Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Возможности коррекции азотистого обмена введением кзогенных малат - лактатдегидрогеназ

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Возможности коррекции азотистого обмена введением кзогенных малат - лактатдегидрогеназ"

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ БАШКИРСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ ИНСТИТУТ

На правах рукописи РОМАНОВА Юлия Валерьевна

УДК 577.158: 616-085: 612.-015.1

ВОЗМОЖНОСТИ КОРРЕКЦИИ АЗОТИСТОГО ОБМЕНА ВВЕДЕНИЕМ ЭКЗОГЕННЫХ МАЛАТ - И ЛАКТАТДЕГИДРОГЕНАЗ

03.00.04 - Биологическая химия

Автореферат диссертации нз соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Уфа- 1993

- ?. -

Работа выполнена на кафедре биохимик Самарского государственного медицинского университета.

Научный руководитель

Официальные оппоненты

Ведушдя организация

доктор медицинских наук, профессор Ф. Н. Гильмиярова

доктор медицинских наук, член-корреспондент РАЕН, профессор Р. И. Лифшиц

кандидат медицинских наук Ф. А. Сагидуллин

Московский государственный медицинский университет имени Н. И. Пирогова

Защита диссертации состоится "_"_199 г. в

_ часов на заседании специализированного Совета

К 084.35. 02.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке БГМИ (450000, г.Уфа, ул. Ленина, 3).

Автореферат разослан'"_"_1993 г.

Ученый секретарь специализированного Совета доктор медицинских наук,

профессор Э. Г. Давлетов

- з -

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В настоящее время актуальным является поиск средств биогенной природы для применения их в качестве препаратов, оказывающих целенаправленное корригирующее влияние на нарушенные метаболические процессы (Березов Т.Т., 1982-, Норовкин Б. Ф. , 1982; Розенфельд Е. JL , Попова И. А. , 1989; Тутель-ян RA. с, соавт. , 1992, Crawfurd et al., 1982).

Ферменты занимают центральное место в сложной иерархии биохимической регуляции, будучи одновременно объектом, воспринимающим информационные сигналы, и исполнительными макромолекулами. Возможность изменения ферментативной активности благодаря динамичности междоменных, межсубъединичных, белок-белковых взаимодействий в зависимости от микроокружения, взаимодействия с различными лигандами, определяет направленность, интенсивность метаболических потоков ( Наградова К К., 1988; Лудак В. И. , 1991, 1992; Курганов Б. И. , 1992; Муронец Е JL , Наградова Н. К. , 1984; Курганов Б. И. , Любарев А. Б. , 1989, 1991, Srere, 1976, 1980, 1981; Bronstein, Knüll, 1981, Marcus et al., 1986; Srivastava, Bernhard, 1986, Freedrich et al., 1987; Fahien, Kmiotek, 1989, Harris, Winzor, 1990).

Наличие множества путей регуляции ферментативного катализа раскрывает перспективы поиска средств для активного влияния на метаболизм с помощью биомолекул разной структуры.

Цель и задачи исследования. Изучить состояние азотистого обмена при введении экзогенных малат дег ядро гена.? н и лататдегид-рогеназы, выяснить характер вызываемых изменений в метаболизме с целью обоснования, возможности применения этих ферментов г качестве знзимотерапевтических средств.

Для достижения цели были поставлены соедующие задачи:

1. Получить в препаративных количествах малатдегидрогеназу и лактатдегидрогеназу из животного сырья.

2. Изучить в динамике влияние данных экзогенных дегидроге-наз на процессы трансаминирования аминокислот.

3. Выяснить интенсивность метаболизма азотосодержащих соединений в сыворотке крови, скелетной и сердечной мышцах через различные временные интервалы после введения ферментов в организм экспериментальных животных. ■ •

4. Охарактеризовать состояние белкового обмена в печенп при

воздействии лактатдегидрогеназы и малатдегидрогеназы в условиях in vitro.

5. Выяснить состояние метаболических процессов в сердечной мышце на субклеточном уровне (цитоэоль, митохондрии) после введения экзогенных дегидрогеназ.

Научная новизна и научно-практическая значимость.

Впервые получены сведения о характере включения экзогенных дегидрогеназ в метаболические процессы животного организма, специфичности и продолжительности вызываемых эффектов. Установлено влияние экзогенных лактатдегидрогеназы и малатдегидрогеназы на состояние азотистого метаболизма. Выявлено воздействие экзогенных ферментов на активность сопряженных с их функцией ферментативных систем. Установлены ранее неизвестные факты о включении экзогенных дегидрогеназ в процессы обмена различных тканей организма (сердечная и скелетная мышцы, печень) как на тканевом, так и субклеточном уровнях. Выявлена динамика изменения уровня ряда интегральных метаболитов (малата, оксалиацетата, глутамата, 2-океоглутарата} в ответ, на введение ферментов - малатдегидрогеназы и лактатдегидрогеназы. Полученные данные впервые позволяют проанализировать возможность коррекции азотистого метаболизма введением экзогенных дегидрогеназ.

Результаты проведенного исследования вносят существенный вклад в раскрытие механизма формирования сдвигов в обмене веществ при гиперферментемиях. В частности, характеризуют состояние азотистого обмена, в ответ на введение экзогенных лактатдегидрогеназы и малатдегидрогеназы. Полученные данные о характере и значении изменения состояния ряда ферментативных систем и унифицированных метаболитов являются основой для перспективного использования дегидрогеназ для коррекции обмена при патологических состояниях, связанных с гипоксией. Использованный в работе методический подход с введением экзогенных ферментов, полученных из неиспользуемых ранее тканей млекопитающих, может быть применен для изучения патогенеза заболеваний, - протекающих с ги-перферментемией.

Апробация работы. Публикации. Основные положения работы доложены на: Всероссийской конференции "Вопросы медицинской химии и лабораторной диагностики", Хабаровск, 1989; "Вопросы теоретической и практической медицины", Уфа, 1990; "XLII Студенческой научной конФ^^нили". Вильних:, 1УЧП; "Итоговых студенческих на-

учных конференциях", Самара, 1990, 1991, 1992; "55-й итоговой научной студенческой конференции", Красноярск, 1991; "Научно-техническая конференция молодых ученых и специалистов", Самара, 1992; "Обмен веществ в корме и патологии", Тюмень, 1992.

Основные положения диссертации отражены в 8 печатных работах, опубликованных в центральной и местной печати, в материалах Всесоюзных, региональных конференций.

На защиту выносятся следующие положения:

1. Экзогенные малат- и лактатдегидрогеназы вызывают стабильные изменения в белковом обмене, специфичные для различных тканей экспериментальных животных.

2. Введенные в организм дегидрогеназы способствуют синхронному увеличению обмена аминокислот, унифицированных метаболитов в цитоплазме и митохондриях, что обеспечивает окисление их до конечных продуктов без накопления промежуточных метаболитов.

3. Малатдегидрогеназа и лактатдегидрогеназа могут быть использованы в перспективе в качестве биогенных средств коррекции метаболизма при патологических состояниях, протекающих с ги-поксическом синдромом.

4. Разработанная модель гиперферментемии может найти применение как способ изучения молекулярных нарушений при врожденных и приобретенных энзимопатиях.

Структура диссертации. Работа состоит из введения, обзора литературы, главы, посвященной описанию материалов и методов исследования, б глав, в которых представлены полученные рузуль-таты, заключения, выводов, списка литературы. Материал изложен на 124 страницах машинописного, текста и иллюстрирован 2 схемами, 21 таблицей и 9 рисунками. Библиография содержит 52 работы отечественных и 117 иностранных авторов.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материал и методы исследования. Опыты проводились на 98 беспородных кроликах весом 2,5 - 3,0 кг. Выделены 3 группы животных: 1-контрольная и 2 опытных. Контрольным животным в ушную йену вводили 1 мл физиологического раствора Первой опытной группе кроликов в ушную вену вводили 1 мл раствора малатдегидро-геназы с удельной активностью 600 Е/мг. Второй опытной группе -1мл раствора лактатдегидрогеназы с удельной активностью 300 Е/мл.

2-4510

Лактадегидрогеназа и малатдегидрогеназа в препаративных количествах были получены из скелетных мышц норок (212 животных). Выделение и очистка лакгатдегидрогеназы проводились по методу Scopes, Storer (1982), малатдегидрогеназы - по методу R. Ritter с соавт. (1979), Brichiewska, F. Skorkawsky (1983). На всех стадиях очистки во фракциях определяли содержание белка, удельную активность получаемых дегидрогеназ и сопутствующих ферментов. Перекристаллизованные ферменты .третировались, хранились в виде суспензии в 3,2 М растворе сульфата аммония. Изучение ответной .реакции организма животных.на введение ферментов проводились в двух аспектах. Оценивались характеристики интегральных показателей белкового метаболизма в крови животных в динамике (через 5, 20 минут и 24 ,часа после внутривенного введения малат- и лактат-дегидрог.еназ), и в тканях (скелетных и сердечных мышцах), полученных через.! час после введения фермента. Кроме того, проведены эксперименты в условиях in vitro с инкубацией дегидрогеназ с тканью печени.

Активность ферментов изучалась в сыворотке крови, гомогена-тах сердечных мышц, супернатанте сердечной мышце и в митохондриях, предварительно обработанных тритоном X-10Q. Гомогенат из скелетных мышц для извлечения саркоплазмагических белков готовился 1:10, печени - 1:5 на фосфатном буфере 0,03 М pH 7,0. При постановке опытов in vitro гомогенат печени инкубировали с ма-латдегидрогеназой, лагегатдегидрогеназой по 500 Е фермента на 1 г сырой ткани в течение 10 минут. По истечении времени часть гомо-гената погружалась в лед и использовалась для определения активности ферментов. Вторая - обрабатывалась 0,6 М хлорной кислотой и использовалась для изучения содержания метаболитов. Контролем служил гомогенат печени в фосфатном буфере при аналогичных условиях инкубации и обработки.

Митохондрии сердца выделяли методом дифференциального центрифугирования (Hogeboom, Schnei der,1953; Уильяме Б. . Уилсон К , 1978).

Активность малатдегидрогеназы с субстратом оксалоацетатоь (Ochoa, 1955), лактатдегидрогеназы с субстратом пируваток (Karnberg, 1955), глутаматдегидрогеназы (Hogeboom, Schneider, 1953), глицеральдегидфосфатдегидрогеназы (Вульфсон ПЛ. с соавт. ,1989) определяли спектрофотометрически.

Активность трансаминаз, мочевины определялась с помощью на-

- 7 -

бора фирмы "ЬасЬеша" (Чехословакия).

Определение содержания малата, оксалоацетата, глутамата, 2-оксоглутарата в крови и тканях проводили специфическим ферментативным методом (Вегдпвуег,1963), унифицированным сотрудниками кафедры биохимии Самарского медицинского института (Гильямирова Ф. Е с соавт. ,1986). Определение содержания белка проводилось биуретовым методом (Кочетов Г. А. ,1980), спектрофотометрически при 280 нм Результаты исследования обработаны на ЭВМ методом вариационной статистики.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Нами моделируются условия, при которых в гармонично протекающие процессы жизнеобеспечения клетки проникает извне биологически активное вещество, присутствующее в ней как естественный компонент. Такое назначение в данном случае выполняют макромолекулы ферментных белков. Объектом наших исследований были окислительно-восстановительные ферменты. Один из них - лактатдегидро-геназа, заключительный фермент анаэробных превращений углеводов. Другой, малатдегидрогеназа, обеспечивает необходимый этап окисления в аэробных процессах. Это - ферменты полифункционального назначения, обеспечивающие базисный энергетический обмен в любой клетке. Благодаря тому, что ингермедиаты этих дегидрогеназ являются продуктами катаболических и анаболических превращений 'белков, жиров и углеводов, они занимают стержневое положение в метаболизме, определяя тем самым жизнедеятельность клеток, органов, организма в целом.

Так как многие заболевания являются результатом нарушения преимущественно определенных обменных процессов, то необходимость поиска средств коррекции нарушенного метаболизма представляется весьма актуальным. Наиболее важным, на наш взгляд, является использование в этих условиях препаратов биогенного происхождения. Особенно интересным видится изучение действия дегидрогеназ. Дегидрогеназы обеспечивают трансформацию водорода, главного источника АТФ в живых системах. Как известно, в патофизиологической картине многих заболеваний имеет место гипоксия тканей (.Меерсон Ф. 3. с соавт., 1992, 1993), что сопровождается накоплением определенного типа метаболитов при общем энергетическом дефиците. Это раскрывает перспективы широкого иепользова-

ния дегидрогеназ в патогенетической терапии множества заболеваний, характеризующих гипоксическим синдромом.

Наряду с этим протонирование белков различного функционального назначения определяет их конформационную перестройку, меняет характер окружения в соответствующем микрокомпартменте, что, естественно, проявляется изменением функционального состояния не только данного структурного, каталитического белка, но и других территориально сопряженных процессов.

В настоящей работе представлены результаты исследования интегральных показателей метаболизма после внутривенного введения малатдегидрогеназы и лактатдегидрогеназы.

Планируя эксперименты, проводя, а затем анализируя полученные результаты, мы ставили перед собой целый ряд вопросов. В частности, как воспримет организм животного введенный извне фермент, каковы взаимоотношения фрмента с дегидрогеназами данного организма, будет ли ответная реакция метаболизма, если да, то на уровне каких метаболических путей непосредственно связанных с катализом данными ферментами или отдаленных. Избирательно ли реагируют ткани на циркулирующий в крови фермент, насколько велика продолжительность нахождения фермента в кровеносной системе, период его полужизни. Безусловно, очень на многие вопросы предстоит еще ответить. Накопление этих знаний позволит создать базу для принципиально новой энзимологии, основанной не только на фактах, полученных в результате опытов in vitro, а энзимологию, основанную на фактах, отражающих status vivo. В соответствии с получен-

(тмогъ/ип

бмкя 20чип " íVjm

Рис.1 Изменение содержания 2-оксоглутзратг и глутамэтг . в крови кроликов под влиянием лактатдегидрогеназы

ними результатами введенный фермент циркулирует в крови в течение суток. Активность лактатдегидрогеназы после введения в кровь повышается особенно резко к 20 минуте, затем спустя 24 часа она снижается, не достигая исходного уровня. Эта закономерность прослеживается и в случае введения малатдегидрогеназы, то есть в этом отношений проявления особой специфичности не выявлено.

Введение лактатдегидрогеназы сопровождается изменением концентрации лактата и пирувата, что вполне естественно, учитывая поплнение эндогенного фонда лактатдегидрогеназы. Однако изменения отмечаются и в других сопряженных и несопряженных системах с лактатдегидрогеназой реакциях.

Предметом детального нашего изучения были показатели азотистого метаболизма. Прежде всего глутамат - коллектор аминогрупп, метаболит, используемый по множественным путям обмена. Количество глутамата увеличивается, особенно к 20 минутам и превышает норму на 49% (р<0,001) (рис.1).

Уровень 2-оксоглутарата также превышает контрольные показатели. Направленность процесса такова, что соотношение между количеством глутамата и 2-оксоглутарата имеет тенденцию к снижению в течение 24 часов. Необходимо отметить, что интенсивность азотистого обмена возрастает спустя сутки, о чем свидетельствует

-по «евепия

■ ис.с Изменение активности аланинамимотрансферазь! (1) и аспартатаминотрансферазы (2) в скелетных мышцах кроликов под влиянием внутривенного введения" яактатпегиврогеназы

3-4510

количество мочевины. Уровень мочевины остается в пределах нормы в течение первых суток и увеличивается на 37% к исходу 24 часов.

Процесс трансашнирования усилен, что выражается увеличением активности как аланинаминотрансферазы, так и аспартаминот-рансферазы (рис.2). Эти изменения отчетливо проявляются в первые 20 шнут наблюдений и к концу суток практически приходят в норму. Вполне согласуктсяс этими результатами количественные перепады содержания халата и охеалоацетата (рис.3). Так, если в норме соотношение этих метаболитов составляет 2,2, то спустя 5 и 20 шнут после внутривенного введения лактатдегидрогеназы эти показатели равны 1,3 и 2,02 соответственно. Введение лактатдегидрогеназы стимулирует и аэробные окислительные процессы, приводит к увеличению активности мадатдегидрогеназы. Однако необходимо отметить, что в первые минуты после введения фермента активность мадатдегидрогеназы оказывается ниже контрольных величин в среднем на 36%.

Принимая во внимание интегральную функцию крови, для получения более полной картины о непосредственном взаимодействия вводимых дегвдрогеназ с ферментными системами тканей, наш изучены показатели обмена в сердечной и скелетной мышцах. Результаты э^'их экспериментов показали, что экзогенный фермент, поступая в кровь, могвт проникать далее в ткани. Об этом свидетельствует, во-первых, увеличение в тканях активности анализируемого фермента и, кроме того, изменения, происходящие в метаболическом статусе (табл. 1,2),

!№« ль/МП

3.4-

33

32-

мвлат

ексалмцгтзт

Рис.3 Измен&ние содержания маната и оксалоацетата сыворотке крови кроликов под воздействием экзогенной пактетдегидрогенэзы.

Сравнительный анализ результатов исследований в миокарде и скелетных мышцах показывает, что прослеживается специфика обмена тканей: создается впечатление, что миокард менее заинтересован в дополнительном поступлении лактатдегидрогеназы. Активность фермента хотя и увеличивается, но менее значительно, чем в скелетных мышцах. Скелетные мышцы, энергообеспечение которых в значительной степени осуществляется за счет анаэробных процессов, более активно насыщаются экзогенной лактатдегидрогеназой и это выводит их метаболические параметры на иную, более высокую ступень. Проявлением этого служит увеличение процесса трансаминиро-вания, перепады концентраций глугамата, 2-оксоглутарата (рис.4). Не исключено, что скелетные мышцы имеют рецепторы, возможно, не узко специализированные, однако способные различить тетрамер от димера, в данном случае лакгатдегидрогеназу от малатдегидрогена-зы. Эти обусловлен характерный метаболический эффект, вызванный экзогенным ферментом.

Что качается миокарда, то наблюдается несколько иная картина взаимодействия малатдегидрогеназы с системами функционирующего кардиомиоцита. Не исключено, что преодолевается не только ци-тозольный, но даже и митохондриальный барьер, о чем свидетельствует соотношение активности митохондриальных и цитоплазмати-ческих аланинаминотрансферазы, аспартатаминотрансферазы, глута-матдегидрогеназы. Интенсификация азотистого обмена проявляется увеличением количества мочевины, глутамата при снижении содержа-

мкмзрь/г ткани

' исч Изменение содержания глутгмата ¡1) и 2-оксоглу-таратэ >2} в скелетных мышцах под воздействием

-лактатдегидрогеназы.

ния 2-оксоглутарата.

Оценка метаболического эффекта, производимого изолированным ранее ферментом, а затем введенным в естественные для него условия, т.е. в организм,. является качественно новым этапом в изучении возможностей ферментативного катализа.

Выделенный из животных тканей фермент, очищенный от балластных и других каталитических белков, а затем введенный вновь в среду с гомеоетатичеекими показателями жизнеобеспечения, т.е. с определенным температурным режимом, степнью ионизации и соотношением катионов-анионов, органических и неорганических компонентов, наличием множества регуляторов гормональной и негормональной природы, сотни близких и несходных по химической структуре субстратов для данного фермента оказывает усиленное не только специфическое, характерное для него действие. В своей работе мы рассматриваем вариант введения дегидрогеназ в кровь ин-тактного животного с целью выяснения включается ли экзогенный фермент в метаболические процессы, в какой степени вызываются изменения, их стабильность и множественность.

Найдя ответы на эти вопросы, можно целенаправленно вводить препарат для коррекции определенных нарушений в метаболизме. Наряду с изучением влияния экзогенной лактатдегидрогеназы, нами оценивалось действие и малатдегидрогеназы. Исследования проводились для ответа на вопрос о специфичности действия дегидрогеназ на метаболизм.

Анализ результатов проведенных экспериментов показал, что введенный фермент активно включается в обменные процессы животного Организма. Наблюдаемые сдвиги в обмене нельзя расценить как лавинообразные, наступающие одномоментно. Отмечаясь на пятой минуте после введения, в целом они нарастают и достигают максимума к 20 минуте. Через сутки многие показатели соответствуют контрольным ведичинам С активность аланинаминотрансферазы, содержание глутамата, мочевины), но метаболический эффект еще сохраняется. Так, удерживается на более высоком уровне активность аспартатаминотрансферазы, интенсивнее, чем в контроле утилизируется 2-океоглутарат.

Возможно, за счет катализа специфической малатдегидрогеназ-ной реакции происходит первоначальный сдвиг в содержании субстратной пары данного фермента. Малат, а особенно оксалоаце-тат, являются метаболически высоко активными соединениями: слу-

Таблица 1

Влияние экзогенной лактЖдегидрогеназы на обменные процессы в скелетных мышцах

Показатели метаболизма Т" " |Контроль (М ± м) Опыт (Ы ± м)

Аланинаминотранфераза (мккат/л) | 0,549 ± 0,061 1,474 ± 0,048***

Аспартатаминотранфераза (мккат/л) | 0,919 ± 0,075 1,686 ± 0,089***

Глицеральдегидфосфатдегидро-геназа (мкмоль НАДН/мин-мг)" | 0,255 ± 0,019 0,390 ± 0,006***

Малатдегидрогеназа (мкмоль НАДН/мин-мг) | 4,629 ± 0,037 .3,911 ± 0,213**

Глутаматдегидрогеназа (мкмоль НАДН/мин-мг | 0,044 ± 0,003 0,021 ± 0,002***

Глутамат (мкмоль/г) | 0,247 ± 0,018 0,571 ± 0,059***

2-оксоглутарат (мкмоль/г) | 0,120 ± 0,016 0,106 ± 0,146*

Малат (мкмоль/г) ! 0,270 к 0,151 1,510 А 0,146***

Оксалоацетат (мкмоль/г) ! 0,151 ± 0,006 ! 0,082 ± 0,005***'

Примечание: * - р > 0,5 ** - р < 0,01 *** - р < 0,001

жат субстратами ферментов анаболизма и катаболизма (глюконеоге-нез, трансаминирование, окисление в трикарбоновом цикле восстановление никотинашдных коферментов в цитоплазме и в митохондриях. Кроме того, они формируют характерное микроокруяение за счет собственной полярности и кислотных свойств. Такие свойства могут служить одним из пусковых факторов наблюдаемых изменений при поступлении малатдегидрогеназы в кровоток. Подтверждением специ-

Таблица 2

Влияние экзогенной лактаидегидрогеназы на обменные процессы в сердечной мышце

Изучаемые ферменты Контроль (М ± м) i ...... 1 Опыт (М ±. м)

контроль i 1 опыт 1 контроль i 1 опыт 1

Аланинаминотрансфераза (мккат/л) 2,032*¿ 0,099 1 1,824 ± Г 0,051 ' 1 3,548 ± 1 0,169 1 1 3,950*± 1 0,121 i

Аспартатаминотранфераза (мккат/л) 1,711 ± 0,053 1 1,594 ± 1 0,062 1 3,110 ± 1 0,098 1 1 3,27б*± 1 0,086 i

Глутаматдегидрогеназа (МКМОЛЬ НАДН/МИН'МГ) i 1 0,084 ± 1 0,004 1 0,059 ±. 1 0,003 i

Изучаемые метаболиты Контроль (М ± м) 1 Опыт (М ± м)

Глутамат (мкмоль/г) 0,532 ±0,032 1 0,748*± 0,051

2-океоглугарат (мкмоль/г) 0,122 ± 0,005 1 0,095*± 0,005

Мочевина .(мкмоль/г) ■ 2,527 ± 0,245 1 3,565**± 0,005 i

Примечание: * - р > 0,5 ** - р < 0,01 *** - р < 0,001

фичности выявленных сдвигов служит установленная в течение всего периода наблюдений активация аспартатаминотрансферазы. Известно, что между этими ферментами, объединенными общим субстратом окса-лоацетатом, существует и селективное межбелковое взаимодействие, установленное в экспериментах in vitro (Backman, Johansson, 1976; Brice et al., 1976, Salerno et al., 1975,1982). Полученные нами данные свидетельствуют о возможности такого эффекта и в условиях целостного организма

Результаты исследований показали, что при усилении метаболических процессов, вызванных введением фермента, не происходит

увеличения образования мочевина Это, на наш взгляд, может служить показателем азотистого катаболизма, сберегания азота в процессе обмена. В пользу этого свидетельствуют данные по глутамат-дегидрогеназной редокс системе. Учитывая коллекторную функцию этой аминокислоты, увеличение концентрации глутаминовой кислоты в крови через 20 минут после поступления малатдегидрогеназыв кровоток, является подтверждением этого допущения.

Определение активности глутаматдегидрогеназы в крови дало отрицательные результаты на протяжении всего эксперимента как в контрольной, так и в опытной группе, что расценивается нами как положительный момент. Поскольку глутаматдегидрогеназа характеризуется только внутриклеточной локализацией (ядра, митохондрии) (Williamson et al, 1967; Arnold, Maier, 1972; Godinot, Lardy, 1973), отсутствие активности этого фермента в крови отражает целостность клеточных и субклеточных мембранных структур.

Эти факты свидетельствуют о том, что обе дегидрогеназы кроме общности в их функции, а именно в обратимом дегидрировании лактата в пируват в случае лактатдегидрогеназы и малата в окса-лоацетат в катализе малатдегидрогеназы вносят сугубо специфичные изменения в обменные процессы. Этим открывается широкая перспектива для теоретического прогнозирования и практического применения данных дегидрогеназ при молекулярных сдвигах при тех или иных заболеваниях.

Поскольку' отклонения в метаболизме отмечаются не только в крови - месте циркуляции экзогенного фермента, но и в тканях, ценность использования препаратов дегидрогеназ для воздействия на нарушенный метаболизм возрастает. Будучи гомогенными белками, дегидрогеназы способны, по-видимому, избирательно захватываться, взаимодействуя с рецепторами клеток и преодолевая мембранный барьер. В разной степени изменяется активность лактатдегидрогеназы и малатдегидрогеназы в миокарде и скелетных мышцах, различны отклонения в показателях азотистого метаболизма в этих тканях.

Экзогенная лактатдегидрогеназа. вызывает отчетливые изменения в метаболизме скелетных мышц. Отмечается усиление катаболизма аминокислот за счет активации трансаминирования аланин- и аспартатаминотрансфераз. Доля окислительного дезаминирования глутаматдегидрогеназой снижается. Характерна активизация катаболизма углеводов, рост активности глицеральдегидрофосфатдегидро-

геназы, что может обеспечить более высокий уровень энергообеспечения, способствовать реализации сократильной функции скелетных мышц.

В сердечной »ладе кроликов в среднем содержится 0,122+0,0054 мкммоль/г 2-оксоглутарата. После введения лактатде-гидрогеназы содержание 2-оксоглутаратаснижается на 28,4% (р < 0,01). Как известно, 2-оксоглутарата является унифицированным интермедиатом: это не только продукт окислительного дезами-нирования глутамата, он образуется как компонент лимоннокислого цикла, используется в глюконеогенёзе, как акцептор аминогрупп при транеаминировании и реаминировании. Снижение его концентрации при превышении уровня контрольных величин глутаминовой кислоты и снижение активности глутаматдегидрогеназы и аспартата-минотрансферазы можно расценить как проявление активного использования 2-оксоглутарата Таким образом, введение лактатдегидро-геназы способствует усилению такого важного интегрального метаболита как 2-оксоглутарат, что свидетельствует, возможно, о повышении эффективности энергетически выгодных процессов. Ускорение трансформации субстратов в цикле трикарбоновых кислот не только служит предпосылкой оптимального энергообеспечения, но определяет возможность выполнения многообразных функций, выполняемых лимоннокислым циклом.

Вклад аминокислот в энергообеспечение миокарда снижается по сравнению с контролем. Источником субстратов цикла Кребса, в том числе океокиелот являются не аминокислоты, катаболизм которых протекает менее интенсивно, а углеводы, липиды, окисление которых эффективно обеспечивает миокард энергией и структурными компонентами.

Таким образом, введение препарата лактатдегидрогеназы в кровоток экспериментальным животным оказывает выраженный метаболический эффект на обменные процессы миокарда. Они регистрируются на разных уровнях клеточной организации - в цитоплазме и митохондриях. Отмечается снижение окислительного дезаминирова-ния: активность глуматдегидрогеназы снижена на 29,8%, намечается тенденция к уменьшению интенсивности трансаминирования аспартат-и аланинаминотрансферазы в цитоплазме и митохондриях. Это находит свое выражение и в менее эффективном использовании глутамата. Его концентрация выше уровня в контроле на 28,9% (р<0,01). Снижение содержания 2-оксоглутарата в условиях моделируемой ги-

перферментемии отражает его интенсивное использование е окислительных превращениях лимоннокислого цикла, поскольку активность трансдезаминирования при этом снижена.

Приготовление гомогената предполагает разрушение цитоплаз-матических мембран и структур субклеточных органелл. Следовательно, введенная извне малатдегидрогеназа находится в контакте с ферментами и субстратами, составляющими метаболическую основу печени. Проведенные эксперименты выявили стабильность метаболического эффекта, вызываемого экзогенными дегидрогеназами, и спе-ци^ич"ч:г:ую напрвленность изменений для каждого фермента. В дан-.чом случае исключены межорганные взаимодействия и связующая просп. обеспечивающая печень регуляторными сигналамии ; л'гескими факторами.

¿•кы,генная малатдегидрогеназа включается в обменные процессы многокомпонентной системы гомогената. Регистрируемая нами усиленная активность на протяжении 24 часов представлена суммарно введенным ферментом, цитоплазматическим и митохондриальным изоформами. Активность аспартатаминотрансферазы также отражает катализ обеими изоформами - цитоплазматической и митохондриаль-ной. Наблюдаемое параллельно усиление активности малатдегидроге-назы и аспартатаминотрансферазы создает условия для активного протекания сочетания процессов окисления - восстановления и трансаминирования. Функция малат-аспаргного шунта по нашим данным в целом превышает фоновые показатели. Следовательно, создаются предпосылки для ритмичной'поставки субстратов в жизненно важные процессы базового метаболизма печени по двум путям. Образумился в малатдегидрогеназной реакции НАДН может служить непосредственным источником восстановленных эквивалентов электрон-транспортную цепь, а малат и оксалоацетат обеспечить бесперебойность окисления в лимоннокислом цикле. Контроль за уровнем 2-оксо'глутарата показал, что этот метаболит активно используется. Его концентрация ниже исходной на 45%. Наряду с усилением энергетического метаболизма отмечается повышение интенсивности превращений аминокислот как за счет переаминирования, так и прямого дезаминирования. Таким образом эти процессы являются эффективными поставщиками оксалоацетата, 2-оксоглутарата и пирувата. Снижение содержания этих унифицированных субстратов отражает их-интенсивную утилизацию. Активность глутаматдегидрогеназы возрастает на 63% и 73% через 10 минут и 24 часа соответственно,

содержание глуташшвой кислоты снижено на 35%. Это служит показателем активного использования глутамата по специфическим путям обмена Данная аминокислота является не только компонентом белковых структур, но служит интегральным метаболитом, формирующимся в результате трансреанимирования из 2-оксоглутарата, продукта углеводно-липидного обмена. Глутамат концентрирует в своей структуре аминогруппы от всех аминокислот, подвергающихся катаболизму, выполняя роль их коллектора. Поэтому его содержание является итоговым показателем интенсивности процессов транс-деза-минирования, представленных в ткани печени.

Положительным моментом усиления потока через глутаматдегид-рогеназу является Образование при этом непосредственно внутрими-тохондриального НАДН, не нуждающегося в дополнительном транспорте для последующего окисления в цепи ферментов окислительного фосфорилирования. Активное использование метаболитов, индуцированное введением малатдегидрогеназы, не вызывает накопления метаболитов - кислых аминокислот оксо- и гидроксикислот, что предотвращает развитие метаболического ацидоза в печеночной ткани.

По-видимому, метаболические сдвиги, вызываемые экзогенным ферментом - характерный редокс потенциал, рН в отдельных микро-компартмантах за счет изменения баланса метаболитов, окисленных и восстановленных коферментов - определяют специфику конформаци-онного состояния гликолитического метаболона, проявляющегося повышением активности, в частности лактатдегидрогеназы, завершающей процесс гликолиза.

Следовательно, введенная малатдегидрогеназа оптимизирует не только аэробные окислительные процессы, но и обеспечивает определенное соответствие между аэробным и анаэробным распадом в печени, что, на наш взгляд, определяет физиологичность используемого фактора. Переводя на более высокий уровень катаболизм аминокислот, создав предпосылку для усиления аккумуляции энергии в терминальном окислении, осуществляется и усиление гликолиза, основного процесса энергообеспечения в цитоплазме, способствующего образованию унифицированных метаболитов, создавая специфическое микроокружение ферментов, стабилизируя электрический баланс в цитоплазме.

При инкубации лактатдегидрогеназы в гомогенате печени определяемая активность увеличивается в течение суток, имея гиперболическую направленность, введенный фермент может адсорбироваться

на фрагментах мембранных структур, пополнить эндогенный комплекс гликолитических ферментов, создав усиление на его заключительном этапе.

Следовательно, экзогенная лактатдегидрогеназа, выполняя реконструктивную функцию и встраиваясь в гликолитический поток, способствует усилению всего процесса. Этот факт необходимо учитывать, оценивая перспективность введения дегидрогеназ как энзи-мотерапевгических факторов.

Обобщая полученные результаты проведенных исследований, можно отметить, что первые таги в расширении наших знаний о возможностях терапии дегидрогеназами, способных индуцировать многообразные метаболические процессы и обеспечить переход на новую ступень взаимоотношений между системами жизнеобеспечения клеток, проделаны. Примечательно, что дегидрогеназы - биогенные факторы, наряду с отчетливым и специфическим действием не оказывают деструктивного влияния на мембранные структуры, поддерживая сбалансированное взаимоотношение различных клеточных микрокомпарт-ментов, определяя в целом клеточный гомеостаз в новых условиях.

ВЫВОДЫ

1. Обнаружено, что внутривенное введение экзогенной малатдегидрогеназы вызывает усиление процессов трансаминирования преимущественно за счет повышения активности аспартатаминотрансфе-разы. Отмечаются перепады концентрации в редоке-системе глута-мат-2-оксоглутарат в течение суток и завершается нормализацией их уровня через 24 часа.

2. Выявлено, что введение лактатдегидрогеназы в кровь способствует активной утилизации унифицированных субстратов: отмечено уменьшение концентрации малага, оксалоацетата, 2-оксоглу-тарата. Интенсивность процессов трансаминирования усиливается за счет роста активности аспартаг- аланинтрансаминаз, причем увеличивается количество мочевины.

3. Установлено, что внутривенное введение лактатдегидрогеназы вызывает отчетливые изменения в азотистом метаболизме скелетных мышц. Выявлено преимущественное расцепление аминокислот по пути непрямого дезаминирования за счет активации аспартат- и аланинаминотрансфераз. Интенсивность окислительного дезаминирования глутаматдегидрогеназой снижена, уровень глутамата повышен.

4. Выявлена специфическая реакция миокарда на гиперлактат-дегидрогеназемию, проявляющаяся снижением процессов трансамини-рования аспартатаминотрансферазой и аланинаминотрансферазой в цитоплазме и митохондриях и окислительного дезаминирования глу-туматдегидрогеназой. Общей закономерностью для мышц является увеличение содержания глутамата и снижение концентрации 2-оксоглутарата.

5. В условиях in vitro под влиянием лактатдегидрогеназы активируется трансаминирование в печени, изменения в глутаматде-гидрогеназной системе носят фазовый характер, увеличение сменяется в последующем снижением активности.

6. Мататдегидрогеназа в условиях in vitro вызывает усиление процесса трансдезаминирования за счет активации аепартатаминот-рансферазы, глутаматдегидрогеназы. Наряду с ростом интенсивности аэробного окисления, обеспечиваемого малатдегидрогеназой, происходит активация и анаэробного окислительного распада с участием лактатдегидрогеназы. Реализация глутамата и 2-оксоглутарата возрастает.

7. Нами разработана экспериментальная1 модель гиперферменте. мий как способ изучения патогенеза заболеваний, характеризующихся отклонениями в ферментном статусе.

8. Малатдегидрогеназа и лактатдегидрогеназа могут быть рассмотрены как перспективные биогенные средства энзимотерапевтической коррекции метаболизма.

- 21 -

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Романова Ю. В., Купаев В. И. Характеристика терминальной стадии гликолиза в миокарде человека при алкогольной интоксикации. //Всероссийской студенческой научной конференции Современные проблемы медицинской химии и клинической лабораторной диагностики. - Тезисы докладов. - г.Хабаровск, 1989. - с. 37-38.

2. Романова Ю. В. Некоторые показатели белкового обмена после введения малатдегидрогеназы. //XII студенческой научной конференции. - Тезисы докладов. - г.Вильнюс, 1990. - с. 4.

3. Романова Ю. В. Характеристика метаболического эффекта экзогенной малатдегидрогеназы. //Вопросы теоретической и практической медицины. - Тезисы докладов 55-й молодежной конференции БГМИ. - г.Уфа, 1990. - с. 18-19.

4. Поиск путей использования цитоплазматических ферментов мышечной ткани в специфической энзимотерапии. /Бабичев А. В. , Са-мыкина Л. Е , Романова Ю. В. и др. //Научно-техническая конференция молодых ученых и специалистов. - Тезисы докладов. - г. Самара, 1992. - с. 16-17.

5. Влияние экзогенной малатдегидрогеназы на процессы обмена белков и углеводов. /Кретова И. Г. , Аникеева 0. Б., Романова Ю. К и др. //Научно-техническая конференция молодых ученых и специалистов. - Тезисы докладов. - г.Самара, 1992. - с. 18-19.

6. О возможностях воздействия на метаболические процессы экзогенной малатдегидрогеназы. /Гильмиярова Ф. Е , Виноградова Л. Е , Романова Ю. В. и др. //Обмен веществ в норме и патологии. -Тезисы докладов. - Тюмень, 1992. - с.25.