Ассоциация транскрибируемой ДНК с ядерным матриксом в условиях активации эндогенных ДНКаз in vitro на примере генов альбумина и C-FOS

Борисова, Наталья Павловна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Ассоциация транскрибируемой ДНК с ядерным матриксом в условиях активации эндогенных ДНКаз in vitro на примере генов альбумина и C-FOS
ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Ассоциация транскрибируемой ДНК с ядерным матриксом в условиях активации эндогенных ДНКаз in vitro на примере генов альбумина и C-FOS"

На правах рукописи

БОРИСОВА НАТАЛЬЯ ПАВЛОВНА

АССОЦИАЦИЯ ТРАНСКРИБИРУЕМОЙ ДНК С ЯДЕРНЫМ МАТРИКСОМ В УСЛОВИЯХ АКТИВАЦИИ ЭНДОГЕННЫХ ДНКаз IN VITRO НА ПРИМЕРЕ ГЕНОВ АЛЬБУМИНА

И C-FOS

03.00.02 - биофизика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2003

Работа выполнена в Институте проблем химической физики РАН.

Научный руководитель: кандидат биологических наук A.A. Терентьев

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

профессор Л.Б. Горбачева; доктор биологических наук В.И. Попенко

Ведущая организация: Институт биофизики клетки РАН Защита состоится « /У » 2003 г. в ^^ч. на засе-

дании Диссертационного Совета Д 002.039.01 в Институте биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН. Адрес: 117977, Москва, ул. Косыгина, 4.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института химической физики им. H.H. Семенова РАН.

Автореферат разослан « 5/» ояжлт^ 2003 г.

Ученый секретарь

Диссертационного Совета Д 002.039.01

кандидат химических наук М.А. Смотряева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Регуляция транскрипции - это сложный многоступенчатый каскад реакций, включающий большой набор факторов различной природы и объединяющий все уровни организации живого организма. Нарушения функций любого из элементов каскада регуляции транскрипции, которые могут быть вызваны факторами окружающей среды или наследственными мутациями, лежат в основе большинства заболеваний. Наряду с практической актуальностью, изучение молекулярных механизмов регуляции транскрипции имеет важное значение для понимания процессов реализации генетической информации, т.е. функционирования генома.

Конечные этапы регуляции транскрипции осуществляются в клеточном ядре и объединяют два основных процесса: модуляция активности ферментативного комплекса, синтезирующего РНК, и изменение структуры хроматина в генном локусе. Белковые факторы, участвующие в данных процессах, а также ДНК генного локуса, должны быть точно скоординированы в пространстве. Подобная пространственная координация предполагает наличие в ядре довольно жестко фиксированной структуры, опосредующей взаимодействие большого набора молекул в определенном внутриядерном локусе.

Функция пространственной координации внутриядерных процессов осуществляется, по-видимому, скелетной структурой клеточного ядра - ядерным матриксом. В настоящее время накоплен большой экспериментальный материал, свидетельствующий о том, что ядерный матрикс играет важную роль в регуляции транскрипции. Показано, что препараты ядерного матрикса обладают ДНК-связывающими активностями к различным регулятор! гым элементам. Среди белков ядерного матрикса обнаружено большое количество ферментативных систем, участвующих во многих внутриядерных процессах, в том числе и транскрипции (Deepesh, 2002). Особую актуальность данной теме придают данные, согласно которым мутации в генах, кодирующих белки ядерного матрикса приводят к ряду наследственных заболеваний (Woman et al., 2000; Cohen

РОС НАЦИОНАЛЬНАЯ!

БИБЛИОТЕКА ] 1 С. Петербург «V ^ Д { 09

et al., 2001). Определенные белки ядерного матрикса являются диагностическим маркером онкологических заболеваний (Bosman, 1999). Вещества, подавляющие активность некоторых белковых факторов ядерного матрикса, рассматриваются как перспективные антираковые соединения (Inoue et al., 2002).

В связи с этим изучение структуры и функции ядерного матрикса имеет важное значение для понимания процессов регуляции транскрипции. Наиболее распространенным подходом к получению препаратов ядерного матрикса является гидролиз ДНК экзогенными ДНКазами с последующей экстракцией матрикс-несвязанного хроматина. При этом как этап нуклео-лиза, так и этап экстракции хроматина не стандартизирован и получаемые препараты ядерного матрикса отличаются по своим свойствам. Таким образом, получение препаратов ядерного матрикса сопряжено с многочисленными трудностями, которые связаны не только с его сложной организацией, но также с отсутствием общепринятых методов для его изучения.

Одним из перспективных подходов для получения препаратов ядерного матрикса, обогащенных факторами, участвующими в регуляции транскрипции может быть использование внутриядерных ДНКаз. Эндогенные ДНКазы имеют принципиальное отличие от экзогенных, которое заключается в том, что пространственное распределение внутриядерных ДНКаз носит неслучайный характер и зависит от их функций (Ходарев, 1989; Casería et al., 1994). Специфичное распределение и локальные различия в активности эндогенных ДНКаз могут служить дополнительным селективным фактором при разделении транскрипционно активного и неактивного хроматина, а также при разделении различных составляющих ядерного хроматина по другим функциональным признакам. В качестве модельных генов выбраны гены, которые в покоящихся гепатоцитах имеют разную транскрипционную активность: протоонкоген c-fos, ген альбумина и ген, кодирующий константную область легкой цепи каппа иммуноглобулина Ск.

Цель и задачи работы

Целью данного исследования является изучение ассоциации транскрипционно активного хроматина с ядерным матриксом, полученным при использовании эндогенных Са27М§2*-зависимых ДНКаз.

В связи с этим основными задачами данного исследования являются:

1) изучение кинетики гидролиза хроматина эндогенными Ca27Mg2+-зависимыми ДНКазами.

2) изучение характера действия эндогенных Са27М£2+-зависимых ДНКаз на ДНК в локусе активного гена альбумина и неактивного гена c-fos.

3) изучение влияния глубины нуклеолиза хроматина эндогенными Са27М§2+-зависимыми ДНКазами на качественный состав препаратов ядерного матрикса.

4) изучение функциональной ассоциации с ядерным матриксом гена с-й« при изменении экспрессии данного гена.

Научная новизна работы

В ходе данного исследования в качестве инструмента для изучения ассоциации транскрибируемой ДНК с ядерным матриксом используются эндогенные Са271^2*-зависимые ДНКазы. В действии внутриядерных ДНКаз обнаружена стадия медленного гидролиза ДНК. На данной стадии фрагментация хроматина происходит без образования кислотораствори-мых продуктов нуклеолиза.

Показано, что на стадии медленного гидролиза ДНК в хроматине, связанном со структурами ядерного матрикса, эндогенные Са2+/Мд2+-зависимые ДНКазы фрагментируют транскрипционно активный ген альбумина в меньшей степени, по сравнению с неактивным геном с-й«.

Для более полного выявления различий в характере фрагментации хроматина предложен дополнительный критерий оценки действия эндогенных ДНКаз - разностные электрофоретические профили ДНК. Поскольку радиоавтограф каждого гена получен с ДНК, обладающей определенным профилем молекулярно-весового распределения, то вычитание из денситограммы радиоавтографа кривой профиля ДНК как фонового позволяет выявить особенности, характерные для исследуемых генов.

С использованием разностных электрофоретических профилей ДНК обнаружен двойственный характер действия эндогенных Са27М§2+-зависимых ДНКаз на хроматин, не связанный с ядерным матриксом. В области легкорастворимого, как и для матрикс-связанного хроматина, внутриядерные ДНКазы фрагментируют транскрипционно активный ген альбумина в меньшей степени, по сравнению с неактивным геном с-Аов. Для труднорастворимого хроматина наблюдается обратная зависимость: активный ген альбумина более подвержен действию эндогенных Са27\^2+-зависимых ДНКаз, чем неактивный ген с-й«.

На основе различий в активности внутриядерных ДНКаз в локусах активных и неактивных генов предложен новый подход для получения препаратов ядерного матрикса, селективно обогащенных транскрибируемой ДНК. В ходе данного метода обнаружено, что при использовании эндогенных Са27М§2+-зависимых ДНКаз в получении препаратов ядерного матрикса важное значение имеет глубина нуклеолиза хроматина внутриядерными ДНКазами. Получение препаратов ядерного матрикса, обогащенных транскрипционно активным хроматином возможно в условиях медленного гидролиза ДНК внутриядерными ДНКазами. При этом степень фрагментации ДНК на данной стадии характеризуется разрушением петлевых доменов

хроматина и относительно равномерной плотностью распределения ДНК на электрофоретическом профиле фрагментированной ДНК ядерного матрикса.

Научно-практическая значимость работы

Полученные в ходе данной работы результаты по ассоциации транскрибируемой ДНК с ядерным матриксом и пониженной активности эндогенных ДНКаз в локусе активных генов, представляют большой интерес для исследования в области структуры и функции хроматина, а также для изучения процессов регуляции транскрипции. Предложенный метод получения препаратов ядерного матрикса, селективно обогащенного транс-крипционно активным хроматином, с применением соответствующих генных маркеров, может быть использован для изучения молекулярных механизмов возникновения генетических и онкологических заболеваний.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Обнаружено явление селективного снижения активности эндогенных Са -зависимых ДНКаз в области транскрипционно активного хроматина.

2. На основе локальных различий в активности эндогенных Са2+/М£2+-зависимых ДНКаз в локусе активных и неактивных генов, разработан подход к получению препаратов ядерного матрикса, обогащенных транскрибируемой ДНК на примере генов альбумина и с-^в.

Апробация работы

Результаты исследований, представленные в работе, были доложены на следующих научных мероприятиях: школа молодых ученых "Молекулярная биология и биомедицина", Черноголовка, апрель 1999 г; школа-конференция "Горизонты физико-биологической науки", Пущино, май 2000 г; конференция "Фундаментальная наука в наукоградах Московской области", Черноголовка, октябрь 2001 г; школа-конференция молодых ученых "Биология - наука XXI века", Пущино, апрель 2003 г.

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 6 печатных работ.

Структура и объем работы

Диссертация состоит из введения, обзора литературы (главы 1-4), описания материалов и методов исследования, результатов и обсуждения (главы 5-9), выводов и списка литературы. Объем диссертации составляет 138 страниц машинописного текста, включая 27 рисунков и 1 таблицу. Библиография включает 246 наименований.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Методы исследования

Эксперименты проводили на самцах крыс линии \М51аг 140-160 г. Образцы печени отбирали после периода голодания продолжительностью 18 ч. Для активации гена раннего ответа с-йэв животным после голодания внутрибрюшинно вводили раствор циклогексимида (ЦГИ) в 0.9 % ЫаС1 из расчета 3 мг/кг веса. Данная концентрация ЦГИ выбрана в связи с тем, что экспрессия исследуемого гена с-Азя изучена с применением именно этой дозы. Образцы печени отбирали через 1 и 2 часа после введения ЦГИ. 1 Ядра из клеток печени очищали гомогенизацией ткани в растворе

0.25 М сахарозы в буфере А (20 мМ ЫН4С1, 5 мМ СаС12, 50 мМ Трис-НС1, рН 9.0) с последующим разрушением мембран в том же растворе в присут-( ствии 0.2 % тритона Х-100 и очисткой через слой 1 М сахарозы в буфере А.

Для изучения кинетики гидролиза хроматина эндогенными -зависимыми ДНКазами, очищенные ядра инкубировали в нук-леазном буфере Б (0.25 М сахароза, 10 мМ К^СЬ, 1 мМ СаСЬ, 50 мМ Трис-НС1, рН 8.0) при 30 °С от 0 до 60 мин. Количество кислотораствори-мого хроматина, экстрагируемого в присутствии 0.25 Н НСЮ4, определяли спектрофотометрически при длине волны 260 нм и выражали в процентах от количества суммарного ядерного хроматина.

Нуклеазную обработку ядер проводили эндогенными зависимыми ДНКазами и экзогенной ДНКазой I. Для гидролиза ДНК эндогенными Са27\^2+-зависимыми ДНКазами изолированные ядра помещали в нуклеазный буфер Б и ядра инкубировали при температуре 30°С в течение 0, 15 и 180 мин. Для нуклеазной обработки ДНКазой I ядра ресуспендировали в нуклеазном буфере В (0.25 М сахароза, 5 мМ М^Ь, 1 мМ СаС12,50 мМ Трис-> НС1, рН 7.5), добавляли ДНКазу I в количестве 1 мг фермента на 3 мг хрома-

тина. Ядра инкубировали при температуре 37 °С в течение 1 и 5 минут.

Фракции хроматина получали без предварительного нуклеолиза, либо после активации внутриядерных ДНКаз в результате инкубации ядер в ' нуклеазном буфере Б при 30 °С в течение 15 и 180 мин. Легкораствори-

мый хроматин экстрагировали раствором ТМ (0.2 мМ 50 мМ Трис-

НС1, рН 7.5), 5 мин при 4 °С (фракция Р1), затем 20 мин при 30 °С (фракция Р2). Труднорастворимый хроматин (фракция Тр) экстрагировали раствором 2 М №С1 в ТМ. После промывки 1 % тритоном Х-100 в ТМ получали конечный препарат ядерного матрикса (фракция ЯМ).

ДНК из препаратов ядерного матрикса очищали растворением материала в растворе ГГЦ (4 М гуанидинтиоцианат, 20 мМ ацетат N8, 1 % лаурил-саркозил №, 1 % р-меркаптоэтанол, 40 мМ трис-НС1, рН 8.0) с последующей инкубацией при 65 °С в присутствии 1 % додецилсульфата № в течение

2-3 мин, депротеинизацией и обработкой РНКазой А. После электрофореза ДНК в 2 % агарозе (10 мкг ДНК на дорожку) проводили гибридизацию по Саузерну с соответствующими меченными зондами исследуемых генов.

Экспрессию генов определяли нозерн-гибридизацией суммарной РНК гепатоцитов с меченными зондами генов альбумина, с-Азв и Ск. РНК из гепатоцитов очищали гомогенизацией ткани в растворе ГТЦ с последующим ультрацентрифугированием в градиенте СбС1. Электрофорез РНК (20 мкг РНК на дорожку) в денатурирующих условиях проводили в 1% агарозе в присутствии формальдегида и формамида.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Кинетика нуклеолиза хроматина эндогенными Са27Мё2+

-зависимыми ДНКазами

В данном исследовании в качестве основного Инструмента для изучения ассоциации транскрипционно активного хроматина с ядерным матриксом использовали эндогенные

-зависимые ДНКазы (СМД). Известно, что активация СМД осуществляется в результате инкубации изолированных ядер в соответствующем реакционном буфере при 37 °С (Ходарев, 1981). Однако в данных условиях контролировать функционирование СМД довольно сложно в связи с их высокой активностью. С целью более достоверного контроля за ходом нуклеолиза скорость реакции была уменьшена за счет понижения температуры с 37 до 30 °С. Примененный подход позволил обнаружить, что динамика хроматина СМД имеет сложную временную зависимость.

На рис. 1 показана динамика накопления кислоторастворимой ДНК в процессе нуклеолиза ядер гепатоцитов эндогенными Са27М§2+- <

зависимыми ДНКазами. Из рис. 1 видно, что в процессе гидролиза хроматина внутриядерными СМД выделяются несколько этапов. В первые 10 мин после активации СМД в изолированных ядрах гепатоцитов ско- 5

рость накопления кислоторастворимой ДНК максимальна. В период от 10 до 20 мин наблюдается медленная стадия нуклеолиза, в это время практически не происходит накопление кислоторастворимой ДНК. Через 20 мин после активации СМД начинается вторая быстрая фаза гидролиза, и через 40 мин кривая накопления кислоторастворимой ДНК выходит на плато. Полученные данные свидетельствуют о том, что в действии СМД имеется стадия медленного гидролиза хроматина, на которой не происходит образование кислоторастворимых продуктов. Для более детального изучения стадии медленного гидролиза ДНК под действием СМД необходимо использование дополнительных методов, одним из которых

является электрофоретическое разделение ДНК, экстрагированной из изолированных ядер гепатоцитов после активации СМД.

На рис. 2 представлены электрофореграммы ДНК, очищенной из ядер гепатоцитов до активации и через 5, 10 и 15 мин после активации СМД. Из рис. 2 видно, что до активации ферментов ДНК изолированных ядер гепатоцитов представлена высокомолекулярными фрагментами, которые при электрофорезе остаются на старте, а также фрагментами ДНК размерами около 2050 тыс. п. н. Данные фрагменты ДНК соответствуют петлевым доменам хроматина и плохо разделяются в данной части геля. В период нуклеолиза от 5 до 15 мин наблюдается разрушение петлевых доменов хроматина с образованием фрагментов ДНК от 200 п. н. до 20 тыс. п. н. (рис. 2). На данном этапе, очевидно, происходит диффузия СМД из участков их начальной локализации и фрагментация ДНК отдельных генных локусов в составе петель хроматина. Для данного исследования особый интерес представляет действие СМД во внутренних областях петель хроматина, так как именно на этом этапе происходит гидролиз ДНК транскрибируемых и нетранскрибируемых генов.

время, мин

Рис. 1. Динамика накопления кислоторастворимой ДНК в изолированных ядрах гепатоцитов после активации эндогенных Са27\^2+-зависимых ДНКаз. Количество кнслоторастворимой ДНК определяли в процентах от суммарного количества ядерного хроматина. По оси абсцисс отложено время после активации эндогенных СМД

12 3 4

Рис. 2. Электрофореграммы ДНК, очищенной из ядер гепатоцитов до активации (I) и через 5 (2), 10 (3), 15 мин (4) после активации эндогенных Са2*/Л^24-зависимых ДНКаз

Таким образом, видно, что отсутствие накопления кислотораствори-мой ДНК на медленной стадии гидролиза не является признаком прекращения процесса нуклеолиза эндогенными СМД, а скорее может свидетельствовать о том, что на этапе медленного гидролиза происходит фрагментация хроматина, но, очевидно, на более крупные кислотонераствори-мые фрагменты.

2. Влияние степени нуклеолиза хроматина эндогенными Са271^2+-зависимыми ДНКазами на обогащенность препаратов ядерного матрикса транскрибируемой ДНК

Выбор оптимального режима нуклеолиза имеет принципиальное значение для данного исследования, так как одной из задач настоящей работы является изучение влияния глубины гидролиза хроматина на качественный состав препаратов ЯМ. С этой целью изучали препараты ЯМ, полученные с использованием различных режимов гидролиза: начального, обусловленного остаточной активностью СМД (0 мин), медленного, при котором не происходит накопление кислоторастворимой ДНК (15 мин) и глубокого, когда хроматин максимально гидролизован (180 мин).

Характер ассоциации транскрибируемого и нетранскрибируемого хроматина с ядерным матриксом исследовали на примере генов альбумина и с-й« (рис. 3, К). Данные гены показывают разную активность в клет-

ках печени: ген с-Аэб неактивен в покоящихся гепатоцитах, ген альбумина проявляет высокую тканеспецифичную экспрессию. Таким образом, гены с-Азв и альбумина могут использоваться при качественном анализе препаратов ядерного матрикса.

К 1 2

Рис. 3. Радиоавтографы, полученные при гибридизации РНК, очищенной из гепатоци-тов контрольных животных (К) и через I и 2 ч после введения ЦГИ (I и 2), с радиоактивными зондами генов с-Гов, альбумина и Ск

^ Препараты ядерного матрикса получали в результате последовательной

экстракции из ядер гепатоцитов матрикс-несвязанного хроматина до активации СМД и после активации СМД в течение 15 и 180 мин. Качественный состав ДНК, оставшейся связанной с ЯМ после активации СМД, исследовали 1 методами электрофореза и Саузсрн-гибридизации.

На рис. 4 показаны результаты гибридизации ДНК полученных препаратов ЯМ с зондами генов c-fos и альбумина. В ДНК ядерного матрикса, полученного без предварительной активации эндогенных ДНКаз (рис. 4а) неактивный ген c-fos и активный ген альбумина фрагментирова-ны слабо и практически в равной степени. В отсутствие нуклеолиза характерно сохранение большей части высокомолекулярной ДНК, т.е. петлевые домены хроматина не разрушены. При этом ДНК генных локусов остается негидролизованной. В связи с этим отсутствует и специфика в характере гидролиза ДНК исследуемых генов.

c-fos -23.7%

альбумин (Alb) -25.5%

c-fos - 5.1 %

альбумин (Alb) -22.8%

c-fos - 5.9 %

альбумин (Alb) -6.8%

поомжность

Рис. 4. Электрофореграмма ДНК и радиоавтографы, полученные при гибридизации с меченными зондами генов c-fos и альбумина ДНК, очищенной из ядерного матрикса

до активации (А) и через 15 мин (Б), 180 мин (В) после активации эндогенных Ca27Mg2*-3HBHCHMbix ДНКаз. По оси ординат отложена оптическая плотность радиоавтографа, по оси абсцисс - подвижность фрагментов ДНК соответствующих генов в ходе электрофореза. Цифрами показано относительное содержание генов в ДНК ядерного матрикса при различной глубине нуклеолиза

Специфика в действии эндогенных ДНКаз не наблюдается также и в случае высокой степени фрагментации ДНК (рис. 4в). ДНК представлена

низкомолекулярными фрагментами и гены с разной транскрипционной активностью также фрагментированы в равной степени (рис. 4в).

На стадии медленного гидролиза при средней степени фрагментации хроматина ДНК, связанная с ядерным матриксом, представлена фрагментами от 200 п. н. до 20 тыс. п. н. (рис. 46). Очевидно, что в этих условиях различия в чувствительности хроматина отдельных генных локусов могут выявляться наиболее достоверно. Действительно, в данном случае характер гидролиза ДНК в локусах неактивного с-йв и активного гена альбумина имеет очевидные различия (рис. 46). Связанная с ядерным матриксом ДНК гена альбумина менее фрагментирована после активации эндо-1 генных СМД по сравнению с ДНК гена с-йю.

Для того чтобы оценить степень связывания ДНК разных генов с ЯМ, вычисляли относительную радиоактивность ДНК ядерного матрикса по ^ двум данным генам как процент от суммарной радиоактивности ДНК всех

фракций, полученных в ходе экстракции ЯМ. Видно, что при низкой степени гидролиза ДНК различия "в содержании активного гена альбумина (25.5 %) и неактивного гена с-й« (23.7 %) в ядерном матриксе отсутствуют. Избыточный нуклеолиз приводит к тому, что оба гена практически утрачивают связь с ЯМ (с-К« - 5.9 %, альбумин - 6.8 %). На этапе медленного гидролиза характер ассоциации генов с ядерным матриксом коррелирует с активностью генов: относительная радиоактивность ДНК ядерного матрикса для гена с-Аэз составляет около 5.1 %, а для гена альбумина - 22.8 %.

Таким образом, применение различных режимов нуклеолиза позволило обнаружить важное свойство СМД. На этапе медленного гидролиза (рис. 1) интенсивность фрагментации матрикс-связанной ДНК неактивного гена превышает скорость разрушения ДНК активного гена. При этом р наблюдается селективная ассоциация транскрибируемой ДНК с ядерным

матриксом. Представленные данные показывают, что при получении пре-г паратов ЯМ необходимо контролировать степень фрагментации ДНК. Оп-

тимальный режим нуклеолиза характеризуется следующими признаками: ь во-первых, период гидролиза ДНК эндогенными СМД должен составлять

около 15 мин при температуре 30 °С; во-вторых, петлевые домены хроматина (соответствующие полимерной ДНК размером выше 20 тыс. п. н.) должны быть фрагментированы; и, в-третьих, профиль фрагментирован-ной ДНК ядерного матрикса должен иметь относительно равномерную плотность распределения ДНК.

3. Функциональная ассоциация гена с-Го$ с ядерным матриксом при его активации циклогексимидом

3.1. Изменения в структуре хроматина при подавлении белкового синтеза циклогексимидом

Данные по изучению ассоциации генов с ядерным матриксом получены на примере двух генов, находящихся в разных функциональных состояниях. В то же время важно провести подобное исследование в локусе одного гена при изменении его транскрипционной активности, которое показывало, что ассоциация с ядерным матриксом свойство не отдельного гена, а характеристика транскрипционно активного хроматина в целом. В связи с этим использовали экспериментальную систему ЦГИ-индуцированной активации генов раннего ответа. Данная система хорошо известна, но ее применение связано с некоторыми ограничениями.

На рис. 5 представлены результаты электрофоретического исследования ДНК, очищенной из ядер гепатоцитов контрольных животных и через 2 ч после введения ЦГИ до и после активации СМД. Из рис. 5 видно, что при действии ЦГИ происходит заметное снижение степени фрагментации ДНК в гепатоцитах, что может свидетельствовать о компактизации хроматина. В тоже время замедление скорости фрагментации ДНК может быть связано с подавлением активности СМД в гепатоцитах при действии ЦГИ.

1 2 3 4 5 6

Рис. 5. Элекгрофореграммы ДНК, очищенной из ядер гепатоцитов контрольных животных (1-3) и через 2 ч после введения ЦГИ (4-6) до (1,4) и после активации эндогенных Са27М$2+-зависимых ДНКаз в течение 5 (2, 5) и 15 мин (3,6)

На рис. 6 представлены электрофореграммы ДНК, очищенной из ядер гепатоцитов, обработанных экзогенной ДНКазой I. Из рис. 6 видно, что в изолированных ядрах контрольных животных ДНКаза I гидролизует ДНК с образованием фрагментов со средним размером около 200-300 п. н. Через 2 ч после введения ЦГИ скорость гидролиза ДНК снижена. Параллельно с ДНК, фрагментированной до 200-300 п. н. наблюдается большое количество высокомолекулярной ДНК. Единственным фактором, определяющим скорость фрагментации хроматина ДНКазой I, является сила взаимодействия ДНК с белками, т.е. структурное состояние хроматина. Следовательно, данные по изменению чувствительности ДНК к экзогенной I' ДНКазе I показывают, что ЦГИ вызывает структурную реорганизацию

хроматина, связанную с его компактизацией.

л 1 2 3 4 5 6

Рис. 6. Электрофореграммы ДНК, очищенной из ядер гепатоцитов контрольных живот-1 ных (1-3) и через 2 ч после введения ЦГИ (4-6) до (1,4) и после обработки хроматина

^ ДНКазой I в течение 1 (2, 5) и 5 мин (3, 6)

В связи с этим, в исследованиях на модели ЦГИ-индуцированной активации генов раннего ответа необходимо учитывать, что компактизация хроматина на общем уровне и возможное снижение активности СМД могут вносить искажения в получаемые результаты по ассоциации исследуемых генов с ЯМ.

3.2. Определение степени ассоциации гена c-fos с ядерным матриксом при индукции его экспрессии

На рис. 3 показаны данные по экспрессии исследуемых генов c-fos, |

Ск и альбумина в гепатоцитах контрольных животных, а также через 1 и '

2 ч после введения ЦГИ. При действии ЦГИ наблюдается значительное повышение количества мРНК гена c-fos, в тоже время экспрессия гена альбумина и Ск не изменяется. Ген альбумина активен, а ген Ск репрессирован в течение первых двух часов действия ЦГИ. Постоянный уровень j экспрессии гена альбумина и Ск предполагает, что в локусе данных генов структура хроматина и степень ассоциации ДНК с ЯМ не изменяется. В ' дальнейшей работе при определении степени ассоциации гена c-fos с ядерным матриксом гены альбумина и Ск используются в качестве кон- 1 троля, позволяющего количественно оценить вклад искажений, вносимых ^ компактизацией хроматина при действии ЦГИ.

С целью изучения ассоциации хроматина генных локусов c-fos, Ск и альбумина с ядерным матриксом ДНК, очищенную из препаратов ЯМ, ги-бридизовали с соответствующими радиоактивными зондами (рис. 7). Изменение радиоактивности ДНК по трем генам, т.е. оптическую плотность радиоавтографов, при действии ЦГИ выражали в процентах от радиоактивности ДНК ядерного матрикса контрольных животных, принятой за 100 %. Полученные результаты (рис. 8) показывают, что индукция гена с-.fos при действии ЦГИ сопровождается увеличением содержания этого гена в ДНК ядерного матрикса до 600 % (в 6 раз). В локусе гена Ск, репрессированного в гепатоцитах как в контроле, так и при действии ЦГИ, наблюдается незначительное усиление в его ассоциации с ЯМ на 20 % (рис. 8). Обнаруженная в контроле некоторая ассоциация неактивного гена Ск с ЯМ объясняется, вероятно, наличием в кластере иммуноглобули- ' нового гена конститутивного MAR, в непосредственной близости от которого расположен ген Ск. Для гена альбумина, проявляющего высокую ак- ' тивность как в гепатоцитах контрольных животных так и при действии 'f ЦГИ, обнаружено, что ЦГИ вызывает усиление его связи с ЯМ в 2 раза (до 400 %) (рис. 8).

Таким образом, в отсутствии изменений в уровне экспрессии гена альбумина и Ск наблюдается определенное усиление в ассоциации данных генов с ЯМ. Очевидно, это связано с рассмотренным выше фактом, свидетельствующим о компактизации хроматина гепатоцитов при действии ЦГИ и возможной частичной инактивации СМД. Следовательно, структурные изменения хроматина гепатоцитов на общем уровне вносят искажения в получаемые результаты. Данные "по генам альбумина и Ск позво-

ляют оценить вклад этих искажений и более достоверно охарактеризовать истинную картину функциональной ассоциации гена c-fos с ЯМ в процессе индукции его экспрессии. Двукратное усиление ассоциации гена альбумина определяется, вероятно, наличием сторонних эффектов, не связанных с изменениями в уровне транскрипции. Следовательно, истинное значение функциональной ассоциации гена c-fos с ЯМ в процессе его индукции оценивается в 300 % (вдвое меньше, чем обнаруженное 6-кратное усиление его связи с ЯМ).

Таким образом, подавление трансляции ЦГИ вызывает компактиза-цию хроматина гепатоцитов. С учетом вклада происходящей компактиза-ции и возможного ингибирования активности СМД обнаружена функциональная ассоциация гена c-fos с ЯМ в процессе его индукции.

ДНК c-fos Ск Alb

К 1 2 К 1 2 К 1 2 К 1 2

Рис. 7. Электрофореграммы ДНК, очищенной из препаратов ядерного матрикса гепатоцитов контрольных животных (К) и через I и 2 ч после введения ЦГИ (I и 2) и радиоавтографы, полученные при гибридизации ДНК с радиоактивными зондами генов с-Л», альбумина и ск

К 1 2

Рис. 8. Изменение оптической плотности радиоавтографов, полученных в результате гибридизации ДНК ядерного матрикса с зондами генов с-йэя, альбумина и Ск1 при действии ЦГИ. Оптическая плотность радиоавтографов, полученных"для ДНК ядерного матрикса через 1 (I) и 2 ч (2) после введения ЦГИ выражена в процентах от оптической плотности радиоавтографов ДНК ядерного матрикса контрольных животных (К)

4. Двойственный характер действия эндогенных Са2+/1У^2+-зависимых ДНКаз на транскрипционно активный и неактивный хроматин

Полученные результаты по функциональной ассоциации транскрибируемых генов с ЯМ основаны на том, что в действии СМД по отношению к транскрипционно активному и неактивному хроматину существует определенная специфичность. ДНК ядерного матрикса представляет собой часть ядерной ДНК, которая не подвержена действию ДНКаз. Следовательно, по характеру фрагментации хроматина ядерного матрикса можно судить лишь о качестве ДНК, недоступной ДНКазам. Хроматин растворимых фракций представляет собой материал, подвергшийся гидролизу эндогенными СМД. Следовательно, динамику фрагментации хроматина необходимо изучать именно на примере ДНК растворимых фракций.

На рис. 9 показаны профили молекулярно-весового распределения ДНК, очищенной из растворимых фракций, и ДНК исследуемых генных локусов после активации внутриядерных СМД. В связи с разной активностью генов следует ожидать, что действие ДНКаз в исследуемых генных локусах различно. Однако из рис. 9 видно, что в растворимых фракциях хроматина различия в характере фрагментации ДНК генов с-Аэз и альбумина выражены довольно слабо.

I I

подвижность

Рис. 9. Денситометрические профили электрофоре грамм (кривая 1) ДНК растворимых фракций Р1 (а), Р2 (б) и Тр (в) и радиоавтографов, полученных при гибридизации данных образцов ДНК с радиоактивными зондами генов с-йк (кривая 2) и альбумина (кривая 3). По оси ординат отложена оптическая плотность, по оси абсцисс - подвижность фрагментов ДНК в ходе электрофореза

Для более полного выявления различий в характере фрагментации хроматина растворимых фракций использовали дополнительный критерий оценки действия ДНКаз - разностные электрофоретические профили фрагментации ДНК. Так как каждый радиоавтограф получен с ДНК, обладающей определенным профилем молекулярно-весового распределения, то вы-

читание из денситограммы радиоавтографа кривой профиля ДНК как фо- ;

нового позволяет выявить особенности, характерные для определенного гена. Получаемые при данной процедуре разностные электрофоретические '

профили ДНК не могут использоваться для корректного математического '

описания наблюдаемых закономерностей, однако, позволяют оценить каче- |

ственную картину фрагментации ДНК в определенном генном локусе. Если I

хроматин генного локуса фрагментируется так же, как и общий ядерный ;

хроматин, то получаемый разностный профиль имеет форму, близкую к прямой, параллельной оси абсцисс. Любые отличия радиоавтографа от эле-ктрофореграммы ДНК приводят к изгибам разностного профиля. I

Полученные разностные электрофоретические профили приведены на рис.10. Обнаружено, что в процессе нуклеолиза хроматина в легкорастворимых фракциях Р1 и Р2 (рис.10 а, б) хроматин в локусе гена альбумина гидролизован в меньшей степени, чем в локусе гена с-йм. Хроматин в локусе неактивного гена с-йн фрагментирован в основном до ди-, три- и '<

тетрануклеосом, а в локусе активного гена альбумина - до более крупных фрагментов. Следовательно, ДНК гена альбумина, экстрагируемая в низкосолевой ТМ-буфер, фрагментируется эндогенными СМД медленнее, чем ДНК гена с-йк. Для фракции труднорастворимого хроматина характерны обратные свойства: фрагментация неактивного гена с-йге в данной фракции замедлена по сравнению с активным геном альбумина (рис.10 в). '

Полученные данные показывают, что действие эндогенных СМД в ,

разных компартментах хроматина неодинаково. Картина гидролиза ДНК определенного генного локуса зависит от того, в каких условиях экстрагируется исследуемый хроматин. Хроматин растворимых фракций и фракции ядерного матрикса обогащен факторами, участвующими в транскрипции, в то время, как труднорастворимый хроматин содержит преимущественно структурные белки хроматина, прочно связанные с ДНК. Снижение скорости гидролиза ДНК транскрибируемых генов эндогенными СМД показыва- ' ет, что активность Ca27Mg2+-зaвиcимыx ДНКаз может локально подавляться в локусах активных генов. Наблюдаемые локальные различия в активности СМД, вероятно, основаны на взаимодействии СМД с белковыми фак- >, торами, участвующими в процессе транскрипции. Таким образом, примененные в ходе данного исследования эндогенные СМД, в отличие от экзогенных ДНКаз, чувствительны не только к структуре хроматина, но и к качественному составу связанных с ними неструктурных белков.

Рис. 10. Разностные электрофоретическне профили фрагментации ДНК гена с-йэв (1) и

альбумина (2) в растворимых фракциях хроматина Р1 (а), Р2 (б) и Тр (в). По оси абсцисс отложена подвижность фрагментов ДНК, по оси ординат - разностная оптическая плотность (Д0=0р-0„ где Ор - оптическая плотность радиоавтографа, О, - оптическая плотность электрофореграммы)

5. Структурная и функциональная составляющие нуклеолиза хроматина эндогенными Са27М§2+-зависимыми ДНКазами

Суммируя данные, полученные в ходе исследования, предлагается '

схема, в которой показано влияние глубины гидролиза хроматина эндогенными СМД на качественный состав препаратов ЯМ.

На начальных этапах нуклеолиза эндогенные СМД фрагментируют ДНК в местах прикрепления петлевых доменов к ЯМ. На данном этапе ген-специфичная активность эндогенных СМД не проявляется, так как, возможно, не происходит фрагментация ДНК генных локусов в составе петель хроматина (рис. 11а). Недостаточный гидролиз хроматина на ранних этапах приводит к получению препаратов ЯМ, содержащих ДНК как активных так и неактивных генов (рис. 11а).

С завершением начального этапа нуклеолиза эндогенные СМД, веро- .

ятно, диффундируют из участков их начальной локализации в область прилегающих участков хроматина (рис. 116). В этот момент начинается гидролиз ДНК на всем протяжении петлевого домена хроматина, включая ДНК отдельных генных локусов. Локусы транскрибируемых генов, по- I

видимому, содержат факторы, которые, с одной стороны, участвуют в процессе транскрипции и в тоже время, способны ингибировать активность СМД (фактор X на рис. 11). На данном этапе локальные различия в активности СМД приводят к тому, что ДНК .нетранскрибируемых генов гидро-лизуется более эффективно, чем ДНК активных генов. В связи с этим, возможно, получение препаратов ЯМ, селективно обогащенных транскрипци-онно активными последовательностями ДНК (рис. 116).

Взаимодействие факторов транскрипции с эндогенными СМД, очевидно, не приводит к полному подавлению активности нуклеазы и при продолжительном нуклеолизе (рис. 11 в) происходит окончательное раз- )

рушение ДНК не только неактивных генных локусов, но также ДНК транскрибируемых генов. При избыточном нуклеолизе активные и неактивны^ гены утрачивают связь с ЯМ (рис. 11в).

Таким образом, использование эндогенных ДНКаз позволило не только '

изучить явление ассоциации транскрибируемой ДНК с ядерным матриксом, но и обнаружить важное свойство Са2+/Т^2+-зависимых ДНКаз — снижение активности данных ферментов в локусе транскрибируемых генов. Известно, что для активации транскрипции необходима реорганизация хроматина, направленная на изменение его компактной структуры. В процессе ремоделиро-вания хроматина происходит временное освобождение определенных участков ДНК от белков. При этом увеличивается доступность ДНК не только для транскрипционных факторов, но и для различных внутриядерных ДНКаз. Функционирование эндогенных ДНКаз связано с внесением одно- и двунети-

вых разрывов и, следовательно, нарушением целостности молекулы ДНК. Появление разрывов в ДНК является сигналом для начала процесса репарации поврежденных участков, который в свою очередь приводит к временному подавлению транскрипции. В связи с этим в процессе транскрипции необходимо ограничение доступа эндогенных ДНКаз к открытым областям ДНК. Одним из возможных механизмов, препятствующих гидролизу ДНК эндогенными ДНКазами может быть ингибирование данных ферментов в локусе транскрибируемых генов, которое осуществляется, по-видимому, белковыми факторами, участвующими в транскрипции. Данный эффект, вероятно, является элементом механизма функционального разделения, (дискриминации) процесса транскрипции, с одной стороны, и процессов репарации и репликации - с другой, в которых участвуют эндогенные ДНКазы.

/ \

¿О^р^р,—{-г>-

ч »

ч /

иг / ^;

л' ч

| Экстракция

I ям

Рис. 11. Механизм ген-специфичной активности эндогенных Ca2+/Mg2*-зaвиcимыx ДНКаз. Влияние режима иуклеолиза хроматина на свойства получаемых препаратов

ядерного матрикса.

Условные обозначения: СМД - эндогенные Са27\^2*-зависимые ДНКазы; X - фактор, участвующий в транскрипции и ингибирующий активность СМД; —— фибрилла ядерного матрикса;

- транскрипционно активный хроматин;

----- транскрипционно неактивный хроматин

выводы

1. Выявлена стадия медленного гидролиза ДНК гепатоцитов эндогенными -зависимыми ДНКазами. Фрагментация хроматина на данной стадии происходит без образования кислоторастворимых продуктов гидролиза ДНК.

2. Обнаружен двойственный характер действия эндогенных Са27Л^2*-зависимых ДНКаз на транскрипционно активный и неактивный хроматин. Для матрикс-связанного, а также легкорастворимого хроматина показано, что скорость фрагментации активного гена альбумина снижена

по сравнению с неактивным геном с-йю. В области труднорастворимого •

хроматина - активный ген альбумина более подвержен действию эндогенных Са27\^2*-зависимых ДНКаз чем неактивный ген с-Гов.

3. Глубина нуклеолиза эндогенными Са27М£2+-зависимыми ДНКазами , оказывает существенное влияние на качественный состав препаратов ядерного матрикса. С ядерным матриксом, полученным на стадии медленного гидролиза ДНК, ассоциирован транскрипционно активный ген альбумина.

4. Подавление трансляции циклогексимидом вызывает компактиза-цию хроматина гепатоцитов. С учетом вклада ЦГИ-индуцируемой ком-пактизации хроматина и возможного ингибирования активности эндогенных Са27М§2+-зависимых ДНКаз показано, что в процессе индукции гена с-Азв происходит его функциональная ассоциация с ядерным матриксом.

5. Полученные экспериментальные данные позволяют предположить, что в действии эндогенных Са27№^2+-зависимых ДНКаз на транскрипционно активный и неактивный хроматин существует определенная специфичность. Снижение активности эндогенных

Са27Мё2+ -зависимых ДНКаз в ло-кусе транскрибируемых генов может быть связано со способностью некоторых белковых факторов, участвующих в транскрипции, ингибировать функ- . ционирование внутриядерных ДНКаз. Данный эффект, вероятно, является элементом механизма функциональной дискриминации процесса транскрипции, с одной стороны, и процессов репарации и репликации — с другой.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Борисова Н.П., Костюк Г.В., Шевченко Н.А Папина Р.И., Бойков П.Я. Два типа структурно-функциональной организации интерфазного хроматина // Тезисы Школы-конференции "Горизонты физико-биологической науки", 28 мая - 2 июня 2000 г., Пущино, 2000. С. 227.

2. Борисова Н.П., Рудакова Е.В., Бойков ПЛ. Изменение структуры интерфазного хроматина, содержащего гены с-тус, р53, с-]ип в процессе их

активации // Тезисы конференции "Фундаментальная наука в наукоградах Московской области", 1-4 октября 2001 г., Черноголовка, 2001. С. 90.

3. Борисова Н.П., Костюк Г.В., Рудакова Е.В., Терентьев A.A. Пониженная чувствительность транскрибируемого хроматина к эндогенным Ca27Mg2+ -зависимым ДНКазам // Тезисы Седьмой Пущинской конференции "Биология наука XXI века", 14-18 апреля 2003 г., Пущино, 2003. С. 312.

4. Борисова Н.П., Костюк Г.В., Шевченко H.A., Бойков П.Я., Рудакова Е.В., Папина Р.И., Терентьев A.A. Функциональная ассоциация гена раннего ответа c-fos с ядерным матриксом // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2003. Т. 135. № 2. С. 194-197.

5. Борисова Н.П., Костюк Г.В., Шевченко H.A., Бойков П.Я., Рудакова Е.В., Папина Р.И., Терентьев A.A. Двойственный характер действия эндогенных ДНКаз на транскрипционно активный и неактивный хроматин // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2003. Т. 135. №3. С. 294-298.

6. Борисова Н.П., Костюк Г.В., Шевченко H.A., Бойков П.Я., Рудакова Е.В., Папина Р.И., Терентьев A.A. Эндогенные ДНКазы как инструмент получения препаратов ядерного матрикса: критические параметры нуклеолиза // Известия АН. Серия биологическая. 2003. № 5. С. 534-541.

)

Борисова Наталья Павловна

АССОЦИАЦИЯ ТРАНСКРИБИРУЕМОЙ ДНК С ЯДЕРНЫМ МАТРИКСОМ В УСЛОВИЯХ АКТИВАЦИИ ЭНДОГЕННЫХ ДНКаз IN VITRO НА ПРИМЕРЕ ГЕНОВ АЛЬБУМИНА И C-FOS

Автореферат

Сдано в набор 22.10.2003 г. Подписано в печать 23.10.2003 г. Формат 60x90 1/16. Бумага офсетная. Печать офсетная Гарнитура "Тайме". Объём 1,5 п. л. Зак. 329. Тир. 100

Оригинал-макет изготовлен в редакционно-издательском отделе ИПХФ РАН Изд. лиц. № 03894 от 30 января 2001 г.

142432, п. Черноголовка, Московская обл., Институтский пр-т, 18

Отпечатано в типографии ИПХФ РАН

'8724

i <

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Борисова, Наталья Павловна

Введение

Актуальность проблемы.

Цель и задачи работы.

Научная новизна работы.

Научно-практическая значимость работы.

Основные положения, выносимые на защиту.

Апробация работы.

Обзор литературы

Глава 1. Механизмы регуляции транскрипции.

1.1. Общие принципы регуляции транскрипции.

1.2. Функции и регуляция генов с-Аэз, альбумина и Ос.

Глава 2. Механизмы структурной реорганизации хроматина при активации или репрессии транскрипции.

2.1. Ковалентные модификации гистонов.

2.2. Хроматин-ремоделирующие комплексы.

Глава 3. Структура ядерного матрикса и его роль в регуляции транскрипции.

3.1. Структурная организация ядерного скелета.

3.2. Роль ядерного матрикса в регуляции транскрипции.

Глава 4. ДНКазы как инструмент исследования структуры хроматина.

Методы исследования.

Результаты исследования и обсуждение.

Глава 5. Кинетика нуклеолиза хроматина эндогенными

-зависимыми ДНКазами.

Глава 6. Влияние степени нуклеолиза хроматина эндогенными Са27М&2+

-зависимыми ДНКазами на обогащенность препаратов ядерного матрикса транскрибируемой ДНК.

Глава 7. Функциональная ассоциация гена с-£оз с ядерным матриксом при его активации циклогексимидом.

7.1. Изменения в структуре хроматина при подавлении белкового синтеза циклогексимидом.

7.2. Определение степени ассоциации гена с-Аэб с ядерным матриксом при индукции его экспрессии.

Глава 8. Двойственный характер действия эндогенных Са2+/1^2+-зависимых

ДНКаз на транскрипционно активный и неактивный хроматин.

Глава 9. Структурная и функциональная составляющие нуклеолиза эндогенными Са /

§ -зависимыми ДНКазами.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Ассоциация транскрибируемой ДНК с ядерным матриксом в условиях активации эндогенных ДНКаз in vitro на примере генов альбумина и C-FOS"

Актуальность проблемы.

Регуляция транскрипции — это сложный многоступенчатый каскад реакций, включающий большой набор факторов различной природы и объединяющий все уровни организации живого организма. Нарушения функций любого из элементов каскада регуляции транскрипции, которые могут быть вызваны факторами окружающей среды или наследственными мутациями, лежат в основе большинства заболеваний. Наряду с практической актуальностью, изучение молекулярных механизмов регуляции транскрипции имеет важное значение для понимания процессов реализации генетической информации, т.е. функционирования генома.

Функция пространственной координации внутриядерных процессов осуществляется, по-видимому, скелетной структурой клеточного ядра -ядерным матриксом. В настоящее время накоплен большой экспериментальный материал, свидетельствующий о том, что ядерный матрикс играет важную роль в регуляции транскрипции. Показано, что препараты ядерного матрикса обладают ДНК-связывающими активностями к различным регуляторным элементам. Среди белков ядерного матрикса обнаружено большое количество ферментативных систем, участвующих во многих внутриядерных процессах, в том числе и транскрипции [75]. Особую актуальность данной теме придают данные, согласно которым мутации в генах, кодирующих белки ядерного матрикса приводят к ряду наследственных заболеваний [236,70]. Определенные белки ядерного матрикса являются диагностическим маркером онкологических заболеваний [52]. Вещества, подавляющие активность некоторых белковых факторов ядерного матрикса, рассматриваются как перспективные антираковые соединения [119].

В связи с этим, изучение структуры и функции ядерного матрикса имеет важное значение для понимания процессов регуляции транскрипции. Наиболее распространенным подходом к получению препаратов ядерного матрикса является гидролиз ДНК экзогенными ДНКазами с последующей экстракцией матрикс-несвязанного хроматина. При этом как этап нуклеолиза, так и этап экстракции хроматина не стандартизирован и получаемые препараты ядерного матрикса отличаются по своим свойствам. Таким образом, получение препаратов ядерного матрикса сопряжено с многочисленными трудностями, которые связаны не только с его сложной организацией, но также с отсутствием общепринятых методов для его изучения.

Одним из перспективных подходов для получения препаратов ядерного матрикса, обогащенных факторами, участвующими в регуляции транскрипции может быть использование внутриядерных ДНКаз. Эндогенные ДНКазы имеют принципиальное отличие от экзогенных, которое заключается в том, что пространственное распределение внутриядерных ДНКаз носит неслучайный характер и зависит от их функций [25,58]. Специфичное распределение и локальные различия в активности эндогенных ДНКаз могут служить дополнительным селективным фактором при разделении транскрипционно активного и неактивного хроматина, а также при разделении различных составляющих ядерного хроматина по другим функциональным признакам. В качестве модельных генов выбраны гены, которые в покоящихся гепатоцитах имеют разную транскрипционную активность: протоонкоген с-Гоб, ген альбумина и ген, кодирующий константную область легкой цепи каппа иммуноглобулина Ск. Цель и задачи работы.

Целью данного исследования является изучение ассоциации транскрипционно активного хроматина с ядерным матриксом, полученным при использовании эндогенных Са2+/М§2+-зависимых ДНКаз.

В связи с этим основными задачами данного исследования являются:

1) изучение кинетики гидролиза хроматина эндогенными Са2+/М§2+-зависимыми ДНКазами.

2) изучение характера действия эндогенных Са2+/М§2+-зависимых ДНКаз на ДНК в локусе активного гена альбумина и неактивного гена с-Аоб.

3) изучение влияния глубины нуклеолиза хроматина эндогенными Са /М£ -зависимыми ДНКазами на качественный состав препаратов ядерного матрикса.

4) изучение функциональной ассоциации с ядерным матриксом гена с-Аоб при изменении экспрессии данного гена.

Научная новизна работы.

В ходе данного исследования в качестве инструмента для изучения ассоциации транскрибируемой ДНК с ядерным матриксом используются 2+ 2+ эндогенные Са /М§ -зависимые ДНКазы. В действии внутриядерных ДНКаз обнаружена стадия медленного гидролиза ДНК. На данной стадии фрагментация хроматина происходит без образования кислоторастворимых продуктов нуклеолиза.

Показано, что на стадии медленного гидролиза ДНК в хроматине, связанном со структурами ядерного матрикса, эндогенные Са2+/М§2+-зависимые ДНКазы фрагментируют транскрипционно активный ген альбумина в меньшей степени, по сравнению с неактивным геном с-Аэб.

Поскольку радиоавтограф каждого гена получен с ДНК, обладающей определенным профилем молекулярно-весового распределения, то вычитание из денситограммы радиоавтографа кривой профиля ДНК как фонового позволяет выявить особенности, характерные для исследуемых генов.

С использованием разностных электрофоретических профилей ДНК обнаружен двойственный характер действия эндогенных зависимых ДНКаз на хроматин, не связанный с ядерным матриксом. В области легкорастворимого, как и для матрикссвязанного хроматина, внутриядерные ДНКазы фрагментируют транскрипционно активный ген альбумина в меньшей степени, по сравнению с неактивным геном с-йэб. Для труднорастворимого хроматина наблюдается обратная зависимость: г л | активный ген альбумина более подвержен действию эндогенных Са /М§ -зависимых ДНКаз, чем неактивный ген с-йэб.

На основе различий в активности внутриядерных ДНКаз в локусах активных и неактивных генов предложен новый подход для получения препаратов ядерного матрикса, селективно обогащенных транскрибируемой ДНК. В ходе данного метода обнаружено, что при использовании эндогенных Са /М§ -зависимых ДНКаз в получении препаратов ядерного матрикса важное значение имеет глубина нуклеолиза хроматина внутриядерными ДНКазами. Получение препаратов ядерного матрикса, обогащенных транскрипционно активным хроматином возможно в условиях медленного гидролиза ДНК внутриядерными ДНКазами. При этом степень фрагментации ДНК на данной стадии характеризуется разрушением петлевых доменов хроматина и относительно равномерной плотностью распределения ДНК на электрофоретическом профиле фрагментированной ДНК ядерного матрикса.

Научно-практическая значимость работы.

Полученные в ходе данной работы результаты по ассоциации транскрибируемой ДНК с ядерным матриксом и пониженной активности эндогенных ДНКаз в локусе активных генов, представляют большой интерес для исследования в области структуры и функции хроматина, а также для изучения процессов регуляции транскрипции. Предложенный метод получения препаратов ядерного матрикса, селективно обогащенного транскрипционно активным хроматином, с применением соответствующих генных маркеров, может быть использован для изучения молекулярных механизмов возникновения генетических и онкологических заболеваний.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Обнаружено явление селективного снижения активности эндогенных

-зависимых ДНКаз в области транскрипционно активного хроматина. . л I

2. На основе локальных различий в активности эндогенных Са /М£ -зависимых ДНКаз в локусе активных и неактивных генов, разработан подход к получению препаратов ядерного матрикса, обогащенных транскрибируемой ДНК на примере генов альбумина и с-Аэб.

Апробация работы.

Результаты исследований, представленные в работе, были доложены на следующих научных мероприятиях: школа молодых ученых "Молекулярная биология и биомедицина", Черноголовка, апрель 1999 г; школа-конференция "Горизонты физико-биологической науки", Пущино, май 2000 г; конференция "Фундаментальная наука в наукоградах Московской области", Черноголовка, октябрь 2001 г; школа-конференция молодых ученых "Биология наука XXI века", Пущино, апрель 2003 г.

Обзор литературы. Глава 1. Механизмы регуляции транскрипции.

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Борисова, Наталья Павловна

Выводы

1. Выявлена стадия медленного гидролиза ДНК гепатоцитов эндогенными зависимыми ДНКазами. Фрагментация хроматина на данной стадии происходит без образования кислоторастворимых продуктов гидролиза ДНК.

2. Обнаружен двойственный характер действия эндогенных зависимых ДНКаз на транскрипционно активный и неактивный хроматин. Для матрикс-связанного, а также легкорастворимого хроматина показано, что скорость фрагментации активного гена альбумина снижена по сравнению с неактивным геном с-Гоэ. В области труднорастворимого хроматина - активный ген альбумина более подвержен действию эндогенных Са /Мё -зависимых ДНКаз чем неактивный ген с-Гоб.

Л I Л |

3. Глубина нуклеолиза эндогенными

Са/Т^

-зависимыми ДНКазами оказывает существенное влияние на качественный состав препаратов ядерного матрикса. С ядерным матриксом, полученным на стадии медленного гидролиза ДНК, ассоциирован транскрипционно активный ген альбумина.

4. Подавление трансляции циклогексимидом вызывает компактизацию хроматина гепатоцитов. С учетом вклада ЦГИ-индуцируемой компактизации хроматина и возможного ингибирования активности

Л I эндогенных Са /М§ -зависимых ДНКаз показано, что в процессе индукции гена с-Гоб происходит его функциональная ассоциация с ядерным матриксом.

5. Полученные экспериментальные данные позволяют предположить, что в действии эндогенных Са /М§ -зависимых ДНКаз на транскрипционно активный и неактивный хроматин существует определенная

2+ специфичность. Снижение активности эндогенных Са -зависимых

ДНКаз в локусе транскрибируемых генов может быть связано со способностью некоторых белковых факторов, участвующих в транскрипции, ингибировать функционирование внутриядерных ДНКаз. Данный эффект, вероятно, является элементом механизма функциональной дискриминации процесса транскрипции, с одной стороны, и процессов репарации и репликации - с другой.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

2. Борисова Н.П., Рудакова Е.В., Бойков П.Я. Изменение структуры интерфазного хроматина, содержащего гены c-myc, р53, c-jun в процессе их активации // Тезисы конференции "Фундаментальная наука в наукоградах Московской области", 1-4 октября 2001 г., Черноголовка, 2001.- с.90.

3. Борисова Н.П., Костюк Г.В., Рудакова Е.В., Терентьев A.A. Пониженная чувствительность транскрибируемого хроматина к эндогенным Ca /Mg -зависимым ДНКазам // Тезисы Седьмой Пущинской конференции "Биология наука XXI века", 14-18 апреля 2003 г., Пущино, 2003.- с.312.

6. Борисова Н.П., Костюк Г.В., Шевченко H.A., Бойков П.Я., Рудакова Е.В., Папина Р.И., Терентьев A.A. Эндогенные ДНКазы как инструмент получения препаратов ядерного матрикса: критические параметры нуклеолиза //Известия АН. Серия биологическая. 2003. №5. с.534-541.

113

Заключение.

В ходе настоящего исследования в качестве основного инструмента для изучения ассоциации транскрибируемой ДНК с ядерным матриксом использовались эндогенные Ca2+/Mg2+ -зависимые ДНКазы. Данный подход был выбран в связи с тем, что пространственное распределение внутриядерных ДНКаз носит неслучайный характер и зависит от их функций. Следовательно, эндогенные ДНКазы могут служить дополнительным селективным фактором при разделении транскрипционно активного и неактивного хроматина, а также при разделении различных составляющих ядерного хроматина по другим функциональным признакам.

При исследовании процесса фрагментации хроматина эндогенными СМД в условиях активации in vitro обнаружена медленная стадия гидролиза ДНК. Дальнейшие исследования показали, что именно на этой стадии проявляется специфичность в действии СМД на транскрипционно активный и неактивный хроматин. Обнаружено, что в области транскрибируемого хроматина эндогенные СМД проявляют пониженную активность, что особенно отчетливо продемонстрировано для матрикс-связанного хроматина. В то же время, как показано для труднорастворимого хроматина, в определенном белковом окружении СМД обладают повышенной активностью в локусе транскрибируемых генов. Таким образом, процесс гидролиза хроматина эндогенными СМД носит сложный характер и данные ферменты могут быть чувствительны как к структурному, так и функциональному состоянию хроматина.

Обнаруженное явление снижения активности эндогенных СМД в области транскрипционно активного хроматина, вероятно, связано со способностью белков, участвующих в транскрипции, ингибировать СМД в локусе активных генов. Данное явление может служить одним из факторов функционального разделения транскрипции и других внутриядерных процессов.

Обнаруженные свойства внутриядерных ДНКаз позволили предложить новый подход для получения препаратов ядерного матрикса, селективно обогащенных факторами, участвующими в транскрипции. На примере индивидуальных генов (с-йэз и альбумина) показано, что с ядерным матриксом, полученным на стадии медленного гидролиза хроматина эндогенными СМД, ассоциируют активные гены как в условиях базальной транскрипции (ген альбумина в покоящихся гепатоцитах), так и при индуцированной транскрипции (ген с-Аэб при ингибировании белкового синтеза).

110

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Борисова, Наталья Павловна, Москва

1. Алесенко A.B., Красильников В.А., Бойков П.Я. Участие сфингомиелина вобразовании связи ДНК с ядерным матриксом в процессе репликации // Доклады АН СССР. 1983. Т.273. № 1. С. 231-234.

2. Алесенко A.B., Красильников В.А., Бойков П.Я. Фосфолипиды как структурные элементы ядерного матрикса // Доклады АН СССР. 1982. Т.263.№3. С. 730-733.

3. Бойков П.Я., Сидоренко Л.И., Тодоров И.Н. Биогенез хроматина в клеткахвысших животных. Активация синтеза ядерных белков и ДНКгепатоцитов после импульсного торможения трансляции циклогексимидом // Биохимия. 1979. Т.44. Вып.6. С. 963-974.

4. Бондарь Н.И., Безруков И.Ф., Сиволоб A.B., Храпунов С.Н. Возможнаяроль эндогенных нуклеаз в структурной организации хроматина // Научные доклады высшей школы. Серия биологические науки. 1992.1. Вып. 2. С. 58-64.

5. Вихонская Ф.Л., Поспелова Т.В., Волков И.В., Кукушкин А.Н., Светликова

6. С.Б., Поспелов В.А. Продукт гена р53 вовлечен в регуляцию активности протоонкогена c-fos // Доклады АН СССР. 1991. Т.321. № 4. С. 846-849.

7. Георгиев Г.П. Гены высших организмов и их экспрессия. М.: Наука, 1989.253 С.

8. Гоникберг Э.М., Андреев В.М. Электрофорез сшитых псораленом и ренатурированных фрагментов ДНК: кинетический анализ фотосшивания ДНК // Молекулярная биология. 1986. Т.20. Вып.4. С. 1039-1047.

9. Збарский И.Б. Организация клеточного ядра.- М.: Медицина, 1988. 368 С. ^ 9. Збарский И.Б., Кузьмина С.Н. Скелетные структуры клеточного ядра. М.:

10. Наука, 1991.-246 С. 10. Краевский В.А., Панин В.М., Разин C.B. Ацетилирование гистонов in vitro вызывает декомпактизацию хроматина // Биофизика. 1994. Т.39. Вып.4. С. 613-618.

11. Лобаненков В.В., Миронов Н.М., Куприянова Е.И., Шапот B.C. Агрегация фрагментированного хроматина, связанная с появлением продуктов его нуклеазной обработки // Биохимия. 1985. Т. 50. Вып. 7. С. 1132-1140.

12. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. М.: Мир, 1984.- 480 С.

13. Поспелова Т.В., Волков И.В., Кукушкин А.Н., Светликова С.Б. Сывороточный элемент (SRE) вероятная мишень для негативного контроля регуляции активности промотора гена c-fos // Доклады АН СССР. 1990. Т.315. № 4. С. 1003-1006.

14. Соколова И.А., Ходарев H.H., Александрова С.С., Вотрин И.И.1. I ^ I

15. Выделение и исследование Ca/Mg -зависимои эндонуклеазы из клеточных ядер лимфоцитов селезенки человека // Биохимия. 1988. Т.53. С. 1163-1173.

16. Соловьян В.Т., Андреев И.О., Кунах В.А. Фракционирование ДНК эукариот в пульсирующем электрическом поле. И. Дискретные фрагменты ДНК и уровни структурной организации хроматина // Молекулярная биология. 1991. Т.25. Вып.6. С. 1483-1491.

17. Соловьян В.Т., Кунах В.А. Фракционирование ДНК эукариот в пульсирующем электрическом поле. I. Обнаружение и свойства дискретных ДНК-фрагментов // Молекулярная биология. 1991. Т.25. Вып.4. С. 1071-1079.

18. Студинский В.М., Храпко K.P. Энхансеры, петли ДНК и стабильные комплексы: механизм активации транскрипции // Молекулярная биология. 1990. Т.24. Вып.4. С. 909-919.

19. Съяксте Н.И., Съяксте Т.Г. Ферментативные активности ядерного матрикса// Биохимия. 1994. Т.59. Вып.11. С. 1663-1673.

20. Съяксте Н.И., Съяксте Т.Г. Факторы транскрипции и ядерный матрикс // Молекулярная Биология. 2001. Т. 35. № 5. С. 739-749.

21. Тодоров И.Н., Бойков П.Я., Сидоренко Л.И., Чирков Г.П., Терских В.В. Стимуляция репликации ДНК в клетках печени крыс как результат ингибирования синтеза белков // Доклады АН СССР. 1978. Т.239. № 5. С. 1255-1258.

22. Тодоров И.Н., Фонарев А.Б., Шевченко H.A., Бойков П.Я., Шугалий A.B. Структурные изменения хроматина в условиях активации транскрипции,

23. V* сопряженной с ингибированием трансляции циклогексимидом //

24. Биохимия. 1984. Т.49. Вып.5. С. 827-835.

25. Транскрипция и трансляция. Методы. / Под ред. Б. Хэймса, С. Хиггинса. -М.: Мир, 1987. 400 С.

26. Филиппова Г.Н., Спитковский Д.Д., Бойков П.Я., Алесенко A.B. * Экспрессия онкогенов в печени крыс в условиях разобщения матричныхбиосинтезов сублетальными дозами ЦГИ // Молекулярная биология. 1989. Т.23. Вып.З. С. 843-850.

27. Ходарев H.H., Вотрин И.И. Обнаружение Са2+ЛУ^2+-зависимой эндонуклеазы в ядрах лимфоцитов периферической крови человека иингибирование Ca2+,Mg2+-3aBHCHMoro эндонуклеолиза при хроническомлимфолейкозе // Доклады АН СССР. 1983. Т.268. № 4. С. 1000-1003.

28. Ходарев H.H., Вотрин И.И., Баснакьян А.Г., Дебов С.С. Обнаружение эндонуклеазной активности и некоторые особенности аутолизахроматина в клеточных ядрах мозга // Биохимия. 1979. Т.44. Вып.4. С. 622-628.

29. Ходарев Н.Н.,Вотрин И.И., Дебов С.С. Об ингибировании аутолиза хроматина в процессе выделения и инкубации клеточных ядер печени крыс // Вопросы медицинской химии. 1981. № 4. С. 538-544.

30. Шевченко Н.А., Бойков П.Я., Иванова Г.И., Тодоров И.Н. Реорганизация суперструктур хроматина в условиях резких колебаний скорости синтеза белков // Биохимия. 1990. Т.55. Вып.9. С. 1356-1361.

31. Шевченко Н.А., Спитковский Д.Д., Логинов А.С., Макарьева Е.Д., Бойков П.Я. Структурные изменения хроматина в процессе активации транскрипции протоонкогенов циклогексимидом: доза эффект // Биохимия. 1992. Т.57. Вып.9. С. 1491-1498.

32. Aebi U., Cohn J., Buhle L., Gerace L. The nuclear lamina is a meshwork of intermediate type filaments //Nature. 1986. V.323. P. 560-564

33. Amati B., Frank S.R., Donjerkovic D., Taubert S. Function of the c Myc oncoprotein in chromatin remodeling and transcription // Biochimica et biophysica Acta. 2001. V.1471. № 3. P. 135-145.

34. Angel P., Karin M. The role of Jun, Fos and AP-1 complex in cell proliferation and transformation // Biochimica et Biophysica Acta. 1991. № 1072. P. 129157.

35. Annunziano A.T., Seale R.L. Histone deacetylation is required for the maturation of newly replicated chromatin // Journal of Biological Chemistry. 1983. V.258. P. 12675-12684.

36. Aoyagi S., Hayes J.J. hSWI/SNF-catalyzed sliding does not occur solely via a twist-diffusion mechanism // Mollecular and Cellular Biology. 2002. V.22. №. 21. P. 7484-7490.

37. Armstrong J.A., Emerson B.M. Transcription of chromatin: these are complextimes // Current Opinion in Genetics and Development. 1998. V.8. P. 165172.

38. Asland R., Srewart A.F., Gibson T. The SANT domain: a putative DNA-binding domain in the SWI-SNF and ADA complexes, the transcriptional compressor N-CoR and TFIIIB // Trends in Biochemical sciences. 1996. V.21. P. 87-88.

39. Baarens W.M., Hoogerbrugge J.W., Roest H.P., Ooms M., Vreeburg J., Hoeijmakers J.H., Grootegoed J.A. Histone ubiquitination and chromatin remodeling in mouse spermatogenesis // Developmental Biology. 1999. V.207. № 2. P. 322-333.

40. Badenhorst P., Voas M., Rebay I., Wu C. Biological functions of the ISWIchromatin remodeling complex NURF // Genes and Development. 2002. V.16. № 24. P. 3186-3198.

41. Bannister A.J., Miiska E.A. Regulation of gene expression by transcriptionfactor acetylation // Cellular and Molecular Life Sciences. 2000. V.57. P. 1184- 1192.

42. Bannister A. J., Schneider R., Kouzarides T. Histone methylation: dynamic orstatic? // Cell. 2002. V.109. № 7. P. 801-806.

43. Bertos N.R., Wang A.H., Yang X-J. Class II histone deacetylases: structure,function and regulation // Biochemistry and Cell Biology. 2001. V.79. № 3. P. 243-252.

44. Blasquez V.C., Speriy A.O., Cockerill P.N., Garrard W.T. Protein:DNA interactions at chromosomal loop attachment sites // Genome. 1989. V.31. P. 503-509.

45. Bohn L., Crane-Robinson C. Proteases and structural probes for chromatic: thedomain structure of histones //Bioscience Reports. 1984. V.4. P. 365-386.

46. Bonaldi T., Langst G., Strohner R., Becker P.B., Bianchi M.E. The DNA chaperone HMGB1 facilitates ACF/CHRAC-dependent nucleosome sliding // EMBO Journal. 2002. V.21. № 24. P. 6865-6873.

47. Bosman F.T. The nuclear matrix in pathology // Virchows Archiv. 1999. V.435.P. 391-399.

48. Boulikas T. Chromatin domains and prediction of MAR sequences // International Revews on Cytology. 1995. V.162A. P. 279-388.

49. Busshmeyer S. M., Atchison M.L. Identification of YY1 sequences necessaryfor association with the nucllear matrix and for transcriptional repression functions //Journal ofCelluarBiochemistry. 1998. V.68. P. 484-499.

50. Cain K., Inayat-Hussain S.H., Wolfe J.T., Cohen G.M. DNA fragmentation into 200-250 and/or 30-50 kilobase pair fragments in rat liver nuclei is stimulated by Mg2+ alone and Ca2+ /Mg2+ but not Ca2+ alone // FEBS Letters. 1994. V.349. P. 385-391.

51. Cairns B.R. Chromatin remodeling machines: similar motors, ulterior motives

52. Trends in Biochemical sciences. 1998. V. 23. P. 20-25.

53. Caserta M., Camilloni G., Venditti S., Venditti P., Di Mauro E. Conformationalinformation in DNA: its role in the interaction with DNA topoisomerase I and nucleosomes // Journal of Cellular Biochemistry. 1994. V.55. P. 93-97.

54. Cartwright P., Helin K. Nucleocytoplasmic shuttling of transcription factors // $ Cellular and Molecular Life Sciences. 2000. V.57. P. 1193-1206.

55. Cereghini S., Blumenfeld M., Yaniv M. A liver-specific factor essential foralbumin transcription differs between differentiated and dedifferentiated rat hepatoma cells // Genes and Development. 1988. V.2. P. 957-974.

56. Chen Z., Han M. C. elegans Rb, NuRD, and Ras regulate line-39-mediated cellfusion during vulval fate specification // Current Biology. 2001. V.l 1. № 23. P. 1874-1879.

57. Chen H., Lin R.J., Xie W., Wilpitz D., Evans R.M. Regulation of hormoneinduced histone hyperacetylation and gene activation via acetylation of acetylase // Cell. 1999. V.98. P. 675-686.

58. Chen T.A., Sterner R., Cozzolino A., Allfrey V.G. Revercible and irreverciblechanges in nucleosome structure along the c-fos and c-myc oncogenes following inhibition of transcription // Journal of Molecular Biology. 1990. V.212. P. 481-493

59. Cheung P., Allis D., Sassone-Corsi P. Signaling to chromatin through histonemodifications // Cell. 2000. V.103. P. 263-271.

60. Chiarugi A. Poly(ADP-ribose)polymerase: killer or conspirator? The "suicidehypothesis" revisited // Trends in Pharmacological Sciences. 2002. V.23. № 3.P. 122-129.if;

61. Chinenov Y. A second catalytic domain in the Eip3 histone acetyltransferases:a candidate for histone demethylase activity? // Trends in Biochemical sciences. 2002. V.27. № 3. P. 115-117.

62. Ciejek E.M., Tsai M.J., O'Malley B.M. Actively transcribed genes are associated with the nuclear matrix // Nature. 1983. V.306. № 5943. P. 6070 609.

63. Cockerill P.N., Garard W.T. Chromosomal loop anchorage of the kappa immunoglobulin gene occurs next to the enhancer in a region containing topoisomerase II sites // Cell. 1986. V.44. P. 273-282.

64. Cockerill P.N., Yuen M.H., Garrard W.T. The enhancer of the immunoglobulin * heavy chain locus is flanked by presumptive chromosomal loop anchorageelements // Journal of Biological Chemistry. 1987. V.262. P. 5394-5397.

65. Cohen M., Lee K.K., Wilson K.L., Gruenbaum Y. Transcriptional repression,apoptosis, human disease and the functional evolution of the nuclear lamin // Trends in Biochemical sciences. 2001. V.26. № 1. P. 41-47.

66. Counis M.F., Torriglia A. Dnases and apoptosis // Biochemistry and Cell Biology. 2000. V.78. № 4. P. 405-414.

67. Dalton S., Treisman R. Characterization of SAP-1, a protein recruited by serumresponse factor to the c-fos serum response element // Cell. 1992. V.68. P. 597-612.

68. Dalton S., Younghusband H.B., Wells J.R. Chicken histone genes retain nuclear matrix association throughout the cell cycle // Nucleic Acids Research. 1986. V.14. P. 6507-6523.

69. Davie J.K., Dent S.Y. Transcriptional control: an activating role for argininemethylation // Current Biology. 2002. V.12. № 2. P. 59-61.

70. Deepesh N. D. Protein constitution of the chromosome axis // Chromosoma.2002. V.lll.P. 69-79.

71. Deppert W. Binding of MAR-DNA elements by mutant p53: possible implications for its oncogenic function // Journal of Cellular Biochemistry. 1996. V.62. P. 172-180.

72. Dickinson L.A., Kohwi-Shigematsu T. Nucleolin is a matrix attachment region

73. DNA-binding protein that specifically recognizes a region with high base-unpairing potential // Mollecular and Cellular Biology. 1995. V.15. № 1. P. 456-465.

74. Donev R. M. The type of DNA attachment sites recovered from nuclear matrixdepends on isolation procedure used // Molecular and Cellular Biochemistry.2000. V.214№1-2.P. 103-110.

75. Dorshkind K. Transcription control points during lymphopoesis // Cell. 1994.5. V.79.P. 751-753.

76. Downes M., Ordent lich P., Kao H.Y., Alvarez J. G., Evans R.M. Identificationof a nuclear domain with deacetylase activity // Proceedings of the National Academy of Sciences of the U.S.A. 2000. V.97. P. 10330-10335.

77. Ely S., D'Arcy A., Jost E. Interaction of antibodies against nuclear envelopeassociated proteins from rat liver nuclei with rodent and human cells // Experimental Cell Research. 1978. V.116. P. 325-331.

78. Enari M., Sakahira H., Yokoyama H., Okawa K., Iwamatsu A., Nagata S. Acaspase-activated Dnase that degrades DNA during apoptosis, and its inhibitor ICAD//Nature. 1998. V.391. P. 43-50.

79. Evans T., Felsenfeld G., Reitman M. Control of globin gene transcription //

80. Annual Revews on Cell Biology. 1990. V.6. P. 95-124.

81. Feddersen R.M., Martin D.J., Van Ness B.G. The frequency of multiple recobination events occuring at the Ig kappa L chain locus // Journal of Immunology. 1990. V.144. № 3 P. 1088-1093.

82. Feng J.L., Villeponteau B. Serum stimulation of the c-fos enhancer inducesreversible changes in c-fos chromatin structure // Molecular and Cellular Biology. 1990. V.10. P. 1126-1133.

83. Feng Q., Zhang Y. The NuRD complex: linking histone modification to nucleosome remodeling // Current Topics in Microbiology and Immunology. 2003. V.274. P. 269-290.

84. Feng Q., Wang H., Hg H.H., Erdjument-Bromage H., Tempst P., Struhl K., Zhang Y. Methylation of H3-lysine 79 is mediated by a new family of HMTases without a SET-domain // Current Biology. 2002. V.12. № 12. P. 1052-1080.

85. Ferreri K., Gill G., Montminy M. The cAMP-regulated transcription factor CREB interacts wth a component of TFIID complex // Proceedings of the National Academy of Sciences of the U.S.A. 1994. V.91. № 4. P. 1210-1213.

86. Fischle W., Kiermer V., Dequiedt F., Verdin E. The emerging role of class IIhistone deacetylase // Biochemistry and Cell Biology. 2001. V.79. № 3. P. 337-348.

87. Fry C.J., Peterson C.L. Chromatin remodeling enzymes: who's on first? // Current Biology. 2001. V.l 1. P. 185-197.

88. Furukawa K., Pante N., Aebi U., Gerace L. Cloning of a cDNA for laminassociated polypeptide2 (LAP2) and identification of regions that specify targeting to the nuclear envelope // EMBO Journal. 1995. V.14. P. 1626-1636.

89. Fyodorov D.V., Kadonaga J.T. Dynamics of ATP-dependent chromatin assembly by ACF //Nature. 2002. V.418. P. 897-900.

90. Gadal O. Nehrbass U. Nuclear structure and intranuclear retention of premature

91. RNAs // Journal of Structural Biology. 2002. V.l 40. P. 1140-146.

92. Getzenberg R.H. Nuclear matrix and the regulation of gene expression: tissue specificity//Journal of Cellular Biochemistry. 1994. V.55. P. 22-31.

93. Getzenberg R.H., Pienta K.J., Ward W.S., Coffey D.S. Nuclear structure andthe three-dimentional organization of DNA // Journal of Cellular Biochemistry. 1991. V.47. P. 289-299.

94. Goldman P.S., Tran V.K., Goldman R.H. The multifunctional role of the coactivator CBP in transcriptional regulation // Recent Progress in Hormone Research. 1997. V.52. P. 103-119.

95. Green G.R. Phosphorylation of histone variant regions in chromatin: unlockingthe linker? // Biochemistry and Cell Biology. 2001. V.79. № 3. P. 275-287.

96. Grunstein M. Histone function in transcription // Annual Revews on Cell Biology. 1991. V.6. P. 643-678.

97. Ham J., Steger G., Yaniv M. How do eukaryotic activator proteins stimulate the rate of transcription by RNA polymerase II? // FEBS Letters. 1992. V.307. № 1.- P. 81-86.

98. Hampsey M. Molecular genetics of the RNA polymerase II general transcriptional machinery // Microbiology and Molecular Biology Reviews.1998. V.62.№ 2. P. 465-503.

99. Hancock R. A new look at the nuclear matrix // Chromosoma. 2000. V.109. P. 219-225.

100. Hanks S.K., Riggs M.G. Selective insolubility of active hsp70 gene chromatin // Biochimica et Biophysica Acta. 1986. V.867. № 3. P. 124-134.

101. Hara R., Sancar A. The SWI/SNF chromatin-remodeling factor stimulates repair by human excision in the mononucleosome core particle // MoIIecular and Cellular Biology. 2002. V.22. № 19. P. 6779-6787.

102. Hartig E., Loncarevic I.F., Buscher M., Herrlich P., Rahmsdorf H.J. A new cAMP response element in the transcribed region of the human c-fos gene //

103. Nucleic Acids Research. 1991. V. 19. P. 4153-4159.

104. Hassan A.H., Neely K.E., Vignali M., Reese J.C., Workman J.L. Promoter targeting of chromatin- modifying complexes // Frontiers in Bioscience. 2001. V.6.P. 1054-1064.

105. Hebbes T.R., Thorne A.W., Crane-Robinson C. A direct link between core histone acetylation and transcriptionaly active chromatin // EMBO Journal.-1988. №7. P. 1395-1402

106. Hediger F., Dubrana K., Gasser S.M. Myosin-like proteins 1 and 2 are not required for silencing or telomere anchoring, but act the Tel 1 pathway of telomere length control // Journal of Structural Biology. 2002. V.140. № 1. P. 79-91.

107. Holloway A.F., Rao S., Chen X., Shannon M.F. Changes in chromatin accessibility across the GM-CSF promoter upon T cell activation are dependent on nuclear factor kappa B proteins // The Journal of Experimental Medicine. 2003. V.197. № 4. P. 413-423.

108. Holmer L., Worman H.J. Inner nuclear membrane proteins: functions and targeting // Cellular and Molecular Life Sciences. 2001. V. 58. P. 1741-1747.

109. Honjo T. Immunoglobulins genes // Annual Review of Immunology. 1983. V.l.P. 499-528.

110. Horlein A.J. et al., Ligand independent repression by the thyroid hormone receptor mediated by a nuclear receptor corepressor // Nature. 1995. V.377. P. 397-404.

111. Imhof A., Yang X-Y., Ogiyzko V.V., Nakatani Y., Wolffe A.P., Ge H.

112. Acetylation of general transcription factors by histone acetyltransferases // Current Biology. 1997. V.7. № 9. P. 689-692.

113. Intres R., Donady J.J. A constitutively transcribed actin gene is associated with the nuclear matrix in a Drosophila cell line // In Vitro Cellular and Developmental Biology. 1985. V.21. № 11. P. 641-648.

114. Izumi M., Vaughan O.A., Hutchison C.J., Gilbert D.M. Head and/or CaX domain deletions of lamin proteins disrupt preformed lamin A and C but not lamin B structure in mammalian cells // Molecular Biology of the Cell. 2000. V.ll.P. 4323-4337.

115. Jacobson S., Pillus L. Modifying chromatin and concepts of cancer // Current m Opinion in Genetics and Development. 1999. V.9. P. 175-184.

116. Janknecht R., Cahill M.A., Nordheim A. Signal integration at the c-fos promoter // Carcinogenesis. 1995. V.16. № 3. P. 443-450.

117. Jenuwein T. Re-SET-ting heterochromatin by histone methylation // Trends in Cell Biology. 2001. V.l 1. № 6. P. 266-273.

118. Jiang M., Axe T., Holgate R., Rubbi C.P., Okorokov A.L., Mee T., Milner J. p53 binds the nuclear matrix in normal cells: binding involves the proline-rich domain of p53 and increases following genotoxic stress // Oncogene. 2001. V.20. P. 5449-5458.

119. Jost J.P., Seldran M. Association of transcriptionally active vitellogenin II gene with the nuclear matrix of chicken liver // EMBO Journal. 1984. V.3. № 9. P. 2005-2008.

120. Kadan S., Emerson B.M. Transcriptional specificity of human SWI/SNF BRG1 and BRM chromatin remodeling complexes // Molecular Cell. 2003. V.ll. № 2. P. 377-389.

121. Kadosh D., Struhl K. Targeted recruitment of the Sin3-Rpd3 histone deacetylase complex generates a highly localized domain of repressed chromatin in vivo // Molecular and Cellular Biology. 1998. V.18. № 9. P. 5121-5127.

122. Kaufmann S.H., Shaper J.H. Association of topoisomerase II with the hepatoma cell nuclear matrix: the role of intermolecular disulfide bond formation // Experimental Cell Research. 1991. V.192. P. 511-523.

123. Kerppola T.K., Curran T. Fos-Jun heterodimers and Jun homodimers bend DNA in opposite orientation: implication for transcription factor cooperativity //Cell. 1991. V.66. P. 317-326.

124. Kirov N., Tsanev R. Activated murine alpha-globin gene is not preferentially associated with the nuclear matrix // The International Journal of Biochemistry. 1986. V.18. № 2. P. 155-159.

125. Kirov N., Djondjurov L., Tsanev R. Nuclear matrix and transcriptional activity of the mouse alpha-globin gene // Journal of Molecular Biology.1984. V.180. № 3. P. 601-614.

126. Klochendler-Yeivin A., Muchardt C., Yaniv M. SWI/SNF chromatin remodeling and canser // Current Opinion in Genetics and Development. 2002. V.12.№ l.p. 73-79.

127. Kohwi-Shigematsu T., Kohwi Y. Torsional stress stabilizes extendent base unpairing in suppressor sites flanking immunoglobulin heavy chain enhancer // Biochemistry. 1990. V.29. P. 9551-9560.

128. Komeili A., O'Shea E.K. Nuclear transport and transcription // Current Opinion in Cell Biology. 2000. V.12. P. 355-360.

129. Kouzarides T. Histone methylation in transcriptional control // Current Opinion in Genetics and Development. 2002. V.12. № 2. P. 198-209.

130. Laherty C.D., Yang W-M., Sun J-M., Davie J.R., Seto E.S., Eisenman R.N. Histone deacetylase associated with the mSin3 corepressor mediate Mad transcriptional repression // Cell. 1997. V. 89. P. 349-356.

131. Langst G., Becker P.B. Nucleosome mobilization and positioning by ISWI-containing chromatin-remodeling factors // Journal of Cell Science 2001. V.114. P. 2561-2568.

132. Lee D., Kim J.W., Seo T., Hwang S.G., Choi E.J., Choe J. SWI/SNF complex interacts with tumor suppressor p53 and is necessary for the activation of p53-mediated transcription // The Journal of Biological Chemistry. 2002. V.277. №25. P. 22330-22337.

133. Lee Y.M., Lee S., Lee E., Shin H., Hahn H., Choi W., Kim W. Human kinesin super family member 4 is dominantly locolized in the nuclear matrix and the associated with chromosome during mitosis // Biochemistry Juornal. 2001. V.360.P. 549-556.

134. Li J., Gorospe M., Barnes J., Liu Y. Tumor promoter arsenite stimulates histone H3 phosphoacetylation of proto-oncogenes c-fos and c-jun chromatin in human Diploid fibroblasts // The Journal of Biological Chemistry. 2003.01

135. V.278.№ 15. P. 13183-13191.

136. Li J., Wang J., Nawaz Z., Liu J.M., Qin J., Wong J. Both corepressor proteins SMRT and N-CoR exist in large protein complexes containing HDAC3 II EMBO Journal. 2000. V.19. P. 4342-4350.

137. Lichtsteiner S., Wuarin J.,Schilber U. The interplay of DNA-binding proteins <*> on the promoter of the mouse albumin gene // Cell. 1987. V.51. P. 963-973.

138. Los M., Neubuser D., Coy J.F., Mozoluk M., Poustka A., Schultze-Osthoff K. Functional characterization of Dnase X, a novel endonuclease expressed in muscle cells // Biochemistry. 2000. V.39. № 25. P. 7365-7373.

139. Lu J., McKinsey T.A., Zhang C.L., Olson E.N. regulation of skeletal myogenesis by association of the MEF2 transcription factor with class II histone deacetylases // Molecular Cell. 2000. V.6. P. 233-244.

140. Luger K., Mader A.W., Richmond R.K., Sargent D.F., Richmond T.J. Crystal structure of the nucleosome core particle at 2,8 A resolution // Nature. 1997. V.389. P. 251-260.

141. Luo R.X., Dean D.C. Chromatin remodeling and transcriptional regulation // Journal of the National Cancer Institute 1999. V.91. № 15. P.1288-1294.

142. Mancini M.A., Shan B., Nickerson J.A., Penman S., Lee W-H. The retinoblastoma gene product is a cell cycle-dependet, nuclear matrix-associated protein // Proceedings of the National Academy of Sciences of the

143. U.S.A. 1994. V.91. P. 418-422.

144. Martelli A.M., Bareggi R., Bortul R., Grill V., Nardussi P., Zweyer M. The nuclear matrix and apoptosis // Histochemistry and Cell Biology. 1997. V.108.P. 1-10.

145. Martens J.H., Verlaan M., Kalkhoven E., Zantema A. Cascade of distinct histone modifications during collagenase gene activation // Mollecular and Cellular Biology. 2003. V.23. № 5. P. 1808-1816.

146. Martens J.A., Winston F. Evidence that Swi/Snf directly represses transcription in S. Cerevisiae // Genes and Development. 2002. V.16. № 17. P. 2231-2236.

147. Martins S.B., Eide T., Steen R.L., Jahnsen T., Skalhegg B.S., Collas P. HA95 is a protein of the chromatin and nuclear matrix regulating nuclear envelope dynamics // Journal of Cell Science. 2000. V.l 13. P. 3703-3713.

148. Matera A.G. Nuclear bodies: multifaceted subdomains of the interchromatin space // Trends in Cell Biology. 1999. V.9. P. 302-309.

149. Meyer K.B., Neuberger M.S. The immunoglobulin k locus contains a second, stronger B-cell-specific enhancer which is located downstream of constant region // EMBO Journal. 1989. V.8. P. 1959-1964.

150. Meyer K.B., Sharpe M.J., Surani M.A., Neuberger M.S. The impotance of the 3'-enhancer region in immunoglobulin k gene expression // Nucleic Acids Research. 1990. V.l8. P. 5609-5615.

151. Montag M. Localization of the nuclear matrix protein mitotin in mouse cells with a mitotic or andomitotic cell cycle // Experimental Cell Research. 1992. V.202. P. 207-210.

152. Moore S.C., Jason L., Ausio J. The elusive structural role of ubiquitinated histones // Biochemistry and Cell Biology 2002. V.80. № 3. P. 311-319.

153. Naar A.M., Lemon B.D., Tjian R. Transcriptional coactivator complexes 11 Annual Reviews Biochemistry. 2001. V.70. P. 475-501.

154. Nakagomi K., Kohwi Y., Dickinson L.A., Kohwi-Shigematsu T. A novel DNA-binding motif in the nuclear matrix attachment DNA-binding protein SATB1 // Molecular and Cellular Biology. 1994. V.14. P. 1852-1860.

155. Natesan S., Gilman M.Z. DNA bending and orientation-dependent function of YY-1 in the c-fos promoter // Genes and Development. 1993. V.7. P. 24972509.

156. Nelsen B., Sen R. Regulation of immunoglobulin gene transcription // International Review of Cytology. 1992. V.133. P. 121-149.

157. Nickerson J.A. Experimental observations of a nuclear matrix // Journal of Cell Science. 2001. V.l 14. P. 463-474.

158. Ng H.H., Robert F., Young R.A., Struhl K. Genome-wide location and regulated recruiment of the RSC nucleosome-remodeling comlex // Genes and Development. 2002. V.16. № 7. P. 806-819.

159. Nutt S.L., Eberhard D., Horcher M., Rolink A.G., Busslinger M. PAX.5determines the identity of B cells from the begining to the end of B-lymphopoiesis // International Reviews of Immunology. 2001. V.20. № l.P. 65-82.

160. Okuwaki M., Matsumoto K., Tsujimoto M., Nagata K. Function of nucleophosmin/B23, a nucleolar acidic protein, as a histone chaperone // FEBS Letters. 2001. V.506. № 3. P. 272-276.

161. Olave I.A., Reek-Peterson S.L., Crabtree G.R. Nuclear actin and actin-related proteins in chromatin remodeling // Annual Reviews Biochemistry. 2002. V.71.P. 755-781.

162. Olson M.O., Hingorani K., Szebeni A. Conventional and nonconventional roles of the nucleolus // International Review of Cytology. 2002. V.219. P. 199-266.

163. O'Nelli L.P., Turner B.M. Histone H4 acetylation distinguishes coding regions of the human genome from heterochromatin in a differentiation-dependent but transcription-independent manner // EMBO Journal. 1995. V.14. P. 3946-3957.

164. Parslow T.G., Granner D.K. Structure of a nuclease-sensitive region inside the immunoglobin kappa gene: evidence for a role in gene regulation // Nucleic Acids Research. 1983. V.l 1. № 14. P. 4775-4792.

165. Pederson T. Thinking about a nuclear matrix // Journal of Molecular Biology. 1998. V.277. P. 147-159.

166. Pederson T. Half a century of "the nuclear matrix" // Molecular Biology of the Cell. 2000. V.ll. P. 799-805.

167. Pederson T., Aebi U. Actin in the nucleus: what form and what for? // Journal of Structural Biology. 2002. V.l 40. P. 3-9.

168. Pederson T.A., Kowenz-Leutz E., Leutz A., Nerlov C. Cooperation between C/EBPalpha TBP/TFIIB and SWI/SNF recruiting domains is required for adipocyte differentiation // Genes and Development. 2001. V.l5. № 23. P. 3208-3216.

169. Peterson C.L., Herskowitz I. Characterization of the yeast SWI1, SWI2, and SWI3 genes, which encode a global activator of transcription // Cell. 1992. V.68. № 3. P. 573-583.

170. Pham A.D., Sauer F. Ubiquitin-activating/conjugating activity of TAF(II)250, a mediator of activation of gene expression in Drosophila // Science. 2000. V.289. P. 2357-2360.

171. Player A.N., Kantor GJ. The endogenous nuclease sensitivity of repaired DNA in human fibroblasts // Mutation Research. 1987. V.184. № 2. P. 169178.

172. Pongubala J.M.R., Atchison M.L. Activating transcription factor 1 and cyclic AMF response element modulator can modulate the activity of the immunoglobulin k 3' enhancer // The Journal of Biological Chemistry. 1995. V.270. № 17. P. 10304-10313.

173. Preuss U., Landsberg G., Scheidtmann K.H. Novel mitosis-specific phosphorylation of histone H3 at Thrll mediated by Dlk/ZIP kinase // Nucleic Acids Research. 2003. V.31. № 3. P. 878-885.

174. Pugh B.F. Control of gene expression through regulation of the TATA-binding protein // Gene. 2000. V.255. P. 1-14.

175. Razin S.V., Yarovaya O.V., Georgiev G.P. Low ionic strength extraction of nuclease-treated nuclei destroys the attachment of transcriptionally active

176. DNA to the nuclear skeleton // Nucleic Acids Research. 1985. V.13. P. 445447.

177. Reyes J.C., Muchardt C., Yaniv M. Components of the human SWI/SNF complex are enriched in active chromatin and are associated with the nuclear matrix // The Journal of Cell Biology. 1997. V.13 7. № 2. P. 263-274.

178. Ridsdale J.A., Hendzel M.J., Delcuve G.P., Davie J.R. Histone acetylation alters the capacity of the HI histones to condense transcriptionally active/competent chromatin // The Journal of Biological Chemistry. 1990. V.265. P. 5150-5156.

179. Roberts S.G.E. Mechanisms of action of transcription activation and ^ repression domains // Cellular and Molecular Life Sciences. 2000. V.57. P.1149-1160.

180. Roman C., Platero J.S., Shuman J., Calame K. Ig/EBP-1: a ubiquitously expressed immunoglobulin enhancer binding protein that is similar to C/EBP and heterodimerizes with C/EBP // Genes and Development. 1990. V.4. № 8.1. P. 1404-1415.

181. Roth S.Y., Denu J.M., Allis C.D. Histone acetyltransferases // Annual Reviews Biochemistry. 2001. V.70. P. 81-120.

182. Rout M.P., Aitchison J.D. The nuclear pore complex as a transport machine // The Journal of Biological Chemistry. 2001. V.276. № 20. P. 16593-16596.

183. Ryseck R.-P., Bravo R. c-Jun, JunB and JunD differ in their binding affinities to AP-1 and CRE consensus sequences: effects of Fos proteins // Oncogene. 1991. V.6. P. 533-542

184. Sasson-Corsi P., Lamph W.W. Verma I.M. Regulation of proto-oncogene c-fos: a paradigm for early response genes // Cold Spring Harbor Symposia on

185. Quantitativ Biology. 1989. V.53. P.749-757.

186. Sen R., Baltimore D. Multiple nuclear factors interact with the immunoglobulin enhancers // Cell. 1986. V.46. P. 705-716.

187. Sen R., Baltimore D. Inducibility of k immunoglobulin enhancer-binding protein NF-kB by a posttranslational mechanism // Cell. 1986. V.47. P. 921928.

188. Seo S-B., McNamara P., Heo S„ Turner A., Lane W. S., Chakravarti D. Regulation of histone acetylation and transcription by INHAT, a human cellular complex containing Set oncoprotein // Cell. 2001. V.104. P. 119-130.

189. Sharma V.M., Li B., Reese J.C. SWI/SNF-dependent chromatin remodeling of RNR3 requires TAF(II)s and the general transcription machinery // Genes and Development. 2003. V.17. № 4. P. 502-515.

190. Shiokawa D., Tanuma S. Characterization of human Dnase I family endonucleases and activation of DNAse gamma during apoptosis // Biochemistry. 2001. V.40. № 1. P. 143-152.

191. Small D., Nelkin B., Vogelstein B. The association of transcribed genes with the nuclear matrix of Drosophila cells during heat shock // Nucleic Acids Research. 1985. V.13. № 7. P. 2413-2431.

192. Stauffer D.R., Howard T.L., Nyun T., Hollenberg S.M. CHMP1 is anovel nuclear matrix protein affecting chromatin structure and cell-cycle progression // Journal of Cell Science. 2001. V.l 14. P. 2383-2393.

193. Sterner D.E., Berger S.L. Acetylation of histones and transcription-related factors // Microbiology and Molecular Biology Reviews. 2000. V.64. № 2. P. 435-459.

194. Stephanova E., Stancheva R., Avramova Z. Binding of sequences from the 5-and 3-nontranscribed spacers of the rat rDNA locus to the nucleolar matrix // Chromosoma. 1993. V.102. P. 287-295.

195. Stullcup M.R. Role of protein methylation in chromatin remodeling and transcriptonal regulation // Oncogene. 2001. V.20. № 24. P. 3014-3020.

196. Stuurman N., Heins S., Aebi U. Nuclear lamins: their structure, assembly and interactions // Journal of Structural Biology. 1998. V.122. P. 42-66.

197. Taciguchi M. The C/EBP family of transcription factors in the liver and other organs // International Journal of Experimental Pathology. 1998. V.79. P. 369-391.

198. Talcott B., Moore M.S. Getting across the nuclear pore complex // Trends in Cell Biology. 1999. V.9. P. 312-318.

199. Tews D.S. Molecules in focus. Emerin // The International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 1999. V.31. P. 891-894.

200. Thomson S., Mahadevan L.C., Clayton A.L. MAP kinase-mediated signalling to nucleosomes and immediated-early gene induction // Seminars in Cell and Developmental Biology. 1999. V.10. P. 205-214.

201. Tikoo K., Ali Z. Structure of active chromatin: covalent modifications of histones in active and inactive genes of control and hypothyroid rat liver // Biochemistry Journal. 1997. V.322. P. 281-287.

202. Torchia J. Glass C., Rosenfeld M.G. Coactivators and corepressors in the integration of transcriptional responses. // Current Opinion in Cell Biology. 1998. V.10. P. 373-383.

203. Trantwein C., Rakemann T., Pietrangelo A., Plumpe J., Montosi G., Manns M.P. C/EBP-beta/LAP controls down-regulation of albumin gene trancription during liver regeneration // Journal of Biological Chemistry. 1996. V.271. № 36. P. 22262-22270.

204. Tremethick D.J. High mobility group proteins 14 and 17 can space nucleosomal particles deficient in histones H2A and H2B creating a template that is transcriptionally active // Journal of Biological Chemistry. 1994. V.269. P. 28436-28442.

205. Trubiani O., De Fazio P., Pieri C., Mazzanti L., Di Primio R. Nuclear matrix provides linkage sites for translocated NF-kB: morphological evidence // Histochemistry and Cell Biology. 2000. V.l 13. P. 369-377.

206. Varga-Weisz P. ATP-dependent chromatin remodeling factors: nucleosome shufflers with many missions // Oncogene. 2001. V.20. № 24. P. 3076-3085.

207. Vlcek S., Dechart T., Foisner R. Nuclear envelope and nuclear matrix: interactions and dynamics // Cellular and Molecular Life Sciences. 2001. V.58.P. 1758-1765.

208. Wachsman J.T. The beneficial effects of dietary restriction: reduced oxidative damage and enhanced apoptosis // Mutation Research. 1996. V.350. № 1. P. 25-34.

209. Waldeck W., Fohring B., Chowdhury K., Gruss P., Sauer G. Origin of DNA replication in papovavirus chromatin is recognized by endogenous endonuclease // Proceedings of the National Academy of Sciences of the U.S.A. 1978. V.75. № 12. P. 5964-5968.

210. Wang W. The SWI/SNF family of ATP-dependent chromatin remodelers: similar mechanisms for diverse functions // Current Topics in Microbiology and Immunology. 2003. V.274. P. 143-169.

211. Wartburton P.E., Earnshaw W.C. Untangling the role of DNA topoisomerase II in mitotic chromosome structure and function // BioAssay. 1997. V.19. P. 97-99.

212. Wiberg J.S. On the mechanism of metal activation of deoxyribonuclease I // Archives of Biochemistry and Biophysics. 1958. V.73. P. 337-385.

213. White R.J. Gene transcription: mechanisms and control 2001. Blackwell Science. 273 P.

214. Wong M., Allan J., Smulson M. The mechanism of histone HI cross-linking by poly(ADP)-ribosylation. Reconstitution with peptide domains // The Journal of Biological Chemistry. 1984. V.259. № 12. P. 7963-7969.

215. Worman H.J., Courvalin J.-C. The inner nuclear membrane // The Journal of Membrane Biology. 2000. V. 177. P. 1-11.

216. Wu J., Grunstein M. 25 years after the nucleosome model: chromatin modifications // Trends in Biochemical Sciences. 2000. V.25. № 12 P. 619623.

217. Wu R.S., Kohn K.W., Bonner W.M. Metabolism of ubiquitinated histones // The Journal of Biological Chemistry. 1981. V.256. P. 5916-5920.

218. Yang W-M., Inouye C., Zeng Y., Bearss D., Seto E. Transcriptional repression by YY1 is mediated by interaction with a mammalian homolog of the yeast global regulator RPD3 // Proceedings of the National Academy of4

219. Sciences of the U.S.A. 1996. V.93. P. 12845-12850.

220. Yaniv M., Cereghini S. Structure of transcriptionally active chromatin // CRC Critical Reviews in Biochemistry. 1986. V.21. № 1. P. 1-26.

221. Yamamoto M., Murato H., Sumryishi H., Endo H. Rapid inactivation of24* 24*

222. Ca /Mg -dependent endonuclease of rat liver nuclei after cycloheximide «i treatment // Biochemical and Biophysical Research Communications. 1984.1. V.119. № 2. P. 618-623.

223. Yasui D., Miyano M., Cai S., Varga-Weisz P., Kohwi-Shigematsu T. SATB1 targets chromatin remodelling to regulate genes over long distances // Nature. 2002. V.419. P. 641-645.

224. Zhang Q., Ragnauth C., Greener M.J., Shanahan C.M., Roberts R.G. Thenesprins are giant actin-binding proteins, orthologous to Drosophila melanogaster muscle protein MSP-300 // Genomics. 2002. V.80. № 5. P. 473478.

225. Zhao K., Harel A., Stuurman N., Guedalia D., Gruenbaum Y. Binding of matrix attachment regions to nuclear lamin is mediated by the rod domain and depends on the lamin polymerization state // FEBS Letters. 1996. V.380. P. 161-164.

226. Zhu H., Joliot V., Prywes R. Role of transcription factor TFIIF in serum response factor-activated transcription // Journal of Biological Chemistry.1994. V.269. P. 3489-3497.

227. Автор выражает глубокую признательность научному руководителю зав. лаб. молекулярной биологии к.б.н. A.A. Терентьеву.

228. Особую благодарность автор выражает д.б.н. И.Н. Тодорову и д.б.н. П.Я. Бойкову за консультации и полезные дискуссии.

229. Автор благодарит сотрудников лаборатории молекулярной биологии Г.В. Костюк, Р.И. Папину, Ю.И. Митрохина и A.B. Шугалия за помощь в работе и обсуждении результатов.

Информация о работе

Борисова, Наталья Павловна
кандидата биологических наук
Москва, 2003
ВАК 03.00.02

Диссертация

Ассоциация транскрибируемой ДНК с ядерным матриксом в условиях активации эндогенных ДНКаз in vitro на примере генов альбумина и C-FOS - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Ассоциация транскрибируемой ДНК с ядерным матриксом в условиях активации эндогенных ДНКаз in vitro на примере генов альбумина и C-FOS - тема автореферата по биологии, скачайте бесплатно автореферат диссертации

Похожие работы