Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Биологические эффекты нативных и мутантных рибонуклеаз BACILLUS INTERMEDIUS

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Биологические эффекты нативных и мутантных рибонуклеаз BACILLUS INTERMEDIUS"

еа

(Г;

'о

I, „

О-

С=г

На правах рукописи

КИПЕНСКАЯ ЛАРИСА ВИКТОРОВНА

БИОЛОГИЧЕСКИЕ ЭФФЕКТЫ НАТИВНЫХ И МУТАНТНЫХ РИБОНУКЛЕАЗ ВАСИШБ ШТЕЯМЕОШЭ

03.00.07 - микробиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

КАЗАНЬ -1998

Работа выполнена в лаборатории биосинтеза и биоинженерип ферментов Казанского государственного университета им В.И. Ульянова - Ленина

Научные руководители: доктор биологических наук,

ведущий научный сотрудник Ф.Г. Куприянова - Ашина

кандидат биологических наук, доцент каф микробиологии О Н Ильинская

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник Г.И. Эль - Регистан (Институт микробиологии РАН, Москва)

доктор химических наук, Завлабораторией инженерии ферментов В.П. Варламов

(Центр «Биоинженерии» РАН, Москва)

Ведущая организация:

Институт молекулярной биологии РАН, Москва

Защита диссертации состоится

. при Казани

1998 г. в

часов на заседании

диссертационного Совета К 053.29.19. щ5и Казанском государственном университете им. В.И. Ульянова - Ленина, 420008 г. Казань, ул. Кремлевская, 18.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Казанского государственного университета

Автореферат разослан 23 март® 1998 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат биологических наук ^^ Аскарова

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. К настоящему времени в зарубежной и отечественной литературе большое внимание уделяется биологически активным веществам, которые при действии на микроорганизмы вызывают разные эффекты. Так, на стимулирующее действие в микродозах химических соединений, обладающих мутагенным и ДНК-повреждающим эффектами в высоких концентрациях, впервые обратил внимание Рапоппорт (1960). В последующем стимулирующее действие химических мутагенов было продемонстрировано на различных растительных, животных (Рапопорт, 1980; 1986) и микробных клетках. Не только химические соединения, но и природные вещества, например антибиотики, в высоких концентрациях оказывают бактерицидное действие, тогда как в малых дозах стимулируют рост бактериальных культур (Шигаева, 1979). Аналогичные данные получены и для таких веществ природного происхождения, как ферменты.

Определенный интерес в этом плане представляет внеклеточная рибонуклеаза Bacillus intermedius, разрабатываемая для использования в медицине в качестве противовирусного и противоопухолевого средства, каталитические и физико-химические свойства которой детально изучены (Булгакова, 1974; Голубенко и др., 1979, 1982; Яковлев и др.,1987; Макаров, 1993).

Показано, что РНКаза B.intermedius (биназа) обладает широким спектром биологических эффектов при воздействии на клетки. Известно, что при действии на живую клетку в микродозах РНКаза стимулирует рост и деление микроорганизмов и растительных клеток, повышает уровень митохондриального дыхания микромицетов, вызывает у ряда бактерий и дрожжей активирование биосинтетических процессов и изменение проницаемости клеток для ионов. Установлено, что эффект РНКазы не связан с увеличением в среде культивирования концентрации предшественников нуклеиновых кислот, в том числе продуктов гидролиза РНК (Куприянова-Ашина и др., 1990; Колпаков, 1993; Ильинская, 1995; Колпаков и др., 1996;). Вместе с тем в серии бактериальных тест-систем показано, что этот же фермент в высоких концентрациях обладает выраженным мутагенным действием (Иванченко и др., 1992).

Несмотря на многочисленные данные, касающиеся проявления мутагенного, ростстимулирующего и других эффектов экзогенной РНКазы, механизмы различных биологических эффектов фермента остаются до конца не выясненными. Большая часть исследований проводилась с использованием каталитически активной природной РНКазы, поэтому трудно определить, какой

вклад вносит ферментативная активность в проявление разнообразных видов биологического действия экзогенных рибонуклеаз. Однако, имеются единичные сообщения о том, что ростстимулирующий эффект фотоинактивированной РНКазы в 1,5 раза меньше, чем активной (Колпаков, 1993), а мутагенное, токсическое и антивирусное действие вызывает только нативный фермент (Куриненко и др., 1989; Шпэкауа е1 а1.,1995) Вместе с тем литическое и статическое действие по отношению к клеткам карциномы Эрлиха вызывается в одинаковой степени инактивированным и активным ферментом (Куриненко и др., 1988).

Таким образом, анализ данных литературы на сегодняшний день позволяет признать, что вклад каталитической активности в проявление тех или иных функций экзогенных РНКаз неодинаков. По-видимому, эффект РНКазы связан как с ее ферментативной активностью, так и мембанотропными свойствами белка. При этом преобладающая роль одной из этих двух составляющих в каждом случае достаточно индивидуальна. Безусловно необходимо дальнейшее изучение механизмов, ответственных за переключение биологических процессов, обуславливающих разнообразные эффекты РНКазы.

Все изложенное свидетельствует об актуальности проблемы регуляции клеточного ответа на внешнее воздействие с участием РНКазы ВлгиегтесНиз. Для расширения представлений о проявлении биологических эффектов РНКазы нами впервые предложено исследовать эффекты мутантных РНКаз, полученных методом сайт-специфического мутагенеза, с пониженной активностью.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы является выяснение механизмов, участвующих в переключении ответа клеток бактерий при воздействии природной РНКазой Влгйегтеёшз и ее мутантными производными в ростстимулирующих и ростингибирующих дозах.

В задачи экспериментальных исследований входило:

1. Получение гомогенных препаратов РНКазы В.ийегтесНш и ее производных с различной ферментативной активностью, полученных методом сайтнаправленного мутагенеза.

2. Изучение действия на рост культур грамотрицательных и грамположительных бактерий РНКаз с различной величиной каталитической активности.

3. Выявление БОБ-индуцирующей функции экзогенной РНКазы ВлгиегтесПиз с целью выяснения роли каталитической аткивности в процессе индукции ЗОБ-ответа бактериальной клетки и генотоксического действия фермента.

4. Изучение влияния РНКазы B.intermedius на функции мембраны (возрастание проницаемости) бактерий в зависимости от концентрации фермента и его каталитической активности.

Научная новизна работы. Впервые были получены и очищены до химически гомогенного состояния мутантные производные РНКазы B.intermedius, которые имели единичные замены аминокислотных остатков в каталитическом участке активного центра фермента и отличались по величине каталитической активности от природной РНКазы. Полученные мутантные формы с заменами Lys 26 на Ala и His 101 на Glu имели активность при расщеплении различных субстратов 30% и 2,5%, соответственно, от активности исходной бациллярной РНКазы.

Установлено, что РНКазы с различной каталитической активностью в определенной низкой концентрации способны стимулировать рост культур бактерий E.coli и B.subtilis. Ростстимулирующий эффект проявляется в одинаковой степени независимо от различий в строении клеточных поверхностей грамотрицательных и грамположительных бактерий. Максимальное стимулирующее действие наблюдается при одинаковой концентрации ферментов (0,001-0,01 мкг/мл), имеющих разную активность. Основной вклад в процесс стимуляции роста и деления бактериальных клеток вносит каталитическая активность РНКазы; эффект природной бациллярной РНКазы выражен в 3 раза сильнее, чем ее мутантной формы с 2,5% остаточной ферментативной активности.

Показано, что бациллярная природная РНКаза в высоких концентрациях (1000 мкг/мл), превышающих ростстимулирующую на 5-6 порядков, обладает мутагенным действием. SOS-ответ клетки на тест-штамме E.coli индуцируется только при наличии ферментативной активности у РНКазы, неактивная HislOlGlu-РЫКаза в той же концентрации не индуцировала SOS - ответ клетки.

Отмечено, что под действием каталитически активной биназы в ростстимулирующей дозе, в отличие от малоактивной HislOlGlu-РНКазы, происходит изменение ионной проницаемости бактерий E.coli и B.subtilis. Бациллярная РНКаза в высоких концентрациях, близких к мутагенным (100-1000 мкг/мл), индуцирует выход свободных нуклеотидов из клеток E.coli и B.subtilis.

Таким образом, впервые получены данные, позволяющие считать, что тригтерным механизмом, ответственным за проявление того или иного ответа клетки на воздействие РНКазы, являются функциональные изменения в мембранах, которые возникают в процессе перехода от низких доз к высоким.

Практическая ценность работы. РНКазы с различной активностью, полученные в результате сайт-направленного мутагенеза, могут быть использованы в качестве инструмента при разработке способов их применения в

медицине, различных отраслях микробиологической промышленности, когда £ каждом конкретном случае для проявления эффекта требуется каталитическая активность или он может быть вызван инактивированным ферментом.

Индукция мутаций РНКазой в высоких концентрациях, связанная с каталитической активностью фермента на уровне популяции может быть рассмотрена как благоприятный фактор, увеличивающий возможность ее выживания в природных условиях.

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы были доложены на Международной конференции «Геном. Структура и функциональный анализ» (Москва, 1994); IV Международной конференции по биотехнологии (Мельбурн, Австралия, 1995); Международной конференции, посвященной 100 летию Бейеринка (Гаага, Нидерланды, 1995); VII Европейском конгрессе по биотехнологии (Ница, Франция, 1995); IV Международном симпозиуме «Рибонуклеазы» (Гронинген, Нидерланды, 1996); III Международной конференции по молекулярной биологии (Москва, 1997); XI Всероссийской конференции «Ферменты микроорганизмов'98» (Казань, 1998).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 13 работ.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 107 страницах машинописного текста; состоит из обзора литературы, описания материалов и методов исследований, раздела собственных исследований, обсуждения результатов, выводов и списка литературы. Работа содержит 13 таблиц, 13 рисунков. Список литературы содержит 106 отечественных и 67 иностранных авторов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В работе использованы штаммы грамположительных и грамотрицательных бактерий, описанные в таблице 1.

Перечень использованных штаммов бактерий Таблица 1

Штаммы Генотип Источник

Escherichia coli (SURE) (e 14-(mcrCB-hsdSMR-mrr) 171, sup E44, thi-1, gyrA96, end Al, relAl, lac, recB, recj, sbcC, umuC::Tn5 (kanr), uvrC, [F, proAB, laclqZM15, TnlO, (tet')l ). Предоставлен Др.Р.Хартли (США)

Escherichia coli PQ37 sñ A::Mud (Ap, lac) cts Lac ДШ69, mal+, uvr A, gal E, gal Y Pho C, rfa. ГосНИИ Генетика, Москва

Escherichia coli wp2(trp") trp'E ГосНИИ Генетика, Москва

Bacillus subtilis 168 дикий тип ГосНИИ Генетика, Москва

Bacillus intermedius 7P дикий тип КГУ,каф.микро-биологии, Казань

Объектом исследования служила внеклеточная рибонуклеаза Bacillus ntermedius и ее мутантные производные (табл.2).

Исходная рибонуклеаза была изолирована из культуральной жидкости 3.intermedius 7Р, очищена до гомогенного состояния с молекулярной массой 12300 Да. Физико-химические и каталитические свойства описаны (Голубенко и Ф., 1979).

Рекомбинантная РНКаза и ее мутантные формы выделены из культуральной •к ид кости бактерий E.coli SURE (табл.1), трансформированных :оответствующими плазмидами (табл.2).

Перечень рекомбинантных штаммов бактерий Таблица 2

Штаммы микроорганизмов, Трансформация Замены аминокислотных

«сущие плазмиды с генами РНКаз плазмидами остатков

B.intermedius — нативная(исходная) биназа

E.coli (SURE) pMl 163 рекомбинантная РНКаза

E.coli (SURE) pMl 164 Lys26Ala

E.coli (SURE) pMl 165 Arg58Lys

E.coli (SURE) pMl 166 ArgölGln

E.coli (SURE) pM1703 HislOlGlu

Выделение плазмид проводилось щелочным методом (Birnboim, Doly, 1979).

Все плазмиды, клонированные в E.coli, содержат ген ингибитора барназы

'барстар), так как суперпродукция бациллярных РНКаз детальна для клеток

E.coli. Трансформацию компетентных клеток плазмидной ДНК проводили с

применением СаС12 (Maniatis et. AI., 1982). Культуры рекомбинантных штаммов

эактерий E.coli и дикого типа выращивали в среде, описанной Hartley (1988).

Последовательность операций очистки РНКаз схематически изображена на рис.1.

Культуральная жидкость I

Хроматография на фосфоцеллюлозе Рц

4-

Элюция 0.2М Na-фосфатным буфером pH 7.0 i

Рехроматография на фосфоцеллюлозе Рц 1

Градиентная элюция (0,02-0,5М) Na-фосфатным буфером pH 7.0

I

Концентрирование на фосфоцеллюлозе Рц

А

Обессоливание на сефадексе G-2S Лиофильная сушка Рис.1 Схема очистки исследуемых РНКаз.

Активность РНКаз определяли по модифицированному методу Анфинсена 'Лещинская, 1980) используя в качестве субстрата высокополимерную

дрожжевую РНК. За единицу активности принимали количество фермента способного увеличить поглощение кислоторастворимых продуктов гидролиз; РНК при 260 нм на 1 единицу в минуту при 37°С и рН 8.5.

Для определения фосфодиэстеразной и фосфомоноэстеразной активностей i качестве субстрата использовали бис-паранитрофенилфосфат \ паранитрофенилфосфат, соответственно.За единицу активности принимал! увеличение оптической плотности при 420 нм в опытной пробе по сравнению < контрольной в пересчете на мл ферментного раствора и 1 час инкубации (ед/час).

ДНКазную активность определяли по количеству продуктов гидролиза ДНК растворимых в 2% НСЮ4. За единицу активности принимали количестве фермента, которое вызывает прирост оптической плотности при 260 нм на 1 опт.ед. за час инкубации.

Степень чистоты препаратов и молекулярные массы определял! электрофорезом в 12,5% ПААГ (полиаклиламидном геле) в присутствш додецилсульфат натрия (DS-Na) (Laemmli, 1970)

Дополнительным методом, подтверждающим гомогенность препарата служил эксперимент по проведению изоэлектрофокусирования. Разделение шл< на колонке LKB в стабилизирующей смеси амфолинов, образующей на колонк градиент рН от 8.0 до 10.0 и градиенте плотности сахарозы от 0 до 40%.

Кинетические параметры реакций расщепления poly(A), poly(I) и GpA по, действием биназы и ее мутантных производных и определения их концентраци исследовали спектрофотометрическим методом при следующих коэффициента экстинкции: GpAA£2so=9760 М"1 • см1 при рН 7.0 (Osterman, Walz, 1978), poly(I Де248 =10,000 м"1 • см"1 при рН 7.8 (Chamberlin, Patterson, 1965), poly(A Д£257=10,000 М"1 см"1 при рН 7.5 (Blake, Fresco, 1966).

Ионную проницаемость мембран контролировали измерение! сопротивления клеточных суспензий по экзоосмосу электролитов из клеток помощью реохордного моста ВМ 401 Е фирмы "Tesla" (Чехословакия (Маленков, 1976).

Выход нуклеотидов из клеток определяли по изменению поглощени супернатанта реакционной смеси при 260 нм на СФ-26 (Конев. 1972).

SOS-хромотест проводили согласно методу (Quillardet and Hofnung, 1985).

Активность р-галактозидазы и щелочной фосфатазы определяли по метод; описанному Миллером (1976).

SOS-ответ, индуцируемый тестируемым соединением, оценивали ка положительный, если эффект дозо-зависим и фактор индукции (IF) превышае 1,5 (Mersch-Sundermann et al., 1992).

Для определения влияния РНКаз на размножение бактерий испытывали действие исходной биназы и ее мутантных производных.

Культуры бактерий E.coli wp2 tip'растили при 37°С, B.subtilis 168 - при 28°С в условиях принудительной аэрации в мясо-пептонном бульоне (МПБ). Инокулятом служила 12-ти часовая культура, которую подращивали до начала экспоненциальной фазы роста (3 часа) в МПБ. При исходной концентрации клеток 10-12'Ю6 на 1 мл среды РНКазы добавляли в культуру в дозах 1000 -0.0001 мкг/мл. Концентрацию вносимого фермента измеряли спектрофотометрически при 280 нм. Рост культуры контролировали подсчетом клеток в 1 мл микробной взвеси в камере Горяева с помощью фазово-контрастной микроскопии. Влияние ферментов на рост культур E.coli и B.subtilis определяли по количеству клеток в микробной взвеси через 3 часа культивирования.

Контролем во всех опытах служили клетки, выращенные в среде без внесения исследуемых РНКаз.

Статистическая обработка результатов проводили минимум в пяти повторностях. Анализ полученных данных осуществляли с использованием компьютеризованного теста Стьюдента, принимая критерий Р<0.05 достаточным для достоверной разницы в результатах.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. Выделение и очистка РНКазы B.intermedius, разработка стратегии получения ее мутантных форм

Учитывая, что для развития представлений о механизмах биологических эффектов экзогенных РНКаз принципиальное значение имеет выяснение связи этих эффектов с их каталитической активностью, нами была поставлена задача получить мутантные формы РНКазы B.intermedius с разной ферментативной активностью. С этой целью, прежде всего, была получена рекомбинантная РНКаза путем трансформации бактерий E.coli SURE (табл.1) плазмидой pML163, несущей структурный ген биназы. Помимо этого, были получены мутантные производные РНКазы с заменой аминокислот в разных участках активного центра фермента методом сайт-специфического мутагенеза.

Для изучения специфичности действия РНКаз на различные субстраты и проявления их биологических эффектов необходимо было иметь значительные количества высокоочищенных ферментов. На рис.] схематически представлена последовательность операций очистки РНКаз.

Нативную РНКазу выделяли из культуральной жидкости B.intermedius, рекомбинантную биназу и ее мутантные производные выделяли из культуральной жидкости E.coli (SURE) стационарной фазы роста. В освобожденную от

биомассы культуральную жидкость вносили фосфоцеллюлозу Р1Ь уравновешенную 0,05М Na-ацетатным буфером рН 5,0. Элюцию фермента проводили в условиях линейного градиента концентрации фосфата Na от 0.02 до 0,5М рН=7,0. На этой стадии была достигнута очистка ферментов от 2,8 до 5,3, выход по белку уменьшился в 10-11 раз, по активности - в 2-4 раза у разных форм РНКаз (табл.3).

Учитывая высокую избирательность для данного фермента фосфоцеллюлозы, обусловленную сродством РНКаз к неорганическому фосфату, а также ионообменными свойствами катионита, для получения гомогенного фермента с одновременным концентрированием его провели операцию рехроматографии на фосфоцеллюлозе. Фермент элюировали в узкой зоне концентрации фосфата натрия. Из данных таблицы 3 видно, что выход РНКазы по белку составляет 6%. При этом в очищенных препаратах не было обнаружено moho-, фосфодиэстеразной и ДНКазной активностей.

Очистка рекомбинантной РНКазы из E.coli pML 163 Таблица 3

Стадии очистки V, мл Белок по Бред-ферду мг Активность Удельная активность на мг белка Степень очистки Выход, %

ед/мл эбщая по белку по активности

Культуральная жидкость 4000 820 407 1629333 1986 1.0 100 100

После фосфоцеллюлозы 450 109 1238 557100 5111 2.6 13.3 34

После элюции 100 87.7 4916 481600 5491 2.8 10.7 29.5

После концентрирования каРц 75 50 6121 459075 9182 4.6 6.0 28.1

Гомогенность очищенных препаратов бяназы и ее мутантных форм подтверждена электрофорезом в полиакриламидном геле в присутствии детергентов. По результатам электрофореза и последующего сканирования геля на ULTRG Scan XL чистота препаратов ферментов составляла 99% при удельной активности в принятых единицах (1 '106/мг белка).

Дополнительным методом, подтверждающим гомогенность препаратов служили результаты изоэлектрофокусирования. Разделение РНКаз шло на колонке LKB в стабилизирующей смеси амфолинов, образующих градиент рН от 8,0 до 10,0 и градиенте плотности сахарозы от 0 до 40%. После окончания фореза в каждой фракции определяли рН и поглощение при E2so- Белок концентрировался в виде единственного пика в области рН=9,5, т.е. изоточка

фермента соответствует этому значению, что согласуется с данными литературы (Голубенко, 1979). В собранных фракциях белкового пика была измерена активность по отношению к РНК и врС. Результаты электрофокусирования биназы представлены на рис.2. Было обнаружено, что отношение активностей РНКазы при использовании в качестве субстратов РНК и врС одинаково для каждой фракции. Аналогичные картины были получены в результате электрофокусирования рекомбинантной и мутантных форм.

При исследовании спектральных свойств химически гомогенного фермента (рис.3) выявлены следующие спектральные отношения Е28о/Е2бо=2,2; Е28о/Е250=3,9. При Е290.292 имеется характерное "плечо", обусловленное высоким содержанием триптофана (Афанасенко, 1979).

30 ЗЬ 2» //аиияаяаашИ

ИМ

Рис.3 УФ - Спектр поглощения РНКазы В.цИегтеёшз.

Рис.2 Белковый пик РНКазы ВлШегтесНиз, изолированный методом изофокуси-рующего фореза.

Следует указать, что значения спектральных отношений являются наиболее простым, надежным и удобным тестом для оценки чистоты и "нативности" препарата, поскольку денатурация РНКазы проявляется прежде всего в увеличении поглощения в коротковолновой области ее УФ спектра и, соответственно, в уменьшении значений характеристических спектральных отношений Е28()/Е2бо и Е28о/Е25о. Таким образом, гомогенность исследуемых РНКаз показана нами по функциональным, химическим и физическим тестам.

Исследование ферментативной активности у очищенных РНКаз показало, что у природной и мутантных форм она существенно различается. Хотя скорость гидролиза субстрата РНКазами изменялась гиперболически с увеличением концентрации фермента, наиболее высокая нуклеолитическая активность была

характерна для исходной бациллярной биназы. Мало отличался этот показатель (на 7%) у рекомбинантной РНКазы, в то время как у мутантных производных значительно уменьшался. При сохранении ферментативной активности на высоком уровне у РНКаз: Arg58Lys и ArgólGln (95%), у РНКаз Lys26Ala и HislOlGlu величина этого показателя составляла лишь 13-30% и 2,5-5.0%, соответственно, от активности исходного фермента, соответственно.

Для выяснения вопроса, чем же обусловлено изменение каталитической активности у мутантных форм биназы провели анализ кинетических параметров (kcai, Кю) гидролиза различных субстратов. Сравнение кинетических параметров реакций РНКазы B.intermedins и ее мутантых форм было сделано на основе отношения величин kcat /Кт При этом исходили из данных (Yakovlev, 1993), что реальные и наблюдаемые значения kcat и Кга для бациллярных РНКаз, в том числе для биназы, могут существенно различаться вследствие сильного влияния непродуктивного связывания субстрата. Влияние непродуктивного связывания субстрата приводит к уменьшению kcal и Кт на величину 1+KS/KS', где Ks и Ks'-константы диссоциации продуктивного и непродуктивного комплекса, соответственно.

Таблица 4

Кинетические параметры гидролиза полинуклеотидов и GpA РНКазой Bacillus intermedias и ее мутантами с заменами His10IGlu, Lys26Ala, Arg58Lys и

РНКаза Субстрат WCs"') Кт(цМ) kcat/Km (|lM"'s"')

Нативная GpA 8.1 2000 4.1 • 10"2

рекомбинантная* poly© 268.0 37 7.2

poly(A) 9.4 40 2.4 • 10"2

Arg58Lys GpA 6.0 3.2-10"' 1.8-10

poly(I) 318 2.7- 10"2 1.2- 102

poly(A) 4.0 1.9-10"1 2.1 • 10

GpA 9.3 2.2 • 10"' 4.3 • 10

Arg6'Gin poly® 252 4.4- 10"2 5.7 • 102

poly(A) 6.0 2.5-10"' 2.4 • 10

Lys26Ala GpA 1.3 190 6.8 • 10"J

poly© 184.0 77 2.4

poly(A) 2.2 70 3.1 • 10"2

GpA 0.2 180 1.1 • 10"J

His10IGlu poly© 4.7 32 1.5 • 10

poly(A) 0.3 53 6.0 • 10"3

a Различие в активностях бациллярной и рекомбинантной РНКаз менее 7%.

Кинетические параметры реакции гидролиза субстратов под действием биназы и ее мутантых производных представлены в табл.4. Как видно из данных таблицы 4, при замене Arg58 на остаток Lys величина kcat /Кт практически не изменилась. Это является подтверждением того, что Arg, участвуя в связывании

субстрата, не принимает участия в фермент-субстратном взаимодействии. Замена положительно заряженного Argól на отрицательно заряженный Gin так же не привела к значительному изменению величины kcat/Km, что подтверждает теоретически предсказанную его роль, заключающуюся в специфическом связывании нуклеотидного основания субстрата.

Относительно умеренное понижение активности фермента (13-33%) при замене остатка Lys26 на Ala обуславливается изменениями как kcat) так и Кт для полимерных субстратов и изменением только kcat для GpA.

Каталитическая активность мутантной формы биназы с заменой положительно заряженного остатка HislOl на отрицательно заряженный остаток Glu при гидролизе различных субстратов составляет 2.0-2.7% от величины каталитической активности нативного фермента. Снижение активности определяется, главным образом уменьшением молекулярной константы скорости kcat при почти неизменном фермент-субстратном сродстве, характеризуемом Кш. Это ожидаемый результат, если HislOl действует как обычная кислота, отдающая протон уходящей группе в ходе ферментативного расщепления фосфодиэфирной связи. Показано, что активность фермента зависит от степени протонизации остатка с определенной рК, пропорциональной коэффициенту 1/(1+10рН~рК) (Fersht, 1977). Тогда, при замене такого остатка с pKi остатком с рК2 отношение активностей А] и А2 равно:

А,/А2=( 1+10рН"рК2)/( 1+10рН-рК1)

Если учесть, что величина рК для HislOl-биназы, найденная из рН-зависимости kcat/Km составляет 6.5, а ожидаемая рК карбоксильной группы остатка глутаминовой кислоты мутанта HislOlGlu составляет 4.2-4.5 (Karpeisky, 1981), то ожидаемая относительная активность биназы при замене HislOl на Glu составит 1.5-2.9% от активности природного фермента. Таким образом, наблюдаемое нами понижение активности фермента соответствует ожидаемой величине. Эта роль HislOl как донора протона аналогична таковой для гомологичного фермента - Hisl02Gln-6apHa3bi, как сообщено Моссаковской с юавторами (1989).

2. Биологические эффекты экзогенных РНКаз в зависимости от каталитической активности 2.1. Ростстнмулирующее действие РНКаз B.intermedius В связи с поставленной задачей выявить зависимость эффектов биназы от ;е ферментативной активности исследования проводились как с нативной РНКазой B.intermedius, так и с рекомбинантной РНКазой и ее производными с мутациями в каталитическом сайте активного центра, которые отличались по величине ферментативной активности. В связи с тем, что активность мутантных

РНКаз с заменами остатков Arg58 и Arg61 практически не отличалась от таковой у исходной биназы, биологические эффекты Arg58 Lys и ArgôlGlu РНКаз не изучались.

На первом этапе исследований были подобраны оптимальные условия для выявления ростстимулирующего действия исходной РНКазы B.intennedius на бактерии E.coli wp2 (trp") и B.subtilis 168. В условиях периодического культивирования бактерий было установлено, что за трехчасовой период инкубации в присутствии биназы, внесенной в среду одновременно с инокулятом, численность популяции возрастала на 30-35% в зависимости от вида бактерий и дозы фермента. Из данных таблицы 5 видно, что ростстимулирующий эффект РНКазы наблюдается в узкой зоне низких концентраций фермента (0,01-0,001 мкг/мл). Добавленная в среду биназа в больших дозах (1000 мкг/мл) угнетает развитие популяции, т.е. установленная для дрожжей дозозависимость эффекта РНКазы (Колпаков, 1993) подтверждается и на бактериальных культурах.

Таблица 5.

Влияние РНКазы B.intermedius на размножение бактерий в зависимости от

концентрации

Концентрация фермента, мкг/мл Штаммы бактерий

B.subtilis 168 E.coli wp 2 (trp")

1 2 1 2

Контроль 114,4 100 109,8 100

1000 80,1 70 79,1 72

100 89,2 78 82,4 75

10 97,2 85 94,4 86

1 113,4 93 108,0 98

0,1 120,0 105 116.4 106

0,01 146.0 128 148.1 135

0,001 158,4 138 149,7 136

0,0001 129,6 ИЗ 126,5 115

1 - количество клеток в млн/мл

2 - количество клеток % к контролю, принятому за 100

Имея набор ферментов с разной каталитической активностью, но структурно идентичных нативной биназе, исследовали влияние их на рост культур бактерий с учетом условий, при которых максимально проявлялся эффект исходного каталитически активного фермента. Как оказалось, все исследуемые нами РНКазы стимулируют размножение бактерий Е.соН. При этом эффект исследуемых РНКаз является дозозависимым (рис.4). Несмотря на

различия в величине каталитической активности, максимальный эффект регистрируется при одинаковых концентрациях ферментов (0,01-0,001 мкг/мл). Обращает на себя внимание наличие положительной корреляции между степенью стимулирующего эффекта и величиной ферментативной активности РНКаз. Так, наибольшая стимуляция размножения бактерий наблюдается при действии ферментов с высокой каталитической активностью. Мутантные же белки с пониженной активностью вызывают эффект в значительно меньшей степени. Аналогичные результаты получены для бактерий В.БиЫШз.

нативная РНК аза

Ь у б2 6 А 1а - Р Н К аза НЬ10Ю1и - Р Н К аза

0,1 0,01 0,001 0,0001 концентрация фермента, мкг/мл

Рис.4. Прирост биомассы Е.соИ через 3 часа инкубации в присутствии микродоз РНКаз. Контроль -100%, среда без фермента

В связи с полученными данными можно заключить, что основной вклад в процесс стимуляции роста и деления клеток вносит именно ферментативная активность РНКазы.

2.2 Генотокснческин эффект исходной РНКазы Вл^егтесИиБ н неактивной ШэЮЮЫ-РНКазы

С учетом данных таблицы 5, указывающих на замедление роста бактериальных культур бациллярной РНКазой в высоких концентрациях (1-1000 мкг/мл, соответственно 1-1000 млн. ед. акт/мл), нами была оценена токсичность активной биназы по отношению к тест-штамму Е.соН РОЗ 7. Результаты тестирования РНКазы показали, что под действием исходной биназы рост культуры В.БиЫШэ угнетается на 15-30% в зависимости от ее концентрации, в то время как неактивная ИзЮШЫ РНКаза в этих же дозах не оказывала влияния на размножение бактерий. Существенно, что уменьшение численности популяции под действием РНКазы не вызвано отмиранием клеток, поскольку число окрашенных метиленовой синью бактерий не превышало уровень их

спонтанного отмирания в культуре без фермента.. Следовательно, уменьшение количества клеток обусловлено угнетением роста и деления клеток.

Опираясь на данные литературы о том, что некоторые ферменты (дезоксирибонуклеаза, рибонуклеаза, лизоцим) мыуг вызывать индукцию профага (Габрилович, 1970; Иванченко, 1993), которая является одним из проявлений ЗОБ-ответа клетки, провели серию экспериментов по оценке 805-индуцирующего действия нативной и мутантной РНКазы в вОБ-хромотесте на штамме Е.соН Р<337. Как показано на рис.4, каталитически активная исходная РНКаза в концентрации 1000 мкг/мл индуцировала БОБ-ответ на тест-штамме Е.соН. В то же время БОБ-индуцирующая способность у РНКазы Из10Ю1и отсутствовала. Отмечено, что между величиной фактора индукции и величиной каталитической активности наблюдается прямая корреляция (корреляционный коэффициент равен0,94).

я ©

3

2.5 -2 -1.5 -1 -0.5 -0 --

1-Бациллярная биназа

2-Рекомбинантная биназа

3-Lys26Ala

4-Hisl 01 Glu

-f-

—1—

1 2 3

Концентрация, 1 мг/мл

Рис. 4 Индукция SOS - ответа под действием РНКаз.

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о способности бациллярной РНКазы в высокой концентрации, превышающей ростстимулирующую на 5-6 порядков, вызывать БОБ-ответ клетки, что говорит о ее генотоксичности. Отсутствие мутагенного действия Н1з10Ю1и РНКазы в той же концентрации (1000 мкг/мл) указывает на то, что БОБ-функции в клетках бактерий могут быть индуцированы лишь при наличии каталитической активности РНКазы.

4

2.3 Изменение функций цитоплазматической мембраны бактерий под действием РНКазы в зависимости от ее каталитической активности

Изучение влияния РНКазы Вл^егтеёшБ на культуры бактерий Е.соН и В.БиЫШз показало, что одно и тоже вещество в зависимости от концентрации обладает разными биологическими эффектами: ростстимулирующим и

мутагенным. На основании данных литературы о мембраннотропности экзогенных РНКаз (Куриненко с соавт., 1986; Ильинская и Крылова, 1995) можно предположить, что регистрируемые эффекты обусловлены изменениями функциями цитоплазматической мембраны бактерий. Нами установлено, что под действием природной РНКазы B.intermedius в ростстимулирующей дозе происходит изменение проницаемости мембран для ионов. Неактивная HislOlGlu - РНКаза в той же концентрации не влияла на ионную проницаемость бактерий. Это свидетельствует о том, что наблюдаемый эффект связан с каталитической активностью фермента.

Известна способность панкреатической РНКазы в концентрации около 100 мкг/мл, т.е. в дозах, превышающих ростстимулирующую на 3-4 порядка, вызывать эффективный выход нуклеотидов из дрожжевых клеток (Конев, 1972). В связи с этим представляло интерес выяснить, насколько этот эффект зависит от каталитической активности РНКазы при воздействии ее на бактериальные клетки. Определение выхода нуклеотидов из клеток E.coli и B.subtilis под действием исходной РНКазы B.intermedius показало, что фермент в высоких концентрациях, угнетающих рост культур бактерий, и вместе с тем, вызывающих мутагенный эффект, способствует существенному выходу нуклеотидов из клеток в сравнении с контролем. При действии на E.coli рекомбинантной РНКазой, характеризующейся той же величиной нуклеолитической активности, что и исходная биназа, максимальный выход нуклеотидов из клеток регистрируется в диапозоне концентраций 100-1000 мкг/мл и составляет 134-136%. Воздействие на E.coli Lys26Ala-PHKa30H, у которой сохраняется около 30% активности вызывает увеличение выхода нуклеотидов из клеток всего на 10-14%. Инкубация бактерий с HislOlGlu-РНКазой с остаточной активностью 2,5% мало влияет на проницаемость мембран E.coli для нуклеотидов (табл.6).

Таблица 6

Выход нуклеотидов (% к контолю) из клеток, инкубированных с РНКазами.

РНКаза Культуры бактерий Концентрация < юрмента, мкг/мл

0,01 0,1 1 10 100 1000

Нативная. 106ед/мг бежа E.coli 100 100 100 115 134 136

B.subtilis 100 100 108 127 139 140

Lys26Ala 3'105ед/мг белка E.coli 100 100 106 111 110 111

B.subtilis 100 100 100 109 113 114

HislOlGlu 3'104ед/мгбелка E.coli н/и н/и н/и 105 103 105

B.subtilis н/и н/и н/и 100 100 101

н/и - не исследовали

Таким образом, наблюдается положительная корреляция между "утечкой" нуклеотидов из клеток, концентрацией фермента и его активностью. На основании полученных данных можно заключить, что изменение функции мембран (проницаемость) зависит от каталитической активности и концентрации фермента. Если при малых (ростстимулирующих) дозах наблюдается изменение электропроводности клеток, то при высоких (мутагенных) дозах РНКазы возрастает проницаемость мембраны для свободных нуклеотидов.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

В результате проведенной работы был разработан новый подход к исследованию механизмов биологических эффектов экзогенных РНКаз. Опираясь на данные Хартли (1989), полученные для РНКазы B.amyloliquefaciens (барназы), имеющей 84% гомологии с РНКазой B.intermedius (биназы), мы сделали попытку сконструировать биназу с различной величиной ферментативной активности. С помощью метода сайт-специфического мутагенеза нами были получены производные биназы, у которых в каталитическом участке активного центра были произведены замены аминокислотных остатков His 101 на Glu, Lys26 на Ala. Активность полученных ферментов составляла 2,5% и 30%, соответственно, от активности природного фермента. Таким образом, подтвердилось наше предположение о влиянии тех или иных мутаций на активность РНКазы B.intermedius и был получен инструмент для дальнейших исследований.

Изучение ростстимулирующего действия РНКаз с различной активностью на бактерии E.coli и B.subtilis показало, что максимально эффект проявляется при определенных низких концентрациях (0,001-0,0001 мкг/мл), хотя РНКазы существенно отличались по ферментативной активности. По видимому сам ферментный белок благодаря мембранотропности оказывает определенное воздействие на клетки. Однако, поскольку ростстимулирующий эффект бациллярной и активной формы рекомбинантной РНКазы выражен почти в 3 раза больше, чем у His 101 Glu-РНКазы с активностью, составляющей всего 2,5% от нативного фермента, было сделано заключение, что основной вклад в процесс стимуляции роста и деления бактерий вносит именно каталитическая активность.

Для объяснения механизма ростстимулирующего действия РНКазы мы исходили из гипотез, базирующихся на известных данных литературы. Одна из гипотез основана на возможности проникновения каталитически активной РНКазы в клетки микроорганизмов. В этом случае фермент, сохраняя свою активность в течение какого-то времени мог бы непосредственно воздействовать на метаболизм нуклеиновых кислот. С использованием методов люминесцентной

микроскопии и электронномикроскопического анализа ультратонких срезов клеток экзогенные ферменты: эндонуклеаза S.marcescens (Беляева с соавт., 1977), панкреатическая ДНКазы (Куприянова-Ашина с соавт., 1992), РНКаза

B.intermedius (Егоров с соавт., 1994) были обнаружены в клетках дрожжей

C.tropicalis. Однако, вопросы проникновения экзогенных нуклеаз в клетку до настоящего времени остаются дискуссионными, поскольку работы указанных авторов не раскрывают полностью механизмы транспорта ферментов в клетку и оставляют открытыми вопросы сохранения каталитической активности проникших в клетку нуклеаз.

Альтернативной является гипотеза, объясняющая ростстимулирующий и другие эффекты РНКазы как результат опосредованного влияния ее на микроорганизмы через мембранотропные взаимодействия. О мембранотропном действии РНКазы B.intermedius свидетельствуют также данные последних лет, установленные при изучении иммуномодулирующего и противовирусного эффектов (Нехорошкова с соавт., 1988; Куриненко, 1991), электрофоретической подвижности микромицетов (Ильинская, Крылова, 1994), электропроводности дрожжей рода Candida (Колпаков, 1993).

Данных относительно изменения функций мембран бактериальных клеток в зависимости от величины каталитической активности РНКазы в литературе мы не встретили. Проведенные нами исследования электропроводности грамположительных и грамотрицательных бактерий, инкубированных с исходной биназой (уд.акт.1млн.ед-100%) и HislOlGlu-РНКазой (25тыс.ед-2,5% активности), позволили установить, что изменение проницаемости клеток для ионов зависит от каталитической активности. Если исходная РНКаза повышала электропроводность бактерий на 20%, то под действием практически неактивной РНКазы (HislOlGlu) в той же ростстимулирующей концентрации (0,01 мкг/мл) ионная проницаемость клеток оставалась на уровне контрольного варианта.

С точки зрения Маленкова (1976) изменение ионной проницаемости является следствием разрушения ферментом РНК, ассоциированной с мембраной. Такое убеждение автора подтверждается данными литературы о наличии РНК в наружном слое цитоплазматической мембраны дрожжей, клеток Neurospora crassa. РНК также была обнаружена на поверхностных структурах различных клеток высших 0praHH3M0B(Fisscher, Mueller, 1968; Burka, Schickling, 1970; McKeel, Jarctt, 1970). Результаты наших исследований в определенной мере согласуются с данными Маленкова (1976), так как ростстиимулирующий эффект тесно связан с наличием каталитической активности у РНКазы и, видимо, полностью определяется теми изменениями поверхности клеток, которые происходят в результате разрушения РНК, ассоциированной с мембраной.

Проявление ростстимулирующего эффекта мутантного фермента (НЦз10Ш1и-РНКаза), хоть и в незначительной степени (11%), вероятно, можно объяснить, учитывая данные литературы, что каталитически неактивные белковые аналоги РНКазы, не обладая способностью к гидролизу субстрата, способны тем не менее к аффинному взаимодействию с нуклеотидными лигандами (Карпейский, Яковлев, 1986; Куриненко, 1986). В связи с этим можно ожидать, что ростстимулирующий эффект может быть обусловлен как ферментативным действием РНКазы, так и аффинными свойствами фермента по отношению к мембранной РНК, хотя в последнем случае он менее выражен. Кроме того, эффект, вызванный неактивной РНКазой, можно объяснить также конформационными перестройками мембраны вследствие электростатического взаимодействия белок-мембрана (А1рег, Ва1пко, 1967; Конев, 1972).

Не менее интересной представляется гипотеза формирования клеточного ответа на воздействие РНКаз через систему вторичных посредников. Возмущения, возникающие в мембранах, модифицированных сорбированным на них белком и/или ферментативным разрушением мембранной РНК, могут приводить к изменению активности мембранных ферментов, в том числе аденилатциклазы, что было показано в работах Колпакова (1993).

Изменение функций цитоплазматической мембраны клеток Е.соН и В.эиМШБ наблюдалось нами и при воздействии бациллярной РНКазы в дозах, превышающих ростстимулирующую на 5-6 порядков. При дозах биназы, угнетающих рост культур бактерий, наблюдается резкое увеличение выхода свободных нуклеотидов из клеток. Механизмы изменения проницаемости мембран бактерий для нуклеотидов, вероятно, являются аналогичными описанным выше для случая вытекания ионов из клетки под действием активной РНКазы, т.к. неактивная ШвЮЮШ-РНКаза почти не изменяла проницаемости клеток для нуклеотидов.

Очевидно, что перестройки во внешней мембране так или иначе должны отразиться на внутриклеточных метаболических процессах. На это указывают наши данные (табл.5) о замедлении роста культур бактерий под влиянием высоких концентраций РНКазы (10-1000 мкг/мл).

Склоняясь к возможному непрямому действию экзогенной РНКазы на рост бактериальных культур исследовали мутагенные свойства каталитически активной РНКазы в дозах, приводящих к изменению проницаемости бактерий для нуклеотидов. С этой целью использовали БОБ-хромотест, позволяющий судить о воздействии РНКазы на включение индуцибельных функций генетического аппарата клеток. Было установлено, что в отличие от ИэЮШЫ-РНКазы каталитически активная биназа в концентрации 1000 мкг/мл

индуцировала БОБ-ответ на тест-штамме Е.соН Р(337. Ранее было показано, что высокие концентрации биназы могут оказывать мутагенное действие на клетки гестерных штаммов бактерий в тесте Эймса и Ага-тесте (Шпэкауа е1 а1., 1995, Иванченко с соавт.. 1995). Механизм индукции точковых мутаций под влиянием каталитически активного фермента, по мнению авторов, связан с возникновением в клетке дисбалланса нуклеотидов, что, в свою очередь, может вызвать как неправильное встраивание нуклеотидов, так и остановку синтеза ДНК. Следствием же остановки синтеза является индукция 808-ответа, при котором эшибочная репарация может приводить к КесА-зависимому мутагенезу, последний, вероятно, вносит свой вклад в регистрируемую в тестах мутагенность. Гак или иначе, генотоксическое действие активного фермента на клетку связано прежде всего с расщеплением мембрано-связанной РЖ, содержание которой в клетках прокариот довольно значительно (Моуег, 1986). Такое воздействие гребует высокой каталитической активности РНКазы, и именно поэтому мутантные ферменты с частичной потерей активности не проявляют ЯОЭ-индуцирующего действия.

Сопоставив полученные нами данные о проявлении эффектов бациллярной РНКазы в зависимости от концентрации (стимуляция пролиферации, замедление роста, генотоксичность) с приведенными выше данными литературы о зозможных механизмах действия рибонуклеаз, можно определить следующие узловые моменты воздействия фермента на клетку:

• Ростстимулирующая концентрация РНКазы (0.001-0,01 мкг/мл, 1-10 ;д.активности)

1. Конформационные перестройки мембран

2. Изменение ионной проницаемости мембран

3. Усиление пролиферации, опосредованное системой вторичных иессенджеров

• Концентрация РНКазы, индуцирующая замедление роста и мутагенез (100 -1000 мкг/мл, 105 - 10бед.активности)

1. Конформационные перестройки мембран

2. Выход свободных нуклеотидов из клетки с соответствующими изменениями баланса предшественников синтеза нуклеиновых кислот

3. Модификация процессов репликации ДНК, индукция ЯОЗ-функпий клетки.

Таким образом, кажется вероятным, что РНКаза не взаимодействует «посредственно с ДНК, а изменения скорости репликации ДНК и деления клеток являются вторичными и опосредуются действием экзогенного фермента та мембрану. Возможно, что основной вклад в реализацию конечного клеточного

ответа вносит какой-либо один из механизмов действия РНКаз на бактерии, Вместе с тем не исключено, что только совокупность выше перечисленных механизмов может способствовать проявлению того или иного эффекта РНКазы, Очевидно, триггерным механизмом, ответственным за проявление эффекта РНКазы являются те функциональные изменения в мембранах, которые возникают в процессе перехода от низких доз фермента к высоким.

ВЫВОДЫ

1. Получены в гомогенном состоянии мутантные производные РНКазы B.intermedius, которые имели единичные замены аминокислотных остатков в каталитическом участке активного центра фермента и отличались по величине каталитической активности от природной РНКазы. Мутантные формы с заменами Lys 26 на Ala и His 101 на Glu имели активность при расщеплении различных субстратов 30% и 2,5%, соответственно, от активности исходной бациллярной РНКазы.

2. РНКазы с различной каталитической активностью в определенной низкой концентрации способны стимулировать рост культур E.coli и B.subtilis, независимо от различий в строении клеточных поверхностей грамотрицательных и грамположительных бактерий.

3. Основной вклад в процесс стимуляции роста и деления бактериальных клеток вносит каталитическая активность РНКазы, т.к. при одинаковой концентрации ферментов (0,001-0,01 мкг/мл), имеющих разную активность, эффект природной бациллярной РНКазы выражен в 3 раза сильнее, чем ее мутантной формы с 2,5% остаточной ферментативной активности.

4. Бациллярная природная РНКаза в отличие от малоактивной HislOlGlu-РНКазы в высоких концентрациях (1000 мкг/мл), превышающих ростстимулирующую на 5-6 порядков, угнетает рост культур бактерий и индуцирует SOS-ответ клетки на тест-штамме E.coli PQ37.

5. Воздействие на грамотрицательные и грамположительные бактерии природной бациллярной РНКазой в широком диапазоне концентраций приводит к изменению функции (проницаемость) клеточной мембраны. При малых (ростстимулирующих) дозах меняется электропроводность клеток, при больших (близких к мутагенным) возрастает проницаемость мембраны для нуклеотидов.

6. Отсутствие функциональных изменений плазматической мембраны при действии на бактерии малоактивной HislOlGlu-РНКазой указывает на ведущую роль ферментативной активности в проявлении биологических эффектов экзогенных РНКаз.