Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Механизм формирования комплексов α-лактальбумина с олеиновой кислотой и молекулярные аспекты их цитотоксического действия

ВАК РФ 03.01.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Механизм формирования комплексов α-лактальбумина с олеиновой кислотой и молекулярные аспекты их цитотоксического действия"

На правах рукописи

Г

КНЯЗЕВА ЕКАТЕРИНА ЛЕОНИДОВНА

МЕХАНИЗМ ФОРМИРОВАНИЯ КОМПЛЕКСОВ сс-ЛАКТАЛЬБУМИНА С ОЛЕИНОВОЙ КИСЛОТОЙ И МОЛЕКУЛЯРНЫЕ АСПЕКТЫ ИХ ЦИТОТОКСИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ

03.01.02 - биофизика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Пущино 2010

004607114

004607114

Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институте биологического приборостроения РАН.

Научные руководители: доктор биологических наук, профессор

Пермяков Евгений Анатольевич

кандидат физико-математических наук Пермяков Сергей Евгеньевич

Официальные оппоненты: доктор физико-математических наук, профессор

Хечинашвили Николай Николаевич

доктор биологических наук Орлов Николай Яковлевич

Ведущая организация: Биологический факультет

Московского Государственного Университета

Защита диссертации состоится « 30 » нюня 2010 г. в 11-00 часов на заседании совета Д 002.066.01 по защите докторских и кандидатских диссертаций при Учреждении Российской академии наук Институте фундаментальных проблем биологии РАН по адресу: 142290, г. Пущино, Институтская ул., 2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИФПБ РАН по адресу: 142290, г. Пущино, Институтская ул., 2.

Автореферат разослан «/.^ » мая 2010 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

// >'< м

г

Г.Н. Назарова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

В настоящее время известен целый рад белков природного происхождения, обладающих селективной цитотоксической активностью по отношению к опухолевым клеткам. Одним из таких препаратов является мулътимериая форма человеческого а-лактальбумина (MAL), выделенная из казеиновой фракции молока (Hakansson et al. 1995). Показано, что MAL проявляет цитотоксическую активность по отношению к раковым и недифференцированным клеткам, не затрагивая при этом зрелые и здоровые клетки. MAL также обладает выраженной антибактериальной активностью по отношению к штаммам Streptococcus pneumonia. Группе К.Сванборг удалось получить подобное состояние in vitro с помощью ионообменной хроматографии апо-формы (свободной от Са2+) человеческого или коровьего а-лактальбумина (a-JIA) на колонке, предварительно кондиционированной олеиновой кислотой (OK) (Svensson et al. 2000). Это состояние белка получило название HAMLET/BAMLET (/mman/èovine olpha-lactalbumin made /ethal to rumor cells). Исследование механизма действия HAMLET на клетки обнаружило удивительную способность комплекса запускать в раковых клетках несколько путей клеточной гибели. Это обстоятельство позволяет надеяться на создание на основе HAMLET лекарственных средств, способных бороться с опухолевыми клетками самыми разными путями.

Несмотря на то, что состояние HAMLET активно изучают на протяжении последнего десятилетия, остаются неразрешёнными многие принципиальные вопросы. До сих пор остается не выясненной структура HAMLET, а также взаимодействия, стабилизирующие комплекс а-ЛА с ОК. Многоступенчатая процедура, применяемая для приготовления HAMLET, представляет собой сложный с физико-химической точки зрения процесс, препятствующий исследованию молекулярных основ формирования комплекса а-ЛА с ОК. Попытки образования активного комплекса путем простого смешения обоих компонентов в условиях раствора сопряжены с образованием протяженных фаз олеиновой кислоты, что приводит к выраженной гетерогенности системы и высокой степени зависимости результатов от условий смешения компонентов. Согласно некоторым работам, приготовленные таким образом комплексы а-лактальбумина с OK обладают низкой в сравнении с HAMLET цитотоксической активностью, однако систематические исследования процесса формирования комплексов а-ЛА с OK в условиях раствора в литературе отстутствуют. Наконец, несмотря на интенсивное изучение механизмов, лежащих в основе цитотоксического действия комплекса, до сих пор остаётся не

выясненным механизм его проникновения в клетку, а также влияние модификации а-лактальбумина олеиновой кислотой на взаимодействие а-ЛА с одной из основных мишеней HAMLET в клетке - гистонами.

Цели и задачи исследования

Целью настоящей работы было изучение механизма формирования в условиях раствора активных по отношению к раковым клеткам комплексов a-JIA с олеиновой кислотой в отсутствие протяженных фаз OK, а также выяснение влияния модификации а-ЛА олеиновой кислотой на взаимодействие белка с мембранами и гистонами.

Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:

1) Изучить влияние условий раствора на эффективность образования комплекса аЛА с олеиновой кислотой, с учётом критической концентрации мицеллообразования (ККМ) ОК.

2) Исследовать роль различных взаимодействий в стабилизации комплекса а-ЛА с олеиновой кислотой.

3) Провести сравнительное исследование структурных, физико-химических и цитотоксических свойств состояния HAMLET и комплексов а-ЛА - OK, получаемых в оптимизированных условиях раствора.

4) Исследовать влияние модификации а-ЛА олеиновой кислотой на взаимодействие белка с искусственными и природными мембранами, а также гистонами, на примере гистона Н1.

Научная новизна

В работе впервые проведено исследование взаимодействия а-лакгальбумина с олеиновой кислотой в условиях раствора с учётом критической концентрации мицеллообразования жирной кислоты. Подобраны оптимальные условия раствора, обеспечивающие максимальную ёмкость белка по отношению к ОК. Обнаружено, что а-лактальбумин обладает множественными центрами связывания олеиновой кислоты. Показано, что стабилизация комплекса а-ЛА - OK достигается за счет гидрофобных взаимодействий между белком и ОК. Связывание OK не вызывает олигомеризации белка, не изменяет его эффективного сродства к ионам Са2+, однако приводит к снижению термостабильности апо-а-ЛА, а также к увеличению содержания в нем а-спиралей. Изучение структурных, физико-химических и цитотоксических свойств комплексов а-ЛА - OK, полученных в оптимизированных условиях раствора, обнаружило сходство этих комплексов с состоянием HAMLET.

Впервые показано, что комплексы а-лактальбумина с OK наряду с интактным

белком взаимодействуют как с искусственными фосфолипидными мембранами, так и с природными мембранами клеток водорослей Chara corallina. При этом модификация a-JIA олеиновой кислотой приводит к усилению наблюдаемых эффектов. Комплексы а-ЛА - OK вызывают изменения ионных токов через плазмалемму клеток Chara corallina, приводя к развитию неспецифической проницаемости мембраны за счёт нарушения её целостности. Также показано, что модификация белка олеиновой кислотой повышает его сродство к гистону Hl in vitro, однако не является необходимым условием взаимодействия а-ЛА с гистоном.

Научно-практическая значимость

Показано, что общепринятый специфический протокол получения состояния HAMLET не является необходимым условием получения комплекса а-лактальбумина с OK, обладающего цитотоксической активностью по отношению к раковым клеткам. Тот факт, что подобные комплексы могут быть приготовлены в водном растворе без использования ионообменных носителей, облегчает и удешевляет процесс их приготовления, делает его более контролируемым и гибким. Предлагаемая в работе методика открывает дополнительные возможности для создания активных комплексов а-ЛА - OK, обладающих требуемыми свойствами, путем внесения модификаций (добавление дополнительных компонентов в раствор, использование других жирных кислот, и пр.), направленных на увеличение эффективности препаратов, повышение селективности их действия по отношению к раковым клеткам, и пр.

Следует отметить, что предложенная в работе методика определения ёмкости белка по отношению к жирной кислоте, основанная на измерении зависимости величины эффективной критической концентрации мицеллообразования ЖК от концентрации белка, может быть применена для исследования взаимодействия других белков с жирными кислотами и другими амфифильными веществами в отсутствие их протяженных фаз.

Апробация работы

Основные положения диссертационной работы были доложены и обсуждены на симпозиумах и конференциях: 11-ая международная школа-конференция «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2007); Школа - конференция молодых ученых, аспирантов и студентов «Биомедицинская инженерия - 2007» (Пущино, 2007); 12-ая международная школа-конференция «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2008); 2nd Symposium on HAMLET and tumor-killing proteins (Lund, 2009); 14-ая международная школа-конференция «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2010).

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на_страницах машинописного текста, состоит из

введения, обзора литературы, методической части, полученных результатов и их

обсуждения, заключения, выводов, списка цитируемой литературы (_источник).

Работа иллюстрирована_рисунками и содержит_таблиц.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Материалы. Человеческий а-ЛА был выделен из молока по методике, описанной в работе (Kaplanas & Antanavichyus 1975). Коровий а-ЛА приобретён у фирмы Sigma Chemical Со. Для работы использовали реактивы степени «осч». Проводимость используемой воды составляла не более 0,05 мкСм/см.

Выбор величины pH и температурных условий. В большинстве экспериментов использовали pH 8,3 - величину, используемую при приготовлении состояния HAMLET. Титрование а-ЛА олеиновой кислотой выполняли при температурах 17°С (выше температуры плавления OK, 16°С, и ниже середины теплового перехода апо-а-ЛА) и 45°С (тепловой переход апо-формы белка завершён).

Приготовление состояния HAMLET проводили согласно методике, описанной в работе (Pettersson et al. 2006), с помощью анионообменной хроматографии на колонке с носителем ДЭАЭ-Трисакрил М.

Приготовление комплексов LA-OA-17 и LA-OA-4S. 50 мл 10 мкМ раствора а-ЛА, свободного от Ca2+, (pH 8,3, 20 мМ Н3В03-К0Н, 150 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА) титровали аликвотами 15-20 мкл 50 мМ раствора OK в 96% этаноле, при постоянном перемешивании до достижения ККМ. Полученные при 17°С (LA-OA-17) или 45°С (LA-OA-45) комплексы диализовали против дистиллированной воды, лиофилизовали и хранили при -18°С.

Приготовление комплекса ЫЛ-ОА-45. 2-6 мл 600 мкМ раствора коровьего а-ЛА, свободного от Ca2+, (pH 12,0, 5 мМ КОН, 1 мМ ЭДТА) титровали при 45°С аликвотами 10-15 мкл 0,994 М раствора OK в 96% этаноле до достижения ККМ. Свободную OK удаляли путём снижения pH до 2,0-2,5 и центрифугирования в течение 30 мин., 12000 g. Нижнюю фазу, не содержащую протяжённых фаз OK, отбирали и доводили pH до 6. Полученный раствор диализовали против дистиллированной воды и лиофилизовали.

Приготовление малых униламелляриых везикул дипальмитоил-фосфатидилхолина (ДПФХ) проводили согласно методике, описанной в работе (Huang 1969). Для разделения смеси везикул использовали носитель Сефароза CL-4B.

Собирали второй пик элюции, соответствующий малым везикулам ДПФХ. Выделение комплекса а-ЛА с липосомами проводили согласно работе (Berliner & Koga 1987). Связавшийся с липосомами а-ЛА отделяли от свободного белка при помощи гель-фильтрации па носителе Сефадекс G-200.

Оценки ёмкости белка по отношению к OK проводили на спектрофотометре Сагу 100 (Varían Inc.) с термостатируемым юоветодержателем. 3 мл буфера титровали аликвотами 2-6 мкл 1-100 мМ раствора OK в 96% этаноле. Появление протяжённых фаз OK контролировали по росту рассеяния света при 310 нм. ККМ свободной кислоты (ККМо) оценивали из спектрофотометрической кривой титрования как концентрацию OK, соответствующую точке пересечения двух линейно аппроксимированных участков титрационной кривой. Аналогичным способом измеряли кажущееся значение ККМ OK в присутствии а-ЛА в концентрации [Р], которое прямо пропорционально ёмкости белка по отношению к OK (nmax):

ККМ=ККМо+пшах[Р] (1)

Величину пшх определяли из наклона зависимости ККМ от [Р]. Флуоресцентные измерения проводили на спектрофлуориметре Сагу Eclipse (Varían Inc.) с термостатируемым кюветодержателем. При измерении температурных зависимостей белковой флуоресценции температуру образца изменяли ступенчатым образом, с шагом 2°С. Средняя скорость нагрева составляла 0,5°С/мин. Круговой дихроизм (КД). Измерение КД проводили на спектрополяриметре JASCO J-810 (JASCO Inc.) с термостатируемым юоветным отделением. Конечный спектр являлся результатом усреднения данных трёх измерений за вычетом спектра буфера (20 мМ Н3ВО3-КОН, 150 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА, pH 8,3). Для количественной оценки содержания элементов вторичной структуры белка использовали пакет ПО CDPro (Sreerama et al. 2000).

Очистка белка от ионов кальция проводилась с помощью гель-фильтрации смеси белка с хелатором ионов Са2+ на носителе Сефадекс G-25 (Blum et al., 1977). Измерение сродства белка к кальцию проводили путём спектрофлуориметрического титрования очищенного от Ca2' белка стандартным раствором СаС12. Равновесную константу связывания Са2+ белком, К, определяли из экспериментальных данных согласно кооперативной схеме связывания:

Белок + п Са2+ <-> Белок Са2+„ ^ ^

где п - коэффициент Хилла. Подгонка экспериментальных данных проводилась с помощью программы FluoTitr v. 1.2 (ИБП РАН, Пущино), по методу Маркуардта, путём варьирования параметров п и К. Абсолютная ошибка определения К не превышала ±0,25 порядка величины.

Измерение сродства белка к ОК. Для оценки сродства a-JTA к ОК использовали метод, аналогичный описанному выше для оценки сродства к Са2+. Раствор а-ЛА титровали аликвотами раствора ОК до величины ККМ.

Исследование взаимодействия a-JIA с гистоном HI проводили на спектрофлуориметре Сагу Eclipse. Триптофановую флуоресценцию а-ЛА возбуждали при 304,5 нм, при спектральной ширине 5 нм. Эффективные параметры ассоциации гистона с а-ЛА определяли из экспериментальных данных согласно кооперативной схеме связывания [1].

Гель-фильтрационная хроматография для проверки наличия олигомеров белка проводилась с помощью системы высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) Prominence HPLC (Shimadzu) на колонке Superdex S-200, уравновешенной буфером 20 мМ Н3ВО3-КОН, 250 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА, рН 8,3. Образцы растворяли в том же буфере с последующим центрифугированием (1300 об./мин. в течение 10 минут при комнатной температуре). Калибровку проводили в тех же условиях. Тест на цитотоксичность проводили совместно с сотрудниками Лаборатории тканевой инженерии ИТЭБ РАН, Пущино. Клетки НЕр-2 были выращены на модифицированной Дульбекко питательной среде Игла (DMEM), дополненной 10% зародышевой сывороткой крупного рогатого скота, в присутствии 40 мг/мл гентамицина, 35 мМ бикарбоната натрия и 20 мМ HEPES при 37°С, в атмосфере 5% С02.

Растворы а-ЛА и комплексов белка с ОК в ростовой среде, также как и OK (1 М раствор в этаноле), добавляли в культуральную среду спустя 24 часа после посева клеток. Цитотоксичность оценивали, используя анализ с кристаллическим фиолетовым, по отношению оптических плотностей на 560 нм в обработанной и контрольной культуре спустя 48 часов после добавления токсичного агента (Noraizu et al. 1995). Отношение оптических плотностей прямо пропорционально числу выживших клеток. Каждый эксперимент выполняли не менее трёх раз. Электрофизиологические исследования были выполнены совместно с Жереловой О.М. (Лаб. Ультраструктуры нейрона ИТЭБ РАН, г. Пущино) и Катаевым А.А. (Лаб. Молекулярной физиологии клетки ИБК РАН, г. Пущино) согласно экспериментальной методике, описанной в работах (Lunevsky et al. 1983) и (Kataev et al. 1984). В работе использовали междоузловые клетки водоросли Chara corallina. Представлены усредненные элекгрофизиологические данные, полученные на 5-7 отдельных клетках.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Зависимость ККМ олеиновой кислоты от условий раствора

Приготовление комплексов а-ЛА с OK в условиях раствора проводили при значении pH 8,3, используемом при получении состояния HAMLET. Карбоксильная группа мономерной OK в данных условиях полностью депротонированна (рКа 4,8) и способна связывать ионы кальция, что, в свою очередь, может влиять на ККМ олеиновой кислоты. Действительно, значение ККМ в отсутствие ионов Са2+ (I мМ ЭДТА) более чем в 5 раз превышало значения, полученные з условиях избытка Са2+ (1 мМ СаСЬ). Добавление NaCl либо KCl оказывало меньшее влияние на величину ККМ.

Таким образом, условия отсутствия Са2+ наиболее благоприятны для насыщения белка ОК.

Ёмкость а-лактальбумина по отношению к олеиновой кислоте

Для оценки ёмкости а-ЛА по отношению к олеиновой кислоте (птах) нами была определена зависимость эффективной критической концентрации мицеллообразования OK от концентрации белка при 17°С и 45°С. Величина ККМ увеличивается пропорционально концентрации белка, при этом наклон прямой линии соответствует величине п^ (Уравнение (1)). Показано, что максимальная величина Птах достигается в условиях отсутствия Са2+, в присутствии солей и повышенной температуре (Табл. 1). При этом не зависит от типа соли (KCl или NaCI). Повышение температуры с 17°С до 45°С сопровождается 40% увеличением nntln. Важность ионной силы для эффективного связывания OK а-лактальбумином подтверждается снижением птах в 3-8 раз в отсутствие солей.

Табл. 1. Зависимость Ёмкости а-ЛА по отношению к ОК (пшо) от условий раствора.

Температура 1мМСаС12 1 мМ ЭДТА

Ятах> без солей Птал без солей Иглах» 150 mMNÜCI Mmaxr 150 мМ KCl

17°С 0 3,7 13,5 12,1

45°С 0 2,2 18,5 18,0

Критическим условием для ассоциации OK явилось отсутствие ионов Са2+, что также подтверждается экспериментами по спектрофлуориметрическому и КД- (в дальней УФ-области) титрованию а-ЛА олеиновой кислотой, которые не выявили каких-либо спектральных изменений для белка, насыщенного кальцием (данные не представлены). Этот вывод хорошо согласуется с имеющимися в литературе данными о невозможности формирования состояния HAMLET из Са2+-насыщеного белка

(Svensson et al. 2000).

В целом, Табл. 1 свидетельствует о том, что наиболее благоприятные для формирования комплекса между а-ЛА и ОК условия, соответствующие максимальной ёмкости белка, достигаются в отсутствие ионов Са2+ при 45°С в присутствии 150 мМ NaCl/KCl. Эти условия переводят белок в состояние «расплавленной глобулы», обладающее хорошо выраженной вторичной структурой, но лишенное уникальной пространственной структуры (Dolgikh et al., 1981). Сворачивание а-ЛА путём понижения температуры или связывания Са2+ сопровождается снижением величины птах.

Механизм связывания олеиновой кислоты а-лактальбумином

Связывание ОК а-лактальбумином в оптимальных условиях сопровождается коротковолновым сдвигом максимума спектра флуоресценции на 2 нм, свидетельствуя о снижении подвижности и полярности окружения остатков Тгр белка, указывая на уменьшение их доступности растворителю.

Для выяснения деталей механизма связывания ОК белком нами были построены флуоресцентные фазовые графики, представляющие собой зависимость интенсивности флуоресценции при фиксированной длине волны от интенсивности флуоресценции при другой длине волны (Бурштейн, 1977) (Рис. 1). Каждая прямая

линия на фазовом графике соответствует переходу между двумя конформационными состояниями белка. Таким образом, можно выявить точки, соответствующие максимальной заселённости отдельных состояний белка, а также переходам между этими состояниями.

Фазовый график для спектрофлуориметрического титрования а-ЛА, свободного от Са2+, олеиновой кислотой до ККМ при 45°С представлен на Рис. 1. Видно, что процесс связывания ОК а-лактальбумином протекает с образованием, по меньшей мере, трёх интермедиатов при 45°С и двух промежуточных состояний белка при 17°С (данные не представлены). Это, в свою очередь, согласуется с оценками ёмкости апо-белка по отношению к ОК и

F310

Рис. 1. Анализ результатов спектрофлуориметрического титрования ОК а-ЛА, свободного ст Са2*, при 45°С, рН 8,3, с помощью фазового графика. Показаны отношения ОК/белок, соответствующие ключевым точкам фазового графика.

свидетельстует о наличии множественных центров связывания олеиновой кислоты и апо-форме а-лактальбумина.

Несмотря на то, что связывание ОК а-лактальбумином, свободным от Са2+, -сложный мультистадийный процесс, можно оценить псевдо-равновесную константу связывания ОК К, используя кооперативную схему связывания п молекул ОК на молекулу белка. В результате оценки мы получили значения К-2х104 М"1 и «=1,3 при 17°С. При 45°С наблюдали повышение сродства а-ЛА к ОК примерно на порядок величины, что находится в соответствии с данными по увеличению величин пшш с повышением температуры (Табл.1).

Исследование взаимодействий, стабилизирующих комплексы а-лактальбумина с олеиновой кислотой

Повышение ёмкости и эффективного сродства апо-а-ЛА по отношению к ОК в результате разворачивания белка, сопровождающегося экспонированием гидрофобных групп белка растворителю, говорит в пользу решающей роли гидрофобных взаимодействий в образовании комплекса белка с жирной кислотой. Для проверки этой гипотезы нами были выбраны крайне щелочные условия среды (рН 12,0), при которых практически полностью исключается электростатическое взаимодействие между основными аминокислотными остатками белка (за исключением одного остатка аргинина) и отрицательно заряженной карбоксильной группой жирной кислоты. Известно, что при щелочных рН коровий а-лактальбумин претерпевает структурные изменения, вызванные депротонированием остатков лизина и тирозина (Регтуакоу ^ а!., 1985). При рН 12,0 щелочной денатурационный переход апо-а-ЛА полностью завершён.

Спектрофотометрическое

Табл. 2. Зависимость ёмкости коровьего а-ЛА по измерение веЛичины ККМ отношению к ОК (птш) от условии раствора при рН 12,0.

ОК при рН 12,0 показывает значительное увеличение ККМ в отсутствии ионов Са2+ (до миллимолей), по сравнению с ККМ при рН 8,3 (данные не представлены), что согласуется с литературными данными об увеличении растворимости длинноцепочечных жирных кислот с повышением рН раствора (Кашску й а1., 2002). В то же время, в присутствии 1 мМ СаС12 величина ККМ олеиновой кислоты остается достаточно низкой (~4 мкМ).

Необходимо отметить, что увеличение растворимости ОК при рН 12,0

И

Температура 1мМСаС12 1 мМ ЭДТА

Я/пах> 150мМКС1 без солей МтаХ' 150ммка

20°С 0 14±1 25±2

45°С 0 34±5 22±3

приводит, соответственно, к увеличению ошибки при определении ККМ0 до нескольких сотен микромолей. Поэтому для более точного определения ёмкости а-JIA по отношению к ОК при рН 12,0 использовали концентрации белка -600 мкМ. Полученные в результате величины п„ах представлены в Табл. 2.

Показано, что ёмкость Са2+-насьпцеиного а-ЛА по отношеню к ОК равна нулю. Для апо-формы белка ёмкость по отношению к ОК была даже выше, чем при рН 8,3 (см. Табл. 1). Это, с одной стороны, свидетельствует о том, что электростатические взаимодействия не играют существенной роли в процессе формирования комплексов а-лактальбумина с ОК, с другой стороны, увеличение пта в данных условиях, когда гидрофобная поверхность апо-белка экспонирована растворителю за счёт щелочной денатурации, подтверждает гидрофобный характер взаимодействий, стабилизирующих комплексы а-ЛА с олеиновой кислотой.

В оптимизированных условиях раствора, обеспечивающих максимальную ёмкость а-лактальбумина по отношению к ОК при рН 8,3 и рН 12,0, были приготовлены комплексы LA-OA-45 (LA-OA-17) и bLA-OA-45, соответственно, как описано в главе Методы. Далее необходимо было провести сравнительное исследование структурных, физико-химических и цитотоксических свойств данных комплексов и состояния HAMLET.

Содержание олеиновой кислоты в препаратах LA-OA

Для оценки числа молекул ОК, приходящихся на молекулу а-лактальбумина в препарате LA-OA-17 (п,„) (после диализа насыщенного ОК белка против воды, с последующей лиофилизацией), некоторые физико-химические параметры LA-OA-17 сравнивали с таковыми для комплексов а-ЛА с ОК, полученных добавлением при 17°С олеиновой кислоты до достижения фиксированного молярного отношения ОК к белку. На Рис. 2 представлены результаты экспериментов по тепловой денатурации смеси ОК-а-ЛА, полученные методом собственной флуоресценции. Как видно из Рис. 2, ассоциация ОК приводит к значительному снижению термостабильности апо-белка. Дестабилизация а-ЛА приводит к сдвигу спектра флуоресценции при 10°С в длинноволновую область. Начальную часть зависимости при 10°С и t1/2 от молярного соотношения [ОК]/[белок] можно аппроксимировать прямой линией (Рис. 2). Сравнивая величины этих параметров для LA-OA-17 с калибровочной кривой, получаем значение п„, равное 6±0,4.

Аналогичным образом, величина nirr для LA-OA-45 составляет ~9. Однако в этом случае зависимость Атах от молярного соотношения ОК/белок теряла линейность выше отношения 10:1 (данные не представлены), что затрудняло точную оценку nirr.

[ОК]/[а-ЛА]

Рис. 2. Зависимость спектральных и термодинамических параметров a-JIA, свободного от Са2\ от молярного соотношения ОК к белку (20 мМ Н3В03-К0Н, 150 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА, рН 8,3). Горизонтальные линии указывают значения соответствующих параметров для LA-0A-17.

Величина nirr для состояния HAMLET не может быть определено аналогичным способом, вследствие специфических условий формирования данного комплекса. Среднее число молекул олеиновой кислоты, связанных на молекулу HAMLET, по литературным данным варьирует от 0,6-1,3 (Svensson et al. 2003) до 5,1-5,4 (Pettersson-Katsberg et al. 2009).

Снижение термо-

стабильности апо-а-ЛА при связывании OK свидетельствует о большем сродстве к OK денатурированного состояния

белка, что находится в соответствии с полученными оценками сродства белка к ОК, а также дополнительно подтверждает решающую роль гидрофобных взаимодействий в образовании комплексов.

Исследование содержания олигомерных форм в комплексах а-лактальбумина с олеиновой кислотой

Для проверки возможного наличия олигомерных форм комплексов а-ЛА с ОК была применена гель-фильтрационная ВЭЖХ на носителе Бирепкх 8-200. Из Рис. 3 видно, что все образцы при 17°С элюируются одним симметричным пиком,

соответствующим мономерной форме человеческого а-ЛА. Тем не менее, при высокой концентрации интактного белка (334 мкМ) обнаружен минорный пик, соответствующий димеру а-ЛА. Аналогичные результаты были

1.6-

р

X

о

(О 1.2-

m

X

<D ■î 08-

Г

ш

Щ

0.4-

F

о

0.0-

димер тример |

I ' А

а-ЛА — M

HAMLET — fl\

LA-OA-17- _^ m L_LA-0A-45

12

14 16 18

Объём элюции, мл

20

Рис. 3. Гель-фильтрационная ВЭЖХ а-ЛА (334 мкМ), HAMLET (ISS мкМ), LA-OA-I7 (49 мкМ) и LA-OA-45(20 мкМ), свободных от Ca2* (1 мМ ЭДТА), на колонке Superdex S-200, 17°С,рН8,3.

получены при 40°С, а также в условиях насыщения интакного белка и его ОК-комплексов ионами Са2+(данные не представлены).

Таким образом, гель-фильтрационный анализ показывает, что модификация а-лактальбумина олеиновой кислотой не приводит к олигомеризации белка.

Влияние связывания ОК на термостабильность а-ЛА, его сродство к сг и вторичную структуру

Связывание ОК приводит к заметному снижению термостабильности апо-а-ЛА, что видно из Рис. 2, а также из спекгрофлуориметрических данных по тепловой денатурации различных состояний а-ЛА, приведённых на Рис. 4А. В то время как комплекс LA-OA-17 характеризуется сдвигом термостабильности по отношению к интактному а-ЛА на ~9°С (Рис. 2), насыщение белка олеиновой кислотой до величины ККМ при 17°С вызывает более значительное изменение термостабилыюсти - на ~12°С. Более выраженные относительно LA-OA-17 изменения термостабильности, обнаруженные для LA-OA-45 и белка, насыщенного ОК, коррелируют с большим числом молекул ОК, приходящихся на молекулу а-ЛА (п,гг).

Температура, °С Температура, °С

Рис. 4. Термостабильность различных состояний ano- (А) и Ca2*-насыщенного (Б) а-ЛА при pH 8,3: интактный а-ЛА (о), HAMLET (is), LA-OA-17 (+), LA-OA-45 (A) и а-ЛА, насыщенный OK до ККМ при 17°С (•) или 4 fC (а).

В отличие от апо-белка, насыщенные Са2+ (1 мМ СаСЬ) комплексы HAMLET, LA-OA-17 и LA-OA-45 демонстрировали слабое (менее, чем на 4°С) повышение термостабилыюсти, по сравнению с интактным а-ЛА (Рис. 4Б).

Для изучения влияния ассоциации ОК на сродство а-ЛА к ионам Са2+ проведено спектрофлуориметрическое титрование кальцием белка, очищенного от катионов, при 45°. Несмотря на заметное снижение термостабильности всех комплексов апо-а-ЛА с ОК (Рис. 4А), их эффективное сродство к ионам Са2+ снижалось примерно в 2 раза, что находится в пределах погрешности эксперимента

14

(Табл. 3). Исключение составляет белок, титрованный ОК до ККМ при 17°С и 45°С, для которого наблюдалось снижение величины К на 0,5-1 порядок величины. Наиболее заметные изменения сродства к Са2+, обнаруженные для а-ЛА, насыщенного ОК, возможно, являются следствием конкуренции между белком и ОК за ионы Са2+.

Табл. 3. Равновесные константы связывания Са~~ (К) и коэффициенты Хилла (п) при 45°С для различных состояний а-ЛА по данным спектрофлуориметрическгсс титрований (рН 8,2).

Состояние белка к, и1 п

Интактный а-ЛА 1,3 х 106 0,95

HAMLET 8 x10s 0,98

LA-OA-17 7 х 105 0,87

LA-OA-45 7 х 105 0,86

Насыщенный OK при 17°С 2,7 х 105* 1,8

Насыщенный ОК при 45°С 1,5 х 105 2,3

* Обнаружен дополнительный Са -связывающий центр с К около

Измерения спектров КД в дальней УФ-области для разных состояний белка при 5°С и 45°С показали, что все формы апо-а-ЛА, содержащие ОК, проявляют повышенную отрицательную молярную эллиптичность в области 210-225 нм. Оценка содержания элементов вторичной структуры для различных форм а-ЛА, свободного от Са2+, с использованием ПО СЭРго, показала, что изменения, вызванные связыванием ОК при 5°С, выражаются, главным образом, в повышении содержания а-спиралей (Табл. 4). Схожие изменения спиральности обнаружены при 45°С.

Табл. 4. Оценка содержания элементов вторичной структуры (%) для различных форм а-ЛА, свободного от Са2*, по данным КД, при 5°С, рН 8,3.

Состояние белка а-спирали ß- структуры Повороты Неупорядоченные структуры

Интактный а-ЛА 34,1 13,5 19,2 32,5

HAMLET 39,6 11,8 19,2 29,9

LA-OA-17 35,9 12,6 20,2 31,2

LA-OA-45 41,2 12,9 18,6 30,3

Таким образом, модификация апо-а-ЛА олеиновой кислотой приводит к снижению его термостабильности, сохраняет довольно высокое сродство к ионам Са2+, но вызывает повышение содержания а-спиралей.

0,-JlA

M

HAMLET \ 1 LA-OA

\ок

\

Сравнение цитотоксических свойств HAMLET и комплексов LA-OA

Концентрационная зависимость цитогоксического действия HAMLET и комплексов LA-OA на клетки эпидермоидной карциномы гортани человека НЕр-2 in vitro представлена на Рис. 5. Олеиновая кислота обладает токсическим действием на клетки НЕр-2 только в концентрациях, превышающих 300 мкМ. Значение 1С5о для комплексов LA-OA (~50 мкМ) близко к 1С50 для HAMLET (~40 мкМ), однако цитотоксическое действие состояния HAMLET становится заметным при более низких концентрациях (около 20-30 мкМ).

Интактный a-JIA в концентрации до 1 мМ не проявляет токсичности, несмотря на имеющиеся в литературе данные о том, что белок способен оказывать цитотоксическое действие на определённые клеточные линии (см., напр., Lin et al. 2008).

Нужно отметить, что комплекс bLA-OA-45 также проявлял цитотоксическую

активность по отношению к клеткам НЕр-2 (1С5о около 20 мкМ), схожую с токсичностью состояния HAMLET (данные не представлены). При этом как интактный, так и контрольный коровий а-ЛА, не проявляли токсичности по отношению к данным клеткам.

Таким образом, показано, что комплексы LA-OA-17 и LA-OA-45 по своим физико-химическим свойствам и цитотоксическому действию на клетки Нер-2 схожи с состоянием HAMLET. Тот факт, что образование HAMLET-подобных комплексов а-ЛА с олеиновой кислотой возможно в условиях раствора без использования ионообменной хроматографии, облегчает и удешевляет процесс их приготовления, делает его более контролируемым и гибким.

120

о:

§.100 II 80

¡5

£ 60

I 40 ш

о 20

5

3 °

1

1000

10 100 Концентрация образца, мкМ

Рис. 5. Концентрационная зависимость цитотоксичности по отношению к клеткам НЕр-2 комплексов а-ЛА-ОК и контролей.

Взаимодействие комплексов а-ЛА - OK с мембранами

Ранее было показано, что HAMLET способен проникать в раковые клетки (Duringer et al., 2003), однако механизм переноса экзогенного цитотоксичного комплекса а-ЛА с OK через плазматическую мембрану остаётся невыясненным до сих пор. Нами был исследован процесс взаимодействия комплексов с двумя модельными системами: малыми униламеллярными везикулами ДПФХ и

плазмалеммой клеток водоросли Chara corallina, которая обладает электровозбудимыми ионными каналами, структурно и функционально схожими с ион-транспортными системами многих животных клеток (Берестовский el al. 1987; Hedrich & Jeromin 1992; Lunevsky et al. 1983).

Взаимодействие комплексов а-ЛА-ОК с малыми униламеллярными везикулами дипальмитоилфосфатидилхолина

Для исследования влияния модификации а-ЛА олеиновой кислотой на его сродство к фосфолипидной мембране мы сравнивали сродство интактного белка и его комплексов с OK к униламеллярным везикулам модельного фосфолипида, ДПФХ. Для этого предварительно инкубированная в течение 15 часов при 4°С смесь белка с везикулами ДПФХ подвергалась гель-фильтрации на колонке Сефадекс G-200. Общее количество свободного и связанного с везикулами белка определяли спектрофото-

метрически. Доля ano-LA-OA-17, связанного с везикулами ДПФХ, составила 53%, что на 19% выше соответствующего значения для апо-формы интактного а-ЛА. Менее выраженный эффект наблюдали для ano-LA-OA-45 и апо-HAMLET (Табл. 5).

Насыщение белка ионами Са2+ приводило к снижению доли а-ЛА, связанного с везикулами, для всех исследуемых форм белка. Наименее выраженный эффект наблюдали для состояний LA-OA-45 и LA-OA-17. Для HAMLET, насыщенного Са2+, сродство к везикулам было близко к таковому для интактного апо-а-ЛА, что, возможно, связано с меньшим количеством молекул OK, приходящихся на молекулу белка, в данном комплексе.

Эксперименты с везикулами ДПФХ показали, что связывание олеиновой кислоты повышает сродство белка к липосомам независимо от концентрации Са2+. Таким образом, связывание OK стабилизирует конформацию белка, способную к Са2+ независимому взаимодействию с мембранами.

Действие комплексов а-ЛА с OK на ионные токи через плазмалемму Chara corallina

Электрофизиологические исследования были выполнены нами совместно с сотрудниками Лаборатории ультраструктуры нейрона ИТЭБ РАН и Лаборатории

Табл. 5. Зависимость доли а-ЛА, связанного с

униламеллярными везикулами ДПФХ, от концентрации кальция (50 мМ НЕРЕБ-КОН, 150 мМ ИаС1, рН 7,4).

Состояние а-ЛА Доля а-ЛА, связанного с везикулами, %

1 мМЭДТА 1 мМ СаС12

Интактный а-ЛА 34 2

HAMLET 50 8

LA-OA-17 53 32

LA-OA-45 40 33

молекулярной физиологии клетки ИБК РАН на междоузловых нативиых и перфузи-рованных клетках Chara corallina в условиях фиксации потенциала. Потенциал действия этих клеток, как показано на Рис. 6, представляет собой суперпозицию входящего Са2+ тока, Са2+-активируемого хлорного тока и К+ тока утечки (Kataev et al. 1984). Добавление к омывающему раствору 10 мкМ LA-OA-17 вызывает изменения амплитуды и активационно-инактивационной кинетики развивающегося суммарного тока, в частности, происходит снижение амплитуды Са2+ тока и Са2+-зависимого С1" тока (Рис. 7А). Интересно, что этот эффект сопровождается увеличением неспецифического К+ тока утечки и резким падением сопротивления мембраны (Рис. 7Б). Электропроводность мембраны повышается с увеличением концентрации LA-OA-17. Добавление 80 мкМ LA-OA-17 (концентрация, превышающая значение 1С50 для цитотоксического действия комплекса на клетки НЕр-2 in vitro) вызывает резкое увеличение К+ тока утечки и полную инактивацию ионных каналов на 20-30 минут (данные не показаны).

Исследования, выполненные на перфузированных клетках, позволили проследить прямое действие LA-OA-17 на Са2+ каналы плазмалеммы. Зависимость плотности Са2+ тока от напряжения на плазматической мембране измеряли через определенные промежутки времени, используя пилообразное напряжение длительностью 30 мс (Рис. 7В). Добавление в омывающий раствор 4 мкМ LA-OA-17 вызывало заметные временные изменения вольтамперных характеристик Са2+ каналов. Наблюдали краткосрочное усиление Са2+ тока в ответ на LA-OA-17 (Рис. 7В, кривая 2), что может быть связано с повышением внутриклеточной концентрации Са2* в течение первых двух минут после введения LA-OA-17. За начальным ростом Са2+ тока следовало его постепенное снижение (Рис. 7В, кривые 3-5), вызванное ингибированием кальциевых каналов. Необходимо подчеркнуть, что наличие изобестической точки в вольтамперных характеристиках (Рис. 7В) свидетельствует о прямом и селективном взаимодействии LA-OA-17 с Са2+ каналами плазмалеммы (Zherelova 1989).

Отмывка плазмалеммы, обработанной LA-OA-17, начальным буферным раствором не восстановливает ионные токи, что свидетельствует о необратимости процесса взаимодействия комплекса с плазмалеммой Chara corallina.

П50 мВ I ! -200 мВ

Рис. 6. А: Типичные ионные токи, развивающиеся на плазмалемме Chara corallina при скачкообразном изменении напряжения. Б: Протокол изменения напряжения на мембране.

0,5 сек

s

5 -з

& -6 *

,о

0 ч

4 Ö

ъ

I

о

0 20 40 60

Время, мин

0.4

0.3-

S 0.2 <

п

_Ь>0.1

о.о

-0.1

-40 -20 0 20 40

V, мВ

Рис. 7. Изменения ионных токов, вызванные LA-OA-17. А, временные изменения суммарного тока: (1) контроль, (2) 2, мин. после добавления 10 мкМ LA-0A-17, (3) 9 мин., (4) 16 мин., (5) 29 мин. Б, изменения тока утечки, развивающиеся после добавления LA-OA-17: (1) 1,4 мкМ, (2) 2,8 мкМ, (3-5) 10 мкМ. В, изменения вольт-амперных характеристик Са2* тока для перфузировапиых клеток: (!) без LA-OA-17,

(2) 2 мин. после введения 4 мкМ LA-OA-17,

(3) 9 мин., (4) 16 мин., (5) 29мин.

Аналогичные исследования, выполненные для состояния HAMLET, показали качественно схожий результат, однако действие HAMLET на ионные каналы было менее выражено количественно, что, вероятно, является следствием меньшего числа молекул OK, связанных на молекулу HAMLET.

Поскольку OK может частично диссоциировать из комплексов LA-OA-17 и HAMLET в условиях, используемых для электрофизиологических измерений, необходимо было исследовать действия на ионные токи, индуцируемые свободной OK и интактным а-ЛА. Экзогенное введение а-ЛА вызывает намного менее выраженные изменения в кинетике инактивации тока, нежели LA-OA-17.

Введение 10 мкМ OK и повышение её концентрации до 20 мкМ вызывает постепенное ускорение блокировки ионных токов, в зависимости от дозы. Калиевые токи утечки при этом не изменяются. Отмывка плазмалеммы, обработанной OK, начальным наружным раствором приводит к эффективному

восстановлению амплитуды Са2+ тока.

Таким образом, полученные данные ясно демонстрируют, что а-лактальбумин взаимодействует как с искусственными, так и с природными мембранами, причём модификация белка олеиновой кислотой приводит к усилению наблюдаемых эффектов. Комплексы с OK блокируют Ca и активируемые СГ токи, вызывают

неселективную проницаемость мембраны (повышение неспецифических К+ токов утечки), изменяя, таким образом, структурное и функциональное состояние плазмалеммы.

Взаимодействие комплексов a-JIA-OK с гистоном Hl in vitro

Установлено, что одной из главных мишеней комплекса HAMLET в раковой клетке являются гистоны (Duringer et al., 2003). С помощью спекгрофлуориметрических методов нами исследовано влияние модификации а-ЛА олеиновой кислотой на взаимодействие с гистонами in vitro на примере гистона HI.

Благодаря тому, что гистоны не содержат остатков триптофана (Isenberg, 1979), мы селективно возбуждали триптофановую флуоресценцию а-ЛА в ходе титрования его гистоном.

Из данных спектрофлуори-метрического титрования (Рис. 8) апо-формы интактного а-ЛА и его комплексов с OK гистоном HI видно, что связывание с гистоном при 5°С вызывает разворачивание Рис. 8. Спектрофлуориметрическое mum- белка, отражающееся в

340

336-

I 332-

£

328-

324

м

4

f — • — а-ЛА

—о—LA-OA-17

х LA-OA-45

! .....а......HAMLET

1 2 [Н1]/[апо-а-ЛА]

рование различных состояний апо-а-ЛА гистоном HI при 5°С (10 mMHEPES-KOH, 1 мМ ЭДТА; pH 7,6).

выраженным сдвиге спектра флуоресценции в длинноволновую сторону. При этом добавление в раствор гистона выше эквимолярной концентрации не приводит к дальнейшим изменениям в спектрах флуоресценции. При очень низком молярном соотношении гистона к комплексам а-ЛА с ОК (1:20-1:10) наблюдается заметный сдвиг спектра флуоресценции в коротковолновую сторону, не наблюдаемый в случае

титрования интактного белка. По-Табл. 6. Равновесные константы связывания видимому, данный эффект вызван

гистона Н1 (К) и коэффициенты Хилла (п) для различных состояний апо-а-ЛА при 5°С.

Состояние белка к, м' п

Интактный а-ЛА 1,4 х Ю5 2,8

LA-OA-17 1,4 х 106 1,3

LA-OA-45 0,8 х 106 2,0

HAMLET 1,2 х 106 2,4

агрегацией а-ЛА вследствие перенасыщения гистона молекулами белка.

Следующий за данным изгибом участок кривой титрования можно описать кооперативной схемой

связывания п молекул a-JTA на молекулу гистона. Полученные в рамках такой модели величины кажущихся констант связывания гистона приведены в Табл. 6. Видно, что модификация а-ЛА олеиновой кислотой повышает примерно в 10 раз эффективное сродство белка к HI in vitro, однако связывание олеиновой кислоты не является необходимым условием взаимодействия а-лактальбумипа с гистоном.

Данные по тепловой денатурации различных состояний апо-а-ЛА, связанных с гистоном HI при 5°С (конечное молярное отношение гистона к белку составляло ~5:1), свидетельствуют о том, что взаимодействие с гистоном приводит к заметному снижению термостабильности а-лактальбумина независимо от присутствия олеиновой кислоты (данные не приведены).

Полученные данные свидетельствуют о том, что связывашге ОК способствует ассоциации а-ЛА с гистоном HI, однако модификация белка олеиновой кислотой не является необходимым условием для взаимодействия а-лакгальбумина с гистоном in vitro.

ВЫВОДЫ

1. Показано, что апо-форма а-лактальбумина обладает множественными центрами связывания олеиновой кислоты (OK). Связывание OK вызывает снижение термостабилыюсти апо-а-ЛА. Тепловое разворачивание апо-а-ЛА вызывает увеличение его ёмкости по отношению к олеиновой кислоте, а также повышение эффективного сродства белка к ней. Повышение pH раствора до 12 не вызывает снижения эффективности связывания OK белком. В целом показано, что образование комплексов а-ЛА с олеиновой кислотой определяется гидрофобными взаимодействиями между белком и ОК.

2. Определены оптимальные условия раствора, обеспечивающие максимальную ёмкость белка по отношению к олеиновой кислоте, в условиях отсутствия протяженных фаз ОК. Приготовленные в оптимизированных условиях раствора комплексы LA-OA-17 и LA-OA-45 мономерны, сохраняют нативноподобное сродство к ионам Са2+, однако демонстрируют повышенное содержание а-спиралей.

3. Показано, что комплексы LA-OA-17 и LA-OA-45 по своим физико-химическим свойствам и цитотоксическому действию на клетки Нер-2 схожи с состоянием HAMLET. Таким образом, образование HAMLET-подобных комплексов а-ЛА с олеиновой кислотой возможно в условиях раствора без использования ионообменной хроматографии.

4. Модификация а-лактальбумина олеиновой кислотой повышает его сродство к малым униламеллярным визикулам ДПФХ независимо от концентрации Са'\ а также вызывает изменения ионных токов через плазмалемму клеток Chara corallina, приводя к развитию неспецифической проницаемости мембраны за счёт нарушения её целостности.

5. Показано, что модификация а-лактальбумина олеиновой кислотой повышает примерно в десять раз его сродство к гистону HI in vitro, однако не является необходимым условием взаимодействия а-JIA с гистоном.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ

Статьи:

1. Knyazeva EL, Grishchenko VM, Fadeev RS, Akatov VS, Permyakov SE, Permyakov EA. Who is Mr. HAMLET? Interaction of human а-lactalbumin with monomeric oleic acid. Biochemistiy, 2008, V. 47, N. 49, p. 13127-37.

2. Permyakov SE, Bakunts AG, Denesyuk AI, Knyazeva EL, Uversky VN, Permyakov EA Apo-parvalbumin as an intrinsically disordered protein. Proteir^ 2008, Vol. 72, N. 3, P. 822-836.

3. Zherelova OM, Kataev AA, Grishchenko VM, Knyazeva EL, Permyakov SE, Permyakov EA. Interaction of antitumor alpha-lactalbumin-oleic acid complexes with artificial and natural membranes. J. Bioenerg. Biomembr. 2009, V. 41, N. 3, p. 229-37.

Тезисы сообщений:

1. Князева Е.Л., Гршценко В.М., Першикова И.В., Пермяков С.Е. Взаимодействие а-лактальбумина с олеиновой кислотой. 11-ая международная школа-конференция «Биология - наука XXI века», Пущино, 29 октября - 2 ноября 2007 г., стр. 10.

2. Князева Е.Л., Грищенко В.М., Першикова И.В., Пермяков С.Е. Исследование природы состояния HAMLET. Школа - конференция молодых ученых, аспирантов и студентов «Биомедицинская инженерия - 2007», Пущино, 10-12 декабря 2007 г., стр. 5-9.

3. Князева Е.Л., Грищенко В.М., Пермяков С.Е., Фадеев Р.С., Акатов B.C. Исследование природы комплексов а-лакгальбумин-олеиновая кислота, обладающих цитотоксической активностью. 12-ая международная школа-конференция «Биология - наука XXI века», Пущино, 10 - 14 ноября 2008 г., стр. 176.

4. Permyakov, S.E., Knyazeva, E.L., Grishchenko, V.M., Zhadan, A.P., Fadeev, R.S., Acatov, V.S., Permyakov, E.A. Interaction of human a-lactalbumin with monomeric oleic acid. 2nd Symposium on HAMLET and tumor-killing proteins. May 12-14, Lund, 2009, p.10.

5. Леонтьева M.B., Князева Е.Л., Фадеев P.С., Акатов B.C., Пермяков С.Е Разработка метода приготовления комплексов а-лактальбумина с олеиновой кислотой, обладающих цитотоксической активностью. 14-ая международная школа-конференция «Биология - наука XXI века», Пущино, 19-23 апреля 2010 г., стр. 84.

6. Князева Е.Л., Грищенко В.М., Жерелова О.М., Катаев А.А., Жадан А.П.,

Пермяков С.Е. Молекулярные аспекты цитотоксического действия комплексов а-лактальбумина с олеиновой кислотой. 14-ая международная школа-конференция «Биология - наука XXI века», Пущино, 19-23 апреля 2010 г., стр. 207.

Подписано в печать: 26.05.2010

Заказ № 3850 Тираж - 100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Князева, Екатерина Леонидовна

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Белки, селективно индуцирующие гибель раковых клеток. а-Лактальбумин: физико-химические свойства.

Структура а-лактальбумина.

Связывание катионов металлов.

Стабильность а-лактальбумина.

Взаимодействие а-лактальбумина с белками, пептидами и низкомолекулярными органическими веществами.

Функции а-лактальбумина.

Цитотоксическая активность а-лактальбумина.

Состояние HAMLET.

Предклинические и клинические испытания HAMLET.

Механизм действия состояния HAMLET.

Взаимодействие с мембранами.

Взаимодействие с гистонами.

Апоптоз.

Альтернативные пути клеточной гибели, запускаемые HAMLET.

Структурные и физико-химические свойства HAMLET.

Жирные кислоты и их взаимодействие с белками.

Взаимодействие а-лактальбумина с жирными кислотами.

ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

Материалы.

Методы.

Общие процедуры.

Выбор величины рН и температурных условий.

Биохимические методы.

Приготовление состояния HAMLET.

Приготовление комплексов LA-OA-17 и LA-OA-45.

Приготовление комплекса bLA-0А-45.

Очистка белка от ионов кальция.

Гель-фильтрационная ВЭЖХ.

Приготовление липосом.

Выделение комплекса белка с липосомами.

Физические методы исследования.

Оценка ёмкости белка по отношению к олеиновой кислоте.

Флуоресцентные измерения.

Круговой дихроизм.

Измерение сродства белка к кальцию.

Измерение сродства белка к олеиновой кислоте.

Исследование взаимодействия а-лактальбумина с гистоном HI.

Клеточные исследования.

Тесты цитотоксичности.

Электрофизиологические исследования.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

Исследование процесса формирования комплексов а-лактальбумина с олеиновой кислотой.

Зависимость ККМ олеиновой кислоты от условий раствора. мкость а-лактальбумина по отношению к олеиновой кислоте.

Механизм связывания олеиновой кислоты а-лактальбумином.

Исследование взаимодействий, стабилизирующих комплексы a-JIA с олеиновой кислотой.

Содержание олеиновой кислоты в препаратах LA-OA.

Исследование содержания олигомерных форм в комплексах а-ЛА с олеиновой кислотой.

Влияние связывания олеиновой кислоты на термостабильность алактальбумина, его сродство к Са и вторичную структуру.

Сравнение цитотоксичностей HAMLET и LA-OA комплексов.

Взаимодействие комплексов а-лактальбумин — олеиновая кислота с мембранами.

Взаимодействие комплексов а-ЛА-ОК с малыми униламеллярными везикулами дипальмитоилфосфатидилхолина.

Действие комплексов а-лактальбумина с олеиновой кислотой на ионные токи через плазмалемму Chara corallina.

Модифицирующее влияние интактного а-лактальбумина и свободной олеиновой кислоты на ионные токи через плазмалемму Chara corallina.

Взаимодействие а-ЛА-ОК комплексов с гистоном HI in vitro.