Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Образование закиси азота почвенными микроскопическими грибами

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Пахненко, Оксана Анатольевна, Москва

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕН им. М.В. ЛОМОНОСОВА ФАКУЛЬТЕТ ПОЧВОВЕДЕНИЯ

На правах рукописи

- „/<"'' 41 Ог...

.. 5» ■• ^ ' / у / и».

ПАХНЕНКО Оксана Анатольевна

ОБРАЗОВАНИЕ ЗАКИСИ АЗОТА ПОЧВЕННЫМИ МИКРОСКОПИЧЕСКИМИ ГРИБАМИ

03.00.07 - микробиология

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор М.М. Умаров

МОСКВА 1999г.

ОГЛАВЛЕНИЕ

1. Введение________1

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1 Баланс закиси азота в атмосфере земли_3

2.2 Образование закиси азота при диссимиляционном восстановлении нитритов в аммоний_____5

2.3 Образование N20 бактериями при нитрификации__6

2.4 Образование закиси азота в процессе денитрификации_8

2.5 Образование закиси азота микроскопическими грибами_11

2.6 Образование закиси азота процессе денитрификации, проводимой грибами___17

2.7 Ферменты, проводящие процесс денитрификации_23

2.8 Восстановление N20 микроорганизмами______35

2.9 Биомасса и распространенность микроскопических грибов в почве________________39

3. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

3.1 Выделение микроскопических грибов из почв, корневой зоны и семян растений________49

3.2 Отбор чистых культур микроскопических грибов___52

3.3 Установление способности к образованию закиси азота у микромицетов__________53

3.4 Анализ газов (N0, №0)__56

3.5 Изучение трансформации азота среды микроскопическими грибами___58

3.6 Исследование способности грибов к восстановлению ИгО и влияние ацетилена на образование и восстановление закиси азота_60

3.7 Исследование возможности образования закиси азота

микроскопическими грибами в стерильной почве___60

4. РЕЗУЛЬТАТЫ

4.1 Образование N20 микромицетами____63

4.2 Образование N20 микроскопическими грибами в зависимости от условий аэрации и источника азота в среде._68

4.3 Активность образования закиси азота микромицетами на питательных средах___73

4.4 Образование окиси азота почвенными микроскопическими грибами________89

4.5 Восстановление закиси азота микроскопическими грибами_90

4.6 Влияние ацетилена на образование и восстановление закиси

азота___________93

4.7 Выделение МгО микроскопическими грибами при инокулияции стерильной почвы_____96

5. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ___102

ВЫВОДЫ_____108

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ________1Ю

1. Введение.

Закись азота (NaO) - один из важнейших микрогазов, ответственный за формирование «парникового эффекта» и разрушение озонового слоя атмосферы Земли. Ежегодное повышение содержания закиси азота в атмосфере составляет 0,2-0,3%, причем в последние годы темпы ее прироста увеличиваются.

Многие организмы обладают способностью к продукции закиси азота. Известны примеры образования ее животными, растениями и водорослями (Hlavica, 1982; Weathers, 1984). Важнейшим источником закиси азота в атмосфере является деятельность почвенных микроорганизмов, на долю которых приходится до 90% от ее суммарного поступления в атмосферу (Умаров, 1998). При этом определяющее значение в продукции и потреблении закиси азота принадлежит, вероятно, прокариотным организмам, осуществляющим денитрификацию, диссимиляторное восстановление нитратов в аммоний и нитрификацию (Robertson, Tiedje, 1987; Knowles, 1990; Zum 1998). Образование закиси азота выявлено и у микроскопических грибов (Fusarium oxysporum и ряда родственных ему видов), которые в большинстве почв представляют доминирующий по биомассе компонент биоты (Bollag, Tung, 1972; Burth, Ottow, 1983; Shoirn et. al., 1992). Исследование биохимии позволило выявить основные этапы процесса образования N2O, которые происходят при участие нитрат-, и нитритредуктазы и цитохрома Р450, выполняющего функции N0-редуктазы (Nakahara et al, 1993; Nakahara et al, 1994; Kobayshi, 1996).

Вместе с тем, до настоящего времени не определено экологическое значение этого явления. Отсутствуют данные о распространенности

среди почвенных микроскопических грибов разных таксономических и эколого-трофических групп способности к продукции и потреблению закиси азота. Не определена активность этого процесса у микромицетов при росте на средах с различными источниками азота. Отсутствуют данные, позволяющие оценить возможный вклад грибов в эмиссию этого газа из почв. Нет данных об образовании разными видами микромицетов окиси азота (N0) .

Целью работы было изучение распространенности среди микроскопических грибов способности к образованию закиси азота и окиси азота и определение активности этого процесса на питательных средах и в почве.

В задачи исследования входило:

1. Определение способности почвенных микроскопических грибов к образованию закиси и окиси азота при росте на питательных средах при различном уровне аэрации и с разными источниками азота.

2. Количественная оценка активности выделения закиси и окиси азота различными видами микромицетов на питательных средах.

3. Изучение распространенности среди представителей различных систематических и эколого-трофических групп почвенных микромицетов способности к образованию закиси и окиси азота.

4. Исследование возможности восстановления закиси азота грибами при использовании ее в качестве единственного источника азота в среде.

5. Определение активности выделения закиси азота из почв различных типов при инокуляции микроскопическими грибами.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1. Баланс закиси азота в атмосфере земли.

В последние годы накоплены многочисленные, но противоречивые данные об источниках и стоках закиси азота. Обнаружено несоответствие между известными масштабами продукции и путями удаления КгО из атмосферы. В настоящее время содержание в атмосфере закиси азота оценивается в 1500 Тг К- N20 (1Тг = 1012г). За последнее время концентрация закиси азота в атмосфере значительно возросла и в 1990 году достигла 310 ррЬу. Для сравнения, контрольная концентрация N20 в воздухе, относящаяся к доиндустриальному периоду (ок. 1700 г.), была получена при изучении состава газа в ледяных отложениях и составила 285-260 ррЬу ^аиГГег, КеЙе1, 1988; ЬеиепЬещег, 81е§еп1Ьа1ег, 1992). Ежегодное увеличение количества закиси азота в атмосфере составляет 0,2 - 0,3%. Серьезную обеспокоенность вызывает тот факт, что за последние несколько лет тенденция увеличения концентрации возросла от 0,5 + 0,2 ррЬу в год до 1,2 + 0,1 ррЬу в год (КЪаШ, Лавтшвеп, 1992Ь).

Таким образом, ежегодный прирост концентрации закиси азота в атмосфере увеличился почти на 50% и, возможно, эмиссия будет возрастать и в дальнейшем (1РСС,1990). Даже в отсутствии увеличения эмиссии, концентрация закиси азота к 2040 году достигнет 340 ррЬу. Такое значительное увеличение концентрации ИгО, которое происходит в настоящее время, нежелательно по двум причинам. Во-первых, закись азота - один из парниковых газов. Во-вторых, закись

азота как и друг ие оксиды азота, образующиеся из N2O в результате фотохимических реакций, разрушают озоновый слой.

Глобальная ежегодная эмиссия закиси азота составляет от 12-15 Тг (Bolle et al., 1986). Эмиссия из тропических лесов составляет 7-8 Тг N-N20 (Kaplan, 1984; McElroy, Wofsy, 1986). Почвы сельскохозяйственных угодий ежегодно выделяют в атмосферу 2,4 - 3,7 Тг N- N2O (Bouwman, 1990). При сжигании топлива образуется 1,5-1 Тг N- N2O в год (Muzio, Kramlich, 1988). Парующие почвы и сжигание биомассы на полях приводят к ежегодному выделению 1-1 Тг N-N2O (Crutzzen, 1983, Cicirone, 1987).

К настоящему времени проведена грубая оценка региональной и глобальной эмиссии, поскольку данные основанные на изучении экосистем и типичных источников приводят к большому разбросу результатов (Prinn et al., 1990; Bard, Robert, 1992 a,b). Ежегодно из почв выделяется 7.5 млн.т закиси азота, т.е. 65% от его общей продукции на Земле (Сорокин, 1990), и следовательно, именно почвы являются основным источником N2O. Однако, до сих пор не оценен объективно вклад почвенных микроорганизмов в поступление N2O в атмосферу. Известны три пути образования закиси азота микроорганизмами -денитрификация, нитрификация и диссимиляторное восстановление нитрата в аммоний. Самым мощным микробиологическим источником NiO считается денитрификация, поскольку нитрификация и диссимиляционное восстановление нитрата в аммоний не являются значимыми путями образования закиси азота в биосфере (Tiedje , 1988).

2.2 Образование NzO бактериями при диссимшшционном восстановлении нитрата в аммоний

Диссимиляционное образование аммония - процесс, при котором нитрат и нитрит, используемые как акцепторы электронов, восстанавливаются в аммоний. Физиология и биохимия процесса восстановления нитрита в аммоний до конца не выяснены. Окислительное фосфорилирование при диссимиляционном восстановлении нитрита в аммоний не всегда имеет место. Число ферментов, восстанавливающих нитрит в аммоний, оказалось довольно большим - настоящему моменту у Е. coli открыто 5 аммонийобразующих нитритредуктаз. Основным ферментом восстановления нитрита у E.coli является НАДН - зависимая растворимая нитритредуктаз а, не связанная с окислительным фосфорилированием. Количественно значимое диссимиляционное восстановление нитрита в аммоний происходит в анаэробных условиях (Cole, 1993).

Сравнительно мало данных об образовании закиси азота при диссимиляции нитратов микроорганизмами. Показано, что Bacillus filari и B.polymyxa способны к диссимиляционному восстановлению нитрита как в аммоний, так и в N2O, N2. Смит и Циммерман (Smith, Zimerman, 1981) выделили из почвы значительное число бактерий, восстанавливающих нитрат в нитрит или аммоний. Большинство штаммов образовывали N2O в количестве 2-24% от внесенного нитрата. Образование N2O не зависело от состава среды и ацетилен не влиял на ее накопление, поэтому авторы заключили, что закись азота образуется не в результате денитрификации. Обнаружено также образование N2O,

составляющее 1% от образования аммония, при восстановлении нитрита в аммоний у штаммов E.coli.

Bleakley и Tiedje (1982) выявили образование N2O при диссимиляционном восстановлении нитрата представителями Escherichia, Serratia, Enterobacter, Bacillus.

2.3. Образование закиси азота бактериями при нитрификации

Ioshida и Alexander (1970) описали образование N2O суспензиями клеток Nitrosomonas europaea при окислении аммония и гидроксиламина. При этом 95% азота выделялось в форме N2O, Авторы сделали вывод, что N2O образуется из промежуточного продукта нитрификации, дальнейшее превращение которого в нитрит ингибируется аммонием, гидразином и температурой выше 35 °С. Значительное образование N2O было получено при работе с клетками, выдержанными несколько дней на холоду.

Блекмер с соавторами (Blackmer et al, 1980) изучили выделение N2O в аэробных условиях из стерильных почв после внесения аммония и инокулирования культурами Nitrosomonas, Nitrosospira, Nitrosolobus. Способность к образованию N2O показана и для у Nitrosococus oceanus, Nitrosospira briensis, Nitrosolobus multiformis. Скорость образования N2O в условиях низкой аэрации значительно уменьшалась. У всех исследованных организмов азот N2O составлял не более 0.5% от суммы окисленного азота. Считается, что суммарный энергодающий процесс образования закиси азота при окислении аммония нитрификаторами происходит в 4 стадии:

цит Р460

КН43 -"-^КН2ОН--ИЖ>Н + М^ОгНг]—N О- —(И20 )

^ ^, цит.Р 460

Огмоноок- Н20 2Н+2е«*Фл, М20 сигеназа цит.Ь,с,а,о—Ю2

Первая реакция образования гидроксиламина из аммония катализируется монооксигеназой. Окисление гидроксиламина в нитрит - энергодающий процесс, сопряженный с ЭТЦ на уровне флавопротеинов, N20 - возможный интермедиант этой реакции. Гидроксиламин - цитохром-с-редуктаза катализирует окисление гидроксиламина в нитроксил (N0-), а затем в нитрит. При этом регенерируется косубстрат монооксигеназной реакции. Реакция превращения промежуточных продуктов окисления гидроксиламина в нитрит обратима (Вгетпег, В1еактег, 1981). Физиологический смысл восстановления нитрита в N20 неясен, поскольку дальнейшего превращения №0 в N2 не происходит. Возможно, функции нитритредуктазы заключаются в удалении токсичного нитрита, накапливающегося в клетках при окислении аммония (Беккер,1988).

Механизм образования N20 у нитрификаторов изучен мало, однако несомненно, что N20 из почвы может выделяться при окислении аммония бактериями-нитрификаторами (Вгетпег, 1981). Присутствие 0.1% ацетилена в атмосфере над почвенными образцами с сульфатом аммония значительно сокращало эмиссию ИгО, указывая на образование последней в результате нитрификации, которая ингибируется ацетиленом на стадии КШ+ — КНгОН. Эмиссия N20 из почв за счет нитрификации составляет 0.1% от внесенного КН4+

азота. Из грибов, осуществляющих процесс нитрификации наиболее хорошо изучены виды Aspergillus flavus, A. wentii.

Нитрификация может быть источником азота в аэрируемых почвах, где нитрификация доминирует в верхних слоях (Seiler, Conrad, 1981). Известно, что эмиссия N2O из увлажненной почвы, превышает выделение закиси азота из дренированных почв (Barraclouen, Puri, 1994), что, по-видимому, связано с ингибированием мембранной нитрат-редуктазы, ответственной за денитрификацию, при повышении уровня аэрации (Akunna et al., 1993). Исследование эмиссии газов из почв показало, что денитрификация и нитрификация протекают одновременно и могут сменять друг друга в течение коротких периодов времени (Cole, 1993). Поэтому хотя закись азота не основной продукт нитрификации, вклад ее в газообразные потери азота может быть значительным в зависимости от экологических условий.

2.4 Образование закиси азота в процессе денитрификации.

Денитрификация - восстановление соединений азота в газообразные продукты (N2O, N2,NO), имеющее энергетическое значение для осуществляющего его организма. Способность к денитрификации показана у представителей самых разных групп микроорганизмов Rhodopseudomonas, Cytophaga, Hypomicrobium, Spirillum, Alcaligenes, Rhizobium, Thiobacillus, Thermothrix, Bacillus и других (Веденина, Лебединский, 1984).

При восстановлении последовательно образующихся из нитрата акцепторов происходит окислительное фосфорилирование (Сорокин, 1990). То, что закись азота является облигатным интермедиатом процесса денитрификации, было подтверждено с помощью

8

ингибиторов восстановления N2O. К факторам, влияющим на активность денитрификации, относятся концентрация нитрита, степень аэрации, pH, температура, наличие микроэлементов (Степанов, 1985; Кромка, 1991). Усиление аэрации и кислая реакция среды снижают скорость денитрификации и повышают соотношение n2o/n2. Например, при переходе культур Hyphomicrobium sp. от аэробных условий к анаэробиозу наблюдалось значительное образование закиси азота, что связано с большой чувствительностью n2o - редуктазы к кислороду, который влияет на степень восстановленности переносчиков электронно-транспортной сети (Blackmer, Bremner, 1978). Низкие концентрации нитрата лимитируют скорость денитрификации. Увеличение доли n2o в составе газообразных продуктов денитрификации в почве происходило при увеличении концентрации нитрата и, особенно, нитрита. Возможно, нитрат индуцирует n2o-редуктазу у почвенных микроорганизмов. В настоящее время хорошо обоснована экспериментальная схема переноса электронов при денитрификации:

НАДН— цитрохром b----------f" Дитохром с-----------¡i I 1 i

нитрат нитрит NO- n2o

редуктаза редуктаза редуктаза редуктаза

I Iii

| J-- NO--1

no3.............--no2-------------n2o--------n2

где no2-, NO и N2O - облигатные интермедианты; реакция катализируется четырьмя различными редуктазами (Egli, Zehnder, 1994), а цитохром bei комплекс и цитохром сг являются компонентами элекгронтранспортной цепи (Satoh,1984; Bell et al,1992;).

Большинство денитрификаторов содержит обычную нитрат-редуктазу в цитоплазматической мембране (Zumf,1992). Однако, Thiosphaera pantotropha содержит еще и периплазматическую нитрат-редуктазу (Berks et al.,1994; Berks et al.,1995). При разрушении мембрансвязаннной нитрат-редуктазы процесс денитрификации осуществлялся благодаря наличию периплазматической нитрат-редуктазы (Bell et al, 1993).

Изучение функций и свойств бактериальной нитрит-редуктазы показало наличие двух типов нитрит-редуктазы - Си-зависимой (Nishiyama et al., 1993) и цитохромзависимой редуктазы cd 1-типа (Mior et al., 1993; Ohshima et al, 1993). Обе редуктазы были локализованы в периплазматическом пространстве (Glockner et al, 1993). Изучение последовательностей аминокислот и иммунологические эксперименты показали, что синяя и зеленая Си- редуктазы относятся к одному типу белков (Ye et al., 1993).

Редуктаза окиси азота катализирует восстановление NO в N20:

2NO + 2Н+ + 2е------N20 + ШО (Ео = +1,18В; G = - 306,3 кДж).

Для реакции требуются два электрона, поскольку реакция включает димеризацию моноазотной разновидности до формы N-N связи. Мембранносвязанная NO-редуктазная активность впервые была обнаружена у бактерии Alcaligenes faecalis (Matsubara, Iwasaki, 1971). Позднее, она была найдена у Pseudomonas stutzeri (Zumf, Vega, 1979; Zumf, Frunzke,1982; Shapleigh et al, 1987), Rhodobacter sphaeroides (Urata, Satoh,1984), Halomonas halodenitrificans (Grant et al.,1984) и Paracoecus denitrificans (Carr, Ferguson, 1988). Бактериальная NO-редуктаза состоит из двух субъединиц - большой (NorB с массой 53 кДа)

и малой (NorC с массой 17 к Да) - которые содержат гем-центры В и С соответственно (Kastrau et al.,1994; Arai et al.,1995; de Boer et al., 1996; Zumf et al., 1994). Большая субъединица NorB представляет собой сильногидрофобный цитохром b-типа. Для бактерий p.Wolinella succinogen.es было показано, что в роли электронного донора для NO-редуктазы способен выступать цитохром с (Zhang, Hollocher, 1993).

МгО-редуктаза бьша изолиро