Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

ГЕНЕТИКО-БИОХИМИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА И СЕЛЕКЦИОННОЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МУТАЦИИ ПОВЫШЕННОГО СОДЕРЖАНИЯ ПАЛЬМИТИНОВОЙ КИСЛОТЫ В МАСЛЕ СЕМЯН ПОДСОЛНЕЧНИКА

ВАК РФ 06.01.05, Селекция и семеноводство

Автореферат диссертации по теме "ГЕНЕТИКО-БИОХИМИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА И СЕЛЕКЦИОННОЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МУТАЦИИ ПОВЫШЕННОГО СОДЕРЖАНИЯ ПАЛЬМИТИНОВОЙ КИСЛОТЫ В МАСЛЕ СЕМЯН ПОДСОЛНЕЧНИКА"

На правах рукописи

ЕФИМЕНКО Светлана Константиновна

ГЕНЕТИКО-БИОХИМИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА И СЕЛЕКЦИОННОЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МУТАЦИИ ПОВЫШЕННОГО СОДЕРЖАНИЯ ПАЛЬМИТИНОВОЙ КИСЛОТЫ В МАСЛЕ СЕМЯН ПОДСОЛНЕЧНИКА

Специальность 06.01.05. — «лекция и семеноводство

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Краснодар, 2007

Работа выполнена в Государственном научном учреждении Всероссийском научно-исследовательском институте масличных культур им. B.C. Пустовойта Российской академии сельскохозяйственных наук (ГНУ ВНИИМК Россельхозакадемии)

Научный руководитель - доктор биологических наук,

доцент Демурин Яков Николаевич

Официальные оппоненты - доктор биологических наук,

профессор Авакян Эльмира Рубеновна

кандидат биологических наук Трембак Евгений Николаевич

Ведущая организация — Кубанский Государственный Университет

Зашита диссертации состоится 22 мая 2007 г. в 10 час. на заседании диссертационного совета Д 006.026.01 Всероссийского научно-исследовательского института риса по адресу: 350921 г. Краснодар, п/о Белозерное

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ВНИИ риса

Автореферат разослан 17 апреля 2007г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук

Гончарова Ю.К.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИК Л РАБОТЫ

Актуальность темы. Селекция растений на качество масла, в частности на повышение содержания насыщенных жирных кислот преследует цель - заменить гидрированные растительные жиры, твердыми натуральными маслами, которые не содержат вредных для здоровья человека трансизомеров жирных кислот. По данным диетологов, масло, рекомендуемое для питания здорового организма, должно содержать следующее соотношение; около 20% полиненасыщенных, 50% мононенасыщенных и 30% насыщенных жирных кислот. Теоретически указанное содержание насыщенных кислот будет способствовать повышению температуры плавления и окси-стабильности масла. Применительно к подсолнечному маслу наибольший интерес представляет повышение содержания пальмитиновой кислоты.

Возделываемые в России традиционные сорта и гибриды подсолнечника содержат в масле около 6% пальмитиновой кислоты.

Создание гибридов подсолнечника с повышенным содержанием пальмитиновой кислоты в масле семян позволит существенно расширить сферу его использования и создать альтернативу пальмовому маслу.

Цель и задачи исследований. Цель настоящих исследований - гене-тнкобиохимическое изучение мутации повышенного содержания пальмитиновой кислоты в масле семян подсолнечника и создание селекционных линий с этим признаком,

В задачи исследований входило решение следующих вопросов:

1. Оценить фенотип ическое варьирование содержания пальмитиновой кислоты в масле семян селекционных линий и коллекционных образцов подсолнечника.

2. Создать линию с повышенным содержанием пальмитиновой кислоты в масле семян.

3. Изучить наследование мутации повышенного содержания пальмитиновой кислоты.

4. Исследовать онтогенетическую изменчивость признака повышенного содержания пальмитиновой кислоты.

5. Создать аналоги селекционных линий с повышенным содержанием пальмитиновой кислоты.

6. Сравнить оксистабильность различных растнтель^'^м^е^^р^зева

Г---рГАУ-МСХА "" 1

ЦНБ имени Н И. Железнова 1 Фонд 1

Научная новизна исследований.

Впервые изучено наследование мутации повышенного содержания пальмитиновой кислоты на основе созданной линии ЛГЗО. Признак контролируется моногенно с рецессивным проявлением. В некоторых комбинациях скрещивания наблюдается более сложное наследование.

Показана возможность идентификации мутации повышенного содержания пальмитиновой кислоты в масле в гетерозиготе на основе анализа семядольных листьев одно-двух дневных проростков подсолнечника.

Установлено, что в л ил идах пыльцы, изученная мутация не проявляется.

Практическая ценность результатов.

Создана линия донор ЛГЗО с повышенным содержанием (около 24%) пальмитиновой кислоты в масле семян.

Разработан и запатентован способ создания аналогов линий с измененным составом жирных кислот.

На основе этого способа созданы аналоги селекционных родительских линий - отцовской ВК580 (зарегистрированной как ВК850) и материнской ВС}ВК87б, отличающиеся от исходных повышенным содержанием пальмитиновой кислоты. Эти линии могут быть использованы для создания высокопальмитинового аналога гибрида Триумф с новым качеством масла, характеризующимся высокой окислительной стабильностью.

Основные положения, вы носимые на защиту.

1. Генотипический контроль мутации повышенного содержания пальмитиновой кислоты в масле семян подсолнечника.

2. Метод создания изо генных линий на основе экспрессивности мутации состава жирных кислот у одно-двух дневных проростков.

3. Увеличение окислительной стабильности масла за счет наследственных изменений состава жирных кислот семян.

Апробация работы н публикация результатов исследований. Результаты исследований и основные положения диссертации доложены на заседаниях методической комиссии учёного совета ВНИИМК 2005-2007 гг., Международной конференции молодых ученых (Харьков, 2001 г.), Международной научно-практической конференции (Пенза, 2003 г.), 3-й Международной конференции молодых учёных и специалистов (Краснодар, 2005 г.).

По материалам диссертации опубликовано 8 работ общим объемом 1,4 печатных листа.

Объем и структура диссертации. Диссертация наложена на 108 страницах машинописного текста, в том числе 85 — основного текста, и состоит из введения, 5-ти глав, выводов и рекомендаций для селекционной практики. Работа иллюстрирована 14 рисунками, 21 таблицами и 7 приложениями. Список литературы включает 152 источника, в том числе 46 — иностранных.

Материал и методы исследования

В работе были использованы сорта, селекционные линии и образцы генетической коллекции ВНИИМК, а так же стерильные аналоги материнских форм, поступающих в институт в рамках обмена селекционным материалом.

Растения выращивали: летом — в поле, зимой — в камере фитотрона.

Скрещивание и самоопыление растений проводили общепринятыми методами. Биохимические признаки изучали на основе анализа отдельных семянок с сохранением жизнеспособности зародыша.

Характеристика метеорологических условий в период формирования семян в июле-октябре 2004 г. представлена по данным метеостанции «Кругл ик», г. Краснодар.

Состав жирных кислот определяли методом газожидкостной хроматографии, содержание отдельных форм токоферолов ~ методом тонкослойной хроматографии, общее содержание токоферолов - колориметрическим способом, кислотное число — титриметрическим способом. Масла получали методом прямого прессования. Окислительную стабильность масел оценивали на приборе Вапс1та1743.

Полученные результаты подвергали статистической обработке.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

1. Изменчивость содержания пальмитиновой кислоты в масле семян подсолнечника

Для изучения фенотипического варьирования содержания пальмитиновой кислоты в масле семян подсолнечника были проанализированы по 40 отдельных семянок сортов: обычного по содержанию жирных кислот— Мастер и высокоолеинового - Круиз.

У сорта Мастер по содержанию пальмитиновой кислоты в масле семян наблюдалось слабое фенотипическое варьирование в пределах от 4,6 ло 6,8%, которое в среднем составляло 5,4% от суммы кислот (табл. 1). Наряду с этим обнаружена значительная изменчивость по содержанию олеиновой и л и нолевой кислот. Эти различия составили около 30%, а пределы варьирования были от 28,6 до 58,6% и от 33,7 до 63,6% соответственно.

В масле семян сорта Круиз среднее значение пальмитиновой кислоты составило всего 4,1% при варьировании от 3,1 до 5,7% от суммы кислот.

Таблица 1 — Фенотип и ческое варьирование состава жирных кислот масла в семенах сортов подсолнечника

_ВНИИМК, 2005 г.

Сорт Жирная кислота, % от суммы

тпьммтиооил! пальм итолеиновак стеариновая оминомя янгюяспля

среднсс 5,4 0,1 3,5 44,6 46,5

MIX Мастер Min 6,8 4,6 0,2 0,0 5,9 1,7 58,6 28,6 63.6 33.7

S (п-40) 0,5 0,1 1,0 7,4 7,6

v.% 9,4 56,8 28,8 16,7 16,3

среднее 4,1 0,1 4,4 88,4 3,0

мах Круиз „¡„ S<n-40) 5,7 0,2 8,5 92,8 28,5

3,1 0,6 0,0 0,1 2,2 1,4 60,8 5.9 0,6 5,2

V,% 14,3 47,5 32,1 6,7 174,1

нср« 0,5 0,1 1,1 5,9 5,7

Изучение содержания пальмитиновой кислоты в семенах селекционных линий и образцов генетической коллекции ВНИИМК (около 150 образцов) показало более существенные различия. Для наглядности приведены данные по 10-ти линиям, которые показывают наибольший размах изменчивости содержания пальмитиновой кислоты в сочетании с другими основными жирными кислотами (табл. 2).

Все эти константные инбредные линии (7-10 самоопылений) отбирались с определенным составом жирных кислот, поэтому коэффициент вариации не превышал 10%. Выявленные различия по содержанию пальмитиновой кислоты (более чем в два раза) между линиями ВК8760/ (4,8%) и ВИР721 (10,0%) представляли интерес для изучения генетического контроля этого признака, но не могли иметь селекционного применения. Поэтому вопрос по поиску более надёжного источника продолжал оставаться актуальным.

Таблица 2 - Состав жирных кислот самоопыленных линий подсолнечника

ВНИИМК, 2003 г.

Жирная кислота, % от суммы

пальмитиновая стеариновая олеиновая ли нолевая

ВК876 01 4,8 4,9 89,2 0,8

ВКбб 01 5,5 3,8 87,6 3,1

ВК66 7,7 5,7 46,0 40,6

ЛГ26 5,8 4,9 86,9 2,4

ЛГ27 5,6 4,6 66,8 23,1

КНА416 7,1 3,1 33,6 56,3

НА413 9,4 2,6 25,7 62,3

ВИР721 10,0 2,6 31,9 55,9

КГ102 7,9 5,8 34,7 51,6

КПЗ 8,2 6,4 30,2 55,2

НСР« 3,0 0,5 6,+ 6,3

В лаборатории генетики ВНИИМК в 80-90 гг. прошлого века дважды выделяли биотипы подсолнечника с повышенным содержанием пальмитиновой кислоты (около 25%). Однако низкая жизнеспособность семян выделенных образцов не позволила получить донорские линии.

Работы по поиску мутаций были продолжены. Для чего ежегодно проводили анализы семян исходного материала, используемого отделом ге-терозисной селекции подсолнечника ВНИИМК по определению состава жирных кислот. Кроме этого исследовали содержание отдельных кислот в масле семян подсолнечника коллекционных образцов различного происхождения, современных коммерческих сортов, селекционных линий и отечественных и иностранных ЦМС форм, поступающих во ВНИИМК в рамках экологических испытаний.

При изучении стерильных линий, полученных из Украины, был выделен искомый образец с повышенным содержанием пальмитиновой кислоты. В масле 15 проанализированных семянок этой линии содержание пальмитиновой кислоты варьировало от 11,3 до 26,6%. В камере фитотрона удалось вырастить два растения из семянок №12 и №15, с содержанием пальмитиновой кислсггы 25,7 и 21,0% соответственно. Эти растения были скрещены с линией ВК580, имеющей ген восстановления фертильности. Дальнейшие самоопыления и отбор позволили создать константную линию, с повышенным содержанием пальмитиновой кислоты в масле (около 24%), которая получила название ЛГЗО (табл. 3).

Таблица 3 - Фен оптическое варьирование состава жирных кислот масла семян подсолнечника линии ЛГЗО

ВНИИМК, 2003 г.

Показатели Жирная кислота, % от суммы

палылитмновдц шшъмъпхиюмноная стсарннолая олсиж>е&я л и ноле лая

Среднее 24,1 3,7 23 18,4 51,5

Мах 27,2 4,4 2,8 20,2 56,8

Мш 21,8 3,2 1.9 16,7 49,7

5 (п=Ю) 1.7 0,4 0,4 М 2,0

V, % 7,1 юз 15,6 ва 3,3

У полученной линии содержание пальмитиновой кислоты варьировало в пределах от 21,8 до 27,2% от суммы кислот, что обусловлено в основном снижением концентрации олеиновой кислоты.

Особенностью источника признака повышенного содержания пальмитиновой кислоты можно считать появление до 4% пальмнтолеиновой кислоты. В обычном подсолнечнике ее содержание не превышает 0,1% от суммы кислот.

Для изучения модификациониой изменчивости изучаемого признака линия ЛГЗО была посеяна в 2004 г. в два срока: 4 мая и 5 июля. В этом случае периоды налива семян характеризовались различными температурными режимами (1-й срок среднесуточная температура составила 23,2°С и 2-й срок - 19,2°С).

Развитие растений линии ЛГЗО 2-го срока посева, проходящее в более прохладных условиях, не способствовало изменению содержания пальмитиновой, лальмитолеиновой и стеариновой кислот. Однако в этом случае отмечено появление в значимых количествах ещё одной не характерной для подсолнечника - пал ьмитол и нолевой жирной кислоты (табл. 4).

Таблица 4 - Состав жирных кислот масла семян линии ЛГ30 в зависимости от сроков посева

ВНИИМК, 2004 г.

Срок ло«ва Период ("[►сдиесчлич ияя Жирная кислота, % от суммы

мпем текнериурэ, "С С 16:0 С16Л С 18:0 С18:1 С 18:2

4 мая IJ.07-1J.08 23,2 22,9 4,0 0,2 1,8 18,2 52,9

5 июля 1.09-МО 19,2 24,1 3,7 1,5 2,9 8,2 59,7

НСРда 3,6 1,1 0,8 1,7 1,8 4,0

Для семян, созревающих при отличающихся температурных режимах, установлены достоверные различия по содержанию пальмитолинолевой, олеиновой и ли ноле вой кислот. Так содержание олеиновой кислоты в масле семян 1-го срока составило 18,2%, а во 2-м её было на 10% меньше (8,2%). Полученные результаты свидетельствуют об отсутствии влияния условий вырашнвакия на содержание пальмитиновой и папьмитолеиновой кислот в масле семян линии ЛГЗО, тогда как количество пальм итоли ноле вой при формировании семян в более прохладных условиях увеличилось с 0,2 до 1,5%.

Таким образом, создана мутантная донорская линия ЛГЗО с содержанием пальмитиновой кислоты около 24% (в норме 4-6%). Отличительной особенностью этой мутации является значительное накопление пальмито-леиновой кислоты (около 4%). Условия выращивания в период накопления масла не оказывают существенного влияния на основной признак, определяемый этой мутацией — повышенное содержание пальмитиновой кислоты.

Следующий этап работы заключался в изучении наследования этого признака. Для изучения наличия материнского эффекта были проведены рецилрокные скрещивания линии ЛГЗО с двумя образцами линолевого типа: однокорзиночной материнской формой НА413 и ветвистой отцовской-ЯНА416, характеризующимися содержанием линолевой кислоты в масле 62,3 н 56,3% соответственно. В результате анализа состава жирных кислот в отдельных семянках от реципрокных скрещиваний установлено, что в Р[ материнский эффект не наблюдался (табл. 5).

В гетерозиготе признак повышенного содержания пальмитиновой кислоты в масле семян от скрещиваний с линиями линолевого типа в четырех изученных комбинациях варьировал от 8,3 до 12,5% от суммы кислот и в среднем составил около 10%. При этом наблюдается повышенное, по отношению к корме, количество пальм итолеи но вой кислоты (в среднем 0,4%).

Таблица 5 - Состав жирных кислот масла семян р! от реципрокных скрещиваний

_ВНИИМК, 2003 г.

Комбинация скрещивания Жирная кислота, % от суммы

пальмитиновая пальмиталенномя стеариновая оленноыя лнполеахя

сриаико мик НА4ПХЛГ30 Hin 10,1 12,4 3,7 1,3 0,4 0,5 од 0,1 1,8 3,2 1,1 0,8 27,1 47,1 13,5 11,1 60,6 75.4 39.5 12,0

среднее мах ЛГ30хНА413 МЦ1 s 10,6 12,3 8,3 1,6 0,4 0,6 0,2 0,1 3,7 5,4 3,0 0,7 28,1 36,6 18,5 7,9 57,3 65,3 47,8 6,5

Среднее дох ЯНА41бхЛГ30 ц1о s 10,3 12,2 8,3 03 0,3 0,2 0,1 2,4 4,1 1,9 0,8 28,1 34,5 18,1 6,0 59,0 69,3 54,1 5,4

средоке ЛГ30х11НА416 s 10,0 12,5 8,3 1,3 0,3 0,5 0,2 0,1 2,8 3,7 2,1 0,5 30,2 33,9 26,3 2,7 56,8 61,6 52,2 3,2

ИСР« 2.1 0.2 1,1 11,1 11.1

Для изучения наследования этой мутации в сочетании с некоторыми биохимическими и морфологическими признаками подсолнечника в полевых условиях в 2003 г. были получены гибриды Р| линии ЛГ30 с четырьмя образцами генетической коллекции различного происхождения: одной высокоолеиновой - ЛГ26 и тремя - КГ102, ВИР721 и КПЗ, обладающими маркерными признаками. При скрещивании линии ЛГ30 с высокоолеиновой ЛГ26 в семенах Р] наблюдалось одновременно доминирование гена О! и гетерозиготное состояние по признаку повышенного содержания пальмитиновой кислоты (табл. б).

При скрещивании ЛГЗО с линиями линолевого типа, обладающими различными морфологическими маркерными признаками - КГ 102, ВИР721 и КПЗ наблюдалось незначительное увеличение (в среднем от 10,0 до 11,2%) пальмитиновой кислоты и появление пальм итолеиновой кислоты (0,4-0,6%).

Таблица 6 — Состав жирных кислот масла семян Г) от скрещивания линии ЛГЗО с образцами генетической коллекции

_ВНИИМК. 2003 г.

Комбинация скрещивания Жирная кислота, %отсуи-ы

ЯЬльиММнОМЯ пм*ч>ггояе*<нов*д «теарннома оленпо«*я якнолевм

среднее мах ЛПОхЛГ» Mill S(n-JS) 8,1 8,7 7,6 0,4 0,4 0,6 0,2 0,2 3,1 3.4 2.5 0,3 84,6 86,2 82,6 1,3 3,8 5,6 3,0 1.0

среднее КПО2хЛГЭ0 юн S 10,0 12,7 8,2 1.5 0,4 0,6 0,2 0,1 3,4 4,7 1,9 0,8 41,5 52,1 27,9 9,5 44,8 59,5 34.0 10.1

средне« мах ВИР72] хЛПЗО мт S 11,1 12,8 9,0 1,5 0,6 0,8 0,2 0,2 2,2 2.5 1.6 0,3 32,9 46.7 22.8 10,8 53,3 61,6 40,0 9,8

среднее ма* ДГЗОхКПЗ И1П S 11,2 12,2 10,4 0,6 0,4 0,6 0,2 0,2 4,1 4,9 2,5 0,8 35,0 39,4 30,3 3,0 49,4 54.4 45.5 3,2

НСР„ 0,8 0.2 1,0 11,1 11.3

Повышение содержания пальмитиновой кислоты в семенах р| и особенно появление в заметных количествах пальмитолеиновой кислоты дает возможность четко идентифицировать гетерозиготу (табл. 7).

Таблица 7 - Содержание пальмитиновой и пальмитолеиновой кислот в масле семян родительских линий и их гибридов, % от суммы

_ВНИИМК, 2003 г.

Комбинация скрещивания Жирная кислота Р. Р* F, HCPos

RHA 416 х ЛГЗО С16:0 С16:1 7,1 следы 24,1 3,7 юз 0,3 1.9 1,0

ВИР721 х ЛГЗО С 16:0 С16;| 10,0 0,1 24,1 3,7 11,1 0,6 1,9 1,0

ЛГЗО х ЛГ26 С 16:0 С16:1 24,1 3,7 5,8 следы 8,1 0,4 1,5 1,0

НА413хЛГ30 С160 С16:1 9,4 следы 24,1 3,7 10,1 0,4 1,7 1,1

ЛГЗО х КПЗ С 16:0 С16:1 24,1 3,7 8,2 следы 11,2 0,4 1.7 1,0

КГ102х ЛГЗО С 16:0 С16:1 7,9 следы 24,1 3,7 10,0 0,4 1,7 1,0

Важно отметить различие по содержанию пальмитиновой (С 16:0) и пальмнтолеиновой (С 16:1) кислот в масле между самоопыленными родительскими формами (материнскими — Р); отцовскими — Рг) и Р|, семена которых были получены в одних и тех же полевых условиях.

В целом, различия в содержании пальмитиновой кислоты между родителями и гибридами Р,, изученные на основе скрещивания ЛГЗО с шестью различными линиями указывают на доминирование признака обычного содержания пальм ига новой кислоты. В четырех случаях (1ША416, ЛГ26, КГ102 и КПЗ) наблюдается неполное доминирование, а в двух (ВИР721 и НА413) характерно полное доминирование нормального типа, так как не наблюдается достоверных различий между родительскими линиями С обычным генотипом и гибридами Р(. Для наглядности представлены хрома-тограммы метиловых эфиров жирных кислот масла семянок линии ЛГЗО в сравнении с линией линолевого типа и Р( (рис. 1).

Рисунок I — Хроматограммы метиловых эфиров жирных кислот масла отдельных семянок:

а — с повышенным содержанием пальмитиновой кислоты, б — с обычным, в - гетерозигота;

1 - (16:0) — пальмитиновая, 2 — (16:1) — пальм итопеи новая, 3 - (18:0) - стеариновая, 4 - (18:1) —олеиновая, 5 - (18:2) — лннолевая

Анализ расщепления по средним пробам отдельных корзинок семян Г) показал, что отношение, соответствующее моногенной модели 1 нормальный : 2 фенотип гетерозиготы ; 1 мутантный наблюдалось только для скрещивания ВИР721 хЛГЗО, =5,11 < = 5,99, р>0,05. В пяти других комбинациях отмечена нехватка корзинок с мутантным классом, что может объясняться как наличием более, чем одного гена, контролирующего накопление повышенного содержания пальмитиновой кислоты, так и пониженной жизнеспособностью мутантных растений.

Изучение наследования мутации повышенного содержания пальмитиновой кислоты в отдельных семенах было проведено на основе скрещивания Л ГЗО с селекционной линией ВК876. У гибрида Рд 30 проанализированных семянок показали неполное доминирование, т. е. 8,0% пальм ига новой кислоты при значении 5,9% у родительской линии ВК876 (НСРО5=0,6), Из 110 семян Ра было получено 34 полноценных растения. После анализа семян Р} из самоопыленных корзинок, удалось однозначно определить генотип исходных семянок и таким образом идентифицировать фекотипические классы характерные для Р2. В анализирующем скрещивании наблюдали дискретную изменчивость по двум классам пальмитиновой кислоты — для "гетерозигот РГ от 9 до 14%, для - "мутантов" от 21 до 29% (рис. 2).

«

X 8

г *

х

I

Рисунок 2 — Распределение частот содержания пальмитиновой кислоты в индивидуальных семенах Рг и ВС при скрещивании линий ВК876 и ЛГЗО

,1,1 .й 1Т.и| .н.я Э Дя.П я.н.п

* Э 3 ТвНИ^и!» 2» 31 »7

ВС с ЛГЗО

-.1

Ссдоржянне пальмитиновой кислот», %

Результаты анализа расщепления признака содержания пальмитиновой кислоты в Р2 и в анализирующем скрещивании согласуются с моногенной моделью наследования рецессивной мутации 3:1 и р.|, соответственно (табл.8).

Таблица 8 - Наследование мутации повышенного содержания пальмитиновой кислоты в и ВС при скрещивании линий ВК876 С ЛГЗО

__ВНИИМК, 2005 г.

Поколение Количество семян, шт. У, 2

норма + гетерозигота мутант 3:1 1:1

Р)(ВК876 х ЛГЗО) ВС (ЛГЗО хР,) 85 19 25 21 0,32 0,10

X2«,, < Х2м=3,84, р > 0,05

На рис. 2 показана изменчивость в Р3 по содержанию пальмитиновой кислоты. Именно такой непрерывный фенотипический ряд позволил установить высокую степень аппроксимации (К2 = 0,95) между содержанием пальмитиновой и лапьмитолеиновой кислот (рис, 3).

Эл ■ .....

¡г

в

1 ■

К «

9

I " г

I '

г

■ «я

-» 5

Рисунок 3 — Зависимость содержания пальмитиновой и пальмитолеи-новой кислот в отдельных семянках Рг при скрещивании ВК876 х ЛГЗО

Для изучения экспрессивности мутации повышенного содержания пальмитиновой кислоты в мужском гаметофите в период цветения была со-

брана пыльца с отдельных растений Ра> различающихся по величине этого признака. Генотип этих растений был установлен по растеплению в Рэ.

При сравнении нормальных» гетерозиготных и мутантных растений по содержанию пальмитиновой кислоты в пыльце достоверных различий между ними не обнаружено (табл. 9).

Таблица 9-Содержание пальмитиновой кислоты в лип идах пыльцы различных генотипов подсолнечника

ВНИИМК, 2006 г.

Число корзи- Содержание пальмитиновой кислоты, %

нок, шт. среднее min max

PIPI (норма) 3 30,1 29,9 30,2

Pipi (гетерозигота) 6 30,3 27,8 32,1

pipi (мутация) 2 29,4 26,8 32,0

НСРИ 2,2

Таким образом, мужской гаметофит подсолнечника невозможно использовать для идентификации мутации повышенного содержания пальмитиновой кислоты в семенах. По всей видимости, обусловленность этого признака связана с его генетическим проявлением только в запасающих масло тканях.

Были изучены особенности изменчивости состава жирных кислот масла в процессе прорастания семян. В полевых условиях отбирали части семядолей у одно-пяти дневных проростков различных генотипов и проводили биохимические анализы. Установлено, что в процессе развития проростка появляется характерная для зеленого листа линоленовая кислота, имеющая следовое количество в семенах (менее 0,1%). Ее содержание существенно увеличивается с возрастом проростка. На 4-5 день от начала появления всходов содержание линоленовой кислоты в семядолях варьируется от 35 до 55% от суммы кислот. Однако в первые два дня её концентрация ещё не превышала 7%, что не оказывало существенного влияния на соотношение основных жирных кислот.

Нами было установлено, что содержание пальмитиновой кислоты в семядольных листьях 1-2 дневных проростков н семядолях семени не имеет различий для каждого из трех изученных генотипов — нормального, мутант-ного и гетерозиготного (табл. 10),

Таблица 10 — Содержание пальмитиновой кислоты в масле семян и семядолей проростков различных генотипов подсолнечника

ВНИИМК, 2004 г.

Содержание пальмитиновой кислоты, % от суммы

Линия, гибрид Генотип семядоли семени семядоли 1-2 дневных проростков

среднее min-max среднее min-max

ВК580 Р1Р1 5,2 4-6 5,4 4-7

ЛПЗО pipi 24,3 22-26 23,5 20-25

F, (ВК580 х ЛГ30) Pipi 10,3 9-13 10,7 9-13

НОР« 1,2 1,4

Этот факт объясняется, вероятно, тем, что в процессе прорастания семени в первую очередь расходуется линолевая кислота, а затем олеиновая. Насыщенные кислоты используются в последнюю очередь (Иванов СЛ., 1961).

Полученные результаты, свидетельствующие о достоверных различиях между нормальными, гетерозиготными н мутантными растениями по содержанию пальмитиновой кислоты в масле семядолей 1-2 дневных проростков позволяют идентифицировать их генотип на ранней стадии вегетативного этапа онтогенеза.

2. Селекционное использование мутации повышенного содержания пальмитиновой кислоты

Результаты изучения наследования в Р| и онтогенетической изменчивости признака повышенного содержания пальмитиновой кислоты предопределили разработку нового способа получения нзогенных линий по доминантному признаку. Рассадный способ выращивания проанализированных семян не всегда позволял получать хорошо развитые растения. Зачастую лучшее растение по передаваемым биохимическим признакам оказывалось самым худшим в плаке роста и развития. В связи с этим появилась необходимость разработки способа создания изогенных линий совмещающего получение хорошо развитых растений и возможности надёжной идентификации генотипа по передаваемому признаку.

Принципиальное отличие разработанного нами метода, на который получен патент на изобретение № 2290785, заключается в том, что отбор гетерозиготных генотипов беккроссных растений производится на ранней

стадии появления всходов в полевых условиях с сохранением жизнеспособности проростков.

Нашими исследованиями была выявлена возможность выделения гетерозиготных беккроссных растений в период, когда они находятся в стадии проростков и сохраняют органы с достаточным для проведения анализа количеством запасных веществ. Это оказалось реальным на этапе развития, когда семядоли оказываются вынесенными над поверхностью почвы и освобожденными от околоплодника, но ещё не перешли к аутотрофному питанию, при котором доминантный признак семян уже не идентифицируется.

Непрерывная схема беккроссов проводилась по общеизвестной методике. А именно реципиент скрещивали с донором доминантного признака (ген А), а затем — с гибридами первого поколения (Р[), что приводило к образованию фенотипически неоднородных семян первого поколения бек-кросса (ВС|), 50% которых имели генотип аа и 50% - генотип Лл, являющийся гетерозиготным по передаваемому признаку (рис. 4).

РI аа х АА Рг

О

Р| аа х Аа Р|

Ф

ВС, - отбору 1-2 диезных г^юросткоа» верхушечной части одной ю семядолей- на биохимический ячапде, а каждый проросток инддачпуадыю мяркфупся

браковка растении ВС) ** 50%

аа 50% Аа * Р| аа

О

ВСг... и т. д. до ВС„ Два поколения самоопыления и отбор АА изогенной линии

Рисунок 4 — Схема получения изогенной линии по доминантному признаку семени у растений Условные обозначения:

А - передаваемый аллель; Р, - гибрид первого поколения;

Р| - реципиент, ВС - беккросс;

Рг- донор; п - нужное число беккроссов.

Семена первого поколения бек кросса (ВС|) высевали в поле. В течение первых двух дней после появления всходов отрезали от семядоли проростка ее верхушечную часть, по результатам биохимического анализа которой устанавливали генотип растения, в частности по составу жирных кислот масла.

Удаляли гомозиготные особи, а гетерозиготные проростки (соответствующие генотипу Аа) выращивали до репродуктивных растений, которые в качестве отцовской формы скрещивали с реципиентом для получения следующего поколения бекк росса. Полученные семянки второго поколения бе к кросса, сформировавшиеся на растениях реципиента Р[ в комбинации скрещивания с отцовской формой генотипа Аа, отбирали для дальнейшего насыщения.

После проведения необходимого для создания нзогенной линии количества циклов беккроссирования, обычно 5-7, выделенные гетерозиготные растения самоопыляли в течение двух поколений. В Рг отбирали 4-6 растений с генотипом АА или Аа, а в третьем поколении из них получали 2-3 самоопылённых растения нзогенной линии гомозиготной по генотипу АА, т.е. по доминантному признаку семени,

В качестве реципиента были взяты родительские линии коммерческого межлинейного гибрида Триумф, созданного во В Н НИМ К, а именно отцовская - ВК580 и материнская - ВК678.

Первое скрещивание линии ВК580 с источником признака повышенного содержания пальмитиновой кислоты с ЦМС линией было проведено в декабре 2001 г. Параллельно с созданием донорской линии этого признака ЛГ30 и изучением наследования данной мутации вели работу по получению аналога ВК580 с повышенным содержанием пальмитиновой кислоты.

Несмотря на то, что мутация повышенного содержания пальмитиновой кислоты является рецессивной, неполное доминирование позволяет различать по фенотипу доминантную гомозиготу нормального типа PIPI и гетерозиготу Pipi.

На основе разработанного нами метода были созданы аналоги с повышенным содержанием пальмитиновой кислоты отцовской линии BKS80 и материнской ВК876, являющиеся родительскими формами коммерческого гибрида Триумф.

Получено авторское свидетельство № 4144) на линию подсолнечника ВК850. Она создана в результате скрещивания селекционной линии ВК580 с донором повышенного содержания пальмитиновой кислоты в масле семян (линией ЛГЗО, созданной в процессе настоящих исследований), последующих возвратных скрещиваний, принудительного самоопыления в сочетании с отбором по комплексу хозяйственно-пенных признаков.

Линия ВК850 обладает генотипически повышенным содержанием пальмитиновой кислоты в масле семян (около 24%; контроль— 6%) (табл. 11).

Таблица 11 - Состав жирных кислот линии ВК 850 с повышенным содержанием пальмитиновой кислоты в масле семян

ВНИИМК, 2005 г.

Линия Жирная кислота, % от суммы

пальм кгиновая пальм 1тт™ешювая стеариновая олеиновая линолевая

ВК 850 24 4 2 15 55

ВК 580

(контроль) 6 0 5 37 52

НСРМ 3

Практически закончено создание аналога материнской линии ВК876 по признаку повышенного содержания пальмитиновой кислоты в масле семян. Этот сортообразец получен на основе скрещивания селекционной линии ВК876, которая представляет собой аналог В Кб 78 по гену О/, с ЛГЗО и последующих возвратных скрещиваний. В 2006 г. в полевых условиях было получено ВС5.

3. Окислительная стабильность растительных масел

В результате селекционной работы нами были созданы линии подсолнечника с повышенным содержанием пальмитиновой кислоты в масле семян - ЛГЗО, аналоги линий 13ВС1ВК87б/>/ и 13ВС*ВК8500/./^А2. Для сравнения устойчивости масел к окислению в качестве контроля были взяты высокоолеиновый, у-токоферольный аналог линии ВК591 и сорт Мастер. На полевых делянках в 2005 г. были собраны семена, сформировавшиеся после свободного цветения растений этих линий. В условиях лаборатории из этих семян методом прямого прессования получены масла.

Известно, что устойчивость растительного масла к окислению зависит, в первую очередь, от содержания ненасыщенных жирных кислот, входящих в состав триацилглицеролов, от состава токоферольного комплекса, сопутствующего маслу, а так же от концентрации свободных жирных кислот, являющихся центрами инициации свободнорадикального переписного окисления.

Результаты анализа химического состава полученных масел представлены в таблицах 12 и 13,

Таблица 12-Состав жирных кислот масел различных гекотапов подсолнечника

ВНИИМК, 2006 г.

Линия, сорт Жирная кислота, % от суммы

С16;0 С16:1 С18:0 С18:1 С) 8:2

ВК850 01,1рН2 18,5 5,5 1,4 67,9 6,7

ВК591 ОирИ2 5,2 0,3 2,7 80,9 10,9

ВК876 р! 16,7 2,6 3,0 55,5 22,2

ЛГЗО 25,9 6,1 2,6 20,4 45,0

Мастер 6,1 0,1 3,2 36,2 54,4

По составу жирных кислот маслА, полученные из семян растений после свободного цветения не значительно отличались от масел семян самоопыленных линий, но сохранили особенности этих генотипов. В маслах, полученных из семян экспериментальных линий содержание пальмитиновой кислоты варьировало от 16,7 до 25,9% в сравнении с обычными генотипами, у которых этой кислоты было 5,2% (ВК591) и 6,1% (Мастер). Так же представленные масла значительно отличались по содержанию олеиновой (от 20,4 до 80,9%) и линолевой (от 6,7 до 54,4%) кислот.

Таблица 13 - Состав токоферолов и кислотное число масел различных генотипов подсолнечника

ВНИИМК, 2006 г.

Линия, сорт Кислотное число, мг КОН Токоферолы % от суммы

а Р 7 5

ВК850 01лрЬ2 1,45 63 сд 37 сл

ВК591 01,)рИ2 1,12 53 11 31 5

ВК876р/ 2,01 60 5 30 5

ЛГЗО 1,38 76 15 9 сл

Мастер 0,96 94 2 4 сл

сл- следовое количество, менее 1% 20

По кислотному числу почти все представленные нативные масла соответствуют высшему сорту, за исключением образца из семян линии ВК876 р/, которое соответствует первому сорту. В составе токоферолов этих масел преобладала а-форма, В первых трех маслах & значительном количестве (от 30 яо 37%) содержался и у-токоферол.

Оценка индукционного периода окисления масел различных генотипов полсолнечника была проведена при двух температурных режимах - 110 и 120°С. Результаты Ранцнмат-теста показали, что высокое содержание пальмитиновой кислоты (25,9%) приводит к повышению устойчивости масла к окислению в 1,44 раза. Самый высокий индекс относительной окислитель-нон стабильности превышающий в 7,5 раз контрольный вариант соответствует маслу, полученному из семян линии ВК850 01,1рЬ2, которая сочетает в генотипе три мутации - повышенное содержание пальмитиновой кислоты, высокоолеиновость и ^-токоферол.

Внедрение в производство новых гибридов подсолнечника, генотип которых включает выше перечисленные мутации, позволит создать альтернативу на рынке растительных масел импортному пальмовому маслу, объёмы применения которого в последние годы существенно увеличились.

При хранении в холодильнике при температуре +7°С у некоторых образцов масел образовалась твердая фракция триацилглицеролов.

Нами были получены два фракционированных подсолнечных масла с различающейся температурой плавления: из семян линии ВК850 01,1рЬ2 -+1 ]°С и линии ЛГЗО - +9°С. Обычное подсолнечное масло застывает при температуре -35°С, а высокоолеиновое становится твёрдым при -5°С.

Для изучения влияния фракционирования на жирнокислотный состав и общее содержание токоферолов, являющихся естественными антнокси-дантамн, провели сравнительные исследования химического состава полученных твердых и жидких фракций этих образцов масел.

С целью более полного анализа полученных данных одновременно было проанализировано пальмовое масло из промышленной партии, предоставленное Краснодарским МЖК (табл. 14).

Таблица 14 - Состав жирных кислот и общее содержание токоферолов пальмового и фракционированных подсолнечных масел

ВНИИМК, 2006 г.

Масло Жирные кислоты, % от суммы Обшес содержание токоферолов, мгнз 100 г

С14:0 С 16:0 С16:1 С 18:0 С18:1 С18:2

ВК850 01,1рк2 тв.фр. ж. фр. сл. сл. 20,8 12,9 5,4 6,0 1,3 1,3 663 71,8 6,2 8,0 79 111

ЛГ 30 тв.фр. ж. фр. сл. сл. 30.3 20.4 5,1 62 2,5 3,1 20,4 25,2 41,7 45,1 103 132

Пальмовое М 43,9 0 43 40,6 10,1 79

сл - следовое количество, менее 0,5%

По содержанию пальмитиновой кислоты наблюдались значительные различия. В твердой фракции её содержание было выше на 8-10%, также имелись различия (около 30 мг на 100г масла) по концентрации токоферолов.

В процессе фракционирования жидкая фракция способна обогащаться токоферолами, возможно, благодаря их большей растворимости в жидком масле.

Окислению на приборе Капе ¡та! 743 были подвергнуты два масла -пальмовое и твердая фракция линии ВК850 01,грЬ2 при температуре 120°С в двух повторностях. Результаты анализа показали высокую сходимость единичных определений, расхождение между ними составили менее 1% и имелись большие различия между образцами. По литературным данным индукционный период окисления пальмового масла при температуре 120°С на приборе КапсшШ составляетот9до 15 часов (ЬЗиЬП, 1986, 1988).

В наших испытаниях индукционный период окисления пальмового масла составил в среднем 11,8 часа, а твердая фракция масла из семян линии ВК850 0/,(рЛ2 окислялась 22,0 часа, т.е. в 1,9 раза медленнее.

Таким образом, новые гибриды подсолнечника с измененным составом жирных кислот и токоферолов в семенах могут вызвать интерес различных отраслей промышленности, в особенности масложировой. В свою очередь масл£, полученные из этих семян способны стать основой для производства жиров и маргаринов специального назначения.

выводы

1. Фенотипическое варьирование содержания пальмитиновой кислоты в масле семян сортов и линий подсолнечника определяется интервалом от 4 до 10% при среднем значении 6%. Минимальные значения этого признака имеют высокооленновые генотипы (сорт Круиз, линия ВК876), а максимальными-линии НА413 иВИР721.

2. Созданная константная линия ЛГ30, является донором признака повышенного содержания пальмитиновой кислоты в масле семян (около 24% от суммы кислот). Особенностью фенотипа этой мутации является увеличенное содержание пальмитолеиновой кислоты (около 4%) при следовых количествах у нормы.

3. При понижении температуры окружающей среды во время созревания семян в мутантном фенотипе появляется пальмитолинолевая кислота от 0,2 до 1,5%. На содержание пальмитиновой и пальмитолеиновой кислот температура не оказывает существенного влияния.

4. В семенах р] признак наследуется по типу полного или неполного доминирования обычного содержания пальмитиновой кислоты. В реци-прокных скрещиваниях материнский эффект по содержанию пальмитиновой кислоты в масле семян Р| не наблюдается.

5. Наследование в семенах ^ с оценкой генотипов по Р} и в ВС при скрещивании ВК876 х ЛГ30 соответствовало моногенной модели. Анализ расщепления по средним пробам отдельных корзинок семян Г; в скрещивании с линиями генетической коллекции показал как мокогенное, так и более сложное наследование признака.

6. Онтогенетическая изменчивость признака характеризуется отсутствием проявления мутации повышенного содержания пальмитиновой кислоты в лип идах пыльцы.

7. Идентификация и отбор гетерозиготных по изучаемой мутации растений после анализа состава жирных кислот семядолей 1-2 дневных проростков позволяют получать изогенные линии при непрерывной схеме беккрос-сов.

8. На основе разработанного способа создана отцовская линия ВК850, обладающая генотипически повышенным содержанием пальмитиновой ки-

слоты в масле семян (около 24%) и получено BCs материнской селекционной линии ВК876 с этим признаком.

9. Высокое содержание пальмитиновой кислоты увеличивает окислительную стабильность масла в 1,4 раза на ли нолевой основе и в 7,5 раз на высокоолеиновом фоне ло отношению к обычному маслу.

10. Особенностью масла, полученного из семян мутантных генотипов, является способность к формированию твердой фракции при температуре ■И0°С.

И. Твердая фракция масла, полученного из линии ВК850 Ol,tph2t сочетающей в генотипе признаки повышенного содержания пальмитиновой кислоты и высокоолеиновости, с увеличенной концентрацией у-токоферола окисляется в 1,9 раза медленнее пальмового масла.

РЕКОМЕНДАЦИИ ДЛЯ СЕЛЕКЦИОННОЙ ПРАКТИКИ

1. При селекции подсолнечника на увеличение содержания пальмитиновой кислоты в семенах предлагается использовать донорскую линию ЛГЗО и аналоги селекционных линий ВК850 и ВК876.

2. При создании иэогенных линий по признаку повышенного содержания пальмитиновой кислоты рекомендуется использовать разработанный «Способ создания изогенной линии по доминантному признаку семени у растений».

3. Для более надежной идентификации гетерозигот по признаку повышенного содержания пальмитиновой кислоты необходимо учитывать содержание пальмиталеиновой кислоты.

Основные положения диссертации опубликованы в следующих работах:

1. Ефим ей ко С.Г., Ефименко С.К. Ускоренный способ получения изо-генных линий подсолнечника ло признакам качества масла//Современные проблемы генетики, биотехнологии и селекции растений. (Сб. тезисов международной конференции молодых ученых 2-7 июля 2001 г.). - Харьков, 2001.-С. 166-167.

2, Демурин Я.Н., Ефименко С.Г., Ефименко С.К- Генетический потенциал в создании экологически чистых и энергосберегающих технологий получения

растительных масел с заданными параметрами качества/Я!риоритет России XX) века: от биосферы и техносферы к ноосфере. (Сб. материалов Межпуна-родной научно-практической конференции). - Пенза, 2003. - С. 57-59.

3. Демурин Я.Н., Ефименко С.Г., Ефименко С.К., Перетяги на Т.М., Бори-сенко О.М. Феномен генетической супрессии мутации высокоолеиновосги в семенах F, у подсол нечника//Нзука Кубани. - X» 3 (ч,1), - 2004. - С.52-54.

4. Ефименко С.Г., Ефименко С.К., Демурин Я.Н. Создание линии подсолнечника ЛГЗО с повышенным содержанием пальмитиновой кислоты в масле семян//Научно-технический бюллетень ВНИИМК. — Вып. 1 (132). — Краснодар, 2005. - С. 14-19.

5. Ефименко С.К. Фенотип и ческое варьирование CI6 жирных кислот в масле семян подсолнечника мутантной линии ЛГЗ0//Актуальные вопросы селекции, технологии и переработки масличных культур: сб. докладов 3-й Международной конференции молодых ученых и специалистов (28-30 марта 2005 г.)/ВНИИ масличных культур. - Краснодар, 2005. - 28-30.

6. Ефименко С.К., Бочкарев Н.И., Бочковой АД., Ефименко С.Г. и др. Подсолнечник ВК 850//А вторе кое свидетельство №41441.-28.09.2005.

7. Ефименко С.К., Бочкарев Н.И., Бочковой АД., Ефименко С.Г. и др. Подсолнечник ВК 588//Авторское свидетельство №41439. -28.09.2005.

8. Ефименко С.Г., Ефименко С.К., Демурин Я.Н. Способ создания изо-генкой линии по доминантному признаку семени у растений. - Патент на изобретение №2290785, Москва, 10 января 2007 г.

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Подлисзно в печать 6.04.2007 г. Тираж 100 экз. Формат 60x84 1/16. Гарнитура Times New Roman. Бумага Maestro. Печать трафаретная, Усл-печ. л. 1,63. Заказ Кг 7090.

Тираж изготовлен в типографии ООО «Просвещение-Юг»

с оригинал-макета заказчика 350059, г, Краснодар, ул. Селезнева, 2, тел./факс*. 239-68-31.