Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Денитрификация с использованием одноуглеродных соединений

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Лебединский, Александр Владимирович

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Глава I. МЕТИЛОТРОФМ УНУРНОМПХШОВПШ

1.1. Гифомикробы как основной агент метилотрофной денитрификации

1.2. Родовые признаки НурЬот1сгоЪ1иш

1.3. Субстраты роста НурЬот1сгоЪ1ш

1.4. Ассимиляция С|~единиц гифомикробами.

1.5. Катаболизм метанола у аэробных бактерий

1.5.1. Метанолдегидрогеназа

1.5.2. Ферменты, окисляющие формальдегид

1.5.3. Формиатдегидрогеназы

Глава 2. ДЕНИТРИФИКАЦШ.1.

2.1. Агенты денитрификации

2.2. Интермедиаты денитрификации

2.2.1. н20 - облигатный свободный интермедиат денитрификации .■.

2.2.2. Является ли N0 облигатным свободным интермедиатом денитрификации?

2.3. Ферменты денитрификации

2.3.1. Диссимшгяционные нитратредуктазы

2.3.2. Диссимиляционные нитритредуктазы денитрификаторов

2.3.3. ш -редуктазы

2.3.4. ЬГ20~редуктазы.

2.4. Перенос электронов при денитрификации

2.5. Перенос электронов.при.метилотройной . денитрификации

2.6. Влияние внешних факторов на

- 3 денитрификацию

2.6.1. Возможные механизмы влияния аэрации на состав продуктов денитрификации в почвах.

2.6.2. Влияние аэрации на ферменты денитрификации

2.6.3. Влияние концентраций окисленных соединений азота на денитрификацию.

2.6.4. Токсическое влияние интермедиатов денитрификации на продуцентов

2.7. Денитрификации и охрана окружающей среды

2.7.1. Антропогенное влияние на цикл азота

2.7.2. Роль закиси азота в атмосфере

2.7.3. Денитрификация как составная часть геохимического барьера на границе природного ландшафта

2.7.4. Метилотрофная денитрификация как метод . очистки сточных вод от соединений азота.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

Глава 3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1. Микроорганизмы - объекты исследований

3.2. Условия выделения и культивирования метилотрофных денитрификаторов

3.3. Методы определения субстратов и продуктов метилотрофной денитрификации

3.4. Методы работы с суспензиями клеток

3.5. Методы определения ферментов в бесклеточных экстрактах

Глава 4. ВЫДЕЛЕНИЕ МЕТИЛОТРОФНЫХ ДЕНИТРИФИКАТОРОВ И

ИССЛЕДОВАНИЕ ОСОБЕННОСТЕЙ ИХ РОСТА

4.1. Выделение метилотрофных денитрификаторов, относящихся к роду нурьот1сгоь1ит

4.2. Способность гифомикробов к росту с различными акцепторами электрона

4.3. Субстраты роста и денитрификации у Hyphomicrobium S-3 И ZV

4.4. Динамика роста и образования продуктов при анаэробном росте Hyphomicrobium Z-Зи ZV на среде 337 с 0,5$ СН30Н и 50 мМ N0" без дополнительного внесения микроэлементов).

4.5. Влияние концентраций нитрата и метанола на метилотрофную денитрификацию У Hyphomicrobium

Z-3 и ZV

4.6. Влияние рН на метилотрофную денитрификацию у штамма Hyphomicrobium Z-3 . ^

4.7. Влияние микроэлементов на метилотрофную денитрификацию у Hyphomicrobium Z-3 И ZV

4.8. Сравнение аэробного и анаэробного роста Hyphomicrobium Z-3 И ZV

4.9. Выделение метилотрофных денитрификаторов, не относящихся к роду Hyphomicrobium

Глава 5. НАКОПЛЕНИЕ НИТРИТА ПРИ МЕТИЛ0ТР0ФН0Й

ДЕНИТРИФИКАЦИИ.

5.1. Влияние нитрита на метилотрофных.денитрификаторов

Hyphomicrobium Z-3 И ZV .Ю

5.2. Перенос электронов от.метанола к нитрату у

Hyphomicrobium Z

5.3. Возможные причины накопления нитрита Hyphomicrobium z-3 и возможный механизм влияния Си2+ на этот процесс

•Глава 6. ВЛИЯНИЕ АЭРАЦИИ НА СОСТАВ ПРОДУКТОВ

МЕТИЛ0ТР0ФН0Й ДЕНИТРИФИКАЦИИ.

6.1. Влияние аэрации на активность ферментов денитрификации в клетках НурЬош1сгоЫит ъ

6.2. Влияние аэрации на синтез ферментов денитрифика-ции у НурЬот^гоМит й-3 и

6.3. Образование закиси и окиси азота при переходе от аэробиоза к анаэробиозу

Введение Диссертация по биологии, на тему "Денитрификация с использованием одноуглеродных соединений"

В В Е Д Е Н И Е Постановка проблемы и ее актуальность. Процесс денитрификации с использованием одноуглеродных соединений на чистых культурах был впервые продемонстрирован в I97I году у двух представителей рода Hyphomicrobium (Sperl, Hoare, 1971). ГифОМИКробы морфологически характерные организмы, легко опознаваемые под световым микроскопом по моно- или биполярным нитевидным выростам клеток (гифам), на концах которых почкованием образуются дочерние клетки (Hirsch, 1974а). По-Бидимому, именно гифомикробы являются основным агентом денитрификации с метанолом и метиламинами. При анаэробной инкубации самых различных образцов с этими субстратами и нитратом наблюдается развитие накопительных культур, в которых доминируют гифомикробы (Attwood, Harder, 1972; Harder, Attwood, 1978). Единственным не относящимся к гифомикробам организмом, для которого показана денитрификация с метанолом, является РагасосCUS denitrifleans (Bamforth, Quayle, 1978b). Метилотрофные денитрификаторы способны сочетать два процесса, которые по отдельности интенсивно изучаются последние 10-15 лет: метилотрофию и денитрификацию. Метилотрофная денитрификация остается мало изученной, хотя представляет значительный практический и теоретический интерес. В настоящее время в индустриально развитых районах, небогатых водными ресурсами, встает проблема защиты водоемов и грунтовых вод от усиливающегося поступления в них соединений азота. Одним из экономичных способов очистки сточных вод от соединений азота является сочетание бактериального аэробного процесса нитрификации с последующей анаэробной стадией, в ходе которой микроорганизмы восстанавливают образованный при нитрификации нитрат в 1 2 за счет экзогенного метанола, который сравнительно дешев, и не дает токсичных побочных продуктов. Практическим достоинством денитрификации с использованием метанола является и ограниченность осуществляющей процесс группы организмов, так как такой процесс легче изучить и контролировать. Таким образом, исследования денитрификации с метанолом и влияния внешних условий на интенсивность процесса и состав продуктов имеют практическое значение. При денитрификации нередко происходит накопление нитрита, окиси и закиси азота. Состав продуктов при метилотрофной денитрификации и его зависимость от внешних услови11 практически не изучены. В то же время накопление окисленных продуктов денитрификации (во всяком случае нитрита и окиси азота) в очистных сооружениях нежелательны. Нитрит ввиду высокой токсичности не должен содержаться в сбросах. Кроме того, он может ингибировать деятельность микрофлоры очистного сооружения. Усиленное выделение окиси азота может вызывать ло1сальную опасность отравления людей, так как этот газ высоко токсичен. Условия, влияющие на образование закиси азота микроорганизмами, заслуживают изучения с позиций глобальной микробиологии, так как Чатыбсферы/ этот газ влияет на озоновый слой, защищающий Землю от ультрафиолетового излучения (Crutzen, 1981). Одним из теоретических стимулов для изучения метилотрод[>ной денитрификации является недостаточная изученность основных агентов процесса представителей Hyphomicrobiiim, что отражается в отсутствии детальной систематики рода. Представляют в частности интерес вопросы, насколько широко распространена среди гифомикробов способность к денитрификации и насколько однородна по свойствам группа гифюмикробов, способных к денитрификации. Метилотрофия свойство, обнарухшваемое среди ряда таксонов (Кондратьева, 1983). Весьма широко распространена и способность к денитрификации (Jeter, Ingraham, 1981). В ТО же время денитрификация с метанолом обнаружена только у гифомикробов и Pcdenitrificans. Причиной редкости сочетания окисления метанола с восстановлением нитрата могут быть особенности функционирования электрон-транспортной цепи (ЭТЦ) при осуществлении этих процессов. Для ряда метилотрофов показано, что метанол (и иногда формальдегид) передают электроны в ЭТЦ на уровне цитохрома с, минуя цитохром Ъ (Anthony, 1975; Hetrusov et al., 1977; Bamforth, Quayle, 1978b). Для ряда денитрификаторов известно, что нитрат принимает электроны от ЭТЦ на уровне цитохрома b (John, Y/hatiey, 1970; Miyata, 1971). Такигй образом, перенос электронов от метанола к нитрату может быть затруднен. Разветвленные бактериальные электрон-транспортные цепи (ЭТЦ), то есть ЭТЦ, принимающие электроны на разных уровнях и отдающие их на разных \/роБнях, в том числе ЭТЦ меишотрофов и денитрифика торов, привлекают внимание исследователей. В то же время метилотрофные денитрификаторы, обладающие весьма разветвленной ЭТЦ, почти не изучались и с этой точки зрения. Многочисленные исследования, посвященные ЭТЦ Pc.denitrifleans, почти не затрагивали ее функционирования при денитрификации за счет метапола у этого организма. Практические соображения делают изучение денитрификации с метанолом более важным, чем с другилш Сj-субстратами. В то же время именно денитрификация с метанолом как с субстратом, отдающим, по-видимому, электроны в ЭТЦ на уровне цитохрома с, наиболее интересна и с точки зрения функционирования ЭТЦ при метилотрофной денитрификации. Одновременно с нашей работой группа Хардера в Голландии проводила исследование физиологии и биохимии метилотрофной денитрификации, уделяя основное внимание метиламинам (Meiberg, Harder, 1978, 1979; Meiberg et al., 1980; Meiberg, 1979). Эти причины побудили нас в нашей работе по денитрификации с С-г-соединениями уделить основное внимание денитрификации с метанолом. Цель и задачи исследования. Целью работы было изучение особенностей микробиологии, физиологии и биохимии возбудителей денитрификации с метанолом и выяснение влияния различных факторов на интенсивность процесса и состав продуктов. Конкретно задачи исследования состояли в следующем. 1) Получить накопительные и чистые культуры метилотрофных денитрификаторов. Проверить, действительно ли в накопительных культурах доминируют гифомикробы, и не способна ли сопутствующая микрофлора к метилотрофной денитрификации. 2) Проверить способность ряда штаммов гифомикробов, выделенных другими авторами в анаэробных условиях, на способность к денитрификации с целью оценить распространенность этого свойства среди гифомикробов. Сравнить гифомикробов-денитрификаторов по ряду признаков (возможность роста с различными акцепторами, образуемые продукты и т.д.) с целью оценить однородность свойств группы гифомикробов, способных к денитрификации. 3) Выявить влияние внешних факторов рН, аэрации, концентрации нитрата, нитрита, метанола, наличия микроэлементов на интенсивность процесса метилотрофной денитрификации и на состав образуемых продуктов.4. Установить у метилотрофных денитрификаторов тип ферментов, 01ШСЛЯЮЩИХ метанол и восстанавливающих нитрат. Выяснить, возможен ли перенос электронов от метанолдегидрогеназы к нитратре дуктазе. Научная новизна работы. Впервые описан состав продуктов, образуемых метилотрофными денитрификаторами, и влияние на него внешних факторов. Показано, что на состав продуктов денитрификации с метанолом большое влияние оказывают ионы Си в присутствии которых в стабильных анаэробных условиях единственным продуктом становится Ug. Показано, что переход метилотрофных денитрификаторов от аэробного линейного роста к денитрификации в анаэробных условиях способствует образованию ими закиси азота ввиду большей чувствительности NgO -редуктазы к репрессии аэрацией по сравнению с другими редуктазами денитрификации. Установлено, что гифомикробы, способные к денитрификации, представляют собой гетерогенную группу. Они значительно различаются по скорости и эффективности анаэробного роста с нитратом и метанолом, по составу продуктов, образуемых в отсутствие ионов Си по способности к росту с метанолом и Ng» Обнаружено, что Hyphomicrobium Z-3 В определенных условиях осуществляет процесс, не укладывающийся в рамки существующих представлений об ЭТЦ метилотрофных денитрификаторов (Bamforth, Quayie, l97Sb; Meiberg, 1979) практически стехиометрическое восстановление нитрата в нитрит за счет метанола. Проведено энзимологическое исследование обнаруженного явления. Практическая ценность исследования. Полученные данные по зависимости интенсивности денитрификации с метанолом и состава ее продуктов от внешних условий могут иметь значение для практики соответствующих очистных сооружений. Показано, что для избежания II образования нежелательных промежуточных продуктов (нитрит, окись 2+ азота, закись азота) могут быть существенны наличие ионов и стабильные анаэробные условия. Си Выделен штамм Hyphomicrobium Z-3, дающий при анаэробном росте с метанолом и нитратом высокий урожай биомассы в расчете на потребленный метанол, сравнимый с наиболее высокими урожаями, которые удается получить при аэробном культивировании бактерий и дрожжей на метаноле. Выявлены условия анаэробного культивирования Hyphomicrobium Z-3, способствующие ВЫСОКОМУ урожаю, высокому содержанию белка и низкому содержанию поли- -оксимасляной Ь кислоты в клет1шх. Метанол может быть экономичным субстратом для получения кормового микробного белка. При аэробном культивировании существенными проблемами производства являются расход энергии на аэрирование культуры и происходящее при аэрировании улетучивание метанола. При условии наличия штамма, дающего высокий урожай в анаэробных условиях, замена кислорода на нитрат может быть экономически выгодной. Апробация работы. Материалы диссертации были доложены на Всесоюзной конференции Термофильные микроорганизмы в природе и практшсе народного хозяйства", г. Москва, 1983 г. и на Всесоюзном семинаре "Закономерности роста микроорганизмов", г, Пущине, 1983 г. Место проведения работы. Работа проводилась в Институте микробиологии АН СССР в отделе Литотрофных ми1фоорганизмов (заведующий отделом член-корреспондент АН СССР, профессор Г.А.Заварзин). Часть экспериментальной работы проведена совместно с канд. биол. наук И.Я. Ведениной.I. О Б З О Р Л И Т Е Р А Т У Р Ы

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Лебединский, Александр Владимирович

ВЫВОДЫ

1. Способность к денитрификации за счет метанола обнаруживается не у всех штаммов гифомикробов.

Гифомикробы, способные к денитрификации с метанолом, представляют собой гетерогенную группу. Они различаются по скорости роста и эффективности использования метанола при денитрификации, составу накапливаемых промежуточных продуктов восстановления нитрата, по способности к росту с закисью азота.

2. Метилотрофная денитрификации даже в строго анаэробных условиях и при нейтральном рН может сопровождаться накоплением промежуточных продуктов - нитрита и закиси азота, причем их состав различен у разных штаммов.

Присутствие ионов меди (0,1-20 мкМ) предотвращает накопление как ж>2, так и н2о. Единственным продуктом метилотрофной денитрификации становится н2.

3. Чередование аэробных и анаэробных условий при метилотрофной денитрификации ведет к образованию закиси азота, что объясняется тем, что синтез н2о -редуктазы репрессируется при значительно более низких концентрациях растворенного кислорода, чем синтез других редуктаз денитрификации.

При переходе метилотрофных денитрификаторов от аэробных условий к анаэробным может образовываться также окись азота.

4. У штамма НурЬот1сгоМит ъ-3 может происходить перенос электронов от метанолдегидрогеназы к нитратредуктазе, что противоречит принятым представлениям о функционировании ЭТД метилотрофных денитрификаторов.

5. Выделение бактериального штамма, отличающегося от НурЬо-т1сгоЪ1гш и Рагасоссиа йеп:1-Ьг1:И.сап8 и способного к денитрифи-кации с метанолом, показывает, что круг организмов, способных к осуществлению этого процесса, не столь узок, как считалось ранее.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Агенты денитрификации с метанолом.

Обзор литературы показывает, что процесс денитрификации с метанолом представляет значительный практический и теоретический интерес, однако недостаточно изучен. Считается, что основными вызывающими его агентами являются представители Hyphomicrobium. Единственным не относящимся к гифомикробам организмом, для которого была известна способность к денитрификации с метанолом, является Paracoccus denitrificans.

В настоящей работе мы подтвердили, что в анаэробных условиях на среде с метанолом и нитратом, инокулированной пробами из естественных местообитаний, развиваются накопительные культуры, где доминируют гифомикробы. Нами выделены три чистые культуры Hyphomicrobium sp., осуществляющие активную денитрификацию с метанолом. Микрофлора, сопутствующая им в накопительных культурах, оказалась неспособной к денитрификации с метанолом.

Однако посев в анаэробные условия с нитратом и метанолом проб активного ила очистного сооружения, осуществляющего денитрификацию промышленного стока за счет смеси хозяйственно-фекальных сточных вод, метанола и отходов его производства, позволил нам выделить способный к денитрификации с метанолом штамм бактерий, отличающихся морфологически от гифомикробов и PC.denitrificans.

Таким образом, круг организмов, способных к денитрификации с метанолом, оказывается шире, чем считалось ранее.

Влияние внешних факторов на денитрификацию с метанолом.

Обзор литературы показал, что состав продуктов денитрификации с метанолом и влияние на него внешних факторов не были изучены. Мы провели такие исследования для наиболее активной из выделенных нами культур гифомикробов - ЕурЬош1сгоЪ1иш г-з и коллекционной культуры НурИопасгоМит , выделенной Г.А.Заварзиным (1960). У этих штаммов мы исследовали динамику роста и образования продуктов.

2+

Мы обнаружили, что при отсутствии в среде ионов Си накапливающимися промежуточными продуктами восстановления нитрата являются нитрит у Нур1ют1сгоМит г-З И закись азота у НурЬюпасго-Мит гу. Добавление меди позволяло избежать накопления промежуточных продуктов, единственным продуктом восстановления нитрата у обоих штаммов становился и2. Таким образом, медь является важным фактором, регулирующим состав продуктов метилотрофной денитрифи-кации.

Наши данные показывают, что для НурЬот1сгоЪ5дш г-З нитрит является агентом, частично нарушающим сопряжение переноса электронов в ЭТЦ и фосфорилирования. В присутствии меди штамм не накапливает нитрит при анаэробном росте с нитратом и метанолом. В результате присутствие меди значительно повышает урожай биомассы в расчете на потребленный метанол и содержание белка в клетках НурЬот1сгоЫит г-З.

Мы исследовали влияние концентраций нитрата и метанола на процесс метилотрофной денитрификации. НурЬот1сгоЫит г-з и гу устойчивы к концентрации нитрата 100 мМ и 1-1,5$ метанола. Более высокие концентрации нитрата и метанола замедляют рост культуры или полностью его ингибируют.

Изучение влияния кислотности среды на денитрификацшо с метанолом у Нур1ют1сгоЪ:шт г-З показало, что максимальная скорость процесса наблюдается при рН 6,5. Значения рН 5,8-7,0 благоприятствуют образованию и«, а при рй 5,6 и ¡А 7,5-8,0 образуется также закись азота.

Переход метилотрофных денитрификаторов от аэробных условий к анаэробным способствовал образованию закиси азота в связи с большей чувствительностью синтеза н2о-редуктазы к репрессии аэрацией по сравнению с синтезом других ферментов денитрификации.

Наши результаты по влиянию внешних факторов на денитрификацию с метанолом могут иметь значение для практики очиотных сооружений.

Вместе с тем, полученные нами на примере метилотрофных денитрифика торов данные могут иметь значение для понимания некоторых закономерностей процесса денитрификации вообще.

Для денитрификации в почвах известна тенденция к повышению отношения 1Т2о/н2 при усилении аэрации. Причины этого явления ранее на чистых культурах не изучались. На культурах Hyphomicrobium z-З и Hyphomicrobium zv нами показано, что повышение соотношения HgO/Hg при усилении аэрации может быть связано с высокой чувствительностью синтеза н2о-редуктазы к репрессии аэрацией. Наши данные показывают, что повышению соотношения и2о/и2 могут способствовать переходы от аэробных условий к анаэробным.

Обнаруженное нами для Hyphomicrobium z-З образование Н20 при слабощелочных, но не нейтральных значениях рН показывает, что общепризнанная тенденция к образованию н2о в кислых, но не щелочных условиях, допускает исключения.

Возможно ли использовать способность к денитрификации для дробной систематики рода Hyphomicrobium?

Полученные нами данные позволяют несколько полнее охарактеризовать род Hyphomicrobium.

Род Hyphomicrobium недостаточно изучен. Дробная систематика его в настоящее время отсутствует. Это объясняется как недостаточной изученностью многих выделенных штаммов, так и рядом других причин. Так, узкий круг используемых субстратов делает затруднительным использование этого признака для внутриродовой систематики.

Возникает вопрос, нельзя ли считать способность части представителей рода к денитрификации основанием для выделения их в вид, отдельный от вида неденитрифицирующих гифомикробов?

Для решения этого вопроса необходимо оценить распространенность способности к денитрификации среди Hyphomicrobium, а также оценить, насколько однородна группа гифомикробов-детарификаторов, в том числе по физиологии осуществляемого ими процесса денитрификации с метанолом.

Распространенность среди гифомикробов способности к денитрификации не вполне ясна.

Как показали Аттвуд и Хардер (Attwood, Harder, 1972), и подтверждают наши результаты, гифомикробы, способные к денитрификации,легко выделяются из различных естественных местообитаний. Многие штаммы, выделенные в аэробных условиях, не проверены на способность к денитрификации. Встает вопрос, не является ли вообще подавляющее большинство гифомикробов денитрификаторами?

Нами получены данные, показывающие, что гифомикробы, не способные к денитрификации, могут обнаруживаться даже в условиях, благоприятствующих этому процессу. Таковы исследованные нами гифомикробы, присутствующие в накопительных культурах тарификаторов.

Таким образом, группы гифомикробов-денитрификаторов и неде-нитрификаторов, по-видимому, являются сравнимыми по мощности и с этой точки зрения разделение рода по признаку способности к денитрификации представляется возможным.

Однако данные, полученные нами при изучении процесса денитрификации у гифомикробов, а также сопоставление их с данными Мей-берга с соавторами (Meiberg, Harder, 1979; Meiberg et al., 1980) показывают, что разные штаммы денитрифицирующих гифомикробов существенно различаются по физиологии осуществляемого процесса.

Суммируем полученные нами и имеющиеся в литературе данные по физиологии процесса денитрификации у гифомикробов.

Hyphomicrobium z-З - штамм, обладающий сравнительно высокой скоростью и эффективностью анаэробного роста с нитратом в присутствии 0,1-20 мкМ си2+. Состав биомассы в таких условиях характеризуется высоким содержанием белка и низким содержанием ПОМК. Урожай, скорость роста и состав биомассы при развитии в аэробных условиях примерно такие же. При анаэробном росте с нитратом при дефиците меди накапливает значительное количество нитрита. Нитрит, по-видимому, частично разобщает перенос электронов и окислительное фосфорилирование. Медь влияет на накопление нитрита этим штаммом, но не на его n2o -редуктазную активность. Рост с и2о трудновоспроизводим, но возможен; медьюне стимулируется.

Hyphomicrobium zv - штамм, имеющий низкую скорость и эффективность анаэробного роста с нитратом независимо от присутствия Си2+. При развитии в таких условиях накапливает значительное количество ПОМК. Аэробный рост значительно быстрее и эффективнее, его физиологические характеристики близки к таковым для Hyphomicrobium z-З. При анаэробном росте с нитратом при дефиците меди нитрит не накапливается. 0,4 мкМ меди при росте в таких условиях стимулируют ii2o -редуктазную активность. Роста с н2о не обнаруживается, в том числе в присутствии меди.

По данным Мейберга с соавторами (Meiberg, Harder, 1979; Meiberg et al., 1980), Hyphomicrobium x в аэробных условиях растёт быстрее, чем в анаэробных с нитратом,.но использует субстраты (диметиламин и триметиламин) примерно с той же эффективностью. Накопление нитрита происходит несмотря на добавление в среду 1,26 мкМ Си2+. Накапливающийся нитрит ингибирует рост. Авторы предполагают, что нитрит ингибирует перенос электронов в ЭТЦ.

Таким образом, группа денитрифицирующих гифомикробов является гетерогенной по физиологии осуществляемого ими процесса мети-лотрофной денитрификации. Представляет интерес вопрос, насколько велики лежащие в основе физиологических различий различия энзимо-логические.

Различия е физиологии денитрификации у гифомикробов скорее всего имеют под собой энзимологическое обоснование. Представляется вероятным, что общий предок денитрифицирующих и не денитрифицирующих гифомикробов был не денитрификатором, а строго аэробным метилотрофом. Способность же к денитрификации была приобретена гифомикробами в результате латерального переноса генетической информации, При этом различия в физиологии (и, по-видимому, энзи-мологии) денитрификаци у гифомикробов позволяют предположить, что ферменты денитрификации были восприняты двумя (или более?) уже дивергировавшими ветвями гифомикробов. Эти ветви уже обладали, в частности, различными ЭТЦ, куда ферменты денитрификации могли встроиться, естественно, по-разному. В результате анаэробный катаболизм метанола у различных гифомикробов оказался весьма различным по энергетической эффективности.

Таким образом, если род Нур1ют:1сгоЬ1шп и может быть разбит на два или более видов, то те или иные штаммы гифомикробов-детарификаторов должны будут быть отнесены к тому или иному виду, объединяющему как денитрификаторов, так и не денитрификаторов. Это будет возможно, если будут найдены корреляции между "физиологическим типом" денитрификации (эффективность, определенный набор ферментов), осуществляемым тем или иным штаммом, и иными его характеристиками, в том числе морфологическими (например, образование розеток).

Считается, что при денитрификации за счет метанола необходима "точно сбалансированная" работа ЭТЦ (см.раздел 2.5). Если бы это было так, то неоднократное эволюционное возникновение способности к денитрификации с метанолом было бы маловероятным. Казалось бы, об этом свидетельствовало и устоявшееся представление о том, что гифомикробы и Paracoccus denitrifleans являются единственными агентами денитрификации с метанолом.

Однако наши данные, полученные с Hyphomicrobium z-З, показывают, что особой сбалансированности работы ЭТЦ при денитрификации с метанолом не требуется. Возможен перенос электронов от цито-хрома с, восстанавливаемого метанолом, к цитохрому ъ, окисляемому нитратом. Перенос электронов против градиента окислительно-восстановительного потенциала оказывается при этом термодинамически возможным, по-видимому, благодаря тому, что цитохром с все время восстановлен метанолом, а цитохром ъ - окислен нитратом.

Нами выделен способный к осуществлению процесса денитрификации С метанолом штамм, не ПОХОЖИЙ НИ. на гифомикробов, НИ на Paracoccus denitrificans. Его выделение вновь подчеркивает, что для осуществления процесса денитрификации с метанолом нет необходимости в наличии уникальной ЭТЦ. Следовательно, неоднократное возникновение способности к денитрификации в различных уже диверги-ровавших ветвях аэробных гифомикробов вполне возможно.

Таким образом, полученные нами данные позволяют утверждать, что разделение рода по принципу способности к денитрификации нецелесообразно.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Лебединский, Александр Владимирович, Москва

1. Белони Ж. Изучение морфологических и физиолого-биохимических особенностей культур ПОЧКУЮЩИХСЯ бактерий рода Hyphomicrobium. Автореферат канд.дисс., Ленинград, 1981.

2. Бертокс П., Радд Д. Стратегия защиты окружающей среды от загрязнений. М., Мир, 1980.

3. Веденина И.Я., Заварзин Г.А. Удаление закиси азота бактериями в окислительных условиях. В сб.: Роль микроорганизмов в круговороте газов в природе. М., Наука, 1979, с.105-113.

4. Веденина И.Я., Лебединский А.В. Превращения закиси азота при денитрификации, диссимиляционном образовании аммония и нитрификации. Успехи микробиологии, 1984, т.19, с.135-165.

5. Головачева Р.С. Термофильные нитрифицирующие бактерии горячих источников. Микробиология, 1976, т.45, с.377-379.

6. Гороновский И.Т., Назаренко Ю.П., Некреч Е.Ф., 1974. Краткий справочник по химии. Наукова Думка, Киев.

7. Заварзин Г.А. Цикл развития и ядерный аппарат Hyphomicrobium vulgare stutz et Hartieb. Микробиология, I960, т.29, с.38-42.

8. Заварзин Г.А. Почкующиеся бактерии. Микробиология, 1961, т.30, с.952-975.

9. Заварзин Г.А. Экстенсивная микробиология. Изв. АН СССР, Сер. биол., 1976, № I, с .121-136.

10. Заварзин Г.А. Микробиология двадцать первому веку. М., Знание,1981.

11. Захарова Е.В. Роль формиата в дыхательной системе метилотро-фов. Автореферат канд.дисс. Москва, 1980.

12. Кондратьева E.H. Хемолитотрофы и метилотрофы. Изд-во МГУ, 1983.

13. Кондратьева E.H., Красильникова E.H. Восстановление нитратов пурпурными бактериями в разных условиях роста. Микробиология, 1981, т.50, с.1066-1071.

14. Кудеяров В.Н. Вопросы охраны окружающей среды в связи с современным состоянием круговорота азота. В сб.: Круговорот и баланс азота в системе почва удобрение - растение - вода. М., Наука, 1979, с.280-284.

15. Кузнецов С,И. Микрофлора озер и ее геохимическая деятельность. Л., Наука, 1970.

16. Логинова Н.В., Шишкина В.Н., Троценко 10.А. Первичные пути метаболизма метилированных аминов У Hyphomicrobium vulgare. -Микробиология, 1976, т.45, с.41-47.

17. Логинова Н.В., Шишкина В.Н., Филипова Т.М., Троценко Ю.А. Сравнительное изучение метаболизма метанола и метиламина у Hyphomicrobium vulgare. -Изв. АН СССР, Сер.биол., 1977, № 2, с.235-243.

18. Макаров Б.Н., Макаров Н.Б. Газообразные потери азота почвы и удобрений. Агрохимия, 1976, № 12, с.120-130.

19. Мишустин E.H. Круговорот азота и его соединений в природе. В сб.: Роль микроорганизмов в круговороте газов в природе. М., Наука, 1979, с.68-91.

20. Муравин Э.А. Применение ингибиторов нитрификации для снижения потерь и повышения эффективности азота удобрений. Итоги науки и техники. Почвоведение и агрохимия, 1979, т.З, с.5-17.

21. Мюллер Г., Гнаук Г. Газы высокой чистоты. М., Мир, 1968.

22. Смирнов П.М. Газообразные потери азота почвы и удобрений и пути их снижения. В сб.: Круговорот и баланс азота в системепочва удобрение - растение - вода. М., Наука, 1979, с.56-64.

23. Тальрозе В.Л., Ларин И.К., Поройкова А.И. Химические реакции микробиогенных газов в земной атмосфере. В кн.: Роль микроорганизмов в круговороте газов в природе. М., Наука, 1979,с.35-49.

24. Торшин С.П. Размер и состав газообразных потерь азота почвы и удобрений в различных условиях. Автореферат канд.дисс., Москва, 1982.

25. Федорова Р.И., Милехина Е.И., Ильюхина,Н.И. 0 возможности метода "газообмена" для обнаружения жизни вне Земли идентификация азотфиксирующих микроорганизмов. - Изв. АН СССР, Сер. биол., 1973, № 6, с.797-806.

26. Шишкина В.Н., Троценко Ю.А. Свойства нового штамма Hyphomic-robium, использующего одноуглеродные соединения. Микробиология, 1974, т.43, с.765-770.

27. Adamse A.D., Velzeboer С.Т.М. Features of a Clostridium strain CV-AAI, an obligatory anaerobic bacterium producing acetic acid from methanol. Antonie van Leeuwenhoek, 1932, v.48,1. P.305-319.

28. Alefounder P.R. , McCarthy J.E.G., Ferguson S.J. The basis of the control of nitrate reduction by oxygen in Paracoccus de-nitrificans. FEMS Microbiol.dett., 1981, v.12, p.321-326.

29. Allen М.Б., van Niel С.Б. Experiments on bacterial denitrifi-cation. J.Bacterid. , 1952, v.64, p.397-412.

30. Ambler R.P. The amino aoid sequence of cytochrome c1 from Alcaligenes sp. NCIB 1105. Biochem.J., 1973, v.135, p.751-758.

31. Anthony C. The microbial metabolism of C^ compounds. The cytochromes of Pseudomonas AMI. Biochem.J., 1975, v.146,p.289-298.

32. Anthony C., Zatman L.J. The microbial oxidation of methanol. 2. The methanol-oxidizing enzyme of Pseudomonas sp. M27. -Biochem.J., 1964, v.92, p.614-621.

33. Anthony C., Zatman L.J. The microbial oxidation of methanol. Purification and properties of the alcohol dehydrogenase of Pseudomonas sp. M27. Biochem.J., 1967, v.104, p.953-959.

34. Aristovskaya T.V., Hirsch P. Genus Pedomicrobium Aristovskaya 1961, 957. In: Buchanen R.E., Gibbons U.E., eds. Bergey's Manual of Determinative Bacteriology. Eigth Edition. The Williams Wilkins Company, Baltimore, 1974, p.151-153.

35. Attwood M.M., Harder W. A rapid and specific enrichment procedure for Hyphomicrobium spp. Antonie van Leeuwenhoek, J.Microbiol.Serol., 1972, v.38, p.369-378.

36. Attwood M.M., Harder W. The oxidation and assimilation of C2 compounds by Hyphomicrobium sp. J.Gen.Microbiol., 1974, v.84, p.350-356.

37. Attwood M.M., Harder W. Formate assimilation by Hyphomicrobium X. PEMS Microbiol.Lett., 1978, v.3, p.111-114.

38. Bache R., Pfennig Ii. Selective isolation of Acetobacterium woodii on methoxylated aromatic acids and determination of growth yields. Arch.Microbiol., 1981, v.130, p.255-261.

39. Baldensperger J., Garcia J.-L. Reduction of oxidised inorganic nitrogen compounds by a new strain of Thiobacillus denitrificans. Arch.Microbiol., 1975, v.103, p.31-36.

40. Balderston W.L., Sherr B., Payne W.J. Blackage by acetylene of nitrous oxide reduction in Pseudomonas perfectomarinus. -Appi.Environ.Microbiol., 1976, v.31, p.504-508.

41. Bamforth C.W., Quayle T.R. The dye-linked alchohol dehydrogenase of Rhodopseudomonas acidophila. Comparison with dye-linked methanol dehydrogenases. Biochem.J., 1978a, v.169, p.677-686.

42. Bamforth С.IV., Quayle J.R. Aerobic and anaerobic growth of Paracoccus denitrificans on methanol. Arch.Microbiol., 1978b, v.119, p.91-97.

43. Bannai M., Satoh T. Electron transport coupled to nitrate reduction in a photodenitrifier, Rhodopseudomonas shpaeroides forma sp. denitrificans. Plant Cell Physiol., 1982, v.23, p.205-211.

44. Bellion E., Bolbot J.A., Timothy D.L. Generation of glyoxy-late in methylotrophic bacteria. Curr.Microbiol., 1981, v.6, p.367-372.

45. Betlach M.R., Tiedje J.M. Kinetic explanation for accumulation of nitrite, nitric oxide and nitrous oxide during bacterial denitrification. Appl.Environ.Microbiol., 1981, v.42, p.1074-1084.

46. Blackmer A.M., Bremner J.M. Inhibitory effect of nitrate on reduction of N20 to N2 by soil microorganisms. Soil Biol. Biochem., 1978, v.10, p.187-191.

47. Blackmer A.M., Bremner J.M. Stimulatory effect of nitrate on reduction of NgO to N2 by soil microorganisms. Soil Biol. Biochem., 1979, v.11, p.313-315.

48. Boogerd F.C., van Verseveld H.W., Stouthamer A.H. Electron transport to nitrous oxide in Paracoccus denitrificans. -PEBS Lett., 1980, v.113, p.279-284.

49. Boogerd P.C., van Verseveld H.W., Stouthamer A.H. Respiration -driven proton translocation with nitrite and nitrous oxide in Paracoccus denitrificans. Biochim.Biophys.Acta, 1981,v.638, p.181-191.

50. Bryan B.A. Physiology and biochemistry of denitrifleation. In: Delwiche C.C. ed., Denitrification., Nitrification and Atmospheric Nitrous Oxide. N.-Y., 1981, p.67-84.

51. Cady P.B., Bartholomew W.V. Investigation of nitric oxide reactions in soils. Soil Sci.Soc.Am.Proc., v.27, p.546-549.

52. Calder K., Burke K.A., Lascelles J. Induction of nitrate reduction and membrane cytochromes in wild type and chlorate-resistant Paracoccus denitrificans. Arch.Microbiol., 1980, v.126, p.149-154.

53. Chung C.W., Najjar V.A. Cofactor requirements for enzymatic denitrification. II. Nitric oxide reductase. J.Biol.Chem., 1956, v.128, p.627-632.

54. Claesson A., Rydtng S.O. Nitrogen a growth limiting nutrient in eutrophic lakes. - Progr.Wat.Techn., 1977, v.8, p.291-299.

55. Colby J., Dalton H., Whittenbury R. Biological and biochemical aspects of microbial growth on C^ compounds. Ann.Rev. Microbiol., 1979, v.33, p.481-517.

56. Cooney C.L., Levine D.W. Microbial utilizarion of methanol. -Adv.Appl.Microbiol., 1972, v.15, P.337-365.

57. Cox C.D., Jr., Payne W.J., Dervartanian D.V. Electron paramagnetic resonance studies on the nature of hemoproteins in nitrite and nitric oxide reduction. Biochim.Biophys.Acta, 1971, v.253, p.290-294.

58. Cox R.B., Quayle J.R. The autotrophic growth of Micrococcus denitrificans on methanol. Biochem.J., 1975, v.150, p.569-571.

59. Crutzen P.J. The influence of nitrogen oxides on the atmospheric ozone content. Quart.J.R.Meteorol.Soc., 1970, v.96,p.320-325.

60. Crutzen P.J. Ozone production rates in an oxygen hydrogen -nitrogen oxide atmosphere. - J.Geophys.Res., 1971, v.76,p.7311-7328.

61. Crutzen P.J. Estimates of possible variations in total ozone due to natural causes and human activities. Ambio, 1974, v.3, p.201-210.

62. Crutzen P.J. Atmospheric chemical processes of the oxides of nitrogen, including nitrous oxide. In: Delwiche C.C. ed., Denit^ification, Nitrification and Atmospheric Nitrous Oxide.1. N.-Y.Tfp.17-44.

63. Crutzen P.J., Howard C.J. The effect of the H02 + NO reaction rate constant on one-demensional model calculations of stratospheric ozone perturbations. Pageoph., 1978, v. 116, p.497-510.

64. De Bont J.A.M., van Dijken J.P., Harder W. Dimethyl sulphoxide and dimethyl sulphide as a carbon, sulphur and energy source for growth of Hyphomicrobium S. J.Gen.Microbiol., 1981, v.127, p.315-323.

65. De Groot G.N., Stouthamer A.H. Regulation of reductase formation in Proteus mirabilis. III. Influence of oxygen, nitrate and azide on thiosulfate reductase and tetrathionate reductase formation.-Arch.Mikrobiol. , 1970, v.74, p.326-339.

66. Delwiche C.C. The nitrogen cycle and Atmospheric Nitrous Oxide. In: Delwiche C.C. ed., Denitrification, Nitrification and

67. Atmospheric Nitrous Oxide. N.-Y.,1981, p. 1-15.

68. Dijkhuizen L., Timmerman J.W.C., Harder W. A pyridine nucleotide-independent membrane-bound formate dehydrogenese in Pseudomonas oxalaticus OX 1. PEMS Microbiol.Lett., 1979, v.6, p.53-56.

69. Douthit H.A., Pfennig N. Isolation and growth rates of methanol utilizing Rhodospirillaceae. Arch.Microbiol., 1976,v.107, p.233-234.

70. Duine J.A., Frank J., De Ruiter L.G. Isolation of a methanol dehydrogenase with a functional coupling to cytochrome c.-J.Gen.Microbiol., 1979, v.115, p.523-526.

71. Duine J.A., Prank J., Westerling J. Purification and properties of methanol dehydrogenase from Hyphomicrobium X. -Biochim.Biophys.Acta, 1978, v.554, p.277-287.

72. Fewson C.A., Nicholas D.J.D. Nitric oxide reductase from Pseudomonas aeruginosa. Biochem.J., 1961, v.78, p.98-108.

73. Pinlay B.J., Span A.S.W., Harman J.A. Nitrate respiration in primitive eukaryotes. Nature, 1983, v.303, p.333-336.

74. Firestone M.K., Firestone R.B., Tiedje J.M. Nitric oxide as an intermediate in denitrification: evidence from Nitrogen-13 isotope exchange. Biochem.Biophys.Res.Commun., 1979a, v.91, p.10-16.

75. Firestone M.K., Smith M.S., Firestone R.B., Tiedje J.M. The influence of nitrate, nitrite and oxygen on the composition of the gaseous products of denitrification in soil. Soil. Sci.Soc.Am.J., 1979, v.43, p.1140-1144.

76. Firestone M.K., Tiedje J.M. Temporal changes in nitrous oxide and dinitrogen from denitrification following onset of ana-erobiosis. Appl.Environ.Microbiol., 1979, v.38, p.673-679.

77. Focht D.D. The effect of temperature, pH and aeration on the production of nitrons oxide and gaseous nitrogen a zero -order kinetic model. - Soil.Sei., 1974, v.118, p.173-179.

78. Fishman J., Crutzen P.J. The origin of ozone in the tropo-shere. Nature, 1978, v.274, p.855-858.

79. Pocht D.D., Verstraete W. Biochemical ecology of nitrification and denitrification. Adv.Microb.Ecol., 1977, v.1,p.135-214.

80. Forget P., Dubourdieu M. Evidence for the preseuce of a small subunit as the principal component of the nitrate reductase / of Escherichia coli K12. Biochem.Biophys.Res.Commun., 1982, v.105, p.450-456.

81. Forsberg C. Nitrogen as a growth factor in fresh water. -Progr.Wat.Techn., 1977, v.8, p.275-290.

82. Garber E.A.E., Hollacher T.C. Ii1^ tracer studies on the role of UO in denitrification. J.Biol.Chem., 1981, v.256,1. P.5459-5465.

83. Garcia J.-L. Étude de la denitrification chez une bactèric thermophile sporulée. Ann.Microbiol. (Inst.Pasteur ), 1977, v. 128A, p.447-458.

84. Greenberg E.P., Becker G.E. Nitrous oxide as end product of denitrification by strains of fluorescent pseudomonads. -Can.J.Microbiol., 1977, v.23, p.903-907.

85. Gudat J.C., Singh J., Wharton D.C. Cytochrome oxidase from Pseudomonas aeruginosa. I. Purification and some properties. ✓ Biochim.Biophys.Acta, 1973, v.292, p.376-390.

86. Harder W., Attwood M.M. Oxidation of organic C1 compounds by Hyphomicrobium spp. Antonie van Leeuwenhoek, 1975, v.41, p.421-429.

87. Harder W., Attwood M.M. Biology, physiology and biochemistry of Hyphomicrobia. Adv.Microb.Physiol., 1978, v.17, p.303-359.

88. Harder W., Attwood M.M., Quayle J.R. Methanol assimilation by Hyphomicrobium sp. J.Gen.Microbiol., 1973, v.78, p.155

89. Harder W., Matiu A., Atvvood M.A. Studies on the physiological significance of the lack of a pyruvate dehydrogenase complex in Hyphomicrobium sp. J.Gen.Microbiol., 1975, v.86, p.319-326.

90. Hart L.T., Larson A.D., McCleskey C.S. Denitrification by Co-rynebacterium nephridi. J.Bacteriol., 1965, v.89, p.1104-1108.

91. Hirsch P. Genus Hyphomicrobium Stutzer and Hartleb 1898, 76. In: Buchanan R.E., Gibbons U.E., eds, Bergey's Manual of Determinative Bacteriology. Eighth Edition, 1974a, p.148-150.

92. Hirsch P. Genus Hyphomonas Pongratz 1957, 607. In: Buchanan R.E., Gibbons N.E., eds, Bergey's Manual of Determinative Bacteriology. Eighth Edition, 1974b, p.150-151. .

93. Hirsch P. Budding Bacteria. Ann.Rev.Microbiol., 1974c, v.28, p.391-444.

94. Hirsch P., Conti S.P. Biology of budding bacteria. II. Growth and nutrition of Hyphomicrobium spp. Arch.Mikrobiol., 1964, v.48, p.358-367.

95. Hollocher T.C. The pathway of nitrogen and reductive enzymes of denitrification. Antonie van Leeuwenhoek, 1982, v.48, p.531-544.

96. Ishaque M., Aleem M.I.H. Intermediates of denitrification in chemoautotroph Thiobacillus denitrificans. Arch.Mikrobiol., 1973, v.94, p.269-282.

97. Iwasaki H., Matsubara T. Cytochrome c-557(551) and cytochrome4cd of Alcaligenes faecalis. J.Biochem., 1971, v.69, p.847-857.

98. Iwasaki H., Noji S., Shidara S. Achromobacter cycloclastesnitrite reductase. The function of copper, amino acid composition, and electron spin resonance spectra. J.Biochem., 1975, v.78, p.355-361.

99. Iwasaki H., Saigo T., Matsubara T. Copper as a controlling factor of anaerobic growth under NgO and biosynthesis of H20 reductase in denitrifying bacteria. Plant Cell Physiol., 1980, v.21, p.1573-1584.

100. Iwasaki H., Terai H. Analysis of H2 and UgO produced during growth of denitrifying bacteria in copper-depleted and -supplemented media. J.Gen.Appl.Microbiol., 1982, v.28,p.189-193.

101. Jeter R.M., Ingraham J.L. The denitrifying prokaryotes. In: Starr M.P. et al. eds. The Prokaryotes. A Handbook of Habitats, Isolation and Identification of Bacteria. SpringerVerlag, 1981, v.1, p.913-925.

102. John P., Whatley P.R. Oxidative phosphorylation coupled to oxygen uptake and nitrate reduction in Micrococcus denitri-ficans. Biochim.Biophys.Acta, 1970, v.216, p.342-352.

103. John R.T., Hollocher T.C. Nitrogen 15 tracer studies on the pathway of denitrification in Pseudomonas aeruginosa. -J.Biol.Chem., 1977, v.252, p.212-218.

104. Johnson P.A., Quayle J.R. Microbial growth on C^ compounds. 6. Oxidation of methanol, formaldehyde and formate by methanol grown. Pseudomonas AM1. - Biochem.J., 1964, v.93,p.281-290.

105. Johnston H. Reduction of stratospheric ozone by nitrogen oxide catalysis from SST exhaust. Science, 1971, v.173, p.517-522.

106. Jones C.Y/., Kingsburg S.A., Dawson M.J. The partial resolution and dye-mediated reconstitution of methanol oxidase activity in Methylophilus methylotrophus. FEMS Microbiol. Lett., 1982, v.13, p.195-200.

107. Kakutani T., Bappu T. , Arima K. Regulation of nitrite reductase in the denitrifying Bacterium Alcaligenes faecalis S-6. Agric.Biol.Chem., 1981, v.45, p.23-28.

108. Kapralek F., Pichinoty F. The effect of oxygen on tetrathio-nate reductase activity and biosynthesis. J.Gen.Microbiol., 1970, v.65, P.95-105.

109. Kaspar H.F. Nitrite reduction to nitrous oxide by Propionibacteria: detoxication machanism. Arch.Microbiol., 1982, v.133, p.126.

110. Kaspar H.F., Tiedje J.M., Firestone R.B. Denitrification and dissimilatiry nitrate reduction to ammonium in digestedsludge. Can.J.Microbiol., 1981, v.27, p.878-885.

111. Kenealy W.R., Zeikus J.G. One-carbon metabolism in methano-gens: evidence for synthesis of two-carbon cellular intermediate and unification of catabolism and anabolism in Metha-nosarcina barkeri. J.Bacteriol., 1982, v.151, p.932-941.

112. Kiszkiss D.F., Downey R.J. Localization and solubilization of the respiratory nitrate reductase of Bacillus stearother-mophilus. J.Bacteriol., 1972, v.109, p.803-810.

113. Knowles R. Denitrification. Microbiol.Rev., 1982, v.46, p.43-70.

114. Kodama T. Effects of growth conditions on formation of cytochrome systems of a denitrifying bacterium, Pseudomonas stu4tzeri. Plant Cell Physiol., 1970, v.11, p.231-239.

115. Köhler Y., Schwartz A.C. Oxidation of aromatic aldehydes and aliphatic secondary alcohols by Hyphomicrobium spp. Can.J.

116. Micr., 1982, v.28, p.65-72.

117. Koike I., Hattori A. Growth yield of a denitrifying bacterium Pseudomonas denitrificans under aerobic and denitrifying conditions. J.Gen.Microbiol., 1975a, v.88, p.1-10.

118. Koike I., Hattori A. Energy yield of denitrification: an estimate from growth yield in continuous culture of Pseudomonasidenitrificans under nitrate-, nitrite- and nitrous oxide -limited conditions. J.Gen.Microbiol., 1975b, v.88, p.11-19.

119. Kortstee G.J.J. The homoisocitrate glyoxylate cycle in pink, facultative methylotrophs. - FEMS Microbiol.Lett., 1980, v.8, p.59-66.

120. Kristjansson J.K., Hollocher T.C. First practical assay for soluble nitrous oxide reductase of denitrifying bacteria and a partial kinetic characterization. J.Biol.Chem., 1980,v.255, p.704-707.

121. Kristjansson J.K., Hollocher C. Partial purilication and characterization of nitrous oxide reductase from Paracoccus denitrificans. Curr.Microbiol., 1981, v.6, p.247-252.

122. Krul J.M. Dissimilatory nitrate and nitrite reduction underiaerobic conditions by an aerobically and anaerobically grown Alcaligenes sp. and by activated sludge. J.Appl.Bacteriol., 1976, v.40, p.245-260.

123. Lam Y., Nicholas D.J.D. Aerobic and anaerobic respiration in Micrococcus denitrificans. Biochim.Biophys.Acta, 1969a,v.172, p.450-461.

124. Lam Y., Nicholas D.J.D. A nitrite reductase with cytochrome oxidase activity from Micrococcus denitrificans, Biochim. Biophys.Acta, 1969b, v.18 0, p.459-472.

125. Lander L. Sources of nitrogen as a water pollutant: industrial waste water. Progr.Water Techn., 1977, v.8, p.55-65.

126. Large P.J., Meiberg J.B.M., Harder W. Cytochrome Cco is not a primary electron acceptor for the amine dehydrogenases of Hyphomicrobium X. FEMS Microbiol.Lett., 1979, v.5, p.281-286.

127. Large P.J., Quayle J.R. Microbial growth on C^ compounds. 5. Enzyme activities in extracts of Pseudomonas ATtll. Biochem. J., 1963, v.87, p.386-396.

128. Logan J.A., Prather M.J., Wofsy S.C., McElroy M.B. Atmospheric chemistry: response to human influence. Phil.Trans.P.Soc. Lond., 1978, v.290, p.187-234.

129. Lowry O.H., Rosebrough W.J., Parr A.L. , Randall R.J. Protein measurement with the Polin phenol reagent. J.Biol.Chem., 1951, v.193, p.265-275.

130. Marison I.W., Attwood M.M. Partial Purification and Characterization of a Dye-linked Formaldehyde Dehydrogenase from Hyphomicrobium X. J.Gen.Microbiol., 1980, v.117, p.305-313.

131. Matsubara T. Studies on denitrification.XIII. Some properties of the NgO-anaerobically grown cell. J.Biochem., 1971,v.69, p.991-1001.

132. Matsubara T. The participation of cytochromes in the reduction of Kg0 to H2 by a denitrifying bacterium. J.Biochem., 1975, v.77, p.627-632.

133. Matsubara T., Prunzke K., Zumft W.G. Modulation by copper of the products of nitrite respiration in Ps.perfectomarinus. -J.Bacterid., 1982, v.149, p.816-823.

134. Matsubara T., Iwasaki H. Enzymatic steps in dissimilatorynitrite reduction in Alcagenes faecalis. J.Biochem., 1971, v.69, P.859-868.

135. Matsubara T., Iwasaki H. Nitric oxide-reducing activity of Alcaligenes faecalis cytochrome cd. J.Biochem., 1972, v.72, P.57-64.

136. Matsubara T., Mori T. Studies on denitrification. IX. Nitrous oxide, its production and reduction to nitrogen. J.Biochem.,' 1968, v.64, p.863-871.

137. Matsubara T., Zumft W.G. Identification of a copper protein as part of the nitrous oxide-reducing system in nitrite-respiring (denitrifying) pseudomonads. Arch.Microbiol., 1982, v.132, p.322-328.

138. McKenney D.J., Shuttleworth K.F., Vriesacker J.R., Findlay

139. W.I. Production and loss of nitric oxide from denitrification in anaerobic Brookston clay.- Appl.Environ.Microbiol., 1982, v.43, p.534-541.

140. Meiberg J.B.M. Metabolism of methylated amines in Hyphomicro-bium spp. Ph.D.Thesis, 1979, Groningen.

141. Meiberg J.B.M. , Harder W. Aerobic and anaerobic metabolismof trimethylamine, dimethylamine and methylamine in Hyphomic-robium X. J.Gen.Microbiol., 1978, v.106, p.265-276.

142. Meiberg J.B.M., Harder W. Dimethylamine dehydrogenase from Hyphomicrobium X: purification and some properties of a new enzyme that oxidizes secondary amines. J.Gen.Microbiol., 1979, v.115, p.49-58.

143. Meiberg J.B.M., Bruinenberg P.M., Harder W. Effect of dissolved oxygen tension on the metabolism of methylated amines in

144. Hyphomicrobium X in the absence and preseuce of nitrate: evidence for "aerobic" denitrification. J.Gen.Microbiol., 1980, v.120, p.453-463.

145. Meijer E.M., van der Zwaan J.W., Wever R., Stouthamer A.H. Anaerobic respiration and energy conservation in Paracoccus denitrificans. Functioning of iron-sulfur centers and the uncoupling effect of nitrite. Eur.J.Biochem., 1979, v.96, p.69-76.

146. Miyata M., Matsubara T., Mori T. Studies on denitrification. XI. Some properties of nitric oxide reductase. J.Biochem., 1969, v.66, p.759-765.

147. Miyata M., Mori T. Studies on denitrification. X. The "denitrifying enzyme" as a nitrite reductase and the electron donating system for denitrification. J.Biochem., 1969,v.66, p.463-471.

148. Moore R.L. Ribosomal ribonucleic acid cistron homologies among Hyphomicrobium and various other bacteria. Can.J. Microbial., 1977, v.23, p.478-481.

149. Moore R.L. The Genera Hyphomicrobium, JPedoraicrobium, and Hyphomonas. In: Starr M.P. et al., eds, "The Prokaryotes. A Handbook on Habitats, Isolation, and Identification of Bacteria", 1981, Springer-Verlag, v.I, p.480-487.

150. Moore R.L., Hirsch P. Deoxyribonucleic acid base sequencehomologies of some budding and prosthecate bacteria. -J.Bacteriol., 1972, v.110, p.256-261.

151. Netrusov A.I., Anthony C. Oxidative phosphorylation in membrane preparations of the facultative methylotroph Pseudomonas AM1. Biochem.Soc.Transactions, 1979a, v.7, p.182-184.

152. Netrusov A.I., Anthony C. The microbial met.-.abolism of C^-compounds. Oxidative phosphorylation in membrane preparations of Pseudomonas AM1. Biochem.J., 1979b, v.178, p.353-360.

153. Nicholas D.J.D. Intermediary met^abolism of nitrifying bacteria, with particular reference to nitrogen, carbon and sulfur compounds. In: D.Schlessinger, ed., ,,Microbiolohy-1978". Washington, 1978, p.305-309.

154. Nicholas D.J.D., Nason A. Determination of nitrate and nitrite. In: Colowick S.P. and Kaplan N.Q., eds, "Methods in Enzymology", N.-Y., Academic Press, 1957, v.3, p.981-984.

155. Nömmik H. Investigation on denitrification in soil. Acta Agric.Scand., 1956, v.6, p.195-228.

156. Nurse G.R. Denitrification with methanol: microbiology and biochemistry. Water Res., 1980, v.14, p.531-537.

157. Payne W.J. Reduction of nitrogenous oxides by microganisms.- Bacterid.Rev., 1973, v.37, p.409-452.

158. Payne W.J. Denitrification. Trends Biochem.Sci., 1976, v.1, p.220-222.

159. Payne W.J. The Status of nitric oxide and nitrous oxide as intermediates in denitrification. In: Delwiche G.G. ed., Denitrification, nitrification and Atmospheric Nitrous Oxide. N.-Y., 1981, p.85-103.

160. Payne W.J., Grant M.A., Shapleigh J., Hoffman P. Nitrogen oxide reduction in Y/olinella succinogenes and Campylobacter species. J.Bacteriol., 1982, v.152, p.915-918.

161. Payne W.J., Riley P.S., Cox J.R. Separate nitrite, nitric oxide and nitrous oxide reducing fractions from Pseudomonas perfectomarinus. -J.Bacteriol., 1971, v.106, p.356-361.

162. Pfennig N., Triiper H.G. The Phototrophic bacteria. In: Buchanan R.E., Gibbous N.E., eds, Bergey's Manual of Determinative Bacteriology. Eighth Edition. 1974, p.24-60.

163. Picard M.A., Paup G.M. Removal of nitrogen from industrial waste waters by biological nitrification denitrification.

164. Water Pollut.Control., 1980, v.79, p.213-220.

165. Pichinoty P. A propos des nitrate reductases d'une bacterie denitrificante. - Biochim.Biophys.Acta, 1964, v.89, p.378-381.

166. Pichinoty P., Bigliardy-Rouvier J., Mandel M., Greenway B., Metenier G., Gorcia J.-L. The isolation and properties of adenitrifying bacterium of the genus Flavobac-terium. Antonie van Leeuwenhoek, 1976a, v.42, p.349-354.

167. Pichinoty P., de Barjac H., Mandel M., Greenway B., Garcia J.L. Une nouvelle bacterie sporule'e denitrifiante, meso-phile: Bacillus azotof>ormans N.sp. Ann.Microbiol. (Inst. Pasteur), 1976b, V.127B, p.351-361.

168. Pichinoty P., Mandel M., Garcia J.L. The properties of novel mesophilic denitrifying Bacillus cultures found in tropical soils. J.Gen.Microbiol., 1979, v.115» P.419-430.

169. Pichinoty P., Piechaud M. Recherche des nitrate-re'ductases bacteriennes A et B: methodes. Ann.Inst.Pasteur, 1968, v.114, p.77-98.

170. Quayle J.R. The metabolism of one-carbon compounds by microorganisms. Adv.Microb.Physiol., 1972, v.7, p.119-203.

171. Quayle J.R. Aspects of the requiation of methylotrophic metabolism. PEBS Lett., 1980, v.117, P.K16-K27.

172. Quayle J.R., Pfennig N. Utilization of methanol by Rhodospi-rillaceae. Arch.Microbiol., 1975, v.102, p.193-198.

173. Rake J.B. , Eagon R.G. Inhibition, but not uncoupling, of respiratory energy coupling of three bacterial species by nitrite. J.Bacterid., 1980, v.144, p.975-982.

174. Ramanathan V. , Callis L.B., Boughner R.E. Sensitivity of surface temperature and atmospheric temperature to perturbations in the stratospheric concentration of ozone and nitrogen-dioxide. J.Atmos.Sci., 1976, v.33, p.1092-1112.

175. Rolston D.E. Nitrous oxide and nitrogen gas production in fertilizer loss. In: C.C.Delwiche, ed., Denitrification, Nitrification and Atmospheric Nitrous Oxide. N.-Y., 1981, P.127-149.

176. Rosswall T. Microbiological nitrous oxide production: implication for the global nitrogen cycle. In: "Biogeochemistry of ancient and modern environments". Berlin etc., 1981, p.267-273.

177. Row J.J., Yarbrough J.M., Rake J.B., Eagon R.G. Nitrite inhibition of aerobic bacteria. Curr.Microbiol., 1979, v.2, P.51-54.

178. Ruiz-Herreda J., De Moss J.A. Nitrate reductase complex of Escherichia coli K12: participation of specific formate dehydrogenase and cytochrome b1 components in nitrate reduction. J.Bacteriol., 1969, v.99, p.720-729.

179. Sacks L.E., Barker H.A. Substrate oxidation and nitrous oxide utilization in denitrification. J.Bacteriol., 1952, v.64, p.247-252.

180. Sahm H., Cox R.B., Quayle J.R. Metabolism of methanol by Rhodopseudomonas acidophila. J.Gen.Microbiol., 1976, v.94, P.313-317.

181. Satoh T. Soluble dissimilatory nitrate reductase containing cytochrome c from a photodenitrifier, Rhodopseudomonas sphaeroides forma sp. denitrificans. Plant Cell Physiol., 1981, v.22, p.443-452.

182. Sawada E., Satoh T. , Kitamura H. Purification and properties of a dissimilatory nitrite reductase of a denitrifying pho-totrophic bacterium. Plant Cell Physiol., 1978, v.19,1. P.1339-1351.

183. Sawney V., Nicholas D.J.D. Sulfite- and NADH -dependent nitrate reductase from Thiobacillus denitrificans. J.Gen.Microbiol., 1977, v.100, p.49-58.

184. Sawney V. , Nicholas D.J.D. Sulphide linked nitritejreductase from Thiobacillus denitrificans with cytochrome oxidase activity: purification and properties. - J.Gen.Microbiol.,1973, v.106, p.119-128.

185. Schroeder E.D. Denitrification in wastewater management. In: Delwiche C.C. ed., Denitrification, Nitrification and Atmospheric Nitrous oxide. N.-Y., 1981, p.105-125.

186. Sharak Genther B.R., Davis C.L., Bryant M.P. Features of rumen and sewage sludge strains of Eubacterium limosum, a methanol- and Hg-COg-utilizing species. Appl.Environ.Microbiol., 1981, v.42, p". 12-19.

187. Shuval H.I., Gruener N. Infant methemoglobinemia and other health effects of nitrate in drinking water. Prog.Water Technol., 1977, v.8, p.183-193.

188. Sidransky E., Walter B., Hollocher T.C. Studies on the diffe-ferent^ial inhibition by azide on the nitrite/nitrous oxide leveldenitrification. Appl.Environ.Microbiol., 1978, v.35, p.247-250.

189. Slepecky R.A., Law J.H. A rapid spectrophotometric assay of alpha, beta-unsaturated acids and beta-hydroxy acids. -Anal.Chem., 1960, v.32, p.1697.

190. Smith M.S.Dissimilatory reduction of NOg to NH+ and NgO by a soil Citrobacter sp. Appl.Environ.Microbiol., 1982, v.43, p.854-860.

191. Smith M.S. Nitrous oxide production by Escherichia coli is correlated with nitrate reductase activity. Appl.Environ. Microbiol., 1983, v.45, P.1545-1547.

192. Smith M.S., Zimmerman K. Nitrous oxide production by nonde-nitrifying soil nitrate reducers. Soil.Sci.Soc ¿Am.J., 1981, v.45, p.865-871.

193. Sorensen J. Capacity for denitrification and reduction of nitrate to ammonia in a coastal marine sediment. Appl.Environ.Microbiol., 1978, v.35, p.301-305.

194. Sperl G.T., Porrest H.S., Gibson D.T. Substrate specifityof the purified primary alcohol dehydrogenase fron methanol-oxidizing bacteria. J.Bacteriol., 1974, v.118, p.541-550.

195. Sperl G.T., Hoare D.S. Denitrification with methanol: a selective enrichment procedure for Hyphomicrobium species. -J.Bacteriol., 1971, v.108, p.733-736.

196. Stirling D.I., Dalton H. Purification and properties of an NAD(P)+-linked formaldehyde dehydrogenase from Methylococcus capsulatus (Bath). J.Gen.Microbiol., 1978, v.107, p.19-29.

197. Stouthamer A.H. Biochemistry and genetics of nitrate reductase in bacteria. Adv.Microb.Physiol., 1976, v.14, p.315-375.

198. Stouthamer A.H., Boogerd F.C., van Verseveld H.VV. The bio, /energetics of denitrification. Antonie van Leeuwenhoek, <1982, v.48, p.545-553.

199. Stouthamer A.H., de V^es W., Niekus H.G.D. Microaerophily. Antonie van Leeuwenhoek, 1979, v.45, p.5-12.

200. Stucki G., Gälli R., Ebersold H.R., Leisinger T. Dehaloge-nation of diehiormethane by cell extracts of Hyphomicrobium DM2. Arch.Microbiol., 1981, v.130. p.366-372.

201. Timmermans P., van Haute A. Denitrification with methanol. Fundumental study of the growth and denitrification capacity of Hyphomicrobium sp. Water Res., 1983, v.17, p.1249-1255.

202. Uebayasi M., Tonomura K. Denitrification by Hyphomicrobium capable of utilizing methanol. J.Fermentation Technol., 1976, v.54, p.885-890.

203. Uebayasi M., Tomizuka N., Kamibayashi A., Tonomura K. Autotrophic growth of a Hyphomicrobium sp. and its hydrogenaseactivity. Agric.Biol.Chem., 1981, v.45, P.1783-1790.

204. Vagnai S., Klein D.A. A study of nitrite-dependent dissimi-latory miro-organisms isolated from Oregon soils. Soil Biol.Biochem., 1974, v.6, p.335-339.

205. Van Dijken J.P., Harder W. Growth yield of microorganisms on methanol and methane. A theoretical study. Biotechnol.Bioeng., 1975, v.17, p.15-30.

206. Van Hartingsveld T., Stouthamer A.H. Properties of a mutant of Pseudomonas aeruginosa affected in aerobic growth.

207. J.Gen.Microbiol., 1974, v.83, p.303-310.

208. Van't Riet J., Stouthamer A.H., Planta R.J. Regulation ofnitrate assimilation and nitrate respiration in Aerobacter aerogenes. J.Bacteriol., 1968, v.96, p.1455-1464.

209. Van Verseved H.W., Meijer E.M., Stouthamer A.H. Energy conservation during nitrate respiration in Paracoccus denitri-ficans. Arch.Microbiol., 1977, v.112, p.17-23.

210. Van Verseveld H.W., Stouthamer A.H. Electron transport chain and coupled oxidative phosphorylation in methanol-grown Paracoccus denitrificans. Arch.Microbiol., 1978, v.118,1. P.13-20.

211. Wang W.C, Yung Y.L., Lacis A.A., Mo T., Hansen J.E. Greenhouse effects due to man-mSlde perturbations of trace gases. Science, 1976, v.194, p.685-690.

212. Weimer P.J., Zeikus J.G. One Carbon Metabolism in methano-genic bacteria. Cellular characterization and growth of Me-thanosarcina barkeri. Arch.Microbiol., 1978, v.119, p.49-57.

213. Weiss R.P. The temporal and spatial distribution of tropo-spheric nitrous oxide. J.Geophys.Res., 1981, v.86, p.71857195.

214. Werber M.M., Mevarech M. Induction of a dissirailatory reduction pathway of nitrate in Halobacterium of the Dead Sea. -Arch.Biochem.Biophys., 1978, v.186, p.60-65.

215. Westerling J., Prank J., Duine J.A. The prosthetic group of methanol dehydrogenase from Hyphomicrobium X: electron spin resonance evidence for a quinone structure. Biochem.Bio-phys.Res.Commun., 1979, v.87, p.719-724.

216. Wijler J., Delwiche C.C. Investigations on the denitrifying process in soil. Plant Soil, 1954, v.5, p.155-169.

217. Williams D.R., Rowe J.J., Romero P., Eagon R.G. Denitrifying Pseudomonas aeruginosa: some parameters of growth and active transport. Appl.Environ.Microbiol., 1978, v.36, p.257-263.

218. Willison J.C., John P. Mutants of Paracoccus denitrificans deficient in c-type cytochromes. J.Gen.Microbiol., 1979, v.115, P.443-450.

219. Yamanaka T. Identity of Pseudomonas cytochrome oxidase with Pseudomonas nitrite reductase. Nature, 1964, v.204, p.253- ' 255.

220. Yoshida T., Alexander M. Nitrous oxide formation by Nitroso-monas europeae and heterotrophic microorganisms. Soil Sci. Soc.Am.Proc., 1970, v.34, p.880-882.

221. Yoshinary T. NgO reduction by Vibrio succinogenes. Appl. Environ.Microbiol., 1980, v.39, p.81-84.

222. Yoshinary T., Hynes R., Knowles R. Acetylene inhibition of nitrous oxide reduction and measurement of denitrification and nitrogen fixation in soil. Soil.Biol.Biochem., 1977, v.9, p.177-183.

223. Yoshinary T., Knowles R. Acetylene inhibition of nitrousoxide reduction by denitrifying bactera. Biochem.Biophys. Res.Commun., 1976, v.69, p.705-710.

224. Zeikus J.G., Lynd L.H., Thompson T.E., Krzycki J.A., Weimer P.J., Hegge P.W. Isolation and characterization of a new, methylotrophic, acidogenic anaerobe, the Marburg strain. -Curr.Microbiol., 1980, v.3, p.381-386.

225. Zumft W.G., Frunzke K. Discrimination of ascorbate dependent nonenzymatic and enzymatic, membrane-bound reduction of nitric oxide in denitrifying

226. Pseudomonas perfectomarinus. Biochim.Biophys.Acta, 1982, v.681, p.459-468.

227. Zumft W.G., Gardenas J. The inorganic biochemistry of nitrogen bioenergetic processes. Naturwissenschaften, 1979, v.66, p.81-88.

228. Zumft W.G., Matsubara T. A novel kind of multi-copper protein as terminal oxidoreductase of nitrous oxide respiration in Pseudomonas perfectomarinus. PEBS Lett., 1982, v.148, p.107-111.

229. Zumft W.G., Sherr B.P., Payne W.J. A reappraisal of the nitric oxide - binding protein of denitrifying Pseudomonas. -Biochem.Biophys.Res.Commun., 1979, v.88, p.1230-1236.

230. Zumft W.G., Vega J.M. Reduction of nitric to nitrous oxide by a cytoplasmic membrane fraction from the marine denitri-fier Pseudomonas perfectomarinus. Biochim.Biophys.Acta, 1979, v.548, p.484-499.