Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Выявление и характеристика новых регуляторных участков гена MTSI мыши ичеловека

ВАК РФ 03.00.26, Молекулярная генетика

Автореферат диссертации по теме "Выявление и характеристика новых регуляторных участков гена MTSI мыши ичеловека"

Р Г Б ОД

; П ; - ц г. 10ЧЯ

I о ыДИ

На правах рукописи

ПРОХОРЧУК ЕГОР БОРИСОВИЧ

ВЫЯВЛЕНИЕ И ХАРАКТЕРИСТИКА НОВЫХ РЕГУЛЯТОРНЫХ УЧАСТКОВ ГЕНА МТв1 МЫШИ И ЧЕЛОВЕКА

Специальность 03.00.26 - молекулярная генетика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА 1996

Работа выполнена в лаборатории молекулярной генетики рака Института биологии гена РАН

Научные руководители:

академик РАН, доктор биологических наук Г. П. Георгиев кандидат биологических наук C.J1. Киселев

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, проф. C.B. Разин

кандидат биологических наук Р.Л. Турецкая

Ведущая организация:

Институт биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН

Защита диссертации состоится г...1996 года в

часов на заседании Диссертационного совета Д.200.30.01 при Институте биологии гена РАН по адресу: 117334, Москва, ул. Вавилова 34/5

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН

Автореферат разослан

996 года

Учёный секретарь Диссертационного совета канд. фарм. наук

ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность задачи

Четкое представление о механизмах регуляции генов эукариотических организмов является одной из важных ступеней познания жизнедеятельности клетки, т.к. позволяет установить взаимосвязь и очередность множества молекулярных событий, приводящих, в конце концов, к фенотипическим изменениям.

Ген mts1 был охарактеризован, как корреллирующий с метастатическим фенотипом многих опухолевых . клеток [Ebralidze,1989]. Ранее, на модели двух" линий клеток аденокарциномы молочной железы КСМЛ 100 и КСМЛ 0 с высоким и низким уровнем транскрипции гена mts1 было показано, что вся положительная регуляторная активность гена сосредоточена в первом интроне и был охарактеризован один из элементов положительного регулятора [Tulchinsky, 1993]. Им оказалась последовательность ДНК, состоящая из 16 пар нуклеотидов и расположенная в первом интроне. Указанная последовательность не подходит ни под один из известных консенсусов для связывания транскрипционных факторов. Результат оказался не столь интересным в смысле сравнения регуляторных систем гена mts1 в двух линиях клеток КСМЛ 0 и КСМЛ 100, в силу того, что в обеих линиях последовательность активировала транскрипцию гена • репортера в транзиторных трансфекциях и спектр связывающихся in vitro с ней белков был одинаков.

Недавно, был найден и охарактеризован негативный регулятор гена [Tulchinsky, 1996]. Его последовательность-TGACGCT. Этот элемент становится функциональным лишь при метилировании динуклеотада CpG. В модифицированном состоянии эта последовательность связывает белки семейства Jun/Fos. Однако, и этот механизм подавления транскрипции оказался не универсальным, т.к. были найдены клеточные системы

с недетектируемым уровнем транскрипции гена mts1 и неметилированным состоянием динуклеотида CpG.

Эти обстоятельства обусловили попытку более глубокого сравнительного анализа положительной регуляции гена mts1 с использованием модели линий клеток КСМЛ 0 и КСМЛ 100, которая и была предпринята в настоящей работе.

Основная цель настоящей работы состояла в обнаружении и характеристике новых регуляторных областей, расположенных в первом интроне гена mts1.

В ходе исследования предполагалось решение следующих экспериментальных задач:

1. Обнаружение и определение точных координат новых регуляторных элементов гена.

2. Сравнение функциональной значимости обнаруженных элементов в системе линий клеток КСМЛ 0 и КСМЛ 100.

3. Характеристика белковых факторов, принимающих участие в активации транскрипции при связывании с обнаруженными регуляторными участками.

Научная новизна и практическое значение работы.

В настоящей работе был обнаружен новый положительный регулятор транскрипции гена mtsl. В его состав входит ранее не описанная неканоническая последовательность энхансера кВ типа. Изучены свойства этой последовательности в отношении связывания in vitro транскрипционных факторов, в том числе и белков семейства NFkB/Rel. Среди них обнаружен полипептид с молекулярной массой 200 кДа и не входящий в семейство NFkB. Для моделирования молекулярных процессов in vivo был налажен современный метод "футпринтинга" in vivo с использованием ДНКазы!. С его помощью были изучены специфические ДНК-

3

белковые взаимодействия в гиперчувствительных к обработке ДНКазой! районах.

Ранее, в лаборатории молекулярной генетики рака было показано, что повышенный уровень экспрессии гена т/Б/ коррелирует с развитием метастатического фенотипа опухолей. Практическое значение настоящей работы определяется возможностью использования этого феномена для диагностики и терапии опухолей. При такого рода использовании гена необходимо знание особенностей регуляции транскрипции человеческого гомолога этого гена. Это направление тоже нашло своё отражение в данной работе.

Аппрпбация ряботы Материалы диссертации были представлены на следующих симпозиумах: Transcriptional Control of Cell Growth and Differentiation

(Boston MA, USA, 1994), Uniqueness & Universality in a Biological World (Paris, France, 1995), Annual meeting of Molecular Biology Department of Danish Cancer Society (Копенгаген, Дания, сентябрь 1994), Энгельгардтовские чтения (Москва, Россия, декабрь 1995).

Публикации j По теме диссертации опубликовано ..(.. печатные работы.

0бъемл__с1ру_к.гура_диссер1ации Диссертация изложена на LQS? страницах машинописного текста и состоит из следующих частей: введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты и обсуждение, выводы и список литературы. Библиография включает в себя /L.Lc~~ источников. Работа проиллюстрирована ./.??. рисунками и таблицами.

Содержание работы Определение гиперчувствительных к обработке ДНКазой I участков в первом интроне гена mis 7.

С целью выявления новых регуляторных областей гена mts1 был проведен поиск участков гиперчувствительных к обработке ДНКазой! и расположенных в первом интроне . гена. На Рис.1 представлен результат такого эксперимента. В клетках линии КСМЛ100 были картированы два гиперчувствительных участка внутри EcoRI рестрикционного фрагмента. Один из них расположен в районе промотора гена, второй в районе с координатами +700, +900 (при указании координат за 0 принят старт транскрипции гена mts1). В клетках линии КСМЛ 0 обнаружен гиперчувствительный участок лишь в районе с координатами +700, +900. Разница в гиперчувствительности в промоторной области является следствием транскрипционной активности гена в клетках линии КСМЛ 100. Как видно из Рис.1, гиперчувствительность в области с координатами +700, +900 шире в клетках линии КСМЛ100, чем в клетках линии КСМЛ0. Разница в структуре гиперчувствительных областей, расположенных в первом интроне, могла быть следствием различия в спектре ДНК-белковых взаимодействий в этом районе.

Картирование областей первого интрона, делеции которых приводят к значительному снижению энхансерной активности.

Нами был создан ряд конструкций, в которых экспрессия гена репортера CAT находилась под контролем регуляторной зоны гена mtsl. В первом интроне были сделаны делеции, которые захватили область с координатами +647, +1130. Полученные делеционные конструкции были транзиторно трансфецированы в эукариотические клетки. Для контроля уровня трансфекции мы котрансфецировали плазмиду pSV-p-gal. Анализ уровня транскрипции проводился методом защиты рибонуклеиновых проб

г

ксмло

ДНКаза I

КСМЛ100

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

£ VI -

ргзд*

i лав* рялуягтвиа* fjv* , *

Промотор =£> ■ -

Энхансер ==> -

я ч

Ь Ш0

в » ©

EcoRI

I"

3 т.п.н.

PI

HcoRI

Эюон!

-КЗ-

Uiil

Экэон2 500 п.н.

ЭкэонЗ

Рис.1. Картирование гиперчувсшпсльних к обработке ДНКаэой 1 сайтов в первом интроне гена mtsl мыши. А. Испоьэовались клетки линий КСМЛО (дорожки 1-6) и КСМЛ100 (дорожки 7-12). Тре)тальники над дорожками указывают на увеличение концентрации ДНКаэы I. стрелки с обознаениями "ПРОМОТОР" и "KP" указывают на полосы гибридизации соответствующие гиперчувегтвительным областям в промоторе и KP. Под авггорадиограммой пана карта геномной организации мышиного гена mrsl с указанием зкзонов, гибридизационной пробы ("проба"), мест узнавания рестриктазы Ис<Л\I. использовавшейся для картирования. На схеме геномной организации пшсрчувствительностъ в консервативном районе обозначена вертикальной стрелкой с пометкой П}. '*

Рис.2. Картирование областей первого нитрона, делеции которого приводят к шачительному снижению энхансерной нсгивности. На рисунке отмечены стрелками гащишенные фрагменты генов p-gal и CAT.

Относительный уровень экспрессии

р17САТ S,"T' _|ТЛТ~ 100%

р <5 5 fi&f S"'-_;-|~5лт~ 40%

р 86 -.U^ ^ ^so_j-^- 4Q%

Pô? -¡ы S"M*2K1 u-......--—\mz 35%

p Ô 8 i^i s"T' ,rrt""71-.....■•-^ж: 2o%

PÔ9 ^801,830_1S0%

TATAÎ EXON

pSVCAT promoter 20%

pÔ4 20%

EXONJ DELETED REGIONS PAKT OFEXON2

CAT и (i-gal от РНКазы. Уровень активности регуляторного элемента определялся из соотношения интенсивностей сигналов CAT и fi-gal. Интенсивность сигналов CAT и p-gal были посчитаны на фосфоимэджере, взято их отношение, которое затем было усреднено по всем экспериментам и приведено на Рис.2. В качестве отрицательного контроля при транзиторных трансфекциях использовалась коммерческая конструкция pSVCATpromoter, в которой отсутствовал энхансерный элемент SV40. У плазмид pSVCATpromoter и р54 (конструкция с полностью делетированым первым интроном) транскрипционная активность была сравнима, что еще раз указывает на сосредоточение всей положительной регуляторной активности в первом интроне гена mts 1. Как видно из рис.2 и соответствующей схемы, в области +647, +1130 картируются два района с положительной транскрипционной активностью: первый с координатами +647, +788 (делеционная конструкция р55) и второй +878,+1028 (делеционная конструкция р58). При делетировании этих областей происходит снижение уровня транскрипции в 2,5 и 2 раза, соответственно. Следует отметить, что область делеции в конструкции р55 приблизительно совпадает с гиперчувствительным к ДНКазе! участком. Факт совпадения области гиперчувствительности' и области, обладающей энхансерной активностью, представлял несомненный интерес.

В экзогенных конструкциях инициация транскрипции с ложных

стартов ослабляет эффект делеции регуляторных областей Картирование старта транскрипции гена mts1 в составе делеционных конструкций показало,, что сигнал CAT в экспериментах по защите от РНКазы складывается из множественных транскриптов разной длины. На Рис. 3 приведен анализ старта транскрипции нескольких делеционных конструкций. В качестве маркера приведен сиквенс плазмиды с того же

3

ложный старт .

Рис.3 Картирование старта транскрипции в экзогенных конструкциях . методом наращивания цепи кДНК на матрице мРНК со специфического CAT праймера. 1 дорожка- р17САТ, 2 дорожка- р55, 3 дорожка- р56, 4 дорожка- р57, 5 дорожка- р58, 6 дорожка- р54. В качестве маркера приведен сиквенс гена CAT с того же праймера.

лраймера, с которого определялся старт инициации транскрипции. Таким образом, если вычесть из CAT сигнала в экспериментах по защите от РНКазы тот фон, который образуется за счет ложных стартов транскрипции, то наблюдается многократное усиление эффекта.

Результаты экспериментов по гиперчувствительности к обработке ДНКазой и по транзиторным трансфекциям выявили область, потенциально интересную с точки зрения регуляции транскрипции. Она была подвергнута более детальному изучению.

Исследование In vitro района с координатами 4-690,+888.

Опыты по задержке ДНК-белковых комплексов в геле с использованием фрагмента первого интрона с координатами

+690,+888 в качестве пробы выявили наличие множественных ДНК-белковых взаимодействий в этом районе (Рис.4). Был обнаружен комплекс с низкой подвижностью (на Рис.4 обозначен стрелкой), который образовывался только при использовании ядерных экстрактов из клеток КСМЛ100. Тем не менее, в этом эксперименте не было достигнуто необходимое разделение для идентификации отдельных комплексов в области геля С (Рис.4). Было решено использовать метод "футпринтинга" с помощью ДНКазы!, который обладает меньшим разрешением ДНК-белковых взаимодействий, чем метод задержки в геле.

Результаты этого эксперимента представлены на Рис.5. При использовании ядерных экстрактов из линии клеток КСМЛ 0 ДНК-иолковые взаимодействия обнаружены в области с координатами +800, +836 (Рис.5 А и Б). Этот участок был защищен от действия ДНКазы! на кодирующей и некодирующей цепях ДНК. При использовании ядерных экстрактов из линии клеток КСМЛ 100 дополнительно к этой области защищен от действия ДНКазы! и короткий район на кодирующей цепи с координатами +770, +775. Найдены также и гиперчувствительные к ДНКазе! участки. На

о о

5 5

g g CSMLO CSML100 «-1 «-1

-Hid- 50 - hol. 50 - specific

- [ -1 - {10 - 50| - |Ю - 50 unspecific

123456 78 9 10

lanes

competitor, fold molar excess

+

Sac I (260) -1-

Rstl(647)

Exonl

Б

v^m - region with coordinates 690-8 used as a probe in EMSA.

Рисунок 4.

-Рвдиоавтограмма ДНК-белковых комплексов в неденатурирующем 4% полиакриламшшом геле. 1 дорожка- . . использовались .ядерные экстракты из клеток КСМЛО, 2 дорожка- то же из клеток КСМЛ100, 3 и 5 дорожки- конкуренция с 10 и 50 .кратным молярным избытком специфической пробы ДНК (ядерные экстракты КСМЛО), 7и 9 дорожки- то же с ядерными экстрактами из клеток КСМЛ100, 4 и 6 дорожки- конкуренция с. 10 и 50 кратным малярным избытком неспецифической ДНК (ядерные экстракты 'КСМЛО), 8 и 10 дорожки- то же с ядерными экстрактами из клеток КСМЛ100.

Фигурной скобкой С обозначены неразрешенные в геле ДНК-белковые комплексы.

Стрелкой обозначен комплекс с низкой подвижностью, который был изучен впоследствии методом интерференции метилирования.

Схема Б демонстрирует расположение исподзовавшейся в эксперименте пробы ДНК.

В. Интерференция метилировании

1екоиируюшли печь

Б. Кодирующая иепь

гщ

СБМЬО

Йог! 1 • ^

¡гсЙС ЙЙ»

Р

+800

а

2 □

2

< о

сп {Г О 1-сг о

р <

+взв 1

сбмыоо

Г 3:

+780

т

+794

+800

О

г а 2

и»! 5 о

СП

О а-

I

а.

+В3б|

в.

/

б

в Т

т

т т т

с. с*

А

С

т

кодирующая некодируюшая

Рис.5

A.Футпринтннг на фрагменте +690, +888 с помощью ДНКазы! ш %-зЧго. Некодируюшая иепь. Область гнлсрчувствительности и зашиты от ДНКазы! обозначена заштрихованным и пустым прямоугольником соответственно.

Б. То же, но изображена кодирующая иепь

B. Определение координат комплекса с низкой подвижностью методом интерференции метилирования. На кодирующей и некодируюшеЛ цепи защищенные основания отмечены звездочками.

некодирующей цепи сразу за защищенной областью по направлению к 3' концу фрагмента находится сильный сайт гиперчувствительности в клетках КСМЛ 0 и КСМЛ 100. На кодирующей цепи мы обнаружили слабый гиперчувствительный сайт лишь в клетках КСМЛ 100 сразу за коротким защищенным районом по направлению к 5' концу фрагмента.

Для определения точного положения комплекса с низкой подвижностью (на Рис.4 обозначен стрелкой) был выполнен эксперимент по интерференции метилирования. Защита четырех G на кодирующей цепи (Рис.5 В) и двух С на некодирующей выявила точную локализацию комплекса: +780, +794. Эти координаты совпадают с короткой областью ДНК-белкового взаимодействия обнаруженного в предыдущем эксперименте (Рис.5 А и Б).

Анализ нуклеотидной последовательности участка первого интрона, который вовлечен в ДНК-белковые взаимодействия, выявил, что область +800, +836 представляет собой сильно изменившуюся микросателлитную ДНК с основным повтором CAG, а район +780, +794 при компьютерном анализе с помощью программы SIGNALSCAN оказался неканонической последовательностью кВ типа.

Определение координат областей первого интрона, вовлеченных в ДНК белковые взаимодействия in vivo.

Для подтверждения существования in vivo найденных in vitro ДНК-белковых взаимодействий была применена техника "футпринтинга" in vivo к области с координатами +700, +900. "Футпринтинг" in vivo с помощью ДНКазы! выявил следующее: 1) на некодирующей цепи последовательность микросателлитной ДНК защищена от действия ДНКазы! в обеих линиях клеток (Рис.6); 2) последовательности ДНК протяженностью 30-40 нуклеотидов примыкающие с 3' конца непосредственно к микросателлиту являются гиперчувствительными к ДНКазе! на кодирующей цепи в

1 2 »

1 2 3

» 19

В. , 2

О О

вз «с:

^=8

Рис. 6

Л. "Футпринтинг" in vivo с помощью ДНКазы! на некодирующей цепи. 1 дорожка- в реакциях LM PCR использовалась обработанная ДНКоэойГ in vivo ДНК из клеток КСМЛ 0. 2 дорожка- тоже из клеток КСМЛ 100. 3 дорожка- использовалась ДНК, обработанная ДНКазой ill vitro. Защищенные и гиперчувствительныс к ДНКазе1 области отмечены пустым и заштрихованным прямоугольником.

Б. "Футпринтинг" с помощью DMS на кодирующей иепи. 1 порожка- КСМЛ 0. 2 дорожка- КСМЛ 100. J дорожка- ДНК. обработанная DMS in vitro.

В. "Футпринтинг" с помощью DMS на некодирующей цепи. I дорожка- КСМЛ 0. 2 дорожка- КСМЛ 100.

щ

обеих линиях клеток; 3) с 5' конца к микросателлиту примыкает короткий район, который включает в себя неканоническую последовательность типа кВ и является гиперчувствительным к ДНКазе! кодирующей цепи только в клетках линии КСМЛ 100. "Футпринтинг" с помощью диметил сульфата (DMS) выявил следующее: 1) четыре G на кодирующей цепи последовательности GGGGTTTTTCC являются гиперчувствительными к обработке DMS в клетках линии КСМЛ 100; 2) два цитозина в той же последовательности, но по некодирующей цепи защищены от действия DMS в клетках линии КСМЛ 100; 3) наблюдается разница в спектрах защищенных. G и С по кодирующей цепи в последовательности микросателлитной ДНК в клетках линии КСМЛО и КСМЛ100. Если вернуться к ДНКазному "футпринтингу" in vitro (Рис. 5 А и Б), то можно заметить наличие гиперчувствительного района фланкирующего микросателлит с 3' конца при использовании ядерных экстрактов из обеих линий клеток, а также гиперчувствительную зону прилегающую к микросателлиту с 5' конца и включающую кВ-подобную последовательность. Таким образом, результат влияния ДНК-белковых взаимодействий на чувствительность ДНК к ДНКазе! и к DMS в составе хроматина и в виде линейной пробы дают основания для следующего заключения: 1) в клетках линии КСМЛ 100 происходит ДНК-белковое взаимодействие в районе кВ-подобного сайта. В клетках линии КСМЛ 0 оно не детектируется; 2) В обеих линиях клеток обнаруживается протяженное ДНК-белковое взаимодействие в области микросателлитной ДНК, но спектр взаимодействий различается в клетках КСМЛ 0 и КСМЛ 100.

Исследование, белковых факторов, . связывающихся . с неканонической последовательностью кВ типа.

Для определения спектра связывающихся белков NFkB/Rel семейства была выбрана последовательность с координатами

\s

CSML100 CSMLO

m m m m

СП Е со Е m m со « E Si en ■л—1 E m m 32P labeled probe

Е Е E E

GQ CQ

- m V - Ш 4—• f— - cû en •+—* r~ competitor, 50-foid

t: E E molar excess

1 2 3 4 5 6 7 8 lanes

Рисунок 7

Исследование белковых факторов, связывающихся с неканонической последовательностью кВ типа, методом задержки ДНК-белковых комплексов в геле. В таблице приведена схема эксперимента по конкуренции. Добавляли 50 кратный молярный избыток конкурента. В таблице были использованы следующие обозначения. кВ~. каноническая последовательность энхансера типа кВ. птИЕкВ-последовательность типа кВ

обнаруженная в первом интроне мышиного гена тЬ1. Положения разрешенных комплексов указаны стрелками и пронумерованы от 1 до 5.

Широкая стрелка указывает на

неспецифический комплекс

+774GGCAGCTGGGGTTTTTCCACTTT+797 (далее mS).

Соответствующий олигонуклеотид использовался в качестве пробы в экспериментах по задержке ДНК-белковых комплексов в геле. Было выявлено пять комплексов ( Рис.7 дорожка 1). Два комплекса исчезали при конкуренции с консенсусной последовательностью энхансера kB AGTTGAGGGGACTTTCCCAGGC (дорожка 2). Уровень белков NFkB в клетках линии КСМЛ100 (дорожка 3) приблизительно в пять раз выше, чем в линии КСМЛО (дорожка 7). Нормализация проводилась по уровню связывания транскрипционного фактора Oct-1 с соответствующей ему последовательностью. Три остальных комплекса не исчезали при конкуренции с канонической последовательностью kB (дорожка 2). Среди них есть и комплекс с очень низкой подвижностью, который, по всей видимости, и был изучен в эксперименте по интерференции метилирования, описанном в предыдущей главе.

Для характеристики спектра NFkB-подобных белков нами были выполнены эксперименты по узнаванию субъединиц специфическими моноклональными антителами (Рис.8). Опыты проводились с использованием ядерных экстрактов из линии клеток КСМЛ100 и двух проб ДНК: mS и канонической последовательности kB типа. Оказалось, что спектр связывающихся субъединиц NFkB с mS и kB сайтом одинаков. В силу того, что комплекс 4 может быть полностью истощен добавлением антител к р50, а добавление антител со специфичностью к другим субъединицам не оказывает никакого влияния на интенсивность соответствующей полосы, то в состав комплекса 4 входит гомодимер р50. Комплекс 3 не может быть истощен ни добавлением антител к р65 ни к relB. Только лишь совместное добавление двух типов антител может привести к исчезновению комплекса 3. В силу того, что relB не может образовывать гетеродимеры с р65 и собственные гомодимеры, то с уверенностью можно утверждать, что гетеродимер p50-relB связывается in vitro с mS и kB-подобным сайтом. Что касается

Рис. 8

Эксперименты по супершифту с помощью специфических моноклональных антител к суб'единицам ИВсВ. Дорожки 1-6- в качестве пробы при задержке в геле использовалась последовательность тБ ( мышиная последовательность кВ типа в первом интроне гена тЫ), дорожки 7-12 -в качестве пробы использовалась консенсусная прследовательность энхансера типа кВ. Тс полоски, на которые влияло добавление антител обозначены черными кружками. Суперслвинутые полоски обозначены белыми кружками.

комплекса 3 с участием р65, то существовало две возможности: либо это гомодимер р65 либо гетеродимер р50-р65. Для ответа на этот вопрос была определена молекулярная масса всех связывающихся с тЭ полипептидов.

Как следует из предыдущих экспериментов, один из белков в комплексах 4 и 5 конкурирует за связывание с олигонуклеотидом кВ, т.е. является одним из белков семейства ЫР-кВ. Его молекулярная масса, определенная методом ультрафиолетовой (УФ) сшивки, составила 50кД. По результатам экспериментов по "суперсдвигу", можно предположить, что комплекс 4 представляет собой гомодимер р50-р50. Молекулярный же вес неконкурирующего с олигонуклеотидом кВ белка, определенный методом УФ сшивки, составляет приблизительно 150кД. Комплексу 3 на Рис.7 отвечают два белка с молекулярной массой 50кД и 65кД. Теперь можно было дать точный ответ на вопрос, который был поставлен в конце предыдущего параграфа: комплекс 3 образован гетеродимерами р50-р65 и р50-ге1В. Комплексы 1 и 2 на Рис.7 образуют белки с молекулярной массой 200кД и 125кД, соответственно.

Таким образом, спектр белков семейства ЫРкВ, действующих в клетках линии КСМЛ100 таков: р50-р50, р50-р65, р50-ге1В. В клетках линии КСМЛО спектр ^кВ белков такой же.

Среди трех полипептидов-125кДа, 150кДа и 200кДа, не принадлежащих к ЫРкВ/Яе! семейству, лишь один специфичен для экспрессирующих ген л^э/ клеток линии КСМЛ 100. Именно поэтому на этом этапе возникла необходимость разделить положительный эффект, который оказывают белки семейства ЫРкВ и тяжелый белок (200 кДа). Для этого было решено сравнить соответствующие области первого интрона человеческого и мышиного гомологов.

Исследование района микросателлитной ДНК в первом интроне человеческого и мышиного гомологов гена mtsl.

Компьютерный анализ ( программа FASTA) первого интрона гена mfsí мыши и человека выявил область высокой гомологии в районе с координатами +804, +863/ +600, +650, соответственно, (рис.9) (далее этот консервативный район сокращенно называется-КР). Была также найдена последовательность клона D0N581 (номер в GenBank RN07929) микросателлитной ДНК крысы, часть которой совпадала с указанными районами. В гомологах гена mtsl с 5' конца к микросателлитной ДНК примыкает последовательность нуклеотидов типа кВ (рис. 9). Далее она будет называться mS и huS для мышиного и человеческого гомологов, соответственно. Дивергенция последовательности от консенсуса кВ увеличивается от mS (1 замена) к huS (3 замены). Во всём остальном интроне протяженных (больше 50 пар нуклетидов) высококонсервативных участков больше обнаружено не было.

Для изучения гиперчувствительности к ДНКазе! в клетках человека была выбрана линия эритролейкемии К562, где ген mtsl не экспрессируется [Gr¡gorian,1995]. Это позволило нам не связывать наблюдаемую гиперчувствительность с транскрипционной активностью. В этой линии

гиперчувствительный участок также лишь один и расположен он в пределах КР (рис.10).

Поскольку микросателлитиая ДНК вовлечена во множественные и высокоспецифичные ДНК-белковые взаимодействия in vitro и in vivo, то мы решили проверить, какой эффект оказывает делеция этого района на уровень транскипции гена репортера при транзиторных трансфекциях. Была сконструирована плазмида с соответствующей делецией (конструкция р59 на Рис.2). При транзиторной трансфекции в клетки КСМЛ 100 (Рис.2) мы наблюдали слабое ( приблизительно в 1,5 раза) усиление транскрипции гена репортера. Интересно

К562

ДНКаза I

1 2 3 4 5 6 7

КР^О

о10

ЕсоК1 -|- 10 т.п.н.

Эоов!

ГЧ

33

ЕооИ

Эгэои2 ЭюонЗ

500 п.н.

Рис. 10

Картирование областей гиперчувств ительности в человеческих клетках эритролейкемии К562. Треугольник над дорожками указывает на увеличение концентрации ДНКазыГ. Стрелка с обозначением "КР" указывает на полосы гибридизации, ' соответствующие гиперчувствительной области в консервативном районе. Под авторадиограммой дана карта геномной организации человеческого гена /л£у/ с указанием экзонов, мест узнавания рестриктазы ЕсоЯI, использовавшейся для картирования, гибридизационной пробы ("проба"). На схеме геномной организации гиперчувствительность в первом интроне обозначена вертмкалбной стрелкой.

заметить, что хотя • во взаимодействии с микросателлит-связывающими белками в клетках КСМЛ 0 участвуют другие нуклеотидные основания, чем в клетках КСМЛ 100,' но при. транзиторной трансфекции конструкции р59 в клетки КСМЛ О также происходило слабое усиление транскрипции.

huS

rats

ms

D0N581

SGGRNNXXCC

578-TGTGCC ЕЙЙИЖИККГв---ACT-----

I !

465-GCAGCdi IIIIII 776-GCAGC3

CTCACT 1 I

371--------------------

II I II I

- TATGCCNAAATCCCCTGG

< 1CCTCCAGCAG

I I I I I I I I

(ICAGCCAGCAG llllllllll

< ICAGCCAGCAG1

I I I I II I I I I

< ICAGCCAGCAG

:CACAC({CAGi}rCTGGGAGGGAAAAGAATGGCAAGGGCGG-663

III ПТ^ llllllllll I I I I I I I I —-Ц I

-CGCGCCCAACGCTGGGAGGGAGAAGAATGGG' "CAG! GGC-555

I I II I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I

:CGCGCCCAACGCTGGGAGGGAGAAGAATGGGCCAGC CCT-868

I I I II I I I I I I I I I I I I II III I I I I I I I I I XGCGCCCAACGCTGGGAGGGAGAAGAATGGG'

I I I

I I

'CAGi

GGC-443

Рисунок 9

Гомологичные области первого интрона гена гШэ! мыши, крысы, человека и клона ООМ581. МР-кВ подобный сайт выделен заштрихованным прямоугольником. Консенсус для связывания белков МЯ-КВ/Яе! приведен отдельно, над соответствующим местом из первого интрона. Отяичия от консенсуса кВ выделены жирными буквами. САв повтор выделен простым прямоугольником. Координаты последовательности клона 00М581 даны в соответствии с его описанием из базы данных СепВапк.

Основным мотивом в микросателлите является последовательность CAG, повторенная четыре раза. Столь короткий участок ДНК мы отнесли к классу микросателлитов, т.к. ■при поиске в базе данных GenBank была • обнаружена последовательность клона D0N581 с названием "клон микросателлитной ДНК из геномной библиотеки крысы LEW/N". Ранее было показано, что микросателлиты с повтором CAG (а именно GTGGGCAGCAG) специфично связывают ряд белков с точно

í

неустановленной функцией [Coollick, 1990]. Одной из возможностей является их участие в механизмах рекомбинации. Как было показано выше, гиперчувствительные к ДНКазе! сайты и в человеческом и в мышином гене картируются в КР. Вероятно, гиперчувствительность в КР возникает именно вследствие взаимодействия белков, описанных в работе [Coollick, 1990], и микросателлитной ДНК (это подтверждает "футпринтинг" in vivo с использованием ДНКазы)). Гиперчувствительность в КР наблюдается во всех исследованных линиях мышиных и человеческих клеток с совершенно различным уровнем экспрессии гена mtsl (всего было исследовано пять мышиных и четыре человеческих клеточных линий), что указывает на независимость гиперчувствительности в КР и регуляции транскрипции гена mtsl. Остается загадкой, почему только эта область важного в регуляторном смысле первого интрона является консервативной. Возможно, КР служит местом прикрепления ДНК к белкам ядерного матрикса. Действительно, в этих случаях гиперчувствительность к ДНКазе! возникает вне зависимости от уровня экспрессии гена [Forrester C.W., 1994]. Более того, при транзиторной трансфекции конструкций с делецией таких мест прикрепления обычно не наблюдается значительного изменения уровня транскрипции гена репортера, что согласуется с полученными нами результатами.

Изменение в процессе эволюции кВ подобной последовательности в первом интроне гена mtsl приводит к изменению спектра связывающихся с ней белков.

Для изучения белков, связывающихся с неканоническими последовательностями кВ, был использован метод торможения ДНК-белковых комплексов в геле (Рис.11). В этих опытах мы использовали ядерные экстракты, полученные из линии клеток КСМЛ100, и три двухцепочечных олигонуклеотида,

шБ

пД

Ы

ЬЯ

№

*В

кВ

кВ

"Р меченая

гтроба

конкурент

ш

гВ

ЕЙ

кВ

1 2 3 4 5 6 7 8 9

4 и 5

4

Рис. И

Задержка в геле ДНК-белковых комплексов в 4% ПААГ. Стрелки указывают на положение пяти комплексов. Широкая стрелка указывает на неспецифически образовавшийся комплекс при использовании консенсуса кВ в качестве 32Р меченой пробы. Над каждой дорожкой дано пояснение

какая проба и какой конкурент (50-кратнь:й нзбыюк по количеству вещества) были использованы.

соответствующих мышиному кВ подобному сайту, человеческому кВ подобному сайту и кВ консенсусу.

Как видно из Рис.11, с mS связываются пять полипептидов, за два из. которых конкурирует олигонуклеотид кВ, а за три huS. Соответственно, с кВ связываются два, а с huS три полипептида. Между кВ и huS нет перекрывания в связываемых ими белках (дорожки 6 и 9). Следует отметить, что нечеткость полосы, соответствующей комплексу 2 на Рис.11, связана с частичной деградацией этого белка.

Таким образом мышиная кВ подобная последовательность в первом интроне гена mtsl связывала белки NFkB семейства и тяжелый белок, а человеческая только тяжелый белок ( имеются в виду различия в спектре связываемых факторов, возможно активирующие транскрипцию гена mtsl). Добавив к этим двум последовательностям консенсусный сайт кВ, который связывает только белки семейства NFkB/Rel, то получается набор со всевозможными комбинациями факторов, которые могут оказать влияние на транскрипцию гена mtsl.

Определение ¡n vivo положительного регуляторного эффекта на гетерологичный промотор, оказываемого последовательностями kB, mS и huS.

В соответствии со сказанным в конце предыдущего раздела нами были созданы конструкции, содержащие в качестве положительного регуляторного элемента гена CAT под промотором SV40 пентамеры исследуемых кВ подобных сайтов. pSVCATN5 пентамер энхансера типа кВ в ориентации, совпадающей с промотором SV40.

PSVCATM5 пентамер мышиной кВ подобной последовательности в ориентации, совпадающей с промотором SV40. pSVCATM5- пентамер мышиной кВ подобной последовательности в противоположной ориентации промотору SV40.

ксмлюо ксмло

12345 12345

Рис. 12

Защита от РНКазы фрагментов РНК гена репортера CAT и fi-gal. РНК для анализа выделялась из клеток КСМЛО (А) и КСМЛЮО (Б) спустя 60 часов после электропорации. Соответствие между номерами дорожек и трансфецированными плазмидами одинаково на А и Б: I-pSVCAT- Promoter, 2-pSVCATN5, 3-pSVCATM5, 4-pSVCATM5-, 5-pSVCATH5. Плазмиду pSVJJ-Galactosidase котрансфецировали в качестве контроля эффективности трансфекции. Стрелки с обозначениями CAT и ¡i-gal указывают на защищенные фрагменты РНК соответствующих генов.

PSVCATH5 пентамер человеческой kB подобной

последовательности в ориентации, совпадающей с промотором SV40.

Уровень энхансерной активности элемента определяли по отношению интенсивностей сигналов CAT и (З-gal, полученных в экспериментах по защите от РНКазы. На Рис.12 приведены результаты транзиторных трансфекции вышеуказанных конструкций в линии клеток KCMJ10 и КСМЛ100 с различным уровнем транскрипции гена mts 1. Конструкция pSVCATN5 работает в обеих линиях клеток, хотя в КСМЛО и с меньшей эффективностью. Это согласуется с тем, что уровень активного NF-кВ значительно ниже в неэкспрессируюицей ген mts1 линии КСМЛО. pSVCATM5 и рБУСАТМб-работают хуже, чем pSVCATN5, но при этом сохраняют превышение положительной активности над контрольной величиной, как минимум на порядок в обеих линиях клеток, причем вне зависимости от ориентации элемента. Конструкция pSVCATH5 работает лишь в клетках линии КСМЛ 100, что кореллирует с наличием в них белка с молекулярным весом 200кД и отсутствием такового в клетках линии КСМЛ 0. Следует подчеркнуть, что наличие этого белка в клетках линии КСМЛ 100 и его отсутствие в клетках линии КСМЛ 0 является единственным принципиальным отличием в спектрах ядерных факторов, связывающихся с регуляторными последовательностями первого интрона in vitro и кореллирующим с уровнем транскрипции гена mtst. Предположительно, основным белковым фактором, который, связываясь с неканонической последовательностью kB типа, активирует транскрипцию, является тяжелый (200 кДа) белок. Это предположение подтверждается тем, что из пяти изученных мышиных линий клеток тяжелый белок был обнаружен только в тех клетках, где уровень экспрессии гена mtsf был высок. Однако нельзя исключить и возможности участия белков семейства NPkB в регуляции транскрипции гена mtsf. Можно предположить, что

сохранение способности человеческой последовательности кВ типа связывать тяжелый белок является функциональной о регуляции транскрипции, осуществляемой этим фактором. В свою очередь, потеря этой последовательностью способности связывать белки семейства ЫРкВ/Яе! является нефункциональной.

1. В первом интроне гена т(э1 обнаружена область с координатами +700, +900, которая входит в зону гиперчувствительности к обработке ДНКазой!. Гиперчувствительность в этом районе не связана с уровнем транскрипционной активности гена т<5/.

2. Внутри области с координатами +700, +900 расположен положительный регуляторный элемент гена тЫ.

3. В состав положительного регуляторного элемента входит неканоническая последовательность энхансера типа кВ.

4. В состав белков семейства ЫРкВ в клетках КСМЛ100, связывающихся с неканонической последовательностью кВ типа, входят гомодимер р50-р50, гетеродимеры р50-р65 и р50-ге1В.

5. В клетках, экспрессирующих ген обнаружен полипептид с молекулярной массой 200 кДа, который специфически связывается с неканонической последовательностью кВ типа и активирует транскрипцию с гетерологичного промотора. В неэкспрессирующих ген клетках ни присутствия подобного фактора ни активации транскрипции с гетерологичного промотора замечено не было.

6. Микросателлитная ДНК с координатами +801, +835 является слабым отрицательным регуляторным элементом гена.

7. Неканоническая последовательность кВ типа и примыкающая к ней с 5" конца микросателлитная ДНК являются консервативными при переходе от мыши к человеку, что указывает на их функциональную значимость.

1

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Е. Prokhorchouk, Е. Tulchinsky, Е. Lukanidin. NFkB participates in the mts1 gene transcriptional activation. Transcriptional Control of Cell Growth and Differentiation. An AACR Special Conference. 1994. p.45

2. Прохорчук Е.Б., Тульчинский E.M., Георгиев Г.П., Луканидин Е.М. Анализ гомологичных последовательностей ДНК в первом интроне гена mts1 мыши и человека: kB-подобный сайт и микросателлитная

- ДНК. Генетика. 1996, ПТИрИ». ■ '-ШгМГЦ

3. Tulchinsky Е, Prokhortchouk Е., Georgiev G., Lukanidin E. Noncanonical NFkB binding site as an itegrate part of the mis/ gene complex enhancer. Molecular and Cellular Biology.1996 в печати.