Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ИДЕНТИФИКАЦИЯ МУТАЦИЙ СОСТАВА ТОКОФЕРОЛОВ В СЕМЕНАХ ПОДСОЛНЕЧНИКА

ВАК РФ 06.01.05, Селекция и семеноводство

Автореферат диссертации по теме "ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ИДЕНТИФИКАЦИЯ МУТАЦИЙ СОСТАВА ТОКОФЕРОЛОВ В СЕМЕНАХ ПОДСОЛНЕЧНИКА"

' На правах рукописи

Перетягана Татьяна Михайловна

а^г

ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ИДЕНТИФИКАЦИЯ МУТАЦИЙ СОСТАВА ТОКОФЕРОЛОВ В СЕМЕНАХ ПОДСОЛНЕЧНИКА

Специальность 06.01.05 - селекция и семеноводство

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Краснодар — 2007

Работа выполнена в Государственном научном учреждении Всероссийском научно-исследовательском институте масличных культур им. B.C. Пустовойта Российской академии сельскохозяйственных наук (ГНУ ВНИИМК Россельхозакадемии) в период с 2003 - 2007гг..

Научный руководитель: доктор биологических наук, доцент

Демурин Яков Николаевич

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

Скаженник Михаил Александрович

кандидат биологических наук Есаулова Любовь Владимировна

Ведущая организация - Кубанский Государственный

Университет

Защита состоится 30 мая 2007 г. в 9 часов 30 минут на заседании Диссертационного совета Д 006.026.01 Всероссийского научно-исследовательского института риса по адресу: 350921, г. Краснодар, п/о Белозерное.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Всероссийского научно-исследовательского института риса.

Автореферат разослан 26 апреля 2007 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук

Гончарова Ю.К.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Одной из важных проблем улучшения качества масла подсолнечника является повышение его устойчивости к окислению с целью предотвращения накопления токсичных веществ, образующихся при деструкции липидов.

Разработка генетических основ селекции на увеличение окислительной стабильности масла учитывает, что этот признак определяется многими факторами различной природы. К числу наиболее значимых эндогенных факторов, наряду с составом жирных кислот, относится наличие естественных антиоксидантов, препятствующих процессу свободнорадикального окисления липидов. Токоферолы (витамин Е) являются группой жирорастворимых веществ, препятствующих окислению и синтезируемых растительными организмами.

Увеличение содержания сильных в антиоксидантном отношении форм токоферолов селекционными методами представляет собой перспективное направление в улучшении качества масла семян подсолнечника.

Известны четыре основные формы токоферолов - а, р, у и 5, в ряду которых увеличивается антиокислительная активность. Обычный генотип подсолнечника характеризуется преобладающим содержанием а-формы в составе токоферолов около 95%. Генетический контроль признака осуществляется двумя генами ТрЫ и Тр!г2. Рецессивные аллели этих генов вызывают в гомозиготе повышенное содержание р и у-токоферолов соответственно. Мутантная дигомозигота приводит к повышеному накоплению 5-формы.

Установлено, что мутация обладает стабильным

фенотипическим проявлением в различных генотипических средах, тогда как экспрессивность мутации (рЬ2 существенно зависит от генотипи ческой среды.

Различная экспрессивность мутации 1рИ2 выражается в варьировании содержания у-формы в токоферольном комплексе от 20 до 95%. Уменьшение экспрессивности мутации 1р)\2 приводит у двойной рецессивной гомозиготы к одновременному появлению всех четырёх форм тпгпфгрпщп п 1

! имени К.А. Тимирязева 1 ЦНБ имени Н.И. Железное»

Испанские ученые создали новые мутантные линии с наследственно измененным токоферольными профилями в семенах п од со л нечника.

Генетическая идентификация полученных в разных странах мутаций состава токоферолов, а также изучение стабильности проявления этого признака в различных генотипнческих средах является актуальной селекционно-генетической задачей.

Цель н задачи исследований. Цель работы - провести генетическую идентификацию мутаций состава токоферола в семенах подсолнечника.

Для этого необходимо решение следующих задач:

1. Провести функциональный и рекомбинационный тест на аллелизм известных мутаций состава токоферолов 1рН1 и 1р!г2 с вновь обнаруженными генотип и чески ми изменениями,

2. Изучить наследование экспрессивности (рЬ2 в различных генотипнческих средах.

3. Создать генетическую коллекцию константных линий с различной экспрессивностью мутаций состава токоферолов.

4. Исследовать экспрессивность мутаций в различных органах растения.

5. Провести тест на сцепление (рИ1 и tph2 с геном устойчивости к имидазолиноновым гербицидам.

6. Оценить влияние состава токоферолов на окислительную стабильность масел.

7. Разработать эффективный способ гибридизации подсолнечника.

Научная иовизна исследования.

1. Впервые установлена аллельность известных мутаций состава токоферолов в семенах 1рМ и 1рИ2 вновь обнаруженным генотип и ческим вариациям испанских линий Т589 и Т2100 соответственно.

2. На основе гибридологического анализа доказано аддитивное действие генов, контролирующих варьирующую экспрессивность мутации ¡рИ2 в различных генотипических средах.

3. Выраженность мутации 1рН2 не проявляется в корне, гипокотиле, листе и пыльце, тогда как варьирующая экспрессивность двойной рецессивной гомозиготы идентифицируется только в корне и гипокотиле.

4. Обнаружено независимое наследование мутаций состава токоферолов и гена, контролирующего устойчивость к имидазолиноновым гербицидам.

Практическая ценность результатов.

Созданная генетическая коллекция линий подсолнечника с различным составом токоферолов, включающая аналоги селекционных линий, содержит доноры для селекции на качество масла. Линия-восстановитель фертильности пыльцы ВК588 с повышенным содержанием у-токоферола в семенах включена в селекционные программы создания гибридов подсолнечника как отцовская форма. Установлено влияние генотип и ческой среды на варьирующую экспрессивность мутации 1рН2, изменяющую состав токоферолов и о кс истаби л ь ноет ь масла. Разработан способ получения гибридов подсолнечника на основе фотопериодической мужской самостерильности в условиях камер и теплиц фитотрона. Основные положения, пыиоснмые на защиту.

- Характеристика генетической коллекции константных линий подсолнечника с идентифицированными мутациями состава токоферолов 1рИ1 и фЬ2;

- Аддитивный генетический контроль различной экспрессивности мутации (рИ2.

Апробация работы и публикация результатов исследования.

Результаты работы докладывались на международной научной конференции молодых ученых и специалистов "Актуальные вопросы селекции, технологии и переработки масличных культур", 28-30 марта 2005 г. Краснодар, ВНИИМК; на международных конференциях по подсолнечнику - X РАО 2005 (Нови Сад, Сербия); ЭиЫВЮ 2003 (Севилья, Испания) и 2006 (Генгенбах, Германия); на ежегодных отчетно-плановых сессиях ВНИИМК в 2003-2006 гг. Работа получила грантовую поддержку регионального конкурса РФФИ с 2006 г. (№ 06-04-96633).

По материалам диссертации опубликовано шесть научных статей. Кроме того, получены два авторских свидетельства: на селекционное достижение и изобретение.

Объем н структура работы. Диссертация изложена на 90 страницах машинописного текста и состоит из введения, 5 глав, выводов, рекомендаций для селекционной практики, списка

литературы, 9 приложений, включает 31 таблицу и 10 рисунков. Список библиографических источников содержит 152 наименований, в том числе 54 - иностранных.

Материалы и методы

Исследования проводили на центральной экспериментальной базе (ЦЭБ) ВНИИ масличных культур им. B.C. Пустовойта (ВНИИМК), г. Краснодар в лаборатории генетики в 2003-2007 гг.

Почвы опытных полей представлены сверхмощным, слабогумусным, выщелоченным черноземом характеризующегося гумусным горизонтом, достигающим 150-180 см. Содержание гумуса в верхних горизонтах колеблется от 4 до 6 %, а на глубине 150-200 см-0,1-1,0%.

Средняя сумма осадков за год в зоне Краснодара составляет 643 мм, в летние месяцы их выпадает около 180 мм.

Температура воздуха летних месяцев в годы проведения экспериментов была оптимальна для подсолнечника и составляла 25,7°С

Материалом исследований служили формы культурного подсолнечника: сорта селекции ВНИИМК Мастер и Фаворит; мутантные инбредные линии генетической коллекции ВНИИМК с измененным составом токоферолов - ЛГ15 (tphltphl), ЛГ17 (tphUphl), ЛГ24 {tphltphl, tph2tph2), ЛГ25 \tph2tph2, OlOl), BK876(tphl(phI, tph2tph2, OlOf); селекционные родительские формы - BK464, BK639, BK678, BK58G, BK541, BK 175, ВК571, ВК653, BK59I; мутантные испанские образцы с измененным профилем токоферолов - Т589 и Т2100; линия генетической коллекции Департамента сельского хозяйства США, обладающая устойчивость к группе имидозолиноновых гербицидов - НЛ425.

Растения выращивались как в полевых опытах на делянках при расстановке 70 х 35 см, так и в камерах фитотрона. Самоопыление и гибридизацию проводили общепринятыми методами.

Состав токоферолов определяли тонкослойной хроматографией с окрашиванием по методу Эммерн-Энгеля, т. е. по продуктам, которые образуются при восстановлении токоферолами трехвалентного хлористого железа и последующего взаимодействия двухвалентного атома железа с а, d- дипиридилом.

Общее содержание токоферолов в масле определяли колориметрическим способом.

Оценку состава жирных кислот в масле проводили в виде их метиловых эфиров с помощью газожидкостной хроматографии. Для этого использовался хроматограф Хром-5 с пламенно ионизационным детектором и интегратором.

Содержание свободных жирных кислот в масле, характеризуемое величиной кислотного числа, определяли стандартным тмтриметрнческим способом.

Окисление масел проводили на приборе Rancimat 743 при 120°С, который управлялся персональным компьютером. Оценочный алгоритм программы определяет точку перегиба кривой и индукционный период автоматически.

Проверка соответствия экспериментальных расщеплений в Рг теоретическим моделям проводилась с помощью %2 критерия Пирсона. Полученные результаты обрабатывали с использованием компьютерной программы STATISTICA 6.0 (основные описательные статистики) и программы Excel.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 1. Тест на аллелизм мутаций состава токоферолов

Из Института полевых культур г. Кордоба, Испания в 2003 г. были получены две инбредные линии подсолнечника с вновь обнаруженными спонтанными моногенными рецессивными мутациями контролирующие состав токоферолов в семенах (табл. 1). Фенотип этих мутаций представлен повышенным содержанием до 50% p-формы (линия Т589) и преобладающим количеством до 100%у-формы в токоферольном комплексе (линия Т2100).

Таблица I - Состав токоферолов испанских мутантных линий подсолнечника Т589 и Т2100

_ЦЭБ ВНИИМК, 2003 г.

Линия Состав токоферолов, %

а Р У 5

Т589 50 50 0 0

Т2100 0 0 100 0

Таблица 2 - Состав токоферолов мутантных линий подсолнечника ВНИИМК

__ЦЭБ ВНИИМК, 2003 г.

Линия, генотип Состав токоферолов, %

а Р Г 5

Норма, ТрМТрМ Тр!г2ТрИ2 95 2 3 0

ВК571, (рННрЬ} 50 50 0 0

ВК175,1рИ2 (рк2 5 0 95 0

ВК876А, фк1фИ! 1рИ2(р/г2 0 0 60 40

Для генетической идентификации использовались линии коллекции ВНИИМК с известным генотипом по мутациям определяющих состав токоферолов: ВК571 (1рЬ1), ВК175 (/рЛ2) и ВК876А (ГрИ], (рИ2) (табл. 2).

Все семена И) в скрещивании линий Т589 и Т2100 с тестерами в качестве как материнской, так и отцовской форм показали соответствующий каждой линии мутантный фенотип (табл. 3 и 4). Следовательно, функциональный тест на аллелизм указывает на идентичность сравниваемых рецессивных мутаций.

Для двух скрещиваний Т589хВК571 и Т2100хВК175 в 2004 г. получено Рг. Отсутствие семян с нормальным фенотипом в этих семьях, т.е, однородное мутантное потомство в каждой популяции без рекомбинаций, является дополнительным доказательством аллельности изучаемых генов

Таблица 3 - Тест на аллелизм мутации состава токоферолов линии Т589

_ЦЭБ ВНИИМК, 2003-2004 гг.

Поколение Число семян Фенотип Генотип

Т589 10 Мутантный, р-т 1рМ1рМ ТрИ2ТрИ2

ВК571 10 Мутантный, р-т грЬирМ ТрЬ2Тр1)2

Г, 10 Мутантный, р-т 1рМ1рЫ Трк2Трк2

Ъ 35 Мутантный, р-т грЪПрЫ ТрИ2ТрИ2

ВК876А Т589 Р, ООО Мутантный, 8-т Мутантный, р-т Мутантный, Р-т (рМ(рМ 1рЬ2)р1>2 1рНЬрЬ1 ТрЬ2ТрЬ2 1рНИрЫ Тр112)р>}2

Таким образом, генетическая идентификация вновь полученных мутаций состава токоферолов в испанских линиях Т589 и Т2100 с использованием функционального в Р, и рекомбинацнонного в К2 тестов показала аллельность этих наследственных изменений известным мутациям 1рк1 и ¡рИ2, соответственно.

Таблица 4 - Тест на аплелизм мутации состава токоферолов линииТ2100

_ЦЭБ ВНИИМК, 2003-2004 гг.

Поколение Число семян Фенотип Генотип

Т2100 10 Мутантный, у-т TphlTphl tph2tph2

ВК175 10 Мутанта ый, у-т TphiTphl (ph2tpk2

F, 10 Мутантный, у-т TphlTphl tph2iph2

Fj 37 Мутантный, у-т TphlTphl tph2tph2

В К876А Т2100 F, 10 10 10 Мутантный 6-т Мутантный, у-т Мутантный, у-т iphl tphl (ph2tph2 TphlTphl iph2lph2 Tphl tphl tph2tph2

2. Гибридологический анализ экспрессивности мутации tpk2 в различных генотипнческнх средах

Изучение различной экспрессивности мутации Iphl как отдельно, так и в сочетании с мутацией tphl в двойной гомозиготе включало отбор константных генотипов с различным количеством содержания у- токоферола и проведение гибридологического анализа.

На основе индивидуального отбора с оценкой по самоопыленному потомству продолжено ведущееся в лаборатории генетики создание двух сублнний BKI75, гомозиготных по мутации lph2. Максимальная экспрессивность этой мутации, или " + *' вариант, характеризуется почти 100% содержанием у-формы в токоферольном комплексе. Минимальная экспрессивность, или " — " вариант, отличается снижением содержания у-формы, в среднем, до 34% и увеличением доли а-формы до 66% (табл. 5). Тем не

менее, этот фен остается мутантным, т.к, нормальное содержание а-токоферола превышает 95%.

Таблица 5 - д Результаты дизруптивного отбора по содержанию у-токоферолау линии ВК175 грЬ2

ЦЭЕ ВНИИМК, 2004 г.

Сублиния Ks корзинки Состав токоферолов, х«, [лимиты), %

а У

" +■" вариант, шах 1 2 3 4 0 11 (0-40) 12 (0-40) 33 (5-60) 100 89 (60-100) 88 (60-100) 67 (40-95)

1 46 (30-70) 54 (30-70)

вариант, 2 46 (30-60) 54 (40-70)

min 3 55 (40-70) 45 (30-60)

4 66 (30-90} 34 (10-70)

Также на основе индивидуального отбора с оценкой по самоопыленному потомству продолжено создание двух сублиний ВК876, гомозиготных по мутациям tphl и tphl одновременно. Максимальная экспрессивность мутации tph.2, или " + " вариант, характеризуется на фоне дирецессива, в среднем, около 72% у-формы, 28% 8-формы при отсутствии а- и ß-токоферолов. Минимальная экспрессивность, или " - " вариант, обладает пониженным содержанием у- формы до 27% при увеличении доли S -формы до 36% и появлении а- и ß-токоферолов до 11 и 26%, соответственно. Следовательно, мутантный фен с минимальной экспрессивностью содержит все четыре формы токоферолов в значительных количествах и качественно отличается от фена с максимальной экспрессивностью, содержащего только две формы -у и - 5 (табл. 6).

Отобранные растения сублинии ВК175 и ВК876 с различной величиной экспрессивности мутации tph2 были включены в систему скрещиваний в камере фитотрона весной 2005 г. Семена F) от скрещивания сублиннй ВК175 (min х max) и сублиний ВК876 (max х min) получены с использованием разработанного метода гибридизации на основе фотопериодической мужской самостерильности (ФМС).

Таблица 6 — Результаты дизруптивного отбора по содержанию у-токоферола у линии ВК8761рИ11рИ2

ЦЭБВНИИМК, 2004 г.

Сублиния № корзинки Состав токоферолов, х^,, (лимиты), %

а Р У 5

" + "вариант, тах 1 2 3 4 0 0 0 0 о о о о 72 (60-80) 66 (50-80) 57 (50-70) 54 (S0- 70) 28 (20-40) 34 (20-50) 43 (30-50) 46 (30-50)

1 4 (0-10) 4 (0-Ю) 52 (50-60) 41 (30-50)

" - " вариант, 2 4 (0-/5) 8 (0-50) 41 (10-50) 47 (30-60)

лип 3 3 (0-10) 8 (0-60) 38 (10-50) 51 (20-60)

4 11 (0-20) 26 (0-40) 27 (10-50) 36 (30-50)

В предлагаемом способе получения гибридов р[ выход ФМС-растений после 24-ти часового фотопериодического воздействия на самофертильные растения составил 100%,гибридностъ — 100% при полном отсутствии самоопыления материнских растений. Причиной появления экологической ФМС является отсутствие выхода пыльников из венчика трубчатых цветков за счет нарушения роста тычиночных нитей.

Сублинии ВК175 с минимальной и максимальной экспрессивностью мутации (рН2 достоверно различались содержанием 7-токоферол а 26 и 69%, соответственно. Наследование признака в Р| отмечено по эффекту частичного доминирования среднем значении 45%. При этом степень доминирования К/с1 равнялась -0,12. В Иг наблюдалось континуальное варьирование без дискретных фенотип и ческих классов и очень высоким СУ, равном 95%, что наряду с относительно небольшим объемом выборки не позволяет обоснованно установить число и взаимодействие сегрегирующих генов (табл. 7), Кроме того, три величины - среднее значение признака в Р] 45%, в Рг 42% и арифметическое среднее между родителями (т) 48% достоверно не различались между собой. Это указывает на аддитивность действия генов, контролирующих различие в содержании у-токоферола между сублиниями ВК175.

Таблица 7 - Наследование содержания у—токоферола при различной экспрессивности мутации /рИ2 в скрещивании сублиний

ВК175

_ЦЭБ ВНИИМК, 2005 г.

Поколение Содержание у- токоферола, % с Количество, шт.

Хев лимиты корзинок семян

Р-шт 26 10-60 1,7 72 3 120

Р-тах 69 20-100 2,6 48 4 160

Р. 45 10-100 2,8 77 4 160

42 10-100 2,9 95 6 190

НСРо) 8

Сублинии ВК876 с минимальной и максимальной экспрессивностью мутации грН2 также достоверно различались содержанием у-токоферола 30 и 66%, соответственно. При этом минимальная экспрессивность характеризовалась наличием всех четырех форм токоферолов, а максимальная — только двух, у и б. В наблюдался частичный тип наследования при среднем значении 50%. При этом степень доминирования Ь/с1 равнялась 0,11. В Рг наблюдалось континуальное варьирование без дискретных фенотипических классов и высоким СУ, равном 68%, что наряду с относительно небольшим объемом выборки не позволяет обоснованно установить число и взаимодействие сегрегирующих генов (табл. 8). Кроме того, три величины - среднее значение признака в Р) 50%, в ¥2 47% и арифметическое среднее между родителями (т) 48% достоверно не различались между собой. Это указывает, также как и для сублиний ВК175, на аддитивное действие генов, контролирующих различие в содержании у-токоферола между сублиниями ВК876.

Таким образом, варьирующая экспрессивность мутации /рИ2 в различных генотипических средах контролируется аддитивной генетической системой. Более тщательное изучение этой системы предполагает использование методов работы с количественными признаками, основанными на большом количестве измерений.

Таблица 8 - Наследование содержания у—токоферола при различной экспрессивности мутации ХрН2 в дигомозиготе с мутацией 1рМ в скрещивании сублиний ВК876

ЦЭБВНИИМК, 2005 г.

Поколение Содержание у- токоферола, % СУ,% Количество, шт.

^Ср лимиты корзинок семян

Р-шт 30 0-70 2,4 72 2 80

Р-тах 66 50-80 1т5 20 2 80

Р, 50 20-80 2,0 51 4 160

47 0-80 2,9 68 3 120

НСР0Я 7

5. Генетическая коллекция линий по составу токоферолов в

семенах

Генетическая коллекция идентифицированных аллелей признака состава токоферолов в семенах подсолнечника представлена 20 линиями различного происхождения.

Семь линий характеризуются гомозиготным состоянием мутации фИ2 в различных генотипических средах (табл. 9). Эта мутация стабильна в фенотип ическом проявлении при варьировании содержания {^-токоферола от 50 до 62%.

Десять линий содержат гомозиготу по мутации 1р!г2 (табл. 10). При этом содержание у-токоферола существенно варьирует от 21 до 100% в зависимости от генотипической среды. Две линии 15ВС;ВК639/р/г2 н ВК175 представлены сублиниями с максимальной и минимальной экспрессивностью, полученными в результате дизруптивного отбора "+" и вариантов в пределах каждой линии. Линия подсолнечника ВК588 с измененным качеством масла семян в 2005 г. была внесена в Госреестр охраняемых селекционных достижений РФ.

Таблица 9 - Линии генетической коллекции подсолнечника,

гомозиготные по мутации 1рЫ

__ЦЭБ ВНИИМК, 2005 г.

Генотип Состав токо< >еролов,%

а Р У 5

ЛП5 45 55 0 0

ВК66>рЫ 50 50 0 0

ВК678 50 50 0 0

ВК571 50 50 0 0

1бВС|(3-8 х ЛГ21 )1рк1 33 62 0 0

[;ВС4ВК591 (рЫ 48 52 0 0

Т589 50 50 0 0

НСРо! 15

Таблица 10-Линии генетической коллекции подсолнечника,

гомозиготные по мутации tph2

_ЦЭБ ВНИИМК, 2005 г.

Генотип Состав токск »ералов, %

а Р У б

ЛГ17 10 0 90 0

ЪК66)рИ2 70 0 30 0

ВК588 50 0 50 0

15ВС,(Ь98 хЛГ24)(рА2 42 0 58 0

ЬВС,(73х ЛГ24)/рА2 36 0 64 0

15ВС4В К5911рИ2 2 0 98 0

15ВС$ В (С653!рЬ2 21 0 79 0

Т2110 0 0 100 0

1,ВС>ВК639/рА2 11 42 0 0 89 58 0 0

ВК175 7 79 0 0 93 21 0 0

НСР05 15

Три линии гомозиготны одновременно по обеим мутациям грк] и ГрИ2 при существенной изменчивости содержания всех форм токоферолов (табл. 11). В частности, содержание у-токоферола варьирует от 18 до 77% в зависимости от генотипической среды. Сублиния ВК876 с максимальной экспрессивностью мутации !рк2 характеризуется наличием только двух форм — у и 5, тогда как сублиния с минимальной экспрессивностью — наличием четырех форм а, (1, у и 8 в сопоставимых количествах.

Таблица 11 - Линии генетической коллекции подсолнечника, гомозиготные по мутации 1рМ 1рИ2

ЦЭБ ВНИИМК, 2005 г.

Генотип Состав токо< >еролов, %

а Р У 8

15ВС4ВК464//>Л/ 1рк2 15ВС4ВК591Г/гА/ 1рк2 42 18 30 0 18 77 10 5

ВК8761рМ (р/}2 0 24 0 25 64 34 36 17

НСР05 15

Изучение проявления экспрессивности мутации 1рИ2 в различных частях растения проводилось с шестью линиями.

Две сублинии ВК639 существенно различались составом токоферолов в семенах. Максимальная экспрессивность характеризовалась 90% содержанием у-формы, тогда как минимальная - 50%. В сублнннях двойной мутанты ой гомозиготы ВК876 максимальное проявление соответствовало наличию только двух форм токоферолов - у и 5, а минимальное - всех четырех. Линия ВК541/рА2 обладала предельной выраженностью мутации около 100% у-токоферола. Состав токоферолов семян нормальной линии ВК541 представлен только а-формой.

Мутация 1рк2 проявилась но отношению к нормальному генотипу во всех изученных частях растения - корне, ги по котил е, листьях и пыльце.

Однако сублинии ВК639, гомозиготные только по мутации (рИ2 и различающиеся составом токоферолов в семенах, не показали достоверных отличий по экспрессивности ни в одной из изученных частей растения. Так разница между содержанием у-формы у сублиний с максимальной и минимальной экспрессивностью не превышала 10% при НСР05 = 15.

Сублинии ВК876, гомозиготные по двум мутациям /рИ1 и (рИ2, сохранили различия в экспрессивности в корне и гипокотиле (табл. 12), заключающиеся как в изменении содержания у-токоферола на количественном уровне, так и наличии или отсутствии р-формы. Однако эти сублинии не показали достоверных отличий при сравнении токоферольных профилей в листьях и пыльце.

Таблица 12 - Состав токоферолов пшокотиля подсолнечника

ЦЭБ ВНИИМК, 2006 г.

Генотип Состав то кос Фролов, %

а Р У б

ВК639 )рШ шах ВК639 1рЬ2 тт 30 30 0 0 70 70 0 0

ВК876 1рЫ, 1рЬ2 тах ВК876 (рИ1, фИ2 тт 0 15 0 25 60 40 40 20

ВК541 !рк2 ВК541 0 100 0 0 80 0 20 0

НСР 5

Таким образом, различная величины экспрессивности мутации 1рк2 в семенах не проявляется в корне, гипокотиле, листе и пыльце. Варьирующая экспрессивность двойной рецессивной гомозиготы по мутациям 1рЫ и 1рН2 идентифицируется в корне и гипокотиле и не определяется в листе и пыльце. Следовательно, лист и пыльца не могут быть использованы в качестве теста для отбора генотипов с максимальной экспрессивностью мутаций состава токоферолов в семенах.

Тест на сцепление мутаций 1рИ1 и (рЬ2 с геном устойчивости к имидазолмнмновым гербицидам проведен с линией НА425, обладающей герб и цидоу стой чн востью, контролируемой одним полудоминантным геном 1тг1. В Р* и Рз наблюдали независимое наследование генов состава токоферолов и герби ци доу стой ч и воет и, что позволит создать селекционный материал, сочетающий признаки качества масла с резистентностью растений к имидазолининам.

Семь экспериментальных масел, полученных из семян различных генотипов подсолнечника при свободном цветении, были использованы в изучении оксистабильности на приборе Лапс^ша! 743 при 120°С. Обычный сорт Мастер являлся контролем.

Для каждого масла было оценено четыре параметра: состав жирных кислот и состав токоферолов, общее содержение токоферолов, кислотное число и оксистабилыюсть.

Семь линий характеризовались повышенным содержанием олеиновой кислоты более 60%, три из которых были высокоолеиновыми выше 85%. Содержание у-токоферола варьировало от отсутствия у контроля до 87% у ВК54Ю/, (рк2.

Общее содержание токоферолов в масле изменялось от 883 до 1002 мг/кг, а кислотное число - от 0,4 до 1,9 мг/г.

О кс истабил ь ноет ь изученных масел, измеряемая длительностью индукционного периода, существенно варьировала от 2,9 часа у сорта Мастер до 31,1 у линии ВК54Ю/,*/?й2 (рис.).

Три высокоолеиновых, масла показали наивысшее значение оксистабильности, что согласуется с многочисленными данными других авторов о первостепенной роли степени ненасыщенностн жирных кислот в скорости их окисления. Высокоолеиновое масло линии ВК54Ю/, относящееся как и контрольное к а-токоферольному типу, обладало в 7 раз увеличенной оксиситабильностью по отношению к линолевому сорту Мастер. Высокоолеиновые масла линий В К87601,1рИ 1,1р/г2та.х. и ВК54101,(рЬ2, относящиеся к у-токоферольному типу, увеличили индукционный период в 10 и 11 раз (рис.).

Возрастание доли у-токоферола с 50 до 65% на повышенно олеиновом фоне у сублиний ВК63901,1рк2тт и В Кб 3 9 ОД 1рИ2т ах соответственно увеличило окснстабияьность с 6,0 до 7,7 часа, т.е. в 1,3 раза. Тогда как возрастание доли у-токоферола с 13 до 35 и 87% на высокоолеиновом фоне у линий ВК54101, ВК8760/урА/,/рЛ2тах и ВК54Ю/,/рА2 соответственно увеличило индукционный период с 19,0 до 28,8 и 31,1 часа, т.е. в 1,5 и 1,6 раза.

Мастер 8K639 0I ВК876 01 BK639 0I ВК54Ю1 BK876 0I ВК54Ю1 tph2 min tph1tph2 tph2 max tph1tph2 tph2

Рисунок - Окистабильность экспериментальных масел различных генотипов подсолнечника. Ranci mat-тест, 120°С

Таким образом, увеличение содержания у-токоферола с 50 до 65% на среднеолеиновом фоне повысило индукционный период в 1,3, а с 13 до 87% на высокоолеиновом фоне - в 1,6 раза. Следовательно, варьирующая экспрессивность мутации 1рИ2, приводящая к различиям в накоплении у-токоферола, должна учитываться в селекции на качество масла.

ВЫВОДЫ

1. Функциональный и ре ко мбинац ионный тест показал аллельность известных мутаций состава токоферолов фИ1 и 1рИ2 вновь обнаруженным в испанских линий Т589 и Т2100, соответственно.

2. На основе внутри л и н е й но го дизруптивного отбора "+" и вариантов созданы константные сублинии с максимальной и минимальной экспрессивностью мутации ¡рИ2 в семенах на генотипи ческой среде ВК175 1р!г2 и ВК8761рЫ 1рЬ2.

3. Максимальная экспрессивность мутации /р)г2 в генотипе ВК175 сопровождается накоплением 93% у-формы в составе токоферолов, а минимальная - 21%. Сублинии ВК876 с минимальной и максимальной экспрессивностью мутации грИ2 также достоверно различались содержанием у-токоферола 30 и 66%, соответственно. При этом минимальная экспрессивность характеризовалась наличием всех четырех форм токоферолов, а максимальная — только двух - у и 5.

4. Гибридологический анализ при скрещивании полученных сублиний с максимальной и минимальной выраженностью признака между собой показал, что наследование различной экспрессивности мутации 1рЬ2 в Р] носит частичный тип наследования. В Р2 наблюдалось континуальное варьирование без дискретных фенотипическнх классов. Среднее значение признака в Рь в Яг и арифметическое среднее между родителями достоверно не различались между собой Это указывает на аддитивное действие генов, контролирующих различие в содержании у-токоферола между соответствующими сублиниями для каждого из генотипов ВК175 и ВК876.

5. Создана генетическая коллекция подсолнечника по признаку состава токоферолов, состоящая нз 20 линий

различного происхождения, включающая гомозиготы по мутациям (рЫ (7 образцов^ 1рН2 (Ю) и дигомозиготу (3). Содержание р-токоферола для линий с мутацией (рИ1 относительно стабильно и изменяется от 50 до 62%. Содержание у-токоферола у генотипов с различной экспрессивностью мутации ф/г2 в разных генотип и ческих средах варьирует более существенно от 18 до 100%.

6. Селекционная линия-восстановитель фертильности пыльцы ВК588 характеризуется повышенным содержанием около 50% у-формы в составе токоферолов.

7. Различная экспрессивность мутации (рИ2 в семенах не проявляется в корне, гипокотиле, листе и пыльце. Варьирующая экспрессивность двойной рецессивной гомозиготы идентифицируется только в корне и гипокотиле по увеличенному содержанию у-токоферола и наличию р-формы. Следовательно, лист и пыльца не могут быть использованы в качестве теста для отбора генотипов с максимальной экспрессивностью мутаций состава токоферолов в семенах.

8. Обнаружено независимое наследование генов состава токоферолов и гена 1тг1, контролирующего устойчивость к нмидазоли ни новым гербицидам. В Р3 отобраны рекомбинактные генотипы, сочетающие признаки измененного состава токоферолов и герб л ци доу сто й ч и воет н.

9. Изучение окси стаб и л ь ности экспериментальных масел семян различных генотипов показало, что увеличение содержания у-токоферола с 50 до 65% на среднеолеиновом фоне повысило индукционный период в 1,3, а увеличение его содержания с 13 до 87% на высокоолеиновом фоне - в 1,6 раза. При этом высокоолеиновое у-токоферольное масло обладало увеличенной в 11 раз оксистабильностью по отношению к нормальному.

10. Использование фотопериодической мужской самостерильности позволяет получать гибриды подсолнечника в условиях 24 светового дня во время цветения в камере фитотрона.

РЕКОМЕНДАЦИИ ДЛЯ СЕЛЕКЦИОННОЙ ПРАКТИКИ

1. Использовать генетическую коллекцию линий подсолнечника, включая аналоги селекционных линий, с различным составом токоферолов в качестве доноров в селекции на качество масла.

2. Рекомендуем использовать запатентованную линию-восстановитель фертильностн пыльцы ВК588 с повышенным содержанием у-токоферола в семенах в селекционных программах при создании гибридов подсолнечника как отцовскую форму.

3. Учитывать влияние генотипической среды на варьирующую экспрессивность мутации изменяющую состав токоферолов и оксистабильность масла.

4. Использовать запатентованный способ получения гибридов подсолнечника на основе фотопериодической мужской самостерильности в условиях камер и теплиц фитотрона.

Основные положения диссертации изложены в следующих

работах:

1. Демурин Я.Н., Гронии В.В., Перетягина Т.М. Проблема сохранения и изучения биологического разнообразия на генетическом уровне у культурного подсолнечника,- Сборник материалов Международной научно-практической конференции «Приоритет России XXI века: от биосферы и техносферы к ноосфере», Пенза, 2003.- С.55-57.

2. Перетягина Т.М, Тест на аллелизм мутаций состава токоферолов в семенах подсолнечника // Сборник докладов 3-й международной конференции молодых ученых и специалистов "Актуальные вопросы селекции , технологии и переработки масличных культур" 28-30 марта 2005 г., Краснодар, ВНИИМК, 2005,-С.47-49.

3. Демурин Я.Н., Перетягина Т.М., Борисенко О.М. Фотопериодическая мужская самостерильность в гибридизации подсолнечника // Масличные культуры (НТБ ВНИИМК), Краснодар,-2005, Вып.№2 (133).- С. 12-18 (издание реферируемое).

4. Патент РФ на селекционное достижение №2845 Подсолнечник ВК588, заявка №9553110 с датой приоритета 21.04.2004, зарегистрировано 28.09.2005 (А.С. №41439, заявка №9553110 с датой приоритета 21.04.2004, авторы Перетягииа Т.М., Бочкарев Н.И., Бочковой А.Д. и др.).

5. Демурин Я.Н., Перетягииа Т.М., Борисенко О.М,, Ветер И.И. Способ получения гибридов растений. Заявка на изобретение №2005135841, дата приоритета 17.11.2005, решение о выдаче патента 9.01.2007.

6. DemurinYa.N., Efimenko S.G., Peretyagina Т.М. Genetic identification of tocopherol mutations in sunflower // Helia.- 2004.-V.27, №40.-P.l 13-116.

7. Demurin Ya.N., Borisenko O.M., Peretyagina T.M., Perstenyeva A.A. Gene linkage test for Imr with Olt Tphl and Tph2 mutations in sunflower // Helia.- 2006.- V.29, №44.- P.41-46.

8. Demurin Ya.N., Peretyagina T.M. Expressivity of tocopherol mutations in sunflower // Helia.- 2006.- V29.- №45.- P.

ПЕРЕТЯГИНА Татьяна Михайловна

ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ИДЕНТИФИКАЦИЯ МУТАЦИЙ СОСТАВА ТОКОФЕРОЛОВ В СЕМЕНАХ ПОДСОЛНЕЧНИКА

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Подписано е печать 23.04.07. Формат 60х84]д6. Усл. леч. л. 1,39. Бумага Maestro. Печать трафаретная. Тираж 110 экз. Заказ № 7118.

Тираж изготовлен в типографии ООО « П рос в ещение-Ю г»

с оригинал-макета заказчика. 350059 г. Краснодар, ул. Селезнева, 2. Тел./факс: 239-68-31.