Сравнительное исследование ферментативных механизмов резистентности к пиретроидам у насекомых

Романова, Ирина Геннадьевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Сравнительное исследование ферментативных механизмов резистентности к пиретроидам у насекомых
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Сравнительное исследование ферментативных механизмов резистентности к пиретроидам у насекомых"

На правах рукописи

Романова Ирина Геннадьевна

СРАВНИТЕЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ МЕХАНИЗМОВ РЕЗИСТЕНТНОСТИ К ПИРЕТРОИДАМ У НАСЕКОМЫХ

Специальность 03.00.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2004

Работа выполнена в Московском педагогическом государственном университете на кафедре органической и биологической химии биолого-химического факультета

Научные руководители:

доктор биологических наук, профессор Филиппович Юрий Борисович |

кандидат биологических наук, доцент Кутузова Нина Михайловна

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Рославцева Светлана Александровна

кандидат биологических наук Шамшина Татьяна Николаевна

Ведущая организация - ВНИИ химических средств зашиты растений

Защита состоится «20» декабря 2004 года в 16 час. 30 мин. на заседании Диссертационного Совета Д- 212.154.17 при Московском педагогическом государственном университете по адресу: 129278, Москва, ул. Кибальчича, д.6, корп.5,ауд.506

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Московского педагогического государственного университета по адресу: 119992, Москва, ул. Малая Пироговская, д. 1

Автореферат разослан

Ученый секретарь Диссертационного совета

Характеристика работы.

Актуальность темы. Резистентность вредных организмов к инсектоакарицидам, фунгицидам и гербицидам является глобальной проблемой. В настоящее время борьба с резистентностью или предотвращение её возникновения включает химические, агротехнические, биологические и биотехнологические мероприятия. Резистентность динамический феномен, развивающийся в весьма различных пределах у разных видов и даже у одного и того же вида при различном давлении отбора (Рославцева, 2003). Интенсивное применение химических средств борьбы с вредителями сельскохозяйственных культур привело к возникновению у них резистентное™ к пестицидам, что является причиной резкого снижения их эффективности в настоящее время. Отмечают, что более половины всех резистентных видов вредителей сельскохозяйственных культур сформировали устойчивые популяции к 2-м или более инсектицидам, принадлежащим к пяти основным их группам (хлорорганические инсектициды, пиретроиды, карбаматы, фосфорорганические, регуляторы роста насекомых гормональной и антигормональной природы). Для того чтобы противостоять катастрофической перспективе потери чувствительности основных вредителей растений к пестицидам необходимо знать, каким образом возникают механизмы резистентности. Основным стратегическим методом в борьбе с резистентностью является ротация пестицидов, имеющих различные механизмы действия, открытие новых классов инсектицидов, а также разработка смесевых композиций (инсектицид - синергист) и внедрение их в практику сельского хозяйства наряду с уже используемыми препаратами.

Пиретроиды - синтетические аналоги природного пиретрина, занимают в настоящее время одно из первых мест по масштабам производства и применения химических средств защиты растений. Основной мишенью действия пиретроидов являются натриевые каналы мембран нервных клеток. Характер и скорость метаболизма зависит от структуры пиретроида, его пространственного строения и отличается у разных видов и популяций насекомых (Филиппович и др. 1989; Рославцева, 2003). Применение пиретроидов, как и других препаратов, как правило, приводит к формированию у насекомых резистентности к инсектицидам. Явление резистентности характеризуется комплексом отдельных физико-химических, физиологических и биохимических показателей.

Анализ литературных данных свидетельствует о том, что наибольший вклад в метаболизм инсектицидов и механизм формирования устойчивых к ним популяций членистоногих вносят монооксигеназы, эстеразы и глутатион-8-трансферазы (Баканова,1993; Рославцева, 1997,2003). Деградация ксенобиотиков, осуществляемая, в основном, тремя отмеченными путями - окислительно-восстановительным, гидролитическим и трансфертным, играет важную роль на определенной стадии развития организмов, тесно взаимосвязана со структурными особенностями применяемых соединений и видом насекомых.

Универсальным способом обезвреживания токсинов и ксенобиотиков в организме животных является их окислительное разрушение микросомальными оксигеназами. Повышение каталитической активности оксигеназ у резистентных членистоногих связывают с изменением соотношения отдельных множественных молекулярных форм цитохрома Р-450, индуцируемого генами-регуляторами, или с увеличением общего количества содержания цитохрома вследствие амплификации

структурных генов, детерминирующих его синтез (Agosin, 1985; 1984; Rose, Walbant, 1986).

При сравнительном исследовании активности монофенолмонооксигеназы (тирозиназы) у чувствительных и резистентных рас комнатных мух, селектируемых карбаматами и пиретроидами, показано участие этого фермента в развитии устойчивости и формировании у них видоизмененных покровов и сдвигов в содержании медиаторов в нервной системе (Животенко, 1989).

Более специализированный эстеразный комплекс ферментов может участвовать в метаболизме всех трех наиболее используемых в настоящее время классов инсектицидов - фосфорорганических соединений, карбаматов и пиретроидов (Еремина и др., 1992, 1996; Рославцева, 1997,2003). Молекулы этих соединений содержат сложноэфирные связи, которые могут быть гидролизованы эстеразами. Показано, что детоксикация пиретроидов с помощью эстераз носит видо - и тканеспецифичный характер.

Сравнительное исследование активности АТФазного комплекса ферментов у чувствительной и резистентных к ФОС, карбаматам и пиретроидам рас комнатных мух продемонстрировало существенную активацию Na+, K+ - АТФазы на фоне ингибирования других АТФаз, что позволило сделать заключение автору об универсальности влияния инсектицидов разных групп на ферменты АТФазного комплекса насекомых и, следовательно, о сходстве механизмов их действия, а также об участии отдельных АТФаз в формировании резистентсности у изученного тест-объекта (Козлова, 1991). Важнейшим механизмом регуляции ферментных систем в клетке, является существование у ферментов множественных форм, отличающихся по физико - химическим свойствам, обеспечивает пластичность обменных процессов, детерминирует адаптационные возможности организма, популяций и вида в целом и таким образом представляет собой один из основополагающих принципов регуляции жизнедеятельности животных организмов. Детальное исследование роли кислых фосфатаз и дегидрогеназного комплекса ферментов американского и рыжего таракана в выработке устойчивости к перметрину позволило сделать заключение о существовании в тканях этих видов насекомых молекулярных форм тестируемых ферментов, реагирующих на воздействие этого инсектицида (Кометиани, 1995; Сёмина, 2000). Установленный усиленный синтез определённых форм испытанных энзимов определяет степень устойчивости тараканов к пиретроидам и тесно взаимосвязан с формированием ферментативных механизмов резистентности.

Исходя из изложенного, представляется возможным в качестве биохимического критерия оценки развития резистентности у насекомых к инсектицидам использовать показатель, как суммарной активности ферментов, так и активности их отдельных молекулярных форм.

Цели и задачи исследования. Основной целью нашего исследования явилось сравнительное изучение ферментативных механизмов резистентности к пиретроидным инсектицидам у двух видов насекомых с полным и неполным превращением (колорадский жук и рыжий таракан), равно как и выяснение роли эстераз, фосфатаз и дегидрогеназ в выработке устойчивости к перметрину и циперметрину.

Для достижения этой цели были поставлены следующие основные задачи: 1. Исследовать активность дегидрогеназного, фосфатазного и эстеразного комплекса ферментов в общем гомогенате, грудных мышцах и жировом теле у чувствительных и резистентных к перметрину популяций рыжего таракана.

2. Изучить в сравнительном аспекте активность дегидрогеназ, фосфатаз и эстераз у трёх популяций колорадского жука: чувствительных и устойчивых к перметрину и циперметрину, отличающихся биологическим показателем резистентности к испытанным инсектицидам.

3. Провести сравнительный анализа суммарной активности тестируемых ферментов, а также активности их молекулярных форм в общем гомогенате двух видов насекомых, представителей разных отрядов, колорадского жука (отряд Coleoptera) и рыжего таракана (отряд Blattoidea), с целью выяснения роли малатдегидрогеназы, сукцинатдегидрогеназы, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы, эстеразного комплекса ферментов, щелочных и кислых фосфатаз в выработке устойчивости к пиретроидным инсектицидам.

4. Установить корреляционные отношения между исследованными биохимическими характеристиками различных популяций рыжего таракана и колорадского жука и биологическим показателем резистентности к пиретроидам, а также разработать предложения по применению ферментативных методов тестирования резистентности у представителей различных отрядов насекомых.

Научная новизна работы. Впервые получены комплексные экспериментальные данные, демонстрирующие участие дегидрогеназного, эстеразного и фосфатазного комплекса ферментов в формировании ферментативных механизмов резистентности к пиретроидным инсектицидам у колорадского жука. Впервые проведён сравнительный анализ ферментативного механизма устойчивости к перметрину у двух представителей различных отрядов - Coleoptera -колорадского жука и Blattoidea - рыжего таракана. Показано, что имаго колорадского жука более устойчивы к действию пиретроидов. Обнаружено, что детоксикация перметрина с помощью эстераз носит виды - и тканеспецифический характер. Анализ отзывчивости отдельных эстераз к действию перметрина позволил установить участие в формировании резистентности контрастных по подвижности ацетилхолинэстераз и карбоксилэстераз.

Практическое значение работы. Осуществлено детальное изучение ферментативных механизмов резистентности к пиретроидным инсектицидам у колорадского жука и рыжего таракана и проведено сопоставление полученных биохимических показателей с биологическим уровнем устойчивости у исследованных насекомых. Знание биохимических механизмов резистентности необходимо учитывать при ротации пестицидов, а также при подборе ингибиторов ферментов, ответственных за её развитие. Исходя из различий в уровне суммарной активности тестируемых ферментов, а также активности их молекулярных форм у чувствительных и устойчивых популяций насекомых и корреляции биохимических показателей с уровнем резистентности, предложен энзиматический способ тестирования её развития. Полученные данные вносят значительный вклад в развитие концепции биохимических механизмов действия пиретроидных инсектицидов и формирование к ним устойчивости у насекомых, особенно колорадского жука и могут быть использованы в ВНИИ защиты растений при скрининге инсектицидов. Результаты исследований включены в лекционные курсы кафедры органической и биологической химии, а также применяются при проведении семинарских занятий, спецкурсов студентов биолого-химического факультета МЯТУ Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на межвузовской научно -практической конференции «Актуальные проблемы экологии и безопасности жизнедеятельности» (Москва 2003), а также были неоднократно представлены на научных конференциях и научных семинарах кафедры органической и биологической химии биолого-химического факультета МПГУ (Москва, 2003,2004).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 работ и 2 статьи находятся в печати.

Структура и объём работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы (Глава1), освещающего степень изученности ферментативных механизмов резистентности к пиретроидам у насекомых; описания объектов и методов исследования (Глава 2);изложения и обсуждения полученных экспериментальных результатов (Главы 3-4); заключения; выводов и списка литературы. Работа изложена на 150 страницах машинописного текста и включает таблицы, рисунки и схемы. Содержание работы.

Материалы и методы исследования. Материалом для исследования служили имаго колорадского жука Leptinotarsa decimlineata и имаго рыжего таракана Blatella germanica. Биологический материал получали из инсектария НИИ дезинфектологии Министерства Здравоохранения Российской Федерации (г. Москвы). У рыжего таракана исследованию подвергали общий гомогенат, жировое тело и грудные мышцы, а у колорадского жука - общий гомогенат.

Сравнительное исследование активности тестируемых ферментов проводили у сенситивных, чувствительных (S) и устойчивых, резистентных (R) к перметрину популяций рыжего таракана Blatella germanica и трёх популяций колорадского жука -чувствительные (S), резистентные к циперметрину и резистентных к перметрину (R.2). Популяции колорадского жука были собраны в Можайском районе Московской области. Селекцию устойчивых тараканов и жуков вели методом погружения их в перметрин или циперметрин. Выборка для каждой селекции составляла 2-3 тысячи особей, степень приобретённой устойчивости характеризовали показателем резистентности (ПР), т.е. отношением CKsoRpacbi/ СКМ S расы (R - резистентные и S — чувствительные особи), где CK» - смертельная концентрация, вызывающая гибель 50% особей популяции.

Насекомых препарировали, выделяя тест-ткани - жировое тело и грудные мышцы. Экстракцию растворимых белков общего гомогената и тканей насекомых вели при 0-4°С, растирая их в фарфоровой ступке в Змл физиологического раствора (0.7г NaCl + 0.1 г KCl + 0.032г СаС12 на 100 мл раствора) в течение 15 минут. Полученный гомогенат центрифугировали при 5500g на центрифуге К-24 (Германия) при температуре 4°С в течение 30 минут. Осадок отбрасывали, а над осадочную жидкость фильтровали через слой капроновой ткани для удаления липидной плёнки и определяли в ней содержание белка по методу Лоури (Lowry et al., 1951) после чего исследовали в ней активность ферментов. Суммарную активность эстераз изучали спектрофотометрически (Van Asperen, 1962) с использованием в качестве субстрата а-нафтилацетат.

Фракционирование растворимых белков осуществляли методом анодного энзимэлектрофореза в 5.5%-м полиакриламидном геле (ПААГ). Электрофорез проводили по методу Дэвиса (Davis, 1964) в модификации для растворимых белков насекомых (Филиппович, Щёголева, 1967). На каждую колонку 5.5%-ного ПААГ, диаметром 5 мм и длиной 60 мм наносили по 0.1 мл ферментного образца, содержащего 400-600 мкг белка. В качестве электродного - использовали трис-глициновый буфер (рН 8.3), разбавляя его перед использованием в 5 раз. Электрофорез вели при следующем режиме работы: напряжение - 200-300B, сила тока - 2.6 мА на одну колонку в течение первых 10 минут и 5мА вплоть до завершения электрофореза, температура - 0°С (вода со льдом), продолжительность процесса составляла 40-90 минут.

После окончания электрофореза каждую гелевую колонку погружали в инкубационную смесь специфичную для каждого фермента (см. главу 2). Активности множественных форм ферментов оценивали по площадям пиков на денситограммах, полученных в результате сканирования гелевых колонок на лазерном денситометре фирмы LKB ULTROSCAN XL Enhanced Laser Densitometer. Площадь пиков рассчитывалась автоматически в условных единицах и регистрировалась интегратором LKB 2220 Recording Integrator. Статистическую обработку результатов проводили, используя формульные соотношения из руководства Чарыкова (Чарыков, 1984). Результаты и их обсуждение. Сравнительное исследование активности дегидрогеназного, эстеразного и Фосфатазного комплекса Ферментов у чувствительных (сенситивных) и резистентных к перметрину популяции рыжего таракана. Первым этапом нашей работы было сравнительное исследование активности дегидрогеназного комплекса ферментов у чувствительных и резистентных популяций рыжего таракана. Известно, что оксидоредуктазы ускоряют реакции окисления - восстановления в живых организмах. Характерной их особенностью является способность образовывать в живой клетке системы или цепи окислительно — восстановительных ферментов, осуществляющих многоступенчатый перенос атомов водорода или электронов от субстратов к конечным акцепторам. Являясь двухкомпонентными ферментами с ограниченным набором коферментов дегидрогеназы способны ускорять большое число самых разнообразных окислительно - восстановительных реакций и способствовать адаптации насекомых к изменению факторов окружающей среды: температуры, пищевым субстратам, ксенобиотикам, в том числе и инсектицидам.

В таблице 1 приведены сравнительные данные исследования активности трёх дегидрогеназ: МДГ, Г-6-ФДГ и СДГ у чувствительных и резистентных к перметрину особей имаго рыжего таракана.

Таблица 1.Сравнительная активность дегидрогеназного комплекса ферментов общего гомогената чувствительных и резистентных популяций имаго рыжего таракана._

№ п/п Наименование ферментов ОЭП Форм Активность в условных единицах Активирование или ингибирование; %

S R

1 МДГ 0.20 10.12+0.27 9.04+0.15 -10.7

0.32 13.50+0.64 19.08+0.47 +41.3

0.54 17.40+0.78 21.15+ 1.13 +21.5

Суммарная активность 41.02 49.27 +20.1

2 Г-6-ФДГ 0.10 7.28+0.32 7.14+0.35 -1.3

0.22 12.74+0.57 18.67+0.61 +46.5

0.34 21.53+0.84 32.17+0.92 +49.4

Суммарная активность 41.54 57.98 +39.6

3 СДГ 0.15 2.80+0.09 3.42+0.07 +22.1

0.32 12.25+0.17 30.50+1.15 +148.9

0.50 7.14+0.15 12.17+0.62 +70.4

Суммарная активность 22.19 46.09 107.7

Условные обозначения:

S - чувствительные популяции таракана

R- резистентные к перметрину популяции таракана

Несмотря на отсутствие различий в наборах множественных форм дегидрогеназ и их анодной подвижности активность дегидрогеназного комплекса ферментов значительно выше у резистентных особей по сравнению с чувствительными.

Наиболее заметно воздействие пиретроидного инсектицида на активность формы МДГ с ОЭП 0.32, активность которой возрастает на 41%. Интересно заметить, что активность одной из форм МДГ (ОЭП 0.20) снижается под воздействием перметрина на 10%. Зависимость функционирования изозимов МДГ от колебания температуры и действия инсектицидов изучена у Drosophila melanogaster и Blattella germanica и было чёткое реагирование изоформ МДГ на изменение внешних условий и действие ксенобиотиков (Филиппович, Коничев, 1987; Филиппович идр.,1989; Сёмина, 2000). МДГ представляет собой один из важнейших ферментов насекомых, активно участвующих в энергетическом обмене (особенно в процессе полёта) и метаболизме углеводов. Второй исследованный нами фермент сукцинатдегидрогеназа, участник цикла Кребса, также обладает полиморфизмом и обнаружен в виде трёх электрофоретических различных форм с ОЭП 0.15,0.32 и 0.50В этих опытах показано, что перметрин вызывает наибольшие изменения именно в активности сукцинатдегидрогеназы. Так, у резистентных популяций рыжего таракана почти вдвое возрастает суммарная активность СДГ, а активность формы СДГ с ОЭП 0.32 более чем в два раза. В тоже время исследование отзывчивости Г-6-ФДГ, стартового фермента апотомического распада глюкозы, продемонстрировало, что одна из форм фермента (ОЭП 0.10) не чувствительна к действию инсектицида, зато активность двух других с ОЭП 0.22 и 0.34 повышается более чем на 40%. На таком же уровне проявляется эффект перметрина по отношению и к суммарной активности Г-6-ФДГ. Таким образом, несмотря на невысокий показатель резистентности, равной 10, возрастает суммарная активность всех трёх исследованных дегидрогеназ на 20-107%, что свидетельствует об изменении в энергетическом обмене под воздействием пиретроидов у рыжего таракана. В отношении изменения активности отдельных форм изученных ферментов следует отметить, что в развитии устойчивости у таракана вносят существенный вклад отдельные множественные формы дегидрогеназ и в первую очередь это связано с изменением в активности сукцинатдегидрогеназы. Исходя из этого, представляется возможным в качестве ферментативного критерия оценки развития устойчивости у рыжего таракана на имагинальной стадии развития использовать показатель как суммарной активности СДГ, так и активность отдельных её молекулярных форм.

Следующим этапом данной работы было сравнительное исследование эстеразного комплекса ферментов у чувствительных и резистентных популяций рыжего таракана.

Многообразие функций, в осуществление которых способны участвовать эстеразы, видимо, определяется полиморфностью этой группы ферментов, а также широкой субстратной специфичностью некоторых из них. Функциональное значение эстераз насекомых определяется их участием в регуляции гормонального титра, метаболизма и мобилизации жиров, нервной передаче, синтезе и отчасти транспорте кутикулярных восков, деградации разнообразных ксенобиотиков, деструкции ювенильного гормона, а также в репродукции (Филиппович и др., 1988; Успенский и др., 1988, Шамшина, 1986). Эстеразы насекомых участвуют в метаболизме всех трёх наиболее используемых в настоящее время классов инсектицидов - фосфорорганических

соединений, карбаматов и пиретроидов. Молекулы всех этих соединений содержат сложноэфирные связи, которые могут быть гидролизованы эстеразами (Schoknecht, Otto, 1991, Ерёмина, 1996). Усиленный эстеразный гидролиз - один из важнейших механизмов устойчивости насекомых к пиретроидам. Детоксикация пиретроидов с помощью эстераз характеризуются видовой и тканевой специфичностью. Эстеразы обеспечивают аккумуляцию инсектицидов, играя роль в формировании резистентности. Существует мнение о том, что инсектицидная резистентность рыжего таракана Blattella germanica L. обеспечивается сверхпроизводством эстеразы Е6, роль которой заключается именно в аккумуляции токсических молекул, а не в гидролизе их (Prabhakaran, Kamble, 1995). Таким образом, к настоящему времени накоплен большой объём информации об участии эстераз в формировании инсектицидной резистентности у насекомых. Однако не достаточно полно изучен вклад отдельных эстераз в механизм формирования резистентности и его половая и тканевая специфичность. Цель нашей работы заключалась в выявлении роли эстераз общего гомогената, а также жирового тела и грудных мышц самок и самцов рыжего таракана Blattella germanica L. в формировании устойчивости к инсектицидам, а также в изучении вклада отдельных эстераз в этот процесс.

Эстеразный комплекс ферментов общего гомогената представлен в таблице 2. Спектр эстераз и их анодная подвижность не отличается у чувствительных и резистентных имаго рыжего таракана.

Таблица 2. Сравнительный анализ эстеразного комплекса ферментов общего гомогената чувствительных и резистентных популяций рыжего таракана._

№ ОЭП Активность в условных %

п/п Эстераз Единицах Активации или ингибирования

S R

1 0.07 3.71^0,19 4.21±-0.53 +13.5

2 0,15 12.52^0.23 12.204.20 -2.5

3 0.26 11.78-2.03 23.54^2.17 +99.8

4 0.33 6.13 4.S2 6.17*0.42 +0.6

5 0.46 27.11 —1.03 34.15-1.15 +26.0

6 0.70 9.72*0.75 10.90 *0.82 +12.1

7 0,83 17.32*0.92 41.10-2.37 +137.3

Суммарная 88.29 132.27 +49.8

активность

Как следует из приведённых данных, суммарная активность эстераз почти на 50% выше у резистентных к перметрину популяций рыжего таракана. Кроме того, следует отметить, что наибольший вклад в формирование устойчивости к инсектициду вносят индивидуальные эстеразы с ОЭП 0.26 и 0.83.

Учитывая литературные данные, что у насекомых имеются гены, регулирующие синтез органоспецифических эстераз, например эстеразы 8 в половых органах БговорШа нами был осуществлён сравнительный анализ в двух тканях, жировом теле и грудных мышц имаго рыжего таракана чувствительных и резистентных линий (рис. 1 и 2).

Рисунок №1

Сравнительная активность эстеразного комплекса ферментов жирового тела имаго рыжего таракана

В результате проведенного исследования в контрольных и опытных образцах выявлено 5 зон эстеразной активности в жировом теле насекомого и 4 - в грудных мышцах (ОЭП) 0 15, 0 26, 0 46, 0 71, 0 83 То установлено отсутствие в грудных мышцах эстеразы с самой низкой анодной ОЭП, но, несмотря на это, суммарная эстеразная активность в данной ткани у резистентных особей на 15% (у самок) и на 12% (у самцов) выше, по сравнению с активностью у чувствительных популяций (см табл 3) Исследование эстеразной активности жирового тела и грудных мышц выявило различную роль изучаемых тканей в формировании резистентности Суммарная активность тестируемого ферментного комплекса, выявленная методом электрофореза в ПААГ, в грудных мышцах существенно не различается у

чувствительных и резистентных особей, что, возможно, свидетельствует о незначительном вкладе этой ткани в механизмы устойчивости к инсектицидам (см. рис. 2). Напротив, жировое тело принимает более активное участие в данном процессе.

Сравнительное изучение чувствительных и резистентных насекомых позволило установить, что суммарная активность, определённая спектрофотометрическим методом, эстераз исследуемых тканей в основном выше у резистентных особей , что по существу согласуется с литературными данными по исследованию механизма формирования инсектицидной устойчивости у рыжего таракана (Prabhakaran, Kamble, 1995; Scharf et al.,1997). В результате изучения активности индивидуальных эстераз в жировом теле и грудных мышцах у чувствительных и резистентных особей, установлено, что в целом формирование устойчивости обусловлено изменением активности определённых эстераз.

В отношении изменения, как суммарной активности, так и активности отдельных зон тестируемого ферментного комплекса не выявлено чёткого полового диморфизма у рыжего таракана. Напротив, наблюдается не только одинаковая направленность данных изменений и у самцов, и у самок, но и практически одинаковые значения этих изменений некоторых зон исследуемого комплекса ферментов.

Полученные экспериментальные данные свидетельствуют, во-первых, о сравнительно более высокой суммарной активности эстеразного комплекса ферментов исследуемых тканей у резистентных особей насекомого; во-вторых, о тканевой специфичности участия эстераз в формировании устойчивости к инсектицидам у особей рыжего таракана; в-третьих, о значительном вкладе определённых эстераз в феномен резистентности и о существенной роли эстераз жирового тела Blattella germanica L. в формировании устойчивости к инсектицидам.

Сравнительное исследование фосфатазного комплекса ферментов у чувствительных и резистентных популяций рыжею таракана.

Следующим этапом изучения биохимического механизма устойчивости к перметрину у таракана было сравнительное исследование активности щелочной и кислой фосфатазы у чувствительных и резистентных популяций. Ранее было показано участие кислофосфатазного комплекса ферментов в развитии резистентности у американского и рыжего таракана (Кометиани,1995; Сёмина, 2000). Результаты исследования активности комплекса щелочных фосфатаз общего гомогената сенситивных и резистентных популяций имаго рыжего таракана демонстрирует таблица 3.

№ оэп Активность в условных %

п/п Щелочной единицах Активации или

фосфатазы ингибирования

S R

1 0,12 2.83 - 0,07 4,28 -0.37 +51.3

2 0,20 5.39 4U0 7.02*0.43 +30.2

3 0.32 22.92*- 0.56 25.31* 1.53 +10.4

4 0.38

5 0.52 19.02 Ч.9А 17.27 =Ч).85 -9.4

6 0,73 12.30 —1.07 22.83 *0.71 +85.6

Суммарная 62.51 ^2.15 76.711 +22.7

активность

Кроме этого, сравнительная активность щелочной фосфатазы была исследована в жировом теле и грудных мышцах контрольных и опытных особей рыжего таракана и оказалось, что ощутимый вклад в развитие резистентности к перметрину вносят контрастные ОЭП формы изученного фермента (0,12 и 0,73 в общем гомогенате; 0.10 и 0,70 в грудных мышцах и 0.20 и 0.68 в жировом теле).

Суммарный прирост активности щелочной фосфатазы у резистентных популяций тестируемого насекомого примерно одинаков и составляет более 20% как в общем гомогенате, так и в двух исследованных тканях: в жировом теле и в грудных мышцах (см. главу 3). Аналогичные данные были получены при сравнительном изучении активности кислых фосфатаз в гомогенате сенситивных и резистентных популяций имаго американского таракана.

Детальное исследование роли щелочных и кислых фосфатаз рыжего таракана в выработке устойчивости к перметрину позволило сделать заключение о существовании в тканях этого вида насекомого форм ферментов, чутко реагирующих на воздействие инсектицида. Эта работа показала, что в общем гомогенате и двух изученных тканях выявляются на энзимограммах с помощью синтетического субстрата (а-нафтилфосфат и нафтол AS-BS) неспецифические формы фосфатаз с высокой анодной подвижностью (ОЭП 0,68; 0,70; 0,73.), активность которых существенно возрастает у резистентных популяций рыжего таракана в целом от 50 до 85%.

Перечисленные формы фосфатаз, а также малоподвижные фосфатазы с ОЭП 0,10 и 0,12 вносят значительный вклад в формирование механизма устойчивости рыжего таракана к пиретроидным инсектицидами. Считают, что функциональная роль множественных форм неспецифической щелочной и кислой фосфатаз связана с защитной функцией, а также с процессами внутриклеточного пищеварения у насекомых.

Функция множественных форм специфического фермента, например, глюкозо-1-фосфатазы (КФЗ.1.3.10) состоит в дефосфорилировании глюкозо-1-фосфата, образующегося в результате фосфоролиза гликогена, что обуславливает поддержание в организме насекомых стабильных концентраций глюкозы, значительная часть которой расходуется в процессе энергетического обмена. Таким образом, отмеченные молекулярные формы исследованных ферментов, по - видимому, определяют степень резистентности рыжего таракана к перметрину, что связано с его гидролизом или косвенным воздействием инсектицидов на усиленный синтез именно этих форм ферментов. Такой «сверхсинтез» определённых форм ферментов является, очевидно, одним из молекулярных механизмов, тесно взаимосвязанным с формированием резистентности у насекомых.

_Сравнительное исследование активности дегидрогеназного. эстеразного.

фосфатазного и комплекса ферментов у трёх популяций колорадского жука чувствительных, высокорезистентны! к перметрину (475) и резистентных к циперметрину (97).

Изучение физиолога - биохимических механизмов резистентности колорадского жука, анализ данных о перекрёстной устойчивости резистентных популяций к соединениям разной химической структуры является основной для рационального использования инсектицидов, для создания эффективных схем чередования препаратов, направленных на предотвращение развития резистентности.

С целью изучения биохимических механизмов резистентности к пиретроидным инсектицидам нами проведено сравнительное исследование активности дегидрогеназного комплекса ферментов (малатдегидрогеназы,

сукцинатдегидрогеназы, глюкозо -6 -фосфатдегидрогеназы) у трёх популяций колорадского жука в общем гомогенате.

Результаты исследования активности дегидрогеназного комплекса ферментов общего гомогената у чувствительных и резистентных особей имаго колорадского жука демонстрирует таблица 4.

Таблица 4. Сравнительная активность дегидрогеназного комплекса ферментов общего гомогената чувствительных и резистентных особей имаго колорадского жука.

№ Наименование ОЭП Активность в условных единицах Активирование или

п/п ферментов Форм иигибирование; %

Б * Я:

0.13 6.32+ 0.23 4.70+0.13 8.78+0.24 -25.6 +38.9

1 Г-б-ФДГ А (, 0.20 41.14+0.78 39.90+0.82 47.54+ 1.16 -3.1 +15.5

т 0.33 4.72+0.17 7.65+0.24 8.17+ 0.16 +68.1 +73.1

Суммарная / 1 активность/ ) 52.18 52.25 64.49 0.0 +23.6

Ы/ 0.22 11.25+0.52 10.77+0.45 11.44+0.41 -4.3 +1.6

2 МДГ 1 * 0.30 17.42+0.63 19.47+0.72 21.54+0.62 +11.8 +23.6

0.48 21.19+0.82 29.44+0.94 28.72+0.73 +38.9 +35.5

Суммарная активность 49.86 59.68 61.70 +19.7 +23.7

0.15 8.25+0.11 9.72+0.27 11.04+0.47 +14.1 +29.6

3 СДГ 0.28 23.44+0.44 29.72+0.63 28.15+0.62 +26.8 +20.4

0.42 17.78+0.62 24.15+0.72 25.72+0.71 +35.8 +44.6

Суммарная активность 49.74 63.59 64.91 +27.8 +30.5

Условные обозначения: 8 - чувствительные популяции

- резистентные к циперметрину

- резистентные к перметрину

Выполненные нами исследования показали, что МДГ, Г-6-ФДГ и СДГ у чувствительных и резистентных рас выявляются в виде трёх молекулярных форм, незначительно отличающихся по анодной электрофоретической подвижности. Как следует из приведённых данных, наибольшие изменения под влиянием пиретроидов наблюдаются в активности сукцинатдегидрогеназы. Так, суммарная активность СДГ возрастает на 28% у особей, резистентных к циперметрину и на 30% - устойчивых к перметрину. Суммарная активность МДГ и Г-6-ФДГ у популяций жука, устойчивых к перметрину возрастает практически на одну величину (+23%), а у популяций, резистентных к циперметрину эти показатели значительно ниже, что коррелирует с биологическим уровнем устойчивости. Существенные различия выявлены в отзывчивости отдельных молекулярных форм дегидрогеназного комплекса ферментов к воздействию инсектицидов. Установлено, что активность некоторых форм снижается под действием циперметрина. Это относится к молекулярной форме МДГ с ОЭП 0.12 и двум формам Г-6-ФДГ с ОЭП 0.13 и 0.20. В целом результаты этих

исследований свидетельствуют о том, что направленность в действии двух пиретроидных инсектицидов совпадает, а степень биохимического эффекта коррелирует с биологическим показателем резистентности.

Сравнительное исследование активности эстеразного комплекса Ферментов общего гомогената v чувствительных и резистентных особей имаго колорадского жука.

Согласно литературным данным, при детальной расшифровке эстеразных механизмов резистентности к перметрину популяций колорадского жука были выявлены изоформы карбоксилэстеразы, обладающие повышенной каталитической активностью. Кроме того обнаружено, что у АХЭ - резистентных жуков имеются структурные изменения в области активного центра (Zhu, Clark, 1994).

Резистентные к инсектицидам насекомые обычно характеризуются увеличением содержания неспецифических эстераз. Именно значительные различия в активности этих ферментов в процессе онтогенеза колорадского жука предопределяют различную чувствительность вредителя к инсектицидам на разных стадиях его развития (Постряков, Амирханов, 1992). Накопленные за последние 20 лет данные о применении синергистов для повышения эффективности пиретроидов в борьбе с резистентными к ним популяциями колорадского жука свидетельствуют о перспективности использования ингибиторов ферментов, ответственных за развитие резистентности насекомых к инсектицидам, в качестве компонента смесевых препаратов может служить одним из приёмов борьбы с этим явлением. Другой аспект применения ингибиторов связан с вопросами изучения активности энзимов членистоногих и биохимических механизмов резистентности вредителей к инсектицидам.

Таблица 5. Активность эстеразного комплекса ферментов чувствительных и резистентных популяций имаго колорадского жука.

№ ОЭП Эстераз Активирование ферментов в условных единицах Активирование или ингибирование,%

S Ri R2 Ri R*

1 0,04 1,90 + 0.03 2,24 + 0.04 1,47 ±0.01 +17,9 -22,7

2 0,12 2,11+0.07 1,07 + 0.01 1,06 + 0.01 -49,3 -49,8

3 0,32 43,37 ±0.17 49,98 ±0.23 46,05 + 0.57 +15,2 +6,1

4 0,38

5 0,50 3,80 ±0.10 6,07 + 0.21 12,71+0.52 +59,7 +234,4

б 0,58 33,92 + 0.78 40,69 + 0.62 39,75 + 0.91 +19,9 +17,1

суммарная активность 85,10 100,05 101,04 +17,5 +18,7

Как следует из вышеизложенных данных, чувствительные и резистентные особи жука не отличаются по количеству и электрофоретической подвижности эстераз, но суммарная активность ферментов эстеразного существенно выше у Я-популяций. Значительный вклад в развитие устойчивости к перметрину вносит эстераза исследованного комплекса с ОЭП 0,50, активность которой возрастает более чем в 3 раза, по сравнению с чувствительными особями. Следует отметить, что активность отмеченной эстеразы также возрастает у популяций колорадского жука, устойчивых к циперметрину, но не так существенно (+59,7%). Сравнительный анализ изменения уровня активности других выявленных эстераз не выявил таких четких

закономерностей. Так, у рас резистентных к циперметрину возрастает также активность эстераз с ОЭП 0,04; 0,32, и 0,58, напротив, деятельность эстераз с ОЭП 0,12 снижается почти в 2 раза (см. табл. 5). Аналогичные данные были получены и в опытах с популяциями колорадского жука, резистентными к перметрину. Сопоставление проведенных биохимических исследований и величины показателя резистентности позволяет сделать следующие выводы. Во-первых, отсутствует четкая корреляция между показателями резистентности и ростом суммарной активности эстераз. Прямая корреляция установлена с возрастанием активности эстеразы с ОЭП 0,50 и показателями резистентности особей, устойчивых к перметрину он равен 475, а у популяций, устойчивых к циперметрину - соответственно - 97. Возможно, эту эстеразу можно отнести к карбоксилэстеразам, исходя из предварительных данных субстратного анализа. Во-вторых, активность высокомолекулярных эстераз (ОЭП 0,04 и 0,17), которые, по-видимому, являются ацетилхолинэстеразами снижается под влиянием инсектицидов, что подтверждает незначительное их участие в формировании устойчивости к пиретроидам. Оценивая существенную роль именно карбоксилэстераз жирового тела у особей рыжего таракана в формировании устойчивости к перметрину, можно предположить, что значительный вклад в феномен резистентности вносит определенные эстеразы. В целом, полученные экспериментальные данные согласуются с ранее проведенными биохимическими исследованиями на других тест-объектах. Так, усиленный эстеразный гидролиз - один из важнейших механизмов устойчивости к пиретроидам у некоторых представителей Ьер1ёор1ега и Со1еор1ега.

Сравнительное исследование активности фосфатазного комплекса ферментов общего гомогената у чувствительных и резистентных особей имаго колорадского жука показало участие ферментов фосфатазного комплекса в развитии устойчивости популяций колорадского жука к пиретроидным инсектицидам. В этих экспериментах показано, что повышение уровня активности кислой и щелочной фосфатазы у резистентных особей коррелирует с их показателем устойчивости. Кроме этого следует отметить, что при развитии ферментативных механизмов резистентности поведение разных молекулярных форм исследуемых фосфатаз дифференцированно и зависит как от их природы энзимов, так и от химической структуры испытанных пиретроидов (см. главу 4).

Сопоставление суммарной активности дегидрогеназного, эстеразного и Фосфатазного комплекса Ферментов высокорезистентных к перметрину и резистентных к циперметрину популяций колорадского жука.

Проведение сопоставительного анализа суммарной активности дегидрогеназного, эстеразного и фосфатазного комплекса ферментов у популяций колорадского жука резко отличающихся по биологическому показателю резистентности позволяет оценить вклад различных детоксицирующих систем в механизм резистентности.

В ходе действительного анализа вклада исследованных ферментов в развитие резистентности у колорадского жука было показано, что уровень суммарной активности, за исключением эстеразного комплекса энзимов, значительно выше у высокорезистентных популяций. Из трёх изученных дегидрогеназ, наибольшие изменения под влиянием пиретроидных инсектицидов наблюдаются в активности сукцинатдегидрогеназы и глюкозо-б-фосфатдегидрогеназы. Оценка вклада щелочной и кислой фосфатазы в формирование устойчивости свидетельствует об их участии в развитии резистентности и разном уровне отзывчивости на пиретроидные

инсектициды, принадлежащие к разным группам. Максимальные изменения в активности обоих названных ферментов наблюдается у высокомолекулярных форм фосфатаз (ОЭП 0.10 и 0.12). Не представляется возможности установить корреляцию в изменении суммарной активности эстераз с биологическим показателем резистентности у двух популяций колорадского жука, однако зафиксированное повышение почти в три раза активности одной из форм эстеразы с ОЭП 0.50 свидетельствует о её участии в детоксикации перметрина.

Таблица 6. Изменение суммарной активности дегидрогеназ, эстераз, щелочной и

й фосф атаз у резист ентных популяций колорадского жука.

№ пУп. Наименован ие ферментов Активирование или ингибирование, %

я. К»

1 МДГ +19.7 +23.7

2 Г-6-ФДГ 0.0 +23.6

3 СДГ +35.8 +44 6

4 Эстеразный комплекс +17.5 +18.7

5 Щелочная фосфатаза +14.0 +41.2

6 Кислая фосфатаза +21.8 +44.3

Таким образом, полученные результаты подтверждают многообразие путей формирования резистентности у популяций колорадского жука. Спектр и сравнительная активность оксидоредукгаз общего гомогената исследованных методом электрофореза в ПААГе показывает, что наряду с участием в энергетическом обмене, изученные МДГ, Г-6-ФДГ и СДГ обеспечивают деструкцию или катаболизм пиретроидных инсектицидов. Оценка участия гидролитических ферментов в биохимических механизмах резистентности свидетельствует о том, что помимо суммарной активности энзимов необходимо учитывать вклад отдельных множественных форм фосфатаз и индивидуальных эстераз. Кроме того, при проведении более эффективного тестирования резистентности и установления корреляции биохимических и биологических показателей необходимо учитывать вклад всех детоксицирующих систем, а не отдельных её показателей и это в какой-то мере позволит решить проблему преодоления устойчивости насекомых к пиретроидным инсектицидам.

Полученные экспериментальные данные представляют первое сравнительное исследование динамики активности ферментов дегидрогеназного, эстеразного и фосфатазного комплекса в процессе формирования резистентности насекомых к перметрину у представителей двух различных отрядов, т.е. с полным и неполным превращением. Эти результаты показывают, что уровень резистентности рыжего таракана коррелирует с ростом активности Г-6-ФДГ (+30%) эстеразного комплекса ферментов (+50%) и особенно СДГ (+108%). В то время как у высокорезистентных особей колорадского жука показатель резистентности коррелирует с активностью СДГ, а также щелочной и кислой фосфатазы, деятельность которых возрастает более,

чем на 40%. В проведённых опытах не удалось установить взаимосвязи биологических показателей резистентное™ к перметрину у исследованных насекомых и уровнем роста у них детоксицирующих ферментативных систем. Определённая корреляция наблюдается лишь по отношению гидролитического расщепления перметрина с помощью кислой и щелочной фосфатазы. В целом, суммируя полученные результаты, представляется возможным сделать вывод о большей устойчивости исследованных ферментов особей колорадского жука к нагрузке пиретроидными инсектицидами. Исходя из изложенного, представляя возможным в качестве биохимического критерия оценки развития резистентности у насекомых к пиретроидным инсектицидам использовать показатель, как суммарной активности ферментов, так и активности их отдельных их молекулярных форм. В принципе, такой подход к тестированию активности ферментов и их множественных форм в ответ на воздействие инсектицидов в процессе развития устойчивости к ним способен обеспечить более глубокое проникновение в сущность этого теоретически и практически важного явления.

Таблица 7. Изменения суммарной активности дегидрогеназ, эстераз, щелочной и кислой фосфатазы у резистентных к перметрину особей рыжего таракана и

олорад № ского жука. Наименование Активирование или ингибирование, %

п/п ферментов Я рыжего таракана Я колорадского жука

1 мдг +21.5 +23.7

2 Г-6-ФДГ +39.6 +23.6

3 сдг + 107.7 +44.6

4 Эстеразный комплекс +49.8 + 18.7

5 Щелочная фосфатаза +22.7 +41.2

б Кислая фосфатаза +25.9 +44.3

Выводы

1. Сравнительное исследование активности дегидрогеназного, эстеразного и фосфатазного комплекса ферментов у чувствительных и устойчивых к пиретроидам популяций рыжего таракана и колорадского жука свидетельствует о том, что в выработке биохимических механизмов резистентности принимают участие все три исследованные ферментативные системы, связанные с энергетическим и пластическим обменом у насекомых.

2. Показан значительный вклад в развитии резистентности эстеразного комплекса ферментов у исследованных насекомых, особенно контрастных по электрофоретической подвижности ацетилхолинэстераз и карбоксилэстераз, что позволяет сделать заключение об универсальности влияния инсектицидов у разных видов насекомых и, следовательно, сходстве в механизме их действия, а также об участии отдельных эстераз в формировании резистентности у изученных тест -объектов.

являются универсальными энзиматическими системами, принимающими участие в обеспечении энергетического обмена и деструкции ксенобиотиков, в том числе и пиретроидов.

4. Наличие ясно выраженной корреляции активности сукцинатдегидрогеназы общего гомогената тканей рыжего таракана и колорадского жука и токсикологическим показателям позволяет обосновать биохимический способ оценки состояния резистентности, а также осуществлять с помощью этого ферментативных тестов скрининг перспективных препаратов.

5. Результаты сравнительного изучения изменения деятельности кислой и щелочной фосфатазы у резистентных популяций рыжего таракана и колорадского жука показали, что происходит активация литических процессов, гидролитические ферменты вносят значительный вклад в развитие устойчивости у тест - объектов, показатель их активности взаимосвязан с биологическим уровнем резистентности и может быть рекомендован в качестве биохимического критерия при селекции инсектицидов.

6. Анализ участия исследованных ферментативных спектров в формировании резистентности у тараканов и колорадского жука свидетельствуют, во - первых, о наличии видовой и тканевой специфичности, проявляющейся как на уровне суммарной активности тест-ферментов, так и молекулярных форм малатдегидрогеназы, сукцинатдегидрогеназы, глюкоза-6-фосфатдегидрогеназы, индивидуальных фосфатаз и эстераз. Во - вторых, энзиматические системы имаго колорадского жука оказались более устойчивыми к нагрузке пиретроидными инсектицидами.

Список печатных работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Балакина О.В., Романова И.Г., Кутузова Н.М., Филиппович Ю.Б. Сравнительное исследование эстераз чувствительных и резистентных особей рыжего таракана //Сборник научных статей биолого-химического факультета. «Прометей», М., 2002. - С.5-18. (1 п.л., доля личного участия -30%).

2. Балакина О.В., Коваль И.А., Кутузова Н.М., Романова И.Г., Филиппович Ю.Б. Влияние биогенных аминов на активность эстеразного комплекса ферментов имаго американского таракана // В сб. "Научные труды МПГУ". Серия Естественные науки. М., 2002. - С.279 -281. ( 0,3 п.л., доля личного участия - 50%).

3. Балакина О.В., Коваль ИА,Романова И.Г., Кутузова Н.М., Филиппович Ю.Б. Изучение совместного влияния мет-энкефалина и дофамина на эстеразы тканей имаго американского таракана // В сб. "Научные труды МПГУ". Серия Естественные науки. М., 2003,-С.З83-386. (0,3 п.л., личная доля участия - 70% ).

4. Романова И.Г., Кутузова Н.М., Кузьмина О.В., Филиппович Ю.Б. Сравнительная характеристика эстеразного комплекса ферментов чувствительных и резистентных к пиретроидам популяций колорадского жука. // Актуальные вопросы биологии, химии и экологии. М., МГОПУ им. МАШолохова., 2004 - С. 108-123 (0,8 п.л., доля личного участия - 60%).

5. Романова И.Г., Семина Н.В., Кутузова Н.М., Филиппович Ю.Б. Сравнительное исследование активности дегидрогеназного комплекса ферментов у сенситивных и резистентных популяций рыжего таракана // В сб. ''Научные труды МПГУ". Серия Естественные науки. М., 2004. - С.328 - 331 ( 0,3 пл., личная доля участия -50%).

Подл, к печ. 17.11.2004 Объем 1.0 п.л. Заказ №.394 Тир 100 экз.

Типография МПГУ

»24 0 6 8

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Романова, Ирина Геннадьевна

ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1 Современное состояние биохимической проблемы резистентности.

1.1. Исследование механизмов резистентности к пиретроидам.

1.1.1. Развитие резистентности к пиретроидным инсектицидам.

1.1.2. Развитие резистентности у колорадского жука.

1.1.3. Развитие резистентности у тараканов.

1.1.4. Развитие резистентности у других членистоногих.

1.2. Ферментативные механизмы резистентности.

1.2.1. Оксидоредуктазы широкого спектра действия.

1.2.2. Трансферазные механизмы резистентности.

1.2.3. Гидролитические механизмы резистентности.

Глава 2. Материалы и методы исследования.

2.1. Материал для исследования.

2.2. Приготовление экстрактов растворимых белков.

2.3. Электрофоретические методы определения активности ферментов.

2.3.1. Малатдегидрогеназа.

2.3.2. Глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа.

2.3.3. Сукцинатдегидрогеназа.

2.3.4. Эстеразный комплекс ферментов.

2.3.4.1. Спектрофотометрический метод измерения эстеразной активности.

2.3.5. Щелочная фосфатаза.

2.3.6. Активность кислых фосфатаз.

2.4. Обработка полученных данных.

2.4.1. Определение активности множественных форм ферментов, расчёт денситограмм.

2.4.2. Определение и расчёт относительной электрофоретической подвижности белковых фракций.

2.4.3. Статистическая обработка полученных данных.

Глава 3. Сравнительное исследование активности дегидрогеназного, эстеразного и фосфатазного комплекса ферментов у чувствительных и резистентных популяций рыжего таракана.

3.1. Сравнительное исследование активности дегидрогеназного комплекса ферментов у чувствительных и резистентных популяций рыжего таракана.

3.2. Сравнительное исследование активности эстеразного комплекса ферментов у чувствительных и резистентных популяций рыжего таракана.

3.3. Сравнительное исследование активности фосфатазного комплекса ферментов у чувствительных и резистентных популяций рыжего таракана.

Глава 4. Сравнительное исследование активности дегидрогеназного, эстеразного и фосфатазного комплекса ферментов у трёх популяций колорадского жука.

4.1. Сравнительное исследование активности дегидрогеназного комплекса ферментов общего гомогената у чувствительных и резистентных особей имаго колорадского жука.

4.2. . Сравнительное исследование активности эстеразного комплекса ферментов общего гомогената у чувствительных и резистентных особей имаго колорадского жука.

4.3. Сравнительное исследование активности фосфатазного комплекса ферментов общего гомогената у чувствительных и резистентных особей имаго колорадского жука.

4.4. Сравнительный анализ активности ферментов у чувствительных и резистентных популяций рыжего таракана и колорадского жука.

4.4.1. Сопоставление суммарной активности дегидрогеназного, эстеразного и фосфатазного комплекса ферментов у высокорезистентных к перметрину и резистентных к циперметрину популяций колорадского жука.

4.4.2. Сравнительный анализ суммарной активности дегидрогеназ, эстераз и фосфатаз у чувтвительных и резистентных к перметрину популяций рыжего таракана и колорадского жука.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Сравнительное исследование ферментативных механизмов резистентности к пиретроидам у насекомых"

Актуальность темы.

Резистентность вредных организмов к инсектоакарицидам, фунгицидам и гербицидам является глобальной проблемой. В настоящее время борьба с резистентностью или предотвращение её возникновения включает химические, агротехнические, биологические и биотехнологические мероприятия. Резистентность динамический феномен, развивающийся в весьма различных пределах у разных видов и даже у одного и того же вида при различном давлении отбора (Рославцева, 2003). Интенсивное применение химических средств борьбы с вредителями сельскохозяйственных культур привело к возникновению у них резистентности к пестицидам, что является причиной резкого снижения их эффективности в настоящее время. Отмечают, что более половины всех резистентных видов вредителей сельскохозяйственных культур сформировали устойчивые популяции к 2-м или более инсектицидам, принадлежащим к пяти основным их группам (хлорорганические инсектициды, пиретроиды, карбаматы, фосфорорганические, регуляторы роста насекомых гормональной и антигормональной природы). Для того чтобы противостоять катастрофической перспективе потери чувствительности основных вредителей растений к пестицидам необходимо знать, каким образом возникают механизмы резистентности. Основным стратегическим методом в борьбе с резистентностью является ротация пестицидов, имеющих различные механизмы действия, открытие новых классов инсектицидов, а также разработка смесевых композиций (инсектицид -синергист) и внедрение их в практику сельского хозяйства наряду с уже используемыми препаратами.

Пиретроиды - синтетические аналоги природного пиретрина, занимают в настоящее время одно из первых мест по масштабам производства и применения химических средств защиты растений. Основной мишенью действия пиретроидов являются натриевые каналы мембран нервных клеток. Характер и скорость метаболизма зависит от структуры пиретроида, его пространственного строения и отличается у разных видов и популяций насекомых (Филиппович и др. 1988; Рославцева, 2003). Применение пиретроидов, как и других препаратов, как правило, приводит к формированию у насекомых резистентности к инсектицидам. Явление резистентности характеризуется комплексом отдельных физико-химических, физиологических и биохимических показателей.

Анализ литературных данных свидетельствует о том, что наибольший вклад в метаболизм инсектицидов и механизм формирования устойчивых к ним популяций членистоногих вносят монооксигеназы, эстеразы и глутатион-8-трансферазы (Баканова,1993; Рославцева, 1997, 2003). Деградация ксенобиотиков, осуществляемая, в основном, тремя отмеченными путями - окислительно-восстановительным, гидролитическим и трансферазным, играет важную роль на определенной стадии развития организмов, тесно взаимосвязана со структурными особенностями применяемых соединений и видом насекомых.

Универсальным способом обезвреживания токсинов и ксенобиотиков в организме животных является их окислительное разрушение микросомальными оксигеназами. Повышение каталитической активности оксигеназ у резистентных членистоногих связывают с изменением соотношения отдельных множественных молекулярных форм цитохрома Р-450, индуцируемого генамирегуляторами, или с увеличением общего количества содержания цитохрома Р-450 вследствие амплификации структурных генов, детерминирующих его синтез (Agosin, 1985; 1984; Rose, Walbant, 1986).

Более специализированный эстеразный комплекс ферментов может участвовать в метаболизме всех трех наиболее используемых в настоящее время классов инсектицидов - фосфорорганических соединений, карбаматов и пиретроидов (Еремина и др., 1992, 1996; Рославцева, 1997,2003). Молекулы этих соединений содержат сложноэфирные связи, которые могут быть гидролизованы эстеразами. Показано, что детоксикация пиретроидов с помощью эстераз носит видо- и тканеспецифичный характер.

Сравнительное исследование активности АТФазного комплекса ферментов у чувствительной и резистентных к ФОС, карбаматам и пиретроидам рас комнатных мух продемонстрировало существенную активацию Na+, К+ - АТФазы на фоне ингибирования других АТФаз, что позволило сделать заключение автору об универсальности влияния инсектицидов разных групп на ферменты АТФазного комплекса насекомых и, следовательно, о сходстве механизмов их действия, а также об участии отдельных АТФаз в формировании резистентсности у изученного тест-объекта (Козлова, 1991). Важнейшим механизмом регуляции ферментных систем в клетке, является существование у ферментов множественных форм, отличающихся по физико -химическим свойствам, что обеспечивает пластичность обменных процессов, детерминирует адаптационные возможности организма, популяций и вида в целом и, таким образом, представляет собой один из основополагающих принципов регуляции жизнедеятельности животных организмов. Детальное исследование роли кислых фосфатаз дегидрогеназного комплекса ферментов американского и рыжего таракана в выработке устойчивости к перметрину позволило сделать заключение о существовании в тканях этого вида насекомого молекулярных форм тестируемых ферментов, реагирующих на воздействие этого инсектицида (Кометиани, 1995; Сёмина, 2000). Установленный усиленный синтез определённых форм испытанных энзимов определяет степень устойчивости рыжего таракана к пиретроидам и тесно взаимосвязан с формированием ферментативных механизмов резистентности.

Цели и задачи исследования:

Основной целью нашего исследования явилось сравнительное изучение ферментативных механизмов резистентности к пиретроидным инсектицидам у двух видов насекомых с полным и неполным превращением (колорадский жук и рыжий таракан), равно как и выяснение роли эстераз, фосфатаз и дегидрогеназ в выработке устойчивости к перметрину и циперметрину.

Для достижения этой цели были поставлены следующие основные задачи:

1. Исследовать активность дегидрогеназного, фосфатазного и эстеразного комплекса ферментов в общем гомогенате, грудных мышцах и жировом теле чувствительных и резистентных к перметрину популяций рыжего таракана.

3. Провести сравнительный анализа суммарной активности тестируемых ферментов, а также активности их молекулярных форм в общем гомогенате двух видов насекомых, представителей разных отрядов - колорадского жука (отряд Coleoptera) и рыжего таракана (отряд Blattodea), с целью выяснения роли малатдегидрогеназы, сукцинатдегидрогеназы, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназ, эстеразного комплекса ферментов, щелочных и кислых фосфатаз в выработке устойчивости к пиретроидным инсектицидам.

Научная новизна работы;

Впервые получены комплексные экспериментальные данные, демонстрирующие участие дегидрогеназного, эстеразного и фосфатазного комплекса ферментов в формировании ферментативных механизмов резистентности к пиретроидным инсектицидам у колорадского жука. Впервые проведён сравнительный анализ ферментативного механизма устойчивости к перметрину у двух представителей различных отрядов - Coleoptera -колорадского жука и

Blattodea - рыжего таракана. Показано, что имаго колорадского жука более устойчивы к действию пиретроидов по сравнению с тараканами. Обнаружено, что детоксикация перметрина с помощью эстераз носит видо - и тканеспецифический характер. Анализ отзывчивости отдельных эстераз к действию перметрина позволил установить участие в формировании резистентности контрастных по подвижности ацетилхолинэстераз и карбоксилэстераз. Практическое значение работы:

Осуществлено детальное изучение ферментативных механизмов резистентности к пиретроидным инсектицидам у колорадского жука и рыжего таракана и проведено сопоставление полученных биохимических показателей с биологическим уровнем устойчивости у исследованных насекомых. Знание биохимических механизмов резистентности необходимо учитывать при ротации пестицидов, а также при подборе ингибиторов ферментов, ответственных за её развитие. Исходя из различий в уровне суммарной активности тестируемых ферментов, а также активности их молекулярных форм у чувствительных и устойчивых популяций насекомых и корреляции биохимических показателей с уровнем резистентности, предложен энзиматический способ тестирования её развития. Полученные данные вносят значительный вклад в развитие концепции биохимических механизмов действия пиретроидных инсектицидов и формирование к ним устойчивости у насекомых, особенно колорадского жука и могут быть использованы в ВНИИ защиты растений при скрининге инсектицидов. Результаты исследований включены в лекционные курсы кафедры органической и биологической химии, а также применяются при проведении семинарских занятий, спецкурсов студентов биолого-химического факультета МПГУ.

Апробация работы:

Материалы диссертации докладывались на межвузовской научно - практической конференции «Актуальные проблемы экологии и безопасности жизнедеятельности» (Москва 2003), а также были неоднократно представлены на научных конференциях МПГУ (Москва 2003,2004) и научных семинарах кафедры органической и биологической химии биолого-химического факультета МПГУ (Москва, 2003,2004). Публикации:

По материалам диссертации опубликовано 5 работ и 2 статьи находятся в печати. Структура и объём работы:

Диссертация состоит из введения, обзора литературы (Глава1), освещающего степень изученности ферментативных механизмов резистентности к пиретроидам у насекомых; описания объектов и методов исследования (Глава 2);изложения и обсуждения полученных экспериментальных результатов (Главы 3-4); заключения; выводов и списка литературы. Работа изложена на 150 страницах машинописного текста и включает таблицы, рисунки и схемы.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Романова, Ирина Геннадьевна

Выводы

3. Установлена роль дегидрогеназного комплекса ферментов в механизме резистентности к пиретроидам у рыжего таракана и колорадского жука и показано, что малатдегидрогеназа, сукцинатдегидрогеназа и глюкоза-6-фосфатдегидрогеназа являются универсальными энзиматическими системами, принимающими участие в обеспечении энергетического обмена и деструкции ксенобиотиков, в том числе и пиретроидов.

4. Наличие ясно выраженной корреляции активности сукцинатдегидрогеназы и кислой фосфатазы тканей рыжего таракана и колорадского жука и токсикологическим показателям позволяет обосновать биохимический способ оценки состояния резистентности, а также осуществлять с помощью ферментативных тестов скрининг перспективных препаратов.

5. Результаты сравнительного изучения изменения деятельности кислой и щелочной фосфатазы у резистентных популяций рыжего таракана и колорадского жука показали, что происходит активация литических процессов, эти ферменты вносят значительный вклад в развитие устойчивости у тест - объектов, показатель их активности взаимосвязан с биологическим уровнем резистентности и может быть рекомендован в качестве биохимического критерия при селекции инсектицидов.

6. Анализ участия исследованных ферментативных спектров в формировании резистентности у тараканов и колорадского жука свидетельствуют о наличии видовой и тканевой специфичности, проявляющейся как на уровне суммарной активности тест-ферментов, так и молекулярных форм малатдегидрогеназы, сукцинатдегидрогеназы, глюкоза-6-фосфатдегидрогеназы, индивидуальных фосфатаз и эстераз. Также, энзиматические системы имаго колорадского жука оказались более устойчивыми к нагрузке пиретроидными инсектицидами.

Суммируя наши эксперементальные данные можно сделать следующие выводы: во-первых, сравнительно более высокой уровень суммарной активности эстеразного комплекса ферментов наблюдается у резистентных особей насекомого; во-вторых, обнаружена тканевая специфичность участия эстераз в формировании устойчивости к инсектицидам у особей рыжего таракана; в-третьих, отмечен значительный вклад определённых эстераз в феномен резистентности, существенную роль, в которой играют эстеразы жирового тела Blattella germanica L. В изучение роли щелочных и кислых фосфатаз рыжего таракана в выработке устойчивости к перметрину позволило сделать заключение о существовании в тканях этого вида насекомого форм ферментов, чутко реагирующих на воздействие этого инсектицида. Нами показано, что в общем гомогенате и двух изученных тканях выявляются на энзимограммах с помощью синтетического субстрата (а-нафтилфосфат и нафтол AS-BS) неспецифические формы фосфатаз с высокой анодной подвижностью, активность которых существенно возрастает у резистентных популяций рыжего таракана в целом от 50 до 85%.

Отмеченные формы фосфатаз, а также малоподвижные фосфатазы вносят значительный вклад в формирование механизма устойчивости рыжего таракана к пиретроидным инсектицидами. Именно отмеченные молекулярные формы исследованных ферментов, по-видимому, определяют степень резистентности рыжего таракана к перметрину, что связано с его гидролизом или косвенным воздействием на усиленный синтез именно этих форм ферментов.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Романова, Ирина Геннадьевна, Москва

1. Баканова Е.И. Сравнительный анализ некоторых биохимических систем детоксикации ксенобиотиков у комнатных мух и тараканов // Автореф. дис. к.б.н., Москва. Тип. МПГУ им. Ленина. 1993. 16 с.

2. Баканова Е.И., Ерёмина О.Ю., Кутузова Н.М., Рославцева С.А. /Свойства и функции глутатион-8-трансферазы членистоногих. //Известия РАН. Сер.биологическая, 1992а,- № 4. с. 537-545.

3. Балакина О.В., Романова И.Г.,Кутузова Н.М., Филиппович Ю.Б. Сравнительное исследование эстераз чувствительных особей рыжего таракана. Сборник научных статей биолого-химического факультета, 2002, 5-18, М.Прометей.

4. Богданов М. Р., Мигранов М.Г., Николенко А.Г. Почвообитающие беспозвоночные нецелевой объект пиретроидных обработок //Агрохимия, 1997, №7, с. 89-94.

5. Бресткин А.П., Кузнецова Л.П., Моралев С.М. Холинэстеразы наземных животных и гидробионтов. Владивосток.: ТИНРО-центр. 1997. 466 с.

6. Волкова Р.И., Титова Э.В. Эстеразы нервных ганглиев таракана: множественные молекулярные формы и ингибиторная специфичность // Биохимия. 1985. Т.50. Вып.З. С.475-484.

7. Грицай О.Б., Пилипенко В.Э., Дубинин В.А. Поведение таракана Periplaneta americana при тесте «горячая пластина» на фоне действия анальгетиков различных классов //Журнал эволюционной биохимии и физиологии т.34., 1988., с.28-36.

8. З.Егорова Т.А. Изучение полиморфизма ферментных систем тутового шелкопряда (В теоретических и практических аспектах) // Дис. д.б.н. М. 1983.386с.

9. Ерёмина О.Ю. Изыскание новых фосфоорганических синергистовпиретроидов и исследование механизмов их дейсвия //Автореф. Дисс.д.б.н.- ВИЗР. Санкт-Петербург. 1996- с.35.

10. Еремина О.Ю., Баканова Е.И., Костырко И.Н. Изучение эстеразных механизмов резистентности нескольких рас комнатных мух // Науч. основы дезинфекции и стерилизации /ВНИИ профилакт.f. токсикол. и дезинфекции. М. 1991. С. 90-93.

11. ЕрёминаО.Ю. / Изыскание новых фосфорорганических синергистовЧпиретроидов и исследование механизмов их действия. //Автореферат. Дисс. К.б.н.- ВИЗР.- Санкт.- Петербург.- 1996.35с.

12. Касида Дж. Агрохимия, 1983.- №5, с. 102-110.

13. Козлова Е.В. АТФазный комплекс ферментов Musca domestica L. в норме и под влиянием роста и развития /Автореф. К.б.н.-Москва 1991.

14. Колесниченко Л.С., Кулинский В.И. Глутатионтрансферазы // Успехи современной биологии. 1989 т. 107. вып.2.

15. Кометиани И.Б. / Исследование дегидрогеназного комплекса ферментов некоторых насекомых в норме и под влиянием регуляторов роста//Дисс. К.б.н.- 1995.-Москва.-с. 183.

16. Кулиева A.M. Сравнительное исследование ферментов медиаторного обмена и метаболизма ксенобиотиков у хлопковой совки Heliothis armigera // Автореф. дис. д.б.н. С-Пб., 1995. 36 с.

17. Кулиева A.M., Кугушева Л.И., Розенгарт Е.В. Карбоксилэстераза гусеницы хлопковой совки Heliothis armigera: субстратная и ингибиторная специфичность // Ж. Эвол. биохимии и физиологии. 1996. Т. 32. №2. С. 204-211.

18. Кутузова Н.М., Шамшина Г.А., Борзаковская Б.В.Активность глюкозо -6-фосфатдегидрогеназы в грене пород и гибридов тутового шелкопряда//Биохимия насекомых М. 1981, с. 51-59.

19. Леонова И.Н. Биохимические механизмы резистентности насекомых к инсектицидам и пути ее преодоления // Автореф. дис. к.б.н., Новосибирск, Тип. Инст. цитологии и генетики СО АН СССР. 1986.15 с.

20. Леонова И.Н., Неделькина С.В., Наумова Н.Б. и др. //Биохимия.-1986.-51, вып. 9. с.420-425.

21. Леонова И.Н., Слынько Н.М., Применение токсикологических методов в изучении механизмов резистентности к инсектицидам у насекомых // Агрохимия, 1988 № 8, Москва, с. 130-140.

22. Лукашина Н.С. Роль генетической регуляции активности ЮГ-эстеразы в устойчивости Drosophila virilis к высокой температуре // Автореф. дис. к.б.н., М., Тип. Инст. цитологии и генетики СО АН СССР. 1985. 16 с.

23. Раушенбах И.Ю. Генетический контроль нейроэндокринной регуляции метаморфоза Drosophila в экстремальных условиях среды // Автореф. дис. д.б.н., М., Тип. Инст. цитологии и генетики СО АН СССР. 1987. 36с.

24. Рославцева С.А. О возникновении популяций членистоногих, резистентных к химическим и микробиологическим средствам регуляции их численности // Состояние проблемы резистентности вредителей и возбудителей болезней растений к химическим

25. Ф средствам защиты и её преодоление. Тезисы докладов 7-го совещания14.18 ноября 1988г., Рига с. 16-17.

26. Рославцева С.А. Выяснение основного пути детоксикации карбофоса в организме рыжего таракана//Науч. основы дезинфекции истерилизации /ВНИИ профилакт.токсикол.идезинфекции. М 1991. С. 88-90.

27. Рославцева С.А. Проблема резистентности членистоногих к инсектоакарицидам (по материалам восьмого международного конгресса по химии пестицидов) // Агрохимия. 1997. №3. С. 89-92.

28. Рославцева С.А. Резистентность членистоногих к инсектоакарицидам //Агрохимия, 2003,№7, с. 83-87.

29. Рославцева С.А., Баканова Е.И., Еремина О.Ю. Эстеразы членистоногих и их роль в механизмах детоксикации инсектоакарицидов//Известия АН. Сер. Биол. 1993.№3.C.386-375.

30. Санкт-Петербург, 20, 22дек., 2000,- СПб, 2000.-C.18-19. СИД ВО 1150432.

31. Сазонова И.Н. Проблема избирательности действия инсектицидов и акарицидов и её значение в защите растений.- Д., 1986.- с. 23-32.

32. Сазонова И.Н., Никанорова Е.В., Швец Е.К. и др. // Там же.- с. 48-59.

33. Сазонова И.Н., Моралев С.Н., Швец Е.К. и др. Токсичность инсектицидов для колорадского жука и его энтомофагов // Бюл. ВНИИ защиты раст. 1988 №70. С. 69-73.

34. Сёмина Н.В. Исследование влияния пептидных гормонов и биогенных аминов на активность ферментов углеводного и липидного обмена Periplaneta americana и Tenebrio тоШог//Дис. к.б.н. М. 2000. 151с.

35. Спирина Т.А. Специфичность резистентности двух видов членистоногих к фосфорорганическим. пестицидам // Автореф. Дис.канд.наук.-М.:ВНИИХСЗР, 1981, с.26.

36. Сухорукова О.В. Участие ферментов фенолоксидазного комплекса в защитных реакциях насекомых /Автореферат к.б.н. Уфа 2002

37. Успенский И.И., Людвиг М.Э., Корочкин Л.И. Сравнительный анализ карбоксилэстераз в различных органах половой системы самцов Drosophila подгруппы Melanogaster//Ж.oбщ.биoл.l988.T.49.№ 5.С.601-608.

38. Фасулати С.Р. Анализ структуры попопуляций колорадского жука и его значение для разработки зональных систем защиты картофеля //Бюлл. ВИЗР.Т.бЗ. 1987а, с. 38-43.

39. Фасулати С.Р. Внутривидовая структура колорадского жука и популяционно биологические аспекты устойчивости к нему сортов картофеля //Автореф. дисс. К.б.н., Всеросс. ин-т защиты растений. СПб. 19876, с.20.

40. Фасулати С.Р. (1987в) Фенегеографическое разделение основных групп популяций колорадского жука в Европейской части СССР //Бюлл. ВИЗР. Т. 67 1987в, с.46-49.

41. Фасулати С.Р. Полиморфизм, экологические группировки и микроэволюция колорадского жука Leptinotarsa decemlineata Say (Coleoptera, Chrysomelidae) // Материалы VI совещ. «Вид и егоу продуктивность в ареале». С. Пб. 1993, с. 260-262.

42. Фасулати С.Р. Методические принципы селекции и сортоиспытания картофеля на устойчивость к колорадскому жуку Leptinotarsa decemlineata Say //Актуал. пробл. соврем/ Картофелеводства. Минск. 1997, С. 40-42.

43. Фасулати С.Р., Вилкова Н.А. (2000) Адаптивная микроэволюция колорадского жука и его внутривидовая структура в современном ареале //Современные системы защиты и новые направления в

44. Ч повышении устойчивости картофеляs к колорадскому жуку.

45. Сер.'Тенетическая инженерия и экология". М. Т.1. с.19-25.

46. Фасулати С.Р., Карасёва Н.А. (1998) Устойчивость овощных паслёновых растений к колорадскому жуку и принципы её оценки в связи с внутривидовой изменчивостью вредителя //Агро ХХ1.№2с.14-16.

47. Филиппович Ю.Б., Коничев А.С.,Множественные формы ферментов насекомых и проблемы сельскохозяйственной энтомологии // Моногр. 1987, Москва, с.86-89.

48. Филиппович Ю.Б. Основы биохимии: Учеб. для хим. и биол. спец. пед. унтов и ин-тов. 4-е изд., перераб. и доп. М.: Изд. Агар. 1999. С. 129.

49. Филиппович Ю.Б. Основы биохимии: Учеб. Для хим. и биол. спец. пед. ун-тов и ин-тов. 4-е изд., перераб. и доп. М.: Изд. Агар. 1999 с.459.

50. Филиппович Ю.Б., Рославцева С.А., Кутузова и др. Физиолого -биохимические основы действия средств борьбы с членистоногими. Итоги науи и техники. М.: ВНИТИ, 1988. Сер. Энтомология Т. 8.C.8-193.

51. Филиппович Ю.Б., Рославцева С.А., Кутузова Н.М., Барыбкина М.Н., Перегуда Т.А., Иванова Г.Б. Физиолого-биохимические основы действия средств борьбы с вредными членистоногими // Итоги науки и техники. Энтомология ВИНИТИ- 1988.-т.8.-с.163.

52. Филиппович Ю.Б., Щёголева Л.И. Исследование растворимых белков тканей тутового шелкопряда методом электрофореза в полиакриламидном геле //Доклады АН ССР. 1967. Т. 174. № I.e.240-242.

53. Хейман В.А. Применение люциферин-люциферазного метода для оценки энергетического состояния насекомых при действии инсектицидов и регуляторов развития //Исследования в области пестицидов. Москва. 1981. С. 52-59.

54. Хрунин А.В. Особенности взаимодействия эстераз насекомых и млекопитающих с производными 1,3,2- дигетер'афосфоринана и тио-и дитиокислот фосфора, содержащими фрагменты N-ацилированных аминокислот // Автореф. Дис. К.б.н., М. Тип МГПУ. 2000. 16с.

55. Чарыков А.К. Математическая обработка результатов химического анализа.-М.: Химия, 1984.- с.22-26.

56. Шамшина Т.Н. Участие неспецифичкских эстераз насекомых в обмене ювенильных гормонов и их аналогов. // Дис. К.б.н. М. 1986. С. 158.

57. Шапиро И.Д., Вилкова Н.А., Рябченко Н.А. Устойчивость растений к вредным организмам с эколого-генетических позиций //Вестн. С.-х. Науки. М. Т.4. 1991, с.151-154.

58. Шапиро И.Д., Фасулати С.Р., Иващенко JI.C. Иммуногенетические барьеры и источники устойчивости картофеля к ко орадскому жуку //Науч. техн. бюлл. ВИЗР. С-Пб. 1992, с.51-56.

59. Шустова В.П. Изучение специфичности действия некорых новых групп фосфорорганических соединений на холинэстеразы насекомых и теплокровных.//Автореф. Дис. к.б.н. М.1987.

60. Abbassy М.А , Eldefrawi М.Е., Eldefrawi А.Т. // Pestic. Biochem. Physiol.- 1983.-19, № 3.P.299-308.

61. Abdel-Aal Y.A.I., Woiff M.A., Roe R.M., Lambert E.P. Aphidcarboxyiesterases:biochemicai aspects and importance in the diagnosis of insecticide resistance // Pestic. Biochem. Physiol. 1990. V. 38. № 3.P.255-266.

62. Agosin M. Multiple forms of insect cytochrome P-450: role in insecticide resistance // Cytochrome P-450. Pap. Biochtm., Biophys. and Environ. Imlic. Proc. 4th Intern. Conf., Amsterdam, 1982. P. 661-669.

63. Argentine J.A., James A.A. Characterization of salivary gland- specific esterase in the vector mosquito, Aedes aegypti // Insect Biochem. Molec. Biol. 1995. V.25. .№ 5. P. 621- 630.

64. Brattsten LB.// Pestic. Biochem. Physiol.- 1987.-27, № l.-p. 1-12.

65. Brown T.M., Bryson P.K. Selective inhibitors of methyl parsthionresistant acetylcholinesterase from Heliothis virescens // Pestic. Biochem. Physiol. 1992. V. 22. № 2. P. 155- 164.

66. Casteels H., De Clercq R.The impact of some commonly used pesticides on the epigeal arthropod fauna in winter wheat // Meded. Fac. Landbouw. Rijksuniv. Gent. 1990. V. 55. № 28. P. 477-482.

67. Chang C.P., Plapp F.W. Jr. // Pestic. Biochem. Physiol.1983. 20. № 1. P. 1206-1210.

68. Chang C.P., Plapp F.W. Jr. // Pestic. Biochem. Physiol.1983. 20. № 1. P. 76-91.

69. Claudianos C.,Russell RJ. Oakeshott J.G. The sam acid substitution in orthologous esterases conferers organopho'sphate resistance on the house fly and a blowfly // Insect. Biochem. Molec. Biol. 1999. V.29. № 8. P. 675- 686.

70. Croft В.A., Whalon M.E. Selective toxicity of pyrethroid insecticides to arthropod natural enemies and pests of agricultural crops // Entomophaga. 1982. V.27. № 1. P.3-21.

71. Crouse G.D. Chemistry and insecticidal' activity of the spinosyns // Abstracts 9th Intern. Congr. Pesticide Chemistry. London, 1998. S. 3.1.

72. Crouse G.D. et al. Chemistry and insecticidal activity of the spinosyns // Pesticide and bioscience. The Food-Environment Challenge / Ed. by G.T. Brooks and T.R. Roberts. Cambridg:Royal Sosaiety Chemistry, 1999. P. 155-166.

73. Dauterman W.C. Insect metabolism: extramicrosomal // Comprehensive Insect Physiology, Biohemistry and pharmacology (Kerkut G.A., Gilbert L.I.). Pergamon Press. Oxford. New York. 1985. V.12. №10. P.713-730.

74. Davis J.R. /Disk electrophpresis. Method and application to humanserum proteins. // Ann. N-Y. Аса. Sci. 1964.- vol.121 № 2.-p. 404-427.

75. Delorme R., Fournier D., Chaufaux J. Esterase metabolism Redyced penetration are causes of resistabce to deltametrin in Spodoptera exigua Hub. (Noctuidea: Lepidoptera) //Pestic. Biochem. Physiol 1988.V.32.№ 3. P. 240-246.

76. Delorme R. //Phytoma.-1985. № 365.-p. 45, 47-48.

77. Doherty J.D., Nishimura K., Kurihara N., et al. // Pestic. Biochem.

78. Physiol 1987a. V 27. № l.-p. 123-131.// Pestic. Biochem. Physiol 1986.25. № 3.-p. 295-305.

79. Dowd P.F. Sparks T.C. Comparative hydrolysis of permetrin and fenvalerate in Pseudoplusia includens (Walker) and Heliothis virescens (F.) // Pestic. Biochem. Physiol 1987a. V 27. № l.-p. 123-131.

80. Dowd P.P. Sparks T.C. Characterization of a trans-permethrin hydrolysing enzyme from the midgut of Pseudoplusia includens (Walker) // Pestic. Biochem. Physiol 1986 V 25. № l.-p. 73-81.

81. Dunning R.A., Cooper J.M., Wardman J.M., Winger G.H. Suceptibility of the carabid Pterostichus melanarius (Illiger) to the aphicide sprays applied to the suugar-beet crop // Ann. Appl. Biol. 1982. V. 100. Suppl. P. 32-33.

82. Endo J., Nishiitswfsujo-Uwo I. // J. Invert. Pathol. 1980. - 36. P. 90103.

83. Feyereisen R, SabouraultC., Guzov V.M. et al. Overproduction of a P-450 that metabolizes diazinon is linked to a loss-of-function in the chromosome 2 aili-es-terase gene inresistant house flies // Ibb. 2002. 3c. 35.

84. Field L.M., Javel N., Devonshire A.L. Myzus persicae esterases and their amplified genes // Book of Abstracts 8-th IUPAC International Congress of Pesticide Chem. July 4-9, 1994: Washington, USA. 1994. V. l.P. 180.

85. Forgash A.J. // Pestic. Biochem. Physiol 1984- 22. № 1 .-p. 178-186.

86. Georghion G.P., Taylor C.E. // Trsns. 15th Intern. Congr. Entomol. -Canberra. 1977. -P. 759-785.

87. Goh D.K.S., Anspaugh D.D., Motoyama N., Rock G.C., Roe R.M. Isolation and characterization of an insecticide resistance associatedesterase in the tobacco budworm, Heliothis virescens (F.) // Pestic. Biochem. Physiol 1995 V.51. № 2.-p. 192-204.

88. Gunninr R.V., Balfe Me. Spinosad resistance in Australian Helicopteratharmigera (Hubner) (Lepidoptera: Noctuidae) // Books of Abstracts 101.tern. Congr. on the Chemistry of Crop Protect. Basel, 2002. V. 1.3c. 08. P. 290.

89. Hagley E.A.C., Pree D.J., Holiday N.J. Toxicity of insecticides to some orchard carabids (Coleoptera: Carabidea) // Can. Entmol. 1980. V. 112. P. 457- 462.

90. Harold J., Ottea J.A. characterization of esterases associated with profenofos resistance in the tobacco budworm Heliothis virescens (F.) // Arch. Insect. Biochem. and Physiol. 2000. V. 45. № 2. P. 47-59.

91. Harold J.,Ottea J.A. Characterization of esterases associated with profenofos resistance in the tobacco budworm, Heliothis virescens (F.)//Arch. Insect. Biochem. and Physiol 2000 V 45. № 2.-p. 47-59.

92. Heimbach U., Wehling A., Sprick P. Mehriahrise Untersuchungen zur 4 Wirkung eineger Blattlausinsektizide auf epigaische Raubarthropoden:

93. Vortr. 48. Dtsch. Pflanzenschuts Tag., Gottingen, 5-8 Okt., 1992 // Mitt. Biol. Bundesanst. Land- und Forstwirt. Berlin; Dehlem, 1992. H.283. S. 98.

94. Inglesfield Ch. The effcts of the Pyrethroid insecticide WL-85871 on non-target arthropods: Field Studies // Pestic. Sci. 1985. V. 16. № 2. P. 211.

95. Kagabu Sh. Imidacloprid: discavery and development // Proc. XX к Intern. Congr. Of Entomology. Firence. August 25-31. 1996. 19-015.

96. Kandil M., Belal M., Abdala M., Ayoub S. Identification of themechanism of resistance in the white fly Bemisia tabaci by using enzymeinhibition // Book of Abstracts 8- th IUPAC Congress of Peticide Chem. Washington, USA. 1994. V. 1. P. 179.

97. Khambay B.P.S., Boyes A., Williamson M.S. et al. Difining type I andthtyp II in insecticide pyrethroids // Books of Abstracts 10 Intern. Congr. Pesticide Chemistry of Crop Protect. Basel, 2002. V. 1.3c. 49. P. 331.

98. Kim H.J., Clark J.M. Evaluation of resistance management in recombinant acetylholinesterase ofcolorado beetl // Ibb. 2002. 3c. 17.p.299.

99. Konno Т.Е., Hodgson E., Dauterman W.C. Purification and characterization of phosphorotriester hydrolysis from metthy parathion -resistant Heliothis virescens // Pest. Biochem. Physiol. 1990. V.36.№ l.P.l-13.

100. Leopold R.A., Marks E.P., Eaton J.K.,et al. // // Pest. Biochem. Physiol.1985. 24, №1. P.267-283.

101. Ley S.V. // Recent adv. In chemicals of insect control.- 1984.-p. 307322.

102. Lowry O.H., Rosenbrough N.J.,Farr A.L., Randall R.J. /Protein measurement with the Folinphenul reagent.-1951.-vol 193., № l.-p. 265272.

103. Moores G.D., Devine G.J., Devonshire A.L. Insecticide-insensitive acetylcholinesterase can enhanse esterase-based resistance in Muzus persicae n Muzus nicotianae // Pest. Biochem. Phisiol. 1994. V. 49. № 2. P. 114-120.

104. Moores G.D., Devine G.J., Devonshire A.L. Insecticide-insensitive acetylcholinesterase can enhance esterase-based resistance in Muzus persicae vs. Muzus nicotianae // Pest. Biochem. Physiol. 1994. V. 49. № 3.P. 114-120.

105. Ono M., Siegfreid B.D. Role of greenbug esterases in parathion resistance // Books of Abstracts 9th IUPAC Congr. of Pesticide Chemistry. July 4-9,1994. Washington, USA. 1994. V.I.p. 185.

106. Perrin R.M., Wege P.J. Mode action and its role to resistanceiLmanagement // Books of Abstracts 9 Intern. Congr. Pesticide Chemistry. London, 1998. Topics 1-4. 4D-002.

107. Prabhakaran S.K., Kamble S.T. Purification and characterization of esterase isozyme from insecticide resistant and susceptible strains of the german cockroach, Blattella germanisa (L) // Insec Biochtm. Molec. Biol. 1995. V. 25. №4. P. 519-524.

108. Reidy G.E., Rose H.A., Visetson S., Murray M./Increased glutatione-S-transferase activity and glutatione congetin in an insecticide-resistant strain of Tribolium castaneum (Herbst). // Pestic. Biochem. and Physiol.-1990.-36, n.3.-p. 269-276.

109. Roelofs W.L. Chemistry of sex attraction // Proc. Nat. Acad. Sci. USA.1995. V. 92. №1. P. 44-49.

110. Rzehak H., Basedow Т. Die auswirkungen verschiedener Insektizide auf die epigaischen Raubarthropoden in Winterrapsfeldem // Anz. Schadlingsk., Pflanzenschuts Umweltschutz. 1992. V. 55. № 5. S. 71-75.

111. Samsoe-Petersen L. Effects of 45 insecticides, acaricides and molluscocides on the rove beetle Aleochara bilineata (Coleoptera: Staphylinidae) in the laboratory // Entomophaga. 1993. V.38. № 3. P. 371382.

112. Scharf M.E., Hemingway J., Small G.J., Bennett G.W. Examination of esterases from insecticide resistant and susceptible strains of the german cockroach, Blattella germanica (L) // Insect Biochem. Molrc. Biol. 1997. V.27. №.6. p. 489-497.

113. Schoknecht U., Otto D. Enzymes involvet in the metabolism of organophosphorus, carbamate and pyrethroid insecticides // Insecticides -mechanism of action and resistance. (D. Otto). INTERCEPT. Andover. England. 1991. P. 119-155.

114. Scott Z.G., Susanna S.T., Shono Т./ Biochemical changes in the cytochome p-450 monooxygenases of seven insectide resistant hous flies (Musca domestica) Strains. //Pest. Biochem. Physiol.-1990.-36, n.2,-127-134.

115. Singh G.S.P., Orchard L. // Pest. Biochem. Physiol.-1982.-17, №.2.-p. 232-242.

116. Small G.J., Hemingway J. Differential glycosylation produces heterogeneity in elevated esterases associated with insecticides resistancein the brown planthoppera Nilaparvata lugens Stal // Insect Biochem. Molec. Biol. 2000. V.30. № 6. P. 443-453.

117. Soderlund D.M., Sanborn J.K., Lee P.W. // Progress in Biochem. and Toxicol.-1983.-3-P. 401-435.

118. Suzuki K., Hama H., Konno Y., Saito T. Carboxylesterase of the cotton phid Aphis gossypii: Properties and role Fenitrothion resistance // Book of Abstract 8-th IUPAC Congress of Pesticide Chem. July 4-9, 1994. Washington, USA. 1994. V.l. P. 187.

119. Vav Asperen K.A. study of housefly esterase by means of sensitivecolorimetric method //J. Insect. Physiol. 1962. V.8. № 3.-p. 401-416.

120. Villate F., Ziliane P., Marcel V., Menozzi P., Foimier D. A high number of mutations in insect acetylcholinesterase may provide insecticide resistance //Pestic. Biochem. And Physiol. 2000. V. 67. № 2. P. 95-102.

121. Wolff M.A., Abdelaal Y.A.I., Goh D.K.S. Organophosphate resistance in the tobacco aphid (Homoptera, Aphididae) purification and characterization of a resistance- associated esterase // J. Econ. Entomol, 1994. V.87. № 5.-p. 1157-1164.

122. Энзимограммы эстеразного комплекса ферментов общего гомогената имаго рыжего таракана.

123. Условные обозначения: S- чувствительные особи R- резистентные особи1. Рисунок 2

124. Энзимограммы кислофосфатазного комплекса ферментов общего гомогената имаго рыжего таракана. Условные обозначения: S- чувствительные особи R- резистентные особи1. Рисунок 3

125. Энзинограммы эстеразного комплекса ферментов общего гомогената колорадского жука.

126. Условные обозначения: S- чувствительные особи Ri резистентные особи R2- высокорезистентные особи1. Ri

127. Энзинограммы глюкозо-6-фосфатдегидрогеназного комплекса ферментов общего гомогената колорадского жука. Условные обозначения: S- чувствительные особи Ri резистентные особи R2- высокорезистентные особи1. Рисунок 5

128. Энзинограммы кислофосфатазного комплекса ферментов общего гомогената колорадского жука. Условные обозначения: S- чувствительные особи Ri резистентные особи R2- высокорезистентные особи1. Рисунок 6

129. Энзимограммы кислофосфатазного комплекса ферментов общего гомогената имаго рыжего таракана. Условные обозначения: S- чувствительные особи R- резистентные особи

Информация о работе

Романова, Ирина Геннадьевна
кандидата биологических наук
Москва, 2004
ВАК 03.00.04

Диссертация

Сравнительное исследование ферментативных механизмов резистентности к пиретроидам у насекомых - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы