Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

Использование мутаций состава токоферолов и жирных кислот в селекции подсолнечника на качество масла

ВАК РФ 06.01.05, Селекция и семеноводство

Автореферат диссертации по теме "Использование мутаций состава токоферолов и жирных кислот в селекции подсолнечника на качество масла"

На правах рукописи

ЕФИМЕНКО Сергей Григорьевич

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МУТАЦИЙ СОСТАВА ТОКОФЕРОЛОВ И ЖИРНЫХ КИСЛОТ В СЕЛЕКЦИИ ПОДСОЛНЕЧНИКА НА КАЧЕСТВО МАСЛА

Специальность 06.01.05 - селекция и семеноводство

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Краснодар, 2003

/

Работа выполнена во Всероссийском научно-исследовательском институте масличных культур имени B.C. Пустовойта (ВНИИМК)

Научный руководитель - доктор биологических наук,

доцент Демурин ЯМ.

Официальные оппоненты - доктор биологических наук,

профессор Авакян Э.Р.

- кандидат биологических наук Трембак Е.Н.

Ведущая организация - Кубанский Государственный Университет

Защита диссертации состоится 16 сентября 2003 г. в 10 час. на заседании диссертационного совета Д 006.026.01 Всероссийского научно-исследовательского института риса по адресу: 350921 г. Краснодар, п/о Белозерное

С диссертацией можно ознакомится в научной библиотеке ВНИИ риса

Автореферат разослан 29 июля 2003 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук

Гончарова Ю.К.

2о©з-А

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Селекция растений на улучшение качества масла заключается в создании сортов и гибридов с новым типом масла, определяемым характером его использования. Очевидно, что для каждого типа масла существуют индивидуальные параметры качества.

Одной из важных проблем улучшения качества масла подсолнечника - основной масличной культуры нашей страны, является повышение его устойчивости к окислению с целью предотвращения накопления токсичных продуктов прогоркания в процессе его хранения и использования.

При разработке генетических основ селекции подсолнечника на увеличение окислительной стабильности масла следует учитывать, что этот признак определяется многими факторами различной природы. К числу наиболее значимых факторов относится степень ненасыщенности жирных кислот и наличие естественных антиоксидан гов, прежде всего токоферолов.

Во ВНИИМК впервые в мировой селекционной практике был создан высокоолеиновый сорт Первенец и получены линии с повышенным содержанием |3-, у-, 5- токоферолов.

Цель и задачи исследований. Цель настоящих исследований - изучение особенностей использования мутаций состава токоферолов и жирных кислот в селекции подсолнечника на качество масла.

В задачи исследований входило решение следующих вопросов:

1. Изучить оксистабильность масла различных генотипов.

2. Определить особенности накопления у- и 5-форм в семенах мутаятов по составу токоферолов.

3. Дать сравнительную характеристику маслообразовательного процесса, состава токоферолов и жирных кислот в онтогенезе различных генотипов.

4. Разработать эффективные методы создания аналогов линий с повышенной оксистабильностью масла.

5. Создать аналоги селекционных линий и гибридов с измененным составом токоферолов и жирных кислот в семенах.

РОС. НАЦИОНАЛЬНАЯ БИБЛИОТЕКА

Научная новизна исследований.

- Впервые показано проявление мутации высокоолеиновости Ol у 6-ти дневных недозрелых семян подсолнечника.

- Обнаружено проявление мутаций состава токоферолов tphl и tph2 в пыльце подсолнечника.

- Показана возможность идентификации гетерозигот по рецессивным мутациям состава токоферолов на основе анализа пыльцы отдельных растений подсолнечника.

- Созданы сублинии с высоким (95%) и низким (20%) содержанием у-формы в токоферольном комплексе семян по tph2 мутации на генотипиче-ской среде линии ВК 66.

- Получены двойные гомозиготные tphl, tph2 линии подсолнечника, накапливающие в семенах только у- и 8-токоферолы в эквивалентных количествах.

Практическая ценность результатов. Предложена и апробирована схема беккроссов для создания аналогов линий с измененным составом токоферолов, основанная на идентификации гетерозигот по составу токоферолов пыльцы. В этом случае генотип беккроссных растений определяется до начала проведения гибридизации, что позволяет сократить количество скрещиваний и число биохимических анализов.

Предложен и апробирован метод ускоренного создания высокоолеиновых аналогов, в основе которого лежит идентификация гетерозиготных генотипов по фенотипу семядолей недозрелых семянок через 12-14 дней после опыления и выращивание отобранных зародышей с исключением стадии созревания и покоя семян.

На основе разработанных методов созданы аналоги восьми селекционных родительских линий ВК678, ВК639, ВК464, ВК653, ВК571, ВК580, ВК541 и ВК591 с высоким содержанием олеиновой кислоты и различными комбинациями высокого содержания ß-, у-, 5-форм токоферолов. Эти изогенные линии могут быть использованы при создании аналогов гибридов серии "Кубанский 341,371,480,481,930,931" с увеличенной оксистабилыгосгью масла.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Увеличение окислительной стабильности масла за счет наследственных изменений состава токоферолов и жирных кислот семян.

2. Метод создания изогенных линий по рецессивному признаку семян на основе экспрессивности мутаций состава токоферолов в пыльце.

3. Метод создания изогенных линий по доминантному признаку на основе экспрессивности мутации высокоолеиновости у 12-ти дневных недозрелых семян.

Апробация работы и публикация результатов исследований. Результаты исследований и основные положения диссертации доложены на методических комиссиях учёного совета ВНИИМК (1992,1993,1994 и1995 гг.), на Международной конференции молодых ученых (Запорожье, 1994 г.), на второй краевой школе-семинаре молодых ученых (Краснодар, 1997г.).

По материалам диссертации опубликовано 14 работ общим объемом 2,7 печатных листов.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 122 страницах машинописного текста, в том числе 105 - основного текста, и состоит из введения, 7 глав, выводов и рекомендаций для селекционной практики. Работа иллюстрирована 25 рисунками, 25 таблицами и 5 приложениями. Список литературы включает 119 источников, в том числе 50 - иностранных.

Материал и методы исследований

В работе использовали сорта, гибриды, родительские линии и му-тантные генотипы селекции ВНИИМК. Растения выращивали: летом - в поле, зимой - в камерах искусственного климата.

Скрещивания и самоопыление растений проводили общепринятым методом с изучением биохимических признаков в отдельном семени с сохранением жизнеспособности зародыша.

Для получения средних проб семян различных генотипов на делянках, площадью 95 м2, изолировали пергаментными пакетами по 100 одновременно зацветающих растений в фазу появления краевых трубчатых цветков. На 4-й день цветения проводили групповое переопыление изолированных растений каждого генотипа в отдельности, на 6-й день после опыления изо-

ляторы удаляли, чтобы семена формировались в естественных условиях. Пробы семян со 100 растений по 50-60 семянок из каждой корзинки отбирали через 6,10, 15, 20, 25, 30, 40 и 60 дней после опыления. Взятие проб проводили утром с 8 до 9 часов. Семянки отбирали из средней зоны корзинки.

Характеристика температуры воздуха в период развития семян в июле-сентябре 1994 г. представлены по данным метеостанции Круглик, г. Краснодар.

Масло извлекали экстракцией гексаном, состав жирных кислот определяли методом газожидкостной хроматографии, содержание отдельных форм токоферолов — методом тонкослойной хроматографии, кислотное и перекисное числа - титрометрическим способом. Продолжительность индукционного периода определяли спектрофотометрически. При статистической обработке экспериментальных данных использовали методы дисперсионного и регрессионного анализов.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

1. Изучение оксистабильности масла различных генотипов.

Изучение влияния различных форм токоферолов на устойчивость к окислению масел, содержащих аналогичное соотношение олеиновой и лино-левой жирных кислот, выявило, что масла с высоким содержанием Р-токофе-рола (24-35 мг на 100 г) или "/-токоферола (31-89 мг на 100 г) обладают соответственно в 1,3-1,9 и 1,5-3,5 раза большей стойкостью к окислению, чем обычное масло с низким содержанием [З+у-токоферолов (2-6 мг на 100 г).

В результате изучения оксистабильности масел, полученных из семян современных гибридов с различным составом жирных кислот и токоферолов обнаружены существенные различия (табл. 1). Качественные характеристики, полученных масел по содержанию свободных жирных кислот (К.Ч. - кислотное число) и перекисей (ПЛ. - перекисное число) соответствовали высшему сорту для пищевых масел (ГОСТ 1129-93).

Повышенное содержание олеиновой кислоты и р-токоферола в семенах гибрида Краснодарский 917 способствует повышению оксистабильности масла в 1,3 раза по отношению к контролю. Высокое содержание олеиновой кислоты (91% от суммы кислот) в семенах гибрида Краснодарский

б

885 обусловило резкое увеличение оксистабильности этого масла, приблизительно в 10 раз. Повышение оксистабильности высокоолеинового масла происходит за счет резкого снижения содержания до 3% линолевой кислоты, которая окисляется на много быстрее олеиновой кислоты.

Таблица 1

Индукционный период окисления (110°С) масел различных генотипов

1994 г.

Сорт, гибрид К.Ч., мгКОН ПЛ., ммоль 'ЛОг/кг Жирная кислота, % Токо< юролы Индукционный период, мин

насыщенные олеиновая лино- левая сумма, мгна 100г состав, %

а ß

Березанский 0,25 8,2 8,5 35,4 56,1 70,0 97 3 48

(Контроль)

Полевнк 0,30 3,9 9,4 43,3 47,3 77,5 96 4 51

Краснодарский 0,34 3,9 9,7 41,5 48,8 61,5 60 40 64

917

Краснодарский 0,33 1,6 6,1 91,1 2,8 80,2 98 2 530

885

Таким образом, основным фактором повышения оксистабильности подсолнечного масла является изменённый состав жирных кислот. В качестве дополнительного фактора может быть использовано высокое содержание наиболее сильных антиоксидантов, таких как у- и 6-токоферолы.

2. Особенности накопления у- и 5-токоферолов у мутантов.

Известно, что на экспрессивность мутации tph2, контролирующей содержание у-токоферола в семенах подсолнечника существенно влияет гено-типическая среда. В процессе создания во ВНИИМК изогенных линий ВК66 и ВК373 по гену tph2 было обнаружено, что состав токоферолов в семенах этих линий имеет иное соотношение, чем у донорских линий ЛГ17 и ЛГ25. Поэтому отбор индивидуальных растений у аналогов не приводил к получению линий стабильных по этому признаку. Анализ отдельных семянок показал наличие широкого размаха варьирования содержания у-токоферола как у родителей так и у потомков (рис.1). Предположительно это связано с наличием у подсолнечника генов-модификаторов, влияющих на экспрессивность мутации tph.2.

Рис. 1. Распределение содержания у-токоферола в 1з ВК 66 ¡рИ2.

Определение коэффициента наследуемости на основе оценки всей популяции свидетельствует о значительном (Ь2=0,50-0,57) контроле содержания у-токоферола генотипом. С другой стороны, в классах с содержанием у-токоферола 90-95% и 20-30% наследуемость этого признака намного выше (Ь2=0,73-0,89). Это означает, что у растений, входящих в крайние классы по проявлению признака фенотип чаще соответствует генотипу, что является следствием гомозиготизации, т.к. растения, содержащие 90% и более у-токоферола, не обнаруживают расщепления в потомстве.

В результате трех циклов самоопыления при жестком фенотапиче-ском контроле были выделены константные сублинии ВК66 1рк2 с минимальным (20%) и максимальным (95%) содержанием у-токоферола.

В связи с этим в процессе работы по созданию аналогов линий по гену грИ2 необходимо контролировать содержание у-токоферола в ¥г бек-кроссных растений с целью отбора фенотипов с максимальным содержанием этой формы для преодоления влияния генотипической среды на проявление мутантного аллеля.

Антиоксидантная роль токоферольного комплекса в семенах подсолнечника возрастает при совмещении в одном генотипе мутаций грИ1 и вызывающих одновременное присутствие в значимых количествах всех 4-х форм токоферолов. Такой фенотип уникален для масличных культур.

В результате целенаправленной работы по поиску фенотипов с максимальным содержанием 5-токоферола в 1998 г. нами были получены биотипы линий ВК66 ¡рЫ, грИ2 и 14ВС1 ВК678 !рк1, <рй2, содержащие около 50% этой формы. Необходимо отметить, что поиск и отбор генотипов с максимальным содержанием б-токоферола привел к практически полному исчезновению а- и Р-форм, хотя родоначальное растение содержало все 4 формы токоферолов (40% а-, 25% |3-, 25% у- и 10% 5-).

Сублинии, накапливающие исключительно у- и 5-токоферолы в эквивалентных количествах, способны максимально повысить устойчивость масла к окислению благодаря присутствию самой сильной антиоксидантной 6-формы. Для селекционной работы очень важно, что фенотип этой рецессивной гомозиготы (50% у- и 50% 5-токоферола) выщепляется в гибридных популяциях независимо от используемых генотипических сред.

3. Характеристика маслообразовательного процесса, состава токоферолов и жирных кислот в онтогенезе различных генотипов.

Изучение динамики накопления различных веществ в онтогенезе семянок подсолнечника показало^ что наличие мутаций по составу жирных кислот и токоферолов не оказывает значительного влияния на содержание сухих веществ. Максимальная интенсивность их прироста у всех генотипов приходится на период с 10 по 30 день после опыления, а на 40 день кривые накопления выходят на плато.

Основным запасным веществом семян подсолнечника является жир. Отложение его происходит неравномерно в процессе созревания семян. Относительное содержание свободных липидов достигает максимума на 20 день после опыления, затем оно стабилизируется (рис. 2А).

Рис. 2. Динамика накопления свободных липидов и токоферолов. А, Б — в относительных; В, Г — в абсолютных единицах.

В абсолютных единицах количество масла в начальный период развития семян невелико (рис. 2В). Наибольшая интенсивность биосинтеза жира наблюдается в период с 10 по 30 день после опыления. На 40 день после опыления маслообразовательный процесс завершается у всех генотипов.

Среди веществ сопутствующих жиру наибольший интерес представляют токоферолы. В токоферольном комплексе семян подсолнечника преобладает а-форма, характеризующая наибольшей Е-витаминной активностью. Изучение динамики общего содержания токоферолов показало, что

ю

величина и характер их накопления однотипны для всех изученных генотипов (рис. 2Б).

Наиболее обогащено токоферолами масло из незрелых семян. Этим качеством особенно выделяются гибриды Полевик и Краснодарский 917. Затем по мере созревания семян' относительная доля токоферолов в масле закономерно снижается, в связи с неодинаковой интенсивностью образования масла и токоферолов, т.е. присутствует эффект разбавления.

Однако биосинтез и накопление токоферолов в семенах происходит до конца их развития (рис. 2Г). Максимум прироста этих веществ наблюдается с 10 по 30 день после опыления у всех генотипов, а на 40 день кривые выходят на плато.

Присутствие мутации ЬрМ у гибрида Краснодарский 917 обусловило качественные различия между этим гибридом и остальными генотипами. Повышенное содержание р-токоферола наблюдалось не только в зрелых семенах, но и обнаруживалось на разных этапах их развития. Так, уже на 6-ой день после опыления в развивающихся семенах гибрида Краснодарский 917 содержалось 65% Р-токоферола, в то время как у обычных генотипов количество р-+у-токоферолов не превышало 10%. И эти различия сохранялись до конца маслообразовательного процесса. Это позволяет использовать признак состава токоферолов для идентификации генотипа гибрида и родительских линий в любую фазу созревания семян, так как ген, контролирующий содержание Р-токоферола является рецессивным.

Редкие рецессивные аллели проще всего обнаружить в генотипе, находящемся в гаплоидном состоянии. Наибольший интерес в этом отношении представляет мужской гаметофит - пыльца. Известно, что в пыльце различных культур экспрессируется от 60 до 80% генов, свойственных спорофиту, в том числе содержатся липиды и токоферолы. В нашем случае работа с мужским гаметофитным поколением не представляет трудности, так как растение подсолнечника продуцирует за период цветения около 1 г пыльцы.

Установлено, что состав токоферолов пыльцы "обычного" подсолнечника содержит 85% а-токоферола и 15% у-токоферола, что сопоставимо с составом токоферолов в семенах (табл. 2).

Мутация по гену 1рк1, контролирующая соотношение ос/р-токо-феролов в семенах, довольно четко проявляется и в пыльце. Мутация по гену /рИ2 (соотношение а/у-токоферолов), в пыльце содержит 15% а-

токоферола и 85% у-токоферола, что приближается к содержанию этих веществ в семенах.

Таблица 2

Состав токоферолов семян и пыльцы различных генотипов

1996 г.

Генотип Состав токоферолов, %

семена пыльца

а Р У 5 а Р У б

ТрМ, ТрИ2 95 сл 5 0 85 сл 15 0

1рМ, Трк2 50 50 0 0 60 40 0 0

ТрЫ, фк2 5 0 95 0 15 0 85 0

1рИ1,1рИ2 сл сл 50 50 сл сл 50 50

ТрЫ, Трк2фк2 95 сл 5 0 60 0 40 0

ТрМгрЫ, ТркИрЪ2 95 сл 5 0 30 20 30 20

Примечание: сл - следовые количества.

Двойная гомозигота показала полное совпадение состава токоферолов в семенах и в пыльце. В связи с рецессивностью токоферольных мутаций обнаружить их в гетерозиготном состоянии не представляется возможным. Однако в пыльце они надежно идентифицируются. Состав токоферолов пыльцы гетерозиготных растений по гену имеет промежуточное соотношение, то есть 60% а-токоферола и 40% у-токоферола. Пыльца генотипов гетерозиготных по двойной мутации содержит все четыре основные формы токоферолов.

Как отмечалось ранее, основная роль в повышении оксистабильности масла определяется составом жирных кислот. Установлено, что различия в накоплении олеиновой кислоты в обычных и высокоолеиновых генотипах подсолнечника обнаруживаются с первых дней синтеза жирных кислот (рис. ЗА). У обычных генотипов: гибрида Полевик и сорта Березанский, наблюдаются резкие пикообразные изменения содержания олеиновой кислоты в период интенсивного маслообразовательного процесса Детальный анализ динамики накопления олеиновой кислоты позволил обнаружить положительную корреляцию между содержанием этой кислоты у вышеуказанных генотипов и минимальной суточной температурой (г = 0,80).

У высокоолеинового гибрида Краснодарский 885 уже на 6 день после опыления доля олеиновой кислоты составила 72% и в дальнейшем увеличивалась до 20 дня после опыления, превысив уровень 90% от суммы кислот.

Олеиновая Линолевая

Рис. 3. Динамика накопления ненасыщенных жирных кислот. А, Б — в относительных; В, Г — в абсолютных единицах.

Следовательно, процесс синтеза олеиновой кислоты в семенах данного к гибрида от температурных условий не зависит.

По абсолютному содержанию олеиновой кислоты в семенах (рис. ЗВ), гибрид Краснодарский 885 примерно в два раза превосходит все остальные генотипы с первых дней начала процесса маслообразования. Необходимо отметить, что накопление олеиновой кислоты, выраженное в абсолютных единицах, прекращается на 30 день после опыления. В дальнейшем вся синтезируемая олеиновая кислота в результате реакции десатурации превращается в линолевую.

Основной жирной кислотой в семенах .обычных генотипов подсолнечника является линолевая. Различия в накоплении линолевой кислоты между обычными и высокоолеиновым (Краснодарский 885) генотипами

подсолнечника также обнаруживаются с первых дней синтеза жирных кислот (рис. ЗБ).

Концентрация этой кислоты у нормальных генотипов: гибрида Полевик и сорта Березанский, отрицательно коррелирует с минимальной суточной температурой (г=-0,80). Максимальное количество линолевой кислоты накапливается на 40 день после опыления, что соответствует фазе физиологической спелости семян подсолнечника (рис. ЗГ).

В семенах высокоолеинового гибрида Краснодарский 885 относительно низкое содержание линолевой кислоты в первые дни после опыления довольно резко снижается с 12,8 до 4,4% и с 15 дня и до конца созревания составляет всего около 3% (см. рис. ЗБ). В этот период она практически не синтезируется, что можно видеть из графика абсолютного ее накопления в семенах (см. рис ЗГ)- Незначительное ее содержание обусловлено генетическими особенностями гибрида Краснодарский 885, у которого заблокирована реакция десатурации олеиновой кислоты в линолевую, контролируемая геном 01.

4. Методы создания аналогов линий с повышенной оксистабильностью масла.

Основанием для разработки методов создания изогенных линий с изменённым составом токоферолов и жирных кислот послужило обнаружение экспрессивности этих признаков в определённые фазы онтогенеза.

Установлено, что идентифицировать генотип растения подсолнечника по признаку состав токоферолов можно на основании соотношения этих веществ в пыльце. Весьма важно подчеркнуть, что анализ пыльцы открывает единственную возможность выявить гетерозиготное состояние растения. Это обстоятельство легло в основу способа создания изогенных линий по рецессивному признаку семени (Патент на изобретение № 2151495 от 27.06.2000 г.).

Сущность способа (рис. 4): реципиент (Р[) скрещивают с донором (Р2) рецессивного гена я, а затем - с гибридами первого поколения (Т]), что приводит к образованию фенотипически не однородных семян первого поколения беккросса (ВС]), 50% которых имеют генотип АА и 50% - генотип Ла.

С нескольких растений, выросших из этих семян, индивидуально собирают пыльцу и на основании анализа состава токоферолов выделяют гетерозиготные растения. Их используют в качестве отцовской формы для получения следующего поколения беккросса. Преимущества этого способа обусловлены определением генотипа растения до начала гибридизации и использованием для скрещивания только особей с искомым состоянием признака. Эффективность метода заключается в существенном снижении , объёмов работ (в 5 раз) и количества необходимых анализов (в 10 раз).

Р) АА х аа Р2 Ф

Р, АА х Аа Б, £

ВС| - отбор пыльцы на биохимический анализ

е? Ъ

браковка растений ВС,-50% АА 50% Аа х Р) АА

вс2...

и т. д. до ВС„

Два поколения самоопыления и отбор аа изогенной линии.

Рис. 4. Схема получения изогенной линии по рецессивному признаку семени у растений

Усломые обозначения:

а - передаваемая аплель; Р| - гибрид первого поколения;

Р: - реципиент; ВС - беккросс;

Ра- донор; п - необходимое число беккроссов.

На этом и следующем рисунках, схемы получения изогеяных линий приводятся в общем виде. Это связано с тем, что они применимы для всех культур, у которых имеет место аналогия при идентификации признаков.

Результаты исследований по динамике накопления олеиновой кислоты показали возможность идентификации высокоолеиновых фенотипов на шестой день после опыления. Известно, что незрелые семена подсолнечни-

ка в возрасте 8-15 дней после опыления могут прорастать, давая нормальные полноценные растения.

Установлено, что оптимальным сроком отбора незрелых семянок для анализа состава жирных кислот и последующего проращивания является 12-14 дней после опыления. Все семянки взятые в этот период для анализа прорастали на питательной среде и в то же время содержали количество ли-пидов (не менее 5 мг) достаточное для определения состава жирных кислот.

Полученные данные по биосинтезу олеиновой кислоты и специфике недозрелых семян послужили основанием для разработки способа создания изогенных линий по доминантному признаку семени (Патент на изобретение № 2151494 от 27.06.2000 г.).

Сущность способа (рис. 5): реципиент (Р|) скрещивают с донором доминантного гена А, а затем с гибридами первого поколения (БО, что приводит к образованию фенотипически не однородных семян первого поколения беккросса (ВС|), 50% которых имеют генотип аа и 50% — генотип Аа.

Р] аа х АА Р2

■О-

Р1 аа х Аа Е|

£

ВС| - отбор 12-14 дневных семянок, 2/3 семядолей с зародышем высаживают на питательную среду, а 1/3 используют на биохимический анализ

браковка растений ВС) - 50% да 50% Аа х Р| аа

£

ВСг... ит. д. доВС„ Два поколения самоопыления и отбор АА изогенной линии

Рис. 5. Схема получения изогенной линии по доминантному признаку семени у растений

Условные обозначения:

А - передаваемая аллель; Р| - гибрид первого поколения;

Р1 - реципиент; ВС - беккросс;

Рг- донор; п - нужное число беккроссов.

Спустя 12-14 дней после оплодотворения семена извлекают из корзинки и сразу же, не давая им подсохнуть, в стерильных условиях освобождают от плодовой и семенной оболочек. Отделяют 2/3 семядолей с осевыми органами зародыша и высаживают на питательную среду. Оставшуюся 1/3 семядолей используют для проведения биохимического анализа состава жирных кислот, на основании которого определяют гетерозиготные растения. Их используют в качестве отцовской формы для получения следующего поколения беккросса. Преимущества этого способа связаны, во-первых, с определением генотипа растения до начала гибридизации и использованием для скрещивания только особей с искомым состоянием признака (Olol). Во-вторых, с сокращением времени одной генерации на 55-70 дней за счет исключения фаз созревания и послеуборочного дозревания семян

В настоящее время теоретически обоснована и подтверждена практически возможность создания гибридов подсолнечника с максимальной ок-систабильностью масла. Для этого необходимо получить аналоги линий по генам, контролирующим высокое содержание олеиновой кислоты (Ol) и состав токоферолов (tphl, tphl).

Создание аналогов селекционных линий одновременно но двум генам сопровождается большими трудностями, связанными с поиском двойной ге-терозиготы в беккроссных растениях. Это предполагает расширение выборки, а в нашем случае ещё и увеличение количества проводимых анализов.

Разработанные нами самостоятельные способы создания изогенных линий по доминантным и рецессивным генам удачно дополняют друг друга. А их совмещение позволяет устанавливать двойную (и даже тройную) гете-розиготу до скрещивания, и для дальнейшего проведения беккроссов использовать только те растения, которые содержат искомые сочетания генов. Тем самым существенно сокращается длительность создания аналогов.

Ускоренный способ создания изогенных линий по составу токоферолов и жирных кислот осуществляется следующим образом. Реципиент (Pi) скрещивают с донором доминантного Ol и рецессивного генов tph2, а затем с полученными гибридами первого поколения (Fi). Это приводит к образо-

ванию фенотипически неоднородных семян первого поколения беккросса (ВС|), 25% которых имеют генотип ОЫ Трк2Трк2, 25% - генотип О1о1 Трк21рк2,25% - генотип о1о1 Трк2Трк2 и 25% - генотип о1о1 Трк2(рк2 (рис. б).

Pi ololTpk2Tpk2 х OlOltpk2tph2 Р2 £

Р, olol Трк2Трк2 х OlolTpk2tpk2 F, £

ВС) - отбор 12-14 дневных семянок, 2/3 семядолей с зародышем высаживают на питательную среду, а 1/3 используют на биохимический анализ

t? Ъ

браковка рас! ений ВС, - 25% olol Tph2Tpk2 25% Olol* Tpk2Tph2

- 25% olol Tpk2tph2 25% Olol Tpk2tpk2

&

BCi - отбор пыльцы на биохимический анализ

Ú Ъ

браковкарастелий ВС, - 50% Olol Tpk2Tph2 50% Olol Tph2tph2 х olol Трк2Трк2 Р,

-О-

ВС2...

и т. д. до ВС„

Два поколения самоопыления и отбор Olol ipk2tpk2 изогенной линии.

Рис. 6. Схема получения изогенной линии по доминантному и рецессивному признаку семени у подсолнечника

Условные обозначения: OI, tpk2 - передаваемые аллели; F, - гибрид первого поколения;

Р, - реципиент; ВС - беккросс;

?2 ~ Донор; л - необходимое число беккроссов.

* - жирным шрифтом выделены искомое состояние генотипа

Спустя 12-14 дней после оплодотворения семена извлекают из корзинки и сразу же, не давая им подсохнуть, в стерильных условиях освобождают от плодовой и семенной оболочек. Отделяют 2/3 семядолей с осевыми органами зародыша и высаживают на питательную среду. Оставшуюся 1/3 семядолей используют для проведения биохимического анализа состава жирных

кислот. В результате определяют гетерозиготные растения, у которых количество олеиновой кислоты превышает 75% от суммы кислот. Приблизительно половина анализируемых растений соответствует генотипу Olol.

Через 5-7 дней, т.е. до образования первой пары настоящих листьев, проростки с генотипом Olol и хорошо развитой корневой системой переносят в камеру искусственного климата или высаживают в поле. С этих растений в начале цветения собирают пыльцу, которая у гетерозиготных растений состоит из смеси пыльцевых зерен с генами Tph2 и tph2. Гаплоидное состояние пыльцы позволяет на основании анализа её химического состава безошибочно отличить гетерозиготы Tph2tph2, которые в качестве отцовской формы используют для получения очередного поколения беккросса. Семена от второго беккросса, сформировавшиеся на растениях Р], через 1214 дней после опыления отбирают для вовлечения в следующий цикл бек-кроссов. После проведения необходимого числа беккроссов (обычно 5-7), растения самоопыляют и в F2 по результатам определения состава токоферолов, а затем и состава жирных кислот отбирают семена с генотипом Olol tph2tph2 и OlOl tph2tph2. Растения, выросшие из этих семянок самоопыляют и в Г'з отбирают те растения, которые не дают расщепления по составу жирных кислот и соответствуют генотипу OlOl tph2tph2.

Таким образом, благодаря высокой точности проведения гибридизации, разработанный нами ускоренный способ сокращает объем скрещиваний в 9-15 раз и количество необходимых биохимических анализов в 6-10 раз, т. с. снижается трудоемкость и себестоимость процесса создания изо-генных линий по составу токоферолов и жирных кислот. А исключение фаз созревания и послеуборочного дозревания семян позволяет создавать аналоги всего за два года.

5. Создание аналогов родительских линий коммерческих гибридов подсолнечника с измененным составом жирных кислот н токоферолов.

В результате применения вышеописанных методов созданы аналоги материнских (табл. 3) и отцовских (табл. 4) селекционных линий с высоким

содержанием олеиновой кислоты и различным сочетанием мутаций по составу токоферолов.

Таблица 3

Аналоги материнских селекционных линий подсолнечника по мутациям Ol, tphl и tph2

2002 г.

Фенотип

Линия Мутация Cl8 1, состав токоферолов, %

% а ß У 5

ВК 678' tphl 40 50 50 0 0

ВК876* Ol, tphl, tph2 90 сл сл 50 50

аналог Ol, tphl 90 50 50 0 0

ВК 639' 37 95 5 г 0

аналог Ol, tph2 90 10 0 90 0

ВК 464' Ol 90 95 5 2 0

аналог Ol, tphl, tph2 90 сл сл 50 50

аналог Ol, tph2 90 10 0 90 0

аналог Ol, tphl 90 50 50 0 0

ВК 653' 30 95 5 2 0

аналог Ol, tph2 87 30 0 70 0

аналог Ol 89 95 5 2 0

---р'—-.——— ----—

Примечание: - линия реципиент, - ß+y -изомеры, *- внесена в Госреестр с 2002 г.

Таблица 4

Аналоги отцовских селекционных линий подсолнечника по мутациям 01, грк1 и 1рИ2

2002 г.

Фенотип

Линия Муыция Ci8:l) CUCidB юкофиролов, %

% а ß У 5

ВК 571' tphl 28 50 50 0 0

ВК175* Ol, tph2 88 10 0 90 0

аналог Ol, tphl 88 50 50 0 0

ВК 541' Ol 90 95 5 2 0

аналог Ol, tph2 90 10 0 90 0

ВК 580' 25 95 5 2 0

аналог Ol, tph2 88 10 0 90 0

аналог Ol 92 95 5 2 0

ВК 591' 28 95 5 2 0

аналог Ol, tphl, tph2 90 сл сл $0 50

аналог Ol, tph2 90 5 0 95 0

аналог Ol, tphl 90 50 50 0 0

-.-г'-- 2------

Примечание: - линия реципиент, - ß+y -изомеры, *- внесена в Госреестр с 2002 г.

Практический результат проведенных исследований подкрепляется авторскими свидетельствами на линии ВК 876 и ВК 175.

Для проверки прогноза проявления признаков качества масла в семенах были получены экспериментальные гибриды, являющиеся аналогами коммерческих гибридов подсолнечника. Результаты изучения состава жирных кислот и токоферолов в масле из семян F2, полученных при групповом опылении представлены в табл. 5 и 6 (соответственно).

Высокоолеиновые аналоги трехлинейных гибридов Кубанский 341 и Кубанский 371 показали стабильно высокое содержание олеиновой кислоты (около 90%).

Таблица 5

Состав жирньпс кислот масла экспериментальных гибридов подсолнечника при групповом опылении

2001 г.

Сорт, гибрид Генотип Состав жирных кислот, % от суммы

С 16:0 С 180 С lg-l С 18:2

Круиз (контроль) 01- 5,1 2,7 80,3 11,9

Кубанский 341' 0101 4,8 2,5 91,1 1,6

Кубанский 371' 0101 5,0 3,2 89,9 1,9

HCPos 0,67

Примечание:1 - аналог

Аналог трехлинейного гибрида Кубанский 481 по мутациям и грк2 четко проявил мутантный фенотип по составу токоферолов.

Таблица 6

Состав токоферолов в масле экспериментального гибрида подсолнечника при групповом опылении

2003 г.

Сорт, гибрид Генотип Состав токоферолов, % от суммы

а 3 У 5

Круиз (контроль) TphlTphl Tph2Tph2 95 5 1 0

Кубанский 481' tphltphl tph2tph2 37 13 35 15

--1--j-

Примечание: - аналог, - Р+у -изомеры

Таким образом, создание изогенных линий материнских и отцовских форм подсолнечника обеспечит получение аналогов коммерческих гибридов с измененным составом жирных кислот и токоферолов в семенах.

ВЫВОДЫ

1. Состав токоферолов и жирных кислот в семенах различных генотипов подсолнечника оказывает существенное влияние на устойчивость масла к окислению. Увеличение содержания сильных в антиоксидантном отношении ¡3- и у-форм токоферолов приводит к повышению оксистабильности от 1,3 до 3,5 раз. Высокое содержание олеиновой кислоты около 90% у гибрида Краснодарский 885 вызывает увеличение индукционного периода в окислении в 10 раз по отношению к обычному маслу.

2. Различная экспрессивность мутации ¡рИ2 в гомозиготе выражается в варьировании содержания у-формы в токоферольном комплексе от 20 до 95%. Около половины этой изменчивости определяется генотипом (Ь2 = 0,53). Выделены сублинии ВК66 фИ2 с минимальным (20%) и максимальным (95%) содержанием у-токоферола, которое обусловлено влиянием ге-нотипической среды.

3. Индивидуальный многократный отбор в пределах фенотипа двойной гомозиготы по мутациям 1рИ1 и грН2 позволил получить генотипиче-ский класс с отсутствием а- и р-токоферолов при стабильном содержании в эквивалентных количествах (по 50%) у- и 8-форм, обладающих самыми сильными антиокислительными свойствами.

4. Диламика накопления сухого вещества, свободных липидов, луз-жистости, общего содержания токоферолов, кислотного и перекисного чисел при созревании семян различных генотипов характеризуется однотипностью для каждого признака. Существенные отличия обнаружены для гибрида Краснодарский 917, в составе токоферолов которого с 6-го дня после опыления и до конца созревания наблюдается повышенное содержание Р-формы 65% и 40%, соответственно. У гибрида Краснодарский 885, проявляющего признак высохоолеиновости, содержание олеиновой кислоты в фазу 6-ти дневных семян составило 72% и к концу созреваЕИЯ достигло более 90%.

5. Между содержанием линолевой кислоты в период интенсивного маслообразовательного процесса и минимальной суточной температурой

воздуха накануне проведения отбора проб у форм подсолнечника с обычным генотипом по составу жирных кислот существует высокая отрицательная корреляция (г = 0,80).

6. Мутации 1рЫ и 1рЬ2, контролирующие состав токоферолов в семенах подсолнечника, обладают экспрессивностью в пыльце всех генотипов • гомозиготных по этому признаку. Состав токоферолов пыльцы гетерози-

готных генотипов показывает промежуточное состояние между соответствующими гомозиготными вариантами. > 7. Идентификация и отбор гетерозиготных растений по анализу токо-

феролов пыльцы отдельных корзинок перед скрещиванием позволяет получать изогенные линии по рецессивным мутациям состава токоферолов в семенах на основе непрерывной схемы беккроссов. Это сокращает объем скрещиваний в 5 раз и число биохимических анализов в 10 раз.

8. Определение состава жирных кислот в части семядолей недозрелых семян в возрасте 12-14-ти дней после опыления с последующим выращиванием гетерозиготных растений позволяет в 2 раза сократить срок создания высокоолеиновых изогенных линий благодаря исключению периодов созревания и послеуборочного дозревания семян.

9. Совмещение способов создания изогенных линий по доминантным и рецессивным генам позволяет устанавливать двойную (и даже тройную) гетерозиготу до скрещивания, и для дальнейшего проведения беккроссов использовать только те растения, которые содержат искомые сочетания генов. Благодаря высокой точности проведения гибридизации объем скрещиваний уменьшается в 9-15 раз, а количество необходимых биохимических анализов - в 6-10 раз. Срок создания аналогов родительских линий сокращается до 2-х лет.

10. На основе разработанных методов созданы аналоги четырех мате) ринских (ВК464, ВК639, ВК678 и ВК653) и четырех отцовских (ВК541,

ВК571, ВК580 и ВК591) селекционных линий с высоким содержанием олеиновой кислоты, а также с различным сочетанием (3-, у- и 5-форм токоферолов.

11. Высокоолеиновые аналоги трехлинейных гибридов Кубанский 341 и Кубанский 371 содержат около 90% олеиновой кислоты. Аналог трехлинейного гибрида Кубанский 481 по мутациям грЬ1 и 1ф2 обладает одновременно повышенным содержанием Р- (13%), у- (35%) и 8- (15%) форм в то-коферольном комплексе.

РЕКОМЕНДАЦИИ ДЛЯ СЕЛЕКЦИОННОЙ ПРАКТИКИ

1. При селекции подсолнечника на увеличение окислительной стабильности масла на основе изменения состава токоферолов и жирных кислот в семенах предлагается использовать серию из аналогов селекционных родительских линий по мутациям tphl, tph2 и 01.

2. Отбор гетерозигот при создании изогенных линий по признаку со-• става токоферолов необходимо проводить на основе биохимического анализа пыльцы. Использовать отобранные растения следует в качестве отцовской формы при беккроссировании.

3. При создании изогенных линий по доминантному признаку высо-коолеиновости анализ состава жирных кислот целесообразно проводить в семядолях 12-14-ти дневных недозрелых семян и с последующим выращиванием гетерозиготных растений из части семени.

4. Для создания аналогов родительских линий сочетающих признаки высокоолеиновости и измененного состава токоферолов следует использовать разработанный ускоренный способ.

Основные положения диссертации изложены в следующих статьях:

1. Попоз П.С., Демурин Я.Н., Рукина З.Е., Ефименко С.Г. Новые типы масла из семян подсолнечника/ЛГехнические культуры. - 1992. - №3. - С. 13-16

2. Loskutov A., Demurin Ya., Obraztsov I., Bochkarev N., Turkav S., Efimenko S. Isozymes, tocopherols and fatty acids as seed biochemical markers of genetic purity in sunflower/,'Helia. - 1994. - V.17, №21. - P. 5-10.

3. Demi-rin Ya., Skoric D., Popov P., Efimenko S., Boclikovoj A. Tocopherol genetic in sunflower breeding for oil quality//Proc. EUCARPIA Symp. Breeding Oil Protein Crops, Albena, Bulgaria. - 1994. - P.193-196.

4. Ефименко С.Г. Биохимическая характеристика гибридов подсолнечника с измененным составом жирных кислот и токоферолов//Проблемы генетики, селекции и возделывания масличных культур. (Материалы научно-теоретической конференции молодых ученых, г. Запорожье, 5-6 апреля 1994 г.). - Запорожье, 1995. - С. 5-6.

5. Ефименко С.Г. Влияние минимальной суточной температуры на содержание ненасыщенных жирных кислот в процессе созревания семян раз-

личных генотипов подсолнечника//Научно-технический бюллетень ВНИ-ИМК. - Краснодар, 1998. - Вып. 119. - С. 18.

6. Ефименко С.Г. Изменчивость содержания у-токоферола в семенах аналогов линий подсолнечника по гену ¡"/^//Научно-технический бюллетень ВНИИМК. - Краснодар, 1999, - Вып. 120. - С. 8-10.

7. Ефименко С.Г. Способ получения изогенной линии по доминантному признаку семени у растений. - Патент на изобретение № 2151494, Москва, 27 июня 2000 г.

8. Ефименко С.Г. Способ получения изогенной линии по рецессивному признаку семени у растений. - Патент на изобретение № 2151495, Москва, 27 июня 2000 г.

9. Ефименко С.Г., Образцов И.С. Мутационный анализ и селекционное использование особенностей биосинтеза токоферолов у гюдсолнечни-ка//Научно-технический бюллетень ВНИИМК. - Краснодар, 2001. - Вып. 124. -С. 25-30.

Ю.Ефименко С.Г., Ефименко С.К. Ускоренный способ получения изо-генных линий подсолнечника по признакам качества масла//Современные проблемы генетики, биотехнологии и селекции растений. (Сб. тезисов международной конференции молодых ученых 2-7 июля 2001 г.). - Харьков, 2001.-С. 166-167.

11 .Демурин Я.Н., Попов П.С., Ефименко С.Г. Гибридологический анализ признака высокоолеиновости масла семян подсолнечника//Научно-технический бюллетень ВНИИМК. - Краснодар, 2001. - Вып. 125. - С. 3-20.

12.Ефименко С.Г., Антонова Т.С., Бочкарев Н.И., Бочковой А.Д. и др. Подсолнечник ВК 876//Авторское свидетельство №37902.

13.Ефименко С.Г., Антонова Т.С., Бочкарев Н.И., Бочковой А.Д. и др. Подсолнечник ВК 175//Авторское свидетельство №37904.

14.Демурин Я.Н., Ефименко С.Г., Ефименко С.К. Генетический потенциал в создании экологически чистых и энергосберегающих тех нологий получения растительных масел с заданными параметрами качест-ва//Приоритет России XXI века: от биосферы и техносферы к ноосфере. (Сб. материалов Международной научно-практической конференции). -Пенза, 2003. - С. 57-59.

Лицензия ИД 02334 14.07.2000.

Подписано в печать 23.07.2003. Формат 60 х 84

Бумага офсетная Офсетная печать

Печ.л. 1 Заказ №436-Тираж 100

Отпечатано в типографии КубГАУ, 350044, Краснодар, Калинина, 13

«

í *

i

I "l

f

I }

i

í

T

1

í I

IM 2 5 5 6

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Ефименко, Сергей Григорьевич

ВВЕДЕНИЕ.

1. СЕЛЕКЦИЯ ПОДСОЛНЕЧНИКА НА КАЧЕСТВО МАСЛА

Обзор литературы).

1Л. Селекция на качество масла.

1.2. Биохимия токоферолов.

1.3. Генетика токоферолов.

1.4. Биохимия жирных кислот.

1.5 Генетика состава жирных кислот у подсолнечника.

2. УСЛОВИЯ, МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

3. ИЗУЧЕНИЕ ОКСИСТАБИЛЬНОСТИ МАСЛА РАЗЛИЧНЫХ ГЕНОТИПОВ.

3.1. Влияние состава токоферолов на оксистабильность масла.

3.2. Влияние состава жирных кислот на оксистабильность масла.

4. ОСОБЕННОСТИ НАКОПЛЕНИЯ у- И 8-ТОКОФЕРОЛОВ

У МУТАНТОВ ПОДСОЛНЕЧНИКА.

4.1. Экспрессивность мутации tph2 в различных генотипических средах

4.2. Создание генотипов подсолнечника со стабильно высоким содержанием 5-токоферола на основе двойной мутации tphltph2 . 53 5. ХАРАКТЕРИСТИКА MACЛООБРАЗОВАТЕЛЬНОГО ПРОЦЕССА, СОСТАВА ТОКОФЕРОЛОВ И ЖИРНЫХ КИСЛОТ В ОНТОГЕНЕЗЕ

РАЗЛИЧНЫХ ГЕНОТИПОВ.

5.1. Динамика показателей маслообразовательного процесса в семенах

5.2. Состав токоферолов.

5.2.1. Динамика синтеза токоферолов в семенах.

5.2.2. Состав токоферолов пыльцы.

5.3. Динамика синтеза жирных кислот в семенах.

6. МЕТОДЫ СОЗДАНИЯ АНАЛОГОВ ЛИНИЙ С ПОВЫШЕННОЙ

ОКСИСТАБИЛЬНОСТЬЮ МАСЛА.

6Л. Метод получения аналогов линий с разным составом токоферолов.

6.2. Ускоренный способ получения аналогов линий с высоким содержанием олеиновой кислоты.

6.3. Усовершенствование схемы беккроссов для одновременной селекции на состав токоферолов и жирных кислот.

7. СОЗДАНИЕ АНАЛОГОВ РОДИТЕЛЬСКИХ ЛИНИЙ КОММЕРЧЕСКИХ ГИБРИДОВ ПОДСОЛНЕЧНИКА С ИЗМЕНЕННЫМ СОСТАВОМ ЖИРНЫХ КИСЛОТ И ТОКОФЕРОЛОВ.

ВЫВОДЫ.

РЕКОМЕНДАЦИИ ДЛЯ СЕЛЕКЦИОННОЙ ПРАКТИКИ.

Введение Диссертация по сельскому хозяйству, на тему "Использование мутаций состава токоферолов и жирных кислот в селекции подсолнечника на качество масла"

В последние годы наблюдается принципиально новый этап в селекции растений на качество масла, заключающийся в преодолении видовых пределов наследственной изменчивости состава жирных кислот семян и получении масел планируемых типов. Прогрессивное развитие работ в этом направлении определяется тремя главными причинами. Во-первых, потребностью перехода на экологически чистые и энергосберегающие технологии в области получения необходимого спектра пищевых, лекарственных и технических масел. Этого вполне реально добиться в результате искусственного преобразования механизмов биосинтеза веществ в растении, использующих неисчерпаемую солнечную энергию, а не только за счёт совершенствования промышленных технологических процессов. Во-вторых, крупными достижениями в липидологии, включая биохимию и медицину, открывших важную роль липидов в жизни растений, животных и человека. И, наконец, экспериментальными успехами молекулярной биологии в целенаправленной модификации запасных жиров растений методами генной инженерии. Качество масла, т.е. его пищевые, биологические и технологические свойства, зависит от состава и молекулярного положения жирных кислот в триацилглицеролах, а также от наличия различных жирорастворимых сопутствующих компонентов, таких, как токоферолы, стеролы, пигменты и др. Селекция растений на улучшение качества масла заключается в создании сортов и гибридов с новым типом масла, определяемым характером его использования. При этом возможен отбор генотипов как на экстремальные проявления признака, т.е. минимум или максимум, так и на оптимальное содержание определённого вещества или группы веществ.Очевидно, что для каждого типа масла существуют индивидуальные параметры качества. В отличие от селекции на увеличение урожая, когда признаки продуктивности и устойчивости к болезням, вредителям и абиотическим стрессам реально проявляются в поле при уборке урожая, селекция на улучшение качества ведётся с признаками химического состава семян, формирующимися в растении и переходящими в сырье и продукты технологической переработки. Одной из важных проблем улучшения качества масла подсолнечника, основной масличной культуры нашей страны, является повышение его устойчивости к автоокислению с целью предотвращения накопления токсичных продуктов прогоркания в процессе его хранении и использовании. При разработке генетических основ селекции подсолнечника на увеличение окислительной стабильности масла следует учитывать, что этот признак определяется многими факторами различной природы. К числу наиболее значимых факторов относится степень ненасыщенности жирных кислот, положительно коррелирующая со способностью к окислению, и наличие естественных антиоксидантов, прежде всего токоферолов, препятствующих процессу свободнорадикального окисления. Цель настоящих исследований изучение особенностей использования мутаций состава токоферолов и жирных кислот в селекции подсолнечника на качество масла. В задачи исследований входило решение следующих вопросов: 1. Изучить оксистабильность масла различных генотипов. 2. Определить особенности накопления у- и 5-форм в семенах мутантов по составу токоферолов. 3. Дать сравнительную характеристику маслообразовательного процесса, состава токоферолов и жирных кислот в онтогенезе различных генотипов.Разработать эффективные методы создания аналогов линий с повышенной оксистабильностью масла. 5. Создать аналоги селекционных линий и гибридов с измененным составом токоферолов и жирных кислот в семенах. Научная новизна исследований. Впервые показано проявление мутации высокоолеиновости 01 у 6-ти дневных недозрелых семян подсолнечника. Обнаружено проявление мутаций состава токоферолов tphl и tph2 в пыльце подсолнечника. Показана возможность идентификации гетерозигот по рецессивным мутациям состава токоферолов на основе анализа пыльцы отдельных растений подсолнечника. Созданы сублинии с высоким (95%) и низким (20%) содержанием у-формы в токоферольном комплексе семян по tph2 мутации на генотипической среде линии ВК 66. Получены двойные гомозиготные tphl, tph2 линии подсолнечника, накапливающие в семенах только у- и 5-токоферолы в эквивалентных количествах. Практическая ценность результатов. Предложена и апробирована схема беккроссов для создания аналогов линий с измененным составом токоферолов, основанная на идентификации гетерозигот по составу токоферолов пыльцы. В этом случае генотип беккроссных растений определяется до начала проведения гибридизации, что позволяет сократить количество скрещиваний и число биохимических анализов. Предложен и апробирован метод ускоренного создания высокоолеиновых аналогов, в основе которого лежит идентификация гетерозиготных генотипов по фенотипу семядолей недозрелых семянок через 12-14 дней после опыления и выращивание отобранных зародышей с исключением стадии созревания и покоя семян. На основе разработанных методов созданы аналоги восьми селекционных родительских линий ВК678, ВК639, ВК464, ВК653, ВК571, ВК580, ВК541 и ВК591 с высоким содержанием олеиновой кислоты и различными комбинациями высокого содержания Р-, у- и 5-форм токоферолов. Эти изогенные линии могут быть использованы при создании аналогов гибридов серии "Кубанский 341, 371, 480, 481, 930, 931" с увеличенной оксистабильностью масла. Основные положения, выносимые на защиту. 1. Увеличение окислительной стабильности масла за счет наследственных изменений состава токоферолов и жирных кислот семян. 2. Метод создания изогенных линий по рецессивному признаку семян на основе экспрессивности мутаций состава токоферолов в пыльце. 3. Метод создания изогенных линий по доминантному признаку на основе экспрессивности мутации высокоолеиновости у 12-ти дневных недозрелых семян.

Заключение Диссертация по теме "Селекция и семеноводство", Ефименко, Сергей Григорьевич

ВЫВОДЫ

1. Состав токоферолов и жирных кислот в семенах различных генотипов подсолнечника оказывает существенное влияние на устойчивость масла к окислению. Увеличение содержания сильных в антиоксидантном отношении Р~ и у-форм токоферолов приводит к повышению оксистабильности от 1,3 до 3,5 раз. Высокое содержание олеиновой кислоты около 90% у гибрида Краснодарский 885 вызывает увеличение индукционного периода в окислении в 10 раз по отношению к обычному маслу.

2. Различная экспрессивность мутации tph2 в гомозиготе выражается в варьировании содержания у-формы в токоферольном комплексе от 20 до 95%. Около половины этой изменчивости определяется генотипом (h2 = 0,53). Выделены сублинии ВК66 tph2 с минимальным (20%) и максимальным (95%) содержанием у-токоферола, которое обусловлено влиянием генотипической среды.

3. Индивидуальный многократный отбор в пределах фенотипа двойной гомозиготы по мутациям tphl и tph2 позволил получить генотипиче-ский класс с отсутствием а- и p-токоферолов при стабильном содержании в эквивалентных количествах (по 50%) у- и 5-форм, обладающих самыми сильными антиокислительными свойствами.

4. Динамика накопления сухого вещества, свободных липидов, луз-жистости, общего содержания токоферолов, кислотного и перекисного чисел при созревании семян различных генотипов характеризуется однотипностью для каждого признака. Существенные отличия обнаружены для гибрида Краснодарский 917, в составе токоферолов которого с 6-го дня после опыления и до конца созревания наблюдается повышенное содержание р-формы 65% и 40%, соответственно. У гибрида Краснодарский 885, проявляющего признак высокоолеиновости, содержание олеиновой кислоты в фазу 6-ти дневных семян составило 72% и к концу созревания достигло более 90%.

5. Между содержанием линолевой кислоты в период интенсивного маслообразовательного процесса и минимальной суточной температурой воздуха накануне проведения отбора проб у форм подсолнечника с обычным генотипом по составу жирных кислот существует высокая отрицательная корреляция (г = -0,80).

6. Мутации tphl и tph2, контролирующие состав токоферолов в семенах подсолнечника, обладают экспрессивностью в пыльце всех генотипов гомозиготных по этому признаку. Состав токоферолов пыльцы гетерозиготных генотипов показывает промежуточное состояние между соответствующими гомозиготными вариантами.

7. Идентификация и отбор гетерозиготных растений по анализу токоферолов пыльцы отдельных корзинок перед скрещиванием позволяет получать изогенные линии по рецессивным мутациям состава токоферолов в семенах на основе непрерывной схемы беккроссов. Это сокращает объем скрещиваний в 5 раз и число биохимических анализов в 10 раз.

8. Определение состава жирных кислот в части семядолей недозрелых семян в возрасте 12-14-ти дней после опыления с последующим выращиванием гетерозиготных растений позволяет в 2 раза сократить срок создания высокоолеиновых изогенных линий благодаря исключению периодов созревания и послеуборочного дозревания семян.

9. Совмещение способов создания изогенных линий по доминантным и рецессивным генам позволяет устанавливать двойную (и даже тройную) гетерозиготу до скрещивания, и для дальнейшего проведения беккроссов использовать только те растения, которые содержат искомые сочетания генов. Благодаря высокой точности проведения гибридизации объем скрещиваний уменьшается в 9-15 раз, а количество необходимых биохимических анализов - в 6-10 раз. Срок создания аналогов родительских линий сокращается до 2-х лет.

10. На основе разработанных методов созданы аналоги четырех материнских (ВК464, ВК639, ВК678 и ВК653) и четырех отцовских (ВК541, ВК571, ВК580 и ВК591) селекционных линий с высоким содержанием олеиновой кислоты, а также с различным сочетанием [3-, у- и 5-форм токоферолов.

11. Высокоолеиновые аналоги трехлинейных гибридов Кубанский 341 и Кубанский 371 содержат около 90% олеиновой кислоты. Аналог трехлинейного гибрида Кубанский 481 по мутациям tphl и tph2 обладает одновременно повышенным содержанием Р- (13%), у- (35%) и 5- (15%) форм в токоферольном комплексе.

РЕКОМЕНДАЦИИ ДЛЯ СЕЛЕКЦИОННОЙ ПРАКТИКИ

1. При селекции подсолнечника на увеличение окислительной стабильности масла на основе изменения состава токоферолов и жирных кислот в семенах предлагается использовать серию из аналогов селекционных родительских линий по мутациям tphl, tph2 и Ol.

2. Отбор гетерозигот при создании изогенных линий по признаку состава токоферолов необходимо проводить на основе биохимического анализа пыльцы. Использовать отобранные растения следует в качестве отцовской формы при беккроссировании.

3. При создании изогенных линий по доминантному признаку высокоолеиновости анализ состава жирных кислот целесообразно проводить в семядолях 12-14-ти дневных недозрелых семян и с последующим выращиванием гетерозиготных растений из части семени.

4. Для создания аналогов родительских линий сочетающих признаки высокоолеиновости и измененного состава токоферолов следует использовать разработанный ускоренный способ.

Библиография Диссертация по сельскому хозяйству, кандидата биологических наук, Ефименко, Сергей Григорьевич, Краснодар

1. Березовский В.М. Химия витаминов. М.: Пищепромиздат, 1973. -632 с.

2. Верещагин А.Г. Биохимия триглицеридов. М.: Наука, 1972. -308 с.

3. Верещагин А.Г. Изменчивость отдельных семян льна по жирно-кислотному составу масла// Биохимия. 1973. - Вып. 38. - С. 573-581.

4. Верещагин А.Г. Влияние фенотипа и генотипа масличных растений на жирнокислотный состав масла.//Физиология растений. -М., 1976. — Т. 23, В. 3.

5. Верещагин А.Г. Триглицериды растений и биологическая изменчивость их состава: Автореф. дис. . д-р. биол. наук. М., 1977.

6. Верещагин А.Г. Закономерности строения и биосинтеза триглицеридов в масличных семенах//Изв. Ан СССР. Биология. 1981. - С. 54-65.

7. Верещагин А.Г. Исследования нейтральных и полярных липидов растений//Новые направления в физиологии. М.: Наука, 1985. - С. 163-174.

8. Владимиров Ю.А., Арчаков А.И. Перекисное окисление липидов в биологических мембранах. М.: Наука, 1972. - 152 с.

9. Воскобойник Л.К., Ткаченко П.И. Наследование содержания олеиновой кислоты в масле семян гибридов подсолнечника//Научно-технический Бюллетень ВНИИМК. Краснодар. - 1987. - Вып.4 (99). - С. 7-9.

10. Гольденберг В.И., Тенцова А.И., Пилько Е.К. Окислительное старение жировых основ и механизм действия антиоксидантов//Химико-фармацевтический журнал. 1978. - № 12. - С. 121-125.

11. Гудвин Т., Мерсер Э. Введение в биохимию растений. М.: Мир, 1986.-Т.2-312 с.

12. Гундаев А.И. Основные принципы селекции подсолнечни-ка//Генетические основы селекции растений. М.: Наука, 1971. - С. 417-465.

13. Демурин Я.Н. Генетический анализ состава токоферолов в семенах подсолнечника//Научно-технический Бюллетень ВИР, Ленинград. -1986. -Вып.165. С. 49-51.

14. Демурин Я.Н. и Бочкарев Н.И. Способ получения изогенной линии по рецессивному признаку семени у растений//Авторское свидетельство №1431094. 1988.

15. Демурин Я.Н., Попов П.С., Антонова Т.С. и Упадхьяя У.К. Состав жирных кислот и токоферолов в каллусе из семян мутантных линий под-солнечника//Научно-технический Бюллетень ВНИИМК. Краснодар. -1990. -Вып.4.- С. 26-29.

16. Демурин Я.Н. Генетический анализ и селекционное использование признаков состава жирных кислот и токоферолов в семенах подсолнечника: Автореф. дис. . д-ра биол. наук. Санкт-Петербург, 1999.

17. Дублянская Н.Ф. Изменения в содержании и составе неомыляе-мой фракции масел при созревании семян подсолнечника. Кр. отчет о научно исследоват. работе ВНИИМКЭМК за 1956г. - Краснодар, 1957.

18. Дублянская Н.Ф. Содержание линолевой кислоты и токоферолов в маслах различных сортов подсолнечника//Вест. сельскохоз. науки. -1960. -№ 6. С. 123-126.

19. Дублянская Н.Ф., Малышева А.Г. Биохимические особенности основных масличных культур//Масличные и эфиромасличные культуры. -М, 1963.-С. 248-262.

20. Дублянская Н.Ф. Состав масла селекционных сортов подсолнеч-ника//Кр. отчет НИР ВНИИЖ за 1961-1962 гг. Краснодар, 1964. - С. 26-34.

21. Дублянская Н.Ф. Особенности маслообразовательного процесса у высокомасличных сортов подсолнечник//Вест. сельскохоз. науки. 1966. -№4.-С. 28-34.

22. Дублянская Н.Ф. Биосинтез жирных кислот в созревающих семенах подсолнечника//Биохимия и физиология масличных культур. (Сб. науч. тр./ ВНИИМК; Выпуск II). - Майкоп, 1967. - С. 177-195.

23. Дублянская Н.Ф., Супрунова JI.B. Жирнокислотный состав масла районированных и перспективных сортов подсолнечника//Масложировая промышленность. 1969. - № 2. - С. 6-9.

24. Дублянская Н.Ф. Химический состав подсолнечникаУ/Подсолнеч-ник.-М, 1975. С.40-50.

25. Журавлев А.И. В сб.: Физико-химические основы авторегуляции в клетках. Труды МОИП. М.: Наука, 1968. - Т. 28. - С. 7-12.

26. Зарубайло Т.Я. Генетические предпосылки создания продуктивных сортов зерновых культур. Тр. по прикл. бот., ген. и сел., 1976. - Т. 58 -Вып. 1 - С. 3-11.

27. Зиновьев А.А. Химия жиров. М.: Пищепромиздат, 1952. - 551 с.

28. Иванов Н.Н. Биохимические основы селекции растений//Тео-ретические основы селекции растений. М. -JL, 1935. - Т. 1. - С. 991-1016.

29. Иванов И.И., Мерзляк М.Н., Тарусов Б.Н. Витамин Е, биологическая роль в связи с антиоксидантным свойствами. Сб. "Биоантиокислители". Труды МОИП. М.: Наука, 1975. - Т.52. - С. 30-52.

30. Клюка В.И., Гусева Т.Е., Гвоздева С.Н. Технология репродуцирования подсолнечника в вегетационных теплицах для ускорения селек-ции//Селекция и семеноводство масличных культур (Сборник научных работ). Краснодар, 1980. - С. 74-78.

31. Кожевникова В.Н. Влияние орошения на качество семян и масла подсолнечника//Вопросы биохимии масличных культур в связи с задачами селекции. (Сб. науч. раб./ВНИИМК). - Краснодар, 1981. - С. 78-99.

32. Кожевникова В.Н. Изменение показателей химического состава семян подсолнечника в зависимости от влагообеспеченности растений: Автореф. дис. . канд. биол. наук. Краснодар, 1982.

33. Кудряшов Б.А. Биологические основы учения о витаминах. М.: Советская наука, 1948. - 543 с.

34. Малышева А.Г. Устойчивость масла различных сортов подсолнечника к окислению//Сборник работ по масличным культурам. Майкоп. - 1966. - Вып.З. - С.52-54.

35. Мережко А.Ф. Система генетического изучения исходного материала для селекции растений (методические указания). Л.: ВИР, 1984. - 70 с.

36. Морозова Т.Б., Миронова А.Н., Слузная Е.М., Пучкова С.М., Яковлева Н.И. О роли а-токоферола в процессе окисления подсолнечных масел//Труды ВНИИЖ. Л. - 1977. - Вып. XXXIII. - С. 31-36.

37. Надиров Н.К. Токоферолы и их использование в медицине и сельском хозяйстве. М.: Наука, 1991. - 336 с.

38. Нечаев А.П., Сандлер Ж.Я. Липиды зерна. М.: Колос, 1975. -160 с.

39. Перестова Т.С., Цухло Л.Г. Строение растений//Биология селекция и возделывание подсолнечника, под ред. В.М. Пенчукова. М.: Агро-промиздат, 1991. - С. 5-7.

40. Попов П.С. О суточном ходе биосинтеза жира и отдельных жирных кислот в семенах подсолнечника//Физиология растений. М., 1973. -Т. 20.-Вып. 5.-С. 900-905.

41. Попов П.С., Осик Н.С. Соединения, сопутствующие жиру и белку в семенах подсолнечника и других масличных культур/ТВопросы биохимии масличных культур в связи с задачами селекции (Сборник научных работ). Краснодар, 1981. - С. 43-59.

42. Попов П.С. Методы определения сопутствующих жиру веществ в семенах//Методические указания по определению биохимических показателей качества масла и семян масличных культур. Краснодар. - 1986. -С. 37-41.

43. Попов П.С., Демурин Я.Н. Мутационная изменчивость и наследование состава токоферолов в семенах подсолнечника коллекции ВИР//Селекция и генетика технических культур, ВИР, Ленинград, 1987. -Т.113.-С. 30-33.

44. Попов П.С., Дьяков А.Б. и Бородулина А.А. и Демурин Я.Н. Генетический анализ состава токоферолов и жирных кислот в семенах подсол-нечника//Генетика. 1988. - Т. XXIV, № 3. - С. 518-527.

45. Попов П.С., Харченко Л.Н. и Демурин Я.Н. Химический состав растений//Биология, селекция и возделывание подсолнечника, под ред. В.М. Пенчукова. -М.: Агропромиздат,1991. С. 28-34.

46. Рамазанова И.Г. Применение этилена для стимуляции прорастания свежеубранных семян подсолнечника//Научно-технический Бюллетень ВНИИМК, Краснодар. -1986. Вып. 3 (94). - С. 29-32.

47. Рокицкий П.Ф. Биологическая статистика.- Минск: Вышейша школа, 1974.-320 с.

48. Руководство по методам исследования, технологическому контролю и учету производства в масложировой промышленности. Д.: ВНИИЖ, 1967.-Т. 1.-Кн. 2.-531 с.

49. Рушковский С.В. Методы исследования при селекции масличных растений на содержание масла и его качество. М.: Пищепромиздат, 1957. -119 с.

50. Семенова Л.И. Кузнецов Д.И. Определение состава токоферолов фотоденситометрическим способом//Масложировая промышленность 1984. -№ 5. С. 17-18.

51. Скурихин И.М., Волгарев М.Н. Химический состав пищевых продуктов//Справочник. М.: Агропромиздат, 1987. - 360 с.

52. Созинов А.А. Полиморфизм белков и его значение в генетике и селекции. М.: Наука, 985. - 272 с.

53. Солдатов К.И., Воскобойник Л.К., Харченко Л.Н. Высокоолеиновый сорт подсолнечника Первенец//Научно-технический Бюллетень ВНИ-ИМК, Краснодар. 1976. - Вйп. 3. - С. 3-7.

54. Тютюнников Б.Н. Химия жиров. М.: Пищепромиздат, 1974. -448с.

55. Ушкалова В.Н. Стабильность липидов пищевых продуктов. М.: ВО "Агропромиздат", 1988. - 152 с.

56. Харченко Л.Н. Определение жирнокислотного состава растительных масел методом газожидкостной хроматографии/ТМасложировая промышленность. 1968. -№ 12. - С. 12-14.

57. Харченко Л.Н., Солдатов К.И. Накопление жирных кислот в ли-пидах семян высокоолеинового мутанта подсолнечника в процессе созре-вания//Физиол. и биохим. культ, растений. 1976. - № 8. - С. 508-513.

58. Харченко J1.H., Бородулина А.А. Накопление и метаболизм жирных кислот в семенах высокоолеинового мутанта подсолнечника//Тез. Докл. VII конф. по подсолнечнику. Краснодар, 1976. - С. 189-190.

59. Харченко Л.Н., Григорьева В.Н., Миронова А.Н. Глицеридный состав масел семян подсолнечника с различным содержанием линолевой и олеиновой кислот//Масложировая промышленность. 1979. - № 10. -С. 13-14.

60. Харченко Л.Н. О гено- и фенотипическом механизме регуляции биосинтеза жирных кислот в семенах подсолнечника//Физиология растений. 1979. - Т.26. - Вып. 6. - С. 1226-1232.

61. Харченко Л.Н. Биосинтез ненасыщенных жирных кислот тригли-церидов семян подсолнечника//Вопросы биохимии масличных культур в связи с задачами селекции. (Сб. науч. раб./ВНИИМК). - Краснодар, 1981. -С. 16-28.

62. Харченко Л.Н. Закономерность накопления липидов и перспективы направленного качества масла семян масличных культур (подсолнечника и горчицы): Автореф. дис. . д-ра биол. наук. Киев, 1981. -48 с.

63. Четвериков С.С. О некоторых моментах эволюционного процесса с точки зрения современной генетики/ЛЛроблемы общей биологии и генетики (Воспоминания, статьи, лекции). Новосибирск. - 1983. - С. 170-226.

64. Шпота В.И., Подколзина В.Е. Наследование содержания эруковой кислоты в масле горчицы' сарептской//Научно-технический Бюллетень ВНИИМК, Краснодар. 1976. - В. 1. - С. 44-46.

65. Шпота В.И., Подколзина В.Е. Низколиноленовые горчично-рапсовые гибриды. Научно-технический Бюллетень ВНИИМК, Краснодар. - 1979 - В. 2 - С. 7-11.

66. Щербаков В.Г. Химия и биохимия переработки масличных семян. М.: Пищевая промышленность, 1977. - 186 с.

67. Эмануэль Н.М., Лясковская Ю.Н. Торможение процессов окисления жиров. М.: Пищепромиздат, 1961. - 359 с.

68. Янишлиева Н., Попов А. Влияние некоторых оксисоединений на автоокисление метиловых эфиров ненасыщенных жирных кислот в начальной стадии процесса.//Изв. Отделения химических наук Болгарской АН. 1971.-Т 4.-№3.-С. 389-400.

69. Andrich G., Balzini S., Zinnai A., Fiorentini R., Baroncelli S., Pugliesi C. The oleic/ linoleic ratio in achenes coming from sunflower lines treated with hard X-rays//Proc. 13th Int. Sunflower Conf., Pisa, Italy. 1992. - P.1544-1549.

70. Appelquist L.A. The chemical nature of vegetable oil//Oil crops of the world, ed. by G. Robbelen et al. 1989. - P.23-37

71. Batty J.F., Katherine M., Schmid M., Ohlrogge J.B. Genetic engineering for plant oils: potential and limitations//Trends in biotechnology. 1989. -V.7 - № 5. - P.122-126.

72. Bauer K., Kangowski E. Changement de composition de I'huile de graines de tournesol pendant de la maturation des matieres grasses. -1934 V. 26-№316-P. 16-18.

73. Beringer H., Nothdurft F. Plastid development and tocochromanol accumulation in oil seeds//Advances in the biochemistry and physiology of plantlipids. Proc. Symp. Amsterdam. - 1979. - P. 133-137.

74. Blomquist G.J., Borgeson C.E., Vundla M. Polyunsaturated fatty acids and eicosanoids in insects//Insect Biochemistry. 1991. - № 1. - P.99-106.

75. Caldironi H.A., Bazan N.G.' Effect of antioxidants on malonaldenyde production and fatty asid composition in pieces of bovine muscle and adipose tissuestored fresh and frozen//J.Food Sci. -1982. V.47. -№ 4. - P. 1329-1336.

76. Camara В., D'Harlingue A. Demonstration and solubilization of S-adenosylmethyonine: y-tocopherol methyltransferase from Capsicum chromo-plasts//Plant Cell Reports. 1985. - V.4, № 1. - P. 31-32.

77. Canvin D.T. The effect of temperature on the oil content and fatty acid composition of the oils from several oilseed crops//Can. J. Botany. 1965. -V.43.-P. 63-69.

78. Chahine M.N., El-Shobaki F.A. The stability of oils and fette foods. The antagonistic effect of the tocopherols to nitrogenous antioxidants in shark liver oil//Grasas у Aceites. 1967. - V. 18. - № 1. - P. 1-4.

79. Chahine M.N., Macneill R.F. Effect of Stabilization of Crude whale Oil with tertiary butylhydroquinone and Other antioxidants upon keeping Quality of resultant deodorized oil. A Feasibility Stydy//J.Amer. Oil Chem.Sjc. -1974. V.51. -№ 3. - P. 37-41.

80. Combs S.B., Combs G.F. Varietal differences in the vitamin E content of corn//J. Agr. Food Chem. 1985. -V.33. -№ 5. - P.815-817.

81. Cort W.M. Anthioxidant activity of tocopherols, ascorbyl palmitate and ascorbic acid and their mode of action//JAOCS. 1974. - V.51. - № 7. -P. 321-323.

82. Demurin Ya.N. Genetic variability of tocopherol composition in sunflower seeds//Helia. 1993. - V. 16. - № 18. - P. 59-62.

83. Demurin Ya., Skoric Dr. Unstable expression of OL gene for high oleic acid content in sunflower seeds//Proc. 14th International Sunflower Conference, Beijing/Shenyang, 12-20 June 1996, China. 1996. - P. 145-150.

84. Demurin Ya., Skoric Dr., Karlovic Dj. Genetic variability of toko-pherol composition in sunflower seeds as a basis of breeding for improved oil quality// Plant Breding. 1996. - V. 115. - P. 33-36.

85. Dorrell D.G. Processing and utilization of oilseed sunflower // Sunflower science and technology, ed. by Carter J.F., Madison, USA. 1978. - P. 407-440.

86. Downes R.W. Factor affecting germination of sunflower under low temperature conditions//Proc. 11th Int. Sunflower Conf., Mar Del Plata, Argentina. 1985.-V. 1.-P. 87-91.

87. Fernandez-Martinez J., Knowles P.F. Maternal and embryo effects on the oleic and linoleic acid contents of sunflower oil//Proc. 10th Int. Sunflower Conf., Surfers Paradise, Australia. 1982. - P. 241-243.

88. Fernandez-Martinez J., Jimenez A., Dominguez J., Garcia J.M., Garces R., Mancha M. Genetic analysis of the high oleic acid content in cultivated sunflower. Euphytica. - 1989. - V. 41.-P. 39-51.

89. Fick G.N. Inheritance of high oleic acid in the seed oil of sunflower// Proc. Sunflower Res. Workshop, National Sunflower Association, Bismarck, ND. 1984. - P.9.

90. Filipescu H., Stoenescu Fl.M. Variability of linoleic acid content in sunflower oil, depending on genotype and environment//Helia. 1978. - № 1. -P. 42-47.

91. Filipescu H., Stoenescu Fl.M. Fatty acid composition and relation to oil content in sunflower cultivars tested in international FAO trials (1978-1979)// Helia. 1981. - № 4. - P. 29-38.

92. Franzke CI. Untersuchungen an reifenden Sonnenblumensamen. Fette und Seifen. 1956. - № 5. - P. 58.

93. Gupta S.K., Walge D.S., Yadava T.P. Effect of environment on fatty acid composition of developing seeds of sunflower {Helianthus annuus L.)//Proc. 11th Int. Sunflower Conf., MarDelPlata, Argentina. 1985. - P. 81-86.

94. Herschberger L.A., Tappel A.L. Effect of vitamin E on pentane ex haled by rats treated vith methylethyl ketone peroxide//Lipids. 1982. - V.17. -№ 10.-P. 686-690.

95. Hilditch T. P. The chemical constitution of natural fats. 1956 -P. 436-471.

96. Hopkins С. V., Cisholm M. J. Defelopment of oil in the seed of Helian-thus annuus L. Canad. Jour, of Biochem. and Physiol. 1961 - V.39. - № 10.

97. Hove E.L., Harris Ph.L. Note on the linoleic acid tocopherol relation-spip in fats and oils//JAOCS. - 1951. - V. 28 - № 9. - P. 405-406.

98. Ivanov P., Ivanov I. Biochemical characteristics of several sunflower muntants//30th Anniversary of Institute "Dobroudja", Sofia, Bulgaria. 1982. -P. 98-102.

99. Jaky M. Einige Angaben zur papirchromatographischen Untersuchung ungarischer Pfianzonole. Nahrung. 1960 - V. 4 - № 12 - P. 1123-1132.

100. Janiszowska W., Rygier J. Changes in the levels of prenylquinones and tocopherols in Calendula officinalis during vegetation//Phisiologia plantarum. -1985. V. 63, Fasc. 4. - P. 425-430. •

101. Knox J.P., Dodge A.D. Singlet oxigen and plants//Phytochemistry. -1985.-V. 24, № 5.-P. 889-898.

102. Kurnik E. Zuchtung von Sonnenblumen (Helianthus Annuus) unter Berucksichtigung von Olmenge und.olqualitat//Qualitas Plantarum et Materiae Vegetabilies. 1966. -Bd. 13, № 1-4.-S. 157-170.

103. Marsic V., Yodice The dietary role of monounsaturates//INFORM. -1992.-V.-№6.-P. 681-685.

104. Miller J.F., Zimmerman D.C. Inheritance of high oleic fatty acid content in sunflower//Proc. Sunflower Research Workshop, National Sunflower Association, Bismarck, ND. 1983. - P. 10.

105. Miller J.F., Zimmerman D.C., Vick B.A. Genetic control of high oleic acid content in sunflower oil//Crop Sci. 1987. - V. 27, № 5. - P. 923-926.

106. Miquel M.F., Browse J.A. High-oleate oilseeds fail to develop et low temperature//Р1 ant Physiol. 1994. - V.106. - P. 421-427.

107. Murphy D.J. Transgenic plants a future source of novel edible and industrial oils//Lipid Technology. - 1994. - July/August. - P. 84-91.

108. Ohlrogge J.B. Design of new plant products: engineering of fatty acid metabolism//Plant Physiol. 1994. -V. 104. - P. 821-826.

109. Robbelen G. Mutation breeding for quality improvement. A case study for oilseed crops//Mutation Breeding Review. 1990. - № 6. - P. 1-44.

110. Robertson J. A., Mortison W.H.? Wilson R.L. Effects of sunflower hybrid or variety and planting location on oil content and fatty acid composition //Proc. 8th Int. Sunflower Conf, Minneapolis, USA. 1978. - P. 524-532.

111. Schulz H., Lausch G, Feldheim W. Veranderung des Tocochromanol-musters einiger Pflanzenole (Sojabohne, Lupine Sonnenblume und Weizen) wahrend Keimund und Wachstum/ZZeitschrifit for Naturforschung. 1985. - Bd. 40 С -№ 11/12. -S. 760-766.

112. Seiler G.J. The genus Helianthus as a source of genetic variability for cultivated sunflower//Proc. 12th Int. Sunflower Conf., Novi Sad, Yugoslavia. -1988.-P. 17-58.

113. Stumpf P.K. Biosynthesis of fatty acids in higher plants//Oil crops of the world, ed.by G. Robbelen et al. 1989. - P. 38-61.

114. Talbot G., Price M.A. Vegetable oil alternatives to mineral hydrocarbons for as release agents and lubricants//European Food and Drink Review. -1990. Winter issue. - P. 41-44.

115. Theile E. Uber die Inhaltsstoffe der Fruchte von Helianthus annuus. Die Pharmazie. 1949. - V. 4. - 428 p.

116. Topfer R., Martini N., Schell J. Modification of plant lipid synthesis //Science.- 1995. -V. 268, 5 May. P. 681-686.

117. Urie A.L. Inheritance of high oleic acid in sunflower//Crop Sci. -1985. V. 25, № 6. - P. 986-989.

118. Zimmerman D.C., Fick G.N. Fatty acid composition of sunflower {Helianthus annuus L.) oil as influenced by seed position//JAOCS. 1973. - V.50, №8.-P. 273-275.