГДГ, ГФДГ и 0ЛДГ 165,5°, 173,3°, 176,5° и 171,3° соответственно. Два домена субъединицы в D-специфичных дегидрогеназах связаны посредством длинных (18 — 22 остатка) а-спиралей (аА и а8 в случае ФДГ), являющихся своеобразными шарнирами, вокруг которых происходит поворот доменов при связывании кофактора. Отклонение доменов от некоторого среднего положения в разные стороны не позволяет совместить субъединицы целиком, в то время как по отдельности домены совмещаются, что свидетельствует о структурном родстве белков.

В таблице введен новый численный критерий структурного выравнивания: среднеквадратичное расстояние/число эквивалентных нар — параметр R/N. Поскольку при сравнении результатов попарного выравнивания структур приходится сопоставлять данные - с различным среднеквадратичным расстоянием для разного числа эквивалентных пар, то встает проблема выбора лучшего наложения: меньшее среднеквадратичное расстояние (точнее соответствие структур), но и меньше эвивалентных атомов, либо среднеквадратичное расстояние больше, но и больше число совпавших пар атомов (большие куски структур совпадают) (см., например, табл.1). Приведение данных к одному знаменателю, тем не менее, может обеднить дашше, так как задание расстояния ограничит размеры сравниваемых структур, а наложение структур с заданием эквивалентных пар сводит задачу попарного сравнения к значительно более трудоемкой задаче множественного пространственного выравнивания, используемого, например, в задачах предсказания структуры. Параметр же "среднеквадратичное расстояние/число эквивалентных пар" имеет компенсаторный характер и несет простой смысл усреднения данных выравнивания. Для субъединиц D-специфичных дегидрогеназ параметр R/N составляет 0,008±0,002 А.

Сходство структур субъединиц D-специфичных дегидрогеназ дополняется одинаковой пространственной организацией их доменов. На рис.2 приведено наложение двух доменов ФДГ друг на друга. Как показано в третьей главе, каталитический домен ФДГ содержит укладку Россмана, совпадающую с никотинамид-связывающей укладкой Россмана из кофермент-связывающего домена. Из рисунка видно, что оба домена имеют более широкую пространственную гомологию, включающую ß-лист целиком и а-спирали, не входящие в укладки Россмана. Топология кофермент-связывающего домена ФДГ задается последовательностью элементов

вторичной структуры аА—а5 — аб — РА—аВ — рв — аС — рС — al — (3D — aD—аЕ —рЕ —aF —pF—aG—PG, составляющих трехслойную структуру, где два внешних слоя образованы a-спиралями, а между ними располагается р-слой параллельной p-структуры. Каталитический домен ФДГ обладает той же топологией, что и кофермент-связывающий домен. Последовательность вторичных элементов pi —al — р4 —a2 —Р5 —a3 — Э7 —а4 —£8 — (вставка кофермент-связывающего домена)—а8 также организована в трехслойную a/p/a структуру или так называемый двойной а!Р-сэндвич (doubly wound a/p sandwich). Пространственно эквивалентные элементы вторичной структуры выделены жирным шрифтом, их соответствие приведено на рис.3 (верхний уровень схемы). Суперпозиция доменов дает среднеквадратичное расстояние 1,1 Á для 52 пространственно эквивалентных пар Са-атомов в этих структурах. Гомология по последовательности между доменами ФДГ невысокая.

Рис.2. Стереоизображение наложения каталитического (прерывистая линия) и кофермент-связывающего (сплошная линия) доменов ФДГ.

Помимо ожидаемого совпадения укладок. Россмана в доменах, примечательной особенностью является пространственное выравнивание двух пар спиралей а2 — а7 и а8 — аА. Последние протяженные а-спирали, длиной 22 (а8) и 18 (аА) остатков соответственно, по первичной структуре находятся в разных концах последовательности относительно самих доменов: аА — в начале кофермент-связывающего домена (Ы-конец домена), а8 — в конце каталитического домена после вставки кофермент-связывающего (С-конец домена). Такая консервативность пространственного положения необходима, по-видимому, для симметрии распределения зарядов и диполей а-спиралей. Спирали каждого из доменов направлены в противоположные стороны относительно щели между доменами, в которой происходит

связывание кофактора и субстрата, и ориентированы своими N-концами в область активного центра. Таким образом, дипольные моменты спиралей, ориентированы к месту связывания лигандов своими положительно заряженными концами па протяжении всего участка узнавания и связывания, что должно играть роль в направленном дрейфе к активному центру отрицательно зараженной молекулы формиата и несущей отрицательные заряды на фосфатных группах молекулы НАД и(или) нужной ориентации

Далее сравнение кофермент-связывающего и каталитического доменов было расширено нами на весь класс D-специфичных дегидрогеназ. Во всех белках данного класса оба домена субъединицы демонстрируют высокое пространственное сходство (табл.2). Параметр R/N для суперпозиции доменов составляет 0,029+0,008 Ä. Пространственное сходство наблюдается в тех же вторичных структурах, что и в ФДГ. Таким образом, внутренняя симметрия субъединицы, установленная в ФДГ на основе обнаруженной нами в ее структуре третьей укладки Россмана, расположенной в каталитическом домене, может быть распространена на весь класс D-специфичных дегидрогеназ. Причем важно, что эта- симметрия выявлена в протяженных участках структуры, включающих более половины домена и большое количество одинаково ориентированных а-спиралей.

Пространственное выравнивание лактат- и малатдегидрогеназы дает среднеквадратичное расстояние 1,42 А для 209 эквивалентных пар. Этот результат хорошо согласуется с литературными данными о высокой структурной гомологии этих белков, субстратами которых являются L-2-оксикислоты, отличающиеся одной карбоксильной группой. К тому же структурному классу L-специфичных дегидрогеназ относятся глицеральдегид-З-фосфатдегидрогеназа и алькогольдегидрогеназа. Их характерной чертой является одинаковая топология кофермент-связывающих доменов на основе укладки Россмана и различное строение каталитических доменов, в основе которых в большинстве случаев лежит антипараллельная ß-структура. Таким образом, НАД-зависимые дегидрогеназы могут быть разделены на два структурных семейства: D- и L-специфичные дегидрогеназы, отличие которых состоит в симметричной (для D-) и несимметричной (для L-) пространственной организации субъединиц, состоящих из доменов, образованных на основе укладки Россмана (Rossmann-like domains).

лигандов в активном центре.

Табл.2. Наложение друг на

друга каталитического и кофермент—связывающего доменов в D — специфичных дегидрогеназах. Приведены числа эквивалентных пар

атомов N, средневадратичные расстояния R, параметры R/N.

N R, А R/N, А

ФДГ 52 1,1 0,021

ргдг 53 1,35 0,025

ФГДГ 32 1,15 0,036

рлдг 50 1,83 0,037

Рис.3. Диаграммное представление структур кофермент — связывающих и каталитических доменов НАД—зависимых дегидрогеназ и родственных белков. Цилиндры означают а — спирали, треугольники — р — структуры. Топологически эквивалентные части структур выделены серым. Cat — каталитический домен; СоЕ — кофермент—связывающий домен. Показаны только консервативные элементы структуры. Обозначения вторичных элементов соответствуют номенклатуре в ФДГ: каталитический домен pi — р4—а2 — р5 —аЗ — Р7—р8 — а8; кофермент—связывающий домен pA-pB-a7-pD-ccD-pE-pF-ccA.

a3/aD,aE

p4/piT

ФДГ-Cat ФДГ-СоЕ ИГДГ—Cat ВГДГ-СоЕ ФГДГ-Cat

_ ФГДГ-СЬЕ

J31/0A p5/pD P7/PE/P8/PF DAAT-Cat

DAAT-Cbe

"ШЙ'"' А8/аА

ЛДГ-Сое МДГ-Cbe

АДГ-Сое ГАФДГ-Сое

ГЛР-Сое ДГФР-Сое

ФД-СЬе

Подробная характеристика пространственной гомологии структур Б-специфичных дегидрогеназ: ФДГ, ПГДГ, БЛДГ, ГФДГ, Ь-специфичных дегидрогеназ: ЛДГ, МДГ, АДГ, ГАФДГ, а также родственных белков — редуктаз: ДГФР, ГЛР и флаводоксина — позволяет выделить структурный мотив, общий для каталитических доменов Б-дегидрогеназ и кофер-мент-связываюгцих доменов Б- и Ь-дегидрогсназ как консервативный супервторичный структурный мотив. Этот мотив включает параллельную пятицепочечную р-структу-ру и две а-спирали. Топология мотива включает одну полную укладку Россмана (три Р-цепи), одну частичную (две Р-цепи), соединяющую их короткую сс-спираль (а2 для каталитического домена ФДГ, а7 — для кофермент-связывающего) и длинную а-спираль (а.8 и аА соответственно), лежащую по другую сторону р-листа относительно первой.

" На диаграмме (рис.3) показано схематическое изображение кофермент-связывающего и каталитического доменов НАД-зави-симых дегидрогеназ и родственных им белков. Приведенные уровни соответствуют степени убывания

гомолопш повторяющегося структурного мотива в указанных белках.

Наивысшей степенью гомологии обладают кофермент-связывающие домены В-специфичных дегидрогеназ (Сое-[3); для них число эквивалентных пар атомов К=128±10, среднеквадратичное расстояние 11=0,79±0,06 А, что дает 11/№=0,0062 (см. табл.3). Затем следуют каталитические домены О-специфичных дегидрогеназ и кофермент-связывающие домены I.-специфичных дсшдрогеназ. Для последних структурные мотивы в лактатдегидрогеназе и малатдегидрогеназе имеют более высокую степень

Табл.3. Суперпозиция НАД(Ф)—связывающих Россман—подобных доменов. Приведены числа эквивалентных пар атомов N, среднеквадратичные расстояния R, параметры R/N.

Название сравниваемых структурных доменов N R, Ä " R/N, А

Кофермент-связывающие домены в Б-специфичных дегидрогеназах (СоЕ-Б) 138+10 0,79+0,06 0,006+0,001

Каталитические домены в Б-специфичных дегидрогеназах (СаЫО) 70+13 1,3±0,3 0,019±0,005

Кофермент-связывающие домены в Ь-специфичных дегидрогеназах (СоЕ-Е) 53±9 1,3±0,5 0,025+0,01

Каталитический домен ФДГ и СоЕ-Ь (Са1 РБН апс! СоЕ-Ь) 38±6 1,2+0,2 0,032+0,007

Домены ФДГ и редуктаз, флаводоксина 28+6 . 1,4+0,3 0,051+0,015

гомологии, чем в алкогольдегидрогеназе и глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназе, в АДГ и ГАФДГ пространственно не эквивалентны соединяющие- укладки Россмапа короткие а-спирали (а2, а7 в ФДГ). В структуре редуктаз отсутствует гомология длинных ос-спиралей (а8, аА), в ферредоксине эквивалентным является уже только |3-лист.

Постоянно увеличивающийся объем решенных пространственных структур белков требует систематизации и классификации большого количества данных рентгеноструктурного анализа. При этом многие вновь определенные структуры оказываются гомологичными уже известным либо целиком (обычно, в однодоменных белках), либо в определенных частях структуры, чаще всего — в доменах глобулы (в мультидоменных белках). Поэтому, представляется важной задача классификации структур белков. Это имеет большое значение для задачи предсказания пространственной структуры белка по последовательности. В настоящее время создан и активно развивается банк классификации пространственных структур белков SCOP (Structure Classification of Protein), доступный, в частности, по каналам Internet [Murzin и соавт., 1996]. Структуры белков разбиваются на группы по следующей системе иерархической организации: SCOP Класс -> Фолд (Тип укладки) -» Суперсемейство -> Семейство -> Домены —> Белок.

Наиболее трудоемкой является задача определения доменного уровня при сравнении мультидоменных белков, так как различные домены почти всегда имеют различный тип укладки цепи. Зачастую эта задача не решается полностью, а белки классифицируются по доменам одного рода.

Из сопоставления каталитических доменов D-специфичных дегидрогеназ и кофермент-связывающих доменов L- и D-специфичных дегидрогеназ, проведенного выше на основе сравнения выделенного нами в НАД-зависимых дегидрогеназах консервативного структурного мотива 5р+2а в указанных структурах (табл.3), отчетливо видно разбиение всей группы доменов на три подгруппы по степени пространственной гомолопш внутри подгруппы. Домены образуют ряд по степени убывания гомологии: Ц кофермент-связывающие домены D-специфичных дегидрогеназ; 2)_ каталитические домены D-специфичных дегидрогеназ; 31 кофермент-связывающие домены L-специфичных дегидрогеназ. Такое структурное деление соответствует уровню доменов в иерархии структур банка классификации пространственных структур SCOP. Таким образом, на этом подуровне может быть проведена классификация (рис.4) структур белков, входящих в вышерасположенный уровень семейства НАД-связывающих белков по типу их доменов.

Рис. 4. Классификация НАД—связывающих белков по типам доменов. Слева приведена схема иерархической организации банка SCOP, справа — соответствующие уровни для НАД—связывающих белков. Показано разбиение данного класса на два подкласса D— и L—специфичных ферментов, с разделением на подгруппы на доменном уровне: 1) Сое —D, 2) Cat-D, 3) Coe-L.

SCOP

КЛАСС

ФОЛД

СУПЕРСЕМЕИСТВО

СЕМЕЙСТВО

ДОМЕНЫ

БЕЛОК

\ I

а/р-белки

I

НАД-связывающне домены

НАД-связывающие белки

I-1-1

D— специфичные дегидрсгеназы

г-1—

Coe-D

L-

специфичные дегидрогеназы

Cat-D

Coe-L

В пятой главе описывается новый тип супервторичной структуры в D-специфичных НАД-зависимых дегидрогеназах.

При расширенном сравнении новой, третьей в субъединице молекулы ФДГ, укладки Россмана в каталитическом домене с классической никотинамид-связывающей укладкой Россмана в кофермент-связывающем домене был получен следующий результат: пространственно совпадающими оказались и значительно большие части третичной структуры — при добавлении к рассмотренным ßaßaß-укладкам ограничивающих их а-спиралей — a2 — ß5 — аЗ — ß7 — а4 — ß8 — аА (номера остатков 81 — 163) и a7-ßD-aE-ßE-aF-ßF-(aG-ßG)-a8 (номера остатков 241-358). В этих элементах длиной 83 и 118 остатков соответственно пространственно эквивалентные пары располагаются в ß- и а-элементах в укладках Россмана и в концевых a-спирадях. Укладка Россмана в кофермент-связывающем домене длиннее укладки из каталитического домена на один aß-элемент, но завершающие a-спирали совпадают. По всей структуре среднеквадратичное расстояние равно 1,27 Ä между 37 эквивалентными парами. Результат совмещения структур показан на рис.5.

Рис.5. Стереоизображение наложения супервторичных структур а — спираль —укладка Россмана—а —спираль из каталитического домена ФДГ (остатки 81 — 163, толстая цепь) и из кофермент—связывающего домена ФДГ (остатки 240 — 356, тонкая цепь).

В Б-специфичных дегидрогеназах БГДГ, БЛДГ, ФГДГ, относящихся к тому же структурному типу, что и ФДГ, также обнаруживаются структурные элементы типа а-спираль —укладка Россмана —а-снираль. Всего выявлено восемь примеров данной структуры, в каждой из четырех исследуемых I)-специфичных дегидрогеназ по две в субъединице, в кофермент-связывающем

и в каталитическом доменах. Из данных пространственного выравнивания указанных структур друг с другом следует их высокая трехмерная гомология. Эквивалентные пары атомов располагаются в элементах вторичной структуры. Наибольшая вариабельность наблюдается в укладках, соединяющих' р-цепи и а-спирали. При этом лучше совмещаются друг с другом новые укладки из доменов с одинаковым функциями: структуры из каталитических доменов со структурами из каталитических доменов, укладки из кофермент-связывающих доменов с аналогичными укладками.

Следует отметить также тот факт, что к укладке Россмана в кофермент-связывающих доменах, являющейся частью нового большого структурного элемента, примыкает дополнительный р/а-элемент. Таким образом, между крайними а-спиралями находится структура из четырех р-цепей и трех а-спиралей. Это характерная особенность всех НАД-связывающих доменов в D-специфичных дегидрогеназах, в отличие от трехцепочечных укладок в известных L-специфичных ЛДГ, МДГ или в каталитических доменах самих D-специфичных дегидрогеназ. Однако завершающая длинная а-спираль нового структурного элемента в кофермент-связывающих доменах совмещается с аналогичной а-спиралью другой структуры в каталитических доменах. Длина полипептидной цепи для новой укладки из каталитического домена составляет 81—83 остатка, для укладки из другого, кофермент-связьюающего домена, — 116—122 остатка. В DJIflT обе структуры трехцепочечные.

Поиск новой структуры был проведен также и в НАД-связывающих доменах дегидрогеназ ЛДГ, МДГ, АДГ, ГАФДГ. Хотя в структуре некоторых из них также имеется укладка Россмана, ограниченная двумя а-спиралями, но размеры и, главное, ориентация спиралей отличаются от таковых в ФДГ, БГДГ, ОЛДГ, ФГДГ. Таким образом, в L-специфичных дегидрогеназах новая укладка не обнаружена.

Общий ход полипептидной цепи нового структурного элемента проиллюстрирован на рис.6 на примере укладки Россмана из каталитического домена ФДГ. Короткая, длиной в два витка, а-спираль, затем укладка Россмана из трех р-цепей и двух а-спиралей и завершающая структуру длинная а-спираль, переводящая полипептидную цепь во второй домен. Отличительной чертой структуры является параллельное расположение а-спиралей в одной плоскости, что приводит к

сонаправленности их дипольных моментов и, в результате, к резко анизотропному суммарному дипольному моменту всей супервторичной структуры.

Отсутствие в первичной структуре Б-специфичных дегидрогеназ заметной гомологии позволяет выделить структурный элемент типа а-спираль — укладка Россмана —а-спираль как новую супервторичную структуру. Данная супервторичпая структура выявлена в Б-спедифичных НАД-зависимых дегидрогеназах, которые отличаются от хорошо изученных Ь-специфичных дегидрогеназ высокой пространственной гомологией каталитических доменов, что приводит к большей симметрии глобулы белка и связанной с этим симметрии распределения дипольных моментов.

В шестой главе дается анализ физико-химических свойств формиатдегидрогеназы, связанных с наличием в структуре ФДГ большого количества а-спиральных фрагментов.

Все а-спирали участвуют в образовании упаковки каждого из доменов ФДГ в компактную трехслойную ара-структуру с большим числом внутренних контактов и с высокой насыщенностью водородными связями и вносят, таким образом, значительный вклад в термодинамическую устойчивость белка. В тоже время а-спирали в новых супервторичных структурах связаны осью псевдосимметрии и их дипольные моменты располагаются так, что суммарный момент глобулы уменьшается, минимизируя электростатические взаимодействия. Известно, по теореме Ирншоу (ЕалгзЬачу), что система электрических зарядов неустойчива, поэтому наличие больших а-спиралей в новых супервторичных структурах с большим локальным дипольным моментом может привести к неустойчивости глобулы в некоторых условиях среды. Таким образом, в ферментах, пространственная структура которых основана на петле Россмана и/или иных супервторичных структурах с ее участием, как, например, новая супервторичная структура а-спираль — укладка Россмана — а-спираль в ФДГ, важную роль в регуляции стабильности и функционировании фермента будут играть а-спирали таких участков белковой глобулы.

В структуре формиатдегидрогеназы такое особенное положение должны занимать спирали аА и а8, входящие в состав новых супервторичных структур. С участием этих сверхдлинных спиралей (Ы-концы которых находятся вблизи от области активного центра (АЦ) фермента) происходит формирование поля электростатического потенциала в АЦ ФДГ. Таким образом, спирали влияют на физические механизмы каталитической активности формиатдегидрогеназы. Поэтому, важны непосредственные экспериментальные данные, с помощью которых мы могли бы определить влияние консервативных структурных мотивов на термодинамические особенности плавления белка.

Для изучения содержания вторичных структур в ФДГ при температурах от физиологических до денатурационных были получены спектры КД при 20-ти различных значениях температуры — от 5°С до 90°С. Изменение спектров КД с температурой носит сложный характер. Его тап отличается, вообще говоря, от большинства наблюдаемых в других белках — не дегидрогеназах — прежде всего тем, что выходящие за пределы ошибок измерения изменения начинаются с достаточно низких температур, то есть с тех, при которых фермент с очевидностью можно считать нативным и поэтому обладающим нормальной ферментативной активностью, хотя само плавление носит очевидно кооперативный характер.

На рис.7 представлена зависимость молярной эллиптичности от температуры для ФДГ при фиксированной длине волны — 222 ям. Как видно из рисунка, конформация белка меняется некоторым образом уже в интервале температур 5 —30° С. Сам интервал температур значительных конформационных изменений разделяется на два участка поглощения тепла: первый — "предденатурационный" участок в интервале 45 —60° С и второй — участок кооперативного плавления в интервале 60 —70° С. В то же время, анализ температурной зависимости кинетических параметров реакции, катализируемой ФДГ, показывает, что при температурах до 60° С с ростом температуры происходит уменьшение констант связывания обоих субстратов фермента. При этом, по данным температурной зависимости скорости тепловой инактивации, при температурах свыше 62° С наблюдается быстрая инактивация фермента. Зависимость константы инактивации от температуры

/

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 Температура, град. Цельсия

Рис.7. (1) Изменение величины молярной эллиптичности 6 при 222 нм

формиатдегидрогеназы в зависимости от температуры. (2) Изменение

константы тепловой инактивации формиатдегидрогеназы в зависимости от температуры.'

"также приведена на рнс.7. Как видно из рисунка, в интервале температур, соответствующем участку кооперативного плавления белка, происходит резкое уменьшение активности фермента.

Таким образом, данные КД можно интерпретировать как свидетельство коиформационной подвижности ФДГ в целом и, в частности, о поэтапном изменении структуры белка при его денатурации. На первом участке плавления фермента происходят постепенные конформационные изменения, которые приводят к ухудшению кинетических параметров ФДГ, в то время как на втором, кооперативном участке наблюдаются уже денатурационные изменения структуры белка, приводящие к инактивации фермента.

Чтобы выяснить , какие именно элементы пространственной структуры ФДГ нестабильны в указанных интервалах температур, а также установить, в каком интервале температур какие из супервторичных структур претерпевают изменения, мы провели по полученным спектрам КД анализ относительного содержания разных типов вторичных структур: а-спиралей, ¡3-сгруктур, р-изгибов и неупорядоченных структур в формиатдегидрогеназе и определили их зависимость от температуры. Температурная зависимость содержания вторичных структур разного типа приведена на рис.8. Относительное содержание вторичных структур при 30°С, полученное по данному методу, хорошо согласуется с рентгенографическими данными (кристаллы ФДГ

0% ---!-1-1-1-1-1-!-!-!-1-1-1-1-1-1-1-

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 Температура, град. Цельсия

Рис.8. Изменение относительного содержания (в %) а —спиралей (а), р — структур (Ь), р—изгибов (с) и неупорядоченных структур (с!) в

формиатдегидрогеназе в зависимости от температуры._

получали при комнатной температуре), что видно из табл.4.

Денатурация фермента сопровождается разрушением а-спиралей, соответствующим ростом содержания неупорядоченных структур и

некоторым изменением относительного содержания 3-изгибов (рис.8). Содержание р-структур остается постоянным. Наиболее заметны в ходе нагревания изменения в содержании а-спираль-ных структур. На начальном участке содержание а-спиралей колеблется около некоторого среднего значения, проходя через максимум при температуре около 30° С. Затем в интервале температур 30 — 62 ° С происходит уменьшение относительного содержания этой вторичной структуры на 10%. При этом на участке 46 — 62° С, соответствующему "предценатурационному" участку плавления, наблюдаемому из спектров КД, скорость уменьшения содержания а-спиралей возрастает и составляет приблизительно полпроцента на один градус нагрева. Резкое уменьшение относительного содержания а-спиралей наблюдается на втором, кооперативном участке в интервале температур 62 —70° С. Скорость уменьшения содержания а-спиралей резко увеличивается и составляет 3% на градус, содержание спиралей уменьшается на 22%.

Таким образом, основной вклад в характер плавления ФДГ вносят а-спиральные структуры. При этом, содержание (3-структур на всем интервале температур (5 — 90 ° С) не метается, в то время как содержание а-спиральных структур при высоких температурах приблизительно соответствует содержанию а-спиралей во всех трех укладках Россмана (-20%). Поэтому можно думать, что эти структурные части глобулы плавятся в последнюю очередь. С другой стороны, уменьшение содержания а-спиральных фрагментов на "прсддснагурационном" участке плавления соответствует доле а-спиралей (10%), которая приходится на аА и а8 — спирали на концах новых супервторичных структур. Это дает основания полагать, что именно длинные, выходящие за пределы укладки Россмана, спирали являются основой конформационной подвижности фермента. Естественно предположить, что эта подвижность связана с электростатическими взаимодействиями типа: диполь —заряд, диполь —диполь, определяемыми длинными а-спиралями в третичной структуре белка.

Для оценки электростатического взаимодействия в новой супервторичной структуре был проведен расчет дипольных моментов ФДГ. Конформационная подвижность а-спиралей в физиологическом интервале температур, не приводящая к кооперативному переходу в белке, оправдывает такое приближение в качестве первого модельного подхода к анализу роли

Табл.4. Сравнение относительного содержания вторичных структур в ФДГ по методу разложения спектров КД (А) и по рентгенографическим данным (25).

...... Структура. Содержание вторичных структур (%) по методу

Л Б

а-спираль 44 44

(5-структура 18 17

¡5-изгиб 15 17

Неупорядоченная структура 25 22

ориентационных факторов электростатических взаимодействий в стабильности и функционировании дегидрогеназ, содержащих новую супервторичпую структуру.

Из расчетов следует, что в структуре формиатдегидрогеназы с учетом протяженной ос-спирали имеет место компенсация диполь —дипольпых взаимодействий в новой супервторичной структуре а-спираль—укладка Россмапа—а-спираль. Так, для апоформы фермента дипольный момент укладки Россмапа в каталитическом домене составляет 36 Дебай, короткой а-спирали перед укладкой Россмана 31 Дебай, в то время как противоположно направленный дипольный момент протяженной а-спирали — 75 Дебай. В результате суммарный дипольный момент всей новой супервторичной структуры составляет всего 10 Дебай. Аналогичная картина компенсации диполь—дшюльных взаимодействий, наблюдается для новой супервторичной структуры в кофермент-связывающем домене.

На рис.9 приведена гистограмма распределения диполыюго момента в структуре ФДГ. Можно видеть, что в электростатическом отношении укладки Россмана, входящие в состав новых супервторичных структур, определяют области максимального прироста значения диполыюго момента в глобуле ФДГ, что соответствует двум пикам на гистограмме. Значительные

160 140 >К td 120 J < Ё 100 CÜ 2 1 « >к § «>• i о С 40 К < 20

- - - 2 Л А

г \ 1 \ * л/лл/ / \ Jifa Л^У 7 A,/ W лД/

0 50 100 150 20О 250 300 350 400

Номер остатка

Рис.9. Распределение значения диполыюго момента участка структуры

формиатдегидрогеназы с первого по N—ый остаток. (1) — для холоформы

фермента, (2) — для апоформы.

относительные изменения суммарных дипольных моментов при переходе от ano- к холоформе фермента, то есть при связывании кофактора и субстрата, наблюдаются для новых супервторичных структур, но не для суммарных дипольных моментов укладок Россмана. Это означает, что продвижение кофактора НАД вдоль кофермент-связываюшего канала происходит в поле

диполей укладок Россмана. Это приводит нас к заключению об определяющей роли взаимодействий типа заряд —диполь. в механизме перехода белка от апо- к холоформе.

Мы считаем, что именно новый обнаруженный нами тип супервторичной структуры, конкретно, большие ее а-спиралыше участки являются причиной резкого кооперативного перехода в ФДГ и других дегидрогеназах, они же обеспечивают в значительной мере те кооперативные свойства третичной структуры D-специфичных дегидрогеназ, которые, в свою очередь, обеспечивают изменения в симметрии фермента при связывании им кофакторов и субстратов in vivo. Таким образом, обнаруженный нами новый тип супервторичной структуры ответственен и за основные проявления физических свойств D-специфичных дегидрогеназ при их функционировании.

ВЫВОДЫ

1. Обнаружена третья супервторичная структура типа "укладка Россмана" в пространственной структуре каталитического домена НАД-зависимой формиатдегидрогеназы из метилотрофных бактерий Pseudomonas sp.101. Установлена внутренняя симметрия расположения укладок Россмана в этом ферменте. Показано наличие псевдосимметрии второго порядка, превращающей весь фермент в целом в структуру с симметрией

22Псевдо2псеВд0.

2. Введен новый численный критерий пространственного сравнения фрагментов белковых структур — параметр "среднеквадратичное расстояние/число эквивалентных пар атомов". Показана его применимость для сравнения фрагментов близкородственных белков на примере класса дегидрогеназ.

3. Показано, что обнаруженная на примере структуры формиатдегидрогеназы симметрия свойственна всем D-специфичным дегидрогеназам, но она отсутствует в L-специфичных дегидрогеназах. Таким образом, дегидрогеназы 2-оксикислот разбиваются на два структурно различных класса: D- и L-специфичные дегидрогеназы.

4. Выявлен новый консервативный структурный мотив в НАД-зависимых дегидрогеназах, включающий параллельную ß-структуру, содержащую пять цепей, и две а-спирали. На его основе предложена классификация доменов дегидрогеназ в соответствии с иерархией банка структурной классификации белков SCOP на уровне доменной организации белков.

5. Найден новый тип супервторичной структуры: а-спираль — укладка Россмана —а-спираль. Последняя спираль имеет значительную длину. Эта супервторичная структура найдена во всех восьми доменах D-специфичных дегидрогеназ.

6. При исследовании формиатдегидрогеназы методом КД показано, что имеются две области конформациошшх изменений: при физиологических температурах и кооперативного плавления при более высоких температурах. При этом конфирмационная подвижность и плавление фермента связаны с неустойчивостью а-спиральных областей, в которую вносят вклад длинные а-спиральные фрагменты новой супервторичной структуры.

7. Путем расчетов распределения дипольных моментов в структуре формиатдегидрогеназы показано, что с учетом протяженной ос-спирали имеет место компенсация диполь — дипольных взаимодействий в новой супервторичной структуре а-спираль—укладка Россмана —а-спираль. Компенсация электростатических взаимодействий также имеет место при образовании комплекса фермент—кофермент.

Материалы диссертации опубликованы в следующих работах:

1. Куценко A.C., Королев C.B., Ламзин B.C., Попов В.О. Исследование внутренней симметрии пространственной структуры НАД-зависимой формиатдегидрогеназы из Pseudomonas sp. 101. Молекулярная биология. Т.28, №. 3, 626-632, 1994.

2. Куценко A.C., Королев C.B., Туманян В.Г., Ламзин B.C., Попов В.О. Топологическое исследование структуры НАД-зависшюй ФДГ и сравнение с другими НАД-сеязывающими белками. Тезисы VI конф. РФ "Новые направления биотехнологии", г. Пущино, 24-26 мая 1994, с.83.

3. Kutsenko A.S. and Popov V.O. Conserved supersecondary structural motif in NAD-dependent dehydrogenases. Abstracts of the 24th Aharon Katzir-Katchalsky Conference. Folding & Design, v.l, suppl. S37,1996.

4. Куценко A.C., Мезенцев A.B., Попов В.О. Пространственная симметрия доменов НАД-зависшюй формиатдегидрогеназы метипотрофных бактерий Pseudomonas sp. 101. Тезисы конф. "Автотрофные микроорганизмы" М., МГУ, 23-25 апреля 1996, с.86.

5. Kutzenko A.S., Lamzin V.S., Popov V.O. Conserved supersecondary structural motif in NAD-dependent dehydrogenases. FEBS Lett., Vol.423, No 1, 105-109, 1998.

6. Куценко A.C., Есипова Н.Г. Новый тип супервторичной структуры в D-специфичных НАД-зависимых дегидрогепазах. Биофизика, в печати.

Отпечатано в издательстве АО "Диалог-МГУ". ЛРЫ 063999 от 04.04.95 Подписано к печати 13.03.98 г. Усл.печл. 1,5. Тираж 80 экз. Заказ 267. Тел. 939-3890, 939-3891, 928-1042. Факс 939-38-93. 119899, Москва, Воробьевы горы, МГУ