Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование дегидрогеназного комплекса ферментов некоторых насекомых в норме и под влиянием регуляторов роста

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Исследование дегидрогеназного комплекса ферментов некоторых насекомых в норме и под влиянием регуляторов роста"

РГБ ОА

2 8 АВГ 1995

На правах рукописи

КОМЕТПАИИ Илопа Бучуевна

ИССЛЕДОВАНИЕ ДЕГИДРОГЕНАЗНОГО КОМПЛЕКСА ФЕРМЕНТОВ НЕКОТОРЫХ НАСЕКОМЫХ В НОРМЕ II ПОД ВЛИЯНИЕМ РЕГУЛЯТОРОВ РОСТА

Специальность 03.00.04 — биологическая химия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 1995

Работа выполнена в 'Московском педагогическом государственном университете им. В. И. Ленина иа кафедре органической и биологической химии.

Научные руководители:

доктор биологических .наук, «профессор ФИЛИППОВИЧ Ю. В.,

кандидат биологических наук, доцент КУТУЗОВА Н. М.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, (Профессор РОСЛАВЦЕ'ВА С. А.,

кандидат биологических наук УШАКОВА Г. И.

Ведущая организация — ИНСТИТУТ ПРОБЛЕМ ЭВОЛЮЦИИ И ЭКОЛОГИИ им. А. И. Северцова.

Защита состоится «.\!.С2... »СМШРА1995 г. в .Лг.'гг.... часов на заседании диссертационного совета К 053.01.01 по присуждению ученой степени кандидата наук в Московском педагогическом государственном университете им. В. И. Ленина по адресу: Москва, ул. Кибальчича, д. 6, корпус 5, ауд. 506.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МПГУ им. В. И. Ленина, 119435, Москва, Малая Пироговская, д. 1.

Автореферат разослан « ..1995 г.

Ученых! секретарь диссертационного совета

ОЖИГОВА А. П.

ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность теш. Для насекомых с полным превращением (Но-lometabola) характерна некоторые особенности б цикле постэмбрио-кального развития, а именно: фазовые переходы (личинка-куколка-имаго), которые сопровождаются быстрыш и закономерными морфологическими перестройками и полным изменением внешнего облика на каждой из Фаз развития. У насекомых с неполным превращением (Не-mimetabola) из-за отсутствия куколочкой фазы развития морфогене-тические процессы проходят постепенно в течение личиночных возрастов, и ето своеобразие отражается в динамике обмена веществ. Эндокринная система в организме насекомых служит источником пептидных и морфогенетических-стероидных и ювенильных гормонов, непосредственно регулирующих биохимические, физиологические и формообразовательные процессы. Один из биохимически! аспектов эндокринного контроля у насекомых связан с гормональной регуляцией энергетического обмена. По использованию запасов энергетических веществ среди многочисленных представителей класса насекомых условно выделяют три группы: I) преставители первой в кзчестве основного источника энергии используют преимущественно углевода (гликоген, трегалоза); 2) насекомые второй группы являются энергетически углевод- и липидзависимыми; 3) и, наконец, третьи полу -так? енергги? в основном скислая ашвэгакмкггу дралин (ШэйЗ, 1981; Gade, Eosinski, 1990; Gade,1992).

Избранные нами в качестве тест-обьектов тараканы Periplaneta americana и Blattela germanica и жуки Tenebrio molitor относятся к первой группе насекомых.

Анализ литературных данных свидетельствует о высокой изменчивости активности оксидоредуктаз в онтогенезе насекомых при различных физиологических состояниях, что обеспечивает их высокую экологическую пластичность и приспособляемость метаболических процессов к постоянно меняющимся условиям внешней среды. Большинство исследований динамики активности ферментов окнслл-телько-восстановительного комплекса, а также их множественных форм осуществление у видов насекомых с полным превращением.Среди них изучены представители Díptera, такие как Drosophila и Aedes

aegepti и представители отряда Lepiûoptera.EoffibST mori и Antera-hia pernyi(Bames et al., 1977; Корочкин,1380; Белоконь, Макси-мыв, 1382; Рог,198б;БорзакоБская,1987). Значительно меньше внимания уделено динамике оксидоредуктаз насекомых с неполным превращением (Тихонравова, 1978).

остановлено, что поступление и использование энергетически важных веществ из депонирующих органов и тканей на разных этапах жизнедеятельности насекомых реализуется при участии нейропептид-ных гормонов (Gade, 1992; Gaie, 1994). Однако, до сих пор не ясна роль морфогенетических гормонов-ювенильных (КГ) и вкдистерои-доб в энергетическом обмене в процессе постэмбрионального развития насекомых, хотя известно, что под их воздействием изменяется содержание гликогена, трегалозы и продуктов их превращений (Филиппович, Кутузова,1985).Следует учитывать, что действие морфогенетических гормонов на метаболизм углеводов носит вторичный характер, так как не установлено их прямого влияния на активность гликогенфосфорилазк, гликогенсинтетазы и других ключевых ферментов углеводного обмена (Gordon, Burford,1984). Считают, что ввеноиды оказывают прямое воздействие на дыхательный метаболизм путем активации респираторных ферментов у насекомых (Siama,1979; Куузик и др. ,1580).

Из пептидных гормонов в регуляции энергетического обмена у насекомых в основном участвуют представители семейства структурно схожих адипокинетических гормонов (Orchard, 1987; Mtioui et al., 1993; Ziegler, 1994; Gade, 1994). Не вызывает сомнений тот факт, что активность ключевых ферментов углеводного и липидкого обмена у насекомых, связанных с обеспечением энергией, находится под контролем пептидных гормонов. Однако, за исключением гликогенфосфорилазк, липопротеинлипазы, гексокинззы и трегалазы, участие каких-либо других ферментов в перечисленные выше метаболических процессах не установлено {Van Heusden et al., 1986; Gade, 1988; 1989; 1992).

Оксидоредуктазы насекомых, наряду с участием в обеспечении энергетического обмена процессов роста и развития, являются наи-

более универсальными знзимзтическими системами, де с третирующими ксенобиотики и, в том числе, многие инсектициды.

Сведений об участии ферментов окислительно-восстановительного комплекса, за исключением микросомальных монооксигеназ с цитохром P-45Q в качестве центрального звена и фенолоксидазы (Рославцева, 13?Б;1388; Леонова, Неделькина, Салганик, 1386; Жи-вотенко, I3B3), в развитии резистентности насекомых к инсектицидам в литературе обнаружить не удалось. Однако, имеющиеся данные о том, что инсектициды из группы карбаматов и ФОС снижают интенсивность авробного и анавробного дыхания у насекомых, в том числе и у Perlplaneta americana, и ингибирувт активность МДГ, ДДГ и СДГ в нервной ткани (Филиппович, Рославцева, Кутузова и др., 1388; Calender, 1990) не исключают того, что выработка биохимических механизмов резистентности осуществляется не без участия дегидрогеназного комплекса ферментов.

Цель и задачи исследования. Основной целью данной работы явилось сравнительное изучение динамики активности а-ГФДГ,Г-6-ФДГ, СДГ, МЯТ и ДДГ в онтогенезе мучного хрущака, представителя насекомых с полным превращением, и американского таракана, представителя насекомых с неполным превращением, и, кроме того, исследование воздействия экзогенных морфогенетических гормонов (вкдистерон и ИТ) и их аналогов, рзено как и пептидных гормонов на активность перечисленных ферментов, а также выяснение роли оксидоредуктаз в выработке комнатными мухами и рыжими тараканами устойчивости к инсектицидам.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи :

1.Сопоставить динамику активности ферментов окислительно-восстановительного комплекса в онтогенезе мучного хрущака и американского таракана.

2.Изучить воздействие екзогеннкх морфогенетических гормонов (вкдистерокэ и KIT) к их аналогов на активность а-ГФДГ,Г-6-ФДГ, СДГ, МДГ и ДДГ у вышеназванных тест-объектов.

3.Исследовать воздействие пептидных гормонов, содержащихся в экстракте кзрдиальных тел (КТ), и синтетических проктолина и

адшюкинетического гормона (АКТ) II на активность дещцрогеназ-ного комплекса ферментов.

4.Провести сравнительный анализ активности а-ГФДГ, Г-Б-фЦГ, СДГ, МДГ и ДДГ у чувствительных и резистентных к инсектицидаи рас комнатных мух и рыжего таракана.

Научная новизна работы. Впервые исследована динамика активности а-ТФДГ, Г-Б-ФДГ, СДГ, шДГ и ДЦГ б онтогенезе мучного хрущака и американского таракана и изучено влияние экзогенных морфогене-тических гормонов (экдистерона и ВТ) на их активность.

Исходя из результатов сравнительного анализа воздействия пептидных гормонов-адипокинетического II, проктолина и экстракта кардиальных тел имаго американского таракана установлено,что последние обладают углевод- и лшшдмобилизувдей активностью.

Впервые сформулирована концепция о роли ферментов дещщю-геназного комплекса в выработке насекомыми устойчивости к различным инсектицидам.

Практическое значение работы. Исследование гормональной регуляции активности дегидрогеназного комплекса ферментов у мучного хрущака и американского таракана позволило установить связь между действием ввеноидов и нарушением энергетического обмена у тестируемых насекомых, что возможно использовать при разработке биохимических методов скрининга различных инсектицидов.

Исходя из данных сравнительного анализа уровня активности дегидрогеназного комплекса ферментов у чувствительных и резистентных рас комнатных мух и рыжего таракана сделан вывод об учас -таги тестируемых ферментов в фэрьпфовата устойчивости насекашх к инсектицидам, что существенно для разработки биохимических проблем резистентности и практических рекомендаций по применению химических средств защиты растений. Кроме того, результаты иссле -дований включена в лекционной щ^е факультатива "Гормональная регуляция обмена веществ у насекомых" для студентов биолого-химического факультета МПГУ им.В.И.Ленина.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на симпозиуме молодых ученых (Курск,1393),на V Европейском знтомо-

логическом конгрессе (Иорк-Англия,1334), нз научной конференции б МШУ им, В • И • Ленина (Москва, апрель 1994), на кафедре органической и биологической химии МПГУ им.В.И.Ленина (сентябрь, 1934).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 работ.

Структура и Объеы работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы (глава I), освещавшего степень изученности ферментов дегидрогеназного комплекса и их гормональную регуляцию у насекомых; описания объектов к методов исследования (глава 2); изложения и обсуждения полученных экспериментальных результатов (главы 3-5); заключения; выводов и списка цитируемой литературы (210). Работа изложена на 183 страницах машинописного текста и включает 36 таблиц.

Экспериментальная часть.

Материалы и методы исследования.

Материалом для исследования служили личинки, куколки и имаго большого мучного хрущака Tenebrio molitor, личинки и имаго амери -капского таракана Fsrlplansta ssssricsna, чу so тзктелъзая я резне -тентзая расы кешатаой ыушг íftiStfa degestios п чувствительная я резистентная расы рыжего таракана Blatella germanica, выращенных в инсектариях РНИИ химических средств защиты растений и РНИЙ дезинсекции и токсикологии (г.Москва).

Суммарную фракцию экстракта кардиальных и прилежащих тел по лучали по методу Сейжерт с соавторами (Seigert et al-,1987).Экстракт КТ-ПТ использовали для инъекции имаго американского таракана и мучного хрущака, вводя каждому насекомому по Юмкл его (содержит Q.3 эквивалента парк КТ-ПТ). 10 М растворы синтетических АКТ II и ггроктолина инъецировали по 10 мкл/особь. Воздействие препаратов на активность ферментов дегидрогеназного комплекса (а-ГфЦГ,Г-Б-ФДГ, СДР, МДГ и ЛДГ) в Шфовом теле американского таракана и мучного хрущака оценивали через 30 минут после инъекции.

Для исследования влияния морфогенетических гормонов на активность дегидрогеназ у подопытных насекомых использовали препараты бкдистерона(83^р1а,США),ювенильного гормона111(Бегта,ФРГ). При выяснении механизма гормональной регуляции активности ферментов дегидрогеназного комплекса и их множественных форм за I час до инъекции екдистерона и ювенильного гормонаIII, куколкам и имаго мучного хрущака и американского таракана вводили водный раствор актиномицина Д-ингибитора транскрипционных процессов и пуромицина-классического ингибитора трансляции. На 1г живой массы тест-объектов вводили 5мкг актиномицина Д (Бегуа, ФРГ) и 1ыкг пуромицина, растворенных в 1мкл бидистиллированной воды. Через I час после инъекции ингибиторов насекомых вводили экдистерон в количестве Юмкл/особь, приготовленный на ?л-ном водном растворе втилового спирта и обрабатывали их топикально по Хмкл раствора ювенильного гормона /II (50мкг/особь), приготовленного на 50%-ном ацетоне. При исследовании влияния ювекоидов на активность мно-кественных форм ВДГ, ДДГ и а-ГФДГ куколок мучного хрущака топикально обрабатывали 0,1%-ным раствором альтозида 5Е в ацетоне {Доской,США) и в той ае концентрации пятью его аналогами (препараты 0Ф-П58, 3-5ТТ, Ш1-А, РВ-53 и 05-010-91), полученными из РНИИХСЗР г.Москва, в количестве I мкл/особь.

Субклеточные фракции жирового тела получали по методу дифференциального центрифугирования Финдлена (Финдлен, 1390). Чистоту полученных фракций контролировали определением активности СДГ (митохондриальная фракция). Содержание белка в пробах определяли по методу Лоури (1оэту et а1., 1351).

Активность дегидрогеназ определяли спектрофотометрически по методу Ещенко и Вольского (Прохорова,138Э) и энзимблектрофорети-чески (Филиппович, Щеголева,1367).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ 05СЩЕНИЕ

Активность ферментов дегидрогеназного комплекса в онтогенезе мучного хрущака к американского таракана. Полученные данные

об изменении активности дегидрогеназного комплекса ферментов б онтогенезе представителей двух различных отрядов с полным (мучной хрущак) и неполным (американский таракан) приращением свидетельствуют о том, что уровень активности изученных ферментов виде- и фазоепецифичен. Изменения активности дегидрогеназ у Те пеЬг1о ШОПйСГ связаны с критическими точками развития насекомого, когда в его организме осуществляются такие процессы, как линька, метаморфоз, питание и репродукция. Как правило, активность дегидрогеназного комплекса ферментов повышается к середине личиночного и кукслочного развития, и, особенно, в период формирования репродуктивной системы. Линочше не процессы и периоды метаморфоза сопровождаются, как правило, некоторым снижением активности дегидрогеназ. Такой четкой закономерности б изменении динамики активности дегидрогеназ, связанный с критическими точками развития мучного хрущака, не наблюдается в онтогенезе американского таракана. Для последнего вида характерно плавное повышение активности дегидрогеназ на личиночных стадиях развития за исключением МДГ(см табл.1) и резкий яодьем уровня дыхательных ферментов на имзгинзльной стадии развития,связанный, по—ви^дмому, с предстоящей репродукцией и более активным образом кизни, со-проволщающимся повышением активности газообмена и ферментов окис -лит-&л!)30-вооотазоаат&лъного комплекса.В ц&и-ом получено^ об активности ферментов окислительно—восстановительного комплекса в онтогенезе исследованных насекомых подтверждает разницу б метаболических процессах, протекающих у насекомых с полным (мучной хрущак) и неполным(американский таракан) превращением.

Полученные экспериментальные данные представляют первое сравнительное исследование динамики активности ферментов дегидрогеназного комплекса в процессе развития представителей насекомых двух различных групп, т.е. с полным и неполным превращением. Эти данные показывают, что уровень активности пяти изученных дегидрогеназ фазоепецифичен и связан с критическими точками развития тестируемых насекомых. Вместе с тем, наличие положительной корреляции активности ферментов окислительно-восстановительного

-fí-

комплекса с титром ЮГ б начале куколочного развития и у имаго, и о титром экдистерока на фазе имаго дает основание высказать

Таблица I.

Динамика активности дегидрогеназ в онтогенезе Perípianeta americana.

Наймено-вание фермента Активность фермента в нмоль НАДН или НАДФН в минуту на мг белка.

личинки ШлЗГО

Iвозраст I1возраст Швозр, IV возр.

а-ГФДГ 2,57*0,41 3,31^0,51 2,72*0,23 3,03*0,25 3,35*0,57

Г-6-ФДГ 3,78*0,38 8,73*0,60 8,08*0,44 3,01*0,18 16,28*0,37

слг 6,58*0,50 3,24*0,27 3,62*0,34 13,44*0,44 19,22*0,48

W 7,07^0,33 10,31*0,БВ 10,37*0,5 3,15*0,43 17,78*0,48

лдг 4,56*0,32 4,70*0,50 5,32*0,55 5,64*0,55 7,48*0,24

Таблица 2.

Динаьйпса активности дегидрогеназ е онтогенезе Tenebrío molítor.

Наименование фермента Активность фермента в на нмоль НАДН или НАДФН в ыг белка. минуту

личинки куколка имаго

IIвозр. Швозр 1Увозр. начало серед. конец

П.-ГФТГГ 3,43 10,52 6,28 6,10 13,87 16,58 22,88

+п пп —UcJ in Л я ±0,43 in се ±0,23

Г-6ЧВДГ 6,43 11,82 7,31 5,78 11,66 13,22 20,64

*0Ч48 ±0,45 *€,?8 ±0, IB £Г> АЛ -4-Í *0,б5

птгл UAÍ 10,53 12,30 13,40 5,41 1Б,41 3,82 13,32

*D, 50 Ч).ЗБ ±0,22 ±0,28 Ч),48 *0,55

ьщг 10,22 12,48 8,44 7,20 14,48 10,32 8,28

±0, 3? 4¡,2Q •и, ,_>.- ±0,25 ±0,55

ДДГ ТТЛ f, 11 3,44 12,32 3,28 10,75 Б, 58 12,41

±0,45 ±0,32 *0,Б0 ±0,35 ±0.32 Ч], 38 *0,48

предположение об эндокринном контроле активности этих ферментов на отмеченных стадиях развития мучного хрущака и американского

Га устала >

Гормональная регуляция активности дегидрогеназ у мучного хрущака и американского таракана. Для проверки предположения о гормональной регуляции деятельности а-ГФДГ, Г-6-ФДГ,СДГ,МДГ и ЛДГ было исследовано влияние экзогенных морфогенетических гормонов (екдистерон и КГ) и пептидных гормонов (экстракт КТ, прок-толин, АКГП) на их активность у имего мучного хрущака и американского таракана.

Влияние пептидных гормонов на активность дегидрогеназ мучного хрущака и американского таракана. Нами установлено, что как в цитозодьной, тзк и в мктохондриальной фракциях жирового тела мучного хрущака, под влиянием экстракта кардиальнкх и прилежащих тел возрастает суммарная активность исследуемых ферментов, причем в наибольшей степени а-ГФДГ и СДГ. Аналогичный эффект наблюдается и при воздействии других пептидных гормонов на ферменты дегидрогеназного комплекса(табл. 3).

Анализ данных, полученных при исследовании влияния пептидных гормонов на активность множественных форм а-ГФДГ, МДГ и ЛДГ б цитозольной и митохондриалыюй фракциях жирового тела мучного хрушака, показал, что все пептидные гормоны проявляют стимулирующий эффект по отношению к выявленным формам ферментов. Причем активность а-ГФДГ под влиянием экстракта кардиальнкх и прилежа-щих тел повышается в цитозольной и митохондриальной фракциях сс— ответственно на 806, Б"/. и 370,3:;. Суммарная активность СДГ под влиянием экстракта кардиальных и прилежащих тел возрастает на 275,8% в цитозольной и на 413,6% в митохондриальной фракции. Данная тенденция сохраняется и для Г-6ЧВДГ, МДГ и ЛДГ.

При исследовании влияния пептидных гормонов на активность дегидрогеназ жирового тела американского таракана, были получены аналогичные результаты.

-10- Таблица 3.

Влияние экстракта кардиальных и прилежащих тел, на суммарную активность дегидрогеназ жирового тела имаго мучного хрущака.

Наимено— ваше Активность фермента в нмоль НАДН или НАДФН в минуту на мг белка. Активирование или

фермента цитозольная фракция митохондриальная фракция ингибирование (х).

контроль экстракт ттт/тч Г\.1 их^ х ) контроль экстракт КТ-ПТ(П) I т т X X

лг тг-^тгр и. 1 •л'Д! 1,53 13,78 2,83 15,78 +806,6 +438,6

43,24 43,31 —0,28 +-0,31

Г-Б-ФДГ 3,60 15,43 3,82 16,30 +330,3 +342,4

±0,27 4), 22 '41,24 43,41

СДГ 4,46 16,76 п ЛК. г 9 38,71 +275,8 +413,6

Ю,38 Ю,31 ю,зз 4?, 32

ыдг 4,48 14,70 10,66 1/1 ЛТ СЧ, IX +228,1 +128,3

41,15 41,23 41,13 41,40

лдг 5,76 21,64 6,85 20,66 +275,7 +201,6

43,27 43,57 43,43 41,88

Влияние Бкдистерока на активность дегидрогеназ мучного хрущака и американского тараканаНаш установлено, что вкдистерон оказывает стимулирующее воздействие на активность дегидрогеназ, участвующих как в липидном, так и углеводном обменах. Причем активирующий эффект екдистерона проявляется как на суммарном уровне активности ферментов (табл.4) дегидрогеназного комплекса, так и на уровне множественных форм. Так, при исследовании суммарной активности дегидрогеназ в жировом теле мучного хрущака оказалось, что более отзывчивы к воздействию вкдистерона Г-Б-ФДГ и СДГ (их активность в.цитозольной фракции возрастает на 124,87. и 104,8л соответственно, а в митохондриальной фракции на 45,6% и

лап

мои, и/. ^ ■

Следует подчеркнуть, что инъекция экдистерона сопровождается мощным подъемом в деятельности митохондриальной сукцгшатде-гидрогеназы, активность которой возрастает е 3,5 раза по сравне-

-22-

нию с контрольными вариантаии.

Необходимо отметить, что в целом механизм гормонального активирования а-ГФДГ, Г-6-ФДГ, СДГ, МДГ и ДДГ у американского таракана совпадает с таковыми у мучного хрущака. Более того, регуляция активности дегидрогеназ в обеих субклеточных фракциях осуществляются как на транскрипционном, так и на трансляционном уровне, как у того, так и у другого.

Таблица 4.

Влияние вкдистерона, актиномицина Д и пуромицина на суммарную активность дегидрогеназ в штозольной фракции жирового тела имаго мучного хрущака.

Наименование фермента Активность фермента в нмоль НАДК или НАДФН в минуту на мг белка Активирование или ингибитювание ('/.').

контроль экдисте ран актиноми цин Д пуромицин 8КДИС-терон актино мицицй пуро МИНИН

а-ГФДГ 4,ЗБ +п т Л -ХУ) х-ч 9,78 ±0,22 3,83 ±0,25 4,00 ±0,13 +37,2 -60,2 -53,1

Г-Б-ФДГ Б, 24 ±0,14 14,03 ±0,37 7,60 ±0,19 5,23 ±0,13 +124,8 -45,8 -62,3

СДГ 8,32 +л па —и'щ С^и 17,04 ±О.ЗЭ 7,26 ±0, 15 4,48 ±0,13 +104,8 -57,4 -73,7

№ 10,38 ±0,24 1Б,ЗЭ ±0,35 6,14 ±0,23 7,6? ±0,13 ►57,3 -62,5 -53,2

ддг 12,0Е %38 29,18 Ю.35 10,32 *9,34 8,61 ±0,22 +142,2 -62,6 -70,5

Воздействие ввешльного гормона на активность дегидрогназ мучного хрущака и американского таракана. Ювенильше гормоны контролируют морфогенетические процессы развития насекомых, подавляя их метаморфоз, и регулируют у них обмен веществ и гонадотроп-ное действие. Установлено,что у насекомых с полным превращением •Евенильнке гормоны, как правило, присутствуют у личинок всех возрастов. Согласно современным данным, действие ювекильного гормона в организме насекомых затрагивает белковый, нуклеиновый, углеводный и липщшый обмен.

Согласно нашим данным в действии ЮГ прослеживается стимулирующее влияние на авробные и анаэробные дегадрогеназы (табл.5). В митохондриальной фракции наиболее отзывчивыми к воздействию ЮГ являются МДГ и а-ГФДГ, активность которых возрастает под влиянием морфогенетичбского гормона на 124/; и соответственно. Воздействие ювенкльного гормона у имаго мучного хрущака и американского таракана сопровождается через 24 часа после инъекции повышением активности дегидрогеназ. Однако четко прослеживается тенденция, связанная с активирующим воздействием ЮГ III на активность дыхательных ферментов митохондриальной фракции жирового тела мучного хрущака и американского таракана.

Исследования по гормональной регуляции ферментов дегидроге-назного комплекса мучного хрущака и американского таракана позволяют сделать вывод о том, что стимуляция активности изученных ферментов ювенильным гормоном осуществляется на разных уровнях.

Таблица 5.

Влияние ювенкльного гормона III на суммарную активность дегидрогеназ в митохондриальной фракции жирового тела, имаго мучного хрущака.

Наименование фбрелсКТа Активность фермента в нмоль НАДН или НАДФН в минуту на мг белка Активирование или ингибнрование (У.).

контроль ЮБ8 ШХЛЬНЫЙ гормон III

а-щцг 4,22*0,35 Г щ *tr -Ч^ч ün +77,0

Г-6-ФДГ п tm+n nn г <vjc-Hj, cu 10,28*0,38 +36,7

СДГ 25,44*0,45 41,52*0,42 +63,3

ццг 10,38*0,38 23,27*0,20 +124,2

ЛДГ 10,53*0,30 II,48*0,55 +3,0

Влияние ввеноидов на активность а-ГФДГ, МДГ и ЛДГ белых куколок мучного хрущака. Анализ экспериментальных данных, посвященных изучению влияния ювеноидов на активность множественных форм дегидрогеназ, свидетельствует о том (табл.Б), что тошкаль-

ная обработка белых куколок вышеназванными препаратами сопровождается значительными изменениями в активности множественных форм а-ГЩЦГ в первые сутки исследования, в то время, как по отношению к деятельности ЭДЦГ и ДДГ стимулирующий эффект соединений проявляется не столь четко.

Таблица 6.

Влияние ювеноидов на активность множественных форм а-глицерофзофатдегидрогеназы белых куколок мучного хрущака.

ИГ множественных форм Активность фермента в условных единицах. Активирование или ингибигюваниеОО ■

контроль НИ-4 2-БТТ НИ-4 2-6ТТ

0,24 22,65*0,46 57,6042,31 46,2243,75 +152,4 +106,2

П 11 и, ^и 33,37*0,36 63,05-1,12 53,744,12 +106,4 +33,3

Суммарная активность 55,63 43,46 125,65 4,71 33,36 43,34 +125,9 +73,7

Как следует из приведенных данных, биохимический эффект испытанных ювеноидов зависит от структур« соединений. а-ГФДГ оказалась наиболее отзывчивым ферментом к действию эталонного ювеноида-альтозида. Причем, активность более высокоподвижной формы под влиянием ювеноида возрастает почти вдвое. Эта форма тест-фермента оказалзсь наиболее чувствительной к топикальной обработке препаратами НИ-4 и 2-БТТ, что сопровождалось повышением суммарной зктивности а-ГФДГ белых куколок мучного хрущзкэ.

Сукадируя полученные данные сравнительного анализа воздействия эталонного препарата альтозида и пяти вновь синтезированных препаратов, представляется возможным рекомендовать к качестве биохимического теста для осуществления скрининга перспективных ювеноидов с инсектицидной активностью показатель уровня деятельности а-ГФДГ белых куколок мучного хрущака.

Роль дегидрогеназ в выработка насекомыми устойчивости к инсектицраи. С целью выяснения возможной роли дегидрогеназ в

-механизмах устойчивости насекомых к инсектицидам нами проведен сравнительный нализ активности а-ГФДГ, Г-Б^ДГ, СДГ, МДГ и ЛЕГ у чувствительной и резистентной к хлорофосу рас комнатных мух. Несмотря на невысокий показатель резистентности, равный 20, суммарная активность а-ГФДГ возрастает на 33, ?'/., а активность СДГ на 39,Эх. У резистентных к хлорофосу рас комнатных мух наблюдается повышение активности и других исследуемых дегидрогеназ (Г-5-ФДГ-аз,57.; МДГ-22,1% и ЛДГ-11,5%). Интересен тот факт, что в развитие устойчивости у мух вносят существенный вклад отдельные множественные формы исследуемых ферментов. Так, активность высокоподвижной формы а-ГФДГ (EÍ 0,35) у резистентных рас по сравнению с чувствительными выше на 42,4%, а активность одной из мнокественных форм СДГ у чувствительной к хлорофосу расы комнатках мух выше по сравнению с чувствительной на 103,7%. Аналогичные данные получены при сравнительном анализе активности "ДГ и

лдг.

Таблица 7.

Сушvi арНа Я аКТИБНОСТЬ фОрЫ6 КТ ОВ Д&РйДрОГвНаЗНОГО

комплекса у чувствительной и резистентной к хлорофосу р 3 С КСаЗН 3 тных мух •

Наименование фермента Активность фермента в нмоль КАДН или НАДФН в минуту на мг ucjuva. Активирование или ингибирование

с хлорофос т> rv хлорофос

п TVTvTTT4- IA~A уДх ц т> + п О, г d •*■ U,CJ 8,34 * 0,31 +33,0

Г-6-1ВД 13,24*0,82 j 53 ~ Ij32 +23,5

СДГ 10,76*0,72 14,38 ± 0,62 +33,2

МДГ 12,54*0,52 15,32 * 0,51 J.T1 т "^CSÜJ 1

тттт ¿VU 16,8243,83 18,76 * 0,64 + 11,5

Учитывая тот факт, что из пяти исследованных ферментов именно СДГ является наиболее показательным внзимом при изучении резистентности, нами осуществлен анализ ее активности у трех различных рас комнатных мух, отличащихся по показателю резистентности. Данные этого анализа представлены в таблице 7. В результате этого исследования удалось установить четкую корреляцию между уровнем активности СДГ и показателем резистентности у комнатных мух. Экспериментальные данные, полученные нами при изучении влияния ФОС на активность множественных форм исследованных ферментов, вполне согласуются с ранее проведенными исследованиями о вкладе определенных молекулярных форм ацетилхолинэстеразы и кислой фосфатазы в детокенкацию инсектицидов и развитие' биохимических механизмов устойчивости комнатных мух к испытанным инсектицидам (Спирина,1381; Рославцева, Золотова, Агашкова, 1332; Филиппович, Рославцева, Кутузова и др., 1388). Наличие ясно выраженной корреляции между увеличением активности дегидрогеназ и определяемым токсикологически показателем резистентности позволяет обосновать биохимический способ оценки состояния резистентности у насекомых к инсектицидам, а также осуществлять с помощью ферментативных тестов скрининг перспективных соединений с инсектицидными свойствами.

Данные сравнительного исследования суммарной активности де-гидрогеназного комплекса ферментов у чувствительной и резистентной к перметрину популяции рыжего таракана показывают, что наибольшие изменения у резистентных рас наблюдаются в активности а-ГФДГ, Г-6-ФДГ и СДГ. Суммарная активность а-ГФДГ возрастает у резистентных тараканов на 134,IX, а активность Г-Б-ФДГ и СДГ соответственно на 12Б,7 и 114,3л.

Учитывая то обстоятельство, что в процессе формирования резистентности у комнатных мух, связанной с детоксицирующими ферментными системами, обладающими множественными формами, лежит усиление активности или устойчивости отдельных молекулярных форм, наш проведен сравнительный анализ активности множественных Форм дегидрогеназ у чувствительной и резистентной к перметрину популя-

щш рыжего таракана (таблица 8). Оказалось, что активность форш СДГ с Е1 0,50 возрастает на 333,Бх.

Таблица 8*

Активность &»:ножв сгветтх форы ферментов дегадрогеназкого комплекса у чувствительной и резистентной к перметрину популяции рЫНбГО ТЗрЗКЗНЗ.

Нзшено- БЗНйб И мно Активность фермента в условных единицах. Активирование или

¡БврмбКТа кест Еен-ных форм Б перметрин н иврМбТрИК ингибирование 00-

а-ГФДГ 0,24 20,16 ± 0,35 51,05 ± 0,2? хТСО П с

0,32 10,01 - 0,15 20,06 ± 0,21 +100,2

Суммарная активность 30,17* 0,25 71,11 ± 0,32 +135,?

сдг 0,14 2,78 ^ 0,2? 3,40 ± 0,25 хПП О ^сс, о

0,30 10,10 * 0,1? 33,07 ± 0,31 +286,8

0,50 5,12 ± 0,45 ПС + п о л г и — и 7 +383,6

Суммарная активность ТО ПП + П ОГ1 1и,ии и^^и 76,23 ± 0,30 +273,5

Идентифицированные форш а-ГЗЩГ (Е£ 0,24 и 0,32) оказались чувствительными к действию перметрика, их активность выше у резистентной популяции соответственно на 153,27. и 100,2/:. Полученные данные свидетельствуют об участии дегидрогеназ в выработке у насекомых устойчивости к инсектицидам.

вывода.

I.Изменение активности а-ГФДГ, Г-6-ФДГ, СДГ, МДГ и ЛДГ в онтогенезе мучного хрущака и американского таракана характеризуется видовой и фазовой специфичностью, что свидетельствует об особенностях метаболических процессов, протекавших у насекомых с полным (ТешЬг1о тоИХог) и неполным (Рег1р1апеХа ашепсаяа) превращением.

3.Сравнительное исследование воздействия экстракта кардиальных и прилежащих тел, адипокинетического гормона II и проктолина на активность дегидрогеназ жирового тела американского таракана и мучного хрущака свидетельствуют о том, что, во-первых, экстракт кардиальных и прилежащих тел тестируемых насекомых содержит субстанции, проявляющие гипергликемическув и гиперлипемическую активность; во-вторых, адипокинетический гормон II проявляет как ишергликемический, так и гиперлипемичэский эффект; в-третьих, пентапептид проктолин, входящий в семейство миоактивных пептидов, принимает участие в гормональной регуляции ферментов углеводного и лишдного обменов.

3.Обработка имаго мучного хрущака и американского таракана экзогенными морфогенетическими гормонами (вкдистерон и юеэиильный гормон III) вызывает изменения как в суммарной активности ферментов дегидрогеназного комплекса, так и в активности множественных форм а-ГФДГ, ЫДГ и ЛДГ. Показано, что эффект испытанных морфогенетических гормонов носит видо- к тканеспецифичный характер.

4.Установлено, что индукция активности а-ГФДГ, Г-Б-ЩГ, СДГ, МДГ и ЛДГ в субклеточных фракциях жирового тела имаго американского таракана и мучного хрущака под воздействием экдистерона осуществляется (по данным опытов с актшюмицином-Д) на транскрипционном, а объем их биосинтеза (по результатам воздействия пуромицина)-контролируется на трансляционном уровне.

5.Показано, что топикальная обработка ювеноидами вызывает увеличение суммарной активности дегидрогеназ у белых куколок мучного хрущакз и оказывает дифференцированное влияние на активность множественных форы МДГ, ЛДГ и а-ГФДГ. На основании сравнительного анализа биохимического анализа эффекта альтозида и 5-ти вновь синтезированных ювеноидов на изменение уровня активности а-ГФДГ два из них (с шифрами КИ-4 и 2-6ТТ) можно рекомендовать в качестве перспективных инсектицидов, а а-ГФДГ-в качестве биохимического критерия для скрининга синтетических

ЮВ&НОИДОВ>

6.Сравнительное исследование активности дегидрогеназного комплекса ферментов у чувствительных и резистентных к ФОС и пире троидам рас комнатных мух и рыжего таракана продемонстрировало участие изученных дегидрогеназ в развитии резистентности у испытанных насекомых. На основании полученных данных представляется возможным рекомендовать в качестве биохимического критерия оценки резистентности уровень как суммарной активности а-ГФДГ и СДГ, так и их отдельных множественных форм.

Список опубликованных работ:

Г.Кометиаки И.В., С-змсонова М.В., Кутузова Н.М., Филиппович 3D.Б. Сравнительное исследование дегидрогеназного комплекса ферментов у различных рас комнатных мух Muscs domustica. // В сборнике :"Научный поиск¡Исследования молодых ученых"./ Часть 2.

-1ЭЭЗ. -о. 33-38

2.Кометиани И.Б., Кутузова Н.М., Филиппович Ю.Б. Влияние экдистерона на активность множественных форм малатдегидрогеназы мучного хрущака Tenebrio molitor.// В сборнике "Научный поиск:Исследования молодых ученых"./ Часть 2. -Курск. -1993. -о. 55-5?.

3.Кометиани И.Б., Кутузова K.M., Филиппович Ю.Б. Блилпие экстракта кардиалышх тел, проктолина и адипошнетического гормона на активность ферментов дегидрогеназного комплекса жирового тела американского таракана. // Деп. в ВИНИТИ. 20.05.34. -N I2S2-B34. -Москва. -1Бс.

4.Kometiani I.B., Kutusowa N.M. T'üe effect of ecdysterone and Juvenile hormone on tbe activity of molecular forms enzymes of Anterahea pemy and Periplaneta americana. // 5-tti European Congres of Entomology Univ. of York, 29 August-2 September 1994.

б.Кометиани И.В., Кутузова Н.М., Филиппович Ю.Б. Сравнительное исследование дегидрогеназного комплекса ферментов у чувствительной и резистентных рас комнатных мух и рыжего таракана. // Деп. в ВИНИТИ. -2Б.10.94. -N 243Q-B94. -Москва.