Управляемая дезинтеграция популяций энтеробактерий (биологические, медицинские и экологические аспекты)

Акайзин, Эдуард Семёнович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Управляемая дезинтеграция популяций энтеробактерий (биологические, медицинские и экологические аспекты)
ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Управляемая дезинтеграция популяций энтеробактерий (биологические, медицинские и экологические аспекты)"

На правах рукописи

АКАЙЗИН ЭДУАРД СЕМЁНОВИЧ

УПРАВЛЯЕМАЯ ДЕЗИНТЕГРАЦИЯ ПОПУЛЯЦИЙ ЭНТЕРОБАКТЕРИЙ (биологические, медицинские и экологические аспекты)

03.00.07 - микробиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Москва - 2000

Работа выполнена в Ивановской государственной медицинской академии. Научный консультант: доктор биологических наук В.А.Мельникова

Официальные оппоненты: заслуженный деятель науки РФ, доктор биологических наук, профессор И.А.Баснакьян, академик РАМТН, доктор медицинских наук, профессор С.А.Дратвин, член-корреспондент РАЕН, доктор медицинских наук, профессор Ю.Г.Сучков,

Ведущая организация: Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф.Гамалеи РАМН

Защита состоится 2000 года в часов на заседании

диссертационного совета Д.074.05.10 при Московской медицинской академии имени И.М.Сеченова по адресу: 119881, Москва, Б. Пироговская ул., 2-6.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ММА им. И.М.Сеченова по адресу: Москва, Зубовская пл., 1.

Автореферат разослан . . . . . . 2000 года.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат медицинских наук, доцент

А.Ю.Миронов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

АКТУАЛЬНОСТЬ ТЕМЫ В связи с глобальным загрязнением окружающей среды актуальны фундаментальные исследования в области предотвращения образования отходов и создание безотходных технологий разрушения и комплексной переработки микробной биомассы. Разрушение клеток необходимо для выделения из биомассы микроорганизмов продуктов биосинтеза, перспективно для переработки и утилизации отходов биомассы бактерий-продуцентов внеклеточных продуктов.

Дезинтырация микроорганизмов - процесс необратимого парушеши анатомической целостности клеток (Б.А.Фихте, Г.А.Гуревич, 1982). Клетки микроорганизмов обладают исклютштельно прочными клеточными стенками, для разрушения которых необходимы механические и физические факторы большой интенсивности. Однако применение таких воздействий требует значительных затрат энергии и финансовых ресурсов. Для реализации перспективных биологических методов разрушения не требуются сложная, энергоемкая аппаратура, агрессивные химические реактивы и устойчивые к коррозии реакторы. Разрушите микробов вызывают: голодный стресс (лишение питательной среды), термошок, осмотический шок, замораживание-отгаивание, литические ферменты, бактериофаги, детергенты, хелатирующие агенты, антибиотики, ингибирующие синтез клеточной стенки, разобщители и ингибиторы дыхания, мембранотрошшй ауторегулятор ¿2 и его аналог - олеиновая кислота, токсичные белки - продукты киллерных генов плазмид (С.П.ЯЬосктап е! а1., 1967; В.М.Беликов с соавт., 1978; О.В.Кислухина и соавт., 1982; М.Ьеёис е! а1., 1982; И.Я.Захарова, И.Н.Павлова, 1985; Г.И.Эль-Регнстан, 1988; Н.НЛищенко, И.А.Баснакьян, 1997, Н.Г.Иванова, 1998, А.Л.Мулюкин, 1998).

Микроорганизмы различных таксономических групп синтезируют ауторегулятор с12, который индуцирует автолиз клеток; его активным началом являются олеиновая и другие жирные кислоты (Г.И.Эль-Регистаи, 1988). Механизмы действия ауторе-хулятора и его аналога - олеиновой кислоты при индуцированном разрушешш бактерий изучены недостаточно. Наиболее эффективные способы индуцированного разру-

тения бактерий: лишение питательной среды в сочетании с воздействием этиленди-амнотетраацетатом (M.Leduc et. al., 1982); пишете питательной среды в сочетании с воздействием термошоком и олеиновой кислотой (Г.И.Эль-Регистан, 1988). В то же время недостаточная эффективность биологических методов разрушения сдерживает их практическое применение. Существующие способы интенсификации индуцированного лизиса микроорганизмов ориентированы на молекулярный уровень, включают использование стимуляторов или ауторегулятора автолиза и создшше оптимума для функционирования литическнх ферментов. Разрушение клеток бактерий хорошо изучено на молекулярном и клеточном уровнях. На практике дезинтеграции подвергаются популяции микроорганизмов, но не исследованы популяционные аспекты разрушения бактерий. В настоящее время не разработана проблема управления дезинтеграцией микроорганизмов.

Изучение механизмов дезинтеграции и устойчивости популяций энтеробактерий необходимо для оптимизации разрушения микроорганизмов и решения биотехнологических, медицинских и экологических проблем.

ЦЕЛЬ РАБОТЫ

Исследование закономерностей реакции популяций энтеробактерий на индукцию разрушения для разработки теоретических положений управляемой дезинтеграции бактерий.

ЗАДАЧИ НАУЧНОГО ИССЛЕДОВАНИЯ

1. Исследовать закономерности реакции популяций энтеробактерий на индукцию разрушения клеток лишением питательной среды и воздействием термошоком и гипотоническим шоком.

2. Изучить влияние олеиновой кислоты на индуцированное разрушение энтеробактерий.

3. Проанализировать изменение размеров устойчивых к разрушению клеток в процессе индуцированной дезинтеграции популяций эшерихий.

4. Исследовать влияние кислотности среды на процесс индуцированного разру-гпеиия популяций энтеробактерий.

5. Создать принципы управления дезинтеграцией бактерий.

6. Систематизировать подходы к дезинтеграции и утилизации многокомпонентных отходов, включающих биомассу микроорганизмов и биоорганические соединения. Разработать способ разрушешм и безотходной утилизации последрожжевой бражки.

7. Обосновать параметры для быстрого обнаружения возбудителей гнойно-воспалительных заболеваний и управления их дезинтеграцией.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА

Доказана адаптивная перестройка популяции при индуцированной дезинтеграции энтеробактерий. Впервые установлено уменьшение размеров и увеличение отношения площади поверхности к объему у неразрушегшых клеток при индущгрованном разрушении популяций эшерихнй. Впервые выявлена способность популяций энтеро-баюерий к саморе1уляции кислотности среды при индуцированной дезшпе1рацин. Впервые выявлено включение олеиновой кислоты в биополимеры бактериальных клеток при индуцированном разрушении E.coli.

В результате исследования разработаны теоретические положения нового направления в микробиологии и биотехнологии - управляемой дезинтеграции микроорганизмов. Разработана классификация производственных отходов, включающих биомассу микроорганизмов и биоорганические соединения. Обоснованы подходы к переработке отходов биологического происхождения и создание безотходных технологий дезинтеграции и утилизации микробной биомассы.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ И ВНРДРЕНИН РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ В ПРАКТИКУ

Разработан способ разрушения и утилизации последрожжевой бражки - многокомпонентного отхода производства, содержащего биомассу микроорганизмов и биоорганические соединения (Патент РФ на изобретение № 2094985 от 10.11.97 г). Разработаны и внедрены в производство способы переработки и использования отходов производства, включающих компоненты биологического происхождения (молоч-

пой сыворотки, жировых сточных вод, отработанной отбельной глины) путем снижения гетерогенности их состава и включения отходов в систему с более высоким уровнем разнообразия (Положительное решение от 10.12.98 г о выдаче патента на изобретение по заявке № 96114588/04; Акт внедрения от 28.10.1994 г).

Разработан и внедрен в клинике «Мать и дитя» Ивановской областной клинической больницы концентрат витаминного напитка «Дрожжи пивные плюс» - дезинте-грат отходов пивных дрожжей (Акт внедрения от 22.01.98 г).

Предложено использовать количественное определение уксусной кислоты в отделяемом ран для быстрого обнаружения факультативно-анаэробных возбудителей гнойной инфекции и быстрой оценки их дезинтеграции под действием лечебных факторов. На основе определения летучих жирных кислот в патологическом материале разработаны и внедрены в лечебную практику с 1991 года в Ивановском областном госпитале для ветеранов войн параметры для быстрого обнаружения ассоциаций возбудителей гнойно-восиалигельных заболеваний и ускоренной оценки их дезинтеграции (Акт внедрения от 21.01.98 г).

Разработаны и внедрены в клинике «Мать и дитя» Ивановской областной клинической больницы (Акт внедрения от 22.01.98 г), в городской клинической больнице № 1 г. Иваново (Акт внедрения от 23.01.98 г, Информационное письмо для врачей от 7.06.99 г), в городской клинической больнице № 3 г. Иваново (Акт внедрения от 23.01.98 г), в Ивановском областном кожно-венерологическом диспансере (Акт внедрения от 14.01.98 г) критерии косвенной оценки дезинтеграции возбудителей воспалительных заболеваний.

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ. ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ

1. Индуцированная дезинтеграция энтеробактерий - процесс нарушения целостности популяции, включающий разрушение части клеток и адаптивную перестройку сообщества.

2. Механизмы адаптации энтеробактерий при индуцированной дезинтеграции: активация БОБ-ответа, уменьшение размеров и прекращение роста на питательных средах у части устойчивых к разрушению клеток популяции.

3. Принципы управления дезинтеграцией бактерий:

1) оптимизация физиологического состояния бактерий до разрушения,

2) противодействие адаптации бактерий после индукции дезинтеграции.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ.

Материалы диссертации доложены на: Всесоюзной конференции «Лимитирова-1ше и ингибирование роста микрооргагшзмов», Пущино, 1990; Научной конференции молодых ученых биологического факультета МГУ, Москва, 1990; IV Областной конференции молодых ученых и специалистов, Иваново, 1990; Всесоюзном симпозиуме «Микробиология охраны биосферы в регионах Урала и Северного Прикаспия», Оренбург, 1991; III съезде инфекционистов, Суздаль, 1992; Конференции «Экологическая безопасность городов», Санкт-Петербург, 1993; Международной конференции «Раны и раневая инфекция», Москва, 1993; V Национальном конгрессе по болезням органов дыхания, Москва, 1995; III Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство», Москва, 1996; I Международной научно-техшиеской конференции «Экология человека и природы», Иваново, 1997; Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные вопросы инфекционной патологии и современные метода лечения», Пенза, 1998; Всероссийской конференции с международным участием «Медико-социальные проблемы костно-мыпгечных заболеваний в XXI веке» Москва, 2000; X Национальном конгрессе по болезням органов дыхания, Санкт-Петербург, 2000.

ПУБЛИКАЦИИ.

По теме диссертатпт опубликованы 35 печатных работ, в том числе описание изобретет!» к патенту РФ.

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ ДИССЕРТАЦИИ.

Работа состоит из введения, обзора литературы, главы «Материалы и методы», б глав собственных исследований, заключения, выводов, списка литературы. Список литературы включает 503 источника, в том числе 292 на русском языке и 211 на иностранных языках. Работа изложена на 215 страницах и включает 30 таблиц и 29 рисунков.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ. Штаммы микроорганизмов. Использовали два штамма Salmonella minnesota SF111 и R595 из набора O.Luderitz из музея кафедры микробиологии Ивановской государственной медицинской академии (штаммы переданы в музей кафедры ИГМА из НИИВС им. И.И.Мечникова РАМН) и промышленный штамм Escherichia coli М-17, переданный нам НПО «Биомед». Штамм S. minnesota SF111 (хемотип S) имеет полноценный липополисахарид наружной мембраны, штамм S.minnesota R595 представляет собой мутант, выделенный из штамма SF111, и имеет в составе шгпополисахари-да только 3 молекулы кетодезоксиоктоната и липид А (хемотип Re).

Культуры выращивали в колбах объемом 2000 мл с 400 мл питательной среды рН 7,2 при 37°С с перемешиванием магнитной мешалкой. Питательные среды.

1. Полусинтетическая питательная среда - среда М-9 с добавлением 10 г/л казамино-вых кислот фирмы «Дифко».

2. Синтетическая среда М-9.

3. Питательный бульон НПО «Питательные среды» (Махачкала).

Метода разрушения энтеробактерий.

1. Отделение от питательной среды и перемещение в 0,001 М раствор этилендиами-нотетраацетата (M.Leduc et. al., 1982).

2. Отделение от питательной среды и перемещение в растворы олеиновой кислоты 200, 600 и 1200 нмоль/мл при температуре 45°С (Г.И.Эль-Регистан, 1988).

3. Отделите от питательной среды и перемещение в фосфатный буфер при температурах 20, 37 и 60°С (M.Leduc et. al., 1980).

4. Отделение от питательной среды и перемещение в дистиллированную воду при температурах 20,37 и 60°С (M.Leduc et. al., 1980).

5. Воздействие температурой 60°С.

Для исследования роли рН растущие бактерии переносили из пигательной среды в водные растворы олеиновой кислоты рН 3,5 (Г.И.Эль-Регистан, 1988) или в дистил-лировшшую воду рН 3,5 с экспозицией 1 минуту, с последующей коррекцией рН до

4,5; 7,0; 8,5; 9,0; 10,5 и инкубацией при температурах 37 и 45°С. Далее поддерживали установленную кислотность среды или процесс происходил без коррекции значения рН.

Методы анализа параметров. Количество биомассы определяли по оптической плотности клеточной суспензии на спектрофотометре. Общую числешюсть бактерий и число рефрактерных клеток подсчитывали камерным методом повышенной точности с осаждением клеток в камере путем центрифугирования (К.К.Смирнов, 1985). Количество колониеобразующих единиц (КОЕ) определяли путем посева соответствующих разведений суспензии бактерий на чашки со средой Эндо и питательным агаром. Белок определяли общепринятым методом Лоури и прямым спектрофотомет-piriecKiiM методом (V.F.Kalb, R.W.Bemlohz, 1977) аминный азот - методом Филдса (R. Fields, 1971). Значаще рН среды измеряли 1 раз в час при помощи иономера ЭВ-74. Измеряли включение в клетки 3Н-урацила (5 мккгори/мл, В/О «Изотоп») в процессе инлугшроБанной дезиптегращш. Клетки перед обработкой фихлоруксусной кислотой

(ТХУ) отмывали физиологическим раствором. Радиоактивность в ТХУ-растворимой

(гшзкомолекулярной) и ТХУ-нерастворимой (высокомолекулярной) фракциях (Р.Хансон, Дж.Филипс, 1984), измеряли на сцинтилляционном счетчике «Бета-1». Рассчитывали величину включения меченого предшественника на одну клетку и одну КОЕ. Изучали включение в клетки олеиновой кислоты с изотопом йод-131(1,1 мюо-ри/мл, В/О «Изотоп») - аналога ауторегуляторного фактора в процессе индуцированного разрушешш энтеробактерий. Клетки перед обработкой трихлоруксусной кислотой (ТХУ) отмывали физиологическим раствором. Обработка бактериальных клеток ТХУ проведена общепринятым методом (Р. Хансон, Дж.Филипс, 1984). Из осадка экстрагировали щгпиды смесью хлороформа с метанолом (J.Folch, 1957). Радиоактивность в хлороформенной, метанольной, ТХУ-растворимой и ТХУ-нерастворимой фракциях измеряли на счетчике «Гамма-12».

Микроскопию проводили, используя микроскоп МБИ-15 с фазово-контрастным устройством. Для микроскопии использовали препараты-мазки, фиксированные нагреванием. На фотографиях препаратов-мазков измеряли размеры бактериальных клеток. Расчеты площади поверхности, объема и отношешю площади поверхности

клеток к их объему (S/V) производили по формулам: S = 2 7tlr; V = тсг2(1-2г/3), где 1 -длина, г - радиус клетки (С.Е.Воскун, 1985).

С мая 1991 года по май 1997 года нами хроматографическим методом исследовано отделяемое ран у 428 больных с острой раневой инфекцией или с обострением хронического остеомиелита. Газожидкостную хроматографию летучих жирных кислот (ЛЖК) выполняли на хроматографе Московского опытного завода «Хроматограф» МОЗХ модель 3700 с пламешю-ионизационным детектором в изотермическом режиме при температуре 200°С. Колонка заполнена Порапак Q (США) с нанесенной на него ортофосфорной кислотой. Идентификацию и количественное определение ЛЖК осуществляли при помощи аналитических стандартов. Определяли показатель частоты первичного выявления облигатных или факультативных анаэробов путем расчета удельного веса положительных анализов б процентах от общего числа анализов раневой инфекции. Анализы повторяли до снижения или полного исчезновения ЛЖК анаэробов. Для оценки эффективности лечения учитывали изменение количественного содержания метаболитов во втором анализе по сравнению с первым.

Микробиологическое исследование отделяемого гнойных ран проводили унифицированными методами в соответствии с Приказом МЗ СССР № 535 от 22.04.85 года «Об унификации микробиологических методов исследования, применяемых в клинико-диапюстических лабораториях лечебно-профилакти-ческих учреждений».

Большая часть экспериментов проведена с попарным сопряжением вариантов для последующей оценки достоверности различий средних величии при помощи непараметрического критерия знаков (И.П.Ашмарин и соавт., 1974). При этом учитывали результаты не менее чем трех независимых экспериментов с двумя повторениями в каждом. Оценку достоверности различий средних величин у независимых совокупностей вариантов проводили при помощи непараметрического критерия U Уайта (И.П.Ашмарин и соавт., 1974). При этом результаты учитывали не менее чем из пяти независимых экспериментов с двумя повторениями в каждом. Статистическая обработка результатов анализов проведена параметрическими методами статистики с использованием прикладной программы «Excel 7.0». Для сравнительной оценки средних величин применяли t-критерий Стьюдента.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Реакции популяций энтеробактерий на индукцию дезинтеграции.

Популяция организмов является элементарной ячейкой развития всех живых существ. Противоречивая сущность индуцировашюй дезинтеграции состоит в том, что однородному неблагоприятному воздействию подвергается гетерогенная популяция бактерий, способная адаптироваться к неблагоприятным факторам среды. При индуцированной дезинтеграции бактерий, с одной стороны, необходимо создать экс-трематьные для существования клеток условия среды, а, с другой стороны, сохранить активность литических ферментов, что существенно ограгаетивает интенсивность используемых факторов. Поэтому мы выдвинули рабочую гипотезу об адаптивной перестройке популяции энтеробактерий в ответ на действие факторов, вызывающих дезинтеграцию. Для проверки рабочей гипотезы нами использованы наиболее эффективные многофакторные способы дезинтеграции энтеробактерий (M.Leduc et. al., 1982, Г.И.Эль-Решстан, 1988). Мы применяли: 1) общепринятые тесты оценки раз-рутения бактерий: измерение оптической плотности клеточной суспензии, концентраций общего белка и амшпюго азота во внеклеточной жидкости, 2) пспуляцношше параметры: общее число бактерий и числетгность рефрактерных клеток, число КОЕ, распределение клеток популяции по S/V.

При разрушении эшерихий, индуцированном лишением питания, термошоком^в популяции наблюдалось более быстрое снижение числа КОЕ по сравнению с падением оптической плотности клеточной суспензии и общего числа клеток, что приводило к уменьшению удельного содержания КОЕ в популяции (рисунок 1). В первые 60 минут дезинтеграции оптическая плотность суспензии клеток «искалась, а численность популяции возрастала, к 4-м часам оба параметра снижались, затем стабилизировались и в дальнейшем (к 120 часам) наблюдалось возрастание численности клеток, числа КОЕ и оптической плотности биомассы. В наших экспериментах увеличение численности клеток и числа КОЕ, по-видимому, отражало рост устойчивых к разрушению особей за счет использования олеиновой кислоты и продуктов распада, что подтверждает уменьшение концентрации белковых веществ после 24 часов. Резкое

Рисунок 1. Кинетика индуцированной дезинтеграции и динамика популяции Е.соБ. По оси абсцисс - время процесса, ч.

По оси ординат - все показатели в % процентах от исходного значения.

1 - концентрация белка во внеклеточной жидкости;

2 - концентрация аминного азота во внеклеточной жидкости;

3 - число клеток; 4 - оптическая плотность клеточной суспензии;

5 - число колониеобразующих единиц (цифры числа КОЕ увеличены в 10 раз).

снижение КОЕ, которое не сопровождалось снижением числа клеток, указывало на переход части популяции в группу нерастущих нелгаирующихся клеток, которая включала устойчивые к дезинтеграции особи. Снижение оптической плотности на 60-I 90% от исходного значения не приводило к полному разрушению клеток, при микро-скопироваюш мы наблюдали клетки малых размеров, при посеве на дифференциально-диагностическую среду Эндо обнаружили типичные колонии Е.соН.

Установлено, что в ходе индуцированной дезинтеграции Е.соН, снижалась чувствительность популяции к повторной индукции дезинтеграции тем же и другим методом (термошоком), что указывает на участие в адаптивной перестройке неспецнфи-чсских механизмов. При индуцированной дезинтеграции этерихий не только разрушалась часть клеток сообщества, но и происходила адаптация популяции к этому экстремальному воздействию.

При исследовании индуцированной дезинтеграции сальмонелл наряду с измерением оптической плотности клеточной суспензии, мы учитывали популятщонные параметры: общее число бактерий, численность КОЕ, число рефрактерных (анабиотических) клеток. В течение 1 часа разрушения Б-формы сальмонелл вместе со снижением оптической плотности клеточной суспензии происходили более быстрое снижение числа КОЕ, увеличение общего числа бактерий н численности рефрактерных клеток. К 4 часам оптическая плотность клеточной суспензии и численность КОЕ стабилизировались, в дальнейшем до 24 часов наблюдался рост оптической плотности клеточной суспензии, рост численности КОЕ, снижение общего числа бактерий и численности рефрактерных клеток. В период от 24 до 48 часов оптическая плотность снижалась, число КОЕ продолжало возрастать, увеличивались общее число клеток и чис-летпюсть рефрактерных клеток. Для Кс-формы сальмонелл в течение 1 часа картина была аналогична тому, что мы наблюдали при шщуцированной дезинтеграции Б-формы сальмонелл: снижение оптической плотности и КОЕ, рост числа рефрактерных клеток и общего числа бактерий. В период от 1 до 4 часов продолжалось падение тшсла КОЕ, снижалось число рефрактерных клеток и общая числешюсть бактерий.

В период от 4 до 24 часов картина была аналогична динамике популяционных параметров 8-формы сальмонелл: рост оптической плотности и КОЕ, снижение числа рефрактерных клеток и общего числа бактерий. От 24 до 48 часов оптическая плотность не изменялась, число КОЕ несколько снижалось, наблюдался рост числа рефрактерных клеток и общей численности бактерий.

Нами было исследовано изменение размеров бактериальных клеток в динамике индуцированной дезинтеграции и рассчитано отношение площади поверхности клеток к их объему Б/У (таблица 1, рисунок 2).

Таблица 1.

Изменение средней длины устойчивых к разрушению клеток эшерихий при индуцированной дезинтеграции с олеиновой кислотой и без олеиновой кислоты.

Время процесса, ч Длина клеток при разрушении, мкм Уровень значимости различия *, Р

Без олеиновой кислоты С олеиновой кислотой

0 6,36 ±0,16 6,36 ±0,16 -

1 4,89 ±0,15 4,57 ±0,12 0,044

4 4,60 ±0,16 4,65 ±0,16 0,404

24 4,11 ±0,13 4,68 ±0,16 0,004

72 4,40 ±0,19 3,89 ±0,12 0,005

96 4,02 ± 0,23 4,94 ± 0,25 0,004

144 3,00 ±0,14 4,72 ±0,12 0,0001 х 10"12

Примечание. * - критерий Стьюдента.

В ходе дезинтеграции популяции энтеробактерий параллельно снижению оптической плотности клеточной суспензии и возрастанию численности микроорганизмов в течение первого часа после индукции процесса происходило уменьшение размеров устойчивых к разрушению клеток и увеличение отношения площади поверхности к объему. Это свидетельствует о том, что процессы разрушения одних клеток и самоперестройки других клеток гетерогенной популяции Е.соН происходили одновремешхо.

—•— 1

--х-- 3

1 -

О ^-■-1-,-,->-,

О 1 4 24 72 96 144

Рисунок 2. Изменение параметров устойчивых к разрушению клеток при индуцированной дезинтеграции Е.соН лишением питания в сочетании с термошоком и воздействием олеиновой кислоты. По оси абсцисс - время, ч.

По оси ординат - параметры клеток: 1 - длина, мкм;

2 - диаметр, мкм;

3 - отношение площади поверхности к объему.

Известно, что в условиях голодания рост клеток бактерий прекращается, но деление (дробление) их продолжается, и в результате образуются мелкие клетки.

При индуцировашюй дезинтеграции эшерихий в присутствии олеиновой кислоты уменьшение размеров клеток было наиболее выражено к 72 часам, наблюдалось увеличение как среднего значения показателя S/V, так и соответствующее изменение вариационной кривой. К 96-144 часам в присутствии олеиновой кислоты происходило увеличение размеров устойчивых к разрушению клеток популяции и, соответствешю, уменьшение средней величины S/V популяции до значений, которые наблюдались через 1 час после индукции дезинтеграции. При индуцированной дезинтеграции эшерихий без олеиновой кислоты уменьшение размеров клеток было наиболее выражено к 144 часам. Нами построены вариационные кривые распределения устойчивых к разрушению клеток популяции по величине отношения площади поверхности к объему E.coli.

Учитывая совокупность ответных реакций бактерий, для описания явления более адекватным термином является не индуцированный автолиз, а индуцированная дезинтеграция популяций энтеробактерий. Разрушение (лизис) является одной из трех основных реакций на комплекс повреждающих воздействий, вызывающих дезинтеграцию популяции бактерий.

Роль олеиновой кислоты в процессе индуцированного разрушения популяций энтеробактерий.

Наиболее интенсивная дезинтеграция E.coli происходила при концентрации олеиновой кислоты 200 нмоль/мл, при увеличении концентрации олеиновой кислоты до 1200 нмоль/мл интенсивность разрушения снижалась (отличие конечной величины разрушения биомассы при концентрации 200 нмоль/мл от конечных величин при 600 и 1200 нмоль/мл статистически достоверны, Р < 0,05, критерий Стьюдента). В ходе разрушения бактерий параллельно снижению оптической плотности клеточной суспензии возрастали концентрации белка и аминного азота во внеклеточной среде, происходило включение в клетки и в биополимеры меченых урацила и олеиновой кислоты (рисунок 3).

16000 л

14000

12000 -

10000

8000

6000 -

4000

2000 -

- Я

□ 1 0 2

□ 3

□ 4 О 5

0,25

Рисунок 3. Включение меченой олеиновой кислоты в процессе разрушения E.coli, индуцированного лишением источников питания в сочетании с воздействием супраоп-тималыюй температуры и 200 нмоль/мл олеиновой кислоты. По оси абсцисс - время разрушения, ч.

По оси ординат - включение меченой олеиновой кислоты, имп/мин.

1 - общее включение в клетки;

2 - включение в ТХУ-растворимую фракцию;

3 - включение в хлороформеш1ую фракцию липидов;

4 - включите в метанольную фракцию липидов;

5 - включение в ТХУ-нерастворимую фракцию без липидов.

Проанализирована динамика включения меченой олеиновой кислоты во фракции клеток Е.соН после индукции дезинтеграции многофакторным методом (рисунок 3). Наиболее активно метка включалась в хлороформенную фракцию, наименее активно в метанольную фракцию. Установлено, что параллельно дезинтеграции части клеток культуры происходило включение меченой олеиновой кислоты в биополимеры бактериальных клеток. Включение олеиновой кислоты в неразрушенные бактериальные клетки: 1) возрастает с увеличением концентрации олеиновой кислоты в среде до 1200 нмоль/мл; 2) выше у клеток, выращехшых (до дезинтеграции) в синтетической питательной среде, по сравнению с клетками, выращенными в питательном бульоне.

При переносе растущих культур сальмонелл из питательной среды в раствор олеиновой кислоты происходило снижение оптической плотности клеточной суспензии: для Ле-форм в среднем на 54,4%, для Б-форм в среднем на 27,8% (уровень достоверности различия средних величин 95%, критерий II). Нами проведено сравнение дезинтеграции эшерихий многофакторными способами с использованием (опыт) и без использования (контроль) олеиновой кислоты. В опытном варианте за счет эффекта олеиновой кислоты выше начальная интенсивность разрушения (отличие достоверно с вероятностью не менее 95%, критерий знаков), быстрее происходило снижение скорости процесса с переходом в стабильное состояние. В обоих случаях процесс состоял из трех основных фаз: литической, стационарной и возобновлещш роста. В контрольных и опытных вариантах дезинтеграция более интенсивно происходила у Ке-формы сальмонелл. Введение олеиновой кислоты увеличило интенсивность разруше-Ш1я 8-формы сальмонелл. Во всех вариантах после завершения лизиса наблюдалась стабилизация оптической плотности с последующим возобновлением роста.

Анализ влияния концентрации ионов водорода в среде на индуцированное разрушите популяций энтеробактерий.

На рисунке 4 представлена динамика рН в процессе дезинтеграции энтеробактерий, индуцировагаюй лишением источников питания в сочетании с воздействием супраоптимальной температуры при рН 3,5 с использованием олеиновой кислоты,и последующим проведением процесса при рН 4,5; 7,0 и 9,0.

- - « - -1

— -2

3 -

2 -

1 -

0 -I-1-1-1->-1

0 1 2 4 24 96

Рисунок 4. Динамика рН при дезинтеграции сальмонелл в зависимости ог начального значения рН среды. Индукция лишением источников питания в сочетании с воздействием супраоптимальной температуры и олеиновой кислоты. По оси абсцисс - время дезинтеграции, ч.

По оси ординат - кислотность среды, единицы рН: 1 - 4,5; 2 - 7,0; 3 - 9,0.

В процессе дезинтеграции сальмонелл наблюдалась следующая динамика показателей реакции среды: при начальном рН 4,5 повышение до 5,7; при исходном рН 7,0 незначительные колебания; при исходном рН 9,0 снижение до 7,5.

При дезинтеграции E.coli наблюдалась следующая динамика показателей реакции среды: при начальном рН 7,0 колебания с незначительной амплитудой; при исходном рН 8,5 снижение до 7,7 - 7,8 и стабилизация на этом уровне с незначительными колебаниями. При возврате за счет коррекции рН к начальным (кислым или щелочным) значениям в дальнейшем происходило изменение рН в сторону оптимальных для энтеробактерий значений.

По современным представлениям для интенсификации автолиза микроорганизмов необходимо создать оптимум для функционирования литических ферментов, который расположен в нейтральной (Г.И.Эль-Регистан, 1988) или слабокислой (М. Leduc et. al., 1982) области значен™ рН. В диапазоне рН от 7,0 до 10,5 наименее эффективно дезинтеграция происходила при нейтральном значении рН (рис. 5). Проведение процесса при рН 8,5 увеличивало интенсивность процесса в опыте и в контроле, дополнительный эффект оказывало поддержание рН 8,5 в динамике разрушения. Наиболее интенсивно процесс происходил в опыте и контроле при реакции среды 10,5 (различия достоверны Р < 0,01, критерий Стьюдента) и поддержании этой величины рН в процессе дезинтеграции (различия достоверны, Р < 0,02, критерий Стьюдента). Во всех случаях при одних и тех же значениях рН процесс индуцированного разрушения был эффективнее в опытных вариантах (с использованием олеиновой кислоты) по сравнению с контрольными вариантами (уровень достоверности 95%, критерий знаков). Наибольшее количество белка к 4 часам и аминного азота к 24 часам выделялось во внеклеточную жидкость в опытном варианте при проведении разрушения прирН 10,5.

Кислотность внеклеточной среды оказывает существенное влияние на процесс индуцированной дезинтеграции популяций энтеробактерий. Саморегуляция рН подтверждает адаптивную перестройку популяции энтеробактерий в процессе индуциро-вашюй дезинтеграции.

«с.

О 1,5

24 48 120

— □— 2

- - А- - 3

—X— 4

— Ж- - 5

— а — 7

Рисунок 5. Дезинтеграция сальмонелл лишением питания в сочетании с воздействием супраоптимальной температуры в зависимости от рН. По оси абсцисс - время процесса, ч.

По оси ординат - оптическая плотность клеточной суспензии в процентах от исходного значения.

1 - рН 7,0 с поддержанием рН; (с использованием олеиновой кислота);

2 - рН 8,5 без поддержания рН; (с использованием олеиновой кислоты);

3 - рН 8,5 с поддержанием рН; (с использованием олеиновой кислоты);

4 - рН 10,5 с поддержанием рН; (с использованием олеиновой кислоты);

5 - рН 8,5 без поддержания рН; (без использования олеиновой кислоты);

6 - рН 8,5 с поддержанием рН; (без использования олеиновой кислоты);

7 - рН 10,5 с поддержанием рН; (без использования олеиновой кислоты).

Для интенсификации разрушения энтеробактерий, индуцировашюго в кислой среде, необходимо поддержание экстремального щелочного значения pH. Учитывая, что разрушение биомассы бактерий наиболее интенсивно происходит при экстремальном щелочном значении pH вне оптимума авголитических ферментов, название процесса термином «индуцированный автолиз» не адекватно отражает процесс. Более подходящими являются термины «индуцированная дезинтеграция» или «индуцированное разрушение».

Управление дезинтеграцией энтеробактерий.

Предлагаем выделять три этапа в управлении индуцированной дезинтеграцией популяций энтеробактерий: 1. Подготовка бактерий к дезинтеграции.

2. Индукция разрушения. 3. Проведение процесса дезинтеграции.

Для изучения влияния подготовки бактерий к разрушению проведено сравнительное исследование дезинтеграции лишением питания в сочетании с воздействием этилендиаминотетраацетатом культур E.coli, выращенных стационарно и с перемешиванием питательной среды. При глубинном культивировании достоверно возрастали максимальная удельная скорость роста, начальная и конечная величины разрушения (уровень достоверности различия средних величин - 99 %, критерий U Уайта). Независимо от способа культивирования наивысшая интенсивность дезинтеграции наблюдалась при индукции процесса в момент достижения культурой бактерий максимальной удельной скорости роста.

Для исследования влияния способа индукции на кинетику процесса нами были сравнительно изучены: однофакторный способ - шок температурой 60°С, и многофакторный способ - шок температурой 60°С, лишение источников питания и воздействие этилендиаминотетраацетатом. При многофакторном способе индукции достоверно выше начальная интенсивность и конечная величина дезинтеграции (отличие достоверно с вероятностью не менее 95 %, критерий знаков).

Проведение дезинтеграции культур E.coli при температуре 60°С по сравнению с 37° и 20° достоверно повышало интенсивность (отличие достоверно с вероятностью

не менее 99 %, критерий знаков), но снижало конечную величину разрушения биомассы (отличие достоверно с вероятностью не менее 95 %, критерий знаков).

Это отражает регуляцию процесса дезинтеграции популяций бактерий по меха-штзму отрицательной обратной связи. Поэтому необходимо подбирать оптимальную интенсивность факторов, используемых для дезинтеграции энтеробактерий.

Наиболее эффективно процесс дезинтеграции энтеробактерий происходил при реакции среды 10,5 единиц и поддержании этой величины рН в процессе дезинтеграции (рис. 5). Наибольшее количество белка к 4 часам и амшшого азота к 24 часам выделялось во внеклетоттую жидкость при проведении разрушения при рН 10,5 единиц. Поэтому кислотность среды можно использовать для управления процессом дезинтеграции популяций энтеробактерий.

Проведенные исследования позволили разработать подходы к управлению дезинтеграцией бактерий для её интенсификации:

1) оптимизация физиологического состояния культуры бактерий до индукции разрушения; 2) индукция процесса многофакторным способом;

3) поддержание экстремальных значений условий среды, в которых возможно эффективное проведете разрушения.

Дезинтеграция и утилизация отходов микробной биомассы и других отходов биологического происхождения.

Закономерности управляемой дезинтеграции популяций бактерий необходимо использовать для решения сложной проблемы разрушения и утилизации отходов биомассы .микроорганизмов. В связи с глобальным загрязнением окружающей среды необходимо создание безотходных технологий комплексной переработки микробной биомассы. Дезинтеграция - необходимый этап технологий переработки микробной биомассы. Закономерности управляемой дезинтеграции популяций бактерий позволяют решать проблемы комплексной переработки микробной биомассы и утилизации отходов производства, содержащих различные компоненты биологического происхождения.

Для успешного решения проблем дезинтеграции и утилизации отходов производства необходима оптимизация их классификации. Существующие в настоящее время классификации отходов производства не учитывают специфику отходов биологического происхождения. Классификацию отходов необходимо дополнить выделением биоорганических отходов и отходов биомассы микроорганизмов. Предлагаем классификацию отходов производства по природе соединений: 1. Неорганические соединения. 2. Органические соединения.

3. Биоорганические соединения - отходы, состоящие из макромолекул и молекул биологического происхождения (молочная сыворотка и т.п.). При этом биомасса микробов содержится в отходах в незначительном количестве.

4. Смесь соединений - отходы, содержащие смесь нсоргашгческих, органических и биоорганических соединений (отработанная отбельная глина, промышленные сточные воды предприятий пищевой промышленности и т.п.).

5. Биомасса - отходы, содержащие преимущественно биомассу одноклеточных организмов (чистая культура микроорганизмов-продуцентов внеклеточных продуктов, отделенная от питательной среды и т.п.).

6. Смесь соединений и биомассы - отходы, состоящие из биомассы одноклеточных организмов и биоорганических, органических и неорганических веществ.

6.1. Смесь соединений и биомассы организмов одного вида (избыточная биомасса пивных дрожжей и т.п.).

6.2. Смесь соединений и биомассы ассоциащш организмов (последрожжевая бражка, избыточный активный ил очистных сооружений городов и т.п.).

Биоорганические соединения, содержащиеся в отходах производства, могут поддерживать развитие микроорганизмов в качестве источников питания и энергии. При длительном хранении биоорганические отходы за счет увеличения содержания биомассы могут превращаться в смесь биомассы и биоорганических соединений (накопление биомассы в молочной сыворотке при хранении и т.п.).

Для переработки и утилизации отходов производства биологического происхождения необходимы:

1) снижение неоднородности состава отходов;

2) включение отходов в систему с более высокой степенью разнообразия. При невозможности или нецелесообразности выше названных подходов предлагается включение отхода производства в небольшом количестве (до 5% от массы) в изделия с одинаковой или более низкой степенью разнообразия.

Общебиологические подходы позволяют предполагать, чго наличие биомассы в составе отходов производства значительно усложняет переработку и утилизацию отходов в силу выраженной способности микробных популяций противостоять перерабатывающим воздействиям. При хранешш отходов биологического происхождения количественное содержание микрофлоры в них возрастает, что затрудняет их переработку и использование. В связи с разнообразием отходов биологического происхождения необходимы различные варианты утилизации, чтобы проводить выбор оптимального решения для конкретного отхода.

Предлагаем варианты безотходной переработки и утилизации биомассы микроорганизмов:

1. Индуцированная дезинтеграция микробов. Инактивация неразрушенных клеток одним из известных способов (автоклавированием и т.п.) и далее использование совместно с дезинтегратом биомассы.

Пример: Разрушение (индуцированный лизис) отходов биомассы бифидобактерий и эшерихий температурой 60 ° С, инактивация неразрушенных клеток автоклавированием и использование дезинтеграта в качестве основ питательных сред для культивирования бактерий.

2. Индуцировашгая дезинтеграция бактерий. Использование неразрушенных клеток для получения пептидогликана и других клеточных компонентов химическими методами.

3. Индущфованная дезинтеграция микроорганизмов. Использование неразрушенных клеток в качестве инокулята для регенерации популящш при культивировании в оптимальных условиях на питательной среде. Повторение циклов дезинтеграции и регенерации культуры бактерий.

После завершения индуцированной дезингарации мы наблюдали самопроизвольную регенерацию (возобновление роста) устойчивых к разрушению клеток энтеробакте-

рий. Устойчивую к разрушению часть популяции предлагаем использовать в качестве шюкулята для регенерации культуры. В оптимальных условиях культивироваши образуются чувствительные к разрушению клетки и дезинтеграцию части микробной популяции можно повторять. При этом мы используем способность выживания популяций микроорганизмов после резкого сокращения числегаюсти. При управлении процессом можно добиться того, что циклы можно повторять длительное время без накопления отходов разрушения биомассы микробов. Это пример утилизации отходов биомассы микроорганизмов путем включения в систему с более высоким уровнем разнообразия.

4. Утилизация путем управляемого включения в искусственную или естественную экосистему, в которой происходит дезинтеграция микробной биомассы.

Примеры: 1) утилизация последрожжевой бражки, содержащей биомассу микроорганизмов путем включения в искусственный биоценоз, включающий ветвистоусых ракообразных и микроорганизмы; 2) использование избыточной биомассы жидких пивных дрожжей с хмелем в качестве источника витаминов, аминокислот и микроэлементов для людей и животных.

Для защиты окружающей среды от загрязнения отходами производства нами предложена утилизация последрожжевой бражки и воды от промывки дрожжей в качестве питательного субстрата для культивирования ветвистоусых ракообразных (Патент РФ на изобретение № 2094985 от 10.11.97 г). Вода от промывки дрожжей и последрожжевая бражка содержат дрожжи за счет потерь (неполного отделения биомассы от отработанной питательной среды). Кроме того, вода от промывки дрожжей и последрожжевая бражка содержат растворешше органические вещества и бактерии, которые вместе с дрожжами удовлетворяют пищевые потребности дафний. Безотходная утилизация нетоксичного отхода производства (последрожжевой бражки), содержащего биомассу микроорганизмов, возможна путем управляемого включения отхода в трофическую сеть искусственной экосистемы. Это пример утилизации отходов биологического происхождения путем включения в систему с более высоким уровнем разнообразия.

Разработка параметров для быстрого обнаружения возбудителей гкойно-воспалителыгых заболеваний и ускоренной оценки их дезинтеграции.

Использование закономерностей дезинтеграции популяций бактерий позволяет решать задачу оптимизации диагностики и лечения гнойно-воспалительных заболеваний (ГВЗ). Комплекс лечебных мер и защитные механизмы макроорганизма направлены на дезинтеграцию возбудителей ГВЗ. При этом разрушается часть клеток популяции и происходит адаптивная перестройка сообщества возбудителей ГВЗ. Поэтому необходима обратная связь для оценки альтернативной ответной реакции возбудителей на комплекс лечебных воздействий и защитных реакций макроорганизма. Концентрации летучих жирных кислот - продуктов энергетического метаболизма отражают поток энергии и поэтому являются существенными параметрами для оценки состояния популяцшЧ и ассоциаций возбудителей ГВЗ.

Бактериологический анализ при заболеваниях, вызванных УПМ, направлен на выделение всех микроорганизмов находящихся в патологическом материале. Общепринятый подход в лабораторной диагностике - дифференциация и идентификация возбудителей ГВЗ. Принадлежность возбудителей ГВЗ к УПМ и сапрофитическим организмам существенно изменяет проведешге и оценку микробиологических исследований и требует новых методических подходов. Новым подходом может быть использование суммарных параметров, информирующих о состоянии и динамике ассоциаций возбудителей и результатах взаимодействия микроорганизмов с лечебными препаратами и защитными механизмами макроорганизма.

Уксусная кислота в настоящее время не используется для выявления анаэробов, так как этот метаболит продуцируют как облигатные, так и факультативные анаэробы. Уксусную кислоту образуют стафилококки, эшерихии, протеи, клебсиеллы и другие факультативтп.тс анаэробы. Количественное определение уксусной кислоты в раневом отделяемом мы предложили использовать для быстрого обнаружения факультативно-анаэробных возбудителей гнойной инфекции.

Недостаточную специфичность уксусной кислоты как маркера облигатных анаэробов можно использовать для суммарной (интегральной) оценки ассоциаций облигатных и факультативных анаэробов - возбудителей ГВЗ. Прямая идентификация облигатных

анаэробных бактерий в патологическом материале газожидкостной хроматографией по спектру летучих жирных кислот в настоящее время невозможна. Однако вся сумма специфических летучих жирных кислот может быть суммарным (интегральным) метаболическим маркером монокультур и ассоциаций облигатных анаэробов.

Газожидкостная хроматография патологического материала позволила обнаружить летучие жирные кислоты у 159 больных (37% от общего числа обследованных пациентов): у 53 больных (12%) выявлены уксусная кислота и суммарный пик изо-масляной, масляной, изовалериановой и валериановой кислот; у 106 пациентов (25%) - только уксусная кислота. У 43 больных с метаболитами облигатных анаэробов параллельно проведено бактериологическое исследование для выявления аэробов и факультативных анаэробов. В подавляющем большинстве случаев обнаружения нами методом ГЖХ специфических метаболитов облигатных анаэробов, в образце присутствовала уксусная кислота, а бактериологический метод выявлял факультативных анаэробов. Облитатно-анаэробпая мононнфекция обнаружена в период с 1991 по 1996 годы у 4 больных (9%), ассоциация облигатных и факультативных анаэробов - у 39 пациентов (91%). Выявлены годовые различия частоты выявления ассоциаций возбудителей и облигатно-анаэробной моноинфекции: в 1991 году ассоциация облигатных анаэробов и факультативных анаэробов (аэробов) встречалась в 25%, в 1992 году - в 89%, а в 1993-1996 годах - в 100% случаев.

Повторные исследования метаболитов проведены у 30 пациентов со специфическими метаболитами облигатных анаэробов. Из них: у 18 больных (60%) метаболиты полностью исчезали, у 9 (30%) концентрация сшгасалась, у 3 пациентов (10%) концентрация метаболитов увеличивалась. У 4 пациентов исчезали специфические летучие жирные кислоты облигатных анаэробов, а сохранялся пик уксусной кислоты как маркер факультативных анаэробов, у 7 пациентов после отрицательного результата появлялись метаболиты облигатных анаэробов. Динамика содержахшя уксусной кислоты в патологическом материале исследована у 44 больных. Из них: у 20 пациентов (45%) уксусная кислота исчезала, у 6 больных (14%) концентрация уксусной кислоты снижалась, у 18 пациентов (41%) динамика отсутствовала или наблюдалось увеличение содержания метаболита. Кроме того, у 10 пациентов отрицательный результат сме-

нялся положительным (в патологическом материале появлялась уксусная кислота). У 3 больных в динамике исчезал пик уксусной кислоты, но появлялся пик изомасляной, масляной и изовалериановой кислот.

При положительном газохроматографическом анализе на факультативные анаэробы бактериологический анализ в 71% случаев позволил обнаружить факультативно-анаэробные бактерии, в 29/о случаев факультативные анаэробы отсутствовали. При выявлении в раневом отделяемом уксусной кислоты бактериологическим методом выделили факультативных анаэробов родов: Staphylococcus, Proteus, Escherichia, Enterobacter, Citrobacter, Streptococcus, Bacillus.

Параллельное исследование в динамике содержания уксусной кислоты и бактерий в патологическом материале проведено у 28 больных. У 19 пациентов (68%) уксусная кислота и бакгерии изменялись в одинаковом направлении. У 9 пациентов (32%) наблюдалась различная динамика хроматографических и бактериологических данных.

Анализ специфических (изомасляная, масляная, изовалериановая, валериановая кислоты) и неспецифических (уксусная кислота) метаболитов анаэробов позволяет проводить быстрое обнаружение возбудителей у конкретного больного и оцеш<у ответной реакции возбудителей на лечение и защитные реакции макрооргатгзма.

Количественное содержание уксусной кислоты и сумма летучих жирных кислот в отделяемом ран - существенные параметры для быстрого обнаружения монокультур и ассоциаций облтаттгых и факультативных анаэробов - возбудителей гнойной инфекции и оценки их дезинтеграции под действием комплекса лечебных факторов.

ВЫВОДЫ

1. При лишении питательной среды в соче тании с термошоком и гипотоническим шоком происходит 1Шдуцированная дезинтеграция эитеробактерий - процесс нарушения целостности популяции, включающий разрушение части клеток и адаптивную перестройку сообщества.

2. Адаптация популяций эитеробактерий при индуцировашюй дезинтеграции происходит за счет активации БОБ-ответа, уменьшения размеров и прекращения роста на питательных средах у части устойчивых к разрушению клеток сообщества.

3. Процесс индуцировашюй дезинтеграции эитеробактерий состоит из трех основных фаз: разрушения, стационарной и возобновления роста.

4. Олеиновая кислота ускоряет индуцирова1шую дезинтеграцию Е.соП, по не приводит к повышению конечной величины разрушения биомассы. При увеличении концентрации олеиновой кислоты в среде выше 200 нмоль/мл интенсивность шщуци-рованной дезинтеграции эитеробактерий снижается.

5. При индуцировашюй дезинтеграции эшерихий олеиновая кислота не только включается в липиды мембран, но и используется в качестве источника питания. Включение олеиновой кислоты в неразрушенные бактериальные клетки возрастает с увеличением концентрации олеиновой кислоты в среде и зависит от предыстории культуры.

6. При лишении питательной среды в сочетании с термошоком и гипотоническим шоком происходит уменьшение размеров устойчивых к разрушению клеток эшерихий.

При воздействии олеиновой кислоты, лишении питательной среды в сочетании с термошоком и гипотоническим шоком после фазы уменьшения размеров клеток Е.соП выявлена фаза увеличения размеров клеток.

7. Обнаружена способность клеток популяций эитеробактерий к регуляции кислотности среды в процессе индуцированной дезинтеграции.

Разрушение эитеробактерий, шщуцированное в кислой среде, наиболее интенсивно происходит в щелочной среде.

8. Разработаны принципы управления дезинтеграцией бактерий:

1) оптимизация физиологического состояния бактерий до разрушения;

2) противодействие адаптации бактерий после индукции дезинтеграции.

9. Подходы к дезинтеграции и утилизации многокомпонентных отходов, включающих биомассу микроорганизмов и биоорганические соединения:

1) уменьшение гетерогенности состава отходов,

2) включение отходов в систему с более высокой степетаю разнообразия.

10. Для разрушения и безотходной утилизации последрожжевой бражки - отхода производства, содержащего биомассу микроорганизмов, необходимо уггравляемое включение этого отхода в искусственный биоценоз.

11. Концентрация уксусной кислоты и сумма летучих жирных кислот в патологическом материале - сутцествешше параметры для быстрого обнаружения монокультур и ассоциаций возбудителей гнойно-воспалительных заболеваний и управления их дезинтеграцией под действием комплекса лечебных факторов.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

!. Акайзин Э.С. Индуцированный автолиз - модель изучения реакции микроорганизмов на антибактериальные агенты // Колонизационная резистентность и \имио-герапевтические антибактериальные препараты: Тезисы докладов Всесоюзного семинара. - М., 1988,- Ч. 1,- С. 27.

2. Акайзин Э.С. Кинетика индуцированного автолиза бактерий // Ред журн. Антибиотики и химиотерапия. - М., 1989,- 10 с. - Деп. в ВИНИТИ 12.09.89, № 5829-В.

3. Акайзин Э.С. Реакция популяций бактерий на лимитирование питанием в сочетании с шоком этнлендиаминотетраацетатом //Лимитирование и иигибированне роста микроорганизмов: Тезисы докл. Всесоюзп. конференции - Пушино, 1989,- С. 4.

4. Акайзин Э.С. Автолиз E.coli в зависимости от условий культивирования // Труды 20 Научной конференции молодых ученых биологического факультета МГУ,-Деп. в ВИНИТИ,- 1990,- № 642-В 90,- 3 с.

5. Акайзин Э.С. Исследование автолиза и утилизации биомассы бактерий // IV Обл. конф. молодых ученых и специалистов: Тез. докладов. - Иваново, 1990,- С. 59.

6. Акайзин Э.С., Воскун С.Е., Панова Л.А., Смирнов С.Г. Гетерогенность популяции Escherichia coli в процессе индуцированного автолиза // Микробиология.-1990,-Вып. 2,-С. 283-288.

7. Акайзин Э.С. Адаптация популяций E.coli к резкому лимитированию питанием // «Микробиология охраны биосферы в регионах Урала и Северного Прикаспия»: Тезисы докладов Всесоюзного симпозиума. - Оренбург, 1991,- С. 4.

8. Акайзин Э.С., Поздышева Т.И., Гретченко Г.А., Эль-Регистан Г.И., Козлова А.Н., Смирнов С.Г. Реакция популяций энтеробактерий на экстремальное изменение среды обитания // «Микробиология охраны биосферы в регионах Урала и Северного Прикаспия»: Тезисы докладов Всесоюзного симпозиума. - Оренбург, 1991.- С. 4-5.

9. Акайзин Э.С. Кинетический анализ взаимодействия популяций E.coli с бакте-риолитическим агентом // Эпидемиология, клиника диагностика и профилактика инфекционных болезней: Сборник научных трудов-Иваново, 1992,- С. 3-4.

10. Акайзин Э.С. Использование молочной сыворотки // Экологический вестник,- 1992,-№3,-С. 2.

11. Акайзин Э.С., Кулагин В.Ф., Сшосар С.Г., Рослова Э.П. Экспресс-диагностика анаэробной инфекции у травматологических больных методом газовой хроматографии // Международная конференция «Раны и раневая инфекция»: Тезисы докладов,-М„ 1993,- С. 298-299.

12. Чемоданов В.В., Акайзин Э.С., Баклушин А.Е. Исследование ... мембран эритроцитов у детей с токсическим течением респираторных заболеваний // V Национальный конгресс по болезням органов дыхания: Сб. резюме - М., 1995,- № 924.

13. Чемоданов В.В., Акайзин Э.С., Шиляев P.P., Баклушин А.Е. Микровязкость мембран клеток крови - критерий для выбора мембранотропной терапии детей с инфекционным токсикозом // Iii Российский национальный конгресс «Человек и лекарство»: Тезисы докладов - 1996,- С. 233.

14. Акайзин Э.С., Поздышева Т.Н., Гретченко Г. А. Дезинтеграция и самоперестройка клеток популяции бактерий в процессе индуцированного автолиза // Вестник Ивановской медицинской академии - 1996,- № 2.- С. 29-33.

15. Горбунов В.А., Стародумов B.JI., Акайзин Э.С. Модификация этанолом и органическим красителем токсического действия свинца; Ивановская государственная медицинская академия. - Иваново, 1996,- 7 с. - Деп. в ВИНИТИ 20.01.97 № 147-В97.

16. Сучкова Г.Д., Шиляев P.P., Чемоданов В.В., Акайзин Э.С. Состояние микро-вязкост мембран нейтрофилов и лимфоцитов у детей с герпетиформной экземой Ка-

погаи и другими неосложиеиными вариантами аллергодерматозов // Новые технологии охраны здоровья семьи: Сборник научных трудов - Иваново, 1997,- С. 306-308.

17. Акайзин Э.С. Биологические и экологические аспекты переработки и утилизации отходов производства биологической природы // Материалы I Международной научно-технической конференции «Экология человека и природы»,- 1997,- С. 97.

18. Акайзин Э.С., Губернаторова В.В., Губернаторова А.А., Гретченко Г.А., По-здышева Т.И. Микробиологические показатели и эпидемическая безопасность майонезов // Вестник Ивановской медицинской академии,- 1997,- № 3,- С. 73-75.

19. Голубева Е.К., Горожанин Л.С., Акайзин Э.С., Назаров С.Б. Некоторые особенности биохимического состава эритроцитарной мембраны потомства матерей, перенесших стресс во время беременности // Вестник Ивановской медицинской академии-1997,-№ 4,-С. 143.

20. Акайзин Э.С., Кулагин В.Ф., Сдюсар С.Г. Экспресс-диагностика возбудителей гпойной инфекции и быстрая оценка эффективности лечения у больных с осложненной травмой // Вестник Ивановской мед. академии - 1997,- № 4,- С. 17-20.

21. Акайзин Э.С. Патент РФ № 2094985 на изобретение «Способ культивирова-1П1Я ветвистоусых ракообразных» // Опубл. Б.И.- 1997.- № 31.

22. Сулейманова Ф.К., Баликин В.Ф., Акайзин Э.С. Динамика показателей микровязкости мембран эритрогпгтов при острых нейроинфекциях у детей // Сборник материалов Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные вопросы инфекционной патологии и современные методы лечения»,- Пенза, 1998,- С. 74-76.

23. Назарова А О., Посисеева Л.В., Акайзин Э.С., Назаров С.Б, Патогенетическое значение опредедешм аргинина в перитонеальной жидкости у женщин с ... гениталь-ным эндометриозом // Вестник Ивановской мед. академии - 1998,- № 2,- С. 92.

24. Акайзин Э.С., Губернаторова В.В., Булыгина В.В. Хроматографическая и бактериологическая диагностика гнойной инфекции у больных с осложненной травмой // Вестник Ивановской медицинской академии,- 1998,- № 2.- С. 22-24.

25. Варникова О.Р., Баликин В.Ф., Акайзин Э.С. и др. Показатели микровязкости мембран эритроцитов здоровых детей и их значение в клшшческой практике: Информационное письмо для врачей... .- Иваново, 1999,- 3 с.

26. Лкайзин Э.С., Гретченко Г.А., Поздышева Т.И. Саморегуляция популяций Salmonella minnesota в процессе индуцировашюго автолиза // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии - 1998.- № 2.- С. 112-115.

27. Акайзин Э.С., Чемоданов В.В. Новые возможности оценки интоксикации и реакции клеток крови у больных с инфекционным токсикозом // Клиническая лабораторная диагностика - 1998,- № 3.- С. 23-24, 33-34.

28. Сулейманова Ф.К., Баликин В.Ф., Акайзин Э.С., Назаров С.Б. Клшшко-патогенетическое значение нарушений гемореологических показателей и микровязкости мембран эритроцитов при острых нейроинфекциях у детей // Вестник Ивановской медицинской академии.- 1998.- № 4,- С. 43-48.

29. Акайзин Э.С. Влияние кислотности среды на индуцированный автолиз популяций энтеробактерий // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии,- 1998,-№4,- С. 6-8.

30. Акайзин Э.С. Разработка принципов управляемого автолиза популяций энтеробактерий // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии,- 1998,- № 5,- С. 22-25.

31. Акайзин Э.С., Булыгина В.В. Новые возможности экспресс-диагностики возбудителей гнойной инфекции и быстрой оценки эффективности лечения // Клиническая лабораторная диагностика - 1999,- № 6.- С. 45-47.

32. Акайзин Э.С. Возможность использования данных о содержании летучих жирных кислот для косвенной индикации возбудителей гнойно-воспалительных заболеваний в патологическом материале // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии,- 2000,- № 3,- С. 69-71.

33. Акайзин Э.С. Изменение размеров клеток Escherichia coli М-17 при индуцированном разрушении // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии,- 2000,- № 3,- С. 71-73.

34. Акайзин Э.С. Управляемая дезинтеграция популяций микроорганизмов // Вестник Ивановской медицинской академии - 2000,- № 3-4.- С. 37-40.

35. Акайзин Э.С. Роль олеиновой кислоты в процессе индуцированного разрушения Escherichia coli М-17 // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии- 2000,- № 5,- С. 82-84.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

1. ГВЗ - гнойно-воспалительные заболевания.

2. ГЖХ - газолшдкостная хроматография.

3. КОЕ - колониеобразующие единицы.

I. ЛЖК - летучие жирные кислоты.

5. РНК - рибонуклеиновая кислота.

6. ТХУ-осажденная фракция клетки - высокомолекулярная фракция, выделяемая из клеток воздействием трихлоруксусной кислоты.

7. ТХУ-растворимая фракция клетки - низкомолекулярная фракция, выделяемая из клскж воздействием трихлоруксусной кислоты.

8 УПМ -условно-патогенные микроорганизмы.

9. ЭДТА - этиленднаминотетраацетат.

10. pl I - водородный показатель.

II. (1 - диаметр бактерии.