Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение взаимодействия TFIID - общего фактора транскрипции и PBAP - комплекса, ремоделирующего хроматин

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Изучение взаимодействия TFIID - общего фактора транскрипции и PBAP - комплекса, ремоделирующего хроматин"

На правах рукописи УДК 575.22:595.773.4

Сошникова Наталия Валерьевна

Изучение взаимодействия ГМШ - общего фактора транскрипции и РВАР - комплекса, ремоделирующего

хроматин

03.00.03 - молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2009

003469929

Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институте биологии гена РАН, лаборатории регуляции экспрессии генов.

Научные руководители:

доктор биологических наук, профессор кандидат физико-математических наук

Георгиева София Георгиев^на Шидловский Юлий Валерьевич

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор кандидат биологических наук

Евгеньев Михаил Борисович Головнин Антон Клеменсович

Ведущая организация: Учреждение Российской академии наук Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН

Защита диссертации состоится Ь июня 2009 года, в /> --часов на заседании диссертационного совета Д 002.037.01 при Учреждении Российской академии наук Институте биологии гена РАН по адресу: 119334, Москва, ул. Вавилова, д. 34/5.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения академии наук Институте молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН по адресу: 119991, Москва, ул. Вавилова, д.32.

Автореферат разослан: апреля 2009 года.

Ученый секретарь

диссертационного совета, —

I. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ. Актуальность темы.

Живые организмы - сложно организованные системы, способные хранить и передавать потомкам свою генетическую информацию. Принципы и механизмы реализации наследственной информации интересуют исследователей с момента открытия основного постулата молекулярной биологии (ДНК<£>РНЮ=>белок). Генетическая информация о структуре отдельных белков и нуклеиновых кислот у всех организмов заключена в молекулах ДНК или РНК в виде последовательностей нуклеотидов, называемых генами. Координированная работа (экспрессия) большого числа генов возможна лишь благодаря наличию тонких регуляторных механизмов, определяющих место, время и уровень экспрессии конкретного гена или группы генов.

Экспрессия генов в эукариотической клетке представляет собой сложный многостадийный процесс, включающий в себя: транскрипцию генов (переписывание генетической информации с ДНК на специальные мРНК), процессинг и сплайсинг мРНК (модификации мРНК и удаление избыточных частей последовательностей мРНК), экспорт упакованных мРНК из ядра в цитоплазму, трансляцию (построение на основе мРНК белковой последовательности) и посттрансляционные модификации белков. Важнейшим этапом является транскрипция, осуществляемая главным ферментом ДНК-зависимой РНК-полимеразой и многочисленными регуляторными белками -факторами транскрипции. Факторы транскрипции взаимодействуют с регуляторными нуклеотидными последовательностями генов, друг с другом, с молекулами РНК-полимеразы и необходимы для правильного узнавания транскрипционным комплексом регуляторных последовательностей в составе генов, а их координированная работа приводит к повышению или понижению уровня транскрипции соответствующих генов при ответе клеток на внешние или внутренние регуляторные сигналы.

В эукариотической клетке ДНК всегда связана с белками и организована в хроматин, который находится в различных состояниях, отличающихся степенью

компактизации н транскрипционной активностью. Степень компактизадии хроматина определяет доступность регуляторных элементов действию транскрипционных факторов, а соответственно, и транскрипционную активность. Существуют разнообразные коактиваторы транскрипции, которые в ответ на действие активаторов способны изменять строение хроматина и структурировать ДНК-матрицу для инициации транскрипции и функционирования транскрипционного комплекса. Одними из коактиваторов транскрипции являются хроматин-ремоделирующие комплексы.

В настоящее время большое количество исследований по инициации транскрипции направлено на изучение механизмов взаимодействия хроматин-ремоделирующих комплексов и общих факторов транскрипции.

Ранее у D.melanogaster был описан новый коактиватор транскрипции эволюционно консервативный белок SAYP (Supporter of Activation of Yellow Protein). Было показано, что SAYP участвует в регуляции транскрипции большого числа генов в ходе развития дрозофилы, способен активировать транскрипцию на хроматиновой матрице. Цель и задачи исследования

Целью настоящей работы являлось изучение функций нового эволюционно консервативного активатора транскрипции D.melanogaster - белка SAYP. Для этого в работе были поставлены следующие экспериментальные задачи:

- выделить и охарактеризовать комплекс, содержащий SAYP;

- изучить распределение компонентов комплекса на промоторе и кодирующей области SAYP-зависимых генов;

- определить роль компонентов комплекса в его структуре и функциях. Научная новизна и практическая ценность работы

В данной работе был выделен SAYP-содержащий комплекс. Полностью установлен субъедшшчный состав комплекса. В отличие от полученных ранее данных (Мошкин, 2008) было показано, что SAYP является компонентом не только хроматин-ремоделирующего комплекса РВАР семейства SWI/SNF, но и компонентом общего фактора транскрипции TFIID. На промоторах SAYP-

зависимых генов in vivo продемонстрирована необходимость каждого из компонентов этого общего суперкомплекса (TFIID, РВАР, SAYP), а также ключевая роль SAYP в его организации.

Таким образом, на молекулярном уровне была показана структурная связь ремоделирования хроматина и инициации транскрипции. Апробация работы

Результаты работы были представлены на следующих конференциях: конференции молодых ученых по Молекулярной Биологии и Генетике (Киев, 2007), «Spring-Meeting and Workshop "Protein-protein interactions" of the International Research Training Group Gießen/Marburg-Moscow (DFG/RFBR-funded)» (Gießen, 2008), «33rd FEBS Congress & 11th IUBMB Conference, Biochemistry of cell regulation» (Athens, 2008), «8th Young Scientist Forum FEBS-IUBMB: Cell Harmony» (Loutraki, 2008). Публикации.

По теме диссертации опубликовано 5 печатных работ. Из них статей - 1, тезисов докладов и материалов конференций - 4. Объем и структура диссертации.

Диссертация изложена на 92 страницах и состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, объект и задачи исследования, материалы и методы, результаты, обсуждение результатов, выводы, благодарности и список литературы. Диссертация содержит 14 рисунков и 3 таблицы. Библиография включает 140 источников.

II. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 1. Очистка БА УР-содержащего комплекса из ядерного экстракта эмбрионов

Для изучения функций БАУР, а также его механизма действия в клетке и роли в активации транскрипции был проведен ряд хроматографических очисток ядерного экстракта эмбрионов дрозофилы. Сначала ядерный экстракт предварительного фракционировали на колонке с Бирегове-б (гель-фильтрация). ЭАУР детектировался в 16-17 фракциях, которые содержали высокомолекулярный комплекс размером не менее 2 МДа (рис. 1). Этот комплекс не является продуктом неспецифической агрегации, так как он элюируется во фракциях, следующих после исключенного объема (ИО). Неспецифические агрегаты содержались в более ранней 15-ой фракции. Элюированные вместе с 8АУР белки не связаны через ДНК, так как при обработке ядерного экстракта эмбрионов ДНКазой I изменения профиля элюции Б АУР не происходит. Это подтверждает существование высокомолекулярного 5АУР-содержащего комплекса.

ИО 2.0 0.67 0,44 МДа

¥ Т Г Т

15 16 17 19 21 23 25 27 29

О а TAF1 ■ ШШ- 1Ц1

н ТВР TAF9 щ » i-и ■

РВАР MOR fr'HI ||Я 81 *"'

РВ «¡Él щЩ

SAP60

шщищ штттттт-■

Рис 1. Гель-фильтрация ядерного экстракта эмбрионов дрозофилы на колонке с Superose-6. Всстерн-блот анализом детектировали субъединицы TFIID комплекса (TAF1, ТВР, TAF9) и РВАР комплекса (MOR. РВ, ВАР60).

8-12-4 эмбрионы дрозофилы

ядерный экстракт *

„Л мМЫаС!

МопоЗ 18/ю #

8 7 8

5АУР

"^«ЖЛ«!. ТАР1

^0.4 М НаС!

# ЛШай!

' Шт* здур ■ - тщг- рв

0.6-0,7 М НаС!

(й- л МогюЗ 5/50 "У * %

й % 1 $ « У в 11 « 15 !?

унц*«»».. - 8АУР

к >■■>* ...... РВ

"^¡Го.32-0,34!

34 М

# # #

5/50 V *»

1п Р! 1 3 5 в ? & в п 13 18 !?

................................... ше «• *• . ' ^ ЕАУР

■■•■■ »й тт

> ШШШШ* ^ РВ

.» Ж: тшшшщшт ~-> аЛМ тттм ТАР1 ^028-0.30 м №а

Эир&готв 6 ИН

<5 1? 19 г1 2$ га ж?

| ^ БАУР

II; 3 РВ

а т.. ■.■;■■.. ТАР1

а-ЗАУР колонка

ПААГ, УАШ!-ТОР

Рис 2. Схема очистки комплекса, содержащего ЭАУР. Фракции анализировали на наличие БАУР, субъединицы ТР1ГО - ТАР 1 и субъединицы РВАР - РВ.

Затем была проведена более тщательная последовательная многоступенчатая очистка эмбрионального ядерного экстракта (рис. 2). На каждой стадии отбирали только SAYP-содержащие фракции, которые затем наносили на колонку другого типа. Элюцию с каждой колонки проводили в градиенте NaCl, а затем фракции проверяли с помощью Вестерн-блот анализа. На последней стадии очистки SAYP-содержащий комплекс иммунопреципитировали с помощью антител к N-концу SAYP. Промывали высокосолевым буфером (1М NaCl) и элюировали глицином с низким рН (рН=2.7). Элюат анализировали на SDS-ПААГ. После окраски геля Coomasie было детектировано около 20 полос (рис.3,а, верхняя панель). В качестве контроля использовали IgG кролика (рис.3,6, верхняя панель).

Рис 3. Верхняя панель: а - анализ 16-18 фракций на 9% SDS-ПААГ, окраска Coomasie; видимые полоски затем были проанализированы с помощью масс-спсктроскопии; б - контроль, преиммунные IgG кролика. (*) - белки SAYP и TAF1 были совместно детектированы в двух соседних полосках;

(**) - полоска вместе с TAF5 содержала Hprl, субъединицу ТНО комплекса, детектирующуюся в следовых количествах;

(***) - помимо ВАР55 был детектирован pontin, часто ассоциирующий с SW1/SNF комплексами;

нижняя панель: Вестерн-блот анализ тех же фракций (а) и ядерного экстракта (в), демонстрирующий наличие компонентов TFIID и отсутствие субъединицы OSA

SAYP*TAF1X ип-SAYP к-IgG

8RM-Оу

f- - <

TAF2-

ВАР111

TAF5-

TAF6-BAPBO+TAFT-BAP55-

А£Вл__Ж&: Srtrl

TAF9"

-220 -160

-120 -100

- 90 80

- 70

■ 80

- 50

- 40

a

TAF3 ?BP TAF10 TAF13 OSA

a

экстрам

6 В

2. Анализ компонентов комплекса:

2.1. Результаты фингер-принтного анализа с использованием MALDI-TOF масс-спектроскопии

С помощью фингер-принтного анализа с использованием MALDI-TOF масс-спектроскопии вырезанных из геля полосок было установлено, что вместе с SAYP были выделены все субъединицы ремоделирующего комплекса РВАР -Brahma(BRM), Moira (MOR), Polybromo (PB), BAP170, BAPlll, BAP60, BAP55, актин и Snrl. Наличие субъединиц ВАР170 и РВ, но не OSA, подтверждает, что ассоциированный с SAYP ремоделирующий комплекс, относится к подсемейству РВАР комплексов SWI/SNF (рис. 3,а, нижняя панель). Также вместе с РВАР комплексом при очистке SAYP были выделены все субъединицы общего фактора транскрипции TFIID. TAF1, TAF2 и TAF4-TAF9 были идентифицированы с помощью фингер-принтного анализа с использованием MALDI-TOF масс-спектроскопии (рис. 3,а, верхняя панель), а наличие низкомолекулярных субъединиц TAF10 и TAF13 было подтверждено Вестерн-блот анализом (рис. 3,а, нижняя панель). TAF3 и ТВР субъединицы, для которых было показано, что они недопредставлены в очищенных препаратах TFIID, были выявлены в очищенных фракциях с SAYP с помощью Вестерн-анализа (рис. 3,а, нижняя панель). Сам SAYP был обнаружен вместе с TAF1 в двух верхних полосках (рис. 3,а, верхняя панель).

Таким образом, специфично иммунопреципитированные белки можно охарактеризовать как единый комплекс, состоящий из общего фактора транскрипции TFIID, ремоделирующего хроматин комплекса РВАР и коактиватора SAYP. Следует отметить, что каких-либо компонентов других комплексов, имеющих отношение к транскрипции, в соотносимых количествах обнаружено не было. Из экспериментов гель-фильтрации следует, что молекулярная масса выделенного комплекса составляет не менее 2.0МДа, что соответствует сумме молекулярных масс его компонентов (1 МДа - РВАР, 1.3 МДа - TFIID и 0.2МДа - SAYP). Важно, что после тщательной

многоступенчатой очистки SAYP имеет такой же профиль элюции, что и на ' гель-фильтрации. Это подтверждает стабильность выделенного комплекса.

2.2. Коиммунопреципитация компонентов комплекса

Чтобы подтвердить, что коактиватор SAYP, комплексы TFIID и РВАР

t

непосредственно взаимодействуют друг с другом были проведены

I:

эксперименты по соосаждению (коиммунопреципитации) на 16-17 фракциях, содержащих SAYP. Антитела к Polybromo (РВ) и Moira (MOR) - компонентам РВАР комплекса, соосаждали SAYP, TAF4 и TAF5, а антитела к TAF1 и TAF8 -компонентам TFIID, в свою очередь, соосаждали SAYP, РВ и MOR (рис. 4,а). Комплексы РВАР и TFIID не соосаждались друг с другом из фракций не содержащих SAYP (20-21 фракции, рис. 1), (рис. 4,6). Это доказывает, что комплексы TFIID и РВАР не агрегируют неспецифично.

о _ип_

ИФ SAYP РВ MOR TAF1 TAF8 IgG

SAYP S3 м * ~~~

TAF4 TAF5 РВ MOR

1

2 3 4 5 6 7

б ИП

ИФ РВ MOR

fíS» tw*i »iiii.II J

TAF5 «и*

TAF10 —

1 2 3

Рис 4. SAYP, часть комплексов РВАР и TFIID связаны в один общий суперкомплекс, а - на 16-18 фракциях проводили соосаждение антителами к SAYP, РВ, MOR, TAF1, TAF8 белкам, в качестве контроля использовали IgG кролика. Одинаковые количества исходной фракции (ИФ) и преципитатов (ИП) анализировали на присутствие белков SAYP, TAF4, TAF5, РВ, MOR.

б - соосаждение антителами к РВ и MOR на 20-22 фракциях после гельфильтрации. Исходную фракцию и преципитаты анализировали на присутствие РВ, TAF5 и TAF10.

1 2.3. Истощение

i

Ключевая роль SAYP в организации РВАР и TFIID в один комплекс была

I

подтверждена с помощью иммуноистощения SAYP специфическими ' антителами из 16-17 фракций после гельфильтрации. Последующая коиммунопреципитация РВ и MOR антителами к TAF1 и TAF9 подтвердила, что недостаток SAYP исключает взаимодействие РВАР и TFIÍD (рис. 5).

Рис 5. Соосажденис комплексов TFIID и РВАР зависит от наличия SAYP. Из фракций 16-18 после гельфильтрации (ИФ) послс истощения IgG (Н) или специфическими антителами к SAYP (И) были проведены иммунопреципитации антителами к TAF1 и TAF9, преципитаты (ИП) анализировали антителами к SAYP, TAF1, TAF4, РВ, MOR.

При очистке SAYP-содержащего комплекса только часть комплексов 1 TFIID и РВАР соочищается совместно с SAYP. Также профиль элюции SAYP

j после гель-фильтрации значительно уже профиля элюции TFIID и РВАР

i

комплексов - перекрывание происходит только в 16-17 фракциях (рис.1). Иммуноистощение SAYP также почти полностью истощает TFIID комплекс (рис.5), то есть почти весь TFIID комплекс в 16-17 фракциях находится в , связанном с SAYP состоянии. В то же время при иммуноистощении SAYP количество субъединиц РВАР комплекса падало незначительно (рис. 5), это | показывает, что только незначительная часть РВАР комплекса связана с SAYP. Таким образом, мы оцениваем, что примерно 20% TFIID комплекса и несколько процентов РВАР комплекса, содержащихся в ядерном экстракте эмбрионов

ИФ

И11

TAF1 TAF9 НИ НИ Н Я

SAYP т та» TAF1

РВ

-prill Щт

i ■'ilil. Ш?

«г--»

^МрМйЦК^ " —

дрозофилы, находится в связанном с SAYP состоянии, образуя единый суперкомплекс.

3. Иммуноокрашивание политенных хромосом

На политенных хромосомах слюнных желез личинок дрозофилы с помощью иммуноокрашивания специфическими антителами была проведена колокализация субъединицы комплекса TFIID - TAF1 и SAYP. При наложении видно, что сайты локализации TAF1 и SAYP совпадают. Это подтверждает, что in vivo в хроматине SAYP и TFIID находятся в одних и тех же функциональных сайтах (рис. 6). Колокализация SAYP и субъединицы РВАР комплекса - ВАР 170 была выполнена ранее. Сайты также совпадали. Таким образом SAYP, TFIID и РВАР локализуются на хромосомах в сайтах транскрипции совместно.

TAF1 fjflpM^fc

SAYP ч

наложение *

Рис 6. Иммуноокрашиваиие политенных хромосом дрозофилы антителами против ТАР1 и БАУР. Показаны два участка хромосом. Показано наложение сайтов локализации ТАР1 и БАУР.

II

4. Распределение компонентов комплекса на промоторе и кодирующей области SA YP-зависимых генов

Для исследования функций SAYP и других компонентов общего комплекса in vivo в хроматине также были проведены эксперименты по хроматиниммунопреципитации (ChIP) с последующим анализом количественной ПЦР. В процессе эксперимента была изучена способность ' компонентов комплекса привлекаться на промоторы SAYP-зависимых генов. SAYP-зависимые гены (CG11395, CG11400 и globinl) - гены экспрессия которых понижается в 7-10 раз после нокаута SAYP с помощью РНК-

I

интерференции в S2 клетках (данные были любезно предоставлены Р. Verrijzer).

пр ко

CG11395 300 по

ген CG11395

TAF1 ТВР SAYP ВАР 170 РВ MOR

Рие 7. Распределение субъединиц комплексов на гене CGI 139. Верхняя панель - схема SAYP-зависимого гена CGI 1395 показаны участки гена на промоторной области (ПО) и I кодирующей области (КО), использовавшиеся для количественной ПЦР.

Нижняя панель - SAYP, TFIID и РВАР связываются предпочтительнее с промоторной I областью гена. Уровень SAYP, субъединиц TFIID (ТВР и TAF i) и субъединиц РВАР I (ВАР!70, РВ, MOR) комплексов на промоторе (синие столбики) и кодирующей области 1 (серые столбики) гена CG11395 измерялся с помощью СЫР. Все результаты ChIP даны в виде обогащения относительно рДНК.

В результате ChIP с помощью специфических антител к SAYP, субъединицам TFIID (TAF1 и ТВР) и субъединицам РВАР (ВАР 170, РВ и MOR) выявил, что все компоненты общего комплекса стабильно связываются с промоторной областью гена (ПР) и в значительно меньшей степени с кодирующей областью (КО) (рис. 7).

5. Влияние «нокдаунов» компонентов комплекса на связывание общего комплекса с промоторами SAYP-зависимых генов:

5.1. Влияние нокдауна SAYP на распределение компонентов TFIID и РВАР на промоторах SAYP-зависимых генов

С помощью РНК-интерференции был проведен отдельно «нокдаун» каждого из компонентов общего суперкомплекса в S2 клетках и также методом ChIP с последующим анализом количественной ПЦР изучена способность SAYP и комплексов TFIID и РВАР привлекаться на промоторы CG11395, CG11400 и globinl генов.

В результате «нокдауна» SAYP происходит значительное падение уровня компонентов комплексов TFIID (TAF1 и ТВР) и РВАР (ВАР 170, РВ и MOR) на промоторах всех трех генов (рис. 8). «Нокдаун» SAYP не влияет на общий уровень ТВР и TAF's в S2 клетках - количество субъединиц комплекса остается прежним, что видно из результатов Вестерн-блот анализа (рис. 9,а). Однако в результате «нокдауна» SAYP уменьшался общий уровень субъединиц РВ и ВАР 170 комплекса РВАР в клетках (рис. 9,а), что, несомненно, влияло на привлечение РВАР к промоторным областям в хроматине. Таким образом, можно утверждать, что TFIID комплекс не может связываться с промоторными участками SAYP-зависимых генов в отсутствие SAYP и комплекса РВАР.

промотор гена CG11395

40,0

TAF1 ТВР SAYP ВАР 170 РВ MOR

Pol II

Рис 8. SAYP, РВАР, TFIID совместно привлекаются на промоторы и каждый из них является ключевым в этом процессе. Уровень SAYP, TFIID и РВАР комплексов на промоторе CGI 1395 был изучен на нормальных S2 клетках (синие столбики), и после «нокдауна» SAYP (зеленые столбики), «нокдауна» ВАР170 (красные столбики), «нокдауна» TAF4 (желтые столбики), аналогичные эксперименты провели для изучения уровня РНК-полимеразы11 (РоШ).

В качестве отрицательного контроля рассматривали связывание компонентов комплекса с промотором гена Hsp70, который не является SAYP-зависимым геном, и SAYP в нормальных S2 клетках не обнаруживается на его промоторах, что и было подтверждено с помощью ChIP (рис. 10). «Нокдаун» SAYP не влиял на уровень TFIID на промоторе Hsp70. Уровень компонентов РВАР немного падает, так как падает общее содержание РВАР в клетке (рис. 9) после интерференции SAYP (рис. 10).

hsp70 промотор

SAYPTAF1 ТВР РВ ВАР60

Рис [0. Уровень ТПГО комплекса наЗАУР-независимом гене Ялу?70 не изменялся после «нокдауна» 5АУР Уровень ЭАУР, субъединиц ТР1ГО (ТАР! и ТВР) и субъединиц РВАР (РВ и ВАР60) в нормальных Б2 клетках (н-синие столбики) и после «нокдауна» вАУР (5АУРи - голубые столбики).

5.2. Влияние «нокдауна» ВАР170 на распределение БАУР и компонентов комплексов ТРПР и РВАР на промоторах Б.'АУР-зависимых генов.

При «нокдауне» субъединицы ВАР170 комплекса РВАР происходит значительное падение уровня 8АУР и субъединиц комплекса ТР1ГО на промоторах ЗАУР-зависимых генов (рис. 8). В то же время общий уровень субъединиц комплексов РВАР и ТР1ГО в 82 клетках уменьшался, но общий уровень БАУР оставался прежним (рис. 9,а). Из этого можно сделать вывод, что свободный 8АУР не привлекается на промоторы в отсутствие комплексов РВАР и ТР1ГО.

РНКИ б

£

V- а О. ^ >: п. иф ип

< со < < Й?

щ 9МШш ■к ЗАУР Ш

РВ

шш ■ МОЯ

Я ТАР4 ■

тубулин - -.

Рис 9. а-общий уровень 5АУР и субъединиц комплексов РВАР (РВ, ВАР170, МОЯ) и ТР/Ш (ТАП, ТАР4, Т'ВР) в нормальных Э2 клетках (82кл-норм) и после «нокдауна» - РНК-интерференции (РНКи) вАУР, ВАР170, ТАР4 соответствующими двуцепочечными РНК, выравнивание проводили по тубулину; б - в отсутствии ТР1ГО ЭАУР соосаждаетея комплексом РВАР. Иммунопреципитации антителами к вАУР были выполнены на нормальных Б2 клетках после «нокдауна» ТАР4. 25% исходной фракции (ИФ) и 50% преципитата (ИП) нанесено.

5.3. Влияние «нокдауна» TAF4 на распределение SAYP и компонентов TFIID и РВАР на промоторах SAYP-зависимых генов

РНК-интерференция TAF4 также оказывала сильный отрицательный эффект на связывание РВАР и SAYP с промоторами SAYP-зависимых генов (рис. 8). Согласно сведениям, опубликованным ранее, «нокдаун» TAF4 приводил к разрушению комплекса TFIID (Wright et al., 2006), не влияя на общий уровень SAYP и РВАР (рис.9,а). При этом SAYP оставался в клетке в связанном с РВАР состоянии (рис. 9,6), однако этот комплекс (РВАР & SAYP) без TFIID не способен стабильно ассоциировать с промоторами SAYP-зависимых генов (рис.8). Этот результат наиболее важен, так как согласно модели последовательного привлечения транскрипционных факторов на промотор, ремоделирующий комплекс должен первым ассоциировать с промотором независимо от других.

«Нокдауны» белков SAYP, ВАР170 или TAF4 также значительно понижали уровень РНК- полимеразы II на промоторах изучаемых SAYP-зависимых генов (рис. 8), подтверждая, что присутствие SAYP, TFIID и РВАР на промоторах является необходимым условием при активации транскрипции.

III. ОБСУЖДЕНИЕ

Активация транскрипции - сложный процесс, требующий участия и координированной работы многих комплексов. В нашей работе было показано, что координация ремоделирования хроматина и инициации транскрипции, двух ключевых процессов активации транскрипции, может осуществляться единым суперкомплексом, состоящим из коактиватора транскрипции SAYP, общего фактора транскрипции TFIID и ремоделирующего хроматин комплекса РВАР. В один общий комплекс с SAYP связываются только 20% TFIID и несколько процентов РВАР в экстракте клетки. При этом транскрипция, опосредованная

SAYP, широко распространена в геноме дрозофилы: при колокализации SAYP и РНК-полимеразы II на политенных хромосомах в эухроматине было обнаружено около 150 сайтов, что в настоящей работе было подтверждено колокализацией SAYPhTAFI.

Несмотря на то, что ранее встречались сведения, что SAYP ассоциирован с комплексом РВАР, с помощью ChIP нами было показано, что в таком состоянии этот комплекс не способен связываться с промоторами SAYP-зависимых генов и является нефункциональным. Также с помощью ChIP была показана необходимость присутствия на промоторах SAYP-зависимых генов каждого из компонентов единого суперкомплекса. Привлечение SAYP, РВАР или TFIID в свободном состоянии на эти промоторы невозможно. Таким образом, общий суперкомплекс функционирует при активации транскрипции как единый модуль, а взаимодействия между его субъединицами и с окружающими белками необходимы для стабильного взаимодействия суперкомплекса с промоторами SAYP-зависимых генов.

Ключевая роль в организации общего комплекса принадлежит коактиватору SAYP, с которым могут взаимодействовать активаторы, таким образом, обеспечивая специфичность активации транскрипции соответствующих генов, как предполагалось ранее.

Ремоделинг хроматиновой матрицы - ключевой этап активации транскрипции, а связывание TFIID комплекса лимитирует скорость инициации транскрипции, поэтому объединение нескольких активностей компонентов в одном суперкомплексе может быть оправдана и функционально реализоваться, т.к. не требует предварительно подготовленной матрицы для инициации траскрипции. Активация SAYP-зависимых генов не зависит от локального состояния хроматина и от общего состояния транскрипционного аппарата, что может быть необходимым в процессе развития организма. В случае единого суперкомплекса сопряжение TFIID и РВАР может повышать эффективность транскрипции определенных генов. Таким образом, общий суперкомплекс способен осуществлять активацию транскрипции определенных генов

независимо от положения гена в хроматине, локальной концентрации ТР1Ю или афинности компонентов к промотору.

IV. ВЫВОДЫ

1. Выделен и охарактеризован новый комплекс, состоящий из общего фактора транскрипции ТР1Ш, ремоделирующего хроматин комплекса РВАР и коактиватора транскрипции БАУР. Показано, что в состав нового комплекса входят все субъединицы комплексов ТР1ГО и РВАР.

2. БАУР - основной фактор клетки, объединяющий ТР1ГО - общий фактор транскрипции и РВАР - комплекс, ремоделирующий хроматин.

3. Единый комплекс, содержащий РВАР, ТР1Ю и Б АУР, локализуется на промоторах БАУР-зависимых генов и необходим для рекрутирования РНК-полимеразы II.

4. Все компоненты общего комплекса (БАУР, ТНШ, РВАР) необходимы для его эффективного связывания с промоторами 5АУР-зависимых генов

V. СПИСОК ПЕЧАТНЫХ РАБОТ

1. Соншикопа Н.В.. Воробьева Н.Е., Краснов А.Н., Георгиева С.Г., Набирочкнна E.H., Ильин Ю.В, Шидловский Ю.В. Взаимодействие коактиваторов на промоторе. ДАН, 2008,423: 561-563.

2. Soshnikova N.V.. Vorobyeva N.E., Georgieva S.G., Shidlovskii Y.V., Ilyin Y.V. Novel transcription factor SAYP directly couples chromatin remodeling and transcription initiation. Conference for young scientists, PhD students and students on molecular biology and genetics, dedicated to 120th anniversary of M.I. Vavilov, Ukraine, Kyiv, 20-22 September 2007, Abstract book, p. 92

3. Soshnikova N.. Georgieva S. The ubiquitous transcription co-activator SAYP interacts with PBAP chromatin remodeling complex and recruits PBAP on gene promoters. Spring-Meeting and Workshop "Protein-protein interactions" of the International Research Training Group Gießen/Marburg-Moscow (DFG/RFBR-funded) from 9th - 12th of March 2008 in Schloß Rauischholzhausen, Germany. Abstract book. p. 31.

4. Soshnikova N.. Vorobyeva N., Shidlovskii Y., Georgieva S., Ilyin Y. Novel mechanism of coupling of chromatin remodeling and transcription initiation. 33rd FEBS Congress & 11th IUBMB Conference, Biochemistry of cell regulation, Athens, Greece, 28th of June- 3rd of July 2008, Abstract book, p. 156.

5. Soshnikova N.. Vorobyeva N., Shidlovskii Y., Georgieva S., Ilyin Y. Novel mechanism of coupling of chromatin remodeling and transcription initiation. 8th Young Scientist Forum FEBS-IUBMB: Cell Harmony, Loutraki, Greece, 26th -28th of June, Abstract book p. 134.

Подписано в печать 27 апреля 2009 г. Объем 1,2 п.л. Тираж 100 экз. Заказ №485 Отпечатано в Центре оперативной полиграфии ООО «Ол Би Принт» Москва, Ленинский пр-т, д.37

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Сошникова, Наталия Валерьевна

Список сокращений

Введение

Обзор литературы

1. Общие принципы инициации транскрипции

1.1. Организация промотора Ю

1.2. Нуклеосомная организация промотора

1.3. Сборка преинициаторного комплекса

2. Общий фактор транскрипции TFIID

2.1. ТВР

2.2. Структура TFIED

2.3. Ферментативные активности субъединиц TFIID

3. Ремоделирование хроматина

3.1. Классификация ремоделирующих комплексов

3.2. SWI/SNF семейство

3.3. Доменная структура субъединиц ВАР и РВАР комплексов

3.3.1. Домены, опосредующие белковые взаимодействия

3.3.2. ДНК-связывающие домены

3.3.3. Актин как компонент SWI/SNF комплексов

3.4. Функции ВАР и РВАР комплексов

3.5. Механизм действия SWI/SNF комплексов

4. Упорядоченное рекрутирование: ген-специфичный механизм активации транскрипции

Экспериментальная часть

1. Объекты и задачи исследования

2. Материалы и методы

2.1. Материалы.

2.1.1. Штаммы и вектора Е. Coli.

2.1.2. Клеточные линии.

2.1.3. Работа с дрозофилами

2.1.4. Бактериальные среды

2.1.5. Ферменты и реактивы 5 о

2.1.6. Антитела

2.1.7. Праймеры

2.2. Работа с клетками

2.2.1. Трансформация S2 клеток

2.2.2. РНК интерференция

2.3. Работа с ДНК

2.3.1. Приготовление компетентных клеток

2.3.2. Трансформация бактерий

2.3.3. Щелочное выделение плазмидной ДНК

2.3.4. Обработка ДНК рестриктазами

2.3.5. Лигирование

2.3.6. Выделение геномной ДНК из мух

2.3.7. Гель-электрофорез ДНК.

2.3.8. ПЦР (PCR)

2.3.9. Секвенирование ДНК

2.4. Работа с РНК

2.4.1. Получение двухцепочечной РНК

2.5. Работа с белками

2.5.1. Экспрессия и очистка рекомбинантных белков

2.5.2. Получение антител и их очистка

2.5.3. Белковый гель-электрофорез

2.5.4. Вестерн-блот анализ

2.5.5. Соосаждение беклов антителами (иммунопреципитация)

2.5.6. Дот-блот анализ

2.5.7. Получение белковых экстрактов из S2 клеток

2.5.8. Выделение эмбрионального ядерного экстракта

2.5.9. Хроматографическая очистка комплекса

2.5.10. Гель-фильтрация

2.5.11. Фингер-принтный анализ с использованием MALDI-TOF масс-спектроскопии

2.6. Иммуноокрашивание политенных хромосом

2.7. Хроматиниммунопреципитация (ChIP)

2.8. Использованное программное обеспечение. 62 3. Результаты

3.1. Очистка SAYP-coдержащего комплекса из ядерного экстракта эмбрионов

3.2. Анализ компонентов комплекса:

3.2.1. Результаты фингер-принтного анализа с использованием MALDI

TOF масс-спектроскопии

3.2.2. Коиммунопреципитация компонентов комплекса

3.2.3. Истощение

3.3. Иммуноокрашивание политенных хромосом

3.4. Распределение компонентов комплекса на промоторе и кодирующей области SAYP-зависимых генов

3.5. Влияние «нокдаунов» компонентов комплекса на связывание общего комплекса с промоторами SAYP-зависимых генов:

3.5.1. Влияние «нокдауна» SAYP на распределение компонентов TFIID и

РВАР на промоторах SAYP-зависимых генов

3.5.2. Влияние «нокдауна» ВАР 170 на распределение SAYP и компонентов комплексов TFIID и РВАР на промоторах SAYP-зависимых генов

3.5.3. Влияние «нокдауна» TAF4 на распределение SAYP и компонентов 74 TFIID и РВАР на промоторах SAYP-зависимых генов

4. Обсуждение результатов

Выводы

Благодарности

Введение Диссертация по биологии, на тему "Изучение взаимодействия TFIID - общего фактора транскрипции и PBAP - комплекса, ремоделирующего хроматин"

Живые организмы — сложно организованные системы, способные хранить и передавать потомкам свою генетическую информацию. Принципы и механизмы реализации наследственной информации интересуют исследователей с момента открытия основного постулата молекулярной биологии (ДНК О РНК=>бел ок). Генетическая информация о структуре отдельных белков и нуклеиновых кислот у всех организмов заключена в молекулах ДНК или РНК в виде последовательностей нуклеотидов, называемых генами. Координированная работа (экспрессия) большого числа генов возможна лишь благодаря наличию тонких регуляторных механизмов, определяющих место, время и уровень экспрессии конкретного гена или группы генов.

Экспрессия генов в эукариотической клетке представляет собой сложный многостадийный процесс, включающий. в себя: транскрипцию генов (переписывание генетической информации с ДНК на специальные матричные РНК (мРНК)), процессинг и сплайсинг мРНК (модификации мРНК и удаление избыточных частей последовательностей мРНК), экспорт упакованных мРНК из ядра в цитоплазму, трансляцию (построение на основе мРНК белковой последовательности) и посттрансляционные модификации белков. Важнейшим этапом является транскрипция, осуществляемая главным ферментом ДНК-зависимой РНК-полимеразой и многочисленными регуляторными белками — факторами транскрипции. Факторы транскрипции взаимодействуют с регуляторными нуклеотидными последовательностями генов, друг с другом, с молекулами РНК-полимеразы и необходимы для правильного узнавания транскрипционным комплексом регуляторных последовательностей в составе генов, а их координированная работа приводит к повышению или понижению уровня или активации транскрипции соответствующих генов при ответе клеток на внешние или внутренние регуляторные сигналы.

В эукариотической клетке ДНК всегда связана с белками и организована в хроматин, который находится в различных состояниях, отличающихся степенью компактизации и транскрипционной активностью. Степень компактизации хроматина определяет доступность регуляторных элементов действию транскрипционных факторов, а соответственно, и транскрипционную активность. Существуют разнообразные коактиваторы транскрипции, которые в ответ на действие активаторов способны изменять строение хроматина и структурировать ДНК-матрицу для инициации транскрипции и функционирования транскрипционного комплекса. Одними из коактиваторов транскрипции являются хроматин-ремоделирующие комплексы.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Сошникова, Наталия Валерьевна

выводы

1. Выделен и охарактеризован новый комплекс, состоящий из общего фактора транскрипции TFIID, ремоделирующего хроматин комплекса РВАР и коактиватора транскрипции SAYP. Показано, что в состав нового комплекса входят все субъединицы комплексов TFIID и РВАР

2. SAYP - основной фактор клетки, объединяющий TFIID - общий фактор транскрипции и РВАР - комплекс, ремоделирующий хроматин.

3. Единый комплекс, содержащий РВАР, TFIID и SAYP, локализуется на промоторах SAYP-зависимых генов и необходим для рекрутирования РНК-полимеразы II.

4. Все компоненты общего комплекса (SAYP, TFIID, РВАР) необходимы для его эффективного связывания с промоторами SAYP-зависимых генов.

БЛАГОДАРНОСТИ

Автор выражает сердечную благодарность коллегам, внесшим вклад в данную работу: Воробьвой Надежде Евгеньевне, Копытовой Дарье Владимировне, Николенко Юлии Владимировне, Набирочкиной Елене Николаевне, Краснову Алексею Николаевичу, Орловой Анастасии, Гурскому Дмитрию, Кузьминой Юлии, а также своим научным руководителям Шидловскому Юлию Влерьевичу и Георгиевой Софии Георгиевне за их терпеливое и чуткое руководство. Искреннюю благодарность автор выражает оппонентам и рецензентам данной работы.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Сошникова, Наталия Валерьевна, Москва

1. Albright, S.R. and Tjian, R. 2000. TAFs revisited: more data reveal new twists and confirm old ideas. Gene 242:1-13.

2. Allen, M. D., Religa, T. L., Freund, S. M. and Bycroft, M. 2007. Solution structure of the BRK domains from CHD7 J Mol Biol 371:1135-40.

3. Aoyagi S., Hayes, J.J. 2002. hSWI/SNF-catalyzed nucleosome sliding does not occur solely via a twist-diffusion mechanism. Mol. Cell. Biol. 35: 7484-7490.

4. Aravind, L., Ieyr L.M. 2002. The SWIRM domain: a conserved module found in chromosomal proteins points to novel chromatin-modifying activities. Genome Biol. 24;3(8).

5. Armstrong, J.A., Papoulas, O., Daubresse, G., Sperling, A.S., Lis, J.T., Scott, M.P., Tamkun, J.W. 2002. The Drosophila BRM complex facilitates global transcription by RNA polymerase II. EMBO J. 21: 5245- 5254.

6. Auty, R., Steen, H., Myers, L.C., Persinger, J., Bartholomew, В., Gygi, S.P., and Buratowski, S. 2004. Purification of active TFIDD from Saccharomyces cerevisiae. Extensive promoter contacts and co-activator fimction. J Biol Chem 279:4997349981.

7. Barton, M.C. and Crowe, A.J. 2001. Chromatin alteration, transcription and replication: What's the opening line to the story? Oncogene 20: 3094-3099.

8. Bartova, E., Krejci, J., Hamicarova, A., Galiova, G., Kozubek, S. 2008. Histone modifications and nuclear architecture. JHC 56(8):711-21.

9. Becker P.B. 2002. Nucleosome sliding: facts and fiction. EMBO J. 21: 4749-4753.

10. Becker, P.B., Horz, W. 2002. ATP-dependent nucleosome remodeling. Annu. Rev. Biochem. 71: 247-273.

11. Boehm, A.K., Saunders, A., Werner, J., and Lis, J.T. 2003. Transcription factor and polymerase recruitment, modification, and movement on dhsp70 in vivo in the minutes following heat shock. Mol Cell Biol. 23: 7628-7637.

12. Boyer, L.A., Latek, R.R., Peterson, C.L. 2004. The SANT domain: a unique histone-tail-binding module? Nat. Rev., Mol. Cell Biol. 5: 158- 163.

13. Burgers, W.A., Fuks, F., Kouzarides, T. 2002. DNA methyltransferases get connected to chromatin. Trends Genet. 18: 275-277.

14. Burke T.W. and Kadonaga J.T. 1997. The downstream core promoter element, DPE, is conserved from Drosophila to humans and is recognized by TAFII60 of Drosophila. Genes Dev. 11: 3020-31.

15. Burley, S.K. and Roeder, R.G. 1996. Biochemistry and structural biology of transcription factor IID (TFIID). Annu. Rev. Biochem. 65: 769-799.

16. Butler, J.E. and Kadonaga, J.T. 2001. Enhancer-promoter specificity mediated by DPE or TATA core promoter motifs. Genes. Dev. 15:2515-2519.

17. Cairns, B.R. 2005. Chromatin remodeling complexes: strength in diversity, precision through specialization Curr. Opin Genet. Dev. 15: 185-190.

18. Chalkley G.E. and Verrijzer C.P. 1999. DNA binding site selection by RNA polymerase П TAFs: a TAFn250-TAFnl50 complex recognizes the initiatior. EMBO J. 18: 4835-4845.

19. Chandrasekaran, R. and Thompson, M. 2007. Polybromo-l-bromodomains bind histone H3 at specific acetyl-lysine positions. Biochem Biophys Res Commun. 355: 661-6.

20. Chandy, M., Gutierrez, J.L., Prochasson, P., Workman, J. L. 2006. SWI/SNF displaces SAGA-acetylated nucleosomes. Eucariotic cell. 5: 1738-1747.

21. Chen, Z. and Manley, J.L. 2000. Robust mRNA transcription in chicken DT40 cells depleted of TAFII31 suggests both functional degeneracy and evolutionary divergence. Mol Cell Biol 20:5064-5076.

22. Collins, R.T., Furukawa, Т., Tanese, N., Treisman, J.E. 1999. Osa associates with the Brahma chromatin remodeling complex and promotes the activation of some target genes. EMBO J. 18: 7029-7040.

23. Cosma, M. P., Tanaka, Т., Nasmyth. K. 1999. Ordered recruitment of transcription and chromatin remodeling factors to a cell cycle- and developmentally regulated promoter. Cell. 97:299-311.

24. Cosma, M.P. 2002. Ordered recruitment: gene-specific mechanism of transcription activation. Mol. Cell. 10: 227-236.

25. Deng, W. and Roberts, S.G.E. 2005. A core promoter element downstream of the TATA box that is recognized by TFIIB. Genes Dev 19:2418-2423.

26. Dhalluin, С., Carlson, J.E., Zeng, L., He, C., Aggarwal, A.K., Zhou, M.M. 1999. Structure and ligand of a histone acetyltransferase bromodomain. Nature. 399: 491496.

27. Doerks, Т., Copley, R. R., Schultz, J., Ponting, C. P. and Bork, P. 2002. Systematic identification of novel protein domain families associated with nuclear functions Genome Res. 12:47-56.

28. Dynlacht, B.D., Hoey, Т., and Tjian, R. 1991. Isolation of coactivators associated with the TATA-binding protein that mediate transcriptional activation. Cell. 66:563-576.

29. Featherstone M. 2002. Coactivators in transcription initiation: here are your orders. Curr. Opin. Genet. Dev. 12: 149-155.

30. Gangloff, Y.-G., Romier, C., Thuault, S.,Werten, S., and Davidson, I. 2001. The histone fold is a key structural motif of transcription factor TFIID. Trends Biochem Sci. 26:250-257.

31. Ge H., Martinez E., Chiang C-M. and Roeder R.G. 1996. Activator-dependent transcription by mammalian RNA polymerasell: in vitro reconstitution with general transcription factors and cofactors. Methods Enzymol. 27: 57-71.

32. Gegonne, A., Weissman, J.D., and Singer, D.S. 2001. TAFII55 binding to TAFII250 inhibits its acetyltransferase activity. Proc Natl Acad Sci USA. 98:12432-12437.

33. Geisberg, J.V., Moqtaderi, Z., Kuras, L., and Struhl, K. 2002. Motl associates with transcriptionally active promoters and inhibits the association of NC2 in yeast. Mol Cell Biol. 22: 8122-8134.

34. Georgieva, S.G., Nabirochkina, E.N., Georgiev, P.G., Soldatov, A.V. 2000. Gene enhancer of yellow 1 of Drosophila melanogaster codes for protein TAFII40. Dokl Biochem 375: 228-30.

35. Georgiev, P. G. and Т. I. Gerasimova. 1989. Novel genes influencing the expression of the yellow locus and mdg4 (gypsy) in Drosophila melanogaster. Mol. Gen. Genet. 220:121-126.

36. Giacinti, C. and Giordano, A. 2006. RB and cell cycle progression. Oncogene. 25: 5220-7.

37. Gregory, S.L. Kortschak, R.D. Kalionis, B. Saint, R. 1996. Characterization of the dead ringer gene identifies a novel, highly conserved family of sequence specific DNA-binding proteins. Mol. Cell. Biol. 16: 792-799.

38. Grob, P., Cruse, M.J., Inouye, C., Paris, M., Penczek, P.A., Tjian, R., Nogales, E. 2006. Cryo-electrom microscopy studies of human TFIID: Conformational breathing in the integration of gene regulatory cues. Structure. 14: 511-520.

39. Hassan, A. H., Neely, К. E., Workman. J. L. 2001. Histone acetyltransferase complexes stabilize Swi/Snf binding to promoter nucleosomes. Cell. 104: 817-827.

40. Hassan, A. H., Neely, К. E., Vignali, M., Reese, J. C., Workman. J. L. 2001. Promoter targeting of chromatin-modifying complexes. Front. Biosci. 6: 1054—1064.

41. Hilton, T.L., Li, Y., Dunphy, E.L., andWang, E.H. 2005. TAF1 histone acetyltransferase activity in Spl activation of the cyclin D1 promoter. Mol. Cell Biol. 25:4321-4332.

42. Hofmann W.A., Stojiljkovic L., Fuchsova B. et al. 2004. Actinis part of pre-initiation complexes and is necessary for transcription by RNA polymerase II. Nat. Cell Biol. 6:1094-1101.

43. Inoue, H., Furukawa, Т., Giannakopoulos, S., Zhou, S., King, D.S., Tanese, N. 2002. Largest subunits of the human SWI/SNF chromatin-remodeling complex promote transcriptional activation by steroid hormone receptors. J. Biol. Chem. 277: 41674— 41685.

44. I to, Т., Levenstein, M.E., Fyodorov, D.V., Kutach, A.K., Kobayashi, R., and Kadonaga, J.T. 1999. ACF consists of two subunits, Acfl and ISWI, that function cooperatively in the ATP-dependent catalysis of chromatin assembly. Genes Dev. 13: 1529-1539.

45. Kal, A.J., Mahmoudi, Т., Zak, N.B., and Verrijzer, C.P. 2000. The Drosophila brahma complex is an essential coactivator for the trithorax group protein zeste. Genes Dev. 14: 1058-1071.

46. Kanno, Т., Kanno, Y., Siegel, R.M., Jang, M.K., Lenardo, M.J., and Ozato, K. 2004. Selective recognition of acetylated histones by bromodomain proteins visualized in living cells. Mol Cell. 13: 33-43.

47. Kim, Т.К., Zhao,Y., Ge, H., Bernstein, R., and Roeder, R.G. 1995. TATAbinding protein residues implicated in a functional interplay between negative cofactor NC2 (Drl) and general factors TFIIA and TFIIB. J Biol Chem 270: 10976-10981.

48. Kim, Т.Н., Barrera, L.O., Zheng, M., Qu, C., Singer, M.A., Richmond, T.A., Wu, Y., Green, R.D., and Ren, B. 2005a. A high-resolution map of active promoters in the human genome. Nature. 436: 876-880.

49. King, I.F., Francis, N.J., Kingston, R.E. 2002. Native and recombinant polycomb group complexes establish a selective block to template accessibility to repress transcription in vitro. Mol. Cell. Biol. 22: 7919- 7928.

50. Klejman, M.P., Pereira, L.A., van Zeeburg, H.J., Gilfillan, S., Meisterernst, M., and Timmers, H.T.M. 2004. NC26 interacts with BTAF1 and stimulates its ATP-dependent association with TATA-binding protein. Mol Cell Biol. 24: 10072-10082.

51. Klejman, M.P., Zhao, X., van Schaik, F.M.A., Herr, W., and Timmers, H.T.M. 2005. Mutational analysis of BTAF1-TBP interaction: BTAF1 can rescue DNA-binding defective TBP mutants. Nucleic Acids Res. 33: 5426-5436.

52. Kokubo, Т., Swanson, M.J., Nishikawa, J.-I., Hinnebusch, A.G., and Nakatani, Y. 1998. The yeast TAF145 inhibitory domain and TFIIAcompetitively bind to TATAbinding protein. Mol Cell Biol 18:1003-1012.

53. Kornberg R. and Lorch Y. 1999. Twenty-five years of the nucleosome, fundamental particle of the eukaryote chromosome. Cell. 98: 285-294.

54. Rravchenko J.E., Rogozin I.B., Koonin E.V., Chumakov P.M. 2005. Trancription of mammalian messenger RNAs by a nuclear RNA polymerase of mitochondrial origin. Nature. 436: 735-739.

55. Kurshakova M., Maksimenko O, Golovnin A., Pulina M., Georgieva S., Georgiev P., Krasnov A. 2007b. Evolutionarily conserved E(y)2/Susl protein is essential for the barrier activity of Su(Hw)-dependent insulators in Drosophila. Mol Cell. 27(2): 332-8.

56. Kutach A. and Kadonaga J.T. 2000. The downstream prommoter element DPE appers to be as widely used as TATA box in Drosophila core promoters. Mol Cell Biol. 20: 4754-4764.

57. Ladurner, A.G., Inouye, C., Jain, R., Tjian, R. 2003. Bromodomains mediate an acetyl-histone encoded antisilencing function at heterochromatin boundaries. Mol. Cell. 11: 365- 376.

58. Lagrange, Т., Kapanidis, A.N., Tang, H., Reinberg, D., and Ebright, R.H. 1998. New core promoter element in RNA polymerase Independent transcription: sequence-specific DNA binding by transcription factor IIB. Genes Dev. 12: 34—44.

59. Lee, C.K., Shibata, Y., Rao, В., Strahl, B.D., and Lieb, J.D. 2004. Evidence for nucleosome depletion at active regulatory regions genome-wide. Nat. Genet. 36: 900905.

60. Lee, D.-H., Gershenzon, N., Gupta, M., Ioshikhes, LP., Reinberg, D., and Lewis, B.A. 2005b. Functional characterization of core promoter elements: the downstream core element is recognized by TAF1. Mol Cell Biol. 25: 9674-9686.

61. Lee Y., Kim M., Han J. et al. 2004. MicroRNA genes are transcribed by RNA polymerase П. EMBO J. V. 23. P. 4051-4060

62. Lemon, B. and Tjian, R. 2000. Orchestrated response: a symphony of transcription factors for gene control. Genes Dev. 14: 2551-2569.

63. Leurent, C., Sanders, S.L., Demeny, M.A., Garbett, K.A., Ruhlmann, C., Weil, P.A., Tora, L., and Schultz, P. 2004. Mapping key functional sites within yeast TFIID. EMBO J. 23: 719-727.

64. Levine M. and Tjian R. 2003. Transcription regulation and animal diversity. Nature. 424(6945): 147-51.

65. Li, В., Carey M., Workman J.L. 2007. The Role of Chromatin during Transcription. Cell. 128: 707-719.

66. Li, X.-Y., Bhaumik, S.R., and Green, M.R. 2000. Distinct classes of yeast promoters revealed by differential TAF recruitment. Science. 288:1242-1244.

67. Lim, C.Y., Santoso, В., Boulay, Т., Dong, E., Ohler, U., and Kadonaga, J.T. 2004. The MTE, a new core promoter element for transcription by RNA polymerase П. Genes Dev. 18: 1606-1617.

68. Lorch, Y., Zhang, M., and Romberg, R.D. 1999. Histone octamer transfer by a chromatin-remodeling complex. Cell 96: 389-392

69. Luger, K., Mader, A.W., Richmond, R.K., Sargent, D.F., and Richmond, T.J. 1997. Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 A resolution. Nature. 389: 251-260.

70. Lusser, A., Kadonaga, J.T. 2003. Chromatin remodeling by ATP-dependent molecular machines. Bioessays. 12: 1192-200.

71. Maile, Т., Kwoczynski, S., Katzenberger, R.J.,Wassarman, D.A., and Sauer, F. 2004. TAF1 activates transcription by phosphorylation of serine 33 in histone H2B. Science. 304: 1010-1014.

72. Marmorstein, R. 2001. Protein modules that manipulate histone tails for chromatin regulation. Nat. Rev. Mol. Cell Biol 2: 422- 432.

73. Mittal, V. and Hernandez, N. 1997. Role for the amino-terminal region of human TBP in U6 snRNA transcription. Science. 275: 1136-1140.

74. Mohrmann, L., Langenberg, K., Krijgsveld, J., Kal, A.J., Heck, A.J., Verrijzer, C.P. 2004. Differential targeting of two distinct SWI/SNF-related Drosophila chromatin-remodeling complexes, Mol. Cell. Biol. 24: 3077- 3088.

75. Mohrmann, L., Verrijzer, P. 2005. Composition and functional specificity of SWI2/SNF2 class chromatin remodeling complexes. Biochimica et Biophysica Acta. 1681:59-73.

76. Montecino, M., Stein, J.L., Stein, G.S., Lian, J.B., van Wijnen A.J., Gutierrez J.L. 2007. Nucleosome organization and targeting of SWI/SNF chromatin-remodeling complexes: contributions of the DNA sequence. Biochem. Cell Biol. 85: 419-425.

77. Moshkin, M.Y., Mohrmann, L., van Ijcken, W.F.J., Verrijzer P.C. 2007. Functional Differentiation of SWI/SNF Remodelers in Transcription and Cell Cycle Control. MolCellBiology. 651-661.

78. Naar, A.M., Lemon, B.D., and Tjian, R. 2001. Transcriptional coactivator complexes. Annu Rev Biochem 70:475-501.

79. Narlikar, G.J., Phelan, M.L., and Kingston, R.E. 2001. Generation and interconversion of multiple distinct nucleosomal states as a mechanism for catalyzing chromatin fluidity. Mol Cell. 8: 1219-1230.

80. Narlikar G.J., Fan H.Y., Kingston R.E. 2002. Cooperation between complexes that regulate chromatin structure and transcription. Cell. 108: 475-487.

81. Nikolov, D.B., and Burley S.K. 1994. 2.1 A resolution refined structure of a TATA box-binding protein (TBP). Nat Struct Biol. 1: 621-637.

82. Nikolov, D.B., Chen, H., Halay, E.D., Hoffman, A., Roeder, R.G., and Burley, S.K. 1996. Crystal structure of a human TATA box-binding protein/TATA element complex. Proc Natl Acad Sci USA. 93: 4862-4867.

83. Nourani, A., Utley, R.T., Allard, S., and Cote, J. 2004. Recruitment of the NuA4 complex poises the PH05 promoter for chromatin remodeling and activation. EMBO J. 23:2597-2607.

84. Olave, I.A., Reek-Peterson, S.L., Crabtree, G.R. 2002. Nuclear actin and actin-related proteins in chromatin remodeling. Annu. Rev. Biochem. 71: 755-781.

85. Onodera Y., Haag J.R., Ream Т., Nunes P.C., Pontes O. and Pikaard C.S. 2005. Plant nuclear RNA polymerase IV mediates siRNA and DNA methylation-dependent heterochromatin formation. Cell. 120: 613-622.

86. Orphanides G. and Reinberg D. 2002. A unified theory of gene expression. Cell. 108: 439-451.

87. Owen-Hughes, T. and Workman, J.L. 1996. Remodeling the chromatin structure of a nucleosome array by transcription factor-targeted /гада-displacement of histones. EMBO J. 15:4702-4712.

88. Papoulas, О. Beek, S.J. Moseley, S.L. McCallum, C.M. Sarte, M. Shearn, A. Tamkun, J.W. 1998. The Drosophila trithorax group proteins BRM, ASH1 and ASH2 are subunits of distinct protein complexes. Development. 125: 3955— 3966.

89. Papoulas, O., Daubresse, G., Armstrong, J.A., Jin, J., Scott, M.P., Tamkun, J.W., 2001. The HMG domain protein BAP111 is important for the function of the BRM chromatin-remodeling complex in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 98: 5728-5733.

90. Park, Y.J., Chodaparambil, J.V., Bao, Y„ McBryant, S.J., and Luger, K. (2005). Nucleosome assembly protein 1 exchanges histone H2A-H2B dimers and assists nucleosome sliding. J. Biol. Chem. 280: 1817-1825

91. Pereira, L.A., van der Knaap, J.A., van den Boom, V., van den Heuvel, F.A.J., and Timmers, H.T.M. 2001. TAFII170 interacts with the concave surface of TATA-binding protein to inhibit its DNA binding activity. Mol. Cell. Biol. 21: 7523-7534.

92. Pereira, L.A., Klejman, M.P., and Timmers, H.T.M. 2003. Roles for BTAF1 and Motlp in dynamics of TATA-binding protein and regulation of RNA polymerase II transcription. Gene 315: 1-13.

93. Pham, A.-D. and Sauer, F. 2000. Ubiquitin-activating/conjugating activity of TAFII250, a mediator of activation of gene expression in Drosophila. Science 289:2357-2360. 255: 1127-1229.

94. Phelan, M. L., Schnitzler, G. R., Kingston. R. E. 2000. Octamer transfer and creation of stably remodeled nucleosomes by human SWI-SNF and its isolated ATPases. Mol. Cell. Biol. 20: 6380-6389.

95. Placek, B.J., Harrison, L.N., Villers, B.M., and Gloss, L.M. 2005. The H2A.Z/H2B dimer is unstable compared to the dimmer containing the major H2A isoform. Protein Sci. 14: 514-522.

96. Raisner, R.M., Hartley, P.D., Meneghini, M.D., Bao, M.Z., Liu, C.L., Schreiber, S.L., Rando, О J., and Madhani, H.D. 2005. Histone variant H2A.Z marks the 5'-ends of both active and inactive genes in euchromatin. Cell 123: 233-248.

97. Reinke, H., and W. Horz. 2003. Histones are first hyperacetylated and then lose contact with the activated PH05 promoter. Mol. Cell. 11:1599-1607.

98. Richards E.J., Elgin S.C. 2002. Epigenetic codes for heterochromatin formation and silencing: Rounding up the usual saspects. Cell. 108:489-500

99. Richmond, T.J. 2006. Genomics: predictable packaging. Nature 442: 750-752

100. Roeder R.G. and Rutter W.J. 1969. Multiple forms of DNA-dependend RNA polymerase in eucaryotic organisms. Nature 224: 234-237.

101. Roeder R.G. and Rutter W.J. 1970. Specific nucreolar and nucleoplasms RNA polymerases. Proc Natl Acad Sci USA 65: 675-682.

102. Sandaltzopoulos, R., Quivy, J.P., Becker P.B. 1995. Analysis of protein/DNA interactions by solid-phase footprinting. Methods Mol. Cell. Biol. 5: 176-181.

103. Schafer, D.A., Schroer, T.A. 1999. Actin-related proteins. Anna. Rev. Cell Dev. Biol. 15:341-363.

104. Shao, H., Revach, M., Moshonov, S., Tzuman, Y., Gazit, K., Albeck, S., Unger, Т., and Dikstein, R. 2005. Core promoter binding by histonelike TAF complexes. Mol Cell Biol 25:206-219.

105. Shen, X., Ranallo, R., Choi, E., Wu, C. 2003. Involvement of actin-related proteins in ATP-dependent chromatin remodeling. Mol. Cell. 12: 147- 155.

106. Shen, W., Xu, C., Huang, W., Zhang, J., Carlson, J. E., Tu, X., Wu, J. and Shi, Y. 2007. Solution structure of human Brgl bromodomain and its specific binding to acetylated histone tails Biochemistry. 46: 2100-10.

107. Sif, S., Saurin A J., Imbalzano, A.N., Kingston, N.E. 2001. Purification and characterization of mSin3A-containing Brgl and hBrm chromatin remodeling complexes. Genes and Development 15: 603-618.

108. Sif, S. 2004. ATP-dependent nucleosome remodeling complexes: enzymes tailored to deal with chromatin. J Cell Biochem 91: 1087-98.

109. Simon, J.A., Tamkun, J.W., 2000. Programming off and on states in chromatin: mechanisms of Polycomb and trithorax group complexes. Curr. Opin. Genet. Dev. 12: 210-218.

110. Smith, T.F., Gaitatzes, C., Saxena, K., Neer, E.J. 1999. The WD repeat: a common architecture for diverse functions. TIBS 4: 01384-5.

111. Soldatov, A., Nabirochkina, E., Georgieva, S., Belenkaja, Т., and Georgiev, P. 1999. TAFII40 protein is encoded by the e(y)l gene: biological consequences of mutations. Mol Cell Bio., 19: 3769-3778.

112. Szerlong, H., Saha, A., Cairns, B.R. 2003. The nuclear actin-related proteins Arp7 and Arp9: a dimeric module that cooperates with architectural proteins for chromatin remodeling. EMBO J. 22: 3175-3187.

113. Thomas, J.O., Travers, A.A. 2001. HMG1 and 2, and related darchitecturalT DNA-binding proteins. Trends Biochem. Sci. 26: 167- 174.

114. Thomas M.C. and Chiang C.M. 2006. The general transcription machinery and general cofactors. Crit Rev Biochem Mol Biol. 41(3): 105-78.

115. Topalidou, I., Papamichos-Chronakis, M., Thireos, G., and Tzamarias, D. 2004. Spt3 and Motl cooperate in nucleosome remodeling independently of TBP recruitment. EMBO J23:1943-1948.

116. Tora, L. 2002. A unified nomenclature for TATA box binding protein (TBP)-associated factors (TAFs) involved in RNA polymerase II transcription. Genes Dev 16:673-675.

117. Trotter, K.W., Archer, Т. K. 2007. Nuclear receptors and chromatin remodeling machinery. Mol Cell Endocrinol. 265: 162-7.

118. Trotter, K.W., Archer, Т. K. 2008. The BRG1 transcriptional coregulator. Nuc Rec Signaling. 6: 1-12.

119. Tyler J.K. 2002 Chromatin assembly. Cooperation between histone shaperones and ATP-dependent nucleosome remodeling machines. Eur. J. Biochem. 269:2268-2274

120. Verrijzer, C.P., Tjian, R. 1996. TAFs mediate transcriptional activation and promoter selectivity. Trends Biochem Sci. 21(9):325-6.

121. Wang, W., Xue, Y., Zhou, S., Kuo, A., Cairns, B.R., Crabtree, G.R. 1996. Diversity and specialization of mammalian SWI/SNF complexes. Genes Dev. 10: 2117-2130.

122. Whitehouse, I., Flaus, A., Cairns, B.R., White, M.F., Workman, J.L., and Owen-Hughes, T. 1999. Nucleosome mobilization catalysed by the yeast SWI/SNF complex. Nature. 400: 784-787.

123. Willy, P.J., Kobayashi, R., and Kadonaga, J.T. 2000. A basal transcription factor that activates or represses transcription. Science 290:982-985.

124. Wright, K., Marr II, M.T., Tjian, R. 2006. TAF4 nucleates a core subcomplex of TFIID and mediates activated transcription from a TATA-less promoter. PNAS 103.3.

125. Wu, S.-Y., Thomas, M.C., Hou, S.Y., Likhite, V., and Chiang, C.-M. 1999. Isolation of mouse TFIID and functional characterization of TBP and TFIID in mediating estrogen receptor and chromatin transcription. J Biol Chem 274:23480-23490.

126. Yuan, G.C., Liu, Y.J., Dion, M.F., Slack, M.D., Wu, L.F., Altschuler, S.J., and Rando, O.J. 2005. Genome-scale identification of nucleosome positions in S. cerevisiae. Science 309: 626-630.

127. Zeng, L., Zhou, M.M. 2002. Bromodomain: an acetyl-lysine binding domain. FEBS Lett. 513:124- 128.

128. Zhao, X. and Herr, W. 2002. A regulated two-step mechanism of TBP binding to DNA: a solvent-exposed surface of TBP inhibits TATA box recognition. Cell 108:615-627.

129. Zhou T. and Chiang C.-M. 2002. Spl and AP2 regulate but do not constitute TATA-less human TAFII55 core promoter activity. Nucleic Acid Res. 30: 4145-4157.

130. Патрушев Л.И. 2000. Экспрессия генов. M.: Наука, 528с.