Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Участие экзогенных дегидрогеназ в метаболизме. Экспериментальные аспекты

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Участие экзогенных дегидрогеназ в метаболизме. Экспериментальные аспекты"

С- • I.!.'-.!

На правах рукописи

ГОЛЕНИЩЕВ ВЛАДИМИР ЮРЬЕВИЧ

Участие экзогенных дегидрогеназ в метаболизме. Экспериментальные аспекты

03.00.04-Биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

УФА - 1997

Работа выполнена на кафедре биологической и клинической химии Самарского государственного медицинского университета

Научный консультант: доктор медицинских наук, профессор Ф.Н.Гильмиярова

Официальные оппоненты:

член-корреспондент РАЕНдоктор медицинских наук,

профессор В.И.Рубин доктор медицинских наук,профессор Н.А.Терентьев доктор медицинских наук,профессор Н.А.Терехина

Ведущее учреждение - Московский государственный университет

им.М.И.Ломоносова

.¿.с? 1997 года в "_

Защита состоится " --> " ^г_1997 года в ". № часов

на заседании диссертационного совета Д 084.35.01. при Башкирском государственном медицинском университете по адресу:

г.Уфа, ул.Ленина,д.З. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Башкирского государственного медицинского университета.

Автореферат разослан "_"_ 1997 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук, профессор

Э.Г.Давлетов

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. В настоящее время одной из ординальных проблем является поиск средств щадящей коррекции настенного метаболизма. В этом плане научный интерес фокусируется ia средствах биогенной природы родственных организмов, обла-(ающих высокой биологической активностью. Уникальные свойства ферментов, лежащие в основе высоко специализированных функций, !Ьшолняемых в организме, служат объектом постоянного изучения Видершайн Г.Я., 1980, Розенфельд Е.Л., 1982, Муронец В.И., Наградо->а Н.К., 1984, Строев Е.А., 1986, Наградова Н.К., 1990, Курганов Б.И., 992, Лущак В.И., 1992, Хорст А., 1982, Ленинджер А., 1985, Srere P.A., ,985, Лоуренс Д.Р., Бенитт П.Н., 1993, Beckmans S., 1993, Higushi Т. et il„ 1994).

Длительный период в развитии энзимологии характеризовался це-тенаправленным исследованием структурных и функциональных особенностей ферментов, выделенных из различных источников, поиску способов очистки, стабилизации, пролонгирования возможности использования (Левин Ф.Б. с соавт., 1979, Тривен М., 1983, Ashmarina L.U. et. al., 1982, Муронец В .И., Наградова Н;К., 1984, Коган A.C. с соавт., 1988).

На базе этих данных сформировался прикладной аспект науки о ферментах, аргументирующий возможность применения их в качестве лечебных средств. Наработки в этом направлении, безусловно, значимы для медицины и позволяют компенсировать различные патологические состояния (Музыченко Н.И., 1987, Лещинский Л.А. с соавт., 1989, Филин В.И., 1991, Харкевич Д.А., 1993, Метелица В.И. с соавт., 1995, Abraham D. et al., 1985). Известен опыт применения гидролитических ферментов при гипо- и аферментемиях пищеварительного тракта, лизо-

сомных болезнях накопления протеаз с антигемостатическим эффекто лиаз и гидролаз, каталитическое действие которых при введении в с ганизм больного обеспечивает задержку опухолевого роста, развит ряда вирусов, деполимеризацией соединительной ткани (Вольф 1\ Рансбергер К., 1976, Березов Т.Т., 1984, Карсакевич A.C., Вина И./ 1985, Пыриг A.A. с соавт., 1986, Кривошеев Б.Н. с соавт., 1987, Труно О.В. с соавт., 1989, Никифоров Н.Д. с соавт., 1990). Перспективен р; работанный метод инкорпорирования ферментов, другого биологи1 ского материала в структуру липосом (Торчилин В.П. с соавт., 19! Грегориадис Г., Аллисон А., 1983, Дворкин В.М., Видершайн Г., 1984). До настоящего времени отсутствуют данные об энзимотераш тическом применении оксидоредуктаз. Оценивая их исключительн; роль в обмене, анализируя сведения о фермент-ферментном взаи\ действии у нас сложилось представление о возможности оказания, п введении дегидрогеназ, на молекулярные процессы организма не то: ко узкоспециализированного, обусловленного конкретным каталити ским эффектом, но более генерализованного воздействия.

Цель настоящего исследования заключается в обосновании в можности и целесообразности применения препаратов дегидрогена качестве биогенных средств энзимотерапевтической коррекции мета' лизма.

Для достижения данной цели были поставлены следующие

ЗАДАЧИ:

1. Получить в препаративных количествах, очистить до гомог ного состояния малатдегидрогеназу и лактатдегидрогеназу из живот го сырья.

2. Изучить в динамике влияние экзогенных дегидрогеназ на состояние углеводного и белкового метаболизма на основании оценки 1ктивности глутаматдегидрогеназы, аспартатаминотрансферазы, ала-чинаминотрансферазы, малатдегидрогеназы, лактатдегидрогеназы, х-глицерофосфатдегидрогеназы, глюкозо-б-фосфатдегидрогеназы, аль-^олазы, НАДФ-Н- и НАД-Н-оксидаз в митохондриях и в цитоплазме различных тканей и содержания интегральных метаболитов: глюкозы, палата, оксал о ацетата, лактата, пирувата, a-глицерофосфата, диоксиа-детонфосфата, 2-оксоглутарата, глутамата, мочевины в крови и мио-<арде, скелетных мышцах, печени и мозге.

3. Исследовать взаимодействие экзогенных лактат- и малатдегид-зогеназ с естественными компонентами тканей и выяснить характер метаболического эффекта, его направленность, продолжительность в условиях in vitro.

4. Визуализировать экзогенные дегидрогеназы путем введения ра-хиоактивной тритиевои метки в фермент с сохранением их свойств и истивности для изучения распределения ферментов в тканях организма зеципиента.

5. Дать общую оценку результатов исследований in vitro и in vivo и сопоставить с топографией экзогенных ферментов в организме с помощью изотопного исследования.

6. Определить преимущественные органы и ткани-мишени связы-зания и проявления метаболических эффектов вводимых малатдегидрогеназы, лактатдегидрогеназы, а-глицерофосфатдегидрогеназы - с целью зыяснения перспективы применения препаратов дегидрогеназ для син-фомной коррекции метаболических нарушений.

7. Разработать способ моделирования патологических проце< путем воспроизведения гиперферменгемии, используя в качестве пу вого этиологического фактора НАД-зависимые дегидрогеназы.

8. Дать обоснование возможности и целесообразности прим ния препаратов дегидрогеназ в качестве энзимотерапевтических сре, биогенной природы широкого спектра действия.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА. Впервые малатдегидрогер а-глицерофосфатдегидрогеназа, лактатдегидрогеназа, выделенные скелетных мышц млекопитающих, очищенные до гомогенного сос ния, стандартизированные, введены в организм двух видов экспери тальных животных. Установлена ранее неизвестная их мегаболиче эффективность.

Впервые в условиях in vitro и in vivo показано, что введенные менты оказывают активное воздействие на процессы катаболиз] анаболизма на органном, клеточном, субклеточном и молекуля] уровне. Впервые произведено введение тритиевой радиоактивной м в структуру лактатдегидрогеназы и а-глицерофосфатдегидрога что позволило получить новые сведения в топографии, распределе избирательности в накоплении органами и тканями экзогенных ментов, судить об органах-мишенях, регистрировать продолжи ность жизни фермента в клетке.

Создана новая модель для изучения патологических проце для выяснения механизмов формирования молекулярных сдвигов г воспроизведения дозированной гиперферментемии.

Впервые раскрыты новые аспекты взаимодействия экзоге ферментов с эндогенными компонентами тканей и органов. Обна] ны ранее неизвестные свойства малатдегидрогеназы, а-глицерофо

дегидрогеназы, лактатдегидрогеназы, их способностей проникать в ткани и фиксироваться в них, оказывая метаболический эффект, что привело к обоснованию возможности энзимотерапии с помощью препаратов дегидрогеназ.

НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ. Совокупность полученных принципиально новых сведений о механизме включения экзогенных дегидрогеназ в метаболические процессы, происходящие в организме, является платформой для выяснения патогенеза заболеваний, диагностики и энзимотерапевтической коррекции нарушений. Обоснованы перспективы применения препаратов дегидрогеназ для синдром-ной коррекции метаболических сдвигов, в частности, сопровождающихся гипоксическими состояниями.

В диагностике могут быть использованы методы выявления резервных способностей организма путем введения экзогенных дегидрогеназ.

Раскрывается возможность лечения многих заболеваний путем введения соответствующих дегидрогеназ, в частности, лактатдегидрогеназы, малатдегидрогеназы, а-глицерофосфатдегидрогеназы.

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ

1. Вводимые в организм препараты малатдегидрогеназы, а-глицеро-фосфатдегидрогеназы, лактатдегидрогеназы оказывают множественное воздействие на метаболические процессы органов и тканей организма реципиента, регистрируемые на разных уровнях структурной организации - тканевом, клеточном, субклеточном, молекулярном.

2. Распределение экзогенных дегидрогеназ, введенных извне в организм, происходит неравномерно в тканях и органах, специфично для

наблюдений, оказывает метаболический эффект широкого спектра установлено на основании суммарной оценки биохимическими ^ диоизотопными методами исследования.

3. Способ моделирования патологических процессов врожден и приобретенного характера с помощью воспроизведения гипер ментемии путем использования в качестве пускового фактора экзс ных дегидрогеназ служит инструментом для раскрытия молекуляр механизмов развития заболеваний.

4. Дегидрогеназы можно рассматривать как новое покол средств биогенной природы, направленных на синдромную орган коррекцию метаболических нарушений.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Результаты исследований были п ставлены на итоговой научной сессии Куйбышевского медицина института имени Д.И. Ульянова (Самара, 1993); на Всероссийской учно-практической конференции "Экология городов. Рессурсосб гающие и экологически чистые технологии" (Самара, 1993); на Все сийской научно-технической конференции "Интеллект и выжива Системный подход (Самара, 1993); на конференции "Биоповрежден промышленности" (Пенза, 1994); на Всероссийской нау практической конференции "Экология и здоровье человека" (Сам

1994); на VII Международном форуме "Экология человека: буду культуры" (Архангельск, 1995); на 2 симпозиуме "Неинвазивные тоды диагностики" (Москва, 1995); на 2 Национальном конгрессе профилактической медицине (С.-Петербург, 1995); на Международ научном конгрессе "Молодежь и наука - третье тысячелетие" (Мое

1995); на XI Международной конференции по нейрокиберне! (Ростов на Дону, 1995), на совместном заседании кафедры биол<

ческой и клинической химии и Всероссийского нейрохимического об-щества(Самара, 1997).

ПУБЛИКАЦИИ. По материалам диссертации опубликовано 19 печатных работ.

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ РАБОТЫ. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, главы, посвященной материалам и методам исследования, 4 глав собственных данных, обсуждения результатов, выводов, практических рекомендаций и списка литературы. Работа из-пожена на 201 странице машинописного, текста, иллюстрирована 23 ри-:унками, содержит 17 таблиц. В работе цитировано 271 источников, из ^их отечественных 109 и 162 зарубежных автора.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ. Целью выявления >ффектов экзогенных дегидрогеназ в организме экспериментальных кивотных в условиях как in vivo так и in vitro ,были выделены и очище-ш из скелетных мышц норок лактат- и малатдегидрогеназы с высокой ггепеныо очистки (438 раз). Выделение лактатдегидрогеназы проводи-тось по методу R.K. Scopes, A. Stoter, малатдегидрогеназы по методу, тредложенному Ф.Н. Гильмияровой с соавт. (1990). Удельная актив-юсть препарата лактатдегидрогеназы составляла 300 мкМоль 1АДН/мин мг, малатдегидрогеназы - 151 мкМоль НАДН/мин мг. Порченные ферментные препараты вводились экспериментальным жи-¡отным (кроликам и белым крысам Wistar) внутривенно однократно. )ценивались характеристики интегральных показателей белкового и глеводного метаболизма в крови в динамике (через 5, 20 мин. и 24 ча-а); в тканях (миокарде, скелетных мышцах и печени). Митохондрии ыделяли по методике дифференциального центрифугирования. Hogeboom I., Shneder W.C., 1953, Уильяме Б., Уилсон К., 1978). Актив-

носгь ферментов определялась в супернатанте и митохондриях. Пров< дено так же исследование влияния экзогенных лактат- и малатдегидрс геназ in vitro в условиях инкубации с митохондриями печени и миокар да. С целью изучения распределения в организме экспериментальны животных экзогенных дегидрогеназ, препараты лактат- и а-глицерс фосфатдегидрогеназы были помечены тритием. Изотопно меченны ферменты получали методом высокотемпературного каталитическог изотопного обмена с газообразным тритием (Zolotarev Yu.A., 199Г Данная часть исследования проведена нами в лаборатории Институт медицинской генетики РАМН, Москва (Заведующий лабораторией д.б.н. Н.Ф. Мясоедов). Меченные тритием лактат- и а-глицерофосфат дегидрогеназа вводились в хвостовую вену крыс в дозе 7,5 мкО/кг мае сы животного. После этого животных забивали через 1 час, 24 часа и 4 часов и проводили расчет активности в крови, сердце, скелетной мьии це, печени, головном мозге, почках и селезенке.

Определение активностей малатдегидрогеназы проводили спек трофотометрически по методу S. Ochoa (1955); лактатдегидрогеназы п методу F.Kornberg (1955); глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы по метод C.A.Ilock, P.M.Lean (1953); глутаматдегидрогеназы по метод I. Hogeboom, W.C. Schneider (1953); альдолазы по методу М.Ф.Гулого соавт. (1972); активность аспартатаминотрансферазы и аланинамино трансферазы измерялась с использованием наборов Био-Lachema ТЕСТ.

Содержание метаболитов (малата, оксалоацетата, лактата, пиру вата, глицерофосфата, глутамата и а-кетоглутарата) оценивалось спек трофотометрически специфическим ферментативным методои (Bergmeyer H.U., 1963), унифицированным сотрудниками кафедры бис

химии Самарского государственного медицинского университета (Гильмиярова Ф.Н. ссоавт., 1986).

Определение белка проводили по методу Лоури О. (1951).

Содержание глюкозы исследовали высокоспецифическим ферментативным глюкозооксидазным методом (Говорецкий В.К., 1964).

Концентрацию мочевины определяли стандартными наборами фирмы "Lachema".

Все результаты исследований подвергнуты статистической обработке с использованием стандартных компьютерных программ: AMIPro, Microsoft Word, Page Maker, Microsoft Exel.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ. Весьма перспективным направлением для решения целой серии медицинских проблем, особенно в плане фармакологической коррекции метаболизма при заболеваниях является возможность использования для этих целей ферментов. Разрешающая способность технических средств позволяет получить достаточно объемный материал, раскрывающий особенности структуры и функции сложной конформации белковой молекулы, в том числе ферментов. Получены сведения о роли отдельных аминокислот в формировании активного центра и реализации каталитического акта (Курганов Б.И., 1978, 1984, 1992, Курганов Б.И., Любарев А.Е., 1981, 1989) в поддержании нативной конформации в межсубъединичном взаимодействии олигомерных белков. Выявлена гомология идентичных доменов в ферментах у различных видов и классов, характер воздействия различных лигандов. Установлена возможность межбелковых взаимодействий (Наградова Н., 1990, Graci Е., TrombettaG., 1980, Jong Е. et al., 1993). Накопленные сведения позволяют рассматривать ферменты как уникальные молекулярные объекты, эффективность деятельности

которых определяет направленность и интенсивность метаболизма уровень жизнедеятельности тканей, органов и организма в целом. От личительной особенностью ферментов является их способность вое принимать различные информационные сигналы, реагируя на них и: менением активности. Эти данные, бесспорно, важны в теоретическо! плане и в прикладном аспекте. Путь к познанию этих свойств лежал чс рез изоляцию ферментов из обычной среды, очистку до гомогенного сс стояния.

В научной лаборатории кафедры биологической и клиническо химии Самарского государственного медицинского университета был получены в очищенном виде фосфофруктокиназа, альдолаза, <х-тпь церофосфатдегидрогеназа, глицеральдегидфосфатдегидрогеназа, ла* татдегидрогеназа, малатдегидрогеназа из тканей кроликов, норок, ч< ловека в норме и патологии (Бабичев A.B., 1985; Кириллова В.Я., 198! Радомская В.М., 1990). Эти исследования позволили выявить структу{ ную близость дегидрогеназ из тканей различных видов и установит структурно функциональные отличия ферментов при атеросклерозе алкогольной интоксикации (Купаев В.И., 1993, Орловский А.Ю., 1993)

Полученные данные привели нас к необходимости решения в< проса о возможности заместительной ферментотерапии и о перспект! вах коррекции нарушенного метаболизма путем введения в организ экзогенных ферментов. Такие данные в литературе отсутствуют. П< становка проблемы порождает серию вопросов о характере метабол! ческого эффекта, его длительности, специфичности, представительсп в различных тканях и другие.

Нам не известна продолжительность жизни фермента в организл реципиента, способность проникать через мембранные барьеры, хара:

Нам не известна продолжительность жизни фермента в организме 1еципиента, способность проникать через мембранные барьеры, харак-ер взаимодействия с молекулярными и субмолекулярными структура-ш, путях элиминации. Возникает вопрос о наличии преимущественных шшеней, тканей или органов, где концентрируется фермент и вызывает 1аиболее значимые изменения в обмене; имеет ли значение природа фермента в проявлении специфичности метаболических сдвигов и це-1ый ряд других вопросов возникает по ходу выполнения работы. Для решения поставленных задач исследование было проведено в несколько пгапов. Первоначально осуществлялось введение экзогенных лактатде--идрогеназы и малатдегидрогеназы, выделенных из скелетных мышц чорок. Фермент был получен в гомогенном состоянии с активностью 300 мкмоль НАДН/мин.мг, превышающей в 438 раз активность скелетных мышц кролика и человека. В соответствии с литературными данными характерна структурная близость для лактатдегидрогеназы и ци-гоплазматической дегидрогеназы из тканей различных животных и человека (Радомская В.М., 1990). Это позволило нам пользоваться ферментами из норок, учитывая, что фермент обладает исключительно высокой активностью.

Нами моделировались условия, при которых в гармонично протекающие процессы жизнеобеспечения клетки проникает извне биологически активное вещество, речь в данном случае о ферментах присутствующих в ней, как естественный компонент. Объектом наших исследований были окислительно-восстановительные ферменты. Один из них - лактатдегидрогеназа, заключительный фермент анаэробных превращений углеводов. Другой, малатдегидрогеназа, обеспечивающая необходимый этап окисления в аэробных процессах. Это - ферменты поли-

интермедиа-™ этих дегидрогеназ являются продуктами катаболическю и анаболических превращений белков, жиров и углеводов, они зани мают стержневое положение в метаболизме, определяя тем самым жиз недеятельность клеток, органов, организма в целом.

Так как многие заболевания являются результатом нарушенш преимущественно определенных обменных процессов, то необходимость поиска средств коррекции нарушенного метаболизма представляется весьма актуальной. Наиболее важным, на наш взгляд, являете* использование в этих условиях препаратов биогенного происхождения Особенно интересным видится изучение действия дегидрогеназ. Дегид-рогеназы обеспечивают трансформацию водорода, главного источника АТФ в живых системах. Как известно, в патофизиологической картине многих заболеваний имеет место гипоксия тканей (Меерсон Ф.З. с со-авт., 1992, 1993), что сопровождается накоплением определенного типа метаболитов при общем энергетическом дефиците. Это открывает перспективы широкого использования дегидрогеназ в патогенетической терапии множества заболеваний, характеризующихся гипоксическим синдромом.

Наряду с этим протонирование белков различного функционального назначения определяет их конформационную перестройку, меняет характер окружения в соответствующем микрокомпартменте, что, естественно, проявляется изменением функционального состояния не только данного структурного, каталитического белка, но и других территориально сопряженных процессов.

В настоящей работе представлены результаты исследования интегральных показателей метаболизма после внутривенного введения ма-латдегидрогеназы и лактатдегидрогеназы.

Планируя и проводя эксперименты, а затем, анализируя получен-ые результаты, мы ставили перед собой целый ряд вопросов. В частости, как воспринимает организм животного введенный извне фер-[ент, каковы взаимоотношения фермента с дегидрогеназами данного рганизма, будет ли ответная реакция метаболизма, если да, то на ровне каких метаболических путей: непосредственно связанных с ка-ализом данными ферментами или отдаленных. Избирательно ли реа-ируют ткани на циркулирующий в крови фермент, насколько велика родолжительность нахождения фермента в кровеносной системе, пе-иод его полужизни. Безусловно, очень на многие вопросы предстоит ще ответить. Накопление этих знаний позволит создать базу для прин-ипиально новой энзимологии, основанной не только на данных, полу-енных в результате опытов in vitro, а энзимологии, базирующейся на >актах, отражающих status vivo. Данные экспериментальные исследо-ания - источник новых данных, первых сведений. В соответствии с поученными результатами введенный фермент циркулирует в крови в те-ение суток (табл. 1).

Так, активность лактатдегидрогеназы после введения в кровь по-ышается особенно резко к 20 минуте, затем спустя 24 часа она сни-сается, не достигая исходного уровня. Эта закономерность прослежи-ается и в случае введения малатдегидрогеназы, то есть в этом отноше-ии обе дегидрогеназы ведут себя одинаково, не проявляя особой специфичности.

Интегральные показатели углеводного и белкового обмена в крови кроликов на фоне внутривенного введения экзогенной лактатдегидрогеназы

Показатели Исходные показатели п=25 (М±т) Через 5 минут п=25 (М±ш) Через 20 минут п=25 (Mim)

Лактатдегидрогеназа, мкмолъ НАДН/мин.мг 0,016±0,001 0,06010,004** 0,07310,005**

Лактат, мкмоль/мл 4,09110,176 3,51010,180** 3,39610,143**

Пируват, мкмоль/мл 0,14710,007 0,11710,005** 0,09010,009**

Глюкоза, мкмоль/мл 4,02410,188 4,82110,282* 6,28210,394**

Альдолаза, мкмоль НАДН/мин.мг 0,002+0,0001 0,00310,0002* 0,00510,0002*

а-Глицерофосфат, мкмоль/мл 0,58410,022 0,57010,030 0,69210,040**

Диоксиацетонфосфат, мкмоль/мл 0,15610,006 0,14010,010* 0,11810,004**

Малатдегидрогеназа, мкмоль НАДН/мин.мг 0,025410,002 0,01610,001** 0,03410,002**

Малат, мкмоль/мл 0,46210,041 0,31110,039* 0,28610,027**

Оксалоацетат, мкмоль/мл 0,20810,015 0,24210,016* 0,14110,013**

Глутамат, мкмоль/мл 0,10610,007 0,12810,008* 0,15810,004**

2-оксоглутарат, мкмоль/мл 0,08610,006 0,07510,004* 0,04410,004**

Мочевина, мкмоль/мл 4,7910,26 5,1310,15* 4,9910,18

*р< 0,01, **р< 0,001

Введение лактатдегидрогеназы сопровождается изменением концентрации лактата (-17%) и пирувата (-38,8%), что вполне естественно учитывая пополнение эндогенного фонда лактатдегидрогеназы. Однакс

изменения отмечаются и в других сопряженных с лактатдегидрогеназой реакциях и в несопряженных системах.

Предметом более детального изучения были показатели азотистого метаболизма. Прежде всего глутамат - коллектор аминогрупп, метаболит, используемый по множественным путям обмена. Количество глутамата увеличивается к 20 минутам и значительно превышает норму (+49%).

Уровень 2-оксоглутарата также выше контрольных показателей. Направленность процесса такова, что соотношение между количеством глутамата и 2-оксоглутарата имеет тенденцию к снижению в течение 24 часов. Необходимо отметить, что интенсивность азотистого обмена возрастает спустя сутки, о чем свидетельствует количество мочевины. Уровень мочевины остается в пределах нормы в течение первых суток и увеличивается к исходу 24 часов.

Процесс трансаминирования усилен, что выражается увеличением активности как аланинаминотрансферазы, так и аспартатаминотранс-феразы. Эти изменения отчетливо проявляются в первые 20 минут наблюдений и к концу суток практически приходят в норму. Вполне согласуются с этими результатами количественные перепады содержания малата и оксалоацетата. Так, если в норме соотношение этих метаболитов составляет 2,2, то спустя 5 и 20 минут после внутривенного введения лактатдегидрогеназы эти показатели равны 1,3 и 2,02 соответственно. Введение лактатдегидрогеназы стимулирует и аэробные окислительные процессы, приводит к увеличению активности малатдегидро-геназы. Однако необходимо отметить, что в первые минуты после введения фермента активность малатдегидрогеназы оказывается ниже контрольных величин в среднем на 36%.

Принимая во внимание интегральную функцию крови, для получения более полной картины о непосредственном взаимодействии вводимых дегидрогеназ с ферментными системами тканей, нами изучены показатели обмена в сердечной (табл. 2) и скелетной (табл. 3) мышцах. Результаты этих экспериментов показали, что экзогенный фермент, поступая в кровь, может проникать далее в ткани. Об этом свидетельствует, во-первых, увеличение в тканях активности анализируемого фермента и, кроме того, изменения, происходящие в метаболическом статусе.

Сравнительный анализ результатов исследований в миокарде и скелетных мышцах показывает, что прослеживается специфика обмена тканей: создается впечатление, что миокард менее заинтересован в дополнительном поступлении лактатдегидрогеназы. Активность фермента хотя и увеличивается, но менее значительно, чем в скелетных мышцах. Скелетные мышцы, энергообеспечение в которых преимущественно осуществляется за счет анаэробных процессов, более активно насыщаются экзогенной лактатдегидрогеназой и это выводит их метаболические параметры на иную, более высокую ступень. Проявлением этого служит увеличение процессов трансаминирования, перепады концентраций глутамата, 2-оксоглутарата. Не исключено, что скелетные мышцы имеют рецепторы, возможно, не узкоспециализированные, однако способные отличить тетрамер от димера, в данном случае лактатдегид-рогеназу от малатдегидрогеназы. Этим обусловлен характерный метаболический эффект, вызванный экзогенным ферментом.

Интегральные показатели углеводного и белкового обмена в миокарде кроликов через 24 часа после внутривенного введения экзогенной лактатдегидрогеназы

Показатели Контроль (М±ш) Опыт (М±ш)

Лактатдегидрогеназа,

мкмоль НАДН/мин.мг

Супернатант 1,923+0,134 3,262±0,167**

Митохондрии 0,098+0,0018 0,048±0,0052**

Лактат, мкмоль/г 5,777±0,216 4,659±0,290*

Пируват, мкмоль/г 0,152+0,004 0,177+0,0095*

Глюкоза, мкмоль/г 3,04±0,182 3,34+0,217*

Альдолаза, мкмоль

НАДН/мин.мг

Супернатант 0,120±0,004 0,146±0,006**

Митохондрии 0,012+0,0007 0,016±0,0005**

а-Глицерофосфат, мкмоль/г 1,108+0,024 1,304+0,015**

Диоксиацетонфосфат, мкмоль/г 0,430+0,0085 0,304+0,015*

Малатдегидрогеназа,

мкмоль НАДН/мин.мг

Супернатант 5,529+0,336 4,244±0,133**

Митохондрии 0,722+0,041 ■ 0,587±0,031*

Малат, мкмоль/г 0,527+0,029 0,865±0,059**

Оксалоацетат, мкмоль/г 0,045±0,006 0,119+0,008*

Аспартатаминотрансфер., мккат/л

Супернатант 1,711 ±0,053 1,594+0,042*

Митохондрии 3,110+0,098 3,393±0,068*

Продолжение таблицы 2

Контроль Опыт

Показатели п=25 п=25

(М±ш) (М±т)

Аланинаминотрансфер, мккат/л

Супернатант 2,032±0,099 1,813+0,084*

Митохондрии 3,548±0,169 3,94910,147**

Глутаматдегидрогеназа, 0,084±0,004 0,059±0,003**

мкмоль НАДН/мин.мг

Глутамат, мкмоль/г 0,385±0,041 0,53210,032*

2-оксоглутарат, мкмоль/г 0,122±0,0054 0,09510,0051**

Мочевина, мкмоль/г 2,527±0,245 3,565±0,453**

*р< 0,01,**р< 0,001

Что касается миокарда, то наблюдается несколько иная карта взаимодействия малатдегидрогеназы с системами функционирующе кардиомиоцита. По-видимому, преодолевается не только цитозольнь но даже и митохондриальный барьер, о чем свидетельствует характ отношения активности митохондриальных и цитоплазматических ш нинаминотрансферазы, аспартатаминотрансферазы, глутаматдегидр геназы. Интенсификация азотистого обмена проявляется увеличени количества мочевины, глутамата при снижении содержания 2-ок< глутарата.

Таблица 3

Интегральные показатели углеводного и белкового обмена в скелетных мышцах кроликов через 24 часа на фоне внутривенного введения

экзогенной лактатдегидрогеназы

Показатели Контроль п=25 (М±ш) Опыт п=25 (М±ш)

Лактатдегидрогеназа, мкмоль-НАДН/мин.мг Изменение в % Р 1,807±0,164 4,252±0,245** + 135,0 <0,001

Лактат, мкмоль/г Изменение в % Р 1,847±0,124 9,956+0,857** +439,0 <0,001

Пируват, мкмоль/г Изменение в % Р 0,053±0,004 0,076±0,006** +43,4 <0,05

Глюкоза, мкмоль/г Изменение в % Р 2,118±0,04 1,817±0,085* -14,2 <0,02

Альдолаза, мкмоль НАДН/мин.мг Изменение в % Р 0,188±0,012 0,445±0,014** + 137,0 <0,001

Аланинаминотрансфераза, мкмоль/мг.час Изменение в % Р 0,549±0,061 1,474±0,048** + 169,0 <0,001

Аспартатаминотрансфераза, мкмоль/мг.час Изменение в % Р 0,919±0,075 1,686±0,089** +83,5% <0,001

Глутамат, мкмоль/г Изменение в % Р 0,24710,018 0,571±0,059** + 130,0 <0,001

2-Оксоглутарат, мкмоль/г Изменение в % Р 0,120+0,016 0,106±0,060* -11,7 >0,5

Малатдегидрогеназа, мкмоль НАДН/мин.мг Изменение в % Р 4,62910,374 3,91110,213* -18,4 <0,01

Малат, мкмоль/г Изменение в % Р 2,71 ±0,161 1,5110,146** -44,3 <0,001

Оксалоацетат, мкмоль/г Изменение в % Р 0,15110,006 0,08210,005** -45,7 <0,001

Глутаматдегидрогеназа, мкмольН АДН/мин .мг Изменение в % Р 0,04410,003 0,02110,002** -52,3 <0,001

Глицеральдегидфосфатдегидрогеназа, мкмоль НАДН/мин.мг Изменение в % Р 0,25510,019 0,39010,006** +52,9 <0,001

*<0,01,**р< 0,001

Выделенный из животных тканей фермент, очищенный от бал-

ластных и других каталитических белков, а затем введенный вновь в среду с гомеостатическими показателями жизнеобеспечения, т.е. с определенным температурным режимом, степенью ионизации и соотношением катионов-анионов, органических и неорганических компонентов, наличием множества регуляторов гормональной и негормональной природы, сотни близких и несходных по химической структуре субстратов для данного фермента оказывают усиленное не только специфическое, характерное для него действие. В своей работе мы рассматриваем вариант введения дегидрогеназ в кровь интактного животного с целью выяснения возможности включения экзогенного фермента в метаболические процессы, выяснения в какой степени вызываются изменения, какова их стабильность и множественность.

Найдя ответы на эти вопросы, можно целенаправленно вводить препарат для коррекции отдельных нарушений в обмене. Наряду с изучением влияния экзогенной лактатдегидрогеназы, нами оценивалось действие и малатдегидрогеназы. Исследования проводились для решения вопроса о специфичности действия дегидрогеназ на метаболизм.

Анализируя результаты проведенных экспериментов, очевидно, что введенный фермент активно включается в обменные процессы животного организма. Наблюдаемые сдвиги в обмене нельзя расценить как лавинообразные, наступающие одномоментно. Отмечаясь на пятой минуте после введения (табл. 4), в целом они нарастают и достигают максимума к 20 минуте. Через сутки многие показатели соответствуют контрольным величинам (активность аланинаминотрансферазы, содержание глутамата, мочевины), но метаболический эффект еще сохраняется. Так, удерживается на более высоком уровне активность аспар-татаминотрансферазы, интенсивнее, чем в контроле утилизируется 2-оксоглутарат.

Возможно, за счет катализа специфической малатдегидрогеназной реакции происходит первоначальный сдвиг в содержании субстратной пары данного фермента. Малат, а особенно оксалоацетат, является метаболически высокоактивными соединениями: служат, как известно, субстратами ферментов анаболизма и катаболизма (глюконеогенез, трансаминирование, окисление в трикарбоновом цикле и в цитоплазме при восстановлении никотинамидных коферментов). Кроме того, они формируют характерное микроокружение за счет собственной полярности и кислотных свойств. Такие свойства могут служить одним из

Интегральные показатели углеводного и белкового обмена в крови кроликов на фоне внутривенного введения экзогенной малатдегидрогеназы

Показатели Исходные Через 5 Через 20 Через 24

(мкмоль/мл - мкмольНАДН/ показатели (М±ш) минут (М1ш) минут (М±т) часа (М+т)

мин.мг)

Лактатдегидро- 0,02810,001 0,03910,001** 0,05610,002** 0,03610,002*

геназа

Лактат 3,12±0,143 3,5810,012** 4,5510,135** 3,0110,103*:

Пируват 0,12810,006 0,09510,004** 0,08110,002** 0,09210,004*

Глюкоза 4,1210,26 6,0010,29** 6,3710,34** 5,5010,15**

Альдолаза 0,001410,0001 0,001910,0002** 0,002410,0002* 0,001610,001

Малатдегидро- 0,02210,001 0,03110,001** 0,05110,002** 0,02410,001

геназа

Малат 2,3210,135 1,3010,068** 0,9710,041** 0,0921.0,036*

Оксалоацетат 0,16510,011 0,28010,016** 0,17010,009 0,18210,01*

2-Оксоглугарат 0,09110,008 0,08810,007 0,08910,008 0,04310,003*

Глутамат 0,09310,006 0,04510,003** 0,10110,005 0,09510,006

Аспартатамино-трансфераза 0,11810,005 0,14910,003** 0,18910,004** 0,14710,004*

(мккат/л)

Мочевина 5,32310,30 5,60210,31 5,18810,30 5,82110,35

* р<0,01** р<0,001

пусковых факторов наблюдаемых изменений при поступлении ма латдегидрогеназы в кровоток. Подтверждением специфичности выяв

ленных сдвигов служит установленная в течение всего периода наблюдений активация аспартатаминотрансферазы. Известно, что между этими ферментами, объединенными общим субстратом оксалоацета-том, существует и селективное межбелковое взаимодействие, установленное в экспериментах in vitro (Backman L, Johansson G, 1976; Brice

C.F. et al., 1976, Salerno G. et al., 1975, 1982). Полученные нами данные свидетельствуют о возможности такого эффекта в условиях целостного организма.

Результаты исследований показали, что при усилении метаболических процессов, вызванных введением фермента, не происходит увеличения образования мочевины. Это, на наш взгляд, может служить показателем азотистого катаболизма, свидетельствующем о сберегании азота в процессе обмена. Подтверждением служат данные по глутаматде-гидрогеназной редокс-систёме. Учитывая коллекторную функцию глу-таминовой кислоты, увеличение ее концентрации в крови через 20 минут после поступления малатдегидрогеназы в кровоток, является фактом, говорящем о реальности этого допущения.

Определение активности глутаматдегидрогеназы в крови дало отрицательные результаты на протяжении всего эксперимента как в контрольной, так и в опытной группе, что расценивается нами как положительный момент. Поскольку глутаматдегидрогеназа характеризуется только внутриклеточной локализацией (ядра, митохондрии) (Williamson

D.H. et al., 1967; Arnold H., Maier K.P., 1972; Godinot С., Lardy H„ 1973), отсутствие активности этого фермента в крови отражает целостность клеточных и субклеточных мембранных структур.

Эти факты свидетельствуют о том, что обе дегидрогеназы кроме общности в их функции, т.е. способности катализировать соответ-

ствующие реакции, а именно в обратимом дегидрировании лактата в пируват в случае лактатдегидрогеназы и малата в оксалоацетат в катализе малатдегидрогеназы вносят сугубо специфичные изменения в обменные процессы. Таким образом открывается широкая перспектива для теоретического прогнозирования и практического применения данных дегидрогеназ при молекулярных сдвигах при тех или иных заболеваниях.

Поскольку отклонения в метаболизме отмечаются не только в крови - среде циркуляции экзогенного фермента, но и в ткани, ценность использования препаратов дегидрогеназ для воздействия на нарушенный метаболизм возрастает. Будучи гомогенными белками, дегидроге-назы способны, по-видимому, избирательно захватываться, взаимодействуя с рецепторами клеток и преодолевая мембранный барьер. В равной степени изменяется активность лактатдегидрогеназы и малатдегидрогеназы в миокарде и скелетных мышцах, различны отклонения в показателях азотистого метаболизма в этих тканях.

Экзогенная лактатдегидрогеназа вызывает отчетливые изменения в метаболизме скелетных мышц. Отмечается усиление катаболизма аминокислот за счет активации трансаминирования аланин- и аспарта-таминотрансфераз. Доля окислительного дезаминирования глутаматде-гидрогеназой снижается. Характерна активация катаболизма углеводов, рост активности глицеральдегидфосфатдегидрогеназы, что может обеспечить более высокий уровень энергообеспечения, способствовать реализации сократительной функции скелетных мышц.

В сердечной мышце кроликов в среднем содержится 0,12210,0054 мкмоль/г 2-оксоглутарата. После введения лактатдегидрогеназы содержание 2-оксоглутарата снижается на 28,4% (р<0,01). Как известно, 2-

оксоглутарат является унифицированным интермедиатом: это не только продукт окислительного дезаминирования глутамата, он образуется как компонент лимоннокислого цикла, используется в глюконеогенезе, как акцептор аминогрупп при трансаминировании и реаминировании. Снижение его концентрации при превышении уровня контрольных величин глутаминовой кислоты и снижение активности глутаматдегидро-геназы и аспартатаминотрансферазы можно расценить как проявление активного использования 2-оксоглутарата. Таким образом, введение лактатдегидрогеназы способствует усилению такого важного интегрального метаболита как 2-оксоглутарат, что свидетельствует, возможно, о повышении эффективности энергетически выгодных процессов. Ускорение трансформации субстратов в цикле трикарбон'овых кислот не только служит предпосылкой оптимального энергообеспечения, но определяет возможность осуществления многообразных функций, выполняемых лимоннокислым циклом.

Вклад аминокислот в энергообеспечение миокарда снижается по сравнению с контролем. Источником субстратов цикла Кребса, в том числе оксокислот являются не аминокислоты, катаболизм которых протекает менее интенсивно, а углеводы и липиды. Их окисление эффективно обеспечивает миокард энергией и структурными компонентами.

Таким образом, введение препарата лактатдегидрогеназы в кровоток экспериментальным животным оказывает выраженный метаболический эффект на обменные процессы миокарда. Они регистрируются на разных уровнях клеточной организации - в цитоплазме и митохондриях. Отмечается снижение окислительного дезаминирования: активность глутаматдегидрогеназы снижена на 29,8%, намечается тенденция к уменьшению интенсивности трансаминирования аспартат - и

аланинаминотрансфераз в цитоплазме и митохондриях. Это находит свое отражение и в менее эффективном использовании глутамата. Егс концентрация выше уровня в контроле на 28,9% (р<0,01). Снижение со держания 2-оксоглутарата в условиях моделируемой гиперферментемш отражает интенсивное использование метаболита в окислительны; превращениях лимоннокислого цикла, поскольку активность трансде заминирования при этом снижена. Естественно, что приготовление го могената предполагает разрушение цитоплазматических мембран i ■ структур субклеточных органелл. Следовательно, введенная извне ма латдегидрогеназа находится в контакте с ферментами и субстратами составляющими метаболическую основу печени. Проведенные экспе рименты выявили стабильность метаболического эффекта, вызь: ваемого экзогенными дегидрогеназами, и специфическую направлен ность изменений для каждого фермента. В данном случае исключен] межорганные взаимодействия и связующая функция крови, обеспечк вающая печень регуляторными сигналами, метаболическими факторе ми.

Экзогенная малатдегидрогеназа включается в обменные процесс многокомпонентной системы гомогената (табл. 5).

Регистрируемая нами усиленная активность на протяжении 24 ч; сов представлена суммарно введенным ферментом, цитоплазматич скими и митохондриальными изоформами. Активность аспартатам нотрансферазы так же отражает катализ обеими изоформами - цит плазматической и митохондриальной. Наблюдаемое параллельно ус ление активности малатдегидрогеназы и аспартатаминотрансфера: создает условия для активного протекания сочетания процессов оки ления - восстановления и трансаминирования. Функция малат-

Интегральные показатели углеводного и белкового обмена в печени кроликов при взаимодействии с экзогенной малатдегидрогеназной в

условиях in vitro

Исходные Через Через

Показатели показатели, 10 минут 24 часа,

п-25 п=25 п=25

(М±т) (М+ш) (Mim)

Лактатдегидрогеназа, мкмоль НАДН/мин.мг 1,01+0,028 1,3610,032* 1,5910,022**

Лактат, мкмоль/г 4,42+0,141 4,75+0,21 5,3410,155*

Пируват, мкмоль/г 0,153±0,007 0,071+0,002** 0,11210,003*

Малатдегидрогеназа, мкмоль НАДН/мин.мг 0,80+0,013 1,26+0,023** 0,945+0,020*

Малат, мкмоль/г 0,84+0,016 1,0910,019* 1,1010,028*

Оксалоацетат, мкмоль/г 0,156±0,003 0,15410,004 0,15810,004

Глутамат, мкмоль/г 0,94710,037 0,58310,033** 0,87710,029

2-Оксоглутарат, мкмоль/г 0,12110,004 0,06510,003** 0,10510,004*

Мочевина, мкмоль/г 3,2410,119 3,4110,109 3,7010,102*

* <0,01,**р <0,001 аспартатного шунта по нашим данным превышает на 30% фоновые показатели. Следовательно, создаются предпосылки для ритмичной поставки субстратов в жизненно важные процессы базового метаболизма печени по двум путям. Образующийся в малатдегидрогеназной реакции НАДН может служить непосредственным источником восстановленных эквивалентов в электронтранспортнуго цепь, а малат и окса-

лоацетат обеспечить бесперебойность окисления в лимоннокислом чикле. Контроль за уровнем 2-оксоглутарата показал, что этот метаболит активно используется.

Его концентрация ниже исходной на 45%. Наряду с усилением энергетического метаболизма отмечается повышение интенсивности превращений аминокислот как за счет переаминирования, так и прямого дезаминирования.

Таким образом эти процессы являются эффективными поставщиками оксалоацетата, 2-оксоглутарата и пирувата. Снижение содержания этих унифицированных субстратов отражает их интенсивную утилизацию. Активность глутаматдегидрогеназы возрастает на 63% и 73% через 10 минут и 24 часа соответственно, содержание глутаминовой кислоты снижено на 35%. Это служит показателем активного использования глутамата по специфическим путям обмена. Данная аминокислота является не только компонентом белковых структур, но служит интегральным метаболитом, формирующимся в результате трансреамини-рования из 2-оксоглутарата, продукта углеводно-липидного обмена. 1'лутамат концентрирует в своей структуре аминогруппы от всех аминокислот, подвергающихся катаболизму, выполняя роль их коллектора. Поэтому его содержание является итоговым показателем интенсивности процессов трансдезаминирования, представленных в ткани печени.

Положительным моментом усиления потока через глутаматдегид-рогеназу является образование при этом непосредственно внутримито-хондриального НАДН, не нуждающегося в дополнительном транспорте для последующего окисления в цепи ферментов окислительного фосфо-рилирования. Активное использование метаболитов, индуцированное

введением малатдегидрогеназы, не вызывает накопление метаболитов кислых аминокислот, оксо- и гидроксикислот, что предотвращает развитие метаболического ацидоза в печеночной ткани.

По-видимому, метаболические сдвиги, вызываемые экзогенным ферментом, - характерный редокс-потенциал, рН в отдельных микро-компартментах за счет изменения баланса метаболитов, окисленных и восстановленных коферментов - определяют специфику конформаци-онного состояния гликолитического метаболона, проявляющегося по-' вышением активности, в частности лактатдегидрогеназы, завершающей процесс гликолиза.

Следовательно, введенная малатдегидрогеназа оптимизирует не только аэробные окислительные процессы, но и обеспечивает определенное соответствие между аэробным и анаэробным распадом в печени, что, на наш взгляд, определяет физиологичносгь используемого фактора. Переводя на более высокий уровень катаболизм аминокислот, создав предпосылку для усиления аккумуляции энергии в терминальном окислении, осуществляется и усиление гликолиза, основного процесса энергообеспечения в цитоплазме, способствующего образованию унифицированных метаболитов, создавая специфическое микроокружение ферментов, стабилизирую электрический баланс в цитоплазме.

При инкубации лактатдегидрогеназы в гомогенате печени (табл. 6) определяемая активность увеличивается в течение суток, имея гиперболическую направленность, введенный фермент может, адсорбироваться на фрагментах мембранных структур, пополнить эндогенный комплекс гликолитических ферментов, создав усиление на его заключительном этапе.

Интегральные показатели углеводного и белкового обмена в печени кроликов при взаимодействии с экзогенной лактатдегидрогеназой в

условиях in vitro

Показатели Исходные показатели п=25 (Mim) Через 10 минут п=25 (М1ш) Через 24 часа n=25 (Mim)

Лактатдегидрогеназа, мкмоль НАДН/мин мг 1,0110,028 1,7710,064** i, 1310,025*

Лактат, мкмоль/г 4,4210.141 4,2710,133 4,4410,125

Пируват, мкмоль/г 0,15310,007 0,109+0,006* 0,13310,006*

Глюкоза, мкмоль/г 4,3710,14 5,4510,117* 3,5510,102*

Малатдегидрогеназа, мкмоль НАДН/мин.мг 0,8010,013 1,2510,024** 0,89410,012*

Малат, мкмоль/г 0,8410,016 1,0710,043* 0,9010,017*

Оксалоацетат, мкмоль/г 0,15610,003 0,15410,004 0,154+0,005

*р < 0,01,**р< 0,001

Следовательно, экзогенная лактатдегидрогеназа, выполняя реконструктивную функцию и встраиваясь в гликолитический поток, способствует усилению всего процесса. Этот факт необходимо учитывать, оценивая перспективность введения дегидрогеназ как энзимотерапев-тических факторов. Обобщая полученные результаты данного этапа проведенных исследований, можно отметить, что первые шаги в расширении наших знаний о возможностях терапии дегидрогеназами, способных индуцировать многообразные метаболические процессы и

обеспечить переход на новую ступень, уровень взаимоотношений между системами жизнеобеспечения клеток, проделаны. Примечательно, что дегидрогеназы - биогенные факторы наряду с отчетливым и специфическим действием не оказывают деструктивного влияния на мембранные структуры, поддерживая сбалансированное взаимоотношение различных клеточных микрокомпартментов, определяя в целом клеточный гомеостаз в новых условиях.

; Получив обширный экспериментальный материал, свидетельствующий о том, что введенный в организм фермент обладает исключительной метаболической активностью с одной стороны, с другой -совокупность изменений метаболизма имеет для каждой дегидрогеназы свою характерную картину, приводит нас к заключению, что ферменто-терапия приобретает по существу новые возможности. Таким образом определяется следующий этап наших исследований, который предполагает решение таких вопросов, как судьба фермента в организме, выяснение, что происходит с ним, преодолевает ли он естественные барьеры. - мембраны, вызывает ли сиюминутные или стабильные изменения в обмене, проникнув внутрь клетки, фиксируется или подвергается деградации или элиминации. Такой широкий спектр вопросов требовал ответа с учетом полученных сведений. Проследить судьбу и ответить на ряд этих вопросов нам представляется возможным путем визуализации конкретного фермента - нашего молекулярного объекта - в эндогенной среде, т.е. в организме. Для этого необходимо было использовать радиоактивную метку. Несмотря на то, что метод меченых атомов относится к числу известных, применяемых в белковой химии, в работе с каталитическим белком возникают дополнительные сложности. Пробле-

ма состоит в том, что в процессе включения радиоактивной метки сохранить ферменту свои нативные свойства и активность. Методически отработанным приемом является включение метки в аминокислоту. Применяется использование аминокислот, меченых по углероду, с последующем введением их в организм экспериментальных животных, что позволяет оценить интенсивность ее включения в анаболические и ка-таболические процессы. Это оправдано при получении меченого фермента из данного организма. Такой фермент будет содержать экзогенную аминокислоту с радиоактивной меткой. Данный экспериментальный подход дает ответ на другие вопросы, связанные, в частности, с изучением интенсивности включения эндогенных аминокислот в определенные белки, при определенных условиях.

Перед нами стояла проблема введения метки в изолированный полноценный фермент, полученный в препаративных количествах, отвечающий требованиям гомогенности и высокой каталитической способности, стабильности. Об этом свидетельствовали данные седимента-ционного анализа, электрофореза в ПААГ, изоэлектрического фокусирования, энзимного теста. Изучен был также аминокислотный состав дегидрогеназ из сердечной, скелетных мышц различных видов, в том числе человека, свидетельствующий о структурном сходстве дегидрогеназ различных видов (Радомская В.М., 1990). Предстояло, сохранив все природные характеристики выделенных ферментов, сдеяать их радиоактивно меченными, доступными для регистрации в различных органах и тканях после введения их в организм реципиентов. Решение этой задачи стало возможным при участии в лаборатории Изотопомодифици-рованных физиологически активных соединений института молекуляр-

ной генетики АН РФ (Директор член-корреспондент АН России, Е.Д. Свердлов; зав. лабораторией доктор биологических наук, профессор Н.Ф. Мясоедов).

В основу был положен метод высокотемпературного твердофазного каталитического изотопного обмена с газообразным тритием (Zolo-tarev Yu.A. et al., 1991 ). Газообразный тритий сорбируется на каталитическом металле платиновой группы и его избыток замещает водород в ферменте, который в заданных нами условиях является твердофазным органическим компонентом. При этом формируется радиоактивно- меченый белок-фермент. От лабильного трития избавлялись путем диализа при постоянной конвекции К-фосфатного буфера. Фермент выделялся хроматографически с использованием HPLC на Superóse 12 с детекцией по белку на детекторе ALTEX 165 (США). Текущий и завершающий контроль активности показал, что процедура введения изотопной метки сопровождается снижением активности всего на 4 - 8% по сравнению с исходными данными.

После поступления в кровь экзогенной а-глицерофосфатдегидро-геназы введенной внутривенно в соответствии с полученными данными нам представляется следующая картина (рис. I).

Фермент присутствует в кровотоке через сутки и двое. Четко прослеживается динамика изменений, его содержание со временем уменьшается, что вполне-закономерно. Примечательным является то, что спустя 48 часов количество фермента, судя по радиоактивности снижается в 3 раза по сравнению с первым часом. Естественно, что белок,

Рис. 1. Изменение распределения экзогенной а-глицерофосфатдегидрогеназы, меченой тритием, в органах и тканях крыс после внутривенного введения

находящийся в кровотоке становится доступным для действия протеаз. Можно было бы допустить, что относительная чужеродность, обусловленная видовыми различиями а-глицерофосфатдегидрогеназы по отношению к организму крысы, станет причиной атаки гидролизи-рующими ферментами, что обеспечит фрагментацию, снижение молекулярной массы и последующую элиминацию из организма почками. Однако полученные результаты по оценке радиоактивности печени, миокарда, скелетных мышц, мозга, селезенки и почек опровергают это допущение. Экзогенный фермент сохраняется в крови и, преодолевая множественные мембранные барьеры находится в тканях. Достаточно высокая молекулярная масса, наличие специфического заряда не мешают а-глицерофосфатдегидрогеназе проникнуть через многослойную архитектуру сосудистой стенки, сложную композицию цитоплазмати-ческих мембран. В принципе у всех тканей и органов складываются

равные условия, определяющие доступность в них экзогенного фермента, находящегося в кровотоке. Пассивно ли поступает туда радиоактивный белок, находящийся в естественном окружении метаболитов, биополимеров и олигомеров различной степени гидрофильности и гид-рофобности, малых молекул, является ли определяющим кровенаполнение, васкуляризация тканей?

Определение активности а-глицерофосфатдегидрогеназы в крови и тканях в указанные сроки выявило ее сохранение и послужило критерием жизнеспособности экзогенного фермента поскольку показало величину его во много раз превышающую норму и коррелирующую с уровнем радиоактивности.

Нами вводился внутривенно изофермент из скелетных мышц, то есть ЛДГ М-типа. Существует ли избирательное сосредоточение его с учетом сродства к тканям с преимущественным аэробным или анаэробным типом окислительного метаболизма. Мы оценили радиоактивность и ферментативную а-глицерофосфатдегидрогеназную активность в различных органах в динамике. Выявлены интересные закономерности. В печени через час после введения радиоактивность практически соответствует ее уровню в крови. Через сутки содержание фермента возрастает, а через 48 ча:сов отмечается резкое накопление радиоактивности в печени, превышающее данные, полученные через час, в три раза. Аналогичная тенденция установлена нами в сердечной мышце, головном мозге; но количественное выражение этих сдвигов характерно для каждой ткани. Обращает внимание уровень радиоактивности в скелетных мышцах. Исходно, через час скелетные мышцы обогащаются а-глицерофосфатдегидрогеназой почти также как кровь, миокард, но меньше, чем печень и значительно меньше, чем селезенка и почки. Ха-

рактерно, что этот уровень содержания фермента в скелетных мышцах удерживается в течение всего периода наблюдения. Очевидно, введенная меченая дегидрогеназа к данной ткани обладает наибольшим сродством и включается в систему ее метаболического обеспечения. Характерно, что в селезенке, почках после введения наблюдается максимальное сосредоточение фермента, близкое по величинам. В селезенке через сутки наблюдается прогрессивное снижение содержания меченого белка, закономерно уменьшающееся через 48 часов, достигая такого уровня как в миокарде через час. В почках фермент сконцентрирован двадцать четыре часа и содержание его снижается только через двое суток, удерживаясь на таком уровне как в сердечной мышце через час после введения.

В самых минимальных концентрациях а-глицерофосфатдегидроге-наза обнаруживается через час в головном мозге. Ее содержание в 14 раз меньше, чем в крови, в 18 раз меньше, чем в миокарде, в 73 раза ниже уровня в почках. Интересна динамика содержания фермента в мозге. Концентрация стремительно увеличивается, достигая к 48 часам уровня, равного тому, который установлен в крови через час после поступления в кровоток, превышая изначальный уровень в мозге на три порядка.

К сожалению не представляется возможным составить карту по полному распределению меченого фермента в организме крысы. Однако если ориентироваться только на исследованные ткани, становится очевидным, что сосредоточение а-глицерофосфатдегидрогеназы отмечается преимущественно в печени, селезенке, мышцах, почках. Данный фермент преодолевает гематоэнцефалический барьер, что отражается увеличением содержания меченой а-глицерофофатдегидрогеназы в этой

ткани. С учетом среднего веса органов экспериментальных животных и величины радиоактивности, очевидно, что печень концентрирует за весь период наблюдения 29,7% количество фермента, из них в первые сутки 32,2%, во вторые сутки 40,0%. Зависимость для сердечной мышцы в таком же аспекте следующая: I сутки 34,5%, II сутки 73,0%, всего -1,7%. Скелетные мышцы поглощают и лактатдегидрогеназу, удерживая фермент в количестве 42,0% в первые сутки, во вторые сутки 61,1% (рис. 2). В головном мозге присутствует 0,2% лактатдегидрогеназы в течение суток, становится 0,4% к 48 часам. Печень и селезенка включают в ткань органов в первые сутки 2,4% и 0,5% фермента, во вторые - 16,0%) и 2,0% соответственно. Во всем объеме крови усредненного экспериментального животного отмечалось повышение через час после инъекции уровня лактатдегидрогеназы на 56,2%, через 24 часа - на 12,6%, через 48 часов - на 6,9%.

—•—через 1 час — -* — через 24 часа • • А • 'через 4В часо!

кровь

печень миокард скелет. головной селезенка почки мышцы мозг

Рис. 2. Изменение распределения экзогенной лактатдегидрогеназы, меченой тритием в органах и тканях крыс после внутривенного введения

ДГаким образом, в течение первых суток содержание меченого экзогенного фермента в изученных органах снижается на 7,2%, за вторые сутки - на 20,6%.

При сравнении результатов экспериментов по введению изотопно меченых а-глицерофосфатдегидрогеназы и лактатдегидрогеназы в организм животных и их распределению в тканях и органах выявляется существенная разница. Тетрамерная молекула лактатдегидрогеназы в значительной степени концентрируется и удерживается в циркулирующей крови, превышая содержание в ней а-глицерофосфатдегидрогеназы через час после поступления на 47,6%, через 24 часа на 6,7%, через двое суток на 4,0%. В печень проникают оба экзогенных фермента, но в течение двух суток лактатдегидрогеназы поступает и удерживается на 13,7% меньше, чем а-глицерофосфатдегидрогеназы, хотя тенденция изменений во времени сохраняется аналогичная. Значительно меньше фонд экзогенной лактатдегидрогеназы в скелетных мышцах и мозге. Обращает внимание противоположный характер распределения лактатдегидрогеназы в селезенке и почках. Концентрация фермента резко увеличивается к 48 часам, а а-глицерофосфатдегидрогеназа концентрируется первоначально в этих органах, а по истечению двух суток содержание ее стремительно снижается.

Результаты наблюдений с использованием дегидрогеназ с различными структурами и физикохимическими характеристиками свидетельствуют, что экзогенные ферменты проникают в ткани, концентрируются в них в режиме, специфичном для каждого фермента и оказывают активное влияние на метаболизм, включая не только изменения в редокс-системе образованной собственной субстратной корой, но и в широком спектре процессов углеводно-белкового обмена.

Суммируя изложенное, следует отметить, что проведение поэтапного исследования, включающего введение в организм животных экзогенных дегидрогеназ с различной молекулярной массой и специфически катализируемых процессов, постановкой серии опытов in vitro с функционально различными тканями, субклеточными органеллами и регистрацией метаболического эффекта по интегральным характеристикам обмена, изучение распределения в организме реципиента изотопно меченых ферментов и учетом динамики элиминации, очевидно показали, что малатдегидрогеназа, лактатдегидрогеназа, а-глицерофосфат-дегидрогеназа включаются в метаболизм тканей и органов, служат пусковыми факторами широкого спектра процессов на разных уровнях структурной организации с определенной стабильностью и спецификой действия. Блок полученных данных позволил прийти к заключению о том, что найдено, экспериментально и теоретически обосновано новое направление в энзимотерапии, раскрывающее возможности эффективного, щадящего управления обменными процессами в норме и патологии с помощью средств биогенной природы - дегидрогеназ с высокой каталитической активностью.

ВЫВОДЫ

1. Аргументирована перспектива нового подхода в теоретической и прикладной энзимологии с использованием ферментов в качестве средств моделирования метаболических процессов, применение экзо-геннных ферментных препаратов для раскрытия патогенеза заболеваний.

2. Установлено, что внутривенное введение экзогенной малатде-гидрогеназы вызывает усиление процессов трансаминирования преимущественно за счет повышения активности аспартатаминотрансфе-

разы. Отмечаются перепады концентрации в редокс - системе глутамат-2-оксоглутарат в течение суток с последующей нормализацией их уровня через 24 часа. Введение лактатдегидрогеназы в кровь способствует активной утилизации унифицированных субстратов, отмечено уменьшение концентрации малата, оксалоацетата, 2-оксоглутарата. Интенсивность процессов трансаминирования усиливается за счет роста активности аспартат-, аланинаминотрансаминаз.

3. Выявлено, что внутривенное введение лактатдегидрогеназы вызывает отчетливые изменения в азотистом метаболизме скелетных мышц. Характерно преимущественное расщепление аминокислот по пути непрямого дезаминирования за счет активации аспартат - и ала-нинаминотрансфераз. Интенсивность окислительного дезаминирования глутаматдегидрогеназой снижена, уровень глутамата повышен. Отмечена специфическая реакция миокарда на гиперлактатдегидроге-наземию, проявляющаяся снижением процессов трансаминирования аспартатаминотрансферазой и аланинаминотрансферазой в цитоплазме и митохондриях и окислительного дезаминирования глутаматдегидрогеназой. Общей закономерностью для мышц является увеличение содержания глутамата и снижение концентрации 2-оксоглутарата.

4. Введение лактатдегидрогеназы экспериментальным животным приводит к увеличению содержания лактата и пирувата в скелетной мышце и пировиноградной кислоты в миокарде. Более значительное увеличение пирувата наблюдается в сердце. В печени содержание пирувата снижается при незначительном повышении лактата. Содержание глюкозы в скелетной мышце снижается, а в печени увеличивается. При этом активация метаболических процессов в результате введения фермента не меняет специфики обмена тканей.

5. Введение экзогенной малатдегидрогеназы приводит к увеличению активности альдолазы и содержания глюкозы крови кролика. Нагрузка животных экзогенными лактатдегидрогеназой, малатдегидроге-назой, а-глицерофосфатдегидрогеназой не сопровождается повреждением клеточных структур, о чем свидетельствует отсутствие глюкозо-6-фосфатдегидрогеназной и глутаматдегидрогеназной активности в крови кролика.

6. Моделируемая в условиях эксперимента гиперферментемия может быть использована в качестве методического подхода для изучения патогенеза врожденных и приобретенных заболеваний.

7. В условиях in vitro изучено взаимодействие лактатдегидрогена-зы и малатдегидрогеназы с естественными компонентами ткани печени и установлено специфическое влияние каждой из дегидрогеназ на интегральные показания метаболизма.

8. Сформулирована новая концепция о возможностях применения дегидрогеназ как молекулярных факторов широкого спектра действия, а так же расширены преставления о динамике метаболических ресурсов живого. Осуществлено введение тритиевой радиоактивной метки в препараты лактатдегидрогеназы и а-глицерофосфатдегидрогеназы с сохранением нативных свойств и активности ферментов.

9. Меченая тритием а-глицерофосфатдегидрогеназа, введенная внутривенно, в течение 48 часов содержится в крови, печени, почках, селезенке, миокарде, скелетной мышце и мозге, сохраняя при этом функцию и метаболическую активность.

10. Установлено, что меченая тритием лактатдегидрогеназа спустя двое суток после введения концентрируется преимущественно в печени,

почках, селезенке, миокарде, скелетной мышце и мозге, прогрессивно снижаясь в крови.

11. Выявлены отчетливые особенности в динамике распределения лактатдегидрогеназы и а-глицерофосфатдегидрогеназы в тканях и органах организма реципиента. Содержание а-глицерофосфатдегидрогеназы первоначально накапливающейся в селезенке и почках, через 48 часов стремительно снижается. Тенденция для лактатдегидрогеназы противоположная. Концентрация а-глицерофосфатдегидрогеназы в скелетных мышцах удерживается на постоянном уровне в течение всего периода наблюдений, а для лактатдегидрогеназы характерна другая тенденция - незначительное содержание через час после поступления в кровоток и резкое накопление фермента по истечению двух суток. Особенностью является максимальная кумуляция а-глицерофосфатдегидрогеназы в ткани печени через 48 часов в отличие от лактатдегидрогеназы, сосредотачивающейся в почках. Установлен факт преодоления гематоэнцефалического барьера обеими экзогенными дегидрогеназами, причем количество а-глицерофосфатдегидрогеназы в два раза более значительно, чем лактатдегидрогеназы, что' обусловлено, очевидно, низкой молекулярной массой димерного фермента, его структурными особенностями.

12. Поэтапное изучение действия экзогенных дегидрогеназ и использованием различных экспериментальных подходов in vitro и in vivo послужило платформой для заключения о новой сфере использования ферментопрепаратов и позволяет рассматривать их как новое поколение биогенных средств коррекции метаболизма.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Нарушение слаженной деятельности дегидрогеназ составляет молекулярную основу различных патологических состояний, в том числе, гипоксий. С целью стабилизации обменных процессов и повышения резистентности организма к гипоксии, рекомендуется энзимотерапия дегидрогеназами.

2. В экстренных случаях оправдано введение никотинамидных ко-ферментов для обогащения эндогенного фонда и создания оптимального режима функционирования дегидрогеназ.

3. Дозированная оксигенотерапия способствует сбалансированности и ритмичности процессов анаэробного и аэробного окисления, катализируемых дегидрогеназами.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Гуморальные факторы культуры макрофагов и тимоцитов, индуцирующие эффекторы РТПХ (в соавт. Анфалова Т.В., Капинус Л.Н., Луцан Н.И., Галактионов В.Г.) // Фагоцитоз и иммунитет. Тезисы докладов Всесоюзного симпозиума - М. 1983. - С. 14-15.

2. Доминирующая роль генов K-региона Н-2 - Системы мышей при макрофагальной индукции Т-эффекторов РТПХ (в соавт. Анфалова Т.В., Галактионов В.Г., Луцан Н.И., Капинус Л.Н.) // Доклады АН СССР. - 1984. - Т. 279, №4. - С. 1016-1020.

3. Генетически ресгриктированный макрофагальный фактор индукции тимоцитов // IV Всесоюзная межуниверситетская конференция по "Биологии клетки'.—Тбилиси, 1985. - С. 164-166.

4. Функциональная дифференцировка тимоцитов под влиянием макрофагов: клеточные, гуморальные и генетические аспекты (в соавт. Галактионов В.Г., Анфалова Т.В., Луцан Н.И.) II ОнТогенез. - 1986. - Т. 17,-№2.-С. 156-164.

5. Контроль генами главного комплекса гистосовместимости взаимодействия макрофагов с тимоцитами при индукции Т-эффекторов РТПХ. Сообщение I. Генетический контроль на клеточном уровне (в соавт. Анфалова Т.В., Галактионов В.Г., Луцан Н.И., Познахирев П.Е.) // Генетика. - 1986. - Т. XXII. - № 2. - С. 244-252.

6. Контроль генами главного комплекса гистосовместимости взаимодействия макрофагов с тимоцитами при индукции Т-эффекторов РТПХ. Сообщение II. Анализ на уровне гуморальных факторов (в соавт. Анфалова Т.В., Галактионов В.Г., Луцан Н.И.) // Генетика. - 1986. -Т. XXII. - № 3. - С. 467-472.

7. Клетки - продуценты гуморального фактора, индуцирующего созревание Т-эффекторов реакции трансплантат против хозяина при взаимодействии макрофагов с тимоцитами in vitro (в соавт. Анфа-лова Т.В., Галактионов В.Г.) // Иммунология. - 1986. - №5. - С. 9-11.

8. Моделирование гиперферментемии - способ изучения механизмов формирования обменных нарушений (в соавт. Гильмиярова Ф.Н. Радомская В.М., Мирзаев Б.С. и др.) // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. -1993. -№10. - С.376-377.

9. Оценка метаболического эффекта экзогенной лактатдегидроге- • назы в условиях in vivo (в соавт. Гильмиярова Ф.Н., Радомская В.М.. Мирзаев Б. и др.) // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 1994. - №5. - С.480-481.

10. Создание безотходных технологий - путь обеспечения здоровья населения (в соавт. Гильмиярова Ф.Н., Радомская В.М., Виноградова J1.H. и др.) // Тез. докладов Всероссийской научно-практической конференции. Экология городов. Ресурсосберегающие и экологически чистые технологии. - Самара. - 1993. - С. 37-38.

11. Состояние метаболических процессов в организме после введения экзогенной лактатдегидрогеназы (в соавт. Мирзаев Б.С., Свердлова Б.И.) // Юбилейные тезисы Самарского государственного медицинского университета. - Самара. - 1993. - С. 28.

12. Перспектива массовой защиты населения от экотоксикантов. поиски и решения (в соавт. Гильмиярова Ф.Н., Радомская В.М., Виноградова JI.H. и др.) // Тез. докладов Всероссийской научно-практической конференции. Экология и здоровье человека. - Самара. -1994. - С. 43.

13. Методологические основы эффективной детекции экотоксикантов и прогнозирования последствий загрязнения окружающей среды (в соавт. Гильмиярова Ф.Н., Радомская В.М., Виноградова JI.H. и др.) // Тез. докладов конференции. Биоповреждения в промышленности

. - ч. И. Пенза. - 1994. - С. 25-26.

14. Субстратное обеспечение сердечной мышцы при инфаркте миокарда: избирательность использования метаболитов. Зависимость от факторов времени (в соавт. Гильмиярова Ф.Н., Радомская В.М. и др.) // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 1995. - №

6.-С.621-624.

15. Возможность энзимотерапевтической коррекции синдромных нарушений метаболизма (в соавт. Гильмиярова Ф.Н., Радомская В.М. и др.) //Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 1995. - №

7. - С.23-25.

16. Новые возможности и перспективы в диагностике заболеваний и мониторинге здоровья (в соавт. Гильмиярова Ф.Н., Линева О.И., Блок М.Л. и др.) // Тез. докладов II симпозиума "Неинвазивные методы диагностики". - Москва. - 1995. - С. 19-20.

17. Доклиническая оценка влияния экотоксикантов на организм человека (в соавт. Гильмиярова Ф.Н., Радомская В.М., Бабичев A.B. и др.) // II национальный конгресс по профилактической медицине. С.г Петербург. Впервые в медицине. - 1995. №2-3. - С.41-42.

18. Состояния анаэробных и аэробных окислительных процессов в миокарде человека при алкогольной интоксикации (в соавт. Баишева Г.М., Рожкова О.В., Романова Ю.В. и др.) // Тез. докладов Международного научного конгресса студентов, аспирантов и молодых ученых Молодежь и наука - третье тысячелетие. Москва. - 1995. - С. 24.

19. Селективное накопление в мозге макромолекул каталитических.белков (в соавт. Гильмиярова Ф.Н., Радомская В.М., Фролова Г.А. и др.) // Тез. докладов 10 Международной конференции по нейрокибер-нетике. Ростов на Дону. - 1995. - С. 37.