Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Структурно-функциональная организация регуляторных районов и механизмы транскрипции генов интерлейкина-5 человека и мыши

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Структурно-функциональная организация регуляторных районов и механизмы транскрипции генов интерлейкина-5 человека и мыши"

На правах рукописи

МОРДВИНОВ ВЯЧЕСЛАВ АЛЕКСЕЕВИЧ

СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ РЕГУЛЯТОРНЫХ РАЙОНОВ И МЕХАНИЗМЫ ТРАНСКРИПЦИИ ГЕНОВ ИНТЕРЛЕЙКИНА-5 ЧЕЛОВЕКА И МЫШИ

03.00.03 - молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Кольцово - 2008

□ОЗ

003170992

Работа выполнена в Институте цитологии и генетики Сибирского отделения Российской академии наук (г Новосибирск), университете Западной Австралии (the University of Western Australia, Perth) и Технологическом университете Перта (Curtin University of Technology, Perth, Western Australia)

Официальные оппоненты

доктор биологических наук, профессор Э. Г. Малыгин доктор медицинских наук, профессор С В. Сенников доктор биологических наук Н. Б. Рубцов

Ведущая организму

Институт химической биологии и фундаментальной медицины Сибирского отделения Российской академии наук, г Новосибирск

Защита диссертации состоится 26 сентября 2008 года в_часов на заседании

диссертационного совета Д208 020 01 при Государственном научном центре вирусологии и биотехнологии «Вектор» по адресу

ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора, Кольцово Новосибирской области, 630559, тел (383) 336-74-28

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор»

Автореферат разослан 2008 года

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор биологических наук

JI И Карпенко

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования

Согласно современным представлениям, основные события, определяющие временные и количественные характеристики экспрессии генов, происходят на уровне транскрипции Транскрипцию генов контролируют регуляторные белки - транскрипционные факторы (ТФ), опознающие определенные последовательности ДНК Такие последовательности - сайты связывания ТФ - представляют собой регуляторные элементы, формирующие регуляторные области генов Инициация транскрипции и ее реализация зависят от взаимодействия ТФ с регуляторными элементами Таким образом, набор регуляторных элементов генов программирует их экспрессию в онтогенезе, определяет тканеспецифичность экспрессии, а также способность отвечать на сигналы внешней и внутренней среды В связи с этим исключительно важное значение имеют исследования, направленные на выявление отдельных регуляторных элементов в различных генах, изучение их свойств и идентификацию ТФ, взаимодействующих с данными элементами Результаты таких структурно-функциональных исследований позволяют перейти к изучению общих и ген-специфических механизмов регуляции транскрипции и создают базу для решения других актуальных задач молекулярной биологии - выяснению принципов организации регуляторной зоны гена и раскрытию механизмов, обеспечивающих реализацию информации, заложенной в последовательностях ДНК этой зоны

Интерлейкин-5 (ИЛ-5) - гомодимерный гликопротеин, секретируемый в основном активированными Т-лимфоцитами [Schwenger et al, 2000] Впервые он был описан как фактор дифференцировки эозинофилов [Sanderson et al, 1985] Впоследствии было показано, что ИЛ-5 регулирует продукцию эозинофилов, контролирует их дифференцировку, миграцию, активацию и продолжительность жизни in vivo и in vitro [Hogan, 2007] Эозинофилия, повышенное содержание эозинофилов в периферической крови и тканях, как правило, сопровождается высоким уровнем экспрессии гена ИЛ-5 У животных, несущих инактивированый ген ИЛ-5, ицдуцировать эозинофилию не удается [Foster et al, 1996] Таким образом, ИЛ-5 является одним из основных факторов, контролирующих созревание и функциональную активность эозинофилов

Эозинофилы - это гранулярные лейкоциты, которые продуцируются в костном мозге и после недолгого пребывания в периферической крови мигрируют в ткани Принято считать, что эти клетки представляют в системе иммунитета основное звено противопаразитарной защиты [Sanderson, 1992] В норме содержание эозинофилов в организме человека незначительно, однако, при определенных патологиях их количество может увеличиваться в несколько раз Следует отметить, что при паразитарных заболеваниях рост числа эозинофилов, как правило, способствует элиминации паразитов и является признаком адекватной реакции организма на, например, глистную инвазию [Voehnnger, 2007] В противоположность этому, при аллергии, в частности, астме, рост числа эозинофилов ассоциируется с обострением заболевания [Kiley et al, 2007] Наличие этих клеток в легких астматиков связано с повреждением ткани, а их количество коррелирует со степенью поздней астматической реакции [Jacobsen et al, 2007] Выявлена также негативная роль эозинофилов при развитии ряда аутоиммунных и злокачественных заболеваний [Di Stefano, Amoroso, 2005]

Широкая распространенность заболеваний, сопровождающихся эозинофилией, подчеркивает актуальность структурно-функционального картирования регуляторных районов гена ИЛ-5, идентификацию ТФ, определяющих активность отдельных элементов этих районов, и выяснение механизмов инициации и регуляции транскрипции гена Не вызывает сомнений, что раскрытие системы контроля экспрессии гена ИЛ-5 будет способствовать дальнейшему прогрессу в понимании молекулярных механизмов патогенеза ряда серьезнейших заболеваний

На сегодняшний день одним из наиболее эффективных средств лечения заболеваний, сопровождающихся эозинофилией, являются препараты глюкокортикоидов [Hall, 2006, Spafan, Szefler, 2007] В результате применения этих средств у пациентов понижается содержание ИЛ-5 в легких и периферической крови [Charlesworfh et al, 1991, Greenfeder et al, 2001], в бронхиально-альвеолярных смывах падает количество Т-клеток, экспрессирующих мРНК ИЛ-5 [Robinson et al, 1993] Однако, несмотря на широкое использование глюкокортикоидов в практической медицине, механизмы, лежащие в основе действия этих препаратов на экспрессию гена ИЛ-5, изучены далеко не полностью В частности, до сих пор не выяснен механизм подавления транскрипции гена ИЛ-5 глюкокортикоидами, не

определены причины возникновения устойчивости экспрессии гена ИЛ-5 к их действию [Inagaki et al ,2006, Kocak et al, 2006] Таким образом, изучение механизмов действия глюкокортикоидов на экспрессию гена ИЛ-5 остается актуальной темой молекулярной биологии Данные, полученные в результате таких исследований, могут быть полезны как для решения задач академического характера, так и для развития прикладных исследований по созданию новых фармакологических препаратов для лечения заболеваний, сопровождающихся эозинофилией

Установлено, что в Т-лимфоцитах экспрессия генов таких индукторов кроветворения и иммунного ответа, как ИЛ-3, ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-13 и ГМ-КСФ часто происходит одновременно [Ansel et al, 2006, Dean, 2006] Вместе с тем известно, что существуют механизмы, позволяющие селективно регулировать экспрессию отдельных генов Например, в отличие от активации экспрессии большинства генов цитокинов, запуск транскрипции гена ИЛ-5 зависит от синтеза белка de novo [Schwenger et al, 2002] Таким образом, исследование структурно-функциональной организации регуляторных районов и механизмов транскрипции ИЛ-5 является важным шагом к пониманию как общих, так и ген-специфических механизмов регуляции экспрессии генов цитокинов

Цель и задачи исследования

Цель данной работы - исследование структурно-функциональной организации регуляторных районов и механизмов транскрипции генов ИЛ-5 человека и мыши Для ее достижения необходимо было решить следующие задачи

Выбрать клеточную модель для проведения масштабных экспериментов по структурно-функциональному картированию регуляторных районов и изучению механизмов активации и регуляции экспрессии гена ИЛ-5 человека Провести структурно-функциональное картирование регуляторных районов генов ИЛ-5 человека и мыши Идентифицировать белки, взаимодействующие с функционально активными элементами регуляторных районов и определить их роль в регуляции транскрипции генов ИЛ-5 человека и мыши

Выяснить основные механизмы инициации и регуляции транскрипции гена ИЛ-5 человека

Основные положения работы, выносимые на защиту

1 Структурно-функциональные карты регуляторных районов генов ИЛ-5 человека и мыши существенно различаются между собой Кроме того, найдены различия в составе белковых комплексов, определяющих активность сходных по локализации, структуре и функции регуляторных элементов генов человека и мыши Эти факты указывают на участие видоспецифических механизмов в системе регуляции транскрипции генов ИЛ-5 человека и мыши

2 Консервативный лимфокиновый элемент О (CLEO) контролирует инициацию и уровень транскрипции гена ИЛ-5 человека Ключевым транскрипционным фактором, определяющим активность CLEO, является АР-1 Функцию регулятора активности формирования комплекса CLE0/AP-1 выполняет одна из субъединиц фактора АР-1 -белок Fra-2

3 Клеточная активация индуцирует экспрессию гена, кодирующего белок Fra-2, который, в свою очередь, инициирует транскрипцию гена ИЛ-5 Существует прямая зависимость между интенсивностью экспрессии генов Fra-2 и ИЛ-5 человека

4 Мишенью дексаметазона в контексте регуляторных элементов гена ИЛ-5 человека является CLEO При определенных условиях клеточной стимуляции дексаметазон индуцирует экспрессию гена, кодирующего белок GILZ (активируемый глюкокортикоидами белок лейциновая застежка, glucocorticoid-mduced leucine zipper) Этот белок ингибирует активность CLEO ИЛ-5, что и приводит к подавлению транскрипции гена

5 Фактор транскрипции GATA-3 непосредственно участвует в регуляции активности промоторов генов ИЛ-5 и ИЛ-4 человека Вероятнее всего он действует как архитектурный фактор, обеспечивающий специфическую конформацию ДНК, т е постоянный контакт GATA-3 с соответствующими элементами генов необходим для создания функционально активной пространственной структуры промоторов

Научная новизна исследования

- Впервые проведено системное картирование функционально активных элементов регуляторных районов генов ИЛ-5 человека и мыши В последовательности промоторов этих генов обнаружены новые уникальные элементы - РЭ1/2 и мРЭ1/2 Установлено, что регуляторные элементы РЭ1 и РЭ2 гена человека принимают участие в подавлении индуцированной транскрипции, а мРЭ1 и мРЭ2 гена мыши - в активации транскрипции

- В составе З'-нетранслируемой области гена ИЛ-5 мыши и найден новый позитивный регуляторный элемент, не имеющий аналогов в гене ИЛ-5 человека

- В последовательности промоторов генов ИЛ-5 и ИЛ-4 человека обнаружены новые элементы GATA, не имеющие аналогов в генах ИЛ-5 и ИЛ-4 мыши Установлено, что данные регуляторные элементы участвуют в подавлении базальной и индуцированной транскрипции

- Впервые идентифицированы ключевые белки, регулирующие экспрессию гена ИЛ-5 человека, и раскрыт механизм инициации и регуляции транскрипции гена Показано, что элемент CLEO контролирует запуск и интенсивность транскрипции гена ИЛ-5 человека Основным фактором, регулирующим эти процессы, является белок Fra-2, входящий в состав CLE0-связывающего комплекса АР-1

- Впервые показано, что механизм подавления транскрипции гена ИЛ-5 человека дексаметазоном связан с экспрессией глюкокортикоид-индуцируемого гена, кодирующего белок GILZ Выяснено, что этот белок блокирует активность промотора гена ИЛ-5 и его мишенью в контексте регуляторных элементов является CLEO

- Идентифицированы белки, входящие в состав транскрипционных комплексов, участвующих в регуляции экспрессии гена ИЛ-5 мыши В результате обнаружены существенные различия в составе факторов транскрипции, регулирующих экспрессию генов ИЛ-5 мыши и человека

- Впервые показано, что белок GATA-3 непосредственно участвует в регуляции активности промоторов генов ИЛ-5 и ИЛ-4 человека все функционально активные элементы GATA промоторов данных генов взаимодействуют именно с этим фактором транскрипции Впервые продемонстрировано, что элементы GATA генов цитокинов участвуют как в индукции, так и в подавлении промоторной активности

Практическая значимость

Ведущая роль ИЛ-5 в регуляции продукции и активации эозинофилов обусловливает практическую значимость исследований структурно-функциональной организации регуляторных областей гена этого цитокина и механизмов, контролирующих его экспрессию Так, на основании данных, полученных в настоящей работе можно предположить, что перспективными мишенями для фармакологических препаратов для лечения заболеваний, сопровождающихся эозинофилией, являются регуляторный элемент CLE0 гена ИЛ-5 человека и ядерные белки, определяющие функциональную активность этого элемента

Практическое значение имеют также данные о различиях в структурно-функциональной организации промоторов и 3'-нетранслируемых областей генов ИЛ-5 человека и мыши Они демонстрируют, что результаты, полученные при исследовании регуляции экспрессии гена ИЛ-5 мыши, не могут адекватно отражать механизмы регуляции экспрессии ИЛ-5 человека

И, наконец, результаты проделанной работы позволяют рекомендовать перевиваемую линию Т-клеток человека PER-117 в качестве модели для изучения механизмов активации и регуляции экспрессии генов ИЛ-5 и ИЛ-4 человека

Апробация результатов диссертации и публикации

Основные положения диссертации докладывались на международном симпозиуме «Интерлейкин-5, первое десятилетие» («Interleukin-5, the First Decade», Перт, Австралия, 1997), Десятом Международном иммунологическом конгрессе (Tenth International Congress of Immunology, Нью-Дели, Индия, 1998), ежегодных собраниях Биохимического Общества Великобритании (1995, 1999), международных конференциях по молекулярной и клеточной биологии в рамках программы «Keystone Symposia» (1996, 1998, 2000, 2002), международных конференциях по молекулярной и клеточной биологии, проводимых исследовательским центром Hanson Institute (Аделаида, Австралия, 1994, 1996, 1998, 2000), собраниях международного общества «International Eosinophil Society» (1997, 1999), международных школах по молекулярной и клеточной биологии (Канберра, Австралия, 1995, 1997) и других международных и национальных конференциях

По материалам диссертации в рецензируемых отечественных и зарубежных изданиях опубликовано 20 статей

Структура и объем работы

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, главы, содержащей результаты собственных исследований и их обсуждение, и выводов Работа изложена на 257 страницах машинописного текста, включая 12 таблиц и 86 рисунков Список цитируемой литературы содержит 382 ссылки

Благодарности

Автор глубоко признателен профессору Colin J Sanderson за его постоянный интерес к исследованиям, за поддержку и ценные предложения, касающиеся экспериментальной работы и интерпретации полученных данных

На разных этапах в работе принимали участие Gretchen Т F Schwenger, Susanne Е Perom, Anish D Smgh, Monica Senna Salerno, Stéphane Karlen, Marc A Thomas, Régis Fournier, Monica L De Boer и другие сотрудники группы профессора Colin J Sanderson - автор приносит им искреннюю благодарность Автор также благодарен ведущему научному сотруднику ИЦиГ СО РАН, доктору биологических наук Д П Фурман и старшему научному сотруднику ИЦиГ СО РАН, кандидату биологических наук А В Катохину за плодотворное сотрудничество при обсуждении представленных в работе результатов исследований

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1 Выбор перевиваемой клеточной линии

Экспрессия генов цитокинов - индуцибельный процесс К началу наших исследований работа по изучению механизмов регуляции экспрессии гена ИЛ-5 человека существенно осложнялась отсутствием лимфоцитарной линии клеток человеческого происхождения, индуцибельно продуцирующей ИЛ-5 после стимуляции стандартными Т-клеточными активаторами Поэтому в качестве этапа, предваряющего исследования структурно-функциональной

организации промотора и механизмов регуляции экспрессии гена ИЛ-5 человека, был проведен поиск Т-клеточных линий человеческого происхождения, обладающих в контексте экспрессии генов лимфокинов свойствами, близкими к свойствам первичных Т-клеток Один из основных критериев отбора линий клеток - кандидатов на роль клеточной модели нашего исследования - экспрессия в них генов ИЛ-5 и ИЛ-4 после активации культур стандартными клеточными стимуляторами

В результате тестирования значительного числа Т-клеточных линий нам удалось найти клетки PER-117, в которых после активации происходит экспрессия генов ИЛ-5 и ИЛ-4 Как показано на рис 1-1, в нестимулированных клетках PER-117 не удается выявить присутствие мРНК ИЛ-5 и ИЛ-4 (дорожка 1) Однако в образцах РНК, полученных из активированных культур, мРНК ИЛ-5 и ИЛ-4 присутствуют (дорожка 2) Таким образом, экспрессия генов ИЛ-4 и ИЛ-5 в клетках линии PER-117 является индуцибельной

Рис 1-1 Экспрессия мРНК ИЛ-5, ИЛ-4 и p-actin в интактных и активированных клетках PER-117 Клетки активированы форбол миристат ацетатом (phorbol 12-mynstate 13-acetate, РМА) в комбинации с кальциевым ионофором А23187 (calcium lonophore А23187, Cal) Определение мРНК проводилось с помощью обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР)

Следует отметить, что РМА активированная продукция ИЛ-5 в клетках PER-117 может быть значительно усилена с помощью ко-активаторов -циклического аденозинмонофосфата (cyclic adenosine monophosphate, cAMP), Cal или анти-СВ28-антител (anti-CD28 antibody, aCD28) (рис 1-2) Таким образом, аналогично продукции ИЛ-5 в первичных Т-лимфоцитах, наиболее эффективная продукция этого цитокина в клетках PER-117 достигается только с помощью стимуляции TCR-зависимого сигнального пути в комбинации с одним из дополнительных сигнальных путей клеточной активации

PER-117 + +

РМА/Са! - + 1 2

ИЛ-5 *»

ИЛ-4 -

li-actin — »-

i

• ... л i

____,._

1 2

. .. i' ' - i ... 4 5

Рис. 1-2. Продукция ИЛ-5 в интактных и активированных клетках PER-117:

1 - интактные. культуры;

2 - стимуляция клеток с помощью РМА;

3 - РМА в комбинации с Cal;

4 - РМА в комбинации с сАМР;

5 - РМА в комбинации с aCD28

Важно подчеркнуть, что синтез мРНК и продукция ИЛ-5 в клетках PER-117 подавляются дексаметазоном. Интересно, что эффект дексаметазона на экспрессию гена ИЛ-5 зависит от условий клеточной активации. Дексаметазон практически полностью подавляет экспрессию этого гена в клетках, активированных РМА или РМА в комбинации с сАМР и aCD28. В культурах же, стимулированных с помощью РМА в комбинации с Cal, дексаметазон лишь слабо понижает уровень синтеза мРНК и продукции ИЛ-5. Аналогичные данные были получены при исследовании эффекта дексаметазона на экспрессию гена ИЛ-5 в первичных Т-лимфоцитах человека. Эти факты в совокупности с данными по активации экспрессии гена ИЛ-5 и продукции данного цитокина в тестируемой культуре дают основания полагать, что регуляция экспрессии гена ИЛ-5 в первичных Т-лимфоцитах и клетках PER-117 осуществляется с помощью, по крайней мере, аналогичных механизмов. Таким образом, клетки PER-117 являются хорошей моделью для изучения механизмов активации и регуляции экспрессии гена ИЛ-5 человека. Тем не менее, необходимо упомянуть, что данные о механизмах экспрессии генов, полученные при использовании этих клеток, как и любых других клеточных линий, должны быть интерпретированы достаточно осторожно, поскольку механизмы, контролирующие экспрессию генов в перевиваемых культурах, могут иметь свои особенности. Поэтому в нашей работе результаты ключевых экспериментов, проведенных с использованием клеток PER-117, всегда проверялись с помощью экспериментов, выполненных на первичных Т-лимфоцитах.

2. Новые регуляторные элементы промотора гена ИЛ-5 человека

Структурно-функциональное картирование регуляторных районов гена ИЛ-5 человека проводилось по следующей схеме (i) выявление потенциальных регуляторных элементов с помощью футпринтинга и компьютерного анализа последовательности регуляторных районов, (и) функциональное тестирование потенциальных регуляторных элементов с использованием адресного мутагенеза и репортерного анализа, (ш) идентификация факторов транскрипции, участвующих в активации этих элементов, с помощью различных модификаций метода задержки ДНК-зондов в геле (electrophoretic mobility shift assay, EMSA)

В результате проделанной работы в составе регуляторной области гена, охватывающей первые 500 пар оснований промотора (п о ), были выявлены функционально активные элементы, аналоги которых присутствуют в составе промоторов ряда других генов цитокинов В частности, непосредственно за ТАТА-боксом между позициями -59 и -43 был локализован консервативный лимфокиновый элемент 0 (CLEO), в районе позиции -70 - элемент GATA, а в районе позиции -110 - сайт связывания NF-AT Далее, в районах позиций -128 и -152 были локализованы два элемента GATA, а в районе позиции -400 еще один элемент GATA Столь «настойчивое» повторение этого мотива может говорить о важной роли элементов GATA в регуляции транскрипции гена ИЛ-5 Поэтому исследованию роли элементов GATA в регуляции активности промотора гена ИЛ-5 была посвящена отдельная работа, результаты которой изложены в следующем разделе

Помимо вышеупомянутых элементов в составе исследуемого фрагмента промотора нам удалось обнаружить два новых регуляторных элемента, РЭ1 и РЭ2 РЭ1 расположен между позициями -90 и -79 в проксимальной области промотора (последовательность CCATTATTAGGC) РЭ2 находиться в дистальной части промотора между позициями -559 и -447 (последовательность TGGCAGTTTCCAT) Мутации последовательностей, участвующих в составе этих элементов во взаимодействии с ядерными белками, приводят к усилению активности промотора в стимулированных культурах первичных Т-лимфоцитов и клетках PER-117 (рис 2-1 и 2-2) Следовательно, новые элементы обладают способностью подавлять активность промотора гена ИЛ-5 человека Поскольку функции РЭ1 и РЭ2

проявляются только в условиях клеточной стимуляции, эти элементы участвуют в репрессии индуцированной активности промотора гена ИЛ-5.

РЭ1 СССАТТАТТАвССАТТСТС

СС-мутант -91-ТТ--------------------га

ТАТ-мутант -81--------СвС---------------------73

бС-мутант -81-------------Ав--------73

Конструкция -281/+18

ОС-мутант

Рис. 2-1. А - замены в последовательности РЭ1; Б - экспрессия репортёрных конструкций, содержащих замены в последовательности РЭ1, в РМА/сАМР-активированных клетках РЕК-117.

Пояснения: репортёрная конструкция -281/+18 несёт фрагмент гена ИЛ-5 человека, расположенный между позициями -281 и +18

Относительная активность люциферазы (%)

-507/+18 пК1м пКЗм ПК1/ЗМ

Рис. 2-2. Экспрессия базовой (-508/+18) и модифицированных (пК1м, пКЗм и пК1/Зм) репортёрных конструкций, несущих замены в последовательности РЭ2, в РМА/Са1-активированных клетках РЕЯ-117. Приведены данные трёх независимых экспериментов: ■ -эксперимент 1; 2; 0- 3.

Активность люциферазы в стимулированных культурах выражена относительно активности люциферазы в нестимурованных культурах

Регуляторные области многих генов цитокинов содержат элементы, участвующие в блокаде базальной и индуцированной активности промоторов [В1ош е! а!., 2006]. Довольно часто репрессорные элементы расположены в проксимальной части промоторов в непосредственной близости от регуляторных последовательностей, участвующих в активации транскрипции [ТзигШа е1 а1., 1998]. Один из обнаруженных нами репрессорных элементов, РЭ1, обладает «классической» локализацией: 3'-область этого элемента

граничит с блоком GATA/CLEO, а 5'-область с блоком GATA/NF-AT, активаторами транскрипции гена ИЛ-5. Расположение же второго репрессора, РЭ2, несколько необычно, - он удалён от насыщенного регуляторными элементами проксимального промотора более чем на 300 п.о.

Идентификация репрессорных элементов существенно дополняет структурно-функциональную карту промотора гена ИЛ-5 и позволяет по-новому взглянуть на возможные механизмы регуляции экспрессии гена. Так, учитывая локализацию РЭ2, можно предположить, что в реализации механизмов регуляции транскрипции этого гена существенную роль играет пространственная структура промотора.

При идентификации факторов транскрипции, входящих в состав ДНК-белковых комплексов РЭ1 и РЭ2, было выяснено, что оба элемента взаимодействуют с фактором YY1 (рис. 2-3) - многофункциональным ядерным белком, способным как активировать, так и репрессировать промоторы различных генов [Shi et al., 1997].

Антитела Конкурентные ояигонукпеотиды

С1 — С2

Проба РЭ1

H н Octl Oct2 н YY10ct1+YY1 (-) 0«1 (-) H YY1 H H

и г*

— *— u k

Проба РЭ2

H « W (•) нг AT

H vr» h m-*r «

r.

K1 K2

C3

- ЩР ЦР щ

КЗ

Рис. 2-3. Идентификация ядерных белков, взаимодействующих с РЭ1 и РЭ2 с использованием ЕМЭА. А: РЭ1 - факторы транскрипции ОсИ и УУ1 участвуют в образовании комплексов С1 и СЗ; Б: РЭ2 - факторы транскрипции М^-АТ и УУ1 входят в состав комплексов К1 и КЗ

Следует отметить, что УУ1 участвует в регуляции экспрессии генов ряда цитокинов и действует при этом как репрессор транскрипции [Уе е1 а1., 1996а; Уе ¡Я а1., 1996Ь]. В состав ДНК-белковых комплексов РЭ1 входит также фактор Ой-!. В некоторых случаях этот белок проявляет свойства репрессора промоторной активности [Норре-8еу1ег е1 а1., 1991; ОеШаве е1 а1., 1996], однако, в основном он выполняет функции активатора транскрипции [БсЬоЬг

et al, 1991] Вместе с YY1 в состав ДНК-белковых комплексов РЭ2 входит фактор транскрипции NF-AT Согласно данным различных авторов, NF-AT является активатором транскрипции и играет важную роль в регуляции экспрессии многих генов цитокинов, в число которых входит и ИЛ-5 [De Boer et al, 1999]

Таким образом, в число факторов, взаимодействующих с РЭ1 и РЭ2, входят репрессор активности промоторов генов цитокинов YY1 и два активатора транскрипции этих генов, Oct-1 и NF-AT Можно предположить, что в составе ДНК-белковых комплексов РЭ1 и РЭ2 YY1 сохранил свою функцию репрессора, однако, функции Oct-1 и NF-AT неясны В пределах каждого регуляторного элемента мотив связывания YY1 перекрывается с мотивами связывания Oct-1 или NF-AT Интересно, что такие комбинации транскрипционных факторов являются уникальными Не исключено, что эта уникальность может отражать особые механизмы регуляции транскрипции гена ИЛ-5

3. Роль фактора транскрипции GATA-3 в регуляции активности промоторов генов ИЛ-5 и ИЛ-4 человека

Как упоминалось в разделе 2, на сравнительно небольшом расстоянии от старта транскрипции в составе промотора гена ИЛ-5 человека расположены три элемента GATA, еще один такой сайт находится в дисталыюй области промотора К началу нашей работы роль элементов GATA в регуляции активности промоторов генов ИЛ-5 человека оставалась неясной, что и послужило мотивацией для следующей работы

3 1 Функции GATA-3-связывающих элементов в регуляции активности промотора гена ИЛ-5 человека

При идентификации белков, формирующих комплексы с элементами GATA промотора гена ИЛ-5, было выяснено, что сайты -70, -152 и -400 взаимодействуют с транскрипционным фактором GATA-3 (рис 3-1) Сайт GATA-128 промотора гена ИЛ-5 не формирует комплексы с ядерными экстрактами из клеток PER-117

При оценке функциональной активности элементов GATA, расположенных в промоторе гена ИЛ-5 человека, было обнаружено, что элементы GATA-70 и GATA-152 участвуют в активации промотора, GATA-

IS

128 не обладает функциональной активностью, а ОАТА-400 принимает участие в подавлении базальной и индуцированной активности промотора (рис. 3-2).

Проба GATA-70

Антитела

Конкурентные олигонуклеотиды

О

Проба GATA-152

Проба GATA-400

(-){-}(-) ну (-)(-) 11

¥ 5 S

(-)?§(-)<-> (-)?§(-){-} wf S ssl Sww

{-) (-) (;> S

И ^МиММ'М

H ' ilKtiMMtt

Рис. 3-1. Идентификация ядерных белков, взаимодействующих с мотивами GATA гена ИЛ-5 человека. Олигонуклеотиды, соответствующие мотивам GATA в районах позиций -70, -152 и -400, обозначены -70, -152 и -400. Олигонуклеотиды, содержащие консенсусные мотивы связывания факторов GATA, Octamer, С/ЕРВ, АР-1 и АР-2, обозначены GATA, Octamer, С/ЕРВ, АР-1 и АР-2

JSL

\

Ж.

ж

Рис. 3-2. Влияние замен в последовательности сайтов GATA-70 (A), GATA-128(E), GATA-152(Б) и GATA-400 (В) на активность промотора гена ИЛ-5 человека: экспрессия репортёрных конструкций в нестимулированных (чёрные столбцы) и РМА/сАМР-активированных (серые столбцы) клетках PER-117. Репортёрные конструкции: 1 - базовая (-508/+18); 2 - мутация сайта GATA-70; 3 - мутация сайта GATA-128; 4 - мутация сайта GATA-152; 5 - мутация сайта GATA-400 в кодирующей цепи, 6 - в некодирующей цепи, 7 - в двух цепях

Таким образом, в результате тестирования функциональной активности четырех элементов GATA промотора гена ИЛ-5 человека были получены данные, указывающие на то, что фактор GATA-3 непосредственно участвует в регуляции транскрипции гена ИЛ-5 человека Действительно, единственный неактивный в отношении регуляции транскрипции элемент, GATA-128, не взаимодействует с GATA-3 Остальные элементы связывают этот фактор и обладают определенными функциями в контексте тестируемого фрагмента промотора гена ИЛ-5 Элементы GATA-70 и GATA-152 являются активаторами транскрипции, элемент GATA-400 проявляет свойства репрессора базальной и индуцированной активности промотора Полярное различие функций элементов GATA, находящихся в составе одного промотора, явление необычное Является ли это особенностью промотора гена ИЛ-5 или элементы GATA промоторов других генов лимфоцитарных цитокинов обладают такими же характеристиками' Чтобы ответить на этот вопрос мы исследовали роль элементов GATA в регуляции активности промотора гена ИЛ-4 человека

3.2. Функции GATA-3-связывающих элементов в регуляции активности промотора гена ИЛ-4 человека

В результате компьютерного анализа регуляторной области гена ИЛ-4 человека, расположенной между позициями -1075 и +66, было обнаружено несколько потенциальных сайтов связывания транскрипционных факторов семейства GATA При тестировании этих сайтов в экспериментах по определению белок связывающей активности было выяснено, что элементы, расположенные между позициями -274/-269 и -860/-852, взаимодействуют с ядерными белками из клеток PER-117 и первичных Т-лимфоцитов Сайты были названы GATA(-)274 и GATA(-)860 Было установлено, что в состав ДНК-белковых комплексов, образованных этим элементами и ядерными экстрактами входит фактор транскрипции GATA-3

При функциональном тестировании элемента GATA(-)274 было показано, что этот сайт участвует в активации промотора гена ИЛ-4 человека Однако при исследовании функциональной активности дистального элемента GATA были получены совершенно иные результаты Мутация последовательности GATA(-)860 и делеция фрагмента ДНК, содержащего этот элемент, существенно увеличивали эффективность экспрессии

репортёрных конструкций. Активность люциферазы в клетках, трансфицированных конструкциями пИЛ4САТА(-)860мут и пИЛ40АТА(-)860дел, в 3-7 раз превышала активность репортёрного белка в клетках, трансфицированных пИЛ4бк (рис. 3-3).

xlfr1 (cps)

PMA/cAMP PMA/Cal PMA/aCD28

xlO3 (cps)

Рис. 3-3. Активность люциферазы в культурах клеток PER-117 и Jurkat, трансфицированных конструкциями, экспрессирующим репортёрный ген под контролем промотора гена ИЛ-4 человека.

Конструкции:

1, пИЛ4бк - содержит фрагмента гена ИЛ-4 человека, расположенный между позициями -1075 и +60;

2, пИЛ4(-)860мут -отличается от пИЛ4бк мутацией мотива GATA в последовательности элемента GATA(-)860, мутация блокирует белоксвязывающую активность сайта;

3, пИЛ4(-)860дел -содержит фрагмента гена ИЛ-4 человека, расположенный между позициями -744 и +60.

НС PMA ТМА/сАМР PMA/Cal ÏMA/aCDÎS

Обозначения: не - нестимулированные культуры; PMA, cAMP, Cal, aCD28 -культуры, стимулированные соответствующими активаторами

Важно отметить, что мутация GATA(-)860 и делеция этого элемента увеличивают активность репортёрных плазмид не только в стимулированных, но и в нестимулированных культурах PER-117 и Jurkat. Это означает, что

Клетки Jurkat

элемент GATA(-)860 участвует в репрессии как базалыюй, так и индуцированной активности промотора ИЛ-4 Поскольку GATA(-)860 взаимодействует с фактором транскрипции GATA-3 в интактных культурах и клеточная активация мало влияет на интенсивность этого взаимодействия, можно заключить, что данный фактор является компонентом механизма, сдерживающего базальную активность промотора ИЛ-4 и подавляющего индуцированную транскрипцию гена

Итак, при исследовании функциональной активности GATA-3-связывающих элементов генов ИЛ-4 и ИЛ-5 человека были получены неоднозначные результаты Так, установлено, что мотивы GATA-860 гена ИЛ-4 и GATA-400 гена ИЛ-5 участвуют в репрессии индуцированной и базальной активности промоторов Таким образом, складывается впечатление, что GATA-3 может действовать как транскрипционный репрессор ИЛ-4 и ИЛ-5 Однако это заключение противоречит нашим же данным о позитивной роли GATA-3-связывающих элементов в активации транскрипции этих генов Действительно, GATA-70 и GATA-152 промотора ИЛ-5, также как и GATA-274 промотора ИЛ-4 являются активаторами транскрипции Кроме того, супрессорный эффект GATA-3 на транскрипцию ИЛ-4 и ИЛ-5 не согласуется с устоявшимися представлениями о важнейшей роли этого белка в экспрессии генов цитокинов в Т-хелперах типа 2 (Тх2) [Murphy, Remer, 2002]

Возникшее противоречие можно разрешить с помощью модели, в которой GATA-3 рассматривается как архитектурный фактор, обеспечивающий специфическую конформацию ДНК В этом случае постоянный контакт GATA-3 с соответствующими элементами гена необходим для создания функционально активной пространственной структуры промотора Разрушение одного из сайтов связывания GATA-3 будет вести к частичному изменению такой структуры, что может выражаться в изменении эффективности действия активаторов или репрессоров транскрипции, действующих как через регуляторные элементы промотора, так и через последовательности, расположенные в других областях кластера генов Тх2 цитокинов В наших экспериментах были использованы фрагменты промоторов, содержащие комплекс регуляторных элементов, среди которых есть репрессоры и активаторы Вполне вероятно, что мутация дистального мотива GATA резко понижает или отменяет действие транскрипционных

репрессоров, например, РЭ1 и РЭ2 гена ИЛ-5 (раздел 2) и Р2 NRE, NRE-I и NRE-II гена ИЛ-4 [Li-Weber et al., 1992]. В отличие от этого, мутации GATA сайтов, расположенных в проксимальных областях промоторов, ослабляют эффект активаторов транскрипции, например, CLEO ИЛ-5 [Stranick et al., 1995; Thomas et al., 1999] и элемента P гена ИЛ-4 [Aune et al., 2001]. Такая модель действия GATA-3 полностью согласуется с общепринятыми представлениями об участии этого белка в инициации реконструкции хроматина для формирования транскрипционного профиля Тх2 и регуляции экспрессии генов Тх2 цитокинов.

4. Идентификация белков, регулирующих активность консервативного лимфокинового элемента 0 (CLEO) генов ИЛ-5 человека и мыши

Идентификацию белков, взаимодействующих с CLEO гена ИЛ-5 человека, проводили с помощью EMSA ядерных экстрактов из клеток PER-117 и олигонуклеотида CLEOo, последовательность которого соответствовала последовательности промотора гена ИЛ-5 человека между позициями -59 и -38. Ядерные экстракты были получены из интактных клеток и культур PER-117, активированных РМА в комбинации с Cal.

Как показано на рис. 4-1 А, ядерные экстракты из нестимулированных клеток и CLEOo формируют два комплекса, CI и CIII (дорожка 1). Активация клеток не влияет на образование комплекса CI, однако значительно усиливает формирование CIII (дорожка 2). Клеточная стимуляция индуцирует также и образование третьего ДНК-белкового комплекса CII (дорожка 2). Формирование этого комплекса полностью зависит от стимуляции клеток PER-117.

А -53S!- Б -///////////

CLEO АР-1 Oct NF-AT

щ №ifi«eei 1= g'» ВёВВВВВЁВВВВ

I «W w™ W

12 125456 7 8 9 .10 11 12

Рис. 4-1. Идентификация ядерных белков, взаимодействующих с CLEO гена ИЛ-5 человека. А - EMSA с использованием конкурентных олигонуклеотидов (CLEOo, олигонуклеотиды, содержащие консенсусные мотивы связывания факторов транскрипции АР-1, Octamer и NF-AT). Б - EMSA с использованием антител к факторам транскрипции (пояснения в тексте)

Антитела, специфические к белку Oct-1, полностью блокируют формирование комплекса CI (рис. 4-1 Б, дорожка 2), а антитела к фактору Oct-2 изменяют эяектрофоретическую подвижность комплекса CIII (дорожка 3). Следовательно, Oct-1 входит в состав комплекса CI, a CHI содержит Oct-2.

Как показано на рис. 4-1Б, антитела, распознающие все белки семейства Jun (a-Jun) значительно подавляют интенсивность формирование комплекса СИ (дорожка 4). Среди антител, специфических к индивидуальным белкам Jun, сходным эффектом обладают только антитела к Jun D (дорожка 7). Антитела, распознающие все белки семейства Fos, также значительно подавляют формирование комплекса CII (дорожка 8). Среди антител, специфических к индивидуальным белкам Fos, подобным образом действуют только антитела к Fra-2 (дорожка 12). Следовательно, комплекс CII содержит фактор транскрипции АР-1, состоящий из белков Jun D и Fra-2.

Таким образом, полученные данные позволяют заключить, что ядерные белки клеток PER-И 7 и CLEO ИЛ-5 человека формируют комплексы, содержащие транскрипционные факторы АР-1 (Jun D/Fra-2), Oct-1 и Oct-2. Такие же комплексы формируют с CLEO ИЛ-5 человека и ядерные белки первичных Т-клеток здоровых доноров.

Для верификации белоксвязывающих мотивов CLEO ИЛ-5 человека были использованы олигонуклеотиды, содержащие замены в последовательности CLEO (рис. 4-2А).

CLEO М1 № m Ш

GAAATTATTCATTTCCTCAAAG -СТС-

-стс-

-стс-

-стс-

CLEO М1 М2 МЗ М4

"И ы

+ - + - + Активация

-Oct-1 -АР-1 - Oct-2

Рис. 4-2. Верификация белоксвязывающих мотивов CLEO ИЛ-5 человека:

А - олигонуклеотиды, содержащие замены последовательности CLEO; Б - влияние замен в последовательности CLEO на формирование ДНК-белковых комплексов.

В EMSA использованы ядерные экстракты из интактных (-) и активированных (+) клеток PER-117

Как показано на рис. 4-2Б, замена триплета AAA, расположенного между позициями -58 и -56, на СТС (проба Ml) приводит к значительному подавлению взаимодействия пробы с факторами Oct-1 и Oct-2, но не влияет на

формирование комплекса AP-l(CII). Замена ТСА на СТС между позициями -51 и -49 (проба МЗ) не оказывает влияния на формирование Oct-1 и Oct-2 содержащих комплексов, однако, эта мутация значительно подавляет формирование комплекса АР-1. В олигонуклеотиде М4 сохранена целостность всех мотивов взаимодействия CLEO с факторами транскрипции, входящими в состав СЫН. Таким образом, можно заключить, что хотя мотивы связывания факторов Octamer и АР-1 в составе последовательности CLEO ИЛ-5 человека перекрываются (проба М2), это не помешает созданию изменённых вариантов CLEO, образующих комплексы только с одним из транскрипционных факторов.

Для оценки функциональной значимости белоксвязывающих мотивов CLEO ИЛ-5 человека на основе базовой конструкции -281/+18, несущей фрагмент гена ИЛ-5 человека, расположенный между позициями -281 и +18, были выполнены плазмиды Octmut, APlmut и Controlmut, содержащие те же замены, что и олигонуклеотиды М1, МЗ и М4 (рис. 4-2А).

Мутации CLEO не влияют на активность репортёрных конструкций в нестимулированных клетках. Однако после клеточной стимуляции активность экспрессии плазмид, содержащих замены в последовательности CLEO, включая Controlmut, составила всего 10 % от активности экспрессии конструкции -281/+18 (рис. 4-3). Эти данные указывают на то, что мутации в пределах CLEO приводят к практически полной потере активности промотора. Следовательно, вся последовательность CLEO - белоксвязывающие мотивы и участки, не вовлечённые в прямое взаимодействие с факторами транскрипции, - играет важнейшую роль в активации промотора гена ИЛ-5 человека.

I

Неактивированные клетки

-281/+18 APlmut □ Octmut ШЗк Controlmut

ш

ГШ

PMA/Cal

Рис. 4-3. Экспрессия репортёрных конструкций, содержащих замены в последовательности CLEO ИЛ-5 человека, в клетках PER-117. Пояснения в тексте

Роль АР-1 в регуляции экспрессии генов цитокинов изучена достаточно подробно. Как следует из названия этого фактора - активирующий белок 1, АР-1 является активатором транскрипции. В противоположность этому, данные о роли факторов Octamer в регуляции экспрессии цитокинов неоднозначны и не позволяют связать эти белки только с одной функцией в отношении контроля транскрипции различных генов. Присутствие Oct-1 и Oct-2 в транскрипционном комплексе CLEO нами обнаружено впервые и функция данных белков в регуляции активности промотора гена ИЛ-5 человека не ясна.

В экспериментах по исследованию роли транскрипционных факторов Oct-1 и Oct-2 в активации CLEO ИЛ-5 помимо репортёрных конструкций были также использованы экспрессионные векторы pCG-Oct-1 и pCG-Oct-2, содержащие кДНК Oct-1 и Oct-2. Экспрессия данных плазмид в клетках PER-117 и Jurkat ведёт к существенному повышению содержания белков Oct-1 и Oct-2 в ядерных экстрактах, полученных из этих культур. Показано, что избыточная продукция факторов Oct-1 и Oct-2 приводит к усилению активности промотора гена ИЛ-5 человека. Таким образом, факторы Oct-1 и Oct-2 действуют как активаторы транскрипции этого гена. Следует отметить, что белок Oct-2 обладает более значительным эффектом, чем Oct-1.

При идентификации белков, взаимодействующих с CLEO гена ИЛ-5 мыши, было установлено, что этот элемент обладает сходной белоксвязывающей активностью с CLEO ИЛ-5 человека. В состав комплексов, образованных CLEO ИЛ-5 мыши и ядерными белками из перевиваемой Т-клеточной линии мыши EL4 и из первичных Т-лимфоцитов мыши, входят транскрипционные факторы Oct-1, Oct-2 (рис. 4-4, дорожки 2 и 3) и АР-1. Однако составы комплексов АР-1 CLEO ИЛ-5 человека и мыши различаются, -последний образован белками FosB и JunB (дорожки 4 и 6).

Рис. 4-4. Идентификация ядерных белков, взаимодействующих с CLEO ИЛ-5 мыши. EMSA ядерных экстрактов из активированных клеток EL4 и олигонуклеотидной пробы, соответствующей CLEO ИЛ-5 мыши, с использованием антител к факторам транскрипции. Стрелкой указан дополнительный комплекс (дорожки 3, 4 и 6)

т f о s ш * « 8 ® § О О £ о т

1 2 3 4 5 6 7

Определение роли факторов Oct-1 и Oct-2 в регуляции транскрипции гена ИЛ-5 мыши было также проведено с использованием репортёрных и экспрессионных конструкций В результате было установлено, что избыточная продукция факторов Oct-1 и Oct-2 в клетках EL4 приводит к усилению активности промотора гена ИЛ-5 мыши Однако в отличие от системы регуляции экспрессии гена человека, где ведущая роль принадлежит белку Oct-2, при активации экспрессии гена мыши эффект Oct-1 представляется более мощным, чем Oct-2

Результаты, полученные при проведении идентификации факторов транскрипции, определяющих активность CLEO ИЛ-5, позволили существенно пополнить наши знания о системе регуляции транскрипции генов ИЛ-5 человека и мыши Установлено, что в интактных клетках CLEO ИЛ-5 взаимодействует с белками, принадлежащими к семейству факторов транскрипции Octamer, - широко распространенным Oct-1 и лимфоцит-специфическим Oct-2 Клеточная стимуляция значительно усиливает связывание Oct-2 и CLEO, но не влияет на взаимодействие этого элемента с Oct-1 Оба фактора являются активаторами транскрипции генов и обладают определенной видовой «тропностью» Для гена человека более мощным активатором является Oct-2, для гена мыши - Oct-1

Следует отметить, что стимуляция клеток индуцирует взаимодействие CLEO с фактором АР-1 Субъединичный состав АР-1 также представляется видоспецифичным CLEO ИЛ-5 человека связывает комплекс белков Jun D и Fra-2, CLEO ИЛ-5 мыши - FosB и JunB

5. Регуляторные элементы гена ИЛ-5 мыши

Изложенные выше данные указывают на возможность участия в системе регуляции транскрипции генов ИЛ-5 человека и мыши видоспецифических механизмов Если это действительно так, то структурно-функциональная организация регуляторных районов этих генов может существенно различаться Для проверки этого предположения был проведен поиск новых регуляторных элементов гена ИЛ-5

5.1. Новые регуляторные элементы промотора гена ИЛ-5 мыши

С помощью компьютерного анализа промотора гена ИЛ-5 мыши были обнаружены потенциальные регуляторные элементы, гомологичные РЭ1 и

РЭ2 гена ИЛ-5 человека Новые элементы были названы мРЭ1 и мРЭ2 Аналогично РЭ1 и РЭ2 они расположены между позициями -79/-90 и -459/470 соответственно Оба элемента содержат идентичные инвертированные повторы в 3 п о, фланкирующие специфические для каждого элемента последовательности размером 5 п о

Функциональная

Таблица 1 Последовательности модифицированных мРЭ1

и мР32, находящихся в составе репортерных конструкций активность потенциальных

регуляторных элементов была исследована с помощью адресного мутагенеза и репортерного анализа В этой работе мы использовали базовую конструкцию

mIL5wt-Luc, содержащую первые 1700 п о промотора гена ИЛ-5 мыши [Campbell et al, 1987] На основе данной конструкции была создана коллекция репортерных плазмид с различньми заменами в последовательности промотора (таблица 1)

Как показано на рис 5-1, мутация в левом плече мРЭ1 приводит к значительному снижению активности промотора Мутация левого плеча элемента мРЭ2 также существенно понижает активность промотора Однако замены в правых плечах элементов мРЭ1 и мРЭ2 оказывают незначительное влияние на активность промотора Слабое влияние на активность промотора оказывает и замена пары нуклеотидов, расположенной выше инвертированных повторов мРЭ1 и мРЭ2

Конструкция Последовательности модифицированных мРЭ1 и мРЭ2

mlL5wt-Luc мРЭ1иутП мРЭ1мутП мРЭ1мутХ мРЭ2мутЛ мРЭ2мутП нРЭ2мутХ мРЭ1/2ыут GOCTTTATTAGG CCCTGTTGAGG G1ССТТ АТГ AGG CCCTGTTG AGO GOCTTTATTA1 V CCCTGTTGAGG АССГГГАТГАОС, CtClGTIGAGG GCCTTTATTAGG CTTCGTTGAGG GCCtTTATTAGG CCCTGTTGCAA GCCTTTATTAGG TCCTGTTGAGG G VGGTTATTAGG CTTCGTTGAGG

SiНеакгивкрованмые клетки

СИ РМА'сАМР

1- «5

S w

Si «и>

3«-§3 5» * I

и С

P-OOOI

Т

X

X

рш

Т

X

р-ММ

X

т

га

т11_5«<алс *РЭ1«утЛ иРЭ1мутП мРЭ1ыу|Х кРЭ2нутЛ иРЭ2иутЛ ыРЭ2нутХ

Рис 5-1 Экспрессия репортерных конструкций, содержащих замены в последовательности мРЭ1 и мРЭ2, в клетках Е1А Пояснения в тексте

Полученные данные позволяют заключить, что левые части палиндромных последовательностей мРЭ1 и мРЭ2 входят в состав регуляторных элементов, участвующих в активации промотора гена ИЛ-5 мыши Таким образом, мРЭ1 и мРЭ2 выполняют функции, противоположные функциям РЭ1 и РЭ2, аналогов этих элементов промотора гена ИЛ-5 человека

5.2. Новый регуляторный элемент З'-нетранслируемой области гена ИЛ-5 мыши

В результате компьютерного анализа последовательности гена ИЛ-5 мыши в области расположения сайта полиаденилирования был обнаружен потенциальный регуляторный район В последовательности этого района между позициями +4539 и +4578 расположены четыре прямых повтора ATGAATGA (рис 5-2) Первый и последний повторы отделены от двух центральных повторов четырьмя нуклеотидами и последовательность этого фрагмента гена в целом выглядит симметричной Весьма существенно, что фрагмент содержит мотивы, имеющие сходство с последовательностями канонических сайтов связывания факторов транскрипции АР-1, Octamer, GATA и c-Ets Как описано в предыдущих разделах, АР-1, Oct-1, Oct-2 и GATA-3 являются важнейшими факторами, регулирующими транскрипцию гена ИЛ-5 человека Поэтому логично было предположить, что данный район З'-нетранслируемой области может участвовать в регуляции транскрипции гена ИЛ-5 мыши

Рис 5-2 Схема фрагмента гена

н

-38611-

♦17" -—.............ИЛ-5 мыши в

составе базовой

1 г в

• -,-----репортер |—|—-—Ща1и пов рыД-СЬН

мЗ'-пэ репортерной

©~Ç J4 50

«Sàn конструкции

Обозначения HindlII (H)/BamHI (В) - фрагмент гена ИЛ-5 мыши [Campbell et al, 1988], регуляторные элементы гена ИЛ-5 мыши - CLEO, мРЭ1, мРЭ1 и мЗ'-ПЭ (PC 1ЛП, повторы ATGAATGA обведены), | - экзоны, alu пов-ры - alu повторы, репортер - ген люциферазы Конструкция выполнена на основе вектора p-Poly-III

Косвенное подтверждение того, что последовательность, содержащая прямые повторы ATGAATGA, может содержать регуляторные элементы, было получено в результате футпринтинга З'-нетранслируемой области гена

ИЛ-5 мыши. Оказалось, что кодирующая и некодирующая цепи ДНК этого фрагмента гена обладают способностью взаимодействовать с ядерными [ белками клеток ЕЬ4. Район связывания с ядерными белками 3'-нетранслируемой области, содержащий повторы АТСААТйА, обозначен как мЗ'-ПЭ (рис. 5-2). Делеция этого района из базовой репортёрной конструкции, I содержащей фрагмент гена ИЛ-5 мыши размером 9.5 1сЬ (рис. 5-2), приводила I к 3-х кратному падению уровня экспрессии репортёрного гена (таблица 2). ,

Эти данные однозначно свидетельствуют о том, фрагмент гена, расположенный между позициями +4539 и +4585 содержит новый |

регуляторный элемент, принимающий участие в активации транскрипции гена | ИЛ-5 мыши. 1

Таблица 2. Результаты пяти независимых экспериментов по исследованию экспрессии базовой конструкции и конструкции с делецией повторов А ГСААТОА в активированных

Эксперимент 1 2 3 4 5

Активность люциферазы в клетках, трансфицировакных базовой конструкцией (ср5) 2756 ±977 2258 ±138 2380 ±253 1577 ±202 1437 ±166

Активность люциферазы в клетках, трансфицированных конструкцией с делецией мЗ'-ПЭ (срз) 863 ±79 648 ±71 713 ±155 475 ±117 419 ±57

Активность конструкции с делецией мЗ'-ПЭ относительно активности базовой конструкции (%) 31.3 28.7 30 30.1 29.2

I

При идентификации факторов транскрипции, входящих в состав ДНК-белковых комплексов мЗ'-ПЭ, были использованы ядерные экстракты из клеток ЕЬ4 и первичных лимфоцитов мыши. Оказалось, что Ой-1 участвует в формировании комплекса С1, АР-1 в формировании С2, а Ой-2 входит в

I '

I состав СЗ (рис. 5-3).

! Неактивированные клетки Активированные клетки

Рис. 5-3. Идентификация ядерных белков, взаимодействующих с мЗ'-ПЭ. ЕМвА ядерных экстрактов из активированных клеток ЕЬ4 и I

о олигонуклеотидной пробы, соответствующей мЗ'-ПЭ, с I

использованием антител к факторам транскрипции

При проведении компьютерного анализа последовательности 3'-нетранслируемой области гена ИЛ-5 человека мы не обнаружили мотивов, обладающих сходством с мЗ'-ПЭ Футпринтинг З'-нетранслируемой области гена человека также не выявил сайтов, взаимодействующих с ядерными белками Т-клеток Негативный результат был получен и при компьютерном скрининге последовательностей интронов гена ИЛ-5 человека

Таким образом, результаты проведенных исследований продемонстрировали наличие существенных различий в функциональной и структурной организации регуляторных областей генов ИЛ-5 мыши и человека Ярким примером функциональных различий структурно схожих районов промоторов являются элементы мРЭ1/2 и РЭ1/2 Действительно, последовательности и локализация этих элементов весьма консервативны для генов ИЛ-5 мыши и человека Однако в контексте промотора гена мыши мРЭ1/2 действуют как активаторы транскрипции, в составе промотора гена человека они выполняют функции транскрипционного репрессора Очевидно, что причиной полярного различия функций являются регуляторные белки, взаимодействующие с этими элементами К сожалению, нам не удалось идентифицировать факторы, активирующие мРЭ1/2 Однако данные предварительного анализа позволяют предположить, что такими факторами могут быть NF-kB подобные белки Участие белков семейства NF-kB в активации экспрессии генов цитокинов хорошо документировано [Kulms et al, 2006] Таким образом, данные предварительного анализа факторов транскрипции, активирующих мРЭ1/2, согласуются с результатами функционального тестирования этих элементов промотора

Кроме того, следует обратить внимание, что состав и локализация регуляторных элементов генов мыши и человека существенно различается Так, в З'-нетранслируемой области гена мыши расположен позитивный регуляторный элемент, З'-нетранслируемая область гена человека не содержит аналогов этого элемента Элемент GATA-400, обнаруженный в составе промотора гена человека (раздел 3 1), не имеет аналогов в последовательности гена мыши В последовательности гена человека между позициями -244 и -237 локализован сайт связывания белков Octamer, участвующий в активации промотора [Mordvinov, Sanderson, 2001] В соответствующем районе промотора гена мыши такой сайт отсутствует

Вышеизложенные факты указывают на то, что механизмы регуляции экспрессии генов ИЛ-5 мыши и человека, по крайней мере, не идентичны Очевидно, различные виды нашли отличающиеся пути тонкой регуляции продукции ИЛ-5 Таким образом, экспериментальные данные, полученные при использовании клеток мыши, не всегда могут адекватно отражать механизмы регуляции экспрессии ИЛ-5 в клетках человека

6. Механизмы регуляции транскрипции гена ИЛ-5 человека

ИЛ-5 принадлежит к семейству индукторов кроветворения и иммунного ответа, членами которого являются также ИЛ-3, ИЛ-4, ИЛ-13 и ГМ-КСФ [Lampmen et al, 2004] Гены, кодирующие эти белки, расположены на участке q31 хромосомы 5 человека и соответствующем районе 11-ой хромосомы мыши [McKenzie et al, 1993, Willman et al, 1993] В активированных Т-лимфоцитах (субпопуляции ТхО и Тх2) эти гены могут экспрессироваться одновременно [Abbas et al, 1996, Stramck et al, 1997] и в литературе часто встречается выражение «активация экспрессии локуса Тх2 цитокинов» [Ansel et al, 2006, Dean, 2006] Однако есть факты, указывающие на то, что помимо системы инициации экспрессии всех генов данного локуса, существуют регуляторные механизмы, позволяющие адресованно индуцировать экспрессию отдельных генов, в частности, экспрессию гена ИЛ-5 Так, при скрининге аллореактивных Т-клеточных клонов, абсолютное большинство которых продуцировало широкий спектр лимфокинов, были обнаружены клоны, продуцирующие только ИЛ-5 [Warren et al, 1985] При изучении эффекта цитокинов на первичные Т-клетки было показано, что стимуляция лимфоцитов с помощью ИЛ-2 индуцирует синтез мРНК ИЛ-5 и не влияет на экспрессию генов ИЛ-4 и ГМ-КСФ, ближайших соседей ИЛ-5 по локусу 5q31 - хромосомному локусу Тх2 цитокинов [Bohjanen et al, 1990] При работе с Т-клетками периферической крови пациентов, страдающих инфекционно-аллергической формой бронхиальной астмы, установлено, что эти клетки секретируют повышенное количество ИЛ-5, в то время как уровень продукции других лимфокинов остается на низком уровне [Comgan et al, 1992] Таким образом, ген ИЛ-5 далеко не всегда ко-экспрессируется с генами других Тх2 цитокинов Это подразумевает существование селективного контроля экспрессии отдельных генов лимфокинов или, по крайней мере, специфического контроля экспрессии гена ИЛ-5

6.1. Механизм инициации транскрипции гена ИЛ-5 человека

Инициация экспрессии большинства генов лимфокинов, в частности, активация синтеза мРНК не зависит от синтеза белка de novo К этому большинству относятся и гены цитокинов, расположенные в локусе 5q31 Исключением является лишь ген ИЛ-5 В ряде работ было показано, что индукция синтеза мРНК ИЛ-5 в первичных Т-клетках невозможна без синтеза

белка de novo [Van Straaten et al, 1994, Stranick et al, 1995, Naora et al, 1995] - + +

- - +

__Рис 6-1 Влияние CHX на синтез

: '--1 мРНК ИЛ-4, ИЛ-5 и P-actin в

j__i интактных и активированных клетках

I--PER-117 (пояснения в тексте)

1 2 3

Важно отметить, что зависимость инициации экспрессии гена ИЛ-5 от синтеза белка de novo сохранена и в клетках PER-117 Как показано на рис 61, с помощью ОТ-ПЦР не удается обнаружить мРНК ИЛ-5 или ИЛ-4 в интактных клетках PER-117 (дорожка 1) Стимуляция клеток с помощью РМА в комбинации с Cal индуцирует синтез этих мРНК (дорожка 2) Ингибитор белкового синтеза циклогексимид (cycloheximid, CHX) полностью блокирует активацию синтеза мРНК ИЛ-5, но не влияет на синтез мРНК ИЛ-4 (дорожка 3) Не влияет СНХ и на синтез мРНК ИЛ-3, ИЛ-13 и ГМ-КСФ в клетках PER-117 Таким образом, инициация транскрипции гена ИЛ-5 в клетках PER-1I7 и первичных Т-клетках проходит, скорее всего, по сходным сценариям и наша клеточная модель может быть использована для исследования механизмов специфической регуляции экспрессии ИЛ-5

Как упоминалось, CLEO играет исключительно важную роль в активации промотора гена ИЛ-5 (рис 4-2) Следовательно, мы вправе предположить, что именно с этим элементом с наибольшей вероятностью должны взаимодействовать регуляторные белки, участвующие в инициации экспрессии гена ИЛ-5

Экспрессия ИЛ-5 в клетках PER-117 может быть активирована с помощью реагентов, стимулирующих различные сигнальные пути (рис 1-2)

PMA/Cal СНХ ИЛ-5 ИЛ-4 p-actrn

Не исключено, что условия клеточной стимуляции влияют на белковый состав транскрипционного комплекса CLEO. В этом случае наиболее вероятным кандидатом на роль основного активатора транскрипции гена будет фактор, взаимодействие которого с CLEO индуцируется в условиях всех используемых нами вариантов клеточной стимуляции.

При идентификации факторов транскрипции, связывающих CLEO ИЛ-5 человека при различных условиях клеточной активации, было выяснено, что Oct-1-содержащий комплекс является конститутивным и образуется как в реакциях с ядерными белками из нестимулированных клеток, так и при исследовании экстрактов из активированных клеток (рис. 6-2). Следует отметить, что ни один из использованных вариантов клеточной стимуляции не влияет на интенсивность формирования Oct-1-содержащего комплекса.

Стимуляция клеток РМА

РОДсАМР PUA,C«I

РШЦсАШЧСЫ

рмде*»снх

о 2 3 12 и Время в часах

«в

ы

V»

4— Oçtl Apt 4— ОсО

Ос« Ар»

S««f

'ЫШкЁЛШ

Оси Apt Oct!

Oeil Api оса

oat

Рис. 6-2. Влияние условий клеточной стимуляции и СНХ на кинетику формирования комплексов ОьЕОИЛ-5 человека и ядерных белков из культур РЕЯ-117 (авторадиограммы с ядерными экстрактами, полученными из СНХ-обработанных клеток, были переэкспонированы по сравнению с другими авторадиограммами)

Комплекс, содержащий фактор транскрипции АР-1, является индуцибельным. Условия клеточной активации не влияют на субъединичный состав этого комплекса - во всех случаях он состоит из белков .ГипЕ) и Рга-2.

Комплекс, содержащий Oct-2, также является индуцибельным, однако, он формируется не при всех условиях клеточной стимуляции Так, этот комплекс не образуется при РМА/сАМР активированной экспрессии ИЛ-5 (рис 6-2) Таким образом, индуцибельным компонентом транскрипционного комплекса CLEO, присутствующим при всех условиях клеточной стимуляции, является АР-1 Эти данные говорят о ключевой роли данного фактора в регуляции экспрессии гена ИЛ-5

При исследовании кинетики формирования комплекса АР-1 было обнаружено, что интенсивность его образования зависит от условий клеточной стимуляции (рис 6-2) РМА является слабым индуктором взаимодействия CLEO с белками Интенсивность формирования РМА-активированного комплекса АР-1 нарастает медленно и достигает максимума только после 12 часов клеточной стимуляции РМА в комбинации с с AMP индуцирует АР-1 гораздо быстрее - максимум интенсивности формирования комплекса в этом случае приходится на интервал между 6 и 12 часами клеточной стимуляции Затем интенсивность формирования комплекса существенно снижается Комплекс АР-1, индуцированный РМА в комбинации с Cal, достигает максимальной интенсивности после 12 часов клеточной стимуляции и остается на этом уровне, по крайней мере, следующие 6 часов

Существует ли корреляция между кинетикой формирования комплекса АР-1 и экспрессией гена ИЛ-5 в клетках PER-1IV Чтобы ответить на этот вопрос, мы провели денситометрический анализ комплекса АР-1, индуцированного различными комбинациями клеточных стимуляторов, и определили кинетику продукции ИЛ-5 при этих условиях клеточной стимуляции

На основании полученных данных можно заключить, что интенсивность формирования комплекса АР-1 прямо пропорциональна интенсивности продукции ИЛ-5 клетками PER-117 (рис 6-3) Активация клеток с помощью одновременного использования РМА, сАМР и Cal обеспечивает наиболее высокий уровень индукции комплекса АР-1 (рис 6-2) и самый высокий уровень экспрессии ИЛ-5 - более 500 пг/мл после 12 часов клеточной стимуляции

pUACol

iX

t

PUAj'tAUP

7

И

ICC '

«

г « 12 о t « с » t « 12 Время в часах

Рис 6-3 Кинетика продукции ИЛ-5 культурами PER-117 при различных условиях клеточной стимуляции (линии, левая ось) и кинетика формирования комплекса АР-1 CLEO ИЛ-5 человека (столбцы, правая ось) Значения плотности комплекса АР-1 выражены как отношение денситометрических характеристик комплекса АР-1 к денситометрическим данным комплекса Oct-1 CLEO ИЛ-5

СНХ полностью подавляет образование комплексов АР-1 и Oct-2 (рис 6-2), что указывает на зависимость их образования от синтеза белка de novo Однако, в отличие от АР-1, формирование Oct-2 содержащего комплекса CLEO не коррелирует с экспрессией ИЛ-5 в клетках PER-117 Продукция ИЛ-5 регистрируется еще до появления этого комплекса Следовательно, ведущую роль в инициации транскрипции гена ИЛ-5 играют, вероятно, белки, входящие в комплекс АР-1

Проверка этого предположения была начата с исследования влияния клеточной активации на синтез белков, взаимодействующих с CLEO ИЛ-5 Как показано на рис 6-4, ядерные белки из интактных и активированных в различных условиях клеток, содержат Oct-1 Первые 12 часов клеточная активация не влияет на уровень содержания Oct-1, однако, затем содержание этого фактора снижается (дорожки 1-13)

Белки Jun D и Fra-2 не были обнаружены в ядрах интактных клеток Все использованные варианты клеточной активации индуцируют появление этих факторов в составе ядерных белков Однако сигнал Fra-2 регистрируется только после 6 часов клеточной стимуляции (рис 6-4, дорожки 3, 7 и 11), в то

время как сигнал Jun D появляется уже после 2 часов стимуляции (дорожки 2, 6 и 10). Cal и с AMP усиливают РМА-индуцированный синтез Fra-2 (сравните дорожки 3-5, 7-9 и 11-13) и не влияют на синтез Jun D.

Стимуляция клеток

Время (часы}

Octl

PMA

PMA+CAMP PMA + Cal

в г 6 tí f8 3 в Ii »8 2 в 12 18

Fra2

JunD

0«2

-116K - MK

62 К 5t К

зек

51 К зек

84К

вгк

Рис. 6-4. Влияние клеточной активации на кинетику синтеза белков, взаимодействующих с CLEO ИЛ-5 человека. Пояснения в тексте

Oct-2 присутствует в ядрах интактных клеток. Клеточная стимуляция с использованием только РМА или РМА в комбинации с Cal ведёт к увеличению содержания этого фактора в составе ядерных белков (рис. 6-4, дорожки 1-5 и 10-13). Важно отметить, что Cal существенно усиливает действие РМА. Интересно, что сАМР таким эффектом не обладает. Первые 12 часов клеточная стимуляция с помощью РМА в комбинации с сАМР не влияет на содержание Oct-2 в ядрах клеток PER-117. К 18-ти часам в ядерных фракциях, полученных из этих культур, содержание Oct-2 снижается.

На основании полученных данных можно заключить, что в результате активации клеток PER-117, независимо от условий стимуляции, происходит инициация синтеза de novo АР-1-формирующих белков Jun D и Fra-2. Эти данные хорошо согласуются с результатами исследования формирования активного ДНК-белкового комплекса CLEO, обеспечивающего транскрипцию гена ИЛ-5 (рис. 6-2). Таким образом, результаты проведённых экспериментов указывают на ключевую роль Jun D и Fra-2 в механизме зависимости экспрессии гена ИЛ-5 от синтеза белка de novo. Действительно, остальные участники ДНК-белкового комплекса CLEO ИЛ-5, факторы транскрипции Oct-1 и Oct-2, постоянно присутствуют в адрах клеток PER-117. После 12 часов стимуляции клеток, содержание Oct-1 снижается. Эффект клеточной активации на синтез Oct-2 зависит от условий стимуляции. Активация с

помощью только PMA или PMA в комбинации с Cal усиливает синтез этого белка, в то время как стимуляция РМА в комбинации с сАМР приводит к снижению содержания Oct-2 Эти факты указывают на то, что механизм зависимости экспрессии гена ИЛ-5 от синтеза белка de novo не связан с продукцией факторов Oct-1 и Oct-2

Суммируя вышеизложенное, можно утверждать, что в значительной мере, если не полностью, механизм зависимости активации экспрессии гена ИЛ-5 от синтеза белка de novo базируется на зависимости инициации транскрипции гена от синтеза de novo субъединиц CLEO ИЛ-5 связывающего фактора АР-1 Несомненно, что этот механизм представляет собой весьма важный, но далеко не единственный уровень контроля инициации экспрессии гена ИЛ-5 Вполне вероятно, что очередной уровень системы контроля может опираться на механизмы регуляции экспрессии генов Jun D и Fra-2 Каков индивидуальный вклад механизмов регуляции экспрессии каждого из этих генов в систему контроля инициации экспрессии гена ИЛ-5?

Чтобы ответить на этот вопрос мы провели исследование синтеза мРНК Jun D и Fra-2 в клетках PER-117 Как видно на рис 6-5, интактные клетки PER-117 содержат мРНК Jun D и не содержат мРНК Fra-2 (дорожка 1) Клеточная стимуляция с помощью РМА в комбинации с Cal инициирует синтез мРНК Fra-2 и усиливает синтез мРНК Jun D (дорожка 2) Эти данные говорят о конститутивном характере экспрессии гена Jun D и индуцибельном Fra-2

Рис 6-5 Влияние двухчасовой стимуляции с помощью РМА в комбинации с Cal на синтез мРНК Jun D и Fra-2 в клетках PER-117

Итак, данные экспериментов по исследованию синтеза мРНК и белков Jun D и Fra-2 позволяют представить следующую схему инициации транскрипции гена ИЛ-5 В результате клеточной стимуляции происходит активация экспрессии гена Fra-2 и трансляции мРНК Jun D Вероятно, нестимулированные клетки содержат значительное количество мРНК Jun D,

PMA/Cal - + Fra-2 I Ч

1 2

что приводит к наработке в активированных клетках избыточного количества белка, необходимого для сборки CLEO ИЛ-5 связывающего фактора АР-1.

Для проверки этого предположения мы провели ингибиторный анализ экспрессии репортёрной конструкции -509/+44, несущей ген люциферазы под контролем промотора гена ИЛ-5 человека, с использованием антисмысловых РНК Fra-2 и Jun D. Источником антисмысловых РНК служили плазмиды, несущие фрагменты кДНК Fra-2 и Jun D в обратной ориентации, pSI-aFra-2 и pSI-aJun D. Эти конструкции были выполнены на основе экспрессионного вектора pSI, использованного при проведении ингибиторного анализа в качестве контрольной плазмиды.

Нестимулированные PMA РМА|сАМР PMA/Cal

клетки

Рис. 6-6. Влияние антисмысловых РНК Рга-2 и Зип Б на активность промотора гена ИЛ-5 человека (кратности индукции определена относительно уровня активности люциферазы в нестимулированных клетках, трансфицированных репортёрной плазмидой и вектором рЭ!)

Как показано на рис. 6-6, в результате экспрессии конструкции, кодирующей антисмысловую последовательность к мРНК Рга-2, активность люциферазы существенно снижается по сравнению с уровнем люциферазы в лизатах клеток, трансфицированных контрольным вектором. При экспрессии конструкции, кодирующей антисмысловую последовательность к мРНК Зип Б, такого эффекта не наблюдалось. Эти результаты поддерживают

предположение об избыточном содержании мРНК Jun D в активированных Т-клетках и еще раз свидетельствуют о том, что белком, регулирующим интенсивность формирования комплекса АР-1, и, соответственно, уровень экспрессии гена ИЛ-5 является Fra-2

Результаты исследований, изложенные в данном разделе, позволяют утверждать, что ключевым транскрипционным фактором, контролирующим инициацию экспрессии гена ИЛ-5 человека, является АР-1 Действительно, данные экспериментов по изучению кинетики взаимодействия CLEO с ядерными белками и влияния условий клеточной стимуляции на это взаимодействие демонстрируют, что именно АР-1-содержащий комплекс формируется первым, независимо от условий активации клеток Более того, существует прямая корреляция между кинетикой формирования комплекса АР-1 и активностью экспрессии гена ИЛ-5 в клетках PER-117 Таким образом, можно заключить, что АР-1 контролирует не только инициацию транскрипции гена, но и уровень ее активности Следовательно, существует прямая зависимость между условиями клеточной стимуляции, определяющими активность экспрессии гена ИЛ-5, и интенсивностью синтеза, по крайней мере, одной из субъединиц АР-1

Нам удалось показать, что такой субъединицей является Fra-2 Cal и сАМР усиливают PMA-индуцированный синтез Fra-2 и не влияют на синтез Jun D Интересно, что индукция экспрессии гена Fra-2 полностью зависит от клеточной стимуляции - интактные клетки PER-117 не содержат мРНК Fra-2 Здесь уместно вспомнить, что активация экспрессии гена ИЛ-5 невозможна без синтеза белка de nova Это ставит ген ИЛ-5 в особое положение по сравнению с другими генами цитокинов и позволяет говорить о существовании уникальной системы запуска экспрессии ИЛ-5 Согласно нашим данным такая уникальная система базируется на жестком контроле инициации транскрипции ИЛ-5 Жесткость заключается в том, что клеточная активация инициирует экспрессию Fra-2, который в свою очередь запускает экспрессию ИЛ-5 Роль Fra-2 как фактора, лимитирующего как инициацию, так и уровень активности экспрессии гена ИЛ-5 была подтверждена в экспериментах с использованием антисмысловых РНК Fra-2 и Jun D

Следует отметить, что полученные данные могут иметь существенное значение не только при планировании дальнейших академических

исследований регуляции экспрессии гена ИЛ-5, но и при проведении прикладных работ, направленных на создание нового поколения фармакологических препаратов для лечения астмы и других аллергических заболеваний, сопровождающихся эозинофилией

6.2. Механизм подавления экспрессии гена ИЛ-5 человека дексаметазоном

В настоящее время для лечения астмы и других аллергических заболеваний, сопровождающихся эозинофилией, активно используются синтетические глюкокортикоиды, в частности, дексаметазон В результате применения этих препаратов у пациентов понижается содержание ИЛ-5 в легких и периферической крови [Charlesworth et al, 1991, Greenfeder et al, 2001] В бронхиально-альвеолярных смывах снижается также и количество Т-клеток, экспрессирующих мРНК ИЛ-5 [Robinson et al, 1993] Однако, несмотря на широкое использование глюкокортикоидов при лечении аллергических заболеваний, механизмы, лежащие в основе действия этих препаратов на экспрессию гена ИЛ-5, изучены далеко не полностью

Известно, что дексаметазон обладает способностью активировать механизмы, понижающие эффективность экспрессии генов цитокинов на транскрипционном, посттранскрипционном и даже посттрансляционном уровнях [Peppel et al, 1991, Adcock et al, 2001] He исключено, что эффект дексаметазона на продукцию ИЛ-5 является результатом суммарного действия всех перечисленных механизмов Однако регуляция экспрессии гена ИЛ-5 происходит на транскрипционном уровне, поэтому вероятнее всего, что основными мишенями дексаметазона в случае ИЛ-5 является именно механизмы транскрипции

Глюкокортикоиды регулируют транскрипцию генов как с использованием механизма прямого воздействия на промоторную активность гена-мишени, так и опосредовано, активируя экспрессию белка, обладающего свойствами транскрипционного регулятора гена-мишени Происходит это следующим образом после проникновения в клетку глюкокортикоиды образуют комплекс с цитоплазматическим глюкокортикоидным рецептором (ГР) Этот комплекс, который чаще называют активированный ГР, перемещается в ядро, где он действует уже как фактор транскрипции Промоторы ряда генов содержат регуляторные элементы, при взаимодействии

с которыми активированный ГР способен инициировать, усиливать или подавлять транскрипцию этих генов [Hayashi et al, 2004, Barnes, 2006]

Необходимо отметить, что согласно проведенному нами и другими авторами компьютерному анализу последовательности гена ИЛ-5 человека, его регуляторные области не содержат элементов, связывающих активированный ГР Следовательно, весьма маловероятно, что эффект глюкокортикоидов, в частности, дексаметазона на экспрессию ИЛ-5 достигается в результате прямого взаимодействия активированного ГР с промотором гена Скорее всего ингибирующее действие дексаметазона на транскрипцию ИЛ-5 осуществляется либо с помощью белка репрессора, экспрессия которого инициирована или усилена этим глюкокортикоидом в активированных Т-клетках, либо в результате подавления активированным ГР экспрессии факторов, обеспечивающих транскрипцию ИЛ-5

В задачи данного этапа нашей работы входили идентификация регуляторных элементов гена ИЛ-5 человека, активность которых подавляется дексаметазоном, и исследование механизма этого подавления В частности, наше внимание было сфокусировано на решении вопроса о том, является ли эффект дексаметазона следствием прямого действия глюкокортикоида на факторы, участвующие в активации транскрипции ИЛ-5, или в данном случае задействованы белки-посредники, ингибирующие взаимодействие факторов транскрипции и регуляторных элементов гена

Для определения участка промотора, содержащего дексаметазон-чувствительные регуляторные элементы гена ИЛ-5, были использованы репортерные конструкции, экспрессирующие люциферазу под контролем различных по размеру фрагментов промотора гена ИЛ-5 человека Репортерные конструкции транфицировали в клетки PER-117, часть клеток обрабатывали дексаметазоном Обработанные глюкокортикоидом и контрольные культуры активировали различными комбинациями клеточных стимуляторов и после 16-ти часовой инкубации в стандартных условиях определяли в них уровень активности люциферазы

В результате проведения этой серии экспериментов было установлено, эффект дексаметазона на экспрессию конструкций, содержащих первые 2000, 1300, 509 и 60 (конструкция CLE0/TATA) п о промотора гена ИЛ-5 зависит от условий клеточной активации Дексаметазон практически полностью подавляет экспрессию репортерного гена в клетках, активированных РМА или

PMA в комбинации с с AMP и aCD28. В культурах же, стимулированных РМА в комбинации с Cal, дексаметазон не влияет на активность экспрессии этого гена (рис. 6-7). Эти данные согласуются с результатами, полученными при определении чувствительности экспрессии гена ИЛ-5 к действию дексаметазона в первичных Т-лимфоцитах человека и клетках PER-117 (раздел 1 ) и ещё раз указывают на то, что в определённых условиях клеточной активации дексаметазон не влияет на активность промотора гена ИЛ-5 человека.

ib

lb

PMA Cal

PMA PMA CAMP aCD28

140 120 100 80

«0 «

20 0

1300 ПН

4

A

PMA Cal

PMA

CAMP

PMA

a€D28

100 Г

so

60

40

X w П

5 20

il

sa-

it PMA

PMA PMA PMA Cal CAMP tiCD28

CLE0/TATA

£ 3CÛ0

s

S кяо

Wr

PMA

PMA/Cal

Рис. 6-7. Активность люциферазы в культурах PER-117, трансфицированных конструкциями, содержащими первые 2000 (А), 1300 (Б), 509 (В) и 60 (Г, конструкция CLE0/TATA) п.о. промотора гена ИЛ-5 человека. Обозначения: К -нестимулированные культуры; PMA, PMA/Cal и т.д. - стимуляция различными комбинациями клеточных активаторов; белые столбцы - без дексаметазона; заштрихованные столбцы - обработка дексаметазоном

Поскольку дексаметазон обладал практически одинаковым эффектом на экспрессию репортёрных конструкций, использованных в данных экспериментах, можно заключить, что мишенью дексаметазона в контексте

промотора гена ИЛ-5 является CLEO, регуляторный элемент, обеспечивающий экспрессию минимальной плазмиды CLE0/TATA.

При проведении данной работы было показано, что CLEO выполняет функции ключевого регуляторного элемента промотора гена ИЛ-5 человека (раздел 4). Не исключено, что механизм подавления экспрессии гена ИЛ-5 дексаметазоном может включать ингибирование формирования транскрипционного комплекса CLEO. В ходе экспериментальной работы было выяснено, что аналогично действию дексаметазона на продукцию ИЛ-5, синтез мРНК этого цитокина и активность ИЛ-5 промотора в составе репортёрных плазмид, эффект этого глюкокортикоида на формирование белковых комплексов CLEO зависит от условий клеточной активации. Нарушения взаимодействия CLEO и факторов транскрипции возникают в клетках, стимулированных РМА или РМА в комбинации с сАМР и aCD28, в то время как в PMA/Cal активированных культурах дексаметазон не оказывает влияния на ДНК связывающую активность CLEO (рис. 6-8).

Рис. 6-8. Влияние дексаметазона (Деке) на белоксвязывающую активность элемента CLEO ИЛ-5 человека (авторадиограммы с ядерными экстрактами, полученными из РМА/сАМР-стимулированных клеток, были переэкспонированы по сравнению с другими авторадиограммами)

На основании представленных выше данных можно предположить, что чувствительность или устойчивость транскрипции гена ИЛ-5 к действию дексаметазона зависит от спектра веществ, синтез которых индуцирует этот глюкокортикоид в клетках при различных условиях клеточной активации. Вполне возможно, что в реализации репрессорного механизма важную роль играет белок (или белки), синтез которого успешно проходит в РМА, РМА/сАМР и PMA/aCD28 стимулированных культурах. В отличие от этого, клеточная активация с помощью РМА в комбинации с Cal отменяет глюкокортикоидзависимый синтез белка, подавляющего транскрипцию гена

ИЛ-5, или экспрессия такого белка в PMA/Cal стимулированных культурах значительно понижена. В подобных условиях механизм подавления экспрессии гена ИЛ-5 эффективно реализоваться не может.

Ранее было показано, что в Т-клетках дексаметазон индуцирует экспрессию белка GILZ [D'Adamio et al., 1997]. Интересно, что GILZ обладает способностью взаимодействовать с фактором транскрипции АР-1. Предполагается, что в основе дексаметазонзависимого механизма подавления TCR-индуцированной экспрессии генов ИЛ-2 и рецептора ИЛ-2 лежит прямое взаимодействие GILZ с АР-1. В результате этого взаимодействия АР-1 теряет свою ДНК-связывающую и, как следствие, регуляторную активность [Mittelstadt et al., 2001]. Эти факты позволяют предположить, что в основе дексаметазонзависимого механизма подавления транскрипции гена ИЛ-5 также лежит прямое взаимодействие GILZ с АР-1.

Проверку данного предположения мы начали с исследования возможности индукции синтеза мРНК GILZ в клетках PER-117. Установлено, что синтез этой мРНК происходит только в обработанных дексаметазоном культурах, стимулированных РМА или РМА в комбинации с с AMP и aCD28. В нестимулированных клетках или культурах, обработанных дексаметазоном и активированных РМА в комбинации с Cal, обнаружить мРНК GILZ не удаётся (рис. 6-9). Таким образом, условия индукции мРНК GILZ дексаметазоном совпадают с условиями, при которых экспрессия гена ИЛ-5 чувствительна к действию этого глюкокортикоида. Использование Cal в качестве ко-активатора приводит к блокаде PMA-индуцированного синтеза мРНК GILZ.

РМА

CAMP

Cal

aCD28 Деке

t i +

4-

+ * i i

+ + + +

GILZ

GÄPDH

Рис. 6-9. Влияние

дексаметазона

(Деке) на синтез

мРНК GILZ в

культурах PER-117,

стимулированных

различными

комбинациями

клеточных

активаторов

Полученные данные указывают на прямую корреляцию между синтезом мРНК 011^ и эффектом дексаметазона на экспрессию гена ИЛ-5, что косвенно подтверждает предположение о возможном участии белка в реализации дексаметазонзависимого механизма подавления транскрипции ИЛ-5.

Для того чтобы получить прямые свидетельства влияния 01Ь2 на активность промотора гена ИЛ-5, мы использовали репортёрный анализ в комбинации с эктопической экспрессией данного белка. В результате были получены данные, демонстрирующие, что в РМА/сАМР-стимулированных клетках РЕК-117 подавляет активность промотора гена ИЛ-5 (рис. 6-10). Аналогичные результаты получены и при проведении экспериментов с использованием РМА/аС028-стимулированных клеток.

*f

I?

= х

É I»

о а

8 а.

-509/+44

il

т

i

□ pcDNA3.1

:_ pcDNA31-GILZ

pcDNÂ3.1-LacZ

Рис. 6-10. Влияния СТЬ2 на экспрессию репортёрных конструкций, содержащих первые 509 (А, плазмида -509/+44) и 60 (Б, плазмида СЬЕО/ТАТА) п.о. промотора гена ИЛ-5 человека в нестимулированных (Н/клетки) и РМА/сАМР-активированных культурах РЕЯ-117. Для эктопической продукции 01ЬХ использована конструкция рсБКАЗЛ-СТЬг, содержащая кДНК СТЬг. В контрольных экспериментах данная конструкция была заменена на плазмиду рсВКА3.1-Ьас2, содержащую кДНК и базовый вектор рсБКАЗЛ

Следует отметить, что ингибирующий эффект GILZ на экспрессию конструкции -509/+44 практически не отличается от эффекта этого белка на активность конструкции CLE0/TATA. Это подтверждает данные, полученные в экспериментах по определению мишени дексаметазона в контексте промотора гена ИЛ-5, и указывает на то, что GILZ полностью блокирует активность CLE0.

Роль GILZ как ингибитора активности CLEO ИЛ-5 была подтверждена с помощью экспрессии репортёрной конструкции CLE0/TATA в PMA/Cal-стимулированных клетках PER-117. Как упоминалось выше, в этих условиях клеточной активации дексаметазон не индуцирует экспрессию гена GILZ и, очевидно, как следствие, не влияет на экспрессию репортёрных плазмид в клетках PER-117. Однако избыточная продукция GILZ ингибирует активность конструкции CLE0/TATA в РМА/Са1-стимулированных клетках PER-117 (рис. 6-11). Таким образом, в условиях блокады экспрессии гена GILZ с помощью Cal эктопическая продукция этого белка приводит к подавлению активности CLEO ИЛ-5.

Рис. 6-11. Влияния GILZ на экспрессию репортёрной конструкции CLE0/TATA в нестимулированных и РМА/Са1-активированных культурах PER-117. Пояснения к обозначению экспрессионных конструкций в подписи рис. 6-10

Ещё одно доказательство того, что подавление активности CLEO ИЛ-5 является следствием именно эктопической продукции GILZ, было получено в экспериментах с использованием культуры клеток Jurkat. Дело в том, что эти клетки не содержат функционально активный глюкокортикоидный рецептор [Northrop et al., 1992]. Следовательно, в культуре Jurkat дексаметазон не может инициировать активность какого-либо механизма, модифицирующего транскрипцию генов. Действительно, обработка клеток Jurkat дексаметазоном при любых условиях клеточной стимуляции не влияет на активность экспрессии репортёрных конструкций, использованных в данном исследовании (рис. 6-12А). Однако эктопическая продукция белка GILZ ингибирует активность конструкции CLE0/TATA в PMA/Cal-стимулированных клетках Jurkat (рис. 6-12Б). Аналогичные результаты получены для РМА/сАМР- и РМА/аС028-стимулированных клеток Jurkat.

#

s

z¡ й

e;

í

5000- Ш PCDNA3.1 И pcDNA3.1-GILZ I

4000- йШР

3000- g¡¡ щрйр м/УШшУ.

2000- УУШЩЩ- /:■■■/■■//' ^////У/Ш/1,

1000-

0- I IWIMII III .... ......

Нестимулированные

Данные результаты ещё раз указывают на то, что GILZ обладает способностью подавлять транскрипцию гена ИЛ-5, в частности, ингибировать активность CLEO, ключевого регуляторного элемента промотора.

А

Б

2 30

29

I

20

0

15

10

5

0

"ПГ

Контроль Деке

pcONA3.1 PCDNA3.1-GLZ

Рис. 6-12А. Влияния дексаметазона на экспрессию конструкции CLE0/TATA в РМА/сАМР-стимулированных культурах Jurkat. Б. Влияния GILZ на экспрессию конструкции CLE0/TATA в РМА/Са1-стимулированных культурах Jurkat. Пояснения к обозначению экспрессионных конструкций в подписи рис. 6-10

Вполне вероятно, что в основе этого эффекта лежит прямое взаимодействие GILZ с фактором транскрипции АР-1. В результате GILZ подавляет ДНК-связывающую активность АР-1, происходит нарушение образования ДНК-белковых комплексов CLEO и, как следствие, блокируется активность промотора.

Для проверки данного предположения мы исследовали влияние белка GILZ, наработанного в клетках COS-7, на формирование ДНК-белковых комплексов CLEO ИЛ-5. Как показано на рис. 6-13, GILZ подавляет образование CLEO-белковых комплексов, причём эффективность действия GILZ находится в прямо пропорциональной зависимости от количества этого белка в реакциях связывания.

CLE0O + + + + + + Экстракт + + + + +

GILZ

+ + ++ +++ ++++

Рис. 6-13. Влияния белка GILZ на взаимодействие CLEO и ядерных экстрактов из РМА/сАМР-активированных клеток PER-117: в реакциях связывания использованы нарастающие количества GILZ

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о том, что GILZ препятствует взаимодействию ядерных белков и CLEO ИЛ-5 Эти данные хорошо согласуются с результатами исследований, изложенными в других разделах, и позволяют заключить, что механизм подавления транскрипции ИЛ-5 дексаметазоном заключается в следующем В определенных условиях клеточной активации глюкокортикоид инициирует в клетках экспрессию GILZ Этот белок ингибирует активность CLEO, что и приводит к подавлению транскрипции гена Ингибирование активности CLEO происходит, скорее всего, в результате взаимодействия GILZ и АР-1, однако, для окончательных выводов требуется дополнительная экспериментальная работа

ВЫВОДЫ

Полученные при выполнении настоящей работы данные позволяют реконструировать систему организации регуляторных районов и механизмы регуляции транскрипции генов ИЛ-5 человека и мыши Они способствуют дальнейшему развитию представлений о структурно-функциональной организации регуляторных районов генов лимфоцитарных цитокинов, общих и ген-специфических механизмах контроля их экспрессии, а также укрепляют экспериментальную базу исследования этих механизмов Вышесказанное мотивируются следующими конкретными выводами

1 Предложена новая клеточная модель для изучения механизмов активации и регуляции экспрессии генов ИЛ-5 и ИЛ-4 человека -перевиваемая линия Т-клеток человека PER-117 Адекватность модели доказана экспериментально

• Показано, что характер инициации транскрипции генов ИЛ-5 и ИЛ-4 в клетках PER-117 не отличается от характера инициации транскрипции этих генов в Т-лимфоцитах, полученных из периферической крови здоровых доноров

• Установлено, что механизмы регуляции транскрипции гена ИЛ-5 в клетках PER-117 совпадают с механизмами регуляции транскрипции этого гена в первичных Т-лимфоцитах человека

• Продемонстрировано, что характер продукции ИЛ-5 в клетках PER-117 не отличается от характера продукции этого белка в первичных Т-лимфоцитах человека

2 Проведено структурно-функциональное картирование промотора гена ИЛ-5 человека

• Показано, что регуляторный элемент CLEO контролирует инициацию транскрипции гена

• Обнаружены новые уникальные элементы - РЭ1 и РЭ2, обладающие свойствами репрессоров индуцированной активности промотора

3 Впервые идентифицированы ключевые белки, регулирующие транскрипцию гена ИЛ-5 человека, и установлен механизм инициации и регуляции транскрипции гена

• Показано, что основным фактором, контролирующим запуск транскрипции, является белок Fra-2, входящий в состав CLEO-связывающего комплекса АР-1

• Предложена модель инициации и регуляции транскрипции гена ИЛ-5 человека

4 Впервые показано, что фактор транскрипции GATA-3 непосредственно участвует в регуляции активности промоторов генов ИЛ-5 и ИЛ-4 человека

• В составе промоторов генов ИЛ-5 и ИЛ-4 человека обнаружены новые элементы GATA, действующие как репрессоры базальной и индуцированной транскрипции

• Установлено, что все функционально активные элементы GATA промоторов генов ИЛ-5 и ИЛ-4 человека взаимодействуют с фактором GATA-3 Таким образом, этот белок взаимодействует как с регуляторными элементами, участвующими в активации транскрипции, так и с элементами, действующими как репрессоры транскрипции

• Предложена модель регуляции транскрипции, в которой GATA-3 рассматривается как архитектурный фактор, обеспечивающий функционально активную пространственную структуру промоторов генов ИЛ-5 и ИЛ-4 человека

5 Впервые показано, что механизм подавления транскрипции гена ИЛ-5 человека дексаметазоном связан с экспрессией глюкокортикоид-индуцируемого гена GILZ Установлено, что мишенью белка GILZ в контексте промотора гена ИЛ-5 является ключевой регуляторный элемент CLEO

6 Впервые проведено структурно-функциональное картирование 3'-нетранслируемой области гена ИЛ-5 мыши Идентифицированы белки, входящие в состав транскрипционных комплексов, участвующих в регуляции экспрессии гена ИЛ-5 мыши В результате обнаружены существенные различия в организации регуляторных районов и составе факторов транскрипции, регулирующих транскрипцию генов ИЛ-5 мыши и человека

• В З'-нетранслируемой области гена ИЛ-5 мыши найден новый позитивный регуляторный элемент, не имеющий аналогов в гене ИЛ-5 человека

• Регуляторные элементы мРЭ1 и мРЭ2 гена ИЛ-5 мыши, аналоги которых в гене человека участвуют в подавлении индуцированной активности промотора, в составе промотора гена мыши действуют как активаторы транскрипции

• Обнаружены существенные различия в составе белковых комплексов, регулирующих активность элементов CLEO, РЭ1 и РЭ2 генов ИЛ-5 мыши и человека

7 Найденные различия в структурно-функциональной организации регуляторных районов и в составе транскрипционных белковых комплексов указывают на то, что механизмы регуляции экспрессии генов ИЛ-5 мыши и человека, по крайней мере, не идентичны Таким образом, экспериментальные данные, полученные при исследовании регуляции экспрессии гена ИЛ-5 мыши, не могут адекватно отражать механизмы регуляции экспрессии ИЛ-5 человека и результаты, полученные при использовании гетерологичных систем (клеточные линии мыши - ген человека) должны быть интерпретированы с большой осторожностью

СПИСОК СТАТЕЙ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 Karlea S . Mordvinov V A and Sanderson C J (1996) How is expression of the interleukin-5 gene regulated' Immunol Cell Biol 74 218-223

2 Karlen S , De Boer M , Lipscombe R J , Lutz W , Mordvinov V A and C I Sanderson (1998) Biological and molecular characteristics of interleukin-5 and its receptor Int Rev Immun 16 227-247

3 Schwenger GTF, Mordvinov VA. Karlen S and Sanderson CJ (1998) Identification of two palindromic regulatory elements (mPREl-IL5 and mPRE2-IL5) in the murine interleukm-5 promoter Molecular Immunology 35 149-158

4 De Boer M L , Mordvinov V A . Thomas M A and Sanderson C J (1999) Role of nuclear factor of activated T cells (NFAT) m the expression of interleukin-5 and other cytokines involved m the regulation of hemopoetic cells Int J Biochem Cell Biol 31, no 10 1221-1236

5 Mordvinov V A . Peroni S E , De Boer M L , Kees U R and Sanderson C J (1999) A human T-cell line with inducible production of interleukins 5 and 4 A model for studies of gene expression J Immunol Methods 228, no 1-2 163-168

6 Mordvinov V A . Schwenger GTF, Fournier R, De Boer M L , Peroni S E , Singh A D , Karlen S , Holland J W and Sanderson C J (1999) Binding of YY1 and Octl to a novel element that downregulates expression of IL-5 in human T cells J Allergy Clin Immunol 103, no 6.1125-1135

7 Sanderson C J , De Boer M , Senna-Salerno M , Schwenger GTF, Thomas M , Mordvinov V A and Karlen S (1999) Regulation of interleukin-5 gene expression In Interleukin-5 From Molecule to Drug Target for Asthma (ed C J Sanderson) Marcel Dekker, New York, p 267-287

8 Schwenger G T , Fournier R , Hall L M , Sanderson C J and Mordvinov V A (1999) Nuclear factor of activated T cells and YY1 combine to repress IL-5 expression in a human T-cell line J Allergy Clin Immunol 104, no 4 Pt 1 820827

9 Thomas M A , Mordvinov V A and Sanderson C J (1999) The activity of the human mterleukin-5 conserved lymphokine element 0 is regulated by octamer factors in human cells Eur J Biochem 265, no 1 300-307

10 Sanderson C J , Mordvinov V A . Schwenger GTF, Thomas M , Fournier R, De Boer M (1999) Key regulatory elements in the control of IL-5 transcription Short papers of Eosinophil 1999, The Biology of the Eosinophil, p 54

11 Schwenger G T F , Mordvinov V A , Fournier R, Czabotar P , Peroni S , Sanderson С J IL-5 In Oppenheim J A Compendium of Cytokines and Other Mediators of Host Defense Academic Press 2000, v l,p 307-341

12 Schwenger G T F , Mordvinov V A . Fournier R , Czabotar P , Peroni S and Sanderson С J (2000) Interleikin-5 In Academic Press Cytokine Reference Database DOI 10 1006/rwcy 2000 0902

13 Senna-Salemo M. Mordvinov V A and Sanderson. С J (2000) Binding of octamer factors to a novel 3'-positive regulatory element in the mouse interleukin-5 gene J Biol Chem 275, no 6 4525-4531

14 Mordvinov VA and Sanderson С J (2001) Regulation of Interleukm-5 expression Archivum Immunologiae et Therapiae Experimentalts 49 345-351

15 Senna-Salerno M, Schwenger GTF, Sanderson С J and Mordvinov V A (2001) Binding of octamer factors to the murine interleukin-5 conserved lymphokine element 0 in primary T-cells and a T-cell line Cytokine 15, no 1 4-9

16 Schwenger GTF, Fournier R , Кок С С , Mordvinov V A . Yeoman D and Sanderson С J (2001) GATA-3 has dual regulatory functions m human mterleukin-5 transcription J Biol Chem 276, no 51 48502-9

17 Schwenger GTF, Кок С С, Arthanmgtyas E , Thomas M A , Sanderson С J, Mordvinov V A (2002) Specific activation of human interleukm-5 depends on de novo synthesis of an AP-1 complex J Biol Chem 211, no 49 47022-7

18 Швенгер Г T Ф. Мордвинов В А . Сандерсон К Дж Фактор транскрипции GATA-3 участвует в подавлении активности промотора гена интерлейкина-4 человека Биохимия 2005, т 70, с 1289-1294

19 Мордвинов В А. Кок Ч Ч, Артанингтяс Э , Швенгер Г Т Ф , Кристоу А, Сандерсон К Дж Дексаметазон подавляет активность промотора гена интерлейкина-5 человека Бюллетень экспериментальной биологии и медицины 2005, т 140, стр 91-95

20 Arthanmgtyas Е , Кок С С , Mordvinov V А . Sanderson С J (2005) The conserved lymphokine element 0 is a powerful activator and target for corticosteroid inhibition m human interleukin-5 transcription Growth Factors 23, no 3 211-21

Подписано в печать 05 05 2008г Формат бумаги 60x84 1\16

Бумага офсетная Печать офсетная Уел печл 3,13

Тираж 115 экз Заказ № 81 Отпечатано в ООО « Омега Принт»,г Новосибирск, пр Лаврентьева,6