Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Управляемая дезинтеграция популяций энтеробактерий (биологические, медицинские и экологические аспекты)

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Управляемая дезинтеграция популяций энтеробактерий (биологические, медицинские и экологические аспекты)"

Р Г Б ОД 2 7 ОПТ 1998

На правах рукописи

АКАЙЗИН Эдуард Семёнович

УПРАВЛЯЕМАЯ ДЕЗИНТЕГРАЦИЯ ПОПУЛЯЦИЙ ЭНТЕРОБАКТЕРИЙ (биологические, медицинские и экологические аспекты)

03.00.07 - микробиология

Автореферат диссертации ма соискание ученой степени доктора медицинских наук

Москва

1998

Работа выполнена в Ивановской государственной медицинской академии.

Научный консультант: доктор биологических наук В.А.Мельникова.

Официальные оппоненты: заслуженный деятель науки РФ, доктор биологических наук, профессор И . А. Баснакьян, доктор медицинских наук, профессор В.Г.Лиходед, доктор медицинских наук, профессор А.С.Быков.

Ведущая организация: Российский государственный медицинский университет.

Защита состоится 19 ноября 1998 года в 14 часов на заседании диссертационного совета Д 001.38.01 при Научно-исследовательском институте вакцин и сывороток им. И.И.Мечникова Российской академии медицинских наук по адресу: 103064, Москва, Малый Казенный переулок, д.5А.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИ вакцин и сывороток им. И.И.Мечникова РАМН.

Автореферат разослан 11 октября 1998 года.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат медицинских наук Н . Г . Кудрявцева .

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ.

Дезинтеграция микроорганизмов - универсальный подход, получивший широкое применение практически во всех областях экспериментальной и прикладной микробиологии (D.E. Hughes, 1971). По современным представлениям дезинтеграция - процесс необратимого нарушения анатомической целостности клеток. К дезинтеграции предложили относить широкий круг процессов от разрушения микробной биомассы до стерилизации (Б.А.Фихте, Г.А.Гуревич, 1982). Разрушение микроорганизмов необходимо для извлечения белка и других биологически активных веществ, получения автопластов, производства автолизатов и экстрактов дрожжей, выделения антигенов из микроорганизмов (Е.С.Станиславский, 1978; К.Г.Каверина, 1990; В.О.Пожарская, 1995). Извлечение из микробных клеток генетического материала является одним из этапов генно-инженерных технологий и молекулярных методов обнаружения возбудителей заболеваний (А.Л.Гинцбург, 1997). Существует проблема извлечения генно-инженерных продуктов из биомассы энтеробактерий.

Клетки микроорганизмов обладают исключительно прочными клеточными стенками, для разрушения которых необходимы механические и физические факторы большой интенсивности. Однако применение таких воздействий может привести к инактивации и деградации клеточных компонентов. Для реализации перспективных биологических методов разрушения не требуются сложная, энергоемкая аппаратура, агрессивные химические реактивы и устойчивые к коррозии реакторы. Биологическую дезинтеграцию микроорганизмов вызывают: лишение источников питания и энергии, супраоптимальная температура, осмотический шок, замораживание-оттаивание, детергенты, хелатирующие агенты, антибиотики, литические фаги, разобщители и ингибиторы дыхания, мембранотропные ауторегуляторы и их аналог олеиновая кислота (G.D. Shock-man et. al., 1967; В.М.Беликов с соавт., 1978; L.educ М.

е^ а1., 1980, 1982; О.В.Кислухина с соавт ., 1982; Г.И. Эль-Рсгистан, Т.Л.Бабаян, 1987). В то же время недостаточная эффективность методов биологического разрушения сдерживает их практическое применение. Существующие способы интенсификации биологической дезинтеграции ориентированы на молекулярный уровень и включают создание оптимума для функционирования литических ферментов. На практике дезинтеграции подвергаются популяции и ассоциации микроорганизмов. Разрушение бактерий хорошо изучено на молекулярном и клеточном уровнях, но не исследованы попу-ляционные аспекты биологической дезинтеграции энтеробак-терий. При изучении проблемы разрушения микроорганизмов недостаточно использовали общебиологические и популяцион-но-биологические подходы. В настоящее время не разработана проблема управляемого разрушения микробных клеток.

В связи с глобальным загрязнением окружающей среды не' обходимо создание безотходных технологий комплексной переработки микробной биомассы. Существующая классификация отходов производства не учитывает специфику отходов биологической природы. На сегодняшний день недостаточно разработаны вопросы переработки и утилизации биомассы бактерий и многокомпонентных отходов биологической природы, содержащих микроорганизмы.

Изучение популяционных аспектов дезинтеграции энтеро-бактерий необходимо для понимания механизмов разрушения т, устойчивости популяций и ассоциаций микроорганизмов, и решения биотехнологических, медицинских и экологических проблем.

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Создание принципов управляемой дезинтеграции популяци-энтеробактерий для безотходного разрушения бактериальной биомассы, утилизации отходов биологической природы, совершенствования диагностики и лечения воспалительных заболеваний, увеличения микробиологической стабильности и безопасности пищевых изделий.

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ.

1. Изучить закономерности динамики популяций энтеробактерий в процессе биологической дезинтеграции.

2. Исследовать взаимодействие кислотности среды и клеток популяций энтеробактерий при биологической дезинтеграции .

3. Создать принципы управляемой биологической дезинтеграции популяций энтеробактерий.

4. Систематизировать подходы к утилизации отходов биологической природы. Разработать способ безотходной утилизации последрожжевой бражки.

5. Обосновать параметры для быстрого обнаружения возбудителей гнойной инфекции и управления их дезинтеграцией .

6. Разработать показатели для оценки взаимодействия возбудителей и макроорганизма у больных с токсическим течением острых заболеваний респираторной системы.

7. Отработать способы увеличения микробиологической стабильности и безопасности пастеризованных пищевых изделий .

НАУЧНАЯ НОВИЗНА.

Доказано, что при биологической дезинтеграции энтеробактерий не только разрушается часть клеток сообщества, но и происходит адаптивная перестройка популяции. Впервые обнаружена способность популяций энтеробактерий к саморегуляции кислотности среды в процессе биологической дезинтеграции. Установлено, что дезинтеграция популяций энтеробактерий, индуцированная многофакторным способом с использованием олеиновой кислоты, наиболее интенсивно происходит при щелочном значении реакции среды.

В результате исследования заложены основы нового направления в микробиологии и биотехнологии - управляемой дезинтеграции микроорганизмов. Разработаны принципы управления биологической дезинтеграцией энтеробактерий.

Предложена классификация отходов производства биологической природы и принципы их утилизации. Обосновано соз-

дание технологий безотходной переработки и утилизации микробной биомассы. Реализована безотходная утилизация многокомпонентного отхода производства биологической природы (последрожжевой бражки) путем управляемого включения в трофическую сеть искусственного биоценоза.

Впервые предложено использовать количественное определение уксусной кислоты в раневом отделяемом для быстрого обнаружения факультативно-анаэробных возбудителей гнойной инфекции и быстрой оценки их дезинтеграции. Установлены годовые различия частоты выявления у больных с осложненной травмой облигатных и факультативных анаэробов - возбудителей гнойной инфекции.

Обнаружены закономерности динамики микровязкости мембран эритроцитов, нейтрофилов и лимфоцитов у больных с токсическим течением острых заболеваний респираторной системы.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ И ВНЕДРЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ В ПРАКТИКУ.

Разработан способ утилизации последрожжевой бражки -многокомпонентного отхода производства биологической природы, включающего биомассу микроорганизмов (Патент на изобретение № 2094985).

Разработаны и внедрены в лечебную практику с 1991 год; в Ивановском областном госпитале для ветеранов войн параметры для быстрого обнаружения факультативных анаэробов, ассоциаций облигатных и факультативных анаэробов - возбудителей гнойной инфекции и быстрой оценки их дезинтеграции (акт внедрения от 21.01.98 года). Разработаны и внедрены: в клинике «Мать и дитя» Ивановской областной клинической больницы с 1992 года (акт внедрения от 22.01. 98 года), в городской клинической больнице № 1 г. Иваново с 1998 года (акт внедрения от 23.01.98 года), в городской клинической больнице № 3 г. Иваново с 1998 года (акт внедрения от 23.01.98 года), в Ивановском областном кожно-венерологическом диспансере с 1998 года (акт внедрения от

14.01.98 года) критерии оценки интоксикации и особенностей реакции клеток крови на воздействие продуктов дезинтеграции и токсинов возбудителей у больных с воспалительными заболеваниями. Разработан и внедрен в клинике «Мать и дитя» Ивановской областной клинической больницы (акт внедрения от 22.01.98 года) концентрат витаминного напитка «Дрожжи пивные плюс».

Разработан комплекс мероприятий для увеличения микробиологической стабильности и эпидемической безопасности пастеризованных пищевых изделий в современной и традиционной упаковке. Разработаны и внедрены в производство микробиологические показатели качества кетчупа и горчицы. Совместно со специалистами Ивановского маргаринового завода разработаны и внедрены в производство нормативно-технические документы: технические условия на опытную партию, рецептуры и технологическая инструкция для производства кетчупа; технические условия, рецептура и технологическая инструкция для производства горчицы «Столовой». Разработаны и внедрены в производство технические описания и рецептуры для производства майонезов со стабилизаторами и консервантом.

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ.

1. При биологической дезинтеграции энтеробактерий не только разрушается часть клеток сообщества, но и происходит адаптивная перестройка популяции.

2. Принципы управления биологической дезинтеграцией энтеробактерий:

1) оптимизация условий культивирования до разрушения бактерий,

2) противодействие адаптации после индукции процесса.

3. Подходы к утилизации отходов биологической природы:

1) уменьшение гетерогенности состава,

2) включение отходов в систему с более высокой степенью разнообразия.

МАТЕРИАЛЫ ДИССЕРТАЦИИ ДОЛОЖЕНЫ на: Всесоюзной конференции «Лимитирование и ингибирование роста микроорганизмов», Пущино, декабрь 1989 г., IV Областной конференции молодых ученых и специалистов, Иваново, май 1990 г., Всесоюзном симпозиуме «Микробиология охраны биосферы в регионах Урала и Северного Прикаспия», Оренбург, октябрь

1991 г., Третьем съезде инфекционистов, Суздаль, сентябрь

1992 г., Конференции «Экологическая безопасность городов», Санкт-Петербург, октябрь 1993 г., Международной конференции «Раны и раневая инфекция», Москва, октябрь

1993 г., 5 Национальном конгрессе по болезням органов дыхания, Москва, март 1995 г., III Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство», Москва, апрель 1996 г.,

I Международной научно-технической конференции «Экология человека и природы», Иваново, май 1997 г.

ПУБЛИКАЦИИ. По теме диссертации опубликовано 24 печатные работы, в том числе описание изобретения к патенту РФ.

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ ДИССЕРТАЦИИ. Работа состоит из введения, обзора литературы, главы «Материалы и методы», 7 глав собственных исследований, заключения, выводов, списка цитируемой литературы. Список литературы включает 503 источника, в том числе 292 отечественных и 211 иностранных источников. Работа изложена на 215 страницах машинописного текста и включает 15 таблиц и 37 рисунков.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ. Штаммы микроорганизмов. Использовали два штамма Salmonella minnesota SF111 и R595 из набора О.Luderitz из музея кафедры микробиологии Ивановской государственной медицинской академии (штаммы переданы в музей кафедры ИГМА из НИИВС им. И.И. Мечникова РАМН) и промышленный штамм Escherichia coli М-17, переданный нам предприятием «Биомед» им. И.И. Мечникова. Штамм S. minne-

sota SFlll (хемотип S) имеет полноценный липополисахарид наружной мембраны, штамм S. minnesota R595 представляет собой мутант, выделенный из штамма SF111, и имеет в составе липополисахарида только 3 молекулы кетодезоксиокто-ната и липид А (хемотип Re).

Культуры выращивали в колбах объемом 2000 мл с 4 00 мл питательного бульона ДагНИИ питательных сред, рН 7,2 при 37°С с перемешиванием магнитной мешалкой.

Методы индукции биологической дезинтеграции (автолиза) энтеробактерий.

1. Лишение источников питания и энергии (M.Leduc, 1980).

2. Лишение источников питания и энергии в сочетании с воздействием олеиновой кислоты и супраоптимальной температуры 45°С (В.А.Светличный и соавт., 1984).

3. Лишение источников питания и энергии в сочетании с воздействием этилендиаминотетраацетата (M.Leduc et. al., 1982) .

4. Лишение источников питания и энергии в сочетании с воздействием супраоптимальной температуры 60°С (M.Leduc, 1980) .

Для исследования роли рН растущие бактерии переносили из питательной среды в водные растворы олеиновой кислоты рН 3,5 (В.А. Светличный и соавт., 1984) или в дистиллированную воду рН 3,5 с последующей инкубацией при рН 4,5; 7,0; 8,5; 9,0; 10,5 при температурах 37 и 45°С. Далее поддерживали установленную кислотность среды или процесс происходил без коррекции значения рН.

Методы анализа. Количество биомассы определяли по оптической плотности клеточной суспензии на спектрофотометре. Общую численность бактерий и число рефрактильных клеток подсчитывали камерным методом повышенной точности (К.К.Смирнов, 1985). Количество колониеобразующих единиц (КОЕ) определяли путем посева соответствующих разведений суспензии бактерий на чашки со средой Эндо и питательным агаром. Белок определяли общепринятым методом Лоури и прямым спектрофотометрическим методом (V.F. Kalb, R.W.

Bernlohz, 1977) аминный азот - методом Филдса (R.Fields, 1971). Значение pH среды измеряли 1 раз в час при помощи мономера ЭВ-7 4. Транспорт урацила и синтез РНК оценивали по включению в клетки 3Н-урацила в процессе биологической дезинтеграции. Подсчет радиоактивности в низкомолекулярной (ТХУ-растворимой) и высокомолекулярной фракциях (Р.Хансон, Дж.Филипс, 1984), проводили на сцинтилляцион-ном счетчике «Бета-1». Рассчитывали величину включения меченого предшественника на одну клетку и одну КОЕ. Механизм действия олеиновой кислоты изучали по включению в клетки меченой олеиновой кислоты. Подсчет радиоактивности в хлороформенной, метанольной, низкомолекулярной (ТХУ-растворимой) и высокомолекулярной фракциях (Р.Хансон, Дж. Филипс, 1984) проводили на счетчике «Гамма-12».

Для микроскопии в светлом поле использовали препараты-мазки, фиксированные нагреванием и окрашенные кристаллическим фиолетовым. На фотографиях препаратов-мазков измеряли размеры бактериальных клеток. Расчеты площади поверхности, объема клеток и отношения (S/V) производили по формулам: S = 2л1г; V = яг2(1-2/Зг), где 1 - длина, г -радиус клетки (С.Е.Воскун, 1985).

С мая 1991 года по май 1997 года нами хроматографиче-ским методом исследовано отделяемое ран у 428 больных с острой раневой инфекцией или с обострением хронического остеомиелита. Газожидкостную хроматографию летучих жирных кислот (ЛЖК) выполняли на хроматографе МОЗХ модель 3700 с пламенно-ионизационным детектором в изотермическом режиме при температуре 200°С. Колонка заполнена Порапак Q (США) (В.М.Митрука, 1978) с нанесенной на него ортофосфорной кислотой. Идентификацию и количественное определение ЛЖК осуществляли при помощи аналитических стандартов. Определяли показатель частоты первичного выявления облигатных или факультативных анаэробов путем расчета удельного веса положительных анализов в процентах от общего числа анализов раневой инфекции. Анализы повторяли до снижения или полного исчезновения ЛЖК анаэробов. Для оценки эффектив-

ности лечения учитывали изменение количественного содержания метаболитов во втором анализе по сравнению с первым. Микробиологическое исследование отделяемого гнойных ран проводили унифицированными методами в соответствии с Приказом МЗ СССР № 535 от 22.04.85 года «Об унификации микробиологических методов исследования, применяемых в клинико-диагностических лабораториях лечебно-профилактических учреждений».

Обследовано 105 детей в возрасте от 1 месяца до 3 лет. Контроль составили 9 здоровых детей. В качестве группы сравнения обследованы 28 пациентов с острым бронхитом или пневмонией. У 68 больных острые заболевания респираторной системы осложнялись инфекционным токсикозом. В том числе: 39 пациентов с токсикозом 1 степени, 17 детей с токсикозом 2 степени и 12 больных с токсикозом 3 степени. Разделение лейкоцитов проводили в двухступенчатом градиенте плотности фиколла-верографина (A.Boyum, 1968). Разделение нейтральных липидов мембран выполняли методом тонкослойной хроматографии (Э.Шталь, 1965). Для расчета индекса микровязкости липидов мембран клеток подсчитывали отношение холестерина к фосфолипидам. Для оценки реакций клеток крови определяли отношение индексов микровязкости нейтро-филов и лимфоцитов. Изучали динамику средних и индивидуальных значений индексов микровязкости клеток крови пациентов .

Исследовали 8 партий высококалорийного майонеза «Провансаль», 9 партий среднекалорийных майонезов и 2 партии низкокалорийного майонеза «Салатный». Для производства среднекалорийных майонезов использовали: стабилизаторы ксантан и альгинат натрия фирмы «Келко» (Великобритания) , стабилизационную систему фирмы «Ханн» (Германия). Исследовали 3 независимые партии горчицы «Столовой» и 2 независимые партии кетчупа. Для подготовки образцов и микробиологических исследований майонезов использовали методы в соответствии с государственными стандартами России. Определяли количество мезофильных аэроб-

ных и факультативно-анаэробных микроорганизмов, содержание бактерий группы кишечной палочки (БГКП), сальмонелл, протеев, стафилококков, мезофильных сульфитредуцируюгцих клостридий, дрожжей и плесневых грибов. Кроме определения БГКП в 0,01 г. продукта по ГОСТ, дополнительно анализировали этот показатель в 0,1 и 1 г. майонезов, кетчупа, горчицы. Анализ афлатоксина Вх в пищевых изделиях проводили утвержденным хроматографическим методом. Идентификацию и количественное определение афлатоксина проводили при помощи стандарта.

Оценка достоверности различий средних величин при помощи непараметрического критерия знаков и непараметрического критерия U Уайта (И.П.Ашмарин и соавт., 1975). Статистическая обработка результатов анализов проведена общепринятыми параметрическими методами вариационной статистики с использованием прикладных программ «Statgraphics 3,0», «Microsoft Works 2,0» и «Excel 7.0».

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Динамика популяций энтеробактерий при биологической дезинтеграции.

Популяция организмов является элементарной ячейкой развития всех живых существ. Противоречивая сущность биологической дезинтеграции состоит в том, что однородному неблагоприятному воздействию подвергается гетерогенная популяция бактерий, способная адаптироваться к неблагоприятным факторам среды. При биологической дезинтеграции бактерий, с одной стороны, необходимо создать экстремальные для существования клеток условия среды, а, с другой стороны, сохранить активность литических ферментов, что существенно ограничивает интенсивность используемых факторов . Поэтому мы выдвинули рабочую гипотезу об адаптивной самоперестройке популяции энтеробактерий в ответ на действие факторов, вызывающих биологическую дезинтеграцию. Для проверки рабочей гипотезы нами использованы

наиболее эффективные многофакторные способы биологической дезинтеграции энтеробактерий (Leduc M. et. al., 1902, В.А.Светличный и соавт., 1984).

Наиболее интенсивная дезинтеграция E.coli происходит при концентрации олеиновой кислоты 200 нмоль/мл, при увеличении концентрации олеиновой кислоты до 1200 нмоль/мл интенсивность дезинтеграции снижается. Нами проведено сравнение дезинтеграции кишечной палочки многофакторными способами с использованием (опыт) и без использования (контроль) олеиновой кислоты. В обоих случаях процесс состоял из трех основных фаз: литичсской, стационарной и возобновления роста. В опытном варианте за счет эффекта олеиновой кислоты выше начальная интенсивность разрушения (уровень достоверности 95%), быстрее происходило снижение скорости процесса с переходом в стабильное состояние. В этом исследовании наряду с общепринятыми тестами оценки дезинтеграции (измерением оптической плотности клеточной суспензии, концентраций общего белка и аминного азота во внеклеточной жидкости) использовали популяционные параметры: подсчеты общего числа клеток, числа КОЕ (рисунок 1), распределения клеток популяции по S/V.

При индуцированном олеиновой кислотой разрушении бактерий в популяции наблюдалось более быстрое снижение числа КОЕ по сравнению с падением оптической плотности клеточной суспензии и общего числа клеток, что приводило к уменьшению удельного содержания КОЕ в популяции. В первые 60 минут дезинтеграции оптическая плотность суспензии клеток снижалась, а численность популяции возрастала, к 4-м часам оба параметра снижались, затем стабилизировались и в дальнейшем (к 120 часам) наблюдалось возрастание численности клеток, числа КОЕ и оптической плотности биомассы. В наших экспериментах увеличение численности клеток и числа КОЕ, по-видимому, отражало рост устойчивых к разрушению особей за счет использования олеиновой кислоты и продуктов распада, что подтверждает уменьшение концентрации белковых соединений после 24 часов (рисунок 1).

Рис. 1 Кинетика дезинтеграции и динамика популяции Е.coli.

По оси абсцисс - время процесса, ч.

По оси ординат - все показатели в % процентах от исходного значения.

1 - концентрация, белка во внеклеточной жидкости;

2 - концентрация аминного азота во внеклеточной жидкости;

3 - число клеток;

4 - оптическая плотность клеточной суспензии;

5 - число колониеобразующих единиц (цифры числа КОЕ увеличены в 10 раз).

Резкое снижение КОЕ, которое не сопровождалось снижением числа клеток, указывало на переход части популяции в группу нерастущих нелизирующихся клеток, которая включала устойчивые к дезинтеграции особи. Поврежденные клетки после латентного периода подвергались разрушению, что отражало возникающее в динамике процесса снижение численности популяции бактерий.

Нами было исследовано изменение размеров бактериальных клеток в динамике индуцированной дезинтеграции и рассчитано отношение площади поверхности микробной клетки к ее объему S/V, построены вариационные кривые распределения клеток популяции по этой величине. В ходе дезинтеграции параллельно снижению оптической плотности клеточной суспензии и возрастанию численности популяции в течение первого часа после индукции процесса происходило уменьшение размеров клеток и увеличение отношения площади поверхности клеток к их объему. Это свидетельствует о том, что процессы разрушения и самоперестройки клеток популяции происходят одновременно. Известно, что в условиях голодания рост клеток бактерий прекращается, но деление (дробление) их продолжается, и в результате образуются мелкие клетки. Уменьшение размеров клеток было наиболее выражено к 72 часам, наблюдалось увеличение как среднего значения показателя S/V, так и соответствующее изменение вариационной кривой. В дальнейшем, к 96-144 часам, происходило увеличение размеров клеток и, соответственно, уменьшение средней величины S/V популяции до значений, которые наблюдались через 1 час после индукции дезинтеграции .

В ходе разрушения бактерий параллельно снижению оптической плотности клеточной суспензии возрастали концентрации белка и аминного азота во внеклеточной среде (рисунок 1), происходило включение в клетки и в биополимеры меченых урацила и олеиновой кислоты (рисунок 2) .

16000 14000 12000 10000 -8000 -6000 -4000 2000

I

□ 3

□ 4 В5

0,25

1

24

Рисунок. 2. Включение меченой олеиновой кислоты в процессе дезинтеграции кишечной палочки, индуцированной лишением источников питания в сочетании с воздействием температуры 45°с и 200 нмоль/мл олеиновой кислоты. По оси абсцисс - время разрушения, ч. По оси ординат - включение меченой олеиновой кислоты, имп/мин.

1 - общее включение в клетки;

2 - включение в пул (ТХУ-растворимая фракция);

3 - включение в хлороформенную фракцию липидов;

4 - включение в метанольную фракцию липидов;

5 - включение в биополимеры (ТХУ-осажденная фракция после экстракции липидов).

0

В наших экспериментах снижение оптической плотности на 60-90% от исходного значения не приводило к полному разрушению клеток, при микроскопировании мы наблюдали клетки малых размеров, при посеве на дифференциально-диагностическую среду Эндо обнаружили типичные колонии E.coli. Установлено, что в ходе индуцированной этилендиа-минотетраацетатом дезинтеграции кишечной палочки, снижается чувствительность популяции к повторной индукции дезинтеграции тем же и другим методом (термошоком)(таблица 1), что указывает на участие в адаптивной перестройке неспецифических механизмов.

Таблица 1.

Динамика чувствительности популяций кишечной палочки к повторной индукции дезинтеграции шоком температурой 60°С.

Период кинетики индуцированной дезинтеграции, в который проводится шок супра-оптимальной температурой, ч. Начальная величина дезинтеграции после шока супраоп-тимальной температурой, о :> ! N=3

0 62,0 ± 5,0

1,0 43,8 ± 6,7

5,0 30,7 ± 1,0

При индуцированной дезинтеграции эшерихий не только разрушается часть клеток сообщества, но и происходит адаптация популяции к этому экстремальному воздействию.

При переносе растущих культур сальмонелл из питательной среды в раствор олеиновой кислоты происходило снижение оптической плотности клеточной суспензии: для Яе-форм в среднем на 52%, для Э-форм в среднем на 13% (уровень достоверности отличия средних величин 99%). В контрольных и опытных вариантах дезинтеграция более интенсивно происходила у Ие-формы сальмонелл. Введение олеиновой кислоты увеличило интенсивность разрушения Э-формы сальмонелл. Во

всех вариантах после завершения лизиса наблюдалась стабилизация оптической плотности с последующим возобновлениег. роста. В этом исследовании наряду с измерением оптическое плотности клеточной суспензии, учитывали популяционные параметры: общее число бактерий, численность КОЕ, число анабиотических «рефрактильных» клеток. В течение 1 часа автолиза вместе со снижением оптической плотности клеточной суспензии происходили более быстрое снижение числа КОЕ, увеличение общего числа бактерий и численности «рефрактильных» клеток. К 4 часам оптическая плотность клеточной суспензии и численность КОЕ стабилизировались, в дальнейшем до 24 часов наблюдался рост оптической плотности клеточной суспензии, рост численности КОЕ, снижение общего числа бактерий и численности «рефрактильных» клеток. В период от 24 до 4 8 часов оптическая плотность снижалась, число КОЕ продолжало возрастать, увеличивались общее число клеток и численность «рефрактильных» клеток. Для Ве-формы сальмонелл в течение 1 часа картина была аналогична тому, что мы наблюдали при биологической дезинтеграции Э-формы сальмонелл: снижение оптической плотности и КОЕ, рост числа «рефрактильных» клеток и общего числа бактерий. В период от 1 до 4 часов продолжалось падение числа КОЕ, снижалось число «рефрактильных» клеток V общая численность бактерий. В период от 4 до 24 часов картина была аналогична динамике популяционных параметрои Э-формы сальмонелл: рост оптической плотности и КОЕ, снижение числа «рефрактильных» клеток и общего числа бактерий. От 24 до 48 часов оптическая плотность не изменялась, число КОЕ несколько снижалось, наблюдался рост числа «рефрактильных» клеток и общей численности бактерий.

Учитывая совокупность ответных реакций бактерий, для описания явления более адекватным термином является не индуцированный автолиз, а индуцированная дезинтеграция популяций энтеробактерий. Автолиз (лизис) является одной из трех основных реакций на комплекс повреждающих воздействий, вызывающих дезинтеграцию бактерий.

Анализ влияния рН среды на биологическую дезинтеграцию популяций энтеробактерий.

На рисунке 3 представлена динамика рН в процессе дезинтеграции энтеробактерий, индуцированного многофакторным способом при рН 3,5 с использованием олеиновой кислоты и последующим проведением процесса при рН 4,5; 7,0 и 9,0.

Рисунок 3. Динамика рН при дезинтеграции сальмонелл в зависимости от начального значения рН среды. Индукция многофакторным способом с применением олеиновой кислоты.

По оси абсцисс - время дезинтеграции, ч.

По оси ординат - кислотность среды, единицы.

1 - рН 4,5; 2 - рН 7,0; 3 - рН 9,0.

В процессе дезинтеграции сальмонелл наблюдалась следующая динамика показателей реакции среды: при начальном рН 4,5 повышение до 5,7; при исходном рН 7,0 незначительные колебания; при исходном рН 9,0 снижение до 7,5. При

дезинтеграции кишечных палочек наблюдалась следующая динамика показателей реакции среды: при начальном рН 7,0 колебания с незначительной амплитудой; при исходном рН 8,5 снижение до 7,7 - 7,8 и стабилизация на этом уровне незначительными колебаниями. При возврате нами рН к начальным (кислым или щелочным) значениям в дальнейшем про исходило изменение рН в сторону оптимальных для энтеробактерий значений.

По современным представлениям для интенсификации автс лиза микроорганизмов после индукции процесса необходимо создать оптимум для функционирования литических ферментов, который расположен в нейтральной (В.А.Светличный и соавт., 1984) или слабокислой (Leduc M. et. al., 1982) области значений рН. в диапазоне рН от 7,0 до 10,5 найме нее эффективно дезинтеграция происходила при нейтральном значении рН (рисунок 4). Проведение процесса при рН 8,5 увеличивало интенсивность процесса в опыте и в контроле, дополнительный эффект оказывало поддержание рН 8,5 в динамике разрушения. Наиболее интенсивно процесс происходи в опыте и контроле при реакции среды 10,5 и поддержании этой величины рН в процессе дезинтеграции (уровень досто верности 99%) . Во всех случаях при одних и тех же значениях рН процесс индуцированного разрушения был эффективнее в опытных вариантах по сравнению с контрольными вари антами (уровень достоверности 95%). Наибольшее количеств белка к 4 часам и аминного азота к 24 часам выделялось в внеклеточную жидкость в опытном варианте при проведении разрушения при рН 10,5.

Кислотность внеклеточной среды оказывает существенное влияние на процесс биологической дезинтеграции популяций энтеробактерий.

Саморегуляция рН подтверждает адаптивную самоперестройку популяции энтеробактерий в процессе биологическо: дезинтеграции. Для интенсификации разрушения энтеробакте рий, индуцированного при кислой реакции среды, целесообразно поддержание экстремального щелочного значения рН.

Рисунок 4. Дезинтеграция сальмонелл в зависимости от

РН.

По оси абсцисс - время процесса, ч.

По оси ординат - оптическая плотность клеточной суспензии в процентах от исходного значения.

1 - рН 7,0 с поддержанием рН; (индукция дезинтеграции с олеиновой кислотой);

2 - рН 8,5 без поддержания рН; (с олеиновой кислотой);

3 - рН 8,5 с поддержанием рН; (с олеиновой кислотой);

4 - рН 10,5 с поддержанием рН; (с олеиновой кислотой);

5 - рН 8,5 без поддержания рН; (без олеиновой кислоты);

6 - рН 8,5 с поддержанием рН; (без олеиновой кислоты);

7 - рН 10,5 с поддержанием рН; (без олеиновой кислоты).

Управление индуцированной дезинтеграцией энтеробактерий.

Предлагаем выделять три этапа в управлении индуцированной дезинтеграцией популяций энтеробактерий:

1. Подготовка бактерий к дезинтеграции.

2. Индукция разрушения.

3. Проведение процесса дезинтеграции.

Для изучения влияния подготовки бактерий к разрушению проведено сравнительное исследование дезинтеграции (многофакторным способом с использованием этилендиамино-тетраацетата) культур кишечной палочки, выращенных стационарно и с перемешиванием питательной среды. При глубинном культивировании достоверно возрастают максимальная удельная скорость роста, начальная и максимальная величины разрушения (уровень достоверности 99%, критерий Уайта) . Независимо от способа культивирования наивысшая интенсивность дезинтеграции наблюдается при индукции процесса в момент достижения культурой бактерий максимальной удельной скорости роста.

Для исследования влияния способа индукции на кинетику процесса нами были сравнительно изучены: однофакторный способ - шок супраоптимальной температурой, и многофакторный способ - шок супраоптимальной температурой, лишение источников питания и воздействие этилендиаминотетра-ацетата. При многофакторном способе индукции достоверно выше начальная интенсивность и конечная величина дезинтеграции .

Проведение дезинтеграции культур кишечной палочки при температуре 60°С по сравнению с 37° и 20° достоверно повышает интенсивность, но снижает конечную величину разрушения биомассы (таблица 2). Это отражает саморегуляцию процесса дезинтеграции популяций бактерий по механизму отрицательной обратной связи. Поэтому необходимо подбирать оптимальную интенсивность факторов, используемых для дезинтеграции энтеробактерий.

Таблица 2.

Сравнительный анализ индуцированной дезинтеграции кишечной палочки при температурах 37 и 60°С.

Параметр Температура дезинтеграции Уровень достоверности о. О

37 °С п = 12 60°С п = 12

Начальная величина разрушения биомассы, % 22,3 ± 2,1 41,5 + 1,4 99

Конечная величина дезинтеграции биомассы,% 58,0 ± 2,6 49,7 ± 2,0 95

Наиболее эффективно процесс дезинтеграции энтеробакте-рий происходил при реакции среды 10,5 единиц и поддержании этой величины рН в процессе дезинтеграции (рис. 4). Наибольшее количество белка к 4 часам и аминного азота к 24 часам выделялось во внеклеточную жидкость при проведении разрушения при рН 10,5 единиц. Поэтому кислотность среды можно использовать для управления процессом дезинтеграции популяций энтеробактерий.

Проведенные исследования позволили разработать подходы к управлению биологической дезинтеграцией для её интенсификации: 1) оптимизация условий среды для увеличения удельной скорости роста культуры бактерий до индукции дезинтеграции;

2) индукция процесса многофакторным способом в момент достижения микробной культурой максимальной удельной скорости роста;

3) поддержание экстремальных значений условий среды, в которых возможно эффективное проведение разрушения.

Разработка подходов к утилизации отходов производства биологической природы.

Существующие в настоящее время классификации отходов производства не учитывают специфику отходов биологической природы. Классификацию отходов необходимо дополнить разделением органических отходов на органические соединения химической природы и органические соединения биологической природы. Предлагаем классификацию отходов производства по природе соединений:

1. Неорганические соединения. 2. Органические соединения химической природы. 3. Органические соединения биологической природы. 4. Смесь соединений неорганической и органической природы.

Нами разработана классификация отходов биологической природы по составу:

1. Молекулярные отходы - отходы, состоящие из молекул органических и неорганических соединений.

2. Клеточные отходы - отходы, содержащие только биомассу микроорганизмов.

3. Молекулярно-клеточные отходы - отходы, состоящие из биомассы микроорганизмов, макромолекул и молекул органических и неорганических соединений.

3.1. Биомасса в виде микроорганизмов одного вида.

3.2. Биомасса в виде ассоциации микроорганизмов.

Для утилизации отходов производства биологической природы необходимы: 1) снижение неоднородности их состава и 2) включение отходов в систему с более высокой степенью разнообразия. При невозможности или нецелесообразности выше названных подходов предлагается включение отхода производства в небольшом количестве (до 5% от массы) в изделия с одинаковой или более низкой степенью разнообразия.

Сравнительно более простой является задача утилизации отходов производства биологической природы, не содержащих биомассу микроорганизмов.

Нами предложены: 1) включение натуральной молочной сыворотки без переработки в рецептуры майонеза «Провансаль», батона «Здоровье»; 2) переработка сыворотки для уменьшения ее гетерогенности с последующим включением в состав рецептур шампуня (пеномоющего средства) и лосьона. Это примеры реализации межотраслевых подходов. При хране-ши отходов биологической природы количественное содержа-ше микрофлоры в них возрастает, что затрудняет их переработку и использование. Общебиологические подходы позво-1яют предполагать, что наличие биомассы в составе отходов фоизводства значительно усложняет переработку и утилиза-щю отходов в силу выраженной способности микробных попу-1яций противостоять перерабатывающим воздействиям. Для тетерогенных популяций микроорганизмов необходимо созда-ше комплексной технологии дезинтеграции с различными :пособами утилизации лизирующихся и нелизирующихся клеток, что позволит создать безотходную технологию разруше-1ия и утилизации биомассы. В связи с разнообразием отхо-1ов биологической природы необходимы различные варианты стилизации, чтобы проводить выбор оптимального решения утя конкретного отхода. Предлагаем варианты безотходной шреработки и утилизации биомассы микроорганизмов:

1. После завершения биологической дезинтеграции не->азрушенные клетки инактивируют одним из известных спосо-5ов и далее используют совместно с дезинтегратом. Пример: 1езинтеграция микробной биомассы с остатками питательной :реды, инактивация неразрушенных клеток и совместное ис-юльзование в качестве основы питательной среды.

2. Биологическая дезинтеграция биомассы и переработ-;а неразрушенных клеток интенсивными физическими и хими-юскими факторами.

3. Биологическая дезинтеграция и использование нераз->ушенных клеток для регенерации популяции (культуры) и ювторение циклов дезинтеграции и регенерации. После за-юршения биологической дезинтеграции мы наблюдали само-[роизвольную регенерацию (вторичный рост) устойчивых к

разрушению клеток. Устойчивую к разрушению часть популяции предлагаем использовать в качестве инокулята для регенерации культуры. Необходимо путем оптимизации условий культивирования стимулировать процесс регенерации. В оптимальных условиях культивирования вновь образуются чувствительные к разрушению клетки и дезинтеграцию можно повторять . При этом мы действуем в соответствии с законами Природы, а не вопреки ним. Это пример оптимизации дезинтеграции микроорганизмов с позиций популяционной биологии. При управлении процессом можно добиться того, что циклы можно повторять длительное время без накопления отходов разрушения биомассы микробов. Это пример утилизации отходов биологической природы, содержащих биомассу микроорганизмов, путем включения в систему с более высоким уровнем разнообразия.

4. Утилизация путем управляемого включения в искусственную или естественную экосистему. Решение проблемы на более высоком уровне структурно-функциональной организации биосистем (утилизация отхода биологической природы популяционного уровня на биоценотическом уровне).

Для защиты окружающей среды от загрязнения отходами производства нами предложена утилизация последрожжевой бражки и воды от промывки дрожжей в качестве питательного субстрата для культивирования ветвистоусых ракообразных. Вода от промывки дрожжей и последрожжевая бражка содержат дрожжи за счет потерь (неполного отделения биомассы от отработанной питательной среды). Кроме того, вода от промывки дрожжей и последрожжевая бражка содержат растворенные органические вещества и бактерии, которые вместе с дрожжами удовлетворяют пищевые потребности дафний. Безотходная утилизация нетоксичного отхода производства (последрожжевой бражки), содержащего биомассу микроорганизмов, возможна путем управляемого включения отхода в трофическую сеть искусственной экосистемы. Это пример утилизации отходов биологической природы путем включения в систему с более высоким уровнем разнообразия.

Обоснование параметров для быстрого обнаружения и оценки дезинтеграции возбудителей раневой инфекции.

Комплекс лечебных мер направлен на уничтожение возбудителей. Популяции и ассоциации микроорганизмов способны к адаптации. Необходима обратная связь для оценки альтернативной ответной реакции возбудителей на комплекс лечебных воздействий и защитных реакций макроорганизма. Уксусная кислота в настоящее время не используется для выявления анаэробов, так как этот метаболит продуцируют как об-лигатные, так и факультативные анаэробы. Уксусную кислоту могут продуцировать стафилококки, кишечные палочки, протеи, клебсие'ллы и другие факультативные анаэробы. Количественное определение уксусной кислоты в раневом отделяемом мы предложили использовать для быстрого обнаружения факультативно-анаэробных возбудителей гнойной инфекции.

Газожидкостная хроматография патологического материала позволила обнаружить летучие жирные кислоты у 159 больных (37% от общего числа обследованных пациентов): у 53 больных (12%) выявлены уксусная кислота и суммарный пик изо-масляной, масляной и изовалериановой кислот; у 106 пациентов (25%) - только уксусная кислота. У 43 больных с метаболитами облигатных анаэробов параллельно проведено бактериологическое исследование для выявления аэробов и факультативных анаэробов. В подавляющем большинстве случаев обнаружения нами методом ГЖХ специфических метаболитов облигатных анаэробов, в образце присутствовала уксусная кислота, а бактериологический метод выявлял факультативных анаэробов. Облигатно-анаэробная моноинфекция обнаружена в период с 1991 по 1996 годы у 4 больных (9%), ассоциация облигатных и факультативных анаэробов - у 39 пациентов (91%). Выявлены годовые различия частоты выявления ассоциаций возбудителей и облигатно-анаэробной моноинфекции: в 1991 году ассоциация облигатных анаэробов и факультативных анаэробов (аэробов) встречалась в 25%, в 1992 году - в 89%, а в 1993-1996 годах - в 100% случаев.

Нами исследована годовая динамика выявления возбудителей анаэробной инфекции в патологическом материале из гнойных ран в период с мая 1991 по май 1997 года. Установлены годовые различия частоты выявления у больных факультативных и облигатных анаэробов: максимум обнаружения факультативных анаэробов 4 9% в 1992 году; максимумы выявления облигатных анаэробов: 20% в 1991 и 23% в 1993 годах, минимум обнаружения факультативных анаэробов 12% в 1991 году; минимумы выявления облигатных анаэробов: 6% в 1995 году и 7% в 1996 году. Наибольшие величины содержания метаболита факультативных анаэробов в материале из гнойных ран наблюдались в 1994 и 1992 годах, наименьшие - в 1995 - 1997 годах, наибольшие величины содержания метаболитов облигатных анаэробов в патологическом материале обнаружены в 1992 году, наименьшие - в 1995 - 1997 годах.

Анализ совпадений и расхождений результатов 199 параллельных анализов газохроматографическим и бактериологическим методами обнаружения возбудителей ГВЗ (первичное выявление) представлен в таблице 3.

Таблица 3.

Совпадения и расхождения результатов газохроматогра-фического и бактериологического методов обнаружения фа-

культативных анаэробов - возбудителей ГВЗ (в процентах).

Уксусная Уксусная Уксусная Уксусная

кислота к-та об- кислота к-та не

обнаружена наружена не обнаружена обнаружена

Бактерии Бактерии Бактерии Бактерии

выделены не выде- выделены не выделе-

лены ны

Факуль Факуль-

та- Аэробы та- Аэробы

тивные Псевдо- тивные Псевдо-

ана- монады анаэро- монады

эробы бы

71 15 14 69 15 16

При положительном газохроматографическом анализе на факультативные анаэробы бактериологический анализ в 71% случаев позволил обнаружить факультативно-анаэробные бактерии, в 29% случаев факультативные анаэробы отсутствовали. При выявлении в раневом отделяемом уксусной кислоты бактериологическим методом выделили факультативных анаэробов родов: Staphylococcus, Proteus, Escherichia, Enterobacter, Citrobacter, Streptococcus, Bacillus.

Повторные исследования метаболитов проведены у 30 пациентов со специфическими метаболитами облигатных анаэробов. Из них: у 18 больных (60%) метаболиты полностью исчезали, у 9 (30%) концентрация снижалась, у 3 пациентов (10%) концентрация метаболитов увеличивалась. У 4 пациентов исчезали метаболиты облигатных анаэробов, а сохранялся пик уксусной кислоты как маркер факультативных анаэробов, у 7 пациентов после отрицательного результата появлялись метаболиты облигатных анаэробов. Динамика содержания уксусной кислоты в патологическом материале исследована у 44 больных. Из них: у 20 пациентов (45%) уксусная кислота исчезала, у 6 больных (14%) концентрация уксусной кислоты снижалась, у 18 пациентов (41%) динамика отсутствовала или наблюдалось увеличение содержания метаболита. Кроме того, у 10 пациентов отрицательный результат сменялся положительным (в патологическом материале появлялась уксусная кислота). У 3 больных в динамике исчезал лик уксусной кислоты, но появлялся пик изомасляной, масляной и изовалериановой кислот.

Параллельное исследование в динамике содержания уксусной кислоты и бактерий в патологическом материале прове-цено у 28 больных. У 19 пациентов (68%) уксусная кислота 1 бактерии изменялись в одинаковом направлении. Из них: у 3 больных (47%) концентрация уксусной кислоты снижалась, / 8 пациентов (42%) динамика отсутствовала, наблюдалось увеличение содержания метаболита у 2 больных (11%) . У 9 зациентов (32%) наблюдалась различная динамика хромато-графических и бактериологических данных. Из них: у 8

больных (89%) в динамике метаболиты в ране исчезали, а бактерии высевались, у 1 пациента (11%) обнаружена уксус ная кислота, при этом рост бактерий не обнаружен. Анали: специфических (изомасляная, масляная, изовалериановая, валериановая кислоты) и неспецифических (уксусная кислота) метаболитов анаэробов - летучих жирных кислот позволяет проводить быстрое обнаружение возбудителей у конкретного больного и оценку ответной реакции возбудителе! на лечение и защитные реакции макроорганизма.

Количественное содержание летучих жирных кислот - су щественный параметр для быстрого обнаружения и оценки де зинтеграции ассоциаций облигатных и факультативных анаэробов - возбудителей гнойной инфекции.

Параметры для оценки токсического воздействия возбуд телей и реакции клеток крови у больных с инфекционным токсикозом.

При воспалительных заболеваниях происходит взаимная биологическая дезинтеграция возбудителей и клеток макроорганизма. При разрушении грамотрицательных бактерий в среду выделяется эндотоксин и другие продукты распада. Необходимы показатели, позволяющие оценить нарушение клс точных функций в ответ на воздействие токсинов и продуктов дезинтеграции бактериальных клеток, а также функционирование клеток, участвующих в защитных реакциях макроорганизма и дезинтеграции микробов. Представляет интерес оценка функционального состояния клеток крови, взаимодее ствующих с популяциями и ассоциациями возбудителей заболеваний. Наиболее информативно исследование отношения сс держания холестерина и фосфолипидов, которое отражает микровязкость клеточных мембран. Проведено параллельное исследование микровязкости эритроцитов, нейтрофилов и лимфоцитов у каждого пациента.

Динамика средних величин микровязкости клеток крови пациентов в зависимости от степени инфекционного токсикс за приведена на рисунке 5.

А

Рисунок 5. Динамика микровязкости клеток крови у пациентов с инфекционным токсикозом (средние величины):

А) токсикоз 1 степени. Б) токсикоз 2 степени, В) токсикоз 3 степени.

1) эритроциты, 2) нейтрофилы, 3) лимфоциты.

По оси абсцисс - время, сутки.

По оси ординат - индексы микровязкости клеточных мембран (отношение холестерина к фосфолипидам).

При неосложненных инфекционным токсикозом формах острого бронхита и пневмонии отмечены достоверные: снижение индекса микровязкости эритроцитов до 1,19 + 0,10, повыше ние индексов нейтрофилов до 1,59 ± 0,05 и лимфоцитов до 1,99 ± 0,22. Анализ индивидуальных значений индексов мик ровязкости эритроцитов у больных при токсикозе 1 степени позволил выявить два симметричных типа изменений текучести липидов мембран: 1 - исходно низкие значения повышались до среднего уровня; 2 - изначально высокие показате ли снижались в динамике заболевания.

Сообщество возбудителей оказывает повреждающее возде£ ствие на мембраны клеток. Одной из реакций живых организ мов на неблагоприятные условия среды является переход в покоящиеся формы с повышенной устойчивостью к повреждающим факторам. Поэтому микровязкость мембран эритроцитов больных токсикозом 1 степени была выше, чем у больных с воспалительными заболеваниями без токсикоза. Еще более выраженное увеличение микровязкости наблюдалось у больнь: с токсикозом 2 степени. Максимум средних значений индекс микровязкости эритроцитов 2,48 ± 0,38 при токсикозе 3 степени наблюдался на 3-4 сутки. На 5 сутки происходило статистически достоверное уменьшение показателя более че в 2 раза, далее наблюдались колебания со значительной аг^ плитудой. При токсикозе 3 степени два альтернативных тип изменений микровязкости мембран: 1 - стабилизация эритрс цитарных мембран, 2 - резкое снижение микровязкости мембран эритроцитов (высокие и низкие значения микровязкоса эритроцитарных мембран). Прогностически неблагоприятны для пациентов с 3 степенью токсикоза: высокие значения микровязкости и ее дальнейшее увеличение в динамике; отсутствие динамики микровязкости эритроцитов при тяжелом состоянии; слишком резкие и значительные колебания, указывающие на нарушение регуляции микровязкости мембран. При снижении в динамике ранее повышенного показателя мир ровязкости эритроцитов, исходы были благоприятными.

По данным литературы (В.А. Извекова, 1991) функция шфоцитов нарушалась при величине отношения холестерина фосфолипидам лимфоцитов выше 1,50 и менее 0,65. При жсикозе 3 степени наблюдались наиболее низкие значения щекса микровязкости лимфоцитов (0,46), что отражает по->еждение клеток и нарушение специфических механизмов за-[ты макроорганизма. При токсикозе 3 степени индекс мик->вязкости нейтрофилов статистически достоверно возрастал 4 суткам от начала заболевания, затем наблюдались коле-1ния индекса микровязкости нейтрофилов с большой ампли-гдой.

При сопоставлении индексов микровязкости мембран лей-щитов у 83% здоровых детей параметры лимфоцитов превы-.ли таковые нейтрофилов, в остальных случаях не имели ютоверных отличий. Средняя величина отношения индекса :кровязкости мембран нейтрофилов к индексу микровязкости мбран лимфоцитов: в контроле - 0,77 ± 0,10, в группе авнения - 0,85 ± 0,15. Более низкий индекс микровязко-'и и более высокую активность мембран нейтрофилов в нор-можно считать «неспецифическим» типом реакции. При токсикозе 1 степени на вторые сутки у всех больных ■казатели микровязкости мембран нейтрофилов были выше казателей лимфоцитов («специфический» тип реакции), едняя величина отношения индекса микровязкости нейтро-лов к индексу лимфоцитов - 1,42 ± 0,25. Это указывает

то, что в начальный период при токсикозе 1 степени оисходила активация лимфоцитов. В динамике индекс мик-вязкости нейтрофилов снижался, а у лимфоцитов возрас-л, что приводило к восстановлению характерного для нор-

соотношения активности нейтрофилов и лимфоцитов на 5 тки.

В начале токсикоза 2 степени более активны нейтрофилы, ена «неспецифического» типа реакции на «специфический» блюдалась после задержки в 1-2 дня. Это может быть свя-но с замедленной ответной реакцией клеток крови на фоне раженного токсического воздействия. На 3 день наблюда-

лась резкая смена соотношения: индекс микровязкости нейтрофилов был выше в 70% случаев. На 4 и 5 сутки у 50% больных показатели микровязкости лимфоцитов превышали по казатели нейтрофилов, а у другой половины пациентов пока затели не имели достоверных отличий.

При токсикозе 3 степени в первые трое суток индекс микровязкости нейтрофилов был выше, чем индекс лимфоцитов. На 5 и 6 дни у больных данной группы выявлялось пре обладание индекса микровязкости мембран лимфоцитов над показателем нейтрофилов. Средняя величина отношения индекса микровязкости нейтрофилов к индексу микровязкости лимфоцитов на пятые сутки 0,74 ± 0,09. У больных с токси козом 3 степени с первых дней «специфический» тип реакции. К 5-6 дню токсикоза при благоприятных исходах, индексы микровязкости лимфоцитов превышали индексы нейтрофилов .

Микровязкость клеточных мембран - существенный параметр для системного анализа взаимодействия возбудителей клеток макроорганизма у больных с токсическим течением острых заболеваний респираторной системы.

Разработка методов увеличения микробиологической стабильности и безопасности пищевых изделий.

Для увеличения эпидемической безопасности и микробиологической стабильности пастеризованных пищевых изделий необходима управляемая дезинтеграция ассоциации микрофлс ры. Нами исследована микрофлора высококалорийных, средне калорийных и низкокалорийных майонезов, кетчупа и горчицы. Во всех исследованных нами образцах майонезов сальмс неллы, протеи, стафилококки не обнаружены. По содержаник бактерий группы кишечной палочки (ВГКП) все исследованнь образцы майонезов соответствовали требованиям ГОСТа. Для углубленной оценки качества майонезов по микробиологическим показателям мы предложили определять «запас прочности» параметров путем определения соответствия более жестким по сравнению с ГОСТ нормативам. Для оценки «запасе

прочности» майонезов по содержанию ВГКП мы исследовали этот показатель в 0,1 и 1 г. продукта. Установлен значительный «запас прочности» по содержанию БГКП у высококалорийных и среднекалорийных майонезов: в 1 г. продукта бактерии группы кишечной палочки не обнаружены. Отсутствие патогенных бактерий и значительный «запас прочности» по содержанию БГКП свидетельствует о высокой эпидемической безопасности высококалорийных и среднекалорийных майонезов. Во всех исследованных нами образцах майонезов содержание дрожжей было в пределах норматива. В одном из пестнадцати образцов майонезов «Провансаль» обнаружено сверхнормативное содержание плесневых грибов. Нами проверено сравнительное исследование динамики микрофлоры майо-гезов «Провансаль» в коробочках из термопластичного материала поливинилхлорида (ПВХ) с герметической укупоркой фольгой и стеклобанках с герметичной укупоркой металличе-:кими крышками. На 121 сутки хранения в холодильнике при температуре 3-7°С майонез без консерванта содержит плесе-гей в 33-4 0 раз больше, чем допускается нормативными до-сументами. Превышение норматива по содержанию плесневых грибов обнаружено у опытно-промышленной партии (Салатного», в одном из двух опытно-промышленных образцов (Осеннего» и в трех из пяти опытно-промышленных образцов гайонеза «Виолетта». У майонеза «Салатный» установлено ¡ревышение норматива по содержанию БГКП. Одним из подхо-юв к увеличению эпидемической безопасности низкокалорийных и среднекалорийных майонезов может быть использование :сантана, альгината натрия и других стабилизаторов. Свя-¡ывая воду, стабилизаторы снижают водную активность, что 'ормозит развитие бактерий и увеличивает эпидемическую ¡езопасность. Снижение водной активности при применении :табилизаторов создает селективные преимущества для дрож-:ей, плесеней и микрококков. Нами проведено сравнительное [сследование динамики микрофлоры майонезов «Виолетта» со :табилизаторами ксантаном и альгинатом натрия без консер-¡анта и с введением сорбата калия в качестве противогриб-

кового консерванта. На 48 сутки хранения в холодильнике среднекалорийный майонез без консерванта содержит дрожже в четыре раза больше, чем допускается нормативными документами. Майонез «Виолетта» с консервантом соответствует ГОСТ и СанПиН на 62 и 73 сутки хранения в холодильнике при температуре 3-7°С. Поэтому для стабилизации микробис логических показателей при хранении майонезов и других пастеризованных пищевых изделий необходимо наряду со ста билизатором добавить противогрибковый консервант. В настоящее время, повышенное внимание уделяется контролю за микотоксинами (афлатоксинами и т.п.) в пищевых изделиях. Представляло интерес исследование содержания афлатоксина В1 в опытно-промышленных партиях майонезов со сверхнормативным содержанием плесеней. Анализ на наличие афлатокси на Вх был отрицательным во всех исследованных нами серийных и опытно-промышленных образцах майонезов. Сверхнорма тивное содержание плесеней в опытных партиях майонеза «Виолетта» было связано с наличием плесеней в яичном порошке, что подтверждено бактериологическим анализом этог сырья. Термолабильность яичного порошка, входящего в рецептуру майонезов, ограничивает температуру пастеризации майонеза, что не позволяет полностью инактивировать дрож жи и плесневые грибы. Поэтому необходима разработка нормативов по содержанию плесневых грибов и дрожжей в яично: порошке и сухих молочных продуктах, используемых в качестве сырья для производства майонеза. Возможности воздей ствия на микрофлору пастеризованного продукта, упакованного в тару из современных термопластичных и термолабиль ных материалов, ограничены. Поэтому особое значение приобретает предупреждение попадания в продукт и размножени в нем возбудителей порчи. Необходимы нормативные меры в виде входного контроля качества сырья, оценки качества готовой продукции, и антимикробные мероприятия, связанны с предупреждением обсеменения при фасовке пищевого изделия и введением пищевых добавок, ингибирующих развитие микрофлоры.

Томатные соусы в соответствии с ГОСТ традиционно готовили как консервы, удовлетворяющие требованиям промышленной стерильности. В последнее время производится пастеризованный кетчуп в упаковке из современных полимерных термопластичных материалов. Нами проведено сравнительное исследование динамики микрофлоры кетчупа в коробочках из полистирола с герметичной укупоркой фольгой. Кетчуп без консерванта содержит плесени, дрожжи, что требует разработки и обоснования микробиологических нормативов по содержанию этих микроорганизмов, выбора режимов термообработки этого изделия для подавления развития в продукте дрожжей и плесеней. Технология приготовления кетчупа предусматривает его пастеризацию при 80-85 ° С в течение 20 минут и горячую фасовку с герметичной укупоркой. Такой режим пастеризации в сочетании с горячей фасовкой позволяет создать стабильное по микробиологическим параметрам изделие до 121 суток хранения в холодильнике при 3-7°С. При низкотемпературной пастеризации кетчупа для увеличения микробиологической стабильности при длительном хранении необходимо использовать противогрибковый консервант. Нами разработаны микробиологические показатели кетчупа, которые включены в технические условия ТУ 9162-00200333457-95.

Комплекс мер по увеличению микробиологической стабильности и безопасности кетчупа в полимерной упаковке включает контроль микробиологических параметров и высокотемпературную пастеризацию для инактивации дрожжей и плесеней. Комплекс мер может быть дополнен применением стабилизаторов и противогрибкового консерванта.

Исследовали содержание микроорганизмов в трех независимых серийных партиях горчицы (пищевой готовой) «Столовой» после хранения в течение 92 суток при температуре 3-7°С. Патогенные микроорганизмы не обнаружены, по содержанию БГКП установлен высокий «запас прочности»: бактерии группы кишечной палочки отсутствовали в 1 г. горчицы. В связи с обсеменением дрожжами и плесенями не-

обходима разработка нормативов содержания этих микроорганизмов в горчице «Столовой». Нами разработаны микробиологические показатели горчицы «Столовой», которые включены в разработанные нами технические условия ТУ 9169-00300333457-96. Горчица «Столовая» обладает собственной мощной антимикробной системой, что позволяет ей сохранять стабильность по микробиологическим параметрам в течение 2 месяцев без использования стабилизаторов и консерванта. Для дезинтеграции гетерогенной ассоциации микрофлоры пастеризованных пищевых изделий необходим многофакторный комплекс нормативных и антимикробных мероприятий, разработанный с учетом особенностей изделия.

ВЫВОДЫ.

1. При биологической дезинтеграции энтеробактерий не только разрушается часть клеток сообщества, но и происходит адаптивная перестройка популяции.

2. Обнаружена способность клеток популяций энтеробактерий к саморегуляции кислотности среды в процессе биологической дезинтеграции. Биологическая дезинтеграция энтеробактерий, индуцированная многофакторным способом при кислом значении рН, наиболее интенсивно происходит при щелочном значении реакции среды.

3. Разработаны принципы управления биологической дезинтеграцией популяций энтеробактерий: оптимизация условий культивирования до разрушения бактерий и противодействие адаптации после индукции процесса.

4. Уменьшение неоднородности состава и включение отхо дов в систему с более высокой степенью разнообразия -подходы к утилизации отходов биологической природы. Для безотходной утилизации последрожжевой бражки, содержащей биомассу микроорганизмов, необходимо управляемое включение этого отхода в искусственный биоценоз.

5. Количественное содержание летучих жирных кислот в хатологическом материале - существенный параметр для бы-;трого обнаружения факультативных анаэробов и ассоциаций шаэробов - возбудителей гнойной инфекции и управления их (езинтеграцией.

6. Анализ состояния и динамики микровязкости мембран )ритроцитов, нейтрофилов и лимфоцитов позволяет оценить ;заимодействие возбудителей и макроорганизма у больных с юксическим течением острых заболеваний респираторной :истемы.

7. Для дезинтеграции гетерогенных ассоциаций микрофло-ы пастеризованных пищевых изделий необходимы многофак-орные комплексы нормативных и антимикробных мероприятий, азработанные с учетом особенностей изделий. Для увеличе-ия микробиологической стабильности и безопасности пасте-изованных пищевых изделий разработаны дополнительные икробиологические показатели качества и антимикробные еры, которые включены в нормативно-техническую докумеп-ацию и внедрены в производство.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1.Реакция популяций бактерий на лимитирование питанием

сочетании с шоком этилендиаминотетраацетатом / Э.С.

кайзин // Лимитирование и ингибирование роста микроорга-лзмов: Тезисы докладов Всесоюзной конференции.- Пущино, 989.- С. 4.

2.Автолиз E.coli в зависимости от условий культивиро-зния / Э.С.Акайзин // Труды 20 Научной конференции моло-jx ученых биологического факультета МГУ.- Деп. в

1НИТИ.- 1990.- № 642- В 90.- 3 с.

3.Исследование автолиза и утилизации биомассы бактерий

3.С.Акайзин, М.А.Акайзина // IV Областная конференция злодых ученых и специалистов: Тезисы докладов. - Ивано-

1990.- С. 59.

4.Гетерогенность популяции Escherichia coli в процессе щуцированного автолиза / Э.С.Акайзин, С.Е.Воскун,

Л.А.Панова, С.Г.Смирнов // Микробиология.- 1990.- Вып.

2.- С. 283-288.

5.Адаптация популяций кишечной палочки к резкому лими тированию питанием / Э.С.Акайзин // «Микробиология oxpai биосферы в регионах Урала и Северного Прикаспия»: Тезис! докладов Всесоюзного симпозиума. - Оренбург, 1991.- С. •

6.Реакция популяций энтеробактерий на экстремальное изменение среды обитания / Э.С.Акайзин, Т.И.Поздышева, Г.А.Гретченко и др. // «Микробиология охраны биосферы в регионах Урала и Северного Прикаспия»: Тезисы докладов Всесоюзного симпозиума. - Оренбург, 1991.- С. 4-5.

7.Кинетический анализ взаимодействия популяций кишечной палочки с бактериолитическим агентом / Э.С.Акайзин Эпидемиология, клиника диагностика и профилактика инфек ционных болезней: Сборник научных трудов.- Иваново, 1992.- С. 3-4.

8.Используйте молочную сыворотку / Э.С.Акайзин // Эк< логический вестник.- 1992.- № 3.- С. 2.

9.Экспресс-диагностика анаэробной инфекции у травмат логических больных методом газовой хроматографии /

3.С.Акайзин, В.Ф. Кулагин, С.Г.Слюсар, Э.П.Рослова // 1 ждународная конференция «Раны и раневая инфекция»: Тез1 докладов.- М., 1993.- С. 298-299.

10. Исследование структурного состояния мембран эрит цитов у детей с токсическим течением респираторных заб( леваний / В.В.Чемоданов, Э.С.Акайзин, А.Е.Баклушин // .' Национальный конгресс по болезням органов дыхания: Сбо; ник резюме.- М., 1995.- № 924.- 1 с.

11. Микровязкость мембран клеток крови - критерий дт выбора мембранотропной терапии детей с инфекционным то сикозом / В.В.Чемоданов, Э.С.Акайзин, Р.Р.Шиляев, А.Е. Ваклушин // III Российский национальный конгресс «Чело и лекарство»: Тезисы докладов.- 1996,- С. 233.

12. Дезинтеграция и самоперестройка клеток популяцих бактерий в процессе индуцированного автолиза /

Э.С.Акайзин, Т.И.Поздышева, Г.А.Гретченко // Вестник Ивановской медицинской академии.- 1996.- № 2.- С. 29-33.

13. Модификация этанолом и органическим красителем токсического действия свинца / В.А.Горбунов, В.Л. Староду-мов, Э.С.Акайзин и др.; Ивановская государственная медицинская академия. - Иваново, 1996.- 7 с. - Деп. в ВИНИТИ 20.01.97 № 147-В97.

14. Состояние микровязкости мембран нейтрофилов и лимфоцитов у детей с герпетиформной экземой Калоши и другими неосложненными вариантами аллергодерматозов / Г.Д. Сучко-ва, Р.Р.Шиляев, В.В.Чемоданов, Э.С.Акайзин // Новые технологии охраны здоровья семьи: Сборник научных трудов.-Иваново, 1997.- С. 306-308.

15. Биологические и экологические аспекты переработки и утилизации отходов производства биологической природы / Э.С.Акайзин, М.А.Акайзина // Материалы I Международной научно-технической конференции «Экология человека и природы»,- 1997,- С. 97.

16. Микробиологические показатели и эпидемическая безопасность майонезов / Э.С.Акайзин, В.В.Губернаторова,

А.А.Губернаторова и др. // Вестник Ивановской медицинской академии.- 1997.- № 3.- С. 73-75.

17. Некоторые особенности биохимического состава эрит-роцитарной мембраны потомства матерей, перенесших стресс во время беременности / Е.К.Голубева, Л.С.Горожанин,

3.С.Акайзин и др. // Вестник Ивановской медицинской академии.- 1997.- № 4.- С. 143.

18. Экспресс-диагностика возбудителей гнойной инфекции и быстрая оценка эффективности лечения у больных с осложненной травмой / Э.С.Акайзин, В.Ф.Кулагин, С.Г.Слюсар и др. // Вестник Ивановской медицинской академии.- 1997,- №

4.- С. 17-20.

19. Саморегуляция популяций Salmonella minnesota в процессе индуцированного автолиза / Э.С.Акайзин, Г.А. Гретченко, Т.И.Поздышева // Журн. микробиол.- 1998.- № 2.- С. 112-115.

20. Хроматографическая и бактериологическая диагности гнойной инфекции у больных с осложненной травмой / Э.С.Акайзин, В.В.Губернаторова, В.В.Булыгина и др. // Вестник .Ивановской мед. академии.- 1998.- № 2.- С. 33-3£

21. Новые возможности оценки интоксикации и реакции клеток крови у больных с инфекционным токсикозом / Э.С. Акайзин, В.В.Чемоданов // Клиническая лабораторная диаг ностика.- 1998.- № 3.- С. 23-24, 33-34.

22. Влияние кислотности среды на индуцированный автох популяций энтеробактерий / Э.С.Акайзин // Журн. микро-биол.- 1998.- № 4.- С. 6-8.

23. Разработка принципов управляемого автолиза популя ций энтеробактерий / Э.С.Акайзин // Журн. микробиол.-1998,- № 5.- С. 22-25.

24. Патент № 2094985 на изобретение «Способ культивие вания ветвистсусых ракообразных» / Э.С.Акайзин // Опубл Б.И.- 1997.- № 31.

Подписано в печать 09.09.98 года. Формат издания 60x84 1/16. Тираж 100 экз.