Факультативно-анаэробные микроскопические грибы в почвах

Лаврентьев, Роман Борисович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Факультативно-анаэробные микроскопические грибы в почвах
ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Факультативно-анаэробные микроскопические грибы в почвах"

На правах рукописи

□□3477431

Лаврентьев Роман Борисович

ФАКУЛЬТАТИВНО-АНАЭРОБНЫЕ МИКРОСКОПИЧЕСКИЕ ГРИБЫ В ПОЧВАХ

Специальность 03.00.07 - микробиология

2 г> СЕН

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2009

003477431

Работа выполнена на кафедре биологии почв факультета почвоведения Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова.

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор

А.В. Кураков

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор кандидат биологических наук

И.И. Сидорова Т.А. Семенова

Ведущее учреиедение:

Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН

Защита диссертации состоится 13 октября 2009 г. в 15 ч 30 мин в аудитории М-2 на заседании диссертационного совета Д 501.002.13 в МГУ им. М.В. Ломоносова по адресу: 119991, Москва, ГСП-1, Ленинские горы, МГУ имени М.В. Ломоносова, д. 1, стр. 12, факультет почвоведения, Ученый совет.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке факультета почвоведения

Приглашаем Вас принять участие в обсуждении диссертации на заседании диссертационного совета или прислать отзывы на автореферат в двух экземплярах, заверенные печатью по адресу: 119991, Москва, ГСП-1, Ленинские горы, МГУ им. М.В. Ломоносова, факультет почвоведения, Ученый совет.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук,

МГУ.

Автореферат разослан « У » Л 2009 г.

профессор

Г.М. Зенова

Актуальность темы. Почва - местообитание, где в определенных зонах или кратковременно в целых горизонтах профиля возникают восстановительные условия, а в болотных и пойменных почв они могут преобладать в течение продолжительных периодов времени (Кауричев, Орлов, 1982). Традиционно считается, что бактерии -единственные организмы, функционирующие в условиях лимитированного обеспечения кислородом в почвах. Облигатно-анаэробные грибы, представленные группой хитридиомицетов (виды родов Caecomyces, Piromyces, Neocalimastix, Anaeromyces, Orpinomyces), обитают только в рубце жвачных животных (Trinci et al, 1994). В то же время известно, что существуют не только дрожжевые, но и мицвлиальные микроскопические грибы способные к брожению (Griffin, 1966, 1981), т. е. факультативно-анаэробные грибы, что позволяет им быть активными при ограниченном поступлении или отсутствии кислорода и наличии легкодоступных Сахаров.

Грибы доминируют по биомассе во многих почвах и поэтому неизбежно попадают в ситуации, характеризующиеся пониженным парциальным давлением кислорода или анаэробными условиями. Однако информация о видовом разнообразии факультативно-анаэробных мицелиальных микроскопических грибов, их обилии и особенностях состава в почвах разных типов отсутствует. Существуют всего несколько сообщений о выделении микроскопических грибов (Fusarium solani, Trichoderma harzianum) из почв, торфа и органических материалов при анаэробных условиях (Marchant et al., 1994; Wainwright et al., 1994; Сизова и др., 1998).

Крайне мало сведений имеется о морфологии грибов при росте в анаэробных условиях, причем описание их развития дано для условий жидкой культуры (Bartnicki-Garsia, Nickerson, 1961; Tabak, Cooke, 1968; Curtis, 1969; Marchant et al., 1994), и не изучены особенности роста факультативно-анаэробных микромицетов на твердой среде, которая более адекватна условиям почвы.

В последнее десятилетие установлено, что существуют грибы, которые в условиях лимитированного обеспечения кислородом, способны к образованию закиси азота (Shoun, Tanimoto, 1991; Kurakov et al., 1997; Пахненко, 1999). В связи с этим актуальным представляется исследование активности выделения закиси азота различными видами факультативно-анаэробных грибов и определение удельной скорости этого процесса непосредственно в почве.

Целью работы было определение разнообразия факультативно-анаэробных мицелиальных микроскопических грибов в почвах, особенностей их роста и активности образования закиси азота.

В задачи исследования входило:

1. Оценка количества жизнеспособного грибного мицелия в почвах с длительным восстановительным режимом.

2. Определение численности колониеобразующих единиц и разнообразия микроскопических грибов, выделяемых в анаэробных условиях, из почв разных типов.

3. Определение скорости роста и культурально-морфологических особенностей мицелиальных микроскопических грибов в анаэробных условиях на твердой среде.

4. Определение удельной активности образования закиси азота факультативно-анаэробных грибами в почве.

Научная новизна. Впервые проведена оценка разнообразия факультативно-анаэробных микроскопических грибов в почвах разных типов. Способность роста в анаэробных условиях впервые показана для представителей Trlchoderma aureoviride, Т. atroviride, Т. viride, Т. polysporum, Umbelopsis (Mortierella) isabellina, Zygorhynchus heterogamus, Clonostachys rosea f. rosea, Sphaerostilbella aureonitens, Paecilomyces lilacinus, Humicola grisea, Tolypocladium inflation, Acremonium strictum, Clonostachys grammicospora, Absidia glauca, Actinomucor elegans, Lecanicillium lecanii, Aspergillus terreus. Дана сравнительная оценка радиальной скорости роста грибов в аэробных и анаэробных условиях и охарактеризованы культурально-морфологические особенности и ультраструктура митохондрий у микромицетов при развитии на твердых средах в условиях анаэробиозиса. Показано, что в почвах при длительном восстановительном режиме сохраняет жизнеспособность довольно значительная часть мицелия грибов. Впервые установлена удельная активность образования закиси азота (в расчете на единицу биомассы) грибами при функционировании непосредственно в почвенных условиях.

Практическая значимость. Разработаны приемы по выделению грибов из почв и других местообитаний в анаэробных условиях. Создана коллекция факультативно-анаэробных микроскопических грибов, которая используется на кафедрах биологии почв и микробиологии МГУ в учебном процессе и для поиска природных изолятов с высокой активностью спиртового брожения. Определена удельная активность

образования закиси азота грибами в почве, что важно для расчетов баланса этого парникового газа в атмосфере.

Апробация работы. Результаты исследования были представлены на Докучаевских молодежных чтениях «Почвы и биоразнообразие» (Санкт-Петербург, 2001); Второй научной конференции «Актуальные вопросы биотехнологии» (Москва, 2001); 6-ой Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2002); 17th World Congress of Soil Science (Thailand, Bangkok, 2002); Первом съезде медицинских микологов (Москва, 2003); XIV и XV Конгрессах Европейских Микологов (Кацивели, Украина, 2003 и Санкт-Петербург, 2007),

Публикации. Основное содержание работы опубликовано в 4 экспериментальных статьях и 6 тезисах.

Объем работы. Диссертация состоит из глав, и включает в себя введение, обзор литературы, экспериментальную часть, результаты исследования и их обсуждение, заключение, выводы и список литературы, включающий наименовании, из них на иностранных языках. Работа изложена на 422 страницах машинописного текста, содержит "¡^таблиц и иллюстрирована /^рисунками.

Автор выражает глубокую признательность своему научному руководителю проф. А. В. Куракову, проф. Д.Г.Звягинцеву за постоянную помощь и консультации, научным сотрудникам ИНМИ РАН д. б. н. Соколовой Т. Г. и д. б. н. Е. А. Бонч-Осмоловской за предоставленную возможность анаэробного культивировании микроскопических грибов; к.б.н. В. С. Соиной и научному сотруднику института Проблем эволюции и экологии животных им. А. Н. Северцева РАН д. б. н. Н. А. Ушаковой, за предоставленную аппаратуру и помощь в микросъемке грибов; докторам Т. Ю. Нечитайло и П. Н. Голышину (Федеральный Биотехнологический Центр, Брауншвейг, Германия) за идентификацию ряда штаммов и всем сотрудникам кафедры биологии почв.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Объектами исследования служили образцы почв и культуры микроскопических грибов. Отбирали образцы верхних горизонтов и в ряде случаев по всему профилю почв в ненарушенных природных экосистемах и агроэкосистемах. Исследовали почвы зонального ряда: дерново-подзолистую, серую лесную, темно-серую лесную,

выщелоченный и обыкновенный чернозем, а также торфяные почвы верхового и низинного болота, мхи разной степени разложения, дерново-аллювиальную почву, аллговиально-луговую пойменную почву, солонцы и солончаки.

Для оценки запасов общего и жизнеспособного грибного мицелия в почвах с длительным восстановительным режимом использовали свежеотобранные образцы дерново-глеевой типичной, торфяно-подзолисто-глеевой и торфяной олиготрофной почвы, отобранные в Центрально-Лесном Государственном Биосферном Заповеднике, (ЦЛГБЗ, Тверская обл.).

Влияние длительного анаэробиоза на изменение пула жизнеспособного мицелия исследовали на образцах торфяной олиготрофной почвы верхового болота из-под соснового редколесья (ЦЛГБЗ) и дерново-подзолистой окультуренной почвы с Почвенного стационара МГУ имени М.В. Ломоносова. Анаэробную инкубацию почв проводили в пенициллиновых флаконах при 25°С и влажности 100% от максимальной влагоемкости в атмосфере аргона в течение 5 недель. Биомассу мицелия в почвах определяли методом люминесцентной микроскопии. Калькофлюор белый использовали для оценки длины общего мицелия и флюоресцеин диацетат -жизнеспособного мицелия (Tsuji et al., 1995; Звягинцев, 1991).

Для изоляции чистых культур микроскопических грибов из почв в анаэробных условиях и определения численности колониеобразующих единиц (КОЕ) использовали метод Хангейта (Hungate, 1969), введя в него ряд модификаций. Агаризованную среду, разлитую в небольшие матрасы, инкубировали в течение 4-12 суток при 24-26°С, а антибиотики добавляли в более высоких концентрациях (200 мг/л), чем при обычных посевах. Атмосфера воздуха в матрасе замещалась на азот. Азот очищали от следов кислорода предварительным пропусканием через колонку Хангейта с раскаленными медными стружками. Раствор минеральных компонентов кипятили для удаления растворенного кислорода, потом остужали в кристаллизаторе с холодной водой. При этом через раствор продували молекулярный азот, пропущенный предварительно через колонку с нагретой медью. Среду анаэробно (в токе N2) разливали в стеклянные матрасы, в которых находились навески агара (из расчета 30 г/л). Отсутствие кислорода в атмосфере флакона контролировали на газовом хроматографе Chrom 3700 (детектор по теплопроводности, колонка 2 м, наполнитель -молекулярные сита 5Ä, температура колонки 50°С, газ носитель - аргон). Кислород в атмосфере флакона не обнаруживали или, в редких случаях, выявляли в следовых количествах в режиме максимальной чувствительности хроматографа Chrom 3700. В качестве индикатора содержания кислорода использовали индикатор метиленовый синий (Eh точки полуперехода при pH 7 равен +60 мВ). Индикатор окрашен в синий цвет, пока давления кислорода не упадет ниже 0,05 атм (Пименова и др., 1971). В ряде

опытов с жидкой средой для контроля анаэробных условий применяли индикатор резазурин (0,0001%). Использовали глюкозо-пептонную среду следующего состава (г/л): КН2Р04 - 1,0, KCl - 0,5, MgS04 - 0,5, FeS04 - 0,01, (NH4)2S04 - 2,0, агар - 15,0 г/л, пептон - 5,0, глюкоза - 5,0, дрожжевой экстракт - 0,5. В среду добавляли 1 мл раствора микроэлементов (иг/л): FeCI2-7H20 - 200, ZnCl2-7H20 - 10, MgCl2-4H20 - 3, Н3В04 - 30, СоС12-6Н20 - 2, CuCl2-2H20 - 1, Na2Mo04 - 3, NiCl2-6H20 - 2, ЭДТА - 500 и 1 мл/л раствора витаминов (мг/л): 4-аминобензойной кислоты - 25, D-биотина - 100, никотиновой кислоты - 25, пантотената кальция - 25, пиридоксина гидрохлорида - 25, фолиевой кислоты - 10, рибофлавина - 25, В12 - 0,5, липоевая кислота - 25. В посевах из почв для подавления роста бактерий в расплавленную стерильную не горячую среду добавляли стрептомицин и хлорамфеникол в концентрации 200 мг/л среды. Стерильные растворы витаминов, микроэлементов и антибиотики добавляли после автоклавирования. Из ряда почв (дерново-подзолистая, выщелоченный чернозем и некоторых других) посев был проведен также на сусло- и Чапек агар. Повторность при посеве в анаэробных условиях составляла 10 матрасов для образцов из одного типа почвы, в аэробных условиях - 10 - 20 чашек Петри.

Посев в анаэробных условия проводили из водно-почвенной суспензии и, в большинстве случаев, мелкоземом, т.к. это было более эффективно.

Выделение грибов проводили также в полевых условиях путем длительной инкубации чашек Петри с твердыми средами (сусло, голодный агар и среда Гетчинсона) на глубине 25-40 см в верховом болоте (ЦЛГБЗ), в слое торфа постоянно насыщенном водой, характеризующемся умеренно-восстановительным режимом и pH около 4,0.

Чистоту грибных изолятов от бактерий проверяли путем высева на глюкозо-минеральную среду, голодный агар и микроскопией препаратов культур.

Идентификацию микроскопических грибов осуществляли по культурально-морфологическим признакам по соответствующим для конкретной систематической группы определителям (Booth, 1977; Domsh et al., 1993; Rifai, 1962; Samuels, 1996; Schipper, 1973 и др.). 35 изолятов, которые принадлежали к разным систематическим группам согласно определению по культурально-морфологическим признакам, были идентифицированы с помощью ПЦР амплификации с последующим сиквенированием амплификонов и их анализом (в Федеральном биотехнологическом центре, Германия) (GenBank Data system: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/,

http://rdp.cme.msu.edu/html/, http://www.arb-home.de).

Описание культуральных и морфологических особенностей грибов при росте в анаэробных условиях проведено для восьми штаммов разных таксонов на

глюкозо-пептонной среде в атмосфере N2, очищенного от следов кислорода, и в его смеси с диоксидом углерода (N2 - 70% и С02 - 30%).

Для определения радиальной скорости роста культуры грибов засевали уколом в 3-кратной повторности на глюкозо-минеральную среду. Аэробную инкубацию грибов проводили в чашках Петри, анаэробную - в матрасах в атмосфере азота при 25°С. Диаметр колоний замеряли на 1, 2, 3, 4 сутки после их появления на средах. Радиальную скорость роста определяли на стадии линейного роста по формуле: Kr=(r2-X\)l(l2-U), где К,- - радиальная скорость роста, гь г2 - значения диаметра в мм, ti, t2 - время соответствующего замера.

Накопление биомассы грибов при росте в аэробных и анаэробных условиях оценивали на жидкой глюкозо-минеральной среде. Мицелий и споры отделяли от среды фильтрованием, промывали дистиллированной водой и высушивали до постоянного веса в течение 24-х часов при 75°С перед взвешиванием на аналитических весах.

Ультраструктуру митохондрий Fusarium oxysponim lldnl при его инкубации в анаэробных и аэробных условиях исследовали после фиксации мицелия 2,5%-ным раствором глютаральдегида в какодилатном буфере (pH - 7,2) в течение 4-х часов с последующей фиксацией в 1%-ном растворе OSO4 в том же буфере в течение 2-х часов и заключением в эпоновые смолы (Glauert, 1980). Тонкие срезы аэробных и анаэробных клеток мицелия после окрашивания цитратом свинца (Reynolds, 1963) просматривали в электронном микроскопе JEM-100C при инструментальном увеличении 10 000-20 ОООх.

Активность брожения у представителей разных таксонов грибов, изолированных в анаэробных условиях, определяли по накоплению этилового спирта на 4-7 сут в глюкозо-минеральной среде во флаконах, атмосфера воздуха в которых замещена атмосферой аргона. Мицелий предварительно выращивали на жидкой среде Чапека (50 мл) в течение 4-6 суток, отмывали в стерильной дистиллированной воде и переносили во флаконы с глюкозо-минеральной средой (25 мл). Образование спирта определяли методом газо-жидкостной хроматографии в культуральной жидкости на хроматографе модели Chrom 3700 с пламенно-ионизационным детектором.

Способность образовывать закись азота (N20) была исследована у факультативно-анаэробных грибов следующих штаммов: Fusarium oxysporum 41Н6, F. oxysporum 1 ldnl, F. oxysporum an6, F. solani Ч1мт4, F. solani Ч'ЗЭ2(1)100, F. solani an-chl2, F. solani 302, F. solani 12, Fusarium sp. T'3H2(1)100, Fusarium sp.2 T'3H2(1)100, Paecilomyces sp. 4'3H2(1)20, Trichoderma aureoviride an5, Trichoderma hamatum A10aX5, T. harzianum an-sall. Их предварительно выращивали в течение 2-6 сут. в 250 мл колбах с 50 мл жидкой среды Чапека. Мицелий промывали 3-х кратно

дистиллированной водой и переносили во флаконы (100 мл) с 25 мл глюкозо-минералыюй среды (ГМ) с микроэлементами (pH 7,0). В качестве источников азота использовали NaN03 (2,0 г/л) или NaN02 (0,7 г/л). Флаконы после внесения отмытого мицелия и вытеснения воздуха аргоном инкубировали при температуре 25°С. Периодически измеряли количество закиси азота на газовом хроматографе Московского опытного завода, модель 3700/4. В качестве контроля служили варианты стерильных сред без гриба и инокулированные простерилизованным мицелием грибов.

Для определения активности выделения закиси азота грибами в почвенных условиях активные штаммы (Fusarium oxysporum lldnl и F. solani 12) вносили в стерильную почву (из расчета 0,5-1 мг сухого мицелия на 1 г почвы) и инкубировали при температуре 25°С в течение 1-2-х недель, периодически измеряя накопление N20. Опыты были проведены с образцами гумусового горизонта (Апах 0-20 см) дерново-подзолистой окультуренной среднесуглинистой почвы с территории почвенного стационара МГУ (рНн2о почвы 6,3 - 6,4; содержание гумуса 2,7%; общего азота 0,24%; плотность - 1,19 г/см3; общая порозность - 53,0-54,9%; полевая влагоемкость - 29,1%, влажность завядания - 11,1%, влажность воздушно-сухой почвы - 1,2%). Динамику биомассы внесенного мицелия в почвах определяли методами люминесцентной микроскопии (Звягинцев, 1991). Контролем служили соответствующие варианты почвы, инокулированные проавтоклавированным мицелием. До и после завершения опыта проводили проверку почвы на бактериальную контаминацию путем посева почвенного мелкозема на глюкозо-пептонный агар. Стерилизацию почв проводили 4-кратным автоклавированием (121°С, 1 атм). Активность эмиссии закиси азота грибами в стерильных почвах сравнивали с интенсивностью денитрификации в аналогичных условиях в нестерильных почвах ацетиленовым методом.

Одновременно был проведен опыт по оценке эмиссии закиси азота грибами при разном уровне увлажнения почвы без добавок и с внесением нитритов (50 мкг N-N02'/r) и нитратов (300 мкг N-N037r).

Повторность в опытах трехкратная. Статистическая обработка данных была проведена с использованием программ Excel и Statistica.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Биомасса жизнеспособного грибного мицелия в почвах, для которых характерны периоды с восстановительными условиями.

Длина общего мицелия грибов (окраска калькофлюором) в торфяных почвах составляла от нескольких сотен до полутора тысяч метров в 1 г, живого мицелия (окраска флюоресцеин диацетатом) от нескольких десятков до одной тысячи метров в

1 г (табл. 1). В верхних горизонтах доля жизнеспособного мицелия варьировала в пределах 48-95% от его общего количества, а в нижнем торфяном горизонте не превышала 20%.

Таблица 1. Длина грибного мицелия в торфяных и дерновой глеевой почвах

Почва, горизонт (см), экосистема Длина мицелия, м/г Доля живого мицелия, %

калькофлюор белый флюоресцеин диацетат

Дерновая глеевая типичная, АУ(Ад), гидроморфный луг 600+73 570+60 95

Торфяно-подзолисто-глеевая, Т.Г, ельник 1393±145 670+71 48

Торфяная олиготрофная, Т1( 10-20 см), верховое болото 815+117 641+69 79

Торфяная олиготрофная, Т2 (20-40 см), верховое болото 1506+149 1149±124 76

Торфяная олиготрофная, Т нижний (40-60 см), верховое болото 400±57 71+29 18

О значительных запасах грибного мицелия в торфяных почвах и в болотах, особенно верховых, сообщали и другие исследователи (Добровольская и др., 1991; Головченко и др., 2002). По данным этих авторов в верховых и низинных торфяниках при движении от поверхности до глубины 1 м длина грибного мицелия уменьшалась на порядок. На большой глубине (6,5-7 м) в сапропелевом слое евтрофного торфяника был обнаружен второй максимум по запасам мицелия (544 м/см3). Такое же количество мицелия (560 м/см3) было и в слое 0-10. В верховой торфяной почве длина грибного мицелия варьировала от 18 до 433 м/см3 (Добровольская и др., 1991; Головченко и др., 2002).

Для оценки, какая доля грибной биомассы сохраняется жизнеспособной при длительном восстановительном режиме в почвах, были проведены опыты по инкубации образцов торфяных и дерново-подзолистой почв в условиях контролируемого анаэробиозиса.

Биомасса общего и жизнеспособного мицелия достоверно снижалась в анаэробных условиях в течение первых 2-х недель инкубации почв (до уровня 30-40% от исходного количества). Запасы мицелия в почвах достоверно не менялись в последующие 3 недели. Биомасса мицелия не уменьшилась при анаэробной инкубации образцов из нижнего горизонта (40-60 см) торфяной олиготрофной почвы в течение всего эксперимента (5 недель) (табл. 2).

Таблица 2. Динамика длины мицелия в дерново-подзолистой и торфяной олиготрофной почве при аэробной и анаэробной инкубации

Почва, горизонт Условия инкубации м/г почвы

0 сут 7 сут 15 сут 35 сут

Дерново-подзолистая почва, А1 аэробные 185* 211 125 80

анаэробные 185 127 98 54

Торфяная почва верхового болота, Т| аэробные 641 564 328 156

анаэробные 641 413 222 250

Торфяная почва верхового болота, Тг аэробные 1149 1212 687 327

анаэробные 1149 1047 417 360

Торфяная почва верхового болота, Т„ аэробные 71 126 61 93

анаэробные 71 138 98 115

* - относительная погрешность 20-25%

Таким образом, выдерживание свежих образцов почв в течение 5 недель в анаэробных условиях не приводило к гибели довольно значительной части мицелия грибов, хотя в целом его количество, как правило, снижалось.

При анаэробной инкубации образцов типичного чернозема (контрольного и с добавкой глюкозы), имеющего влажность 25%, на 7 сут в них даже отмечали возрастание в 3 раза длины мицелия (Полянская и др., 2004).

Полученные данные свидетельствуют, что как в гидроморфных, так и автоморфных почвах (дерново-подзолистой почве в данном случае) существуют грибы способные длительное время сохраняться в виде мицелия и, очевидно, функционировать в анаэробных условиях.

Численность и разнообразие микроскопических грибов, выделяемых в анаэробных условиях из почв разных типов

Установлено, что для выделения грибов в анаэробных условиях необходимо использовать свежие образцы или образцы, хранившиеся в замороженном состоянии (замороженные образцы не хранили более 1-2 месяцев). Из почв, длительно хранившихся в воздушно-сухом состоянии, количество выявляемых грибов в анаэробных посевах резко снижалось или, что было чаще, они не выделялись вообще. При длительном хранении почв в воздушно-сухом состоянии в них существенно снижается содержание жизнеспособного мицелия. Данные посева косвенно свидетельствуют, что формирование колонии в анаэробных условиях идет из фрагментов гиф, а не из спор. Поэтому для выявления факультативно-анаэробных грибов в таких образцах почв их необходимо было проинкубировать перед посевом в увлажненном состоянии в течение 1-2 недель.

Таблица 3. Численность микроскопических грибов, установленная в почвах при аэробных и анаэробных условиях инкубации посевов (КОЕ/г в.-с. почвы).

Почва Условия инкубации

Аэробные Анаэробные

Дерново-подзолистая почва 23300±10000 200±110

Торфяная верхового болота 76000±15000 350±190

Низинно-торфяная 30100±13500 150±120

Выщелоченный чернозем 16300±7000 250±200

Черноземно-луговая солонцеватая 400±270

Аллювиальная солончаковато-солонцеватая 16000±10300 320±200

* - нет данных

Численность микроскопических грибов, выделяемых в анаэробных условиях из почв разных типов на твердые среды, составляла от полутора до нескольких сотен КОЕ в 1 г (табл. 3). То есть количество культивируемых пропагул грибов, способных развиваться в анаэробных условиях, составляет 0,5 - 2% от численности КОЕ, обнаруживаемых при инкубации посевов из почв в атмосфере воздуха. Это обусловлено тем, что в анаэробных условиях колонии преимущественно или полностью развиваются из фрагментов мицелия, а не из спор, как при посеве на агаризованные среды в аэробных условиях.

Все культуры, изолированные в анаэробных посевах, росли на сусло-агаре в атмосфере воздуха, т.е. выделяемые грибы являлись факультативными анаэробами. Из образцов почв, торфов и мхов было выделено 550 изолятов, из них были отобраны для идентификации 180 штаммов. Они представляли весь спектр колоний по различным культурально-морфологическим признакам. У подавляющего большинства из них была установлена таксономическая принадлежность, и они были отнесены к 28 видам мицелиальных микроскопических грибов. Несколько культур, представленных стерильными формами, остались неопределенными. 35 штаммов - представителей разных таксонов, что было установлено на основе их культурально-морфологических свойств, параллельно идентифицировали и по 26s рДНК (Di/D2 домен). Полученные результаты практически полностью соответствовали родовой (на 100%) и видовой (на 95%) идентификации грибов, данной ранее по культурально-морфологическим признакам. Кроме того, на основе этого метода были определены до вида некоторые изоляты, представленные стерильным мицелием.

Из почвы одного типа, как правило, изолировали от 3 до 8 видов факультативно-анаэробных грибов (табл. 4). Наиболее часто из почв выделяли Mucor hiemalis, М.

circinelloides, Rhizopus arrhízus var. arrhizus, Fusarium solani, F. oxysporum, Trichoderma atroviride, T. polysporum, T. harzianum, T. aureoviride, T. viride, T. koningii. Их относительное обилие, доля от общего числа всех выделенных в анаэробных условиях из почвы изолятов, превышала 15% (табл. 4). В следующую по относительному обилию группу грибов (7-15%) можно отнести виды Zygorhynchus moelleri, Z heíerogamus, Clonostachys rosea f. rosea, Acremonium sp., Actinomucor elegans, Mucor racemosus и виды родов Umbelopsis и Mortierella. Грибы, которые в анаэробных условиях инкубации посевов из почв выделяли редко (относительное обилие менее 7%), представлены видами Paecilomyces lilacinus, Humicola grísea, Sphaerostilbella aureonitens, Clonostachys grammicospora, Aspergillus terreus, Tolypocladium inflatum, Acremonium sp., Lecanicillium lecanii. В анаэробных посевах периодически отмечали колонии дрожжей, но их идентификации не проводили, так как это не входило в задачи исследования.

При инкубации чашек Петри со средами непосредственно в водной толще верхового болота на глубине 25-40 см было выделено 18 штаммов грибов. На большинстве чашек (6 из 10) со средой Гетчинсона и сусло-агаром, и на 2 чашках с голодным агаром обнаружены колонии грибов рода Trichoderma и слабый рост светлоокрашенного стерильного мицелия.

Выявлены различия в составе и относительном обилии видов, выделяющихся в анаэробных условиях из разных почв. Факультативно-анаэробные грибы из рода Mucor, Fusarium, Trichoderma были изолированы из почв разных типов, однако виды Fusarium преобладали в почвах из южных регионов, представители мукоровых - в дерново-подзолистых, серых, аллювиально-луговых и низинно-торфяных почвах, Trichoderma - в торфяных почвах верхового болота, на поверхности сфагнума и зеленых мхов.

Для выделенных нами из почв митотических грибов известны связи с совершенными стадиями (Ainsworth & Bisby's..., 2008; база Index Fungorum). Все они относились к отделу Ascomycota порядку Hypocreales семействам Nectriaceae (>7 видов), Нуросгеасеае (6 видов), Clavicipitaceae (2 вида) и порядку Eurotiales семейству Trichocomaceae (3 вида) (табл. 5). Подавляющее большинство других изолятов принадлежат к отделу Zygomycota порядку Mucorales семействам Mucoraceae (8 видов) и Umbelopsidaceae (1 вид) и порядку Mortierellales семейству Mortierellaceae (1 вид).

Таким образом, способность к росту в анаэробных условиях характерна для ограниченного в таксономическом аспекте круга мицелиальных микромицетов - не

многим более 30 видов, относящихся к 3 семействам зигомицетов и 4 семействам аскомицетов, т.е. не более 0,5-5% от их общего видового богатства в почвах.

Таблица 4. Относительное обилие видов микроскопических грибов, изолированных из почв в анаэробных условиях

Почва доля от общего числа изолятов, %

> 15 15-7 <7

Дерново-подзолистая Mucor hiemalis, Мисог circinelloides, Mucor sp. Fusarium oxysporum, F. solani, Zygorhynchus moelleri, Trichoderma viride

Серая лесная Mucor sp., Rhizopus arrhizus var. arrhizus

Чернозем выщелоченный Fusarium solani Rhizopus arrhizus var. arrhizus, Mucor racemosus Humicola grisea, Sphaerostilbella aureonitens

Черноземно- луговая солонцеватая Fusarium solani Mucor sp.

Корковый солончак, солончаковато- солонцеватая аллювиальная, лугово-бурая солонцеватая солончаковатая Fusarium solani, F. oxysportim, Fusarium sp. Clonostachys rosea f. rosea Acremonium sp., Nectria grammicospora *, Aspergillus terreus

Аллювиально-луговая пойменная Mucor hiemalis, M. circinelloides Fusarium oxysporum, F. solani, Actinomucor elegans, Zygorhynchus heterogamus Absidia sp.

Дерново- аллювиальная почва Trichoderma polysporum, T. Atroviride*, T. harz'tanum Fusarium sp. Paecilomyces lilacinus

Торфяная почва верхового болота Trichoderma aureoviride, T. viride, T. koningii Mucor hiemalis, Umbelopsis isabellina*, Fusarium oxysporum Tolypocladium inßatum*

Низинно-торфяная почва Mucor hiemalis Fusarium sp., Trichoderma viride Zygorhynchus sp.

* идентифицированы на основе анализа последовательности 26s рДНК (D|/D2 домен)

Таблица 5. Таксономическая принадлежность факультативно-анаэробных микроскопических грибов по базе данных Index Fungorum на основе X издания «Словаря грибов» (Kirk, Cannon, Minter & Stalpers, Ainsworth & Bisby's Dictionaiy of the Fungi, 2008)

Отдел Порядок Семейство Род/вид

Ascomycota llypocreales Nectriaceae Fusarium solani (Mart.) Sacc. (1881)

Fusarium oxysporum Schlecht. (1824)

Fusarium spp.

Clonostachys grammicospora Schroers&Samuels (2001)

Clonostachys rosea (J.C. Gilman & E.V. Abbott) Schroers (2001) f. rosea (syn Gliocladium roseum)

Clonostachys sp.

Acremonium sp., близок к A. kashiense (Rhizostilbella hibisci (Pat.) Seifert, (1985))

Hypocreaceae Sphaerostilbella aureonitens (Tul. & C. Tul.) Seifert, Samuels & W. Gams (1985) (syn Gliocladium penicilloides)

Trichoderma aureoviride Rifai (1969)

Trichoderma harzianum Rifai (1969)

Trichoderma polysporum (Link) Rifai (1969)

Trichoderma viride Pers. (1794)

Trichoderma koningii Oudem. (1902)

Clavicipitaceae Lecanicillium lecanii (Zimm.) Zare & W. Gams (2001) (syn Verticillium lecanii)

Tolypocladium inflatum W. Gams (1971)

Eurotiales Trichocomaceae Aspergillus terreus Thom (1918)

Aspergillus niger van Teighem (1867)

Paecilomvces lilacinus (Thom) Samson (1974)

Incertae sedis Acremonium striatum W. Gams (1971)

Humicola grisea Traaen (1914)

Zygomycota Mucorales Mucoraceae Actinomucor elegans (Eidam) C.R. Benj. & Hesselt. (1957)

Absidia glauca Hagem (1908)

Mucor circinelloides van Tiegh. (1875)

Mucor hiemalis Wehmer (1903)

Mucor racemosus Fresen (1850)

Rhizopus arrhizus A. Fisch., in Rabenhorst (1892), var. arrhizus (syn Rhizopus oryzae)

Zygorhynchus moelleri Vuill. (1903)

Zygorhynchus heterogamus (Vuill.) Vuill. (1903)

Umbelopsidaceae Umbelopsis isabellina (Mortierella isabellina Oudem. (1902))

Mortierellales Mortierellaceae Mortierella sp.

Способность к спиртовому брожению у факультативно-анаэробных грибов

Возможность распространения и функционирования грибов в местообитаниях с пониженным снабжением кислородом, очевидно, связана с их способностью к брожению. Так, доля видов дрожжей (Candida paludigena, С. drymidis, С. sake, Pichia silvícola, Р. capsúlala), способных к бродильному метаболизму, в торфе значительно выше, чем в почвах (Полякова и др., 2001; Полякова, 2002). Известно, что такие грибы, как Rhizopus arrhizus var. arrhizus, Mucor racemosus способны к брожению (Фостер, 1950; Wainwright, 1988). Вместе с тем, и другие виды, выделенные нами из почв при анаэробной инкубации посевов, осуществляют субстратное фосфорилирование (табл. б). Из протестированных штаммов максимальной активностью продукции этанола, близкой к уровню природных изолятов дрожжей Saccharomyces cerevisiae DSB-3781 и Hanseniaspora sp. IR, обладали мукоровые родов Rhizopus, Mucor и Zygorhynchus, ниже она была у видов Trichoderma и Fusaríum, наименьшее накопление этанола обнаружено у представителей родов Clonostachys, Humicola. При росте на минеральной среде с глюкозой (1%) мицелиальные грибы накапливали 0,3-0,4% этанола (по массе). В этих же условиях продукция этанола дрожжами Saccharomyces cerevisiae DSB-3781 и Hanseniaspora sp. IR составило 0,5% и 0,4%, соответственно. Среди других продуктов, помимо диоксида углерода, обнаружено образование ацетата, ацетапьдегида и ряда 3-х и 4-х углеродных летучих соединений (спиртов, альдегидов или эфиров). Накопление ацетата составляло от следовых количеств до 20 мкг/мл среды.

Таблица 6. Активность брожения природных изолятов мицелиальных и дрожжевых грибов

Вид C2H5OH*, мг/мл мгС2Н5ОН/(мг сухой биомассы)-час

4 сутки 7 сутки

Actinomucor elegans an202 1,30** 1,92 18,5

Fusaríum oxysporum апб 1,73 2,60 15,4

Humicola grísea an-ch 13 0,06 0,11 0,6

Rhizopus arrhizus var. arrhizus an2 2,95 3,55 12,7

Trichoderma aureoviride 810 2,50 4,25 12,5

Saccharomyces cerevisiae DSB-3781 3,65 4,60 48,1

Hanseniaspora sp. IR 2,55 4,0 33,1

*- среда с глюкозой (1%); ** - максимальная относительная погрешность - 9% (р=0,95).

Культурально-морфологические особенности и ультраструкгтура митохондрий при росте грибов в анаэробных условиях

Все из восьми исследованых штаммов грибов, относящихся к 3 видам зигомицетов и 5 видам митотических грибов, росли на глюкозо-пептонном агаре в анаэробных условиях (N2), как и в атмосфере воздуха, в виде мицелия. В атмосфере азота с диоксидом углерода (N2 - 70% и С02 - 30%) они также имели мицелиальный характер роста, за исключением Mucor circinelloides, который в атмосфере N2 с С02 переходил к дрожжевому росту. Колонии представителей зигомицетов (Мисог circinelloides, Rhizopus arrhizus var. arrhizus, Zygorhynchus moelleri) в анаэробных условиях не имели воздушного мицелия. Их гифы распространялись по поверхности агара, формируя полупрозрачную стелющуюся пленку. Колонии митотических грибов (Hiimicola grísea, Trichoderma harzianum, Sphaerostilbella aureonitens, Fusarium oxysporum, F. solani) образовывали воздушный мицелий, но высота их колоний была 1,0-1,5 мм, в 2-3 раза ниже, чем при росте в аэробных условиях.

Грибы в анаэробных условиях на твердых средах не образовывали визуально видимых эксудатов и пигментов. Отсутствие или слабое пигментообразование отмечали при развитии грибов и в жидкой анаэробной среде (Tabak, Cooke, 1968). Образование зигот - органов полового размножения у Zygorhynchus moelleri при росте в анаэробных условиях не происходило. У Z. moelleri ап4 в анаэробных условиях апикально и интеркалярно формировались одиночные, округлые крупные (25-40 мкм) клетки, напоминающие артроспоры (рис. 1).

При инкубации грибов в атмосфере азота с углекислым газом Мисог circinelloides ап20 проявлял диморфизм - переходил к дрожжевому росту. Круглые дрожжевые клетки варьировали в диаметре от 2 до 25 мкм (рис. 1). Крупные клетки были способны к множественному почкованию. Аналогичную реакцию на анаэробные условия (N2+C02) - дрожжевой рост наблюдали у М. rouxii (Amylomyces rouxii) (Bartnicki-Garsia, Nickerson, 1961). У M. rouxii вместо мицелия формировались округлые клетки, которые размножались множественным почкованием. Рост М. rouxii, как и в нашем случае у М. circinelloides, в атмосфере молекулярного азота был мицелиальным.

Д е

Рис. 1. Рост Fusarium oxysporum апб (a), Zygorhynchus moelleri ап4 (б), Rh'tzopus arrhizus var. arrhizits aii2 (в), к Mucor circineüoides ап20 {г, д) на глюкозо-пептонном агаре в атмосфере 100% N? и рост Muco г circinelloides ап20 в атмосфере 70% N2+30% С02 (е). Увеличение 10x40 (а, б, в, д, е; масштабная линия 10 икм), 10x20 (г; масштабная линия 100 мкм).

Рис.2. Электронные фотографии тонких срезов клеток гриба Ршвгшм охузрогит 11(1п1, выращенного в аэробных (А) и анаэробных (Б) условиях культивирования: А - клетка 3-суточноЙ культуры, выращенной в аэробных условиях, в котором выявляется митохондрия с хорошо выраженной наружной и внутренней мембраной, образующей кристы.

Б - клетка 4-суточной культуры, выращенной в анаэробных условиях, в которой прослеживается редукция крист при сохранении целостности наружной мембраны митохондрии.

мит - митохондрия, кле - клеточная иенка, пм - плазматическая мембрана, нм -наружная мембрана митохондрий, кр- кристы, я - ядро. Масштабная линия - 2 м км

Анаморфные грибы аскомицетного аффинитета были способны в этих условиях образовывать редкие одиночные споры. Образование одиночных интеркалярных и терминальных спор было обнаружено у Trichoderma harzianum an-sall и Humicola grísea an-chl3 в условиях анаэробиозиса. У Fusarium solani и F. oxysporum наблюдали одиночные споры, формирующиеся, вероятно, по типу бластоспор (рис. 1) и закругленные вытянутые споры (5x10 - 7x40), без перегородок, в отличие от типичных макроконидий. В анаэробных условиях фузарии образовывали значительно меньше спор, чем в атмосфере воздуха. Марчант с соавторами (Marchant et al., 1994) также отмечали образование одиночных спор при анаэробном культивировании штамма F. solani (согласно его предварительной идентификации).

Мицелий грибов, особенно, у Z. moelleri, R. arrhizus var. arrhizus, M. circinelloides, в анаэробных условиях характеризовался неравномерной толщиной на небольших по протяженности участках - 200-3000 мкм. У R. arrhizus var. arrhizus, M. circinelloides наблюдали образование утолщений мицелия с многочисленными ответвлениями тонких ризоидовидных гиф. У всех исследованных культур наблюдали уменьшение диаметра мицелия при росте в анаэробных условиях. Распределение величин диаметров гиф у грибов лучше всего аппроксимируется лог-нормальной функцией распределения (Р > 0,95). При переходе в анаэробные условия у них увеличивалась асимметрия распределения величин диаметра из-за появления на гифах утолщенных участков, диаметр которых в 2 раза и более превосходил его среднее значение.

Электронно-микроскопическое исследование митохондрий в клетках Fusarium oxysporum lldnl показало, что в анаэробных условиях происходит изменение их ультраструктуры, которое выражается, прежде всего, в редукции крист (рис. 2). В некоторых клетках митохондрии помимо редуцированных выростов внутренней мембраны имеют меньшие размеры (рис. 2), или вообще не обнаруживаются. Частичная резорбция митохондриального аппарата, сопровождающаяся редукцией крист, известна у дрожжей при помещении их в анаэробные условия и связана с переходом клеток к брожению (Бирюзова, 1973).

Радиальная скорость роста грибов в анаэробных условиях была, как правило, в 1,3-4 раза ниже, чем в аэробных (табл. 7). Однако некоторые штаммы (F. solani, F. oxysporum) росли в анаэробных условиях с такой же скоростью, или даже немного быстрее, чем в аэробных. Относительно высокая скорость роста в анаэробных условиях связана со стратегией поиска субстрата. Грибы росли в анаэробных условиях также на олиготрофной среде (агаризованная среда с 0,001% глюкозы). Следует

подчеркнуть, что накопление биомассы в анаэробных условиях, особенно при низких концентрациях глюкозы в среде было намного ниже, чем в аэробных условиях.

Таблица 7. Радиальная скорость роста почвенных микроскопических грибов на среде в аэробных и анаэробных условиях.

Вид/штамм Kr, мм/ч*

аэробные анаэробные

Sphaerostilbella aureonilens an-chl 1 0,14 0,09

Fusarium solani an-chl2 0,22 0,10

F. solani an 19 0,21 0,13

F. solani an21 0,16 0,13

F. oxysporum an6 0,25 0,35

Humicola grisea an-ch 13 0,14 0,12

Mucor hiemalis an48 0,64 0,36

M. circinelloides an20 0,71 0,34

Rhizopus arrhizus var. arrhizus an2 1,19 0,80

Zygorhynchus heterogamus an 18 0,71 0,53

Z. moelleri an4 0,89 0,53

Trichoderma aureoviride an5 0,70 0,38

T. harzianum an-sal 1 0,66 0,17

T. polysporum an-sal2 0,64 0,36

* глюкозо-минеральная среда с добавкой пептона, дрожжевого экстракта, витаминов и микроэлементов; относительная вероятная (р=0,95) погрешность 10%

Определение биомассы грибов при анаэробном росте в жидкой глюкозо-минеральной среде с добавками витаминов и микроэлементов показало, что ее накопление было в 20 раз ниже, чем при аэробных условиях (рис. 3). Если в аэробных условиях на 4, 5 и 7 сут прирост биомассы Р. охуврогит 11с1п1 составил 20, 57, и 165 мг, то в анаэробных - 2, 5 и 8 мг, соответственно, что объясняется намного меньшей энергетической эффективностью субстратного фосфорилирования (2 АТФ), чем окислительного (38 АТФ).

250

u 200 5 L-—$ а

g 150 0 л 1 100-s Ю 50

I—^ л_£ 6

um i x i i

0 48 96 144 192 240

время, часы

Рис. 3. Биомасса Fusarium oxysporum 1 ldnl в жидкой глюкозо-минеральной среде с микроэлементами и витаминами при росте в аэробных (а) и анаэробных (б) условиях.

Активность выделения закиси азота факультативно-анаэробными грибами на средах и в почве

Установлено, что изоляты факультативно-анаэробных грибов, принадлежащие к родам Fusarium, Trichoderma, Paecylomyces, способны к образованию N20 в условиях ограниченного доступа кислорода на среде с нитритами, а штаммы F. oxysporum и F. solani и на среде с нитратами. Выделение N20 не обнаружено у представителей родов Mucor, Rhyzopus, Zygorhinchus, выделенных как в анаэробных, так и аэробных условиях (табл. 8).

Таблица 8. Образование закиси азота чистыми культурами факультативно-анаэробных грибов

Bud/uimamt нмоль N-N20/mh час

Fusarium oxysporum ЧШ6 7,0

F. oxysporum lldnl* 62,5(1,1)*

F. oxysporum an6 35,0

F. solani ЧШмт4 65,7

F. solani Ч'ЗЭ2( 1 )100 3,1

F. solani Шрт1 55,0

F. solani 302 68,8 (6,4)*

F. solani 12* 7,5

Fusarium sp. T'3H2(1)100 6,7

Fusarium sp.l T2H2(2)100 0

Fusarium sp.2 T'3H2(1)100 6,7

Sphaerostilbella aureonitens an-chl 1 0

Humicola grisea an-chl3 0

Mucor sp. ВП 4-26 0

Mucor sp. T1H9 0

Paecilomyces TlOOa' 1 0

Paecilomyces sp. 4'3H2(1)20 2,1

Rhyzopus arrhizus var. arrhizus an2 0

Trichoderma aureoviride 810 2,8

Trichoderma aureoviride 17dnl 0

Trichoderma hamatum A10aX5 11,1

Trichoderma harzianum an sai 1 0

T. harzianum A 100hl 66,2

Trichoderma sp. A10aX4 0

Zygorhynchus moelleri an4 0

* - штаммы, которые продуцировали Ы20 на среде с нитратом и активность образования >}20; глюкозо-минеральная среда с нитритом (20 тМ) с добавкой микроэлементов и витаминов, культуры инкубировали во флаконах в анаэробных условиях (с атмосферой аргона или молекулярного азота); относительная вероятная погрешность 14%.

Полученные данные соответствуют представлениям о способности грибов разных таксономических групп к образованию N20 при восстановлении нитритов и реже нитратов в условиях гипоксии (Shoun et al., 1992; Tsuruta et al., 1998; Кураков и др., 1997). Интенсивность выделения N20 была в диапазоне 0-69 нмоль N-М20/(мл-час), сходная с таковой у культур этих же таксонов, изолированных в посевах из почв в атмосфере воздуха (Кураков и др., 1997; Пахненко и др., 1999). Удельная активность выделения N20 грибами была близка к активности образования N20 бродящими бактериями Propionibacterium freudenreichii, Propionibacterium acnes (Kaspar, 1982; Allison, Macfarlane, 1989), Enterobacter aerogenes, которые восстанавливают нитрит до закиси азота с целью детоксикации, и значительно меньше, чем продукция N20 у денитрифицирующих бактерий - Pseudomonas stützen, Paracoccus denitrificans (Mahne, Tiedje, 1995; Matsubara, 1971; Zumft, 1997).

В опытах по инокуляции штаммов F. oxysporum и F. solani в стерильную дерново-подзолистую почву интенсивное образование N20 происходит при 50% содержании воды (соответствует уровню полной влагоемкости этой почвы и атмосфере аргона - анаэробным условиям) и если атмосферу воздуха во флаконах не замещали на аргон, т. е. в исходно микроаэробных условиях. Активность образования N20 грибами возрастала в несколько раз при добавке нитритов или нитратов в почву, ее выделение было обнаружено уже в первую неделю. Выделение N20 грибами существенно уменьшалось при повышении аэрированности почвы (30% содержание воды), что соответствует 20%-му заполнению воздухом порового пространства. При дальнейшем увеличение аэрации выделения N20 не обнаружено или было следовым (20% влажности почвы), что соответствует 60% от полной влагоемкости. При влажности почвы 16% и 10% образование закиси азота грибами в почве не наблюдали.

Итак, выделение N20 грибами из дерново-подзолистой почвы обнаружено нами не только в анаэробных (денитрифицирующих) условиях, но и при инкубации почвы во флаконах с атмосферой воздуха, когда существуют микроаэробные условия. Это соответствует данным, полученным в опытах на питательных средах по сравнительной оценке активности образования N20 грибами в аэробных, микроаэробных и анаэробных условиях (Кураков и др., 1997; Пахненко, 1999) и недавнему сообщению, что максимальная активность образования N20 грибам наблюдается при небольшом количестве кислорода, а при дальнейшем уменьшении его снижается интенсивность выделения N20 (Zhou et al., 2001).

Продукция N20 активным штаммом F. oxysporum в опытах в стерильной дерново-подзолистой почве в вариантах с внесением нитратов составляла 5 мкг/г на 4

и - 117 мкг/г почвы на 12 сут; нитритов - 30 мкг Ы^О/г - на 12 сутки; без дополнительного внесения источников азота достигала 3 мкг М-^О/г на 12 сут (рис.

4).

Рис. 4. Продукция закиси азота в окультуренной дерново-подзолистой нестерильной почве (I, II) и в стерильной почве, инокулированной грибом Fusarium oxysporum 1 ldnl (III, IV) (I, III - без добавок, II, IV - с добавкой 50 мкг N-N03-/r, влажность почвы -

50%, атмосфера Ar).

Знание интенсивности выделения N20 и биомассы мицелия F. oxysporum (0,39+ 0,05 - 0,66±0,06 мг сухого мицелия на 1 г почвы на 4 и 12 сутки) впервые позволило рассчитать удельную активность выделения N20 грибами в почве. Активность образования закиси азота достигала 0,25±0,1 - 0,54+0,1 нмоль N20 ч"1 • г"1 почвы, что в пересчете на биомассу гриба составило 0,38±0,15 - 0,82±0,25 нмоль N20 • ч'1 ■ мг"1 сухого мицелия. Скорость образования N20 микромицетами в почвенных условиях близка к интенсивности ее продукции на питательных средах с нитратами (0,3-0,6 цМ N20 час"1 • г"' мицелия, сухой вес), и значительно ниже, чем на среде с нитритами (77,0 цМ N20 час"1 ■ г"1 мицелия, сухой вес) (Kurakov et al., 2000).

Вклад грибов в газообразные потери азота был определен путем сравнения активности выделения ими N20 из стерильной почвы с интенсивностью эмиссии газообразных соединений азота при денитрификации из нативной дерново-подзолистой почвы. В таких условиях вклад грибов составлял от долей до десяти процентов от общей эмиссии азотных соединений, что соответствует данным раннее оценкам (Кураков и др., 1997; Пахненко и др., 1999). Роль грибов в формировании потока N20 из почв может быть и более значимой, так как в отличие от бактерий-

денитрификаторов N20 у грибов является конечным продуктом анаэробного восстановления нитратов/нитритов. Такие данные получены недавно в работах с удобряемой бурой почвой, полупустынной почвой и обработанной хлорпикрином почвой лесопитомника (Laughlin, Stevens, 2002; Spokas et al., 2006; Crenshaw et al., 2008).

ВЫВОДЫ

1. Существует ограниченная в таксономическом отношении группа факультативно-анаэробных грибов, способных функционировать в почве в условиях лимитированного доступа кислорода. Доля мицелия, сохраняющего жизнеспособность в длительно (более месяца) инкубируемых в анаэробных условиях автоморфных почвах составляет 10-20% от биомассы живого мицелия и 30-40% - в почве верхового болота.

2. Она включает немногим более 30 видов митоспоровых грибов аскомицетного аффинитета - порядков Hypocreales и Eurotiales и отдела Zygomycota порядка Mucorales и Mortierellales. Наиболее часто в анаэробных условиях из почв выделялись виды Fusarium, Trichoderma, Mucor, Rhizopus, Zygorhynchus, реже - Absidia, Actinomucor, Mortierella, Aspergillus, Clonostachys, Tolypocladium, Acremonium, Paecilomyces, Humicola. Обнаружены различия в относительном обилии факультативно-анаэробных грибов в почвах разных типов.

3. Впервые способность роста в анаэробных условиях установлена у представителей Trichoderma aureoviride, Т. alroviride, Т. viride, Т. polysporum, Umbelopsis isabellina, Zygorhynchus heterogamus, Sphaerostilbella aureonitens, Paecilomyces lilacinus, Humicola grísea, Tolypocladium inflaium, Acremonium strictum, Clonostachys grammicospora, C. rosea var. rosea, Absidia glauca, Actinomucor elegans, Lecanicillium lecanii, Aspergillus terreus.

4. Микроскопические мицелиальные грибы развиваются на твердой среде при отсутствии кислорода (атмосфера N2) преимущественно в виде мицелия со скоростью роста в 1,3-4 раза меньшей, чем в атмосфере воздуха. Они не образуют характерных половых и бесполых структур, а формируют редкие одиночные бластоспоры или артроспоры, мицелий отличается неравномерной толщиной и в среднем меньшим диаметром. При наличии в атмосфере азота двуокиси углерода (30%) у Мисог circinelloides обнаружен переход к дрожжевому росту (мультипочкованию). При анаэробных условиях в митохондриях грибов {Fusarium oxysporum) происходила

редукция крист, они уменьшались в размерах или вообще не обнаруживались в отдельных клетках, что свидетельствовало о переходе микромицета к брожению.

5. Изученные штаммы факультативно-анаэробных грибов способны к спиртовому брожению. Многие из них выделяют закись азота с удельной активностью близкой к таковой у пропионовых бактерий и энтеробактерий, и заметно более низкой, чем у денитрифицирующих бактерий. Впервые установлена удельная активность выделения закиси азота грибами в почве, которая была близка к интенсивности ее образования на средах с нитратами.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Кураков А.В., Лаврентьев Р.Б., Дорошенко И.В. Видовое разнообразие и численность микроскопических грибов, изолируемых из почв в анаэробных условиях / Вторая научная конференция «Актуальные вопросы биотехнологии». Москва, 2001, МГУ, с.28.

2. Лаврентьев Р.Б., Кураков А.В., Зайцев С.В. Факультативно-анаэробные микроскопические мицелиальные грибы в почвах / 6-я Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология - наука XXI века». Пущино, 2002, том 3, с. 33-34.

3. Kurakov A.V., Zvyagintsev D.G., Lavrentiev R.B., Umarov M.M. Microscopic fungi isolated under anaerobic conditions from soils and their activity of nitrous oxide production / Simposia of the 17th World Congress of Soil Science, Thailand, Bangkok, 2002, Vol.1, Symposium no. 11, paper no. 977, p. 344.

4. Kurakov A.V., Lavrentiev R.B., Harin S.A., Zvyagintsev D.G. Soil microscopic fungi growing under anaerobic conditions and their metabolic activity / XIV Congress of European Mycologists, Katsiveli, Yalta, Crimea, Ukraine, 2003, p.22-23.

5. Лаврентьев Р.Б., Кураков A.B. Условно-патогенные грибы способные к росту в анаэробных условиях / Материалы Первого Всероссийского Конгресса по Медицинской Микологии. Национальная академия микологии. Успехи медицинской микробиологии. Москва, 2003, том I, с. 36-38.

6. Лаврентьев Р. Б., Кураков А. В. Активность спиртового брожения и разнообразие факультативно-анаэробных мицелиальных микромицетов в почвах / Материалы Международ. Конференции. Биотехнология - охране окружающей среды. Москва, МБЦ, 2004, с. 103-108.

(7) Кураков А.В., Лаврентьев Р.Б., Соина B.C. Культурально-морфологические особенности роста мицелиальных микроскопических грибов в анаэробных условиях // Микология и Фитопатология, 2007, том 41, вып. 6, стр. 526-535.

(J) Кураков A.B., Лаврентьев Р.Б., Нечитайло Т.Ю., Голышин П.Н., Звягинцев Д.Г. Разнообразие факультативно-анаэробных мицелиальных микроскопических грибов в почвах //Микробиология, 2008, 77, №1, стр. 103-112. (?) Лаврентьев Р.Б., Зайцев С.А., Судницын И.И., Кураков А.В. Образование закиси азота грибами в почве при разном уровне влажности // Вестник Моск. ун-та, сер. 17. Почвоведение, 2008, №4, с. 34-39. 10. Kurakov А. V., Lavrentev R. В., Khidirov К. S. Diversity of facultative-anaerobic fungi in soils and their activity of ethanol fermentation / XV Congress of European Mycologists. Saint Petersburg, 2007, p. 171-172.

Заказ № 02-а/09/09 Подписано в печать 03.09.2009 Тираж 100 экз. Усл. п.л. 1,5

ООО "Цифровичок", тел. (495) 649-83-30; (495) 778-22-20 www.cfr.ru; e-mail:info@cfr.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Лаврентьев, Роман Борисович

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Глава 1. Классификация и разнообразие бактерий, растущих при различной концентрации кислорода.

1.1. Разнообразие,грибов, растущих при различной концентрации.

1 4 t кислорода.

Глава 2. Энергетический метаболизм грибов и бактерий в анаэробных условиях.

2.1. Энергетика анаэробного роста прокариот.

2.2. Брожение - анаэробный энергетический метаболизм у грибов.

2.2.1. Брожение у дрожжевых и мицелиальных грибов.

2.2.2. Биохимия брожения у хитридиомицетов.

2.3. Диссимиляторное восстановление нитратов и нитритов у грибов.

2.4. Выделение закиси азота грибами в условиях гипоксии.

Глава 3. Особенности роста дрожжевых и мицелиальных грибов в анаэробных условиях.

3.1. Влияние содержания диоксида углерода в атмосфере на рост грибов.

3.2. Влияние состава культуральной среды на рост грибов в анаэробных условиях.

Глава 4. Анаэробиоз в почвах и возможность развития в этих условиях грибов.

Глава 5. Объекты и методы.

5.1. ОБЪЕКТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

5.2. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

5.2.1. Определение биомассы мицелия грибов в почвах.'.

5.2.2. Выделение чистых культур грибов в анаэробных условиях и определение численности их колониеобразующих единиц в почвах.

5.2.3. Выделение микроскопических грибов в полевых условиях.

5.2.4. Определение радиальной скорости роста грибов в аэробных и анаэробных условиях.

5.2.5. Определение биомассы гриба Fusarium oxysporum lldnl при росте на жидкой среде в аэробных и анаэробных условиях.

5.2.6. Идентификация культур грибов.

5.2.7. Изучение культурально-морфологических особенностей роста грибов в анаэробных условиях на агаровых средах.

5.2.8. Электронная микроскопия клеток Fusarium oxysporum 1 ldnl.

5.2.9. Определение активности спиртового брожения у грибов.

5.2.10. Определение активности выделения закиси азота факультативно-анаэробными грибами на питательных средах и в стерильной почве.

Глава 6. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

6.1. Влияние восстановительного режима в почвах на биомассу и численность грибов.

6.2. Численность колоний микроскопических грибов, выделяемых в анаэробных условиях из почв.

6.3. Видовое разнообразие факультативно-анаэробных микроскопических грибов в почвах.

6.4. Способность к спиртовому брожению у факультативно-анаэробных мицелиальных грибов.

6.5. Радиальная скорость роста и накопление биомассы грибами в анаэробных условиях.

6.6. Культурально-морфологические особенности роста грибов в анаэробных условиях.

6.7. Выделение закиси азота факультативно-анаэробными грибами.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Факультативно-анаэробные микроскопические грибы в почвах"

Для почвы, как среды обитания микроорганизмов, характерно наличие множества местообитаний, различных по своим свойствам (по содержанию газов в почвенном воздухе, элементов питания, воды). Среди них значительную часть составляют отдельные микрозоны, агрегаты (> 5 мм), или целые горизонты, где часто возникают восстановительные условия, а в болотных и пойменных почвах они могут преобладать в течение продолжительных периодов времени (Орлов, 1987).

Традиционно считается, что бактерии единственные организмы, функционирующие в условиях лимитированного обеспечения кислородом в почвах. Облигатно-анаэробные грибы представлены группой хитридиомицетов (виды родов Caecomyces, Piromyces, Neocalimastix, Anaeromyces, Orpinomyces), которые обитают в рубце жвачных животных. (Trinci et al., 1994). В то же время известно, что существуют не только дрожжевые, но и мицелиальные микроскопические грибы способные к брожению, что позволяет им быть активными при ограниченном поступлении или отсутствии кислорода и наличии легкодоступных Сахаров» (Bartnicki-Garsia Nickerson, 1961; Tabak, Cooke, 1968; Curtis, 1969; Gunner, Alexander 1964; Лаврентьев, Кураков, 2004).

Грибы доминируют по биомассе во многих почвах и поэтому неизбежно попадают в ситуации, характеризующиеся пониженным парциальным давлением кислорода или анаэробными условиями. Мицелиальные микромицеты рассматривали в большинстве случаев как аэробные организмы, поэтому информация о видовом разнообразии факультативно-анаэробных грибов, их обилии и особенностях состава в почвах разных типов крайне ограничена. Существует всего- несколько сообщений о выделении микроскопических грибов (Fusarium solani, Trichoderma harzianum) из почв, торфа и органических материалов при f анаэробных условиях (Marchant et al.5 1994; Wainwright et al., 1994; Сизова и др., 1998).

Недостаточно сведений имеется о морфологии грибов при росте в анаэробных условиях, причем описание их развития дано, как правило, для условий жидкой культуры (Bartnicki-Garsia, Nickerson, 1961; Tabak, Cooke, 1968; Curtis, 1969; Marchant et al., 1994). Крайне ограничена информация о характере роста факультативно-анаэробных микромицетов на твердой среде, которая более адекватна условиям почвы.

В последнее десятилетие установлено, что существуют грибы, которые в условиях лимитированного обеспечения кислородом, способны к образованию закиси азота (Shoun et al., 1992, Кураков и др., 1997; Пахненко и др., 1999). В связи с этим, актуальным представлялось изучить возможность выделения закиси азота различными видами факультативно-анаэробных грибов, определить удельную активность этого процесса непосредственно в почве.

1. Оценка количества жизнеспособного грибного мицелия в почвах с длительным восстановительным режимом.

4. Определение удельной активности образования закиси азота факультативно-анаэробными грибами в почве.

Научная новизна. Впервые проведена оценка разнообразия факультативно-анаэробных микроскопических грибов в почвах разных типов. Способность роста в анаэробных условиях впервые показана для представителей Trichoderma aureoviride, Т. atroviride, Т. viride, Т. polysporum, Umbelopsis (Mortierella) isabellina, Zygorhynchas heterogamus, Clonostachys rosea f. rosea, Sphaerostilbella aureonitens, Paecilomyces lilacinns, Humicola grisea, Tolypocladium inflatum, Acremonium strictum, Clonostachys grammicospora, Absidia glauca, Actinomncor elegans, Lecanicillium lecanii, Aspergillus terreus. Дана сравнительная оценка радиальной скорости роста грибов в аэробных и анаэробных условиях и охарактеризованы культурально-морфологические особенности и ультраструктура митохондрий у микромицетов при развитии на твердых средах в условиях анаэробиозиса. Показано,- что в почвах при длительном восстановительном режиме сохраняет жизнеспособность довольно значительная часть мицелия* грибов. Впервые установлена удельная активность образования закиси азота (в расчете на единицу биомассы) грибами при функционировании непосредственно» в почвенных условиях.

Практическая значимость. Разработаны приемы по выделению грибов из почв- и других местообитаний в анаэробных условиях. Создана коллекция факультативно-анаэробных микроскопических грибов, которая используется на кафедрах биологии почв и микробиологии МГУ в учебном процессе и для поиска природных изолятов с высокой активностью спиртового брожения. Определена удельная активность образования закиси* азота грибами в почве, что важно для расчетов баланса этого парникового газа в атмосфере.

Апробация работы. Результаты исследования были представлены на Докучаевских молодежных чтениях «Почвы и, биоразнообразие» (Санкт-Петербург, 2001); Второй научной конференции «Актуальные вопросы биотехнологии» (Москва, 2001); 6-ой Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI, века»

Пущино, 2002); 17th World-Congress of Soil Science (Thailand, Bangkok, 2002); Первом съезде медицинских микологов (Москва, 2003); XIV и XV Конгрессах Европейских Микологов (Кацивели, Украина, 2003 и Санкт-Петербург, 2007).

If и

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Лаврентьев, Роман Борисович

выводы

1. Существует ограниченная в таксономическом отношении группа факультативно-анаэробных грибов, способных функционировать в почве в условиях лимитированного доступа кислорода. Доля, мицелия, сохраняющего жизнеспособность в длительно (более месяца) инкубируемых в анаэробных условиях автоморфных почвах составляет 1020% от биомассы живого мицелия и 30-40% - в почве верхового болота.

2. Она включает немногим более 30 видов митоспоровых грибов аскомицетного аффинитета - порядков Hypocreales и Eurotiales и отдела Zygomycota порядка Mucorales и Mortierellales. Наиболее часто в анаэробных условиях из почв выделялись виды Fusarium, Trichoderma, Mucor, Rhizopus, Zygorhynchus, реже — Absidia, Actinomucor, Mortierella, Aspergillus, Clonostachys, Tolypocladium, Acremonium, Paecilomyces, Humicola. Обнаружены различия в относительном обилии факультативно-анаэробных грибов в почвах разных типов.

3. Впервые способность роста в анаэробных условиях установлена у представителей Trichoderma aureoviride, Т. atroviride, Т. viride, Т. polysporum, Umbelopsis isabellina, Zygorhynchus heterogamus, Sphaerostilbella aureonitens, Paecilomyces lilacinus, Humicola grisea, Tolypocladium inflatum, Acremonium strictum, Clonostachys grammicospora, C. rosea var. rosea, Absidia glauca, Actinomucor elegans, Lecanicillium lecanii, Aspergillus terreus.

При наличии в атмосфере азота двуокиси углерода (30%) у Mucor circinelloides обнаружен переход к дрожжевому росту (мультипочкованию). При анаэробных условиях в митохондриях грибов (Fusarium oxysporum) происходила редукция крист, они уменьшались в размерах или вообще не обнаруживались в отдельных клетках, что свидетельствовало о переходе микромицета к брожению.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Полученные данные свидетельствуют, что в свежих образцах верхних горизонтов гидроморфных почв, характеризующихся восстановительными условиями, доля жизнеспособного мицелия варьирует в пределах 50-95% от его общего количества, а в нижнем торфяном горизонте не превышает 20% (в целом была в пределах от десятков до 1 тысячи м в 1 г). Установлено, что как в гидроморфных, так и автоморфных почвах существуют грибы, способные в мицелиальной-форме довольно длительное время (более месяца) сохраняться в, анаэробных условиях. В гидроморфных торфяных почвах доля таких грибов выше (30-40% от биомассы.живого мицелия в исходной почве, не подвергавшейся такому длительному инкубированию при- анаэробиозисе), по сравнению с автоморфной дерново-подзолистой почвой (10-20% от биомассы живого мицелия). При* очень длительной анаэробной инкубации (12 месяцев) образцов дерново-подзолистой почвы в них не было-обнаружено живых гиф грибов, а довольно значительное количество спор сохранили жизнеспособность.

Для выделения микроскопических грибов- из почв в анаэробных условиях нами была разработана модификация метода Хангейта. Ее особенности, в отличие от традиционной методики, используемой, для выделения и культивирования анаэробных бактерий, заключаются в использовании твердых сред, свежих образцов, посеве мелкоземом или очень малых разведений, увеличение периода и снижении температуры инкубации, внесении повышенных концентраций антибиотиков.

Из постоянно затопленных водой, характеризующихся анаэробиозисом горизонтов верховых болот (глубина 40-60" см) грибы, способные расти в- таких условиях, можно изолировать, погружая» непосредственно в эти слои на длительный срок чашки Петри с разными питательными средами.

Согласно данным выделения грибов из почв при анаэробных условиях инкубации посевов, численность микромицетов, способных развиваться в отсутствии кислорода в 50-200 раз ниже, чем в посевах, инубируемых в обычных условиях (от полутора до нескольких сотен КОЕ в 1 г почвы). Колонии грибов вырастали только при низких разведениях свежих образцов почв 1:10 - 1:50, либо^ при посеве мелкозема. Из высушенных образцов почв, в которых, как известно, резко снижается биомасса живого мицелия, грибы не выделялись. При посеве в анаэробных условиях почвы, инкубировавшейся в течение одного года при анаэробиозисе, грибы, не выделялись. В тоже время, при инкубации, посевов в атмофере воздуха количество КОЕ грибов в них достигало 2-3 тысяч в 1 г. На основании этих данных и результатов, люминесцентной микроскопии живого мицелия-и спор, можно сделать вывод о-том, что в анаэробных условиях грибы развиваются-и формируют колонии на средах из фрагментов мицелия, а не из спор.

Все выделенные нами в анаэробных условиях культуры грибов росли и в аэробных условиях, т.е. это представители факультативно анаэробных организмов.

Систематическая принадлежность этих грибов была установлена на основе культурально-морфологических признаков, а нескольких десятков штаммов - и анализе последовательности 26s рДНК (Di/D2 домен). Способностью к росту в анаэробных условиях обладают представители родов Mucor, Rhizopus, Zygorhynchus, Umbelopsis, Mortierella, Actinomucor, Fusarium, Trichoderma, Clonostachys, Acremonium, Humicola, Paecelomyces. Доминировали виды Mucor hiemalis, Mucor circineloides, Rhizopus arrhizus var. arrhizus, Fusarium solani, F. oxysporum, Trichoderma atroviride, T. polysporum, T. harzianum, T. aureoviride, T. viride, T. koningii. Реже встречались Zygorhynchus moelleri, Z. heterogamus, Clonostachys rosea f. rosea, Acremonium strictum, Actinomucor elegans, Mucor racemosus и виды родов Umbelopsis и Mortierella. Редко выделялись в анаэробных условиях (меньше 7% от общего числа колоний, либо единичные колонии) виды Paecilomyces lilacinus, Humicola grisea, Sphaerostilbella aureonitens, Clonostachys grammicospora, Aspergillus terreus, Tolypocladium inflatum, Acremonium strictum, Lecanicillium lecanii. Таким образом, факультативно-анаэробные грибы относятся к обычным, часто выделяемым из почв видам микросокопических грибов. Они представляют узкую группу светлоокрашенных митотических грибов и зигомицетов, для многих из которых отмечена способность к выживанию в неблагоприятных условиях, многие являются оппортунистическими видами.

Факультативно-анаэробные митоспоровые микромицеты относились к отделу Ascomycota порядку Hypocreales семействам Nectriaceae (более 7 видов), Нуросгеасеае (6 видов), Clavicipitaceae (2 вида) и порядку Eurotiales семейству Trichocomaceae (3 вида) и отделу Zygomycota порядку Mucorales семействам Mucoraceae (8 видов) и Umbelopsidaceae (1 вид) и порядку Mortierellales семейству Mortierellaceae (1 вид) (Kirk et al., 2008).

В литературе крайне мало сообщений о выделении мицелиальных грибов непосредственно из природных объектов в анаэробных условиях. В единственной работе методом световой1 микроскопии отмечен рост гриба вокруг почвенных частиц, помещенных на поверхность олиготрофной среды с силикагелем и инкубированных в анаэробных условиях (атмосфера С02 и смесь С02+Н2). Выделенный гриб был идентифицирован как Fusarium solani (Mart.) Sacc. (Wainwright et al, 1994). Из образцов торфа верхового болота при анаэробных условиях был выделен гриб Trichoderma harzianum (Сизова и др., 1998). Гриб, предварительно идентифицированный как F. solani, изолировали после длительной (более года) инкубации в атмосфере N2 в жидкой минеральной среде с красителями тканей в качестве источника углерода, инокулированной I почвой и органическими субстратами (Marchant et al, 1994).

В данной работе при изоляции грибов из образцов почв, торфов и с поверхности зеленых и сфагновых мхов способность к росту в анаэробных условиях впервые установлена у представителей Trichoderma aureoviride, Т. atroviride, Т. viride, Т. polysporum, Umbelopsis (Mortierella) isabellina, Zygorhynchus heterogamus, Sphaerostilbella aureonitens, Clonostachys rosea f. rosea, Paecilomyces lilacinus, Humicola grisea, Tolypocladium inflatum, Acremonium strictum, Clonostachys grammicospora, Absidic glauca, Actinomucor elegans, Lecanicillium lecanii, Aspergillus terreus.

Все выделенные штаммы росли на твердой среде с глюкозой, содержащей витамины и микроэлементы, в атмосфере молекулярного азота в виде мицелия, стелящегося по поверхности. Скудный воздушный мицелий образовывали лишь виды родов Fusarium, Trichoderma, Clonostachys, Acremonium, Humicola, Paecilomyces и Sphaerostilbella aureonitens. Наиболее часто встречаемые значения толщины мицелия в анаэробных условиях меньше, чем при росте в анаэробных условиях. Наблюдали изменение диаметра гиф, появление вздутий, тонких участков и усиленного ветвления. Уменьшение толщины мицелия отмечено другими исследователями у грибов, подвергающихся действию неблагоприятных факторов внешней среды, например, при их росте в почве по сравнению с питательной средой.

При росте в атмосфере N2 грибы росли в виде светлого стелющегося мицелия (зигомицеты), а митосторовые грибы формировали небольшие колонии с воздушным мицелием. Микромицеты не образовывали типичных половых и бесполых спороношений, характерных для роста в атмосфере воздуха. Наблюдали образование одиночных спор, по типу бластоспор или артроспор, у Zygorhynchus moelleri, Trichoderma harzianum, Sphaerostilbella aureonitens, Fusarium solani, F. oxysporum, Humicola grisea, Rhizopus arrhizus var. arrhizus и Mucor circinelloides. Введение в атмосферу N2 до 30% С02 приводило к переходу Mucor circinelloides к дрожжевому росту. Аналогичное явление было описано ранее для Mucor rouxii (Amylomyces rowcii) (Bartnicki-Garsia, Nickerson, 1961).

Все изученные штаммы факультативно-анаэробных грибов осуществляют спиртовое брожение в анаэробных условиях. Максимальной скоростью образования этанола обладают представители мукоровых -Mucor, Rhizopus и Zygorhynchus. Они накапливают в среде количество этанола, близкое к количеству, образуемому природными штаммами сахаролитических дрожжей. Среди других продуктов брожения у грибов отмечены ацетат и менее летучие спирты и кислоты с 3- и 4-углеродистыми цепочками. В условиях анаэробиоза в митохондриях грибов {Fusarium oxysporum) происходила редукция крист, они уменьшались в размерах или вообще не обнаруживались в отдельных клетках, что свидетельствовало о переходе микромицета к брожению.

Не менее значимым продуктом функционирования грибов в анаэробных условиях наряду с органическими спиртами и кислотами является закись азота. Культуры факультативно-анаэробных грибов, принадлежащих к родам Fusarium, Trichoderma, Paecylomyces, способны к образованию N20 в условиях гипоксии на среде с нитритами. Такая способность была отмечена ранее для штаммов этих видов, выделенных в аэробных условиях (Кураков и др., 1997; Пахненко и др., 1999). Штаммы F. oxysporum и F. solani были наиболее активными продуцентами N20, причем некоторые из них образовывали N20 и на среде с нитратами. Впервые определена удельная активность образования закиси азота грибами непосредственно в почве. Она была значительно ниже, чем у грибов на средах с нитратами и близкой к таковой - на нитратах. Активность образования N20 грибами на питательных средах существенно ниже, чем скорость продукции газообразных форм азота у респираторных бактерий-денитрификаторов, таких как Pseudomonas stutzeri, Paracoccus denitrificans (Mahne, Tiedje, 1995; Matsubara, 1971; Zumft, 1997). У грибов она близка к скорости продукции N20 бактериями Propionibacterium freudenreichii, Propionibacterium acnes и Enterobacter aerogenes, у которых редукция нитритов до закиси азота имеет детоксикационный механизм.

Оценка вклада грибов в общую эмиссию газообразных форм азота из почвы показала, что он составляет от долей процентов до 8-10%. В тоже время роль грибов в образование N20, которая является у них, в отличие от бактерий, конечным продуктом анаэробного восстановления нитратов и нитритов, в почвах может быть значительно выше. Об этом свидетельствуют проводимые в настоящее время работы и других авторов (Ma et al., 2008).

Выделение N20 грибами из стерильной дерново-подзолистой почвы обнаружено нами не только в типичных условиях для денитрификации, но и при более низкой влажности почвы или при инкубации почвы во флаконах с атмосферой воздуха, когда существуют микроаэробные условия. Это соответствует данным, полученным ранее в опытах на питательных средах по оценке активности образования N20 грибами в аэробных, микроаэробных и анаэробных условиях (Кураков и др., 1997). Данные наблюдения важны при оценке формирования потока N20 из почв в природных условиях.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Лаврентьев, Роман Борисович, Москва

1. Бабьева И. П., Зенова Г. М. Биология почв.- М.: издательство Московского Университета, 1989. с. 246

2. Бабьева И. П., Чернов И. Ю. Биология дрожжей.- М.: Тов-во научных изданий КМК, 2004. 221 с.

3. Баринова Н.П. Влияние диоксида углерода на рост плесневых грибов//Микробиология, 1953. т. 22. с. 391-398

4. Боргардтъ А.И. Интрамолекулярное дыхание плесневых грибков/Труды Агрономической Лаборатории Императорского Новороссийского Университета, 1911, Одесса, с. 31

5. Беккер 3. Э. Физиология грибов и их практическое использование.- М.: МГУ, 1963. с. 25

6. Берри Д. Биология дрожжей.- М.: Мир, 1985. с. 19, 25

7. Билай В. И. Фузарии.- Киев: Наукова Думка, 1977. с. 56

8. Билай В.И. (ред.) Методы экспериментальной микологии. Справочник.-Киев. Наукова Думка, 1982. 550 с.

9. Бирюзова В. И. Мембранные структуры микроорганизмов.- М.: Наука, 1973. с. 112

10. Ю.Вайнштейн М. В., Лауринавичус К. С. Учет и культивирование анаэробных бактерий.- Пущино, 1988. с. 4-5, 22

11. Великанов Л.Л. Роль грибов в формировании мико- и микробиоты почв естественных и нарушенных биоценозов и агроэкосистем: Дис. . д-ра биол. наук, М., 1997

12. Вишневская Б. Н., Емельянов А. М. Окислительно-восстановительные свойства целинных и освоенных черноземов Кустанайской области//Изв. АН Каз ССР. Сер. биол., 1970. № 1

13. З.Воронин А.Д. Основы физики почв. М.: Изд-во МГУ, 1986. 243 с.

14. Головченко А.В. Особенности пространственного распределения и структуры микробных комплексов болотно-лесных экосистем, Автореф. канд. дисс., Москва, 1992. с.7, с. 12

15. Головченко А.В., Полянская JI.M., Добровольская Т.Г., Васильева JI.B., Чернов И.Ю., Звягинцев Д.Г. Особенности пространственного распределения и структуры микробных комплексов болотно-лесных экосистем//Почвоведение. 1993. №10. с. 78-89

16. Головченко А.В., Семенова Т.А., Полякова А.В., Инишева Л.И. Структура микромицетного комплекса олиготрофных торфяников южно-таежной подзоны западной Сибири//Микробиология. 2002. том 71. №5. с. 667-674

17. Горшкова Е.И. Изменение органического вещества сухо-степных и степных почв под влиянием культуры риса : Автореф. канд. дисс. М.: МГУ. 1972

18. Готтшалк Г. Метаболизм бактерий.- М.: Мир, 1982. с. 187, 191

19. Гусев М.В., Минеева Н.В. Микробиология.- М.: Академия, 2004. с. 127

20. Добровольская Т. Г., Полянская JI. М., Головченко А. В., Смагина М. В., Звягинцев Д. Г. Микробный пул в торфяных почвах//Почвоведение. 1991. №7. с. 69-77

21. Звягинцев Д.Г. ред. Методы почвенной микробиологии и биохимии М.: изд-воМГУ, 1991. с. 156-163,166-168

22. Кауричев И. С., Тарарина JL Ф. Об окислительно-росстаноБительных условиях внутри и вне агрегатов серой лесной почвы// Почвоведение. 1972. №10. с. 18

23. Кауричев И. С., Орлов Д. С. Окислительно-восстановительные процессы и их роль в генезисе и плодородии почв.- М.: Колос, 1982. 247 с.

24. Классификация почв России, сост-ли Л.Л. Шишов, В.Д. Тонконогов, И.И. Лебедева.- М.: Почвенный институт им. В.В.Докучаева РАСХН, 1997. 236 с.

25. Коновалов С. А. Биохимия дрожжей.- М.: Москва, Пищепромиздат, 1962. 110 с.

26. Костычев С.П. Избранные труды по физиологии и биохимии микроорганизмов,- М.: Изд-во АН СССР, 1956. II. с.

27. Кураков А. В., Пахненко О. А., Костина Н. В., Умаров М. М. Образование закиси азота микроскопическими грибами на* питательных средах и в почве//Почвоведение. 1997. №12. с. 1497-1503

28. Кураков А.В. Роль микроскопических грибов в трансформации азота в почвах/Труды Всероссийской конф., посвященной 100-летию со дня рождения Е.Н. Мишустина: Перспективы развития почвенной биологии. М.: МаксПресс, 2001. с. 133-162

29. Кураков А. В. Грибы в круговороте азота в почвах. Москва, 2003. автореф. докт. биол. наук. с. 31-37

30. Лаврентьев Р. Б., Кураков А. В. Активность спиртового брожения и разнообразие факультативно-анаэробных мицелиальных микромицетов в почвах/Материалы Международ. Конференции. Биотехнология -охране окружающей среды. М.: МБЦ, 2004. с.103-108

31. Марфенина О.Е., Попова Л.В., Звягинцев Д.Г. Особенности циклов развития микроскопических грибов в почвах//Почвоведение. 1991. № 8, с. 80-87

32. Марфенина О.Е. Антропогенная экология почвенных грибов.- М.: Медицина для всех, 2005. с. 195

33. Мирчинк T.F. Почвенная микология.- М.: Изд-во МГУ, 1988. 220 с.

34. Морозкина Е.В., Кураков А.В., Носиков А.Н., Сапова Е;В., Львов Н.П. Свойства нитратредуктазы гриба Fusarium oxysporum lldnl, выращенного в аэробных и анаэробных условиях // Прикл. биохимия и микробиология. 2005. Т. 41(3), с. 298-302

35. Мюллер Э., Леффлер В: Микология,- М.: Изд-во Мир, 1995. 343 с.

36. Никитин Д. И. Роль микроорганизмов в образовании и удалении, этилена// сборник «Роль микроорганизмов в круговороте газов, в природе». М.: АН СССР, Наука, 1979. с. 241-254

37. Орлов Д. е., Химия почв.- М.: изд-во МГУ, 1985. с. 320, с. 33540.0рлов Д. С., ред. Комплексная^ химическая характеристика почв Нечерноземья.-М.: Изд-во Московского университета, 1987.,с. 118

38. Пахненко О.А., Кураков А.В., Костина Н.В., Умаров М.М. Образование и восстановление закиси азота почвенными микроскопическими грибами//Почвоведение. 1999: № 2. с. 235-240

39. Полякова А.В., Чернов И.Ю., Паников Н.С.,Биоразнообразие дрожжей в гидроморфных почвах на примере травяно-сфагнового болота (Западная Сибирь) и кочкарной тундры (Барроу, Аляска)//Микробиология, 2001. т. 70. вып. 5. с. 714-720

40. Полякова А.В., Дрожжи в торфяно-болотных почвах. Автореф. дис. . канд. биол. наук. М. 2002. с. 24

41. Практикум по микробиологии, п/р Н.С. Егорова.- М.: изд-во Московского университета, 1976. с. 184

42. Пименова М. Н., Гречушкина Н. Н., Азова JI. Г. Руководство к практическим занятиям по микробиологии.- М.: изд-во Московского университета, 1971. с. 82

43. Росихина О. Г. Дрожжи лесных экосистем и их участие в превращениях соединений азота, Автореф. канд. дисс. Москва. 1986. с. 27

44. Сэги Й. Методы почвенной микробиологии.- М.: Колос, 1983. с.

45. Уайт Д. Технология дрожжей.- М.: Пищепромиздат, 1957. с.

46. Фостер Д. Химическая деятельность грибов.- М.: Иностранная литература, 1950. с. 651

47. Хидиров К. С., Кураков А. В. Активность спиртового брожения и образования этилена факультативно-анаэробными микроскопическими грибами/Доклады МОИП. Графикон-принт. Москва. 2005. Т.36. с. 143145

48. Шлегель Г. Общая микробиология.- М.: Колос, 1983. с. 476

49. Экология микроорганизмов, п/р. А.И. Нетрусова.- Москва, Академия, 2004. с. 37

50. Abe Т., Hoshino Т., Nakamura А., Takaya N. Anaerobic elemental sulfur reduction by fungus Fusarium oxysporum//Biosci. Biotechnol. Biochem. 2007. v. 71(10). p. 2402-2407

51. Allison С., Macfarlane G.T. Dissimilatory nitrate reduction by Propionibacterium acnes//A^\. Environ. Microbiol. 1989. v.55. p. 28992903

52. Bartnicki-Garsia S., Nickerson W.J. Thiamine and nicotinic acid: anaerobic growth factors for Mucor rouxii //J. Bacteriol., 1961 Vol. 82, p. 142-148

53. Bartnicki-Garsia S., Nickerson WJ. Induction of yeastlike development in Mucor by carbon dioxide//J. Bacteriol., 1962a. Vol. 84. p. 829-840

54. Bartnicki-Garsia S., Nickerson W J. Nutrition, growth, and morphogenesis of Mucor rouxii//J. Bacteriol., 1962b. Vol. 84. p. 841-858

55. Bauchop T. Rumen anaerobic fungi of cattle and shtep//Appi. Environ. Microbiol. 1979. Vol. 38. p. 148-158

56. Bell R. G. Studies on the decomposition of organic matter in flooded soil// Soil Biol. Biochem. 1969. Vol. 1. p. 105-116

57. Bergey Manual of determinative bacteriology. Ninth Edition. Ed. J.G. Holt, N.R. Krieg, Peter H.A. Smath, J.T. Stanley S.T. Williams.: more ets. William and Wilkins. 1994. 787 p.

58. Bergman H. F. J. Oxygen deficiency as a cause os disease of plants//Bot: Rev. 1959. Vol. 25. p. 417-485

59. Bleakley В. H., Tiedje J. M. Nitrous oxide production by organisms- other than nitrifiers or denitrifiers//Appl. Environ. Microbiol. 1982. Vol. 44. No. 6. p. 1342-1348

60. Bollag J. M., Tung G. Nitrous oxide release by soil fungi//Soil Biol. Biochem. 1972. Vol. 4. p. 271-276

61. Booth C., Fusarium. Laboratory guide to the identification of the major species. Commonwealth Mycological Inst. Kew, Surrey, 1977. 58 p.

62. Brock T. D., Smith D. W., Madigan M. T. Biology of microorganisms, IV ed., N. Y., Prentice-Hall; Inc., 1984. p.847

63. Bull A.T. and Bushell M.E. The filamentous fungi. Ed. Smith J.E. and Berry D.R.: London: Arnold, 1976. 1-31 p.

64. Burges A., Fenton E. The effect of carbon dioxide on the growth of certain soil fungi//Trans. br. mycol. soc. 1953. Vol. 36. p. 104-108

65. Burth I., Ottow J. Bakterien und Fusarium solani in Abhangigkeit von der Wasserstoff Ionenkonzentration. Landwirt. Forsch.-1982, Bd. 34, N.38, s. 655-666

66. Carlile M. J., Watkinson S. C., Gooday G. G. W. The Fungi/ The Effect of the Environment on Growth/The aeration complex, sec. ed., Academic Press, San Diego, San Francisco, New York, Boston, London, Sydney, Tokyo, 2001. p. 145-148

67. Chague V., Elad Y.,Barakat R., Tudzunski P., Sharon A. Ethylene biosyntesis in Botrytis cinerea/fFEMS Microbiology Ecology. 2002. V. 40. p. 143-149

68. Cochrane V.W. Physiology of fungi. John Wiley&Sons, N.Y., 1958. p:

69. Considine P. J., Flinn N., Patching J. W. Ethylene production by soil microorganisms//Appl. and Environ. Microbiol. 1977. Vol. 33. p. 977-979

70. Crenshaw C.L., Lauber C., Sinsabaugh R.L., Stavely L.K. Fungal control of nitrous oxide production in semiarid grassland//Biogeochemistry. 2008. V.87. P. 17-27

71. Curtis P. J. Anaerobic growth of fungi//Trans. br. mycol. soc. 1969 Vol. 53. p. 299-302

72. Domsch'K.H. Distribution of soil fungi. In: Hasegawa T. (ed.), Proc. First Int. Congr. IAMS. Vol.2. Developmental microbiology. Ecology. Science Council of Japan, p. 340-353

73. Domsch K.H., W.Gams and T.Anderson. Compendium of Soil Fungi, 1993, Vols. 1. IHW-Verlag. p. 860

74. Domsh К. H. Das pillspectrum einer bodenprobe. 3. Nachmeis der einzelrilse. Arch. Mikrobiol. 1960. Vol. 35. p. 181-195

75. Foster J. W. Chemical activities of fungi.- New York. Academic Press, 1949. P

76. Gallmetzer M., Meraner J., Burgstaller W. Succinate synthesis and excretion by Penicillium simplicissimum under aerobic and anaerobic conditions//FEMS Microbiology Letters, 2002. Vol. 210. Issue 2. p. 221-225

77. Gibb E., Walsh J.'H. Effect of nutritional factors and carbon dioxide on growth of Fusarium moniliforme and other fungi in reduced oxygen concentrations//Trans. Br. mycol. Soc. 1980. Vol. 74(1). p. 111-118

78. Glauert A. M. Fixation, dehydration and embedding of biological.specimens, 1980, A.M. Glauert (ed:), Practical methods in Electron microscopy, n.Holland Publishing Co., Amsterdam, v.3. p. 1

79. Golding N. S. The gas requirements of molds 4. A preliminary interpretation of the growth rates of four common mold cultures on the basis of absorbed gases J. Dairy-sci. 1945, Vol. 28, p. 737-750

80. Greenwood DJ. The effect of oxygen concentration on the decomposition of, organic materials in soil//Plant Soil, 1961. Vol. 14. p. 360-367

81. Griffin D. M. Soil physical factors and the ecology of fungi. 4.1nfluence of the soil atmosphere// Trans, br. mycol. soc. 1966. Vol. 49. p. 115-119

82. Griffin D. H. Fungal physiology.- N.Y. John Wiley & Sons, 1981. 383 p.

83. Gunner H. В., Alexander M. Anaerobic growth of Fusarium oxysporum!'/J. Bact. 1964. No. 87. p. 1309-1316

84. Hattori T. Soil aggregates as microhabitats for microorganisms// Rep. Inst. Agric. Res. Tohoku Univ. 1988. Vol. 37. p. 23-26.

85. Hobson P. N., Wallace R. J. Microbial ecology and activities in the rumen, part-I//Critical Reviews in Microbiology, 1982. Vol. 9. p. 165-225

86. Hollis I. P. Oxygen and1 carbon dioxide relation of Fusarium oxysporum Schlecht. and Fusarium eumartii Carp.//Phytopathology, 1948. Vol. 38. p. 761-775

87. Hungate R. E. A role tube method for cultivation of strict anaerobes, 1969, In I. R. Norris and D. W. Ribbons (ed.) Methods in microbiology. 3B. Academic Press, Inc., London, p. 117-132

88. Kaspar H:E. Nitrite: reduction to nitrous oxide by Propionibacteria: Detoxication mechanism//ArchMicrobiol, 1982. v.l 11. p.126-130;

89. Kirk P. M, Cannon P: F., Minter D; W., Stalpers J. A. Ainsworth & Bisby's Dictionary of the Fungi (10th edition);// Wallingford (UK): CABI Europe -UK, 2008. p. 640

90. Khidirov K.S., Kurakov A.V. Ethanol, fermentation? by natural strains;; of microscopic fungi: / Acta Microbiologica et Immunologica Hungarica. (Abstracts of the Fourth Hungarian Conference of Mycology). 2008. vol. 55. Number 2. p.207

91. Klein A. D., Thayer J. S. Interaction betweemsoil microbial:communities and organometallic compounds//Soil Biochemistry J.M. Bollag, G.Stotzky (Eds) V.6. Marcel Dekker. NewYork. 1990. p. 431-481

92. Kobayashi M., Matsuo Y., Takimoto A., Suzuki S., Maruo F. and Shoun H. Denitrification, a novel type of respiratory metavolism in fungal; mitochodrion// The Journal of Biological Chemistry, 1996. Vol: 271. No. 27. p. 16263-16267

93. Kobayashi M., Shoun H. The copper-containing dissimllatory nitrite reductase involved; in the denitrilying system of the fungus Fusarium oxysporum/П. Biol. Chem. 1995. Vol. 270. p. 4146-4151

94. Kurakov. A.V., Nosikov A.N., Skrynnikova E.V., L'vov N.P; Nitrate reductase and nitrouse oxide production by Fusarium oxysporum 1 lnl under aerobic and anaerobic conditions//Gurrent microbiology, 2000. Vol. 41. No. 2. p. 114-119

95. Kurtzman C. P., Fell S. W. (eds.), The yeasts, a taxonomic study. 4th ed. 1998; Elsevier Sci. В: V. Amsterdam, The Netherlands, p. 1055;

96. Laughlin. R.J., R.J.Stevens. Evidence for fungal dominance of denitrification and codenitrification in a grassland soil // Soil Sci. Soc. Am. J. 2002: V. 66, p. 1540-1548

97. Lodder J. The yeasts a taxonomic stady, 2nd ed., North-Holland Publishing Co., Amsterdam, 1970. p. 1385

98. Lubbehusen T.L., Nielsen J., Mclntyre M. Morphology and physiology of the dimorphic fungus Mucor circinelloides (syn. M. racemosus) during anaerobic growth// Mycological Research, 2003. Vol. 107. Issue 2. p. 223230

99. Lubbehusen T.L., Nielsen J., Mclntyre M. Aerobic and anaerobic ethanol production by Mucor circinelloides during submerged growth// Appl. Microbiol. Biotech. 2004. Vol. 63. Issue 5. p. 543-548

100. Lynch J. M., Harper S. H. T. Formation of ethylene by a soil fiingus//J. Gen. Microbiol. 1974. Vol. 80. p. 187-195

101. Ma W.K., Farrell R.E., Siciliano S.D. Soil formate regulates the fungal nitrous oxide emission pathway// Appl. Environ. Microbiol. 2008. Vol.74, p. 6690-6696

102. Macauley B. J. and Griffin D.M. Effect of carbon dioxide and oxygen on the activity of some soil fungi//Trans. Br. Mycol. Soc. 1969. Vol. 53. p. 5362

103. Mahne I, Tiedje J.M. Criteria and methodology for identifying respiratory denitrifiers// Appl. Environ. Microbiol., 1995, v.61, p.l 110-1115

104. Malinowsky P., Ottow J.C.C. Okologiche Bedingungen der "Denitrifikation" bei Pilzen, Landwirt. Forsch. 1985, Bd.38, № 1-2, s. 115121

105. Marchant R., Nigam P., Banat I. M. An unusual facultatively anaerobic filamentous fungus isolated under prolonged enrichment culture conditions/ZMycol. Res. 1994. 98(7). p. 757-760

106. Matsubara T. Studies on denitrification. ХП1: Some properties of the N20-anaerobically grown cell// J. Bacteriol. 1971. V.69. P.991-1001

107. Morrison M., Mackie R. I., Kistner A. Evidence that cellulolysis by an anaerobic ruminal fungus is catabolite regulated by glucose cellobiose and soluble starch//Appl. Environ. Microbiol. 1990. Vol. 56. p. 3227-3229

108. Orpin C. G. Studies on the rumen flagellate Neocallimastix frontalis/'/J. Gen. Microbiol. 1975. Vol. 91. p. 249-262

109. Pushalkar S., Rao K.K. Ethanol fermentation by a cellulolytic fungus Aspergillus terreus, short communication//World Journal of Microbiology & Biotechnology, 1998. Vol. 14. p. 289-291

110. Reynolds T. S. The use of lead citrate at high pH as en electron opaque stain in electron microscopy//J.Cell Biol. 1963. V. 17. p. 208

111. Rifai M.A. A revision of the genus Trichoderma!'I Mycol. Paper, 1962. Vol.ll6.p. 3-56

112. Robertson K. Nitrous oxide emission from soil on extrapolation from soil enviromental factors/ Linkoping Univer. Linkoping. 1995. p. 9-44

113. Samuels G.J. Trichoderma a review of biology and systematics of the genus//Mycol.Res. 1996. Vol. 100. p. 923-935

114. Schipper M.A.A. A study on variability in Mucor hiemalis and related species//Studies in Mycology, 1973. No. 4. 40 p.

115. Sextone A. J., Mains C. N. Production of methane and ethylene in organic horizons of spruce forest soils//Soil Biol. Biochem. 1990. Vol. 22. No. 2. p. 135-139

116. Sharifia Mahnaz, Karimi Keikhosro, Production of ethanol by filamentous and yeast-like forms of Mucor indicus from fructose, glucose, sucrose, andmolasses//Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology, 2008. Vol. 35. No. 11. p. 1253-1259

117. Sherwood R. T. and Hagerdorn D. J. Effect of oxygen tension on growth of Aphanomyces euteiches// Phytopatology, 1961. Vol. 51. No. 7. p. 492-493

118. Shoun H., Tanimoto T. Denitrification by the fungus Fusarium oxysporum and involvement of cytochrome P-450 in the respiratory nitrite reduction//J. Biol. Chem. 1991. Vol. 266. No. 17. p. 11078-11082

119. Shoun H., Kim D. H., Ushiyama H., Sugiyma J. Denitrification by fungi//FEMS Microbiol. Lett. 1992. V. 92. p. 277-282

120. Smith K. A. A model of anaerobic zones in aggregeted soils, and its potential application to estimates of denitrification//J. Soil Sci. 1980. Vol. 31. p. 263-277

121. Smith K. A., Dowdell R. J. Field studies of the soil atmosphere I. Relationships between ethylene, oxygen, soil moisture content and temperature//J. Soil Sci. 1974. Vol. 25. p. 217-230

122. Soderstrom В. E. Vital staining of fungi in pure cultures and in soil with fluorescein diacetate//Soil Biol. Biochem. 1977. Vol. 9. p. 59-63

123. Spokas K., Wang D., Venterea R., Sadowsky M. Mechanisms of N20 production following chloropicrin fumigation // Appl. Soil Ecology, 2006. V.31. P.101-109.

124. Stotzky G., Goos R. D. Effect of high C02 and low 02 tensions of the soil microbiota//Can. J. Microbiol. 1965. Vol. 11. p. 853-868

125. Suihko M.-L. The fermentation of different carbon sources by Fusarium oxysporum!rQ\otQc\mo\ogy Letters, 1983. Vol. 5. p. 721-724

126. Tabak H.H. and Cooke W.B. Growth and metabolism of fungi in an atmosphere of nitrogen/ZMycologia. 1968. Vol. 69. p. 115-140

127. Takaya N. Dissimilatory nitrate reduction metabolisms and their control in fungi//J. Biosci. Bioeng, 2002. Vol. 94(6). p. 506-510.

128. Tanimoto Т., Nakahara К., Shoun H. Diauxic growth of Fusarium oxysporum during aerobic culture in the presence of nitrate/nitrite// Biosci. Biotechnol. Biochem. 1992. Vol. 56. p. 2058-2059

129. Toler R. W., Dukes P. D., Jenkins S. F., Jr. Growth response of Fusarium oxysporum f. tracheiphilum in vitro to varying oxygen and carbon dioxide tensions/ZPhytopatology, 1966. Vol. 56. p. 183-186

130. Trinci A. P. J., Davies D. R., Gull K., Lawrence M. I., Nielsen В. В., Rickers A., Theodorou M. K. Anaerobic fungi in herbivorous animals// Mycol. Res. 1994. Vol. 98 (2). p. 129-152

131. Tsuji Т., Kawasaki Y., Sekiya Т., Tanaka S. A new fluorescence staining assay for visualizing living microorganisms in soil//Appl. Environ. Microbiol. 1995. Vol. 61. No 9. p. 3415-3421

132. Uchimura H., Enjoji H., Seki Т., Taguchi A., Takaya N., Shoun H. Nitrate reductase-formate dehydrogenase couple involved in the, fungal denitrification by Fusarium oxysporum!'/J. Biochem. 2002. Vol. 131. p. 579586

133. Usuda K., Toritsuka N., Matsuo Y., Kim D., Shoun H. Denitrification by the fungus Cylindrocarpon tonkinense: anaerobic cell growth and two isozyme forms of cytochrome P-450nor//Appl. Environ. Microbiol. 1995. Vol. 61. No. 3. p. 883-889

134. Walsh J. H., Stewart C. S. Effect of temperature, oxygen and carbon dioxide on cellulolytic activity of some fungi//Trans. Br. Mycol. Soc. 1971. Vol. 57(1). p. 75-84

135. Walsh J. H., Growth and deteriorative ability of fungi at low oxygen tensions/Applied science publishers limited Proceedings of the 2nd International biodeterioration symposium, Lunteren, The Netherlands, 1971. P

136. Wainwright M. Metabolic diversity of fungi in relation to growth and mineral cycling in soil a review // Trans. Br. Mycol. Soc. 1988. Vol. 90. №2. p. 159-170

137. Wainwright M., Ali T. A., Killham K. Anaerobic growth of fungal mycelium from soil particles onto nutrient-free silica gel // Mycol. Res. 1994. Vol. 98(7). p. 761-762

138. Wells J. M., Uota M. Germination and growth of five fungi in low-oxygen and high-carbon dioxide atmospheres // Phytopathology, 1970. Vol. 60. p. 50-53

139. Zhou Z., Takaya N., Sakairi M.A.C., Shoun H. Oxygen requirement for the denitrification by the filamentous fungus Fusarium oxysporum II Arch. Microbiol, 2001. Vol. 175. p. 19-25

140. Zhou Z., Takaya N., Nakamura A., Yamaguchi M., Takeo K., Shoun H. J. Ammonia fermentation, a novel anoxic metabolism of nitrate by fungi // Biol. Chem. 2002. Vol. 277. p. 1892-1896

141. Zumft W.G. Cell biology and molecular basis of denitrification // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 1997. Vol. 61. p. 533-616

Информация о работе

Лаврентьев, Роман Борисович
кандидата биологических наук
Москва, 2009
ВАК 03.00.07

Диссертация

Факультативно-анаэробные микроскопические грибы в почвах - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы