Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Функционирование и регуляция диссимиляционного гексулозофосфатного цикла у метилотрофных бактерий

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Функционирование и регуляция диссимиляционного гексулозофосфатного цикла у метилотрофных бактерий"

РГВ Од

российская академия наук институт биохимик и физиологии микроорганизмов

На правах рукописи УДК 577.171

СОКОЛОВ АЛЕКСАНДР ПАВЛОВИЧ

ФУНКЦИОНИРОВАНИЕ И РЕГУЛЯЦИЯ ДИССИМИЛЯЦИОННОГО ГЕКСУЛОЗОФОСФАТНОГО ЦИКЛА У МЕТИЛОТРОФНЫХ БАКТЕРИЙ

(специальность 03.00.04 - биохимия)

Авто рефер ат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Пущине • 1993

Работа выполнена в лаборатории радиоактивных изотопов Института биохимии и физиологии микроорганизмов РАН.

Научный руководитель: доктор биологических наук Ю. А Троценко

Официальные оппоненты: профессор, доктор биологических наук И. Н. Гоготов доктор биологических наук А. И. Нетрусов

Ведущее учреждение: Научно-исследовательский институт генетики и селекции

промышленных микроорганизмов

Защита диссертации состоится 993 г. в 14 час. 30 мин. на заседании

Специализированного совета Д 002. 69.01 при Институте биохимии и физиологии микроорганизме^! Р А Н, г. Пущино, Московской области.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биохимии и физиологии микроорганизмов РАН

Автореферат разослан" 29" сентября 1993 г.

Ученый секретарь Специализированного совета доктор биологических наук

В. М. Вагабо

Актуальность проблемы. Восстановленные Cj-соединения, не содержащие С-С связей, широко распространены в природе. Они образуются в результате микробной деградации или трансформации органического вещества. Значительные количества токсичных Cj-соединений (галогенпроизводные метана, метанол и его эфиры, цианиды, роданиды) присутствуют в стоках предприятий химической, деревообрабатывающей, целлюлозно-бумажной, горно-обогатительной, лако-красочной промышленности. Поэтому метилотрофные микроорганизмы, способные использовать Cj-соединения, привлекают большое внимание. Исследование организации и регуляции метаболизма метилотрофов представляет значительный теоретический и практический интерес, учитывая их важную роль в биосферном цикле и детоксикации промышленных отходов, а также в связи с реальными перспективами использования в биотехнологии и генной инженерии.

Особенно интенсивно метилотрофы изучаются в последние 20 лет. Однако к началу нашей работы (1974 год) были получены только предварительные данные о биохимической структуре первичных путей метаболизма у метилотрофных бактерий. Были частично определены начальные стадии окисления Сj-субстратов и установлено функционирование у метилотрофов серинового и рибулозомонофосфатного (РуМФ) путей ассимиляции формальдегида. Сведения о последующих этапах метаболизма формальдегида оставались фрагментарными, что препятствовало эффективному использованию метилотрофов в биотехнологии.

В частности, не были детально изучены механизмы получения энергии метилотрофами, у которых отсутствуют или имеют очень низкую активность дегидрогеназы формальдегида и формиата. На основании данных энзимологического анализа бесклеточных экстрактов метано- и метилотрофных бактерий с РуМФ-путем Квейлом (1974) и Затманом (1975) была постулирована возможность циклического окисления формальдегида после конденсации с рибулозо-5-фосфатом. Однако прямые доказательства функционирования такого механизма отсутствовали. Тем более не было никаких сведений о распространении и возможных механизмах регуляции циклического окисления формальдегида у метилотрофов различного таксономического положения.

Цель работы. Учитывая биотехнологическую перспективность различных метилотрофов, реализующих РуМФ-путь, представлялось необходимым детально изучить особенности организации и регуляции их первичного метаболизма, а также взаимодействие процессов ассимиляции и диссимиляции формальдегида. Поэтому в данной работе решались следующие задачи:

а) получить прямые доказательства функционирования у метилотрофов циклического механизма окисления формальдегида до COj (диссимиляционного гексулозофосфатного цикла, ДГФЦ);

б) определить распространение ДГФЦ среди метилотрофов различного таксономического положения;

в) выделить из метилотрофных бактерий с разными механизмами распада фосфогексоз ключевые ферменты, образующие ДГФЦ, и определить их основные характеристики;

г) изучить возможные механизмы регуляции ДГФЦ.

Научная новизна. Впервые получены прямые доказательства функционирования у метилотрофных бактерий диссимиляционного гексулозофосфатного цикла. Из представителей разных групп метилотрофных бактерий выделены в высокоочищенном состояниии ключевые ферменты этого цикла. Определены основные физико-химические и кинетические характеристики очищенных ферментов, изучено влияние на них различных эффекторов. Предложена модель регуляции ДГФЦ у метилотрофных бактерий с разными путями распада фосфогексоз.

Научно-практическое значение. Полученные результаты создали предпосылки для использования метилотрофных бактерий в качестве продуцентов ряда ферментов. На их основе разработаны и защищены авторскими свидетельствами технологические регламенты получения в

высокоочищенном виде некоторых дегидрогеназ, представляющих интерес в качестве реагентов для клинической диагностики и научных исследований. Препараты были испытаны и получили положительные отзывы.

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы были доложены на всесоюзных и международных конференциях по регуляции биохимических процессов у микроорганизмов (Пущино, 1978, 1983), VI съезде ВМО (Рига, 1980), Vферментационном симпозиуме (Западный Берлин, 1976), симпозиуме ФЕМО "Сверхпродукция микробных продуктов" (Градец Кралове, 1981), международных симпозиумах "Рост микроорганизмов на С ^-соединениях" (Пушино,1977; Шеффилд, 1980; Миннеаполис, 1983; Харен, 1986; Гетгинген, 1989).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 15 работ, получено 2 авторских свидетельства.

Экспериментальная часть Методы исследований

Объекты исследований. Большинство экспериментов проводили на факультативных мегилогрофах Pseudomonas okavorans 52 [Егоров и др, 1976] и Arthrobacterglobiformis В-175 [Логинова, Троценко, 1975]. Первый метилогроф, помимо иолиуглеродных субстратов, способен расти ка метаноле и метиламине, а второй - на moho-, ди- и тряметиламинах.

Для выращивания бактерий использовали минеральную среду К [Kaneda, Roxburgh, 1959], содержащую метанол (0,5%, о/о) или метилированные амины (0у3%, в/о). Температура культивирования - 30°.

Для получения большого количества биомассы бактерии выращивали в ферментере с рабочим объемом 70 л на той же среде. Скорость перемешивания - 500 об/мин, аэрация - 0,5 л воздуха/л среды в мин.

После выращивания клетки отделяли от среды центрифугированием или на сепараторе АСГ-ЗМ. Собранные клетки промывали буфером и хранили при -20°.

Получение .^есклеточных экстрактов, Для получения бесклеточных экстрактов клетки суспендировали в буфере и разрушали с помощью пресса ИБФМ из замороженного состояния или па ультразвуковом дезинтеграторе MSE при частоте 20 кГц и температуре 04° в импульсном режиме с перерывами 15 сек между импульсами для охлаждения гомогената.Гомогенат далее центрифугировали при 16000 g в течение 60 мин. Осадок, содержащий неразрушенные клетки и клеточные обломки, отбрасывали, а супернатант использовали в качестве бесклеточного экстракта.

Скорость циклического окисления **С-формальдегида до ^CÜ2 определяли, помещая пробирку с реакционной смесью в герметично закрытый сцингилляционный флакон. В качестве поглотителя выделяющегося ^COj использовали 1М КОН. Раствор поглотителя высушивали при 130°. Остаток растворяли в 1 мл воды, добавляли 10 мл универсального сцинтилляционного коктейля Aquasol-2 (NEN) и измеряли радиоактивность на спектрометре SL-30 "Intertechnique".

Определение активности Ферментов. Активность гексулозофосфат синтазы (ГФС) определяли по уменьшению количества свободного формальдегида, зависящему от присутствия рибулозо-5-фосфата в реакционной смеси. За единицу активности принимали количество фермента, катализирующее включение 1 мкмоль формальдегида в минуту при 30°. Активность дегидрогеназ глюкозо-6-фосфата и б-фосфоглюконата измеряли сиектрофотометрически по восстановлению НАД(Ф). За единицу принимали количество фермента, катализирующего восстановление 1 мкмоль пиридиннуклеотида в минуту при 30°. Активность фосфогексулоизомеразы определяли

спектрофотометркчески в сопряженной реакции, используя в качестве субстрата Д-арабино-3-гексулоэо-6-фосфат, синтезированный с помощью очищенной ГФС. При расчете активности использовали ту же формулу, что и для расчета активности дегидрогеназ.

Аналитические методы. Концентрацию белка определяли двумя методами: спектрофото-метрически [Kalb et al, 1977] и ло образованию комплекса с красителем [Bradford, 1976]. Формальдегид определяли по образованию окрашенного продукта с ацетилацетоном в присутствии ионов аммония [Nash, 1953].

Очистка ферментов. Все процедуры очистки ферментов были разработаны нами. Очистку проводили при 4°, если не указаны другие условия.

ГФС из Ps.oleovorans очищали с помощью фракционирования сульфатом аммония, гель-фильтрации на Сефадексе G-150, ионообменной хроматографии на ДЭАЭ-Сефадексе А-50 и повторной гель-фильтрации на Сефадексе G-150.

Для очистки глюшзо-6-фосфат дегидрогеназы (ГФД) из Ps.oleovorans бесхлеточный экстракт обрабатывали стрептомицин-сульфатом, фракционировали сульфатом аммония, пропускали через колонку с Сефакрилом S-200 и хроматографа ров ал и на ДЭАЭ-Биогеле А и фосфоцеллюлозе P-U.

Очистку б-фосфоглкжонат дегидрогеназы (ФГД) из Ps.oleovorans проводили одновременно с ГФД. Ферменты разделяются во время хроматографии на ДЭАЭ-Биогеле^А, поэтому дальнейшую очистку проводили независимо, хотя и в одинаковых условиях.

При очистке ГФД из A.globiformis применяли обработку стрептомицин-сульфатом, фракционирование полиэтиленгликолем, негативную сорбцию на ДЭАЭ-Биогеле А, ионообменную хроматографию на КМ-Сефарозе CL-6B и ПЭИ-Биогеле А ОДМ и аффинную хроматографию на УТФ-Биогеле А.

Для очистки ФГД из A.globiformis бесклеточный экстракт обрабатывали стрептомицин-сульфатом, фракционировали сульфатом аммония, пропускали через колонку с Сефарозой CL-6B и хроматографировали иа иммобилизованных красителях Cibacron Blue F3G-A и Procion Red НЕ-ЗВ.

Синтез ..носителей. дщя. хроматографии, Окрашенные производные Сефароэы CL-6B синтезировали по [Heyns, de Moore, 1974], УТФ-Биогель А 0,5М по [Wilchek, Lamed, 1974], ПЭИ-Био-гель по [Быстрых, Троценко, 1983].

Результаты

Обнаружение циклического окисления формальдегида.

Поскольку бесклеточные экстракты почти всех метилотрофных бактерий с РуМФ путем содержат полный набор ферментов, необходимых для функционирования его диссимиляционной ветви: гексулозофосфатсинтаэу, изомеразы З-гексулозо-6-фосфата и глюкозо-6-фосфата, дегидрогеназы глюкозо-6-фосфата и 6-фосфоглюконата, была предложена схема циклического пути окисления формальдегида [Strom et al., 1974; Colby, Zatman, 1975]. Однако уровни ферментов у разных метилотрофов отличались на несколько порядков. Поэтому необходимо было получить прямое подтверждение этого предположения. Использованная нами методика позволила однозначно доказать функционирование ДГФЦ у ряда метилотрофных бактерий (Табл. 1).

Полученные результаты указывают, что процесс окисления формальдегида сильно зависит от присутствия рибозо-5-фосфата, который изомеризуется в рибулозо-5-фосфат фосфо-рибоизомеразой. Скорость циклического окисления формальдегида согласуется с уровнями активности дегидрогеназ глюкозо-6-фосфата и 6-фосфоглюконата у исследованных метилотрофов [Логинова, Троценко, 1976; 1977]: чем выше активность этих ферментов в бесклеточных экстрактах, тем больше скорость циклического окисления формальдегида. Кроме того, в присутствии НАДФ в качестве кофактора окисление формальдегида происходит интенсивнее, что соответствовало

большей активности НАДФ-зависимых дегидрогсназ по сравнению с НАД-зависимыми, У облигаткого метанотрофа Ме1Ну1отопи5 таНмка добавление в реакционную смесь рибозо-5-фосфата не оказывало существенного влияния на скорость окисления формальдегида. Очевидно, микроорганизмы, обладающие высокоактивными ферментами прямого окисления формальдегида, дегидрогеназами формальдегида и формиата, не нуждаются в ДГФЦ в качестве источника восстановленных пиридиннуклеотидов. Таким образом, наши данные опровергают предположение Квейла о возможном функционировании ДГФЦ у облигатных метанотрофов.

Таблица 1

Скорость циклического окисления формальдегида у различных метилотрофов

Образование ^С(>2, имп/мин на мг белка

Реакционная Кофактор Pseudomonas Arthrobacter Methylobacillus Methylomonas Candida

смесь okovorans globifoimis methanolovorus methanica methylico

Полная НАДФ 10000 9700 12500 5750 1300

НАД 8000 и.о. 12000 H.O. 2000

Без рибозо-5-Р НАДФ 4500 7000 3600 5650 1300

НАД 6000 н.о. ■Ш) и.о. 2100

Без кофактора - 4000 яоо 2200 5000 1500

Без экстракта НАДФ 4000 5200 loao 5000 1500

НАД 5000 и.о. 1000 и.о. im

Примечание: н.о. - не определяли

Скорость циклического окисления формальдегида в наших экспериментах ниже, чем можно было ожидать, исходя из активности ферментов, присутствующих в бесклеточных экстрактах. Причина этого заключалась, очевидно, в том, что при исследовании полиферментной системы практически невозможно создать условия, одинаково оптимальные для всех ее компонентов.

Циклическое окисление формальдегида, как показано в Табл. 1, наиболее интенсивно происходит у факультативного метил отрофа Р$.о1ескогапз и облигатного метил отрофа М.те&шю1спюпя. Мы исследовали данный процесс более подробно, используя бесклеточные экстракты Р$.о1е(П'огаш. Зависимость скорости окисления формальдегида от концентрации кофакторов представлена на рис. 1. При низких концентрациях куклеотидов скорость образования 14С02 выше в присутствии НАДФ. Вместе с тем для этого нуклеотида характерна более низкая насыщающая концентрация, после которой дальнейшего увеличения скорости окисления формальдегида не происходило. Максимальная скорость циклического окисления формальдегида в присутствии НАД заметно выше, чем при использовании в качестве кофактора НАДФ.

иС. пш/юш х Ю3

Рис. 1. Зависимость скорости окисления формальдегида от концентрации кофакторов

Для выяснения возможных механизмов регуляции ДГФЦ исследовали влияние различных метаболитов на скорость окисления формальдегида до СС^. Полученные данные приведены в табл. 2. Наибольшее ингибирующее влияние на скорость образования СО2 оказывали восстановленные пиридиннуклеотиды - НАДФН и, в меньшей степени, НАДН. Данный цикл служит прежде всего для получения восстановленных пиридиннуклеотидов, используемых в энергетических и биоссинтетических процессах. Поэтому не удивительно, что высокоэнергетические соединения оказывают на диссимиляционный гексулозофосфатный цикл ингибирующее влияние. При высоком содержании в клетке макроэргических соединений потребность в окислении формальдегида исчезает. Процессы биосинтеза могут происходить за счет запасов энергии, имеющихся в клетке. По мере их исчерпания снимается ингибирование ДГФЦ и, соответственно, процесс циклического окисления формальдегида усиливается.

Ингибирующее влияние на ДГФЦ оказывают также некоторые соединения промежуточного метаболизма: пируват, цитрат, 3-фосфоглицерат. Хотя данные соединения и не содержат макроэргических связей, тем не менее высокоэнергетические продукты образуются при их метаболизме. Кроме того, эти метаболиты либо непосредственно участвуют в процессах биосинтеза, либо легко превращаются в соответствующие биосинтетические субстраты. Поэтому, вероятно, при повышении внутриклеточной концентрации пирувата, цитрата или З-фосфотлицерата роль диссимиляционного гексулозофосфатного цикла в метаболизме уменьшается. В действие приводятся механизмы своеобразного ретроиигибирования, т.е. ингибирования конечными продуктами метаболической последовательности ферментов, катализирующих ее первые этапы. В результате предотвращается нерациональное окисление ростового субстрата.

б

Для более детального исследования регуляторных механизмов и основных точек, в которых осуществляется регуляция, мы выделили в очищенном виде ключевые ферменты ДГФЦ, В качестве источника ферментов использовали бесклеточные экстракты двух факультативных метилотрофов: Рз.о1еоуогал5, использующего в качестве источника углерода и энергии метанол или метиламин, и А^1оЫ/отш, растущего на метилированных аминах. Выбор объектов исследования обусловлен различиями в путях первичной ассимиляции (^-соединений у данных бактерий. У Рз.октогши расщепление вновь синтезированных гексозофосфатов происходит при участии ферментов пути Энтнера-Дудорова: 6-фосфоглюконат дегидратаэы и 2-кето-3-дезокси-6-фосфоглюконат альдолазы. Для А.^оЬ^огттш характерен гликолитический вариант расщепления с участием фруктозобисфосфат альдолазы. Таким образом, у данных метилотрофов разветвление ассимиляционной и диссимиляционной частей РуМФ пути происходит в разных точках. У р5.о1е<н/огам на этом своеобразном метаболическом перекрестке находится 6-фосфоглюконат, а у А.%1оЫ{отт& • фруктозо-б-фосфат. Поэтому у Рз-окс^огат единственным специфическим ферментом ДГФЦ является б-фосфоглюконат дегидрогеназа, тогда как глюкозо-6-фосфат дегидрогеназа участвует в процессах и диссимиляции, и ассимиляции. У А.$1оЫ/огт1з обе дегидрогеназы принимают участие только в окислении формальдегида, ко не в его ассимиляции.

Таблица 2

Влияние некоторых метаболитов на скорость циклического окисления формальдегида у

Рз.оксксгапз.

Реакционная смесь Интенсивность образования СС>2,'

Без добавок 100

+ НАДФН 24

+ НАДН 74

+ АТФ 72

+ АДФ 53

+ АМФ 84

+ цАМФ 126

+ ГТФ 109

+ ЦТФ 118

+ ФЕП 106

+ пируват 62

+ цитрат 36

+ 3-фосфоглицерат 44

Примечание: концентрация метаболитов -1 мМ

Очистка в свойства ферментов д ассимиляционного гексулозофосфатного цикла из Рх.октогат.

Очистка и свойства гексулозоФосФатсинтазы (ГФС). Разработанная нами процедура очистки ГФС кз факультативного метилотрофа Рз.октогапз позволяет получать фермент с удельной активностью 196 Е/мг при выходе 69% .На последней стадии очистки при гель-фильтрации на Сефадексе 0-150 фермент элюировался в виде симметричного пика с одинаковой удельной активностью по всему пику, что служит одним из доказательств гомогенности препарата. Кроме того, очищенный фермент давал одну полосу при электрофорезе в ПААГ как в нативных

условиях, так и в присутствии до деци л сульфата натрия (ДСН). Молекулярная масса ГФС, определенная гель-фильтрацией на Сефадексе G-150 составляет 45000 Да. Молекулярная масса субъединицы» определенная электрофорезом в ПААГ в присутствии ДСН, равна 22000 Да. Таким образом, молекула ГФС из Ps.oleovorans состоит из двух, по-видимому идентичных, субъединиц. Зависимость активности ГФС от pH изучали в пределах от 5.2 до 8.6 в 0.05 М трис-малеатном буфере. Фермент имеет четко выраженный максимум активности при pH 6.8-7.0. Зависимость активности фермента от температуры изучали в 0.05 М трис-малеатном буфере при pH 7.0. Реакцию проводили при температуре от 20° до 65°. Максимальная скорость синтазной реакции наблюдалась при 50°. При изучении термостабильности ГФС раствор фермента в 0.05 М трис-малеатном буфере pH 7.0 прогревали при 50° и 60°. Определяли остаточную активность через 1,3,5,10 и 30 мин после начала прогревания. В течение этого времени фермент стабилен при 50°, но быстро терял активность при 60°. Ранее было установлено, что ГФС облигатных метанотрофов нуждается в ионах или для проявления активности [Strom et al., 1974]. Мы проверяли влияние

различных двухвалентных катионов на ГФС Ps.oleovorans. Оказалось, что для проявления активности этого фермента также необходимы ионы Mg21- или Большинство других

использованных катионов в той или иной степени ингибировали ГФС. Специфичность фермента по отношению к акцептору формальдегида изучали, добавляя в реакционную смесь вместо рибулозо-5-фосфата другие сахарофосфаты. Включения формальдегида не происходило в присутствии рибозо-5-фосфата, ксилулозо-5-фосфата, глюкоэо-1-фосфата, глкжозо-6-фосфата, фруктозо-6-фосфата, фрукгозо-1,6-6 исфосфата, се до гептулозо-7-фосфата, седогептулозо-1,7-бисфосфата, и фосфоенолпирувата. Активность ГФС проявлялась только с рибулоэо-5-фосфатом. Для выяснения механизмов регуляции РуМФ цикла мы изучали влияние пиридиннуклеотидов на активность ГФС. НАД и НАДФ не влияли на активность фермента. В то же время восстановленные формы этих нуклеотидов 8 некоторой степени ингибировали синтазную реакцию.

Кинетические свойства ГФС. Эксперименты с очищенным ферментом показали, что ГФС из Ps.oleovorans характеризуется сложным кинетическим поведением. Для рибулозо-5-фосфата и формальдегида зависимость скорости реакции от концентрации субстрата имела область промежуточного плато. При изменении концентрации рибулозо-5-фосфата эта область локализована между 0.9 и 1.6 мМ, независимо от концентрации формальдегида (Рис. 2). Таким образом, область плато сдвинута в сторону больших концентраций субстрата по сравнению с результатами, полученными на неочищенных экстрактах и клетках с нарушенной проницаемостью Ps.oleovorans [Babel, Maller, 1978].

Более сложная кинетика обнаружена при изменяющихся коцентрациях формальдегида (Рис. 3). В этом случае наблюдали две области плато, которые проявлялись в разной степени в зависимости от концентрации второго субстрата.

Второе плато возможно также при переменных концентрациях рибулозо-5*фосфата. В отличие от опытов на неочищенном экстракте, в которых высокие концентрации этого субстрата приводили к уменьшению скорости реакции, при использовании очищенного фермента такой эффект обнаружен не был. Напротив, увеличение фиксированной концентрации формальдегида при высоких концентрациях рибулозо-5-фосфата приводило к дополнительному возрастанию скорости реакции. Это становится очевидным при сравнении скоростей синтазной реакции при концентрациях рибулозо-5-фосфата 4.0 мМ и 8.0 мМ (Табл. 3).

.Ажтжвноет», шмолк/шв

[Р7-5Ф],

Рис. 2. Зависимость скорости синтаэной реакции от концентрации рибулозо-5-фосфата при фиксированных концентрациях 0.9,1.8 и 3.6 мМ формальдегида

Актшшосп, юа£ол»/1

[НСНО].

Рис. 3. Зависимость скорости синтаэной реакции от концентрации формальдегида при фиксированных концентрациях 2,0 и 4,0 мМ рибоэо-5-фосфата

Таблица 3

Возрастание скорости синтазной реакции при повышении концентрации формальдегида

Концентрация формальдегида, мМ Е412/мин при концентрации рибулозо-5-фосфата 4 мМ 8 мМ V8mM/V4mM

0.9 8.0 8.4 1.05

1.8 12.0 133 1.13

3.6 18.7 24.0 1.28

Появлению таких сложных кинетических кривых могут способствовать, например, внутримолекулярные взаимодействия, в частности, изменения положительной и отрицательной кооперативности при насыщении субстратом олигомерного фермента [Teipel, Koshland, 1969; Levitzki, Koshland, 1969], медленные изменения молекулы фермента, приводящие к множественным формам [Курганов, 19781 или наличие изоэнзимов.

Различные формы ГФС из Ps.oleovorans удалось разделить с помощью ионообменной хроматографии на ДЭАЭ-Биогеле А, используя очень пологий градиент концентрации NaCI (Рис. 4). Исследование разных пиков приводило к различным кинетическим кривым. Зависимость скорости реакции от концентрации рибулозо-5-фосфага для пика I имела сигмоидную форму, а для пика 1Н - гиперболическую (Рис.5). Фермент из пика II имел более сложную зависимость, что обусловлено, по-видимому, присутствием обеих форм. Интересно отметить, что при сложении относительных скоростей, полученных для пиков I и III, получается кривая (Рис.5), на которой область плато находилась в том же положении, что и для нефракционированного фермента (Рис. 2). Исследование кинетики фермента из пика I через два дня после разделения вновь дало кривую с двумя областями плато (Рис. 6). Это означало, что через определенное время устанавливалось новое равновесие между формами фермента. Следовательно, эти формы взаимопревращаемы.

Согласно Курганову [1973], множественные и взаимопревращаем ые формы ферментов даюг возможность эффективной регуляции оборота субстратов. Показано, что в зависимости от различных воздействий, таких как присутствие субстратов эффекторов или внешних условий, наблюдаются изменения в соотношении разных форм фермента, поэтому оборот субстратов может варьировать достаточно сильно. На основании имеющихся данных пока трудно представить, каким образом такой механизм может функционировать внутри клетки в случае ГФС. Для этого необходимо наряду со знанием концентраций субстратов в клетке исследовать условия, приводящие к изменению соотношения форм фермента.

Очистка и свойства глюкозо-6~Фосфат дегидрогеназы (ГФД1 и 6-фосФотюкзнат дегушроте-назы (ФрП, Разделение ГФД и ФГД происходит на стадии ионообменной хроматографии на ДЭАЭ-Биогеле А (Рис. 7). Последующая очистка на фосфоцеллюлозе позволила получить гомогенные препараты обеих дегидрогеназ.

ип

Рис. 4. Ионообменная хроматография очищенной ГФС из Римскими цифрами обозначены фракции, использовавшиеся в кинетических экспериментах.

[Ру-ВС], ми

Рис. 5. Кинетическое поведение индивидуальных форм ГФС из Л.с/еоуогаш после разделения на

ДЭАЭ-Биогеле А. Римские цифры соответствуют пикам Рис. 4.

[Ру—5Ф], ми

Рис. 6. Изменение кинетики ГФСI во времени

В результате очистки ГФД получена с удельной активностью 196 Е/мг при выходе 38%, а ФГД - с удельной активностью 6.1 Е/мг и выходом 19%. Молекулярные массы дегидрогеназ определяли гель-фильтрацией на Сефадексе С-150. Установлено, что молекулярная масса нативной ГФД составляла 100000 Да, а ФГД - 110000 Да. Как показал электрофорез в ПААГ в присутствии ДСН, молекулы обоих ферментов состоят из двух субъединиц. Молекулярная масса субъединицы ГФД равна 50000 Да, а субъединицы ФГД - 55000 Да. Для ГФД оптимум рН равен 85, а для ФГД - 8.0. Дегидрогеназ а глюкозо-6-фосфата имела температурный оптимум при 55°, а 6-фосфоглюконат дегидрогеназа - при 50°. 6-Фосфоглюконат дегидрогеназа из Р$.о1есп>огат -нестабильна и полностью теряла активность через несколько часов при комнатной температуре или после десятиминутной инкубации при 30°. Напротив, глюкозо-6-фосфат дегидрогеназа относительно стабильна при комнатной температуре (через 8 недель сохраняется 50% активности). Влияние различных иуклеотидов, сахарофосфатов и органических кислот на активность очищенных ферментов показано в табл. 4. Константы Михаэлиса составляют; для ГФД -= 2.8Х1СГ5 М, КтГ^ф - 65х10"5 М; для ФГД - КтНА^ф * 55х10'5 М, К,*** = ШМ"4 М.

Очистка и свойства ферментов диссимнляционного гсксулозофосфатного цикла т А.¿1оЬ¡/огтЬ.

Очистка и свойства ГФД» При очистке ГФД использовали буфера, не содержащие ионов СГ, поскольку этот анион оказывал дестабилизирующее влияние на фермент. На последней стадии при аффинной хроматографии на УТФ-Биогеле А 05М ГФД элюировалась симметричным пиком с одинаковой удельной активностью во всех фракциях, что служило одним из подтверждений гомогенности препарата. В результате очистки ГФД А.$!оЫ[огтпк получена с удельной активностью

185 Е/мг при выходе 18%. Электрофорез в ПЛАТ в присутствии ДСН выявил только одну белковую

полосу, что подтверждало гомогенность препарата фермента. Молекулярная масса нативной ГФД,

по результатам гель-фильтрации на Сефарозе СЫ>В, составляла 142000 Да. По данным

электрофореза в ПААГ в присутствии ДСН в состав молекулы фермента входят две субъединицы с

молекулярной массой 72000 Да. Максимальную активность ГФД проявляла при рН 7.5.

Стабильность фермента наиболее высока в диапазоне рН 63-6.6. Фермент заметно активировался в

присутствии и Следует отметить, что магний оказывал большее активирующее

влияние в форме сульфата, чем в форме хлорида. Это послужило причиной использования при

2 +

очистке и исследовании ГФД буферов, не содержащих С1. Катионы тяжелых металлов - 2л , н РЬ^+ очень сильно ннгибировали фермент, причем цинк полностью подавлял активность ГФД уже в концентрации 0.1 мМ. Изучение влияния метаболитов на активность ГФД показало, что в различной степени ингибировали фермент 2-оксоглутарат, фумарат, гликолат, 3-фосфоглицерат. Значительное снижение активности ГФД наблюдалось также в присутствии восстановленных пиридиннуклеотидов и АТФ. Обращает на себя внимание активирование фермента в присутствии ацетил-КоА. До настоящего времени такого влияния ацетил-Ко А на глюкозо-6-фосфат дегидрогеназу не обнаруживали. По-видимому, этот феномен играет существенную роль в регуляции активности ГФД из А.$1оЫ^лш и всего ДГФЦ у данного факультативного метилотрофа. Фермент проявлял абсолютную специфичность по отношению к НАДФ. С НАД в качестве кофактора реакция не шла. В качестве субстрата фермент использовал только глюкозо-6-фосфат. Кинетические константы ГФД, определенные «о методу прямого линейного графика, равны: Утах = 33.1 мкмоль/мин на мг белка, КЮНАДФ = 2.6x10-5 М, ^НАДФ _ 3.0x10-5 М, КтГ"6-ф * 2.6x10-5 М,К5Г*6'Ф - 4.6x10-5 М.

мл

Рис. 7, Разделение дегидрогеназ глюкозо-6-фосфата и 6-фосфоглюконата из IЪокоюпии на ДЭАЭ-

Биогеле А.

1 * ^280' ^ * активность глюкозо-6-фосфат дегидрогеназы; 3 • активность 6-фосфоглюконат дегидрогеназы; 4 - концентрация КаС1.

Для соединений, оказывающих ингибирутощее влияние на фермент, определены константы и характер ингибирования (Табл. 5). Это позволило установить, что реакция, катализируемая ГФД из A.globiformis, происходит по так называемому направленному Би-Би механизму [Cleland, 1969].

Очистка ц свойства ФГД, В основу процедуры очистки ФГД положено использование групповой аффинной хроматографии на текстильных красителях. В качестве аффинных лигандов нами использованы Cibacron Blue F3-GA и Procion Red НН-ЗВ. Типичный эксперимент по очистке ФГД из A.globiformis давал фермент с удельной активностью 25.7 Е/мг и выходом 16%. Подтверждение гомогенности препарата получено при электрофорезе в ПААГ в присутствии ДСН, в результате которого обнаружена одна белковая полоса.

Таблица 4.

Влияние метаболитов на активности ГФД и ФГД из Ps.oleovorans.

Эффектор Активность ГФД, % Активность ФГД, %

с НАД с НАДФ с НАДФ

Без добавок 100 100 100

АМФ 88 89 100

ддф 78 93 87

АТФ 84 82 79

ГДФ 96 73 66

ГТФ 86 86 100

УДФ 100 91 95

УТФ 98 96 100

ЦДФ 100 93 79

цгф 98 78 100

Пируват 98 100 100

Охсалоацетат 100 65 100

Глиоксилат Ы 72 100

Фосфоенолпируват 93 97 93

Малат 100 83 103

Цитрат 92 55 100

З-Фосфоглицерат 90 94 100

Рибозо-5-фосфат 95 98 71

Фрукгозо-6-фосфат 100 98 100

Фрукгозд- 1,6-бисфосфат 107 98 43

Примечание: концентрация всех эффекторов • 1 мМ.

При гель-фильтрации нативной ФГД на Сефарозе СХ-бВ обнаружен один пик с молекулярной массой 229000 Да. Молекулярная масса субъединицы, определенная электрофорезом в ПААГ в присутствии ДСН, равна 57000 Да. Таким образом, молекула ФГД из А.%1оЫ{огт1$ состоит из четырех, по-видимому идентичных, субъединиц. Оптимальное значение рН для проявления активности ФГД равно 75. Стабильность фермента оставалась примерно постоянной в области рН от 6.0 до 10.0. Максимальная скорость реакции наблюдалась при 65°. Активность фермента заметно возрастала в присутствии и Са^+. Другие катионы оказывали на ФГД ингибирующее

действие. За исключением восстановленных пиридиннуклеотидов, ингибирукяцих фермент, другие эффекторы не оказывали существенного влияния на активность ФГД. Фермент проявлял абсолютную специфичность по отношению к НАДФ. В присутствии НАД в качестве кофактора

реакция не происходила. Субстратом дегидрогеназной реакции служил только 6-фосфоглюконат. Кинетика реакции подчинялась уравнению Михаэлиса-Мелтен. Значения кинетических констант: Утах = 50 мкмоль/мин на мг белка, КтНАДФ = 3.7x10-5 М, К§11АДФ = 2.6x10-5 М, Кт6"ФГ -3.9x10-5 М, в 2.8x10-5 М,

Таблица 5.

Константы ингибирования ГФД различными эффекторами

Переменный субстрат

Ингибитор глюкозо-6-фосфат НАДФ

Тип ингиби- Тип ингиби- Ъ

рования мкМ мкМ рования мкМ мкМ

НАДФН Н 28 28 К 7.6 0

НАДН Н 38 38 К 93 0

АТФ С 180 220 К 76 0

2-Оксоглутарат К 34 0 Б 85

Гликолат С 340 120 С 340 98

З-Фосфоглицерат К 110 0 С 100 920

Глюкозо-1-фосфат К 110 0 Н 960 960

Рибозо-5-фосфат С 230 150 С 280 120

Фруктозо-1,б-бис-

фо£(|эат К 160 0 Б 410

н 4.8 4.8 Н 4.8 4.8

Примечание: К - конкурентное, Н - неконкурентное, С - смешанное, Б - бесконкурентное

Для выяснения механизма реакции, катализируемой ФГД тЛ.$1оЫ/огпш> мы исследовали характер ингибирования фермента продуктами реакции. В качестве продуктов-ингибиторов использовали НАДФ и рибулозо-5-фосфат. Определяли тип ингибирования для каждого из субстратов реакции при ненасыщающей и насыщающей концентрации второго субстрата. Ненасыщающая концентрация в данных экспериментах равна 051^, а насыщающая - 10Кт для каждого субстрата. Полученные результаты приведены в табл. 6.

Таблица б.

Ингибирование ФГД пзА^1оЫ[отй£ продуктами реакции

Переменный субстрат

Продукт- НАДФ 6-фосфоглюконат

ингибитор ______

6-ФГ 6-ФГ НАДФ НАДФ

ненасыщ. насыщ. ненасыщ. насыщ.

НАДФН Н Н Н Н

Рибулозо-5-фосфат К - К

Примечание: Н • неконкурентное ингибирование, К - конкурентное ингибирование, - - отсутствие ингибирования

При интерпретации результатов применяли правила [Segal, 1975]. В соответствии с ними можно сделать вывод, что реакция, катализируемая ФГД из A.globíformis, протекает по схеме с неупорядоченным присоединением субстратов и упорядоченным отщеплением продуктов, причем НАДФН отщепляется первым, а рибулозо-5-фосфат - последним.

Данные о свойствах дегидрогеназ глюкозо-6-фосфата и 6-фосфоппюконзта из Ps.oleo\'orans и A.globifomtis обобщены в Табл. 7.

Как отмечалось выше, все исследованные до настоящего времени дегидрогеназы глюкозо-6-фосфата и 6-фосфоглюконата метилотрофиых бактерий были выделены из штаммов, реализующих КДФГ-вариант РуМФ цикла. A.globíformis • первый представитель метилотрофов с ФБФ-вариантом РуМФ цикла, у которого изучены свойства этих ферментов. Тем не менее имеющаяся информация позволяет высказать предположение об отличиях в регуляции ДГФЦ у двух указанных групп метилотрофиых бактерий. Эти отличия связаны, очевидно, с тем, что разделение РуМФ-пути на ассимиляционную и диссимиляциошгую ветви происходит на разных уровнях. У бактерий с КДФГ-вариантом последним обидим метаболитом ассимиляционной и диссимиляционной ветвей является 6-фосфоглюконат, тогда как у бактерий, реализующих ФБФ-вариант, на этом метаболическом перекрестке стоит фруктозо-6-фосфат. Таким образом, в первом случае специфическим ферментом диссимиляционной ветви является только 6-фосфоглюконат дегидрогеназа, а во втором, кроме того, и глкжозо-6-фосфат дегидрогеназа. Здесь необходимо отметить, что у бактерий с КДФГ-вариантом восстановленные пиридиннуклеотиды и АТФ сильнее ингибируют 6-фосфоглюконат дегидрогеназу, чем глюкозо-6-фосфат дегидрогеназу, тогда как у A.globiformis, реализующего ФБФ-вариант, наблюдается обратная ситуация. Кроме того, у A.globifomtis спектр эффекторов глюкозо-6-фосфат дегидрогеназы щире, чем 6-фосфоглюконат дегидрогеназы, в отличие от бактерий с КДФГ-вариантом.

Таблица 7.

Свойства дегидрогеназ глюкозо-6-фосфата и б-фосфоглюконата у метилобактерий с разными типами распада фосфогексоз

Характеристики Pseudomonas oleovorans Anhrobacter globiformís

ГФД ФГД ГФД ФГД

Мол.масса, кД 100 110 142 229

Число субъединиц 2 2 2 4

Оптимум рН 85 8.0 73 15

Кофакторы НАД(Ф) НАДФ НАДФ НАДФ

К^нМ 65(НАДФ) 55(НАДФ) 16(НАДФ) Э7(НДДФ)

28(Г-6-Ф) 15(б-ФГ) 26(Г-6-Ф) 39(6-ФГ)

Ингибиторы АТФ АТФ АТФ, НАД(Ф)Н АТФ

НАД(Ф)Н НАД(Ф)Н Ру5Ф, Ф-б-Ф НАД(Ф)Н

Py-5-Ф, Ф-Б-ф 2-оксоглутарат Ф-1,6-Ф2

Ф-6-Ф фосфоглицерат

Активаторы ацетил-КоА ■

Таким образом, можно предположить, что у метилотрофов с гликолитическим типом распада фосфогексоз регуляция ДГФЦ осуществляется на уровне глюкозо-6-фосфат дегидрогеназы. У бактерий с вариантом Энтнера-Дудорова распада фосфогексоз, основной регуляторной точкой этого цикла является 6-фосфоглюконат дегидрогеназа. Схема регуляции ДГФЦ у Р$.о\ескотап5 \\A.globiformis приведена на рис. 8.

СН^^ СН3ОН

г

КДФГ 1

ГФС С02 рУ_5Ф

ФГД^НАД(Ф)Н ^-НАД(Ф)

— 6-ФГ

нсно---> нсоон

Гу-5Ф

ДХФ—| \ ФГуИ г-----(Е>------------[КАД(Ф)Н

Рибозо-5Ф

Фруктозо-1,6Ф2

Фосфоенолпируват

Р$(ц<1отокт о1(оуогаяз

Фруктозо-1,бФ2

З-Фосфоглицерат 2-Оксоглутарат

Ацетил-КоА "|

Аг^гоЬааег^оЫ/огв!!

Рис. 8. Регуляция ДГфЦу метилотрофных бактерий с различными типами распада фосфогексоз

Выводы

1. Впервые получены прямые доказательства функционирования у метилотрофо диссимиляциокного гексулозофосфатного цикла. ДГФЦ обнаружен у бактерий, использующи метанол или метилированые амины как факультативно, так и облигатно. У облигатны метанотрофов и метилотрофных дрожжей ДГФЦ не выявлен.

2. Разработаны эффективные процедуры получения в высокоочищенном состояни основных ферментов ДГФЦ, определены их физико-химические и кинетические свойства.

3. Показано, что гексулозофосфат синтаза - димер с молекулярной массой 45000 Д характеризуется сложной кинетикой, обусловленной наличием нескольких взаимопревраща* щихся форм, которые были разделены ионообменной хроматографией на ДЭАЭ-агарозе.

4. Установлено, что по основным физико-химическим свойствам и кинетически константам дегидроген азы глюкозо-6-фосфата и 6-фосфоглюконата из исследованных бактерий существенно не отличаются от аналогичных ферментов из других метилотрофов. Различи обнаружены в характере действия метаболитов на активность указаных дегидрогеназ.

5. Исследование влияния эффекторов показало, что у Л.о/еоуо/шм (КДФГ-тип распад; фосфогексоз) основной регуляторной точкой диссимиляционного гексулозофосфатного цию является 6-фосфоглюконат дегидрогеназа. Напротив, у А^оЬЦогти (ФДФ-тип распада) регуляция ДГФЦ осуществляется главным образом на уровне глюкозо-6-фосфат дегидрогеназы. Общим Д1 обоих микроорганизмов является ингибирование диссимиляционного гексулозофосфатного цию АТФ и восстановленными пиридиннуклеотидами.

По теме диссертации опубликованы следующие работы:

1. Trotsenko YA., Loginova N.V., Byk.ovsk.aiya S.V., Sokolov A.P. (1976) Regulatory aspects of methanol metabolism. Abstr. V Int. Ferment. Symp. W.Berlin, p391.

2. Соколов А.П., Троценко ЮА (1977) Циклический путь окисления формальдегида у Pseudomonas oleovorans. Микробиология 1977, т.46, N6, с.1119-1121.

3. Троценко ЮА., Соколов А.П. (1977) Диссимиляционный гсксулозофосфатный цикл и его регуляция у Pseudomonas oleovorans. Сб. "Рост микроорганизмов на С-^-соединениях" (Г.К.Скрябин и др., ред.), НЦБИ Пущино, с.44-45.

4. Соколов АП., Троценко ЮА. (1978) Очистка и характеристика 3-гексулозофосфатсин-тазы из факультативного метилотрофа Pseudomonas oleovorans. Биохимия, т.43, N5, с.782-787.

5. Соколов АП., Лучин С.В. (1979) Свойства и регуляция ферментов диссимиляционного гексулозофосфатного цикла у Pseudomonas oleovorans. Сб. "Регуляция биохимических процессов у микроорганизмов", Пущино, с.330-332

6. Muller R., Sokolov А.Р. (1979) Kinetic properties of the purified 3-hexulosephosphate synthase from Pseudomonas oleovorans. Z. Allg. Mikrobiol., v.19, N4, p.261-267.

7. Троценко ЮА., Соколов АП., Лучин С.В., Логинова Н.В. (1980) Способ получения дегидрогеназ - Авт. свид. N763463. Бюл. изобр. N34.

8. Соколов АП., Лучин С.В., Троценко ЮА (1980) Очистка и свойства дегидрогеназ глюкозо-6-фосфата и 6-фосфоглюконата. Биохимия, т.45, N8, с.1371-1378.

9. Соколов АП., Троценко ЮА. (1980) Регуляция ферментов гексулозофосфатного цикла у облигатных и факультативных метилотрофов. Материалы VI съезда ВМО, Рига, тЗ, с.70.

10. Trotsenko YA., Sokolov А.Р. (1980) Dissimilatory hexulosephosphate cycle and its control in various methylotrophs. Abstr 3rd Int. Symp. "Microbial Growth on Cj Compounds" England, Sheffield, p.62-63.

11.Троценко ЮА, Соколов АП. (1984) Эволюция путей первичной ассимиляции Cj-соеди-нсний у бактерий. Сб. "Вопросы эволюции бактерий" Пущино, с.80-93.

12. Троценко ЮА, Соколов АП. (1985) Регуляция диссимиляционного гексулозофосфатного цикла у метилотрофных бактерий. Сб. "Проблемы биохимии и физиологии микроорганизмов" Пущино, с.44-50.

13. Соколов АП., Троценко ЮА (1985) Очистка и свойства глюкозо-б-фосфатдегидрогеназы и 6-фосфоглюконатдегидрогеназы факультативного метилотрофа Arthrobacter globifonnis. Биохимия, т.50, N8, с.1269-1277.

14. Sokolov А.Р., Trotsenko YA. (1986) Regulation of dissimilatory hexulosephosphate cycle in Arthrobacter globiformis. Abstr. 5th Int.Symp. "Microbial Growth on Cj-Compounds" Holland, Haren, p.64.

15. Троценко ЮА, Быстрых Л.В., Соколов АП. (1987) Регуляция первичного метаболизма метанола у бактерий и дрожжей. Сб. "Биохимия и физиология мегилотрофов" Пущино, с.62-77.

16. Sokolov А.Р., Trotsenko YA (1990) Glucose-6-phosphate dehydrogenase and 6-phosphogluconate dehydrogenase from Arthrobacter globiformis. Methods in Enzymology, v.188, p.339-345.

24.09.93 г. Эак.57В7Р. ТирЛЗО экз. Уч.-изд.л.-I.O

Отпечатано на ротапринте в 0НТИ ШЦ РАН