Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

ДЕНИТРИФИКАЦИЯ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ОДНОУГЛЕРОДНЫХ СОЕДИНЕНИЙ

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "ДЕНИТРИФИКАЦИЯ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ОДНОУГЛЕРОДНЫХ СОЕДИНЕНИЙ"

{Шт

АКАДЕМИЯ НАУК СССР ИНСТИТУТ МИКРОБИОЛОГИИ

На драмах рукописи

лещдокжий Александр Владимирова

удк 579.1.017.7-266.2+695

ттшшмт с использованием оевоуглеродны! сошшений

Спеажалъиостъ 03.00.07 - мжкройиологжя

Автореферат дяосергацж* на еомсканве ученой стеиекя каадкдата биологических наук

Москва - 1984

АКАДЕМИЯ НАУК СССР ° ИНСТИТУТ МИКРОБИОЛОГИИ

На правах рукописи

ЛЕБЕДИНСКИЙ Александр Влалшчирович

УДК S79.I.017.7-266.2+695

ДЕЖГРИФИКАЩЯ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ . ОДНОУГЛЕРОДНЫХ СОЕДИНЕНИЯ

Специальность 03.00.07 - микробиология

*

А в т о'р е ф в р s т ■ диссертации на соискание учекой степени кандидата биологических наук

Москва — 1984

ц- ■ > *■ ЛоНАЯ НАУЧ :.v '■Л.ЮТС'-А Мое-1. сор .с

НаупкыД руководитель: члеи-корресповденг АН СССР,

профессор Г.А.ЗАВАРЗИН

Официальные оппоненты;

доктор биологических наук Г,А.ДУБИНИНА кандидат биологических неук Ю.А,ТР0ЦШЮ

Ведут? организация - Тимирязевская сельскохозяйственная академич,

кафедра микробиологии

Защита состоится -ЛЗ" 1984 г. в /А, час.

на шседании специалкеироваяного яовета д 002.64.01 при Институте микробиологии АН СССР ПС адресу: П73Г2, г, МОСКВА, В-оГ2, Проспект 60-летяя Октября, д.?, кори.2,

»

С диссертацией можно ознакомиться в библиотек« института йшфойиологаи АН СССР

Автореферат разослан "ЛЗ" 1964 г.

Ученый секретарь ссоциализнрованного совета

Л.Н.Москаленко

ВВВДВНИЕ

Актуальность проблемы. Maтилотрофньл деmтряфакаторы способны сочетать два процесса, которые по отделъноота интенсивно изучается: метвлотрофию к данитрификацию. Металотрофвая деглтрифыса-гая остается малоизученной, хоти представляет значительный практический в теоретический кнтэрес.

Одним 13 экономичных способов очистки сточных вод от соединений азота является сочетание бактериального* аэробного процеооа нитрификация с последувдей анаэробной стадией, в ходе которой микроорганизмы в процессе де н итрификациа вое с тана влива от нитрат в *г за счет экзогенного метанола.

При деяитрификации нередко происходит накопление нитрита, окиоп и закиси азота. Состав продуктов при метилотрофвой дэнктри-фикации и его зависимость от внешних условкй практически ве изучены. Накопление нитрита и окиси азота в очистных сооружениях нэже-лательно ввиду их токсичности. Условия, влиядвде на накопление закиси азота микроорганизмами, заслуживают изучения с позиции глобальной микробиологииг так как этот газ влияет на озоновый олой атмосфера (c*ut*»n, 1901).

Основным агентом де нитрификации с метанолом считаются представители рода HjphoŒicroMum (Harder, ittwood, 197ÖJ, Единственным на относящимся к гифомвхробам организмом, для которего показана денитряфикащщ о метанолом, является Гагасоссив <3enltrl.flo«ni. Причиной того, что окисление метанола рэдко сочетается с восстановлением нитрата, могут быть особенности функционирования алект-рон-трансаортаой цапи (ЭТЦ) при осуществлении этех процессов. Считается, что метанол отдает электрона в ЭТЦ аа уровне датохроиа о, минуя цитохром Ъ (Anthony, 1975; batrueov et al., 1977» Banfortb, Qunyi», 1978b), от которого принимает электроны нитрат (John, ibetley, 1970; Mlyata, 1971). Таким образом, серенос электронов от метанола к нитрату моле™ бить затруднен. Ферыенты денитрификации и их связь с ЭТЦ у пифомикробов не изучены*

Теоретическим стимулом для изученья метипотрофной дэнитрифм-кации является вообшэ недостаточная изученность основных агентов процесса - представителей HypfcomieroMwa, что отражается в отсутствии детальной систем х/ки рода. Представляют в частности интемо

вопросы, насколько широко распространена среди гяфомикробав способность к денитрификации в насколько однородна по свойотвем группа гифомихробов, способных к денитрификации.

Цель, и задачи исследования. Целью работы было «эучанме особенностей микробиологии, физиологии и биохимии возбудителей денитрификации о метанолом а выяснение влияния различных факторов ва интенсивность процессе и состав продуктов.

Конкретно задачи исследования состояли вол в думцем.

I* Получить накопительные я чистые культуры метилотрофвых де-нетрифлсатороа. Проверить, действительно ли в накопительных культурах доминирует гифошцеробы, и не способна ли егшутотвугщая мвх-рофлора к иетилотрофноВ денитрификации.

2* Проверить способность ряда штаммов гкфомдкробов» выделенных другими авторами в аэробных условиях, не способность к двнят-рификацик о целью оценить распространенность »того свойства среди гифошперобов. Сравнить гифомикробов -денитрификаторов по ряду признаков (воздокнооть роста о различными акцепторами, образуемые продукты и т.д.) в ивлы> оценить однородность свойств группы гкфо-мвкробов, способных к дзнитрафяквции.

3. Выявить влияние внешних факторов - рН, аэрации, ковцеитра-цис нитрата', нитрите, метанола, наличия микроэлементов на интенсивность процесса кетидотрофяой денитрифевапяи и на ооотав образуемых продуктов.

' 4. Установить у метялотрофвкх денитрификаторов тип ферментов, окисляющих метанол и гооотанавливаадих нитрат. Выяснить, возможен ли лэревоо электронов от шганолдегкдрогеназы к нитратредуктазе.

Даучнря новизна работ». Впервые описан состав продуктов, образуемых метило тройными денитряфикаторами, и влияние на него внешних факторов. Показано, что на состав проектов денитрификации с метанолом большое ышяние оказывают ионы си2*, в присутствия которых в стабильных анаэробных условиях единственном продуктом становится м2. Показано, что переход иетглстрочных денигрифякаторс в от аэробного линейного роста к денигрифякеиун в анаэробных условиях способствует образованию ими закиси езетД рейду большей чувствительности я20 -редуктазы к репрессия зэ^циай по сравнению с другими редуктазам денитра^икации.

Установлено, что гифомикробн, спосоотое к денитрификацив, представляют содой гетерогенную груцпу. Они значительно разлетаются по скорости и эффективности анаэробного росте с нитратом и метанолом, по составу продуктов, образуете: в отоутствяе ионов си2*, по способности я росту с метанолом я н2о.

Обнаружено, что НурЬош1с'гоЫищ г-Э в определенных условиях осуществляет практически стахиометр кческо е восстановление игтрата в нитрит эа счет метанола, что ав укладывается в рамки существующих представлений ос! ЭТЦ штоотрофных денитрйфикаторов (ЗатГог*ь( Оиау1», 1978в; Мв1Ъеге, 1979). Проведено энзимологияесков исследование обнаруженного явления, показавшее возможность переноса, электронов ОТ цнтохрома в е штохрому Ъ у НурЬо!ь1сгоЪ1лий

Выделен атаьы бактерий, слособньос к л<э нитрификации с метанолом в отличающихся морфологически от гвфоыакробов к Pc.detd.trin-вааа. Таким образом, расширены представления о круга органявмов, способных к соуаествленшэ процесса дэпитрификацяи с метанолом.

Практическая данность исследование. Полученные данные по зависимости ЛЕтеасиваости денитрификацля с метанолом к состава ее продуктов от внешних условий могут иметь значение для практики биологической очесткк сточных вод. Показано, что образовать нежелательных промежуточных продуктов (нитрит, окись л закись а&ота) можно избежать, обеспечив доступность ионов си2* в стабильность анаэробных условий.

Метанол модет быть экономичным субстратом дня получения кормового микробного белка. При аэробном культивировании проблемой производства является расхсд энергии на аэрзроьание. При наличии штамма, дашего высокий урожай в анаэробных условиях, зсиена кислорода на нитрат может быть экономически выгодной. Нами выделен штамм нурЬо&1сгоЪ1иш 2-3, дзааий при азаэробио») росте с метанолом и нитратом еысодий урожай беоаассы в расчете на потребленный метанол, сравнимый о урожаями, которые удг. дтоя получить при аэробном культивировании бактерий и дрожжей на метаноле. Выявлены условия анаэробного культивирования НурЬоаЛегоЫит 2-3, способствующие высокому урожаю, высокому содержанию белка и низкому содержание аоли-р -оксимасляной хислотк в клерках.

Апробанкд работа. Материала дпсоертации были доложены па Всесоюзной конференции "'^ерыо^вдьные мяк&оорганкэма в природе и прок-

тике народного хозяйства" (г.Москва, 1583г.) л на Воаоовэвом семинаре "Закономэрноети роста микроорганизмов" (г.Пущино, 1933г.).

Публикации. Ооновнне материалы диссертация опубликованы в шести статьях.

Объем и структура работы. Диссертация состоит из впадения, шести глав, заключения, выводов и списка литературы. Материалы галояэЕн на 177 стрш'вцах манЕКоппслого текота, вккьчая 9 таблис, 8 схем и 29 рисунков. Сносок литара^ры содержит 229 нашаеновеяий работ - 26 ва русском и 203 Ра иностранных языках.

Че$то п^овэиония работы. Работа проводилась в Институте мгк-робиологяи АН СССР в Огцеле лктотро^аых микроорганизмов (заведув-шЛ Отделом - член-коррзспондент АН СССР, профессор Г.А.Заварзея). Часть экспериьжяха л ь ной работы прпредена совместно с кандидатом З/ологичэикчх лаук И .Я .Ведениной'.

ОЕЬККШ И МЕТОДЫ ИССВДСВАНИЯ

В работе бил использован штамм НурЬоз)1огоМит 2-3, выдалзн-най намл из низового болота {АЗрамцаво, Подмосковье), штаммы Иу-рЬоо1о1сЫгш г-гл и . 2-113, вшилешшв нагли из поймы р.Сетунь, А шхаммн гифоулкробов, совученяне от других исследователей. Штамм ИурьошАсгоЫил гч бил внделон Г.А.Заеарзшым; шуам-ль* 03, 04, 05, <17, 03 и ош иолучонв от Б.В.Громова; мтзмм 3 - от Ю.А Лроненко; штпммы ур-201 и ИА-1С0 - от Д,11 .Никитина.

Бнли непользованы такжэ предоставленные нам °.С,Головачевой накопительные к^ль^у;1» терма? :ыц>нчх ньтри^иьатсров, в которю стс-бплЬРС присутствовал НурЬо!а.«гоМшг ер.

В работе од использовали также образцы активного ила из аэро-тенков Люблинской водоочистной ставши и из очистных сооружений, осущеотвдяятпс денктич£якащш промстокя п/о "Азот" в г.Щёкиво. Из Гёкчас»лх образцов активного яла нами были выделены штаммы 2-1 оо я 2-121 - метилотро$ные денитрс&икатора, нэ относящиеся к НурЬо-зЛогоМит. При их пзуча нии для сравнения нами была использована коллекционная культура Рыпоосоив <1еы-Ьг1*1сшэ ютами Тов*.

Для выделения и кулыхв »фова н ия метилотро?лих дэнктрпфштаторов использовали среду 337 (Ш-гасЬ, Ссп«1, 1964) с нитратом и метанолом. В секоторнх случаях вносили дополнитеяьнче микроэлементы.

Анаэробное культивирование проводили в бутиадх, котсрыз закрывали резиновыми пробкам* и заполняли инертным газом. Поойа дм анализа газов н пробы оусгевэии отбирали алрнцеа. Англизгезов производили о помотьз хроматографа JIÏM-CM с катаряметр^м как детектором аа коло.жах о Порапак Q и молекулярным ситоы I3X о га» зом-носителом водорсдом. При поотроении калибровочных кривых попользовали н2, NgO и о2 из баллонов» а но сиэтазиоовали методом, основаннтш на взаимодействии КаШ2 l I) в 50Я (Киллер, Гкаук, IS68) в атиоофере янертногэ газа.

Пробы культуры центрифугировала, в осадке определяли содержанке белка <bowry et al., 1S51 ) й поли-р -оксамасляной кислоты (31 «Феску, Law, i960). В оупаряатзнте оирадэчяли концентргг^Р нитратов, пзтрлтов и метанола. Кптратн определяли с фапслдиоуль-фоквалотой, нитриты - з сульфашшевой кислотой и и -нафткдзтилен-дпамкном (Nie bol as, Naeoa, 1957). МетаЕОЛ определяли методом бл~ хроматгого окисления или на хроматографе ДХМ-8М о пламеаро-ионя-зационяны детектором и колонкой о Порапак <1.

Опыты о суспензиями, в которых но требовалось аэрирования, ставили .в шприцах на 50 мл о легко подвижными стеклянными поршня- * ми. Опыты, г которых .требовалось аэрирование оуссизии, стевили в ферментере *Blotek" о кислородные электродом при интенсивном перемешивании.

Активность ферм<штов определяли в г.вочпцанном экстракте из клеток Hypbor.tcrobi'un Z--3. Суспензии клеток разрушали о помсщьс ультразвукового дезинтегратора изв при мощности 50С -эат-г и частоте 20 ктврц в течение 5 минут; в качество источника »врменток использовала оупср1штаит после цэнтрв$угирования при £0000 xg s течение 40 минут. Активность ферментов определял» (шектрофотсмзтрл-чеоздми метопами. Все реакгш проводи.»« в анаэробных услогиях в трубках Тунберга, чтоб и избежать самопроизвольного окислендя вг.о-отановченных нрасителэй. Meталолдjгидрогонаэу определяли по аода-фицирошанначу методу Антони и Затыали (Autboay, Zatm&a, 1967)» формальдегиддегвдрогенизы и 4орчяатдегидрогенаэу - методами, о писанными Джонсоном ж Квейчом (Jobneon, Cuftjle, 1964). Нитрат- ж штрит-родуктазы определяла по изменению поглощения при faOQ iu происходящему при окисленчя дотилвиологена, прадверительви воо-отановлешюго дитисниточ. Метод бил икахогачея прхлнечаому Ко»с-ТИаНСОЫОМ и Холочером (Irletjajueon, Hollooher, 19ÔO) ДМ СВр»Д9-

хонял н^о-рвдуктавн Ро, denít.riílcans.

" РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛДДОЕАШНИ ОБСУЖДЕНИИ

1. Вцдэленив мвтш:огрофнюс денитрифнкаторов.

Оря посеве apod ила низовых болот и речной поймы в среду о штанолоы к ширатш в анаэробных условиях развивались накопитель ase культуры, где доминировала гкфомикробы. Эти организмы легко * распознайся под сватовым микроскопом по моно- зли биполярный нитевидным выростам клеток (гифам), на конце ноторнх почкованием разуются дочерние клетка. Нами били выделены гри чистые культуры Brphomlcrcbiua Ж-Э, Z-111 а 2-113.

Кроме того» при выделения иетшютрофвыг девятрвфикаторов из активного ила очистного сооружения, ооуществдявдаго данитрификацию промышленного стока за счет смеси метанола и отходов его производства с хозяйственно-фекальными сточными водами, мн получили две чистые культуры бактерий, способных к денитрификации о метано лом - штаммы 2-121 к z-100. Штамм Z-121 предотаэяяет собой "грамотрицательный кокк, морфологически сходный о Po.denitr-lfloaai и, подобно ему» способный к автотрофаому росту в атмосфере Н2 + О2 + СО2. Штамм z-ioo - грачотрицательная палочка, морфологически отличная от Pe.denltriflc вне л неспособная к автотрсфному росту в атмосфере Н2 + Og +COg. Выделение втамма z-too показывает что круг организмов, способных к девитрпфакешх о метанолом, не ограничивается гифоыикробаыи и fa.dealtrlflear.B, как его считалось ранее,

2. Распространенность способности к денятрифихадвл среди гифоышфобов.

Гифомикробы легка выделяются из различай* естественных кзо-тообптаний как кетилотрофныэ деиятрификатсры. Многие штаммы гифо-микробов, ввдаленние в аэробных условиях, не проверялись на способность к денитрификации. Возникает вопрос, не является ля вообще подавляющее большинство гяфоиакройов денатрьфекаторами? Для исследования этого вопроса мы проверяли способность ряда штаммов . гкфомякробов к росту с различными акцепторами электронов (нитрат, закись азота, кислород воздуха). Результату представлены в табл.1. Шгакаи Ду(íhealeгоъinn z-3, z-111 и 2-113 выделены нами в ана-

эробаыг у од о виях, остальные штаммы - другими авторами в аэробных условиях.

Таблица I

Рост тофомикробов о различными акцепторами электрона_

Штаммы

I

¿'словил роста

Среда баз кво3; ;Среду, с 50 Ш;Срвда без гко-и газовая фаза - : ИО3 газовая: газовая фаза -воздух_.'фаза - неон *м л

:м2о

2-Э 2-111 1-113

zr

МА-160 НР-201

3

03 в* «5 07 оа 010

+ + + + + +

Примечание: - ве менее чем 5-кратное превышение исходной мутности

"++" - ве менее чем 30-кратное превышение иоходаой мутности

' - результат получен лишь через X суток.

Из табл.1 видно, что большинство штаммов, выделенных в аэробных условиях, неспособно к анаэробному росту. Аэробно выдедеЕНчо отаммы вурЬоейлгоЪ1ш 24 и Н4-160 рооли анаэробно с нитратом, яо не о закись» азота.

Девитрификаторы, как правило, при проверке окаэнваотся опо-«обны растя с »2о как акцептором (Раум, 1973). Денятрифякагору, на растущие о и2о, вообще неспособны восстанавливать закись азота* и она является у них единственным газообразным продуктом восстановления нитрата (В**« «г »1., 1965| 0***аЪ*гв, Вмквг, 1977). Напротив, у ВурЪоаЮкоЫим ¿чл неспособность расти о аакисьп азота не связана о неспособностью ее восстанавливать.

- в -

О распространенности среди гифомикробов способности к данвт-р^яквции позволяют такая косвенно судить давние, полученные нйми при работе о пятью накопительными культурами термофильных нлтри-фикаторов, предоставленными Р. С, Головаче вой. В этих накопительных культурах, инкубируемых при 40-50°, стабильно присутствовали гяфо-михробы. Догачно было предположить, что эти гифомякробы способны к денитрафакацяи. Однако наши попытки выделить их в условиях, способствующих метилотрофноа денитрвфикации, оказались безуспешными. Б то же время пересевы в аэробные условия о метанолом приводили к развитию накопительных культур, где домшшровади гифомякробы, Таким образом, деже в условиях, благоприятствувдиг денятрификации, могут обнаруживаться гифомяхробы, неспособные к этому вроцеооу.

3. Динамика роста и образования продуктов при дэнитрификации с метанолом у Bypbouierebium Z-3 я HyphosloroMun ZT.

Посладуицую работу проводили с двумя штаммами гефомикробов -коллекционным HypbonieroMtm £т и выделенным нами Hypboaierobiu* г-Э, который характеризовался наиболее активным анаэробным ростом о метанолом и нитратом из воех исследованных нами штаммов.

Между процессами дэнитрификация, осуществляемыми Hyphoalcro-Mun z-3 к Hypbomleroblua Z7, мы обнаружили существенные различия. Данитрификация на среде 337 с нитратом я метанолом у Hypho-eioroblua 2V происходила баз накопления нитрита. Основным продуктом боя н2. В качестве промежуточного продукта образовывалась ш^О (рио.ХА). Скорость роста Byphomicrobium z-3 в тех же условиях была значительно выше, л нитрат восстанавливался этим штаммом значительно быстрее; при атом накапливался нитрит, по яе х2о (рио.1Б).

4. Влияние ионов Cu2+ на деиитрификацию о метанолом у

HypbomioroMum Z-3 И HypboieieroMura ZT.

Исходная среда 337, юпокьзованная нами для выделения и культивирования гяфомидробов, не включала ионов Си2+. В дальнейшем мы обнаружили, что добавление в среду 0,1-20 мкМ си2+ приводит к тому, что üyphoeioroblшя z-3 накапливает значительно меньше нитрите, чем без добавления этого макроэлемента, а урожай биэмасоы в раочете на перенесенные в ЭГ4 электроны возрастает почти вдвое. . (ряс.IB). Изучение влияния ионов Оаг+ на Hypbomiorobtun zv показало» что ях добавление не угелячдвало ни окорость роста, ни урожай этою ютгмма. В то же время добавление 0,4 мкЫ Си2* препятот-

вовало накоплению у«0 *пш вташом ■ *2 становился единственным

Рдо.1 Рост гифомикробов на среда о нитратом я метанолом.

A. ВурЬо®1огоЪ1иа XV без внеоеккя Си2*

Б. ну?ьо®1о гоъ1ию 2-3 без внесения Си2+

B. ИтрЪот1огоЫш» х-3 о вяеовняем 0,2 икЫ Са

Ряд данных, появившихся в последнее время а литературе, свидетельствуют о том, что *го-редуктава монет бить медьсодержащим ферментом (Х«гая«к1 Л., 1930« 1«г»в»1с1, Т«г*1, 1932, **г«иЪ*г» •* >1., 1982). Нами обнаружено отимулмруадве влияние Оа * на споообвооть к вооотановленио вго у Нурьов1о гоМи* хг. В то »а время другой штамм - НурЬоо!» гоМи« 2-3 - при анаэробном росте о 50 МЫ нитратом не накашивал н2о. Рост «того штамма с я20 как акцептором возможен с накоплением знсчительной бяомаоом без даба»- ■ дання медн; отнмулирутаего влияния меди на его рост о яго ьамя на

сбааружено. Хотя мн яа проводила очистки фоновой ореды от меда, ев содержание было достаточно вязким, чтобы позволить обнаружить сильное влияние ОД мхЫ внооимой меди на накопление нитрита и урожай биомассы при анаэробном роста Нурьоа1огоМш 2-3 о нитратом. Таким фразой, ваши данные позволяют предположить, что 7 аурЬо-«1сгоЪ1ш» го являотоя медьсодержавим ферментом,

а у ЯуфЬм1«*еЪ1ш XV - возможно, является. *

Накопление нитрита НгрЬопЦвгоЫиш 2-з в случаях, когда в оралу ве добавляли сиг+ (рис,16), проще всего было бы объяснить таи, что нитритредуктаэа »того штамма является медьсодержащей. Известно, что нитритредуктазы некоторых данитрафикаторов содержат медь <1»м*к1 •* «1., 1975; К<зг1, 1969( Эя*я&ш • % ,

19781 Еаки«ао1 «1., 199«). Однако клетки НурПоа1егоМим 1-3 после анаэробного культивирования о цитратом без добавления медк обладает достаточно высокое споообноотьс к восстановлению нитрита. Тем не менее оуспензик этих клеток накапливапт нитрит при восстановления нитрата. По-видимому, нитрат ингибирует активность нжт-ритредуктазы в этих метках. Механизмом ингябирования может явля-тьоя конкуренция за электроны между нитратрадуктязой и нитритра-духтааой ца уровне взаимодействия о ЭТЦ. Возможно, что пр1 культивировании в присутствии ь мди синтезируется дополнительный содержащий медь перевоочик электронов к нятрнтредуктаэе, обладающий высоким сродством х ЭТЦ. Синтез этого переносчика повышает конкурентоспособность восстановления нитрита о восстановлением нитрата. Наличие двух переносчиков электронов к нитритредуктазе, один яа которых содержит медь» известно для гмибодозд« модим»« <ха»»~ пака, 19641 Р*)»*. 1931).

5. Ннгнбирущее влияние нитрита на НурЪслЦ.огоЪ1иа 2-3.

Поскольку добавление меди к среде культивирования НурЬош1о~ гоМиш 2-3 препятствует накоплению нитрита и значительно повышает урожай биомассы в расчете на перенесенные в ЭТЦ электроды, можно , предположить, что нитрит снижает эффективность биоэнергетических процессов. Для проверки этого предположения и выяснения механизма действия нитрита мы решили определить, как влияет присутствие накапливаемого или экзогенно внесенного нитрита ва урожай биомасс» ЕлрЬол1агоМша г-3 (в расчете ва попользованный метано^ в на содержание в клетках белка и ПОЩ (табл.2), В этом опыте культяеяро-. вание ПурЬооаогоМи« 2-3 веля на среде 33? с начальной концентра-

кнеЯ летаяода 0,16< >/т - 40 ы», выбранной о раочето«, чтобы акцептор влвхтронов находился в избытке, в оледутгх вариантах;

1) Анаэробно о 50 itU HOj о внесением 0,2 мкМ Си2*

2) Анаэробно с 50 мМ moJ des внесчия Cu2*

3) Аэробно о добавлением 50 м!1 »Oj

4) Аэробно без добавления ЯО|.

Таблиц» 2

Влияние нитрита не роот в состав биомассы НурЬм1огоЫиш ï-э

■ ■ ■ 1 1 i ■—■■■'■i ■- ---;-...........

:Налн-: На- : : Конечные ; Остаточны«

Акцептор : тле :чаль-s К, :-———---—•:•"----------—j-~

вдектронов:-„2+: ныЛ : т:Сухой:Белок.: ÏÏ0MK,: сн,он»: КО-,,: во,, : f1 ï ma- ¡чае :ввв. ,,í Í от : ? от : * : *х ~ :(0,2 iKa2 : r/r :оухого:оухого: мМ : мМ: «M _; ыкМ): мМ : ¿СНч<Ш! восп 1 В9°а ;

SO мЫ BOj

02 воздуха

Снижение в присутствия нитрата урожаяв раочеты не попользованный метанол» ониженяе содержания белка в метках ■ накопление ПОДО, синтез которое требует меньше энергия» свидетельствует ö тс», что нитрит для Byphoalorobiue'2-3 является вгеэтом, частично нарушапаим сопряжение переноса электродов £ фоо$ораллровавия, подобно. тому, как »то .имеет место у Po.d«nltrlfio»ne, i*ta«ruet»o«* и fa.putld* <H*j*r •t «1., 1979» Керш, 1980).

Для Hjrphoalorobtua г~3 маловероятен механизм ангибиргвенся, вредполагапииЗся по косвенным данным дня Bypbonicroblim х(И«1-b«v« «t «1., 19во) - ннгибироьакве переаооа электронов в 3TU., так как, если бы питрит жнгибирсвал перенос моктролев в ЭШ, яеенм-катически окисляя г*2+ переносчиков, как «то первоначально предполагалось ДДЯ Р».а»гив1п9" (Row «t «1., 1979)* ОН Сам бы -восстанавливался и удалялся иэ среды оря народном жультивирова-

♦ - 0,03 Ô.34 60 2 0 14 4

0.08 0,32 68 0 14 4

_ - 0,05 0,20 48 14 0 I 29

0,05 0,19 44 0 I 33

+ 0,075 0,41 72 2 0 чя

0,075 !0,42 76 0 - «Я

+ 50 0,025 0,34 45 14 a - 46

0,025 0,30 4G • a 46

нии, чего в наших опытах не набл«далось, Бели нитрат внгибароьал бв перенос алехтронов в ЭТИ каким-то ивы» образом, то, по-видимому,' снижалась бы скорость роста, во не урожай.

6. Э&екишзость аэробного я анаэробного катаболизма метанола

у НурЬо.. »о гоЪ 1ш» 2-3 н В7рЬот1с гоЫш» XV,

Между штаммами нурЬоюЛогоЫиа г~у я гч нами были обнаружены значительные различия в скорости роста и урожае при анаэробном развитии о нитратом, особенно в присутствия сп2+ (рио.1). Это добудило нас сравнить скорости роста и урожаи этих штаммов я пря аа-робном культивирования. Б табл.З сопоотавлены характериотяяи роста ж состав биомассы НурЬ«в1сгоЫшв 2-3 я ИгрЬот1е*оЪ1им 2Г после аэробного и анаэробного роста с начальной концентрацией метанола 0,16^ т/т ■ 40 мМ, выбранной с раочетом, чтобы акцептор электронов находился в избытке.

Таблица 3

Характеристика роста и состав бкомаосы нурЬоаЮгоЫиш х-Э и нурЬои1огоЪ1шп гт при аэробном в анаэробном ростес 50 Ш >0* в присутствии 0,2 мкЫ си2*

* ■ 1 * * * 1 " • . » « . , » Конечные » Остаточные

Штат • : Акцептор ; адоктроаов * * • : ^*.:Сухой:Еадок,: поык,:св,ш, :чпг,-1: вес,; % от : % от : 3 .час . гуг ;сухого:сухого: ш '■ 1С1Ц0Н: вооа : веоа : "" * * : ! Ш * »

1-У 60 м 0,03 0,08 0,34 0,32 68 .60 * 2 0 0 14 14 4 4

0>2 воздуха 0,075 0,075 0,41 0,42 72 76 2 0 0 —

хт 50 ми мо" *0,02 0,03 0,12 0,17 43 50 28 0 0 **

(¡2 воздуха 0,085 0,065 0,34 0,27 54 50 9 0 0

АвробшЛ рост штаммов нурЬовЛогоЫиа г-э к г? разлжчаэтоя сравнительно мало. Анаэробное культивирование пря внесении с»2* выявляет большие различия между этими атаммами в скорости я эффективности анаэробного роста о нитратом и метанолом.

Hyphomlorabtun zt имеет низкую скорость я эффективность анаэробного роста о аятратом независимо от присутствия Cu2+, При развитии в таких условиях накапливает в клетках значительное количество ПОМК.

arpboeloroMu» z-э обладает высок 2 скоростью к эффектность» анаэробного роста о аятратои в прясутотвяя Сц2+. Состав биомассы в таких условиях характеризуется высоким содержанием белка к яязглм содержанием ПОНЕС. Урожай, скорость роста я соотаа биомаооы этого штамма в аэробвхк я анаэробных услошях примерно одинаковы.

При аэробном культивировании бактерий я дроджей на метанола урожай у различных ях предотавятелеЯ варьирует от 0,19 до 0,45 г сухой биомассы на I г метанола (соовву, Ьет1де, 1972), достигая у отдельных культур 0,5 г/г (ran Dijkaa, Border, 1975). По литературным данным, анаэробный рост данятрцфикаторов характеризуется меньшим урокаем, чем их аэробный рост (Koike, Hattorl, 1975*4 atott-thomep «t «i., 1982). Таким образом, походя иэ литературных данных до урожаи бактерий я-дроххей яа метаноле л аэробных условиях и по сравнительной эффективности плодородного дыхания я дэ-нигрифякацил, можно предположить, что Hyphomiorobiua z-Э обладает предельно эффективным катаболизмом метанола при деяитрлфикаоии.

В настоящее время во многих странах проводится поиск культур микроорганизмов, перспективных для получения кормового белка из метаиола. Разрабатываются методы аэробного получения бвомаосы. При наличии штамма, дающего высокая урожай в анаэробных условиях, замена кислорода на нитрат моле г быть экоыомяческн выгодной,

7. Влияние аэрации на состав продуктов метидотрофной донит-рификгхдаа.

Для денитрификация в почвах известно, что уоиленяе аэрации снижает скорость процесса и повышает отношение к^^^г* Фязяолого-биохимический механизм повышения отношения 120/ы2 не изучен. Это явление может быть объяснено тем, что м2о-редунтаза из всех ферментов денитрификации наиболее чувствительна или I) к инглЗирова-ик» аэрацией актявнооти фермента, или 2) к репрессии аэрацией его синтеза.

Мы последовали влияние аэрации аа активность ферментов да нитрификации у Uyphomicrobiua я Ht, синтез ферме иго в деантри^ика-цаи у Byphomieroblu« 2-3 и ilyphomlorobtue ZV. Ферменты донитоз-

иоследовались в данном случае по способности суспензия клеток восстанавливать ЯО3, ко^ я я2о за счет метанола.

Влияние аэрация на активность ферментов дэнитрификации оценивали, инкубируи одновременно о нитратом (или В2о) и кислородом суспензии клеток Hyphomicrobiua z-э» собранных после анаэробного роота о нитратом. Суспензии в таких опытах инкубировали.в ферментере "Biotek" с киолороднны адактродом при интенсивном перемешивание. Кислород вводили в газону» фазу (инертный газ или - кгО) в начале опыта.

На рис.2 представлена влияние Og aa воостановление к^О клетками Hyphoelcrobim« z-З. Вначале клетки восстанавливает только 0^. Медленное восстановление жго начинается лишь пооле снижения концентрации растворенного кислорода, tto изменению скорооти поглощения в это время можно сделать здвод о том, что эта концентрация примерно равна 1-2 К^ цитохромокиодазы. При дальнейшем ожижения концентрации растворенного &> окорооть вооотааовлеяия Я20 ■ становятся максимальной.

Несмотря на янгибирухвдее влияние кислорода на н20-редуктаяу BrpboaleгоЫш» z-Э, мы не обнаружили образования эакно* азота жэ нитрата суспензиями клеток этого штамма в присутствии различных концентраций растворенного кислорода. Денитрификации либо на про-

100 минуты

20

60

всходило, либо образовывался только н2, Такая образом, у НурЬ»-я1вгоЫид) актхввооть ыго-родукгаэы ял гиб пру б тел аэрацией а« сильнее, чем активность других $ермептов да нитрификация, Дейотши аэрации на активность ферментов денитрпфякапви у этого организма а« ираводкт к оЗраэоьашш и2о из «Оу

Чтобы выяонять влияние авраоти на синтез ферментов дэаитрлфя-кадаш, клетки собирала юане аэробного роста и инкубировали а анаэробных условиях о нятретом, нитритом или иго .Для сравнения исследовали улотки, »крашенные анаэробно о нитратом иди вго .

В клетках ВурЬои1сгоЪ1ит г-З из экоиоввнцналыюв фазы аэробного роота активность всех ферментов денитрификации весьма низка. Одвако вскоре после наступления линейной фзвч роста в кдетмйх обнаруживается достаточно высокая активность нитрат- и нятритре-думвэ, но аз в2о-радустазы (табл.4).

Клвгхи НурЬом1сгоЫшп гч поола аэробного линайяого роота ■сакжа имели »ыооуу» активность нитрат- и нитритредуктаз в ниэкув активность и2о-редуктазы (табл.4).

Таблица 4

Влияние уоловнй культивирования на ферменты денитрификации

* » Организм ; * Условия кулыввиро&ания : Восотановлениевкцептооов : г суспензиях, помешенных : в анаэробные условия т :мкт-ат-ж .чао--1 .иг белка А

• * : но" ■ щ \ Иг°

НурЬом1огоЫшв г-Э аааэробно с во^ анаэробно о »го аэробно (линейный роот) 3,5 х.з 1.0 3,3 5,0 0,8 4,0 0,14 0,02

ЦурЬохаХо гоЪ1ш» авробно (линейный рост) 1.0 1,0 0,006

Твккм образом, дорепрессия епктезе нитрат- ж дитритредуктез ВтрЬот1агвЫшь г-Э о НурЬоп1агбЫил VI наступает в ляниЗноЙ флзе роста, то есть в условиях, когда концентрация рзстворснчсго кислорода начинает л л*:: тировать скорос*© роста.,

Икгг.бирущео злиднлв кислорода на (зрменты дя ни трп,? якания у ВурЬою!«гоЫию г-З снимается такко при снисендо конпонтрацли

растворенного кислороде до значений, близких к к,, цигсхромокск-дазы во 02 (рисЛ).

Эти данные согласуются о предположение« (з^и^адог, 1976)* что ферменты денлтри^и'чацпи регулирует не кислород сам ао себе, а здияицг, которое он оказывает на степень восстановленноотя переносчиков ЭТЦ, и что активность и синтез ферментов деяитрифпкации регулируется координирование.

Э то же время исключительно высокая чувствительность синтеза {но на активности) я2о-редуктазы нурЬом1егоЫиа 7,-у к аэрации противоречит этой проотой модели.

8. Образование таяиси и окиси азота при переходе от аэробиоза к анаэробиозу.

Суспензии клеток НупЬо*1ег©Миа гч, собранных после аэробного линейрого роста обра&уот из нитрата лишь Я£о (рио.З),

Суспензия клеток НурЬопЛогоМшв 2-3, собранных после аэробного линейного роста, при анаэробной инкубации о нитратом образует, помимо н2,закись и окись азота (рис,4). Промежуточным продуктом является нитрит. Образовсние закиси азста особенно заметно при длительной инкубации. Через 20 часов около половины азота нитрата сказывается в составе к2о (рис.45). Напротив, суспензии клеток ЕурЪот1агоЪ1лш 2-3, выращенных аназробко с нитратом, на образуют * анаэробных условиях газообразных продуктов иных, чем а2.

Таким обрезеш, основным газообразном продуктом денитрификации у аур^олЮгоЫия г-З я у НурЬояАсгоЪ1иш 27 при переходе от аэробиоза х анаэробиозу является закись азота. Уехакизмом является большая чувствительность ечнтеза »20-редук1ази к репрессии аэрацией по сравнению с синтезом других ферментов денитрификации.

Полученные да ннкс-могут иметь определенное значение для практики. Существующие технологические проехты очветвыл сооружений предусматривают после анаэробного тенкя аэробный для удаления из-, быточаого метанола, причем отстойник между ниуи не предусматривается, а избыточная ^иоыэсса из после №его азробзого танка возвращается в ана?робый< танк. К.1ши денные показывают, что а случае образования нежелательных гезообразных продуктов причину можно искать в переходных прокеосах, которым подвергается метшютрофные деинтрк^икаторы оси такой технологии.

Рпс.З Восстановлен« нитрата клетками ЧурЬом1огеЪ1ив г?, вчрчщеиными аэробно.

3 А чэсн

ус ЦО-Ы

' СО часы

^ис.4 Восстановление нитрата клетками ПурЬс>т1огоМша г-},

выращенными аэробно

9. Перенос электронов от метанола к нитрат; у НтрЬсшигоЫш

Л-3.

Для Ро.а®э1Лг1*1сала предложена оло дующая схема переноса Электронов при де нл трифика дай за счет метанолэ (ВатГогШ, Спел«» !

С02 -----т- ВСООН -^НСЕО -»—^-- СЕ^ОД

формнэт- формальдегид- метанол-

дегидрогаивза дегидрогеназа дегидрогенаэа * . $

КАДН дкгохром Ь -цитохром в

^ Ф .

нитрат- нитрит-

редщстаза редуктаза

&'0~ £;о~---> Ко

Эта схема экстраполируется. к на гифсмикроОов <ь&гв« «1; , 1970; 1С*1Ьег£, 1979), Согласно схеме, электрона к пктрету могут быть первнеоены от формиата я формальдегида, но яе от метанола (от наго они могут быть перенесены к ио^, яо, в2о).

Расчет покаангает, что дажз нри условии наличия НАД-зашговмоз формальдегидовгидроганезы схема ив допускает накопления нитрита в количестве , превншатем 2/3 восстановленного нитрата. Учз? ассимиляции формальдегида далаэт эту цифру еще меньше. Однако наки обнаружено, что КурЬоиНегоЬхшя г-3 при анаэробном росте с Нитратом я метанолом в отсутствии ионов накашивает нятрят в количе-

стве, составляющем 60-90Я от воссталовлзнного нитрата. Более того, после аэробного лянеСного росте в отсутствие Си2г клетки НурЦо-ш1сюЪ1тш 2-3, переведенные в. анаэробные условия, почти стехио-метрическя восстанавливают нитрат в нитояу за счет метанола.: Скорость восстановления за счет эндогенных .субстратов много ашке.

• Одним из объяснений наблюдаемого явления могло бн'бнть наличие у НурЬотШгоЫим 2-3 необычной мб тонолдегидрогенаэа или нит-рзтрйдукгвзы, когорте реагировали ¿¿г с ЪТЦ в тих участках, чем указанные на принятой схеме.

Мы ясследовали свойства натратредуктазы и метаноллегздрогена-эы в экстрактах клеток аэробно вираценной культуры НурЬопИого'Ылш . 7>-3,обладавшей укаааяным свойством почти стехкоызтрическя восстанавливать нитрат в нитрит за счет метанола посла перехода в аза^ робные усковяя. Полученака данные свидетельствует с наличии обычной дкеекмйдяцконной яигратредуктазы А г стандартной бякггриалвяой ме-танолдэгидроганазы. Кроме того, наш получени сдаитрн целых клеток НурЬош1сгоЫит 2-3, показывающие окислейяе >шпогрома ь, но на цитсхрома о, нитратом и восстановление ад^о-рома с, яо не Ъ,

этанолом, авляхшимоя. одами к« субстратов метанолдагядрогена эу.

Ряс,5 Восстаноадеаяэ гштохро-ма в этанолом н окисление цитохрома ъ нитратом в клетках НтрЬош!сгоМим г-з»

Диф£еренцйальныа опвктра;

A.

Б. С2В5ОН + + дитяонят

B. дитиоаит

- без добавок;

- без добавок;

- дятноннт +

+ X о

э*

Таким образом, наблцдаемый процесс восстановления нитрата в нитрит за счет метанола клетками ЕурЬотЛегоМш« г-Э осуществляется в участием обычных ферментов я происходит с переносом электронов от автохрома в к цитохрому Ъ. Такая возможность не учитывается в литературе но ЭТЦ металотрофных денитрификатсров.

Приведенные на рис.5 спектры даьт основания полагать, что перенос электронов от цитохрома Ь к цитохрому с* происходящий при воестановлении нитрата в нитрит за счет метанола, идет против градиента окислительно-восстановительного яотенцеалэ. Вели бы цято-хром ь, передающий электроны на нитратредуктаэу, имел бы потенциал больший или равный потенциалу цитохрома о, принимающего але 1<гроны от метзнолдзгидрогена?н, то цягохром ь должен был бы восстанавливаться в присутствии метанола, а цитохро.ч о окисляться л присутствии нитрата. По-видимому, перенос электронов против градиента окяслительно-воссъ'аьовительного потенциала происходит за . счет того, что при одновременном присутствии метанола и нитрата цитохром ъ все время находится в ониоленном, а цитохром о-в восстановленном состоянии, и реакция становится тэрмодаясмячески закономерной.

10. О возможности использования способности к данитрификации в качестве видового признака у ги$омикробов.

Род, ЯтрЬот1сгоЬ1ип изучен недостаточно, Свотематика его на видовом уровне а настоящее время отсутствует. Возникает вопрос* нельзя ля считать способность части представителей рода к денитрификация видовым признаком?

Кач показали Аттвуд я Харде? (А^еюЛ, НдгЛвг, 1972), и

подтверждают ааии результаты, гифомикробы, способные к" денитрификации, легко выделяются из разлачных естественных местообитаний. В то же время нами показана неспособность к деяитрвфикацни ряда штаммов, выделенных е аэробных условиях, Наши опыты о накопительными культурами яитрификаторов показали, что гифомикробы, неспособные к денитрификация, могут обнаруживаться в условиях, благо-пряятотвушшх процессу. Таким образом, группы гифошкробов-денжт-рификаторов и неденитрификаторов, по-видимому, сравнимы по мощности и с этой точки зрения разделение рода по признаку способности к денитрвфгкацви могло бы быть возможные. Однако наше исследование физиологии денитрифшшции у гяфомикробов показало, что атаммы гяфомикробов резко различаются по скорости я эффективности использования метанола при денитряфикзции, составу накапливаемых промежуточных продуктов, по способности к росту о закись» азота, по потребности в нонах меди.

Различия в физиология денитрификации у гяфомикробов скорее всего имеют под собой энзимолэгическое обоснование, что позволяет предположить, что ферменты денитрифшсаедя появилиоь независимо в двух или более группах гифомикробов.

Считается, что при денктрификация за счет метанога необходима "точно сбалансированная" работа ЭТЦ (см,стр.18). Дели бы это было так, то неоднократное эволюционное иозндкневенке способности к денитрифшшции с метанолом у гяфомикробов выглядело бы маловероятным. Казалось 6«, о том же говорит и устоявшееся представление м узости круга организмов, способных к деяитрификации о метанолом.

Наши данные, полученные с ВурЬот1сгаЪ1ит г-Э, показывают, что особой сбалансировонноста работы ЭТЦ при денитрификации с метанолом не требуется. Возможен перенос электронов от цитохрома с, восстанавливаемого метачолом, к цитохрому ъ, окисляемому нитратом. Выделение штамма 2-100, спосооного к денитр:' ;;:кзшш с метанолом и яа похожего на гифомикробов и рс.аепллг!г1сцпз, показывает, что круг метилотрофных денитри^икаторов и;ре, чем считалось. Этот факт

также говорит о том, что неоднократное возникновение способности к денятрификацкя с метанолом, в том числе внутри рода Нурьоааого-Мша, вполне возможно.

Таким образом, полученные нами данные позволяют утверждать, что разделение рода НурЬовЛогоМив по признаку способности к д®-нятрификацни нецелесообразно.'

ВЫВОДЫ

1. Способность к денитрификация за счет метанола обнаруживается не у всех штаммов гифомикробов.

Гифомикробк, споообные к деяитряеякации о метанолом, представляют собой гетерогенную группу. Они различаются по окороотх роста и эффективности использования метанола при денитрификация, ооотаву накапливаемых промежуточных продуктов восстановления нитрата, по способности к росту о закиоью азота.

2. Метклогрофная денитрификация даже в строго анаэробных условиях и при нейтральном рН может сопровождаться накоплением промежуточных продуктов - нитрита и закиои азота, прячем их состав различен у разных штаммов.

Присутствие ионов меди (0,1-20 мкМ) предотвращает накопление как но^, так и иго. единственным продуктом метялотрофной дэнит-рификация становится 32,

3. Чередование аэробных и анаэробных условий при метилотроф-вой денитрификэцки ведет к образование закиси азота, что объясняется тем, что синтез 1Г20-редуктазы репрессируется при значительно более низких концентрациях растворенного кислорода, чем синтез других радуятаз денитрификация.

При переходе матклотрофных денитрификаторов от аэробных увло-.аиЯ к анаэробным может образовываться также окись азота.'

4. У штамма НурЪоШ.огоЫшп 3-3 может происходить перенос электронов от метанолдегпдрогекаэы к иитратредуктазе, что противоречит принятым представлениям о функционировали ЗЩ метилотроф-ных денитрНкка торов.

5. Выделение байтерияльного штамма, отлкчаюэегооя от Нурьо-«1с5гоЪ1^л и Рагаооссив deni.trtfi.eane я способного К денитрифкка-

ция о метанолом, показывает, что круг организмов, способных к осуществлению «того процесса.не отодь узок, как считалооь ранее.

Спкоок работ, опубликованных по теме двооертапии.

*

1. Лебединский A.B. Роот HypbosLltrobiua о различными акцепторами электрона. - Микробиология, I9SI, т.50, » 4, с.665-669.

2. Лебединский А.В., Веденина И.Л. Образование закиси и окиси азота метилотрофными денитрификаторамя. - Микробиология, 1981, т.50, Ä 5, 0,757-762.

3. Веденина И.Я., Лебедянский ¿.в. Влияние меди на состав продуктов денитрификацни у гифомикробов, - Микробиология, 1983, т.52, * 6, 0,917-923,

•

4. Лебединокий А.В,, Головачева ^.С, Термофильный Hyphoelo-гоЫия. - В сб.: Термофильные михроорганиамы в природе и практике народного хозяйства. Тез.докл., Москва, 1963, с.57.

5. Лебединский A.B. Метилотрофная денитрификация как метод счистки сточных вод от нитратов. - В сб.; Биология культивирования я использования микроорганизмов в народном хозяйстве. Тез. докл., Ташкент, 1983, с.45,

6. Веденина ПЛ., Лебединский A.B. Превращения закиси азота при денитрификацки, диссималяадонном образовании аммония к нитрификации. - Успехи микробиологии, 1984, т.19, с.135-165.

Т-04306.Подписано к печати 16.05.84г.Заказ » 112,Тирах 150 экз.

Бюро множительной техники Института полиомиелита АМН СССР.