Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Генетический анализ и селекционное использование признаков состава жировых кислот и токоферолов в семенах подсолнечника

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Демурин, Яков Николаевич

ВВЕДЕНИЕ

1. ГЕНЕТИЧЕСКАЯ МОДИФИКАЦИЯ КАЧЕСТВА МАСЛА обзор литературы)

1.1 Краткий исторический аспект

1.2 Биохимия жирных кислот

1.3 Генетика жирных кислот у подсолнечника

1.4 Биохимия токоферолов

1.5 Генетика токоферолов у растений

2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

3. ГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ СОСТАВА ЖИРНЫХ КИСЛОТ

3.1 Гибридологический анализ признака высокоолеиновости

3.1.1 Результаты предварительного этапа

3.1.2 Результаты международной программы

3.1.3 Наследование признаков повышенного и пониженного содержания олеиновой кислоты

3.2 Цитогенетика мутации Ol

3.3 Гистология высокоолеиновых семян

3.4 Онтогенетическая изменчивость состава жирных кислот

3.5 Гипотетические механизмы генетического блока в реакции десатурации олеиновой кислоты в линолевую

4. ГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ СОСТАВА ТОКОФЕРОЛОВ

4.1 Исходное фенотипическое варьирование

4.2 Обнаружение мутаций и установление генов

4.3 Идентификация генов и определение их взаимодействия

4.4 Частота встречаемости мутантных аллелей

4.5 Тест на сцепление с другими генами

4.6 Экспрессивность мутаций 1рк1 и 1рИ

4.6.1 Модификационная изменчивость

4.6.2 Онтогенетическая изменчивость

4.6.3 Влияние генотипической среды

4.7 Гипотетическая схема генетических блоков в биосинтезе токоферолов

5. СЕЛЕКЦИОННОЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МУТАЦИЙ 1рМ, 1рк2 и

5.1 Метод ускоренного получения аналогов линий

5.2 Создание межлинейного гибрида подсолнечника

Краснодарский

5.3 Оценка окислительной стабильности масел с генетически изменённым составом жирных кислот и токоферолов

ВЫВОДЫ

РЕКОМЕНДАЦИИ ДЛЯ ПРАКТИЧЕСКОЙ СЕЛЕКЦИИ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Генетический анализ и селекционное использование признаков состава жировых кислот и токоферолов в семенах подсолнечника"

Актуальность темы.

В последние годы наблюдается принципиально новый этап в селекции растений на качество масла, заключающийся в преодолении межвидовых барьеров в наследственной изменчивости по составу жирных кислот семян и создании планируемых типов масел методами генной инженерии.

Прогрессивное развитие работ в этом направлении определяется тремя главными причинами - потребностью перехода на экологически чистые и энергосберегающие технологии в области получения нужного спектра пищевых, лекарственных и технических масел за счёт преобразования механизмов биосинтеза в растении, а не за счёт технологических процессов; крупными достижениями в липидологии, включая биохимию и медицину, открывших важную роль липидов в жизни растений, животных и человека; и, наконец, практическими успехами молекулярной биологии в целенаправленной модификации запасных жиров.

Качество масла, т.е. его пищевые, биологические и технологические свойства, зависит от состава и молекулярного положения жирных кислот, а также от наличия различных жирорастворимых сопутствующих компонентов, таких, как токоферолы, стеролы, пигменты и др.

Селекция растений на улучшение качества масла заключается в создании сортов и гибридов с новым типом масла, определяемым характером его использования. При этом возможен отбор генотипов как на экстремальные проявления признака, т.е. минимум или максимум, так и на оптимальное содержание определённого вещества или группы веществ. Очевидно, что для каждого типа масла существуют индивидуальные параметры качества.

В отличие от селекции на увеличение урожая, когда признаки продуктивности и устойчивости к болезням, вредителям и абиотическим стрессам реализуются в поле при уборке, селекция на улучшение качества ведётся с т.н. "сквозными " признаками химического состава биомассы, формирующимися в растении и переходящими в предметы и продукты технологической переработки.

Подсолнечник является одной из основных масличных культур в мире и главной масличной культурой в России, где в 1997 г. его посевные площади были около 3.6 млн. га при урожае семян около 0.79 т/га.

Одной из важных проблем улучшения качества масла из семян подсолнечника является повышение устойчивости масла к автоокислению с целью предотвращения накопления токсичных продуктов прогоркания во время его хранения и использования.

При разработке генетических основ селекции на увеличение окислительной стабильности масла следует учитывать, что этот признак определяется многими факторами различной природы. К числу наиболее значимых факторов относится степень ненасыщенности жирных кислот, положительно коррелирующая со способностью к окислению, и наличие естественных антиоксидантов, прежде всего токоферолов, препятствующих процессу свободнорадикального окисления.

В 1968 г. во ВНИИ масличных культур, г. Краснодар, на расширенном пленуме секции масличных и эфиромасличных культур ВАСХНИЛ с участием учёных, работающих в области селекции, биохимии, технологии переработки жиров, а также диетологии и медицины, обсуждался вопрос о перспективах изменения селекционными методами как содержания олеиновой и линолевой кислот в подсолнечном масле (Панченко А .Я., 1969), так и повышения содержания в нём сильных в антиоксидантном отношении у- и 5-форм токоферолов (Ржехин В.П., 1969).

Первая проблема была впервые успешно решена в 1976 г. путём создания во ВНИИМК высокоолеинового сорта подсолнечника Первенец (Солдатов К.И. и др., 1976). Этот сорт стал уникальным донором признака высокоолеиновости в селекционных программах во всём мире. Гибридологический анализ этого признака, проведённый в разных странах, тем не менее, давал не согласующиеся, часто противоречивые, гипотезы о его генетическом контроле. В 1993 году в г. Удине, Италия на совещании рабочей группы ФАО по проблемам генетики подсолнечника была отмечена необходимость в верифицикации этих гипотез в рамках международной программы совместных исследований.

Решение второй проблемы было начато во ВНИИМК в 1982 г. Результаты этого исследования представлены в данной работе.

Существуют четыре основные формы токоферолов - а, 0, у и 8, в ряду которых наблюдается уменьшение витаминной и увеличение антиоксидантной активности. Токоферольный комплекс семян подсолнечника более чем на 90% состоит из а-формы при общем содержании токоферолов в масле около 800 мг/кг.

Наследственной изменчивости по составу токоферолов у подсолнечника не было известно и устранение антиоксидантной несбалансированности его токоферольного комплекса путём поиска и отбора мутаций представлялось перспективным. При этом предполагалось изменить состав токоферолов в сторону повышения содержания {3-, у- и 5-форм. Эффективность увеличения общего содержания токоферолов в масле ограничена существованием оптимума в концентрации токоферолов при антиоксидантной защите масла с верхней границей около 1000 мг/кг.

Таким образом, развиваемая нами научная концепция формулируется как поиск, создание и отбор генотипов подсолнечника с наследственными изменениями в составе липидов семян, которые направлены на получение масла с заданными параметрами качества. В её основе лежат: центральная догма биохимической генетики "ген—» фермент-» этап метаболизма"; способность к существенным изменениям физико-химических и биологических свойств липидов при незначительных изменениях в структуре их молекул, а также известный "принцип усилителя" Тимофеева-Ресовского, указывающий на возрастание энергетических последствий в ходе фенотипической реализации мутации.

Цель и задачи исследования.

Цель настоящей работы - изучить генетический контроль и оценить возможность селекционного использования признаков состава жирных кислот и токоферолов в семенах подсолнечника.

При этом следовало решить следующие задачи:

1. Провести генетический анализ признака высокоолеиновости и верифицировать различные гипотезы его наследования;

2. Обнаружить мутационную изменчивость и провести генетический анализ признака состава токоферолов;

3. Создать генетическую коллекцию и селекционный материал с различными параметрами качества масла.

Научная новизна и теоретическая значимость.

Впервые проведён всесторонний генетический анализ признака высокоолеиновости масла из семян подсолнечника, включающий гибридологический анализ с использованием мировой коллекции инбредных линий, а также цитогенетическое и гистологическое исследование.

Показана неполная пенетрантность доминантной мутации высокоолеиновости 01 в гетерозиготе за счёт действия нестабильного генотипического фактора реверсии, находящегося в геноме некоторых нормальных линий.

- Мутация 01 не связана ни с геномными нарушениями или крупными хромосомными аберрациями, ни с изменениями в микроструктуре мезофилла семядолей семян.

- Обнаружен рецессивный аллель о1\ вызывающий в гомозиготе повышенное содержание олеиновой кислоты.

- Доказана несостоятельность гипотез о комплементарном и эпистатическом взаимодействии генов в попытке модифицировать описание наследование гена 01, контролирующего содержание олеиновой и линолевой кислот в масле семян подсолнечника.

- Обнаружены два гена ТрИ1 и ТрН2, контролирующие состав токоферолов в семенах растений, в частности подсолнечника.

- Изучена система изменчивости признака состава токоферолов, включая генотипическое, онтогенетическое и модификационное варьирование.

Практическая значимость работы.

- Создана и изучена генетическая коллекция из 22 мутантных и почти-изогенных линий подсолнечника по признакам состава жирных кислот и токоферолов в семенах. Она включает 8 мутантных линий - ЛГ15 {1рЫ1рМ\ ЛГ17 {1рк2грк2\ ЛГ21 (грИПрМ 0101), ЛГ24 (грИПрМ 1рЪ2грН2\ ЛГ25 (рк2фк2 ОЮ1), ЛГ26 (0101 и 5 маркерных генов - Т, vs, о, р, М), ЛГ27 (о/7о/7) и ЛГ28 (аддитивная генетическая система пониженного содержания олеиновой кислоты), а также 12 почти-изогенных линий по генам 01, ТрЬ1 и Трк2 на генотипической среде нормальных линий ВК66 и ВК373.

Создан ультраскороспелый межлинейный гибрид подсолнечника Краснодарский 917 с повышенным содержанием р-токоферола в семенах (авторское свидетельство № 6237, заявка № 9301453 с датой приоритета 26.11.1992).

- Разработан метод ускоренного создания аналогов линий по рецессивным признакам семян на основе непрерывной схемы беккроссов (авторское свидетельство № 1431094, заявка № 4169327 с датой приоритета 24.12.1986).

- Показана возможность существенного увеличения устойчивости масла к окислению за счёт синергизма при объединении в одном генотипе признаков высокоолеиновости и повышенного содержания 0-, у- и 6-токоферолов.

Основные положения, выносящиеся на защиту.

1. Система генетического контроля над содержанием олеиновой и линолевой кислот в масле семян подсолнечника состоит из пяти элементов. Первые три элемента представляют собой серию из трёх аллелей одного гена - доминантного аллеля 01, определяющего признак высокоолеиновости около 89% олеиновой кислоты, рецессивного аллеля о!1, определяющего признак повышенного содержания олеиновой кислоты около 62% и рецессивного аллеля дикого типа о1, дающего в фенотипе около 35% олеиновой кислоты. Четвёртым элементом является нестабильный в фенотипической реализации генотипический фактор реверсии, вызывающий неполную пенетрантность мутации 01 в гетерозиготе. К пятому элементу относится аддитивный генетический контроль над пониженным содержанием олеиновой кислоты около 22 %.

2. Система генетического контроля над составом токоферолов в семенах подсолнечника состоит из двух неаллельных, несцепленных генов Tphl и Tph2. Рецессивные аллели в гомозиготе вызывают специфические для каждого гена нарушения в биосинтезе а-токоферола, приводящие к накоплению веществ-предшественников, а именно, (3-, у- и 5-форм.

3. Мутации по составу жирных кислот и токоферолов могут эффективно использоваться в селекции подсолнечника на увеличение устойчивости масла к окислению.

Апробация работы и публикация результатов.

Результаты исследований докладывались на международной молодёжной конференции по генетике растений (Болгария, 1990), международном симпозиуме по биотехнологии (Швеция, 1991), ФАО совещании по генетике подсолнечника (Италия, 1993), ЕУКАРПИЯ симпозиумах по селекции масличных и белковых культур (Болгария, 1994; Украина, 1996), совещаниях о развитии масло-жировой промышленности (Югославия, 1994, 1995, 1996), симпозиуме по гиперлипопротеинемии (Югославия, 1995), Первом Балканском симпозиуме по селекции и возделыванию пшеницы, подсолнечника и белковых культур (Болгария, 1995), международной конференции по подсолнечнику (Китай, 1996), а также ежегодных отчётно-плановых сессиях ВНИИМК по заданиям государственным программам 0.51.102 (1981-85г.), 0.51.15 (1986-90г.) и 0.12.03.025 (1991-95г.).

3 По материалам диссертации опубликовано 34 научные работы, в т.ч. 14 на русском, 11 на английском, 8 на сербском и 1 на венгерском языках, включая 2 авторских свидетельства и 2 главы в книге "Биология, селекция и возделывание подсолнечника", 1991 г.

Объём и структура работы.

Диссертация изложена на 182 страницах машинописного текста и состоит из введения, 5 разделов, выводов, рекомендаций для практики, списка литературы, 8 приложений, включает 60 таблиц и 11 рисунков. Список библиографических источников содержит 155 наименований, в т.ч. 90 на иностранных языках.