Структурно-функциональная организация регуляторных районов и механизмы транскрипции генов интерлейкина-5 человека и мыши

Мордвинов, Вячеслав Алексеевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Структурно-функциональная организация регуляторных районов и механизмы транскрипции генов интерлейкина-5 человека и мыши
ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Структурно-функциональная организация регуляторных районов и механизмы транскрипции генов интерлейкина-5 человека и мыши"

003467049

На правах рукописи

МОРДВИНОВ ВЯЧЕСЛАВ АЛЕКСЕЕВИЧ

СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ РЕГУЛЯТОРНЫХ РАЙОНОВ И МЕХАНИЗМЫ ТРАНСКРИПЦИИ ГЕНОВ ИНТЕРЛЕЙКИНА-5 ЧЕЛОВЕКА И МЫШИ

03.00.03 - молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Кольцово - 2009

003467049

Работа выполнена в Институте цитологии и генетики Сибирского отделения Российской академии наук (г. Новосибирск), университете Западной Австралии (the University of Western Australia, Perth) и Технологическом университете Перта (Curtin University of Technology, Perth,'Western Australia)

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор Эрнст Георгиевич Малыгин доктор медицинских наук, профессор Сергей Витальевич Сенников доктор биологических наук, профессор Людмила Фёдоровна Гуляева

Ведущая организация".

Институт химической биологии и фундаментальной медицины Сибирского отделения Российской академии наук, г. Новосибирск

Защита диссертации состоитаР^^' ^2009 года в № часов на заседании диссертационного совета Д.208.020.01 при Федеральном государственном учреждении науки «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Роспотребнадзора по адресу: ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора, Кольцово Новосибирской области, 630559; тел. (383) 336-74-28

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» Автореферат разослан /К уШ/^! 2009 года

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук

J1. И. Карпенко

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования

Согласно современным представлениям, основные события, определяющие временные и количественные характеристики экспрессии генов, происходят на уровне транскрипции. Транскрипцию генов контролируют регуляторные белки — транскрипционные факторы (ТФ), опознающие определенные последовательности ДНК. Такие последовательности - сайты связывания ТФ - представляют собой регуляторные элементы, формирующие регуляторные области генов. Инициация транскрипции и её реализация зависят от взаимодействия ТФ с регуляторными элементами. Таким образом, набор регуляторных элементов генов программирует их экспрессию в онтогенезе, определяет тканеспецифичность экспрессии, а также способность отвечать на сигналы внешней и внутренней среды. В связи с этим исключительно важное значение имеют исследования, направленные на выявление отдельных регуляторных элементов в различных генах, изучение их свойств и идентификацию ТФ, взаимодействующих с данными элементами. Результаты таких структурно-функциональных исследований позволяют перейти к изучению общих и ген-специфических механизмов регуляции транскрипции и создают базу для решения других актуальных задач молекулярной биологии - выяснению принципов организации регуляторной зоны гена и раскрытию механизмов, обеспечивающих реализацию информации, заложенной в последовательностях ДНК этой зоны.

Интерлейкин-5 (ИЛ-5) - гомодимерный гликопротеин, секретируемый в основном активированными Т-лимфоцитами [Schwenger et al., 2000]. Впервые он был описан как фактор дифференцировки эозинофилов [Sanderson et al., 1985]. Впоследствии было показано, что ИЛ-5 регулирует продукцию эозинофилов, контролирует их дифференцировку, миграцию, активацию и продолжительность жизни in vivo и in vitro [Hogan, 2007]. Эозинофилия, повышенное содержание эозинофилов в периферической крови и тканях, как правило, сопровождается высоким . уровнем экспрессии гена ИЛ-5. У животных, несущих инактивированый ген ИЛ-5, индуцировать эозинофилию не удаётся [Foster ét al., 1996]. Таким образом, ИЛ-5 является одним из основных факторов, контролирующих созревание и функциональную активность эозинофилов.

Эозинофилы - это гранулярные лейкоциты, которые продуцируются в костном мозге и после недолгого пребывания в периферической крови мигрируют в ткани. Принято считать, что эти клетки представляют в системе иммунитета основное звено противопаразитарной защиты [Sanderson, 1992]. В норме содержание эозинофилов в организме человека незначительно, однако, при определенных патологиях их количество может увеличиваться в несколько раз. Следует отметить, что при паразитарных заболеваниях рост числа эозинофилов, как правило, способствует элиминации паразитов и является признаком адекватной реакции организма на, например, глистную инвазию [Voehringer, 2007]. В противоположность этому, при аллергии, в частности, астме, рост числа эозинофилов ассоциируется с обострением заболевания fKiley et al., 2007]. Наличие этих клеток в легких астматиков связано с повреждением ткани, а их количество коррелирует со степенью поздней астматической реакции [Jacobsen et al., 2007]. Выявлена также негативная роль эозинофилов при развитии ряда аутоиммунных и злокачественных заболеваний [Di Stefano, Amoroso, 2005].

Широкая распространенность заболеваний, сопровождающихся эозинофшшей, подчеркивает актуальность структурно-функционального картирования регуляторных районов гена ИЛ-5, идентификацию ТФ, определяющих активность отдельных элементов этих районов, и выяснение механизмов инициации и регуляции транскрипции гена. Не вызывает сомнений, что раскрытие системы контроля экспрессии гена ИЛ-5 будет способствовать дальнейшему прогрессу в понимании молекулярных механизмов патогенеза ряда серьёзнейших заболеваний.

На сегодняшний день одним из наиболее эффективных средств лечения заболеваний, сопровождающихся эозинофшшей, являются препараты гдюкокортикоидов [Hall, 2006; Spahn, Szefler, 2007]. В результате применения этих средств у пациентов понижается содержание ИЛ-5 в легких и периферической крови [Charlesworth et al., 1991; Greenfeder et al., 2001], в бронхиально-альвеолярных смывах падает количество Т-клеток, экспрессирующих мРНК ИЛ-5 [Robinson et al., 1993]. Однако, несмотря на широкое использование глюкокортикоидов в практической медицине, механизмы, лежащие в основе действия этих препаратов на экспрессию гена ИЛ-5, изучены далеко не полностью. В частности, до сих пор не выяснен механизм подавления транскрипции гена ИЛ-5 глюкокортикоидами, не

определены причины возникновения устойчивости экспрессии гена ИЛ-5 к их действию [Inagaki et al.,2006; Kocak et al., 2006]. Таким образом, изучение механизмов действия глюкокортикоидов на экспрессию гена ИЛ-5 остается актуальной темой молекулярной биологии. Данные, полученные в результате таких исследований, могут быть полезны как для решения задач академического характера, так и для развития прикладных исследований по созданию новых фармакологических препаратов для лечения заболеваний, сопровождающихся эозинофилией.

Установлено, что в Т-лимфоцитах экспрессия генов таких индукторов кроветворения и иммунного ответа, как ИЛ-3, ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-13 и ГМ-КСФ часто происходит одновременно [Ansel et al., 2006; Dean, 2006]. Вместе с тем известно, что существуют механизмы, позволяющие селективно регулировать экспрессию отдельных генов. Например, в отличие от активации экспрессии большинства генов цитокинов, запуск транскрипции гена ИЛ-5 зависит от синтеза белка de novo [Schwenger et ai., 2002]. Таким образом, исследование структурно-функциональной организации регуляторных районов и механизмов транскрипции ИЛ-5 является важным шагом к пониманию как общих, так и ген-специфических механизмов регуляции экспрессии генов цитокинов.

Цель и задачи исследования

Цель данной работы - исследование структурно-функциональной организации регуляторных районов и механизмов транскрипции генов ИЛ-5 человека и мыши. Для её достижения необходимо было решить следующие задачи:

Выбрать клеточную модель для проведения масштабных экспериментов по структурно-функциональному картированию регуляторных районов и изучению механизмов активации и регуляции экспрессии гена ИЛ-5 человека. Провести структурно-функциональное картирование регуляторных районов генов ИЛ-5 человека и мыши. Идентифицировать белки, взаимодействующие с функционально активными элементами регуляторных районов и определить их роль в регуляции транскрипции генов ИЛ-5 человека и мыши.

Выяснить основные механизмы инициации и регуляции транскрипции гена ИЛ-5 человека.

Основные положения работы, выносимые на защиту

1. Структурно-функциональные карты регуляторных районов генов ИЛ-5 человека и мыши существенно различаются между собой. Кроме того, найдены различия в составе белковых комплексов, определяющих активность сходных по локализации, структуре и функции регуляторных элементов генов человека и мыши. Эти факты указывают на участие видоспецифических механизмов в системе регуляции транскрипции генов ИЛ-5 человека и мыши.

2. Консервативный лимфокиновый элемент О (CLEO) контролирует инициацию и уровень транскрипции гена ИЛ-5 человека. Ключевым транскрипционным фактором, определяющим активность CLEO, является АР-1. Функцию регулятора активности формирования комплекса CLE0/AP-1 выполняет одна из субъединиц фактора АР-1 -белокРга-2.

3. Клеточная активация индуцирует экспрессию гена, кодирующего белок Fra-2, который, в свою очередь, инициирует транскрипцию гена ИЛ-5. Существует прямая зависимость между интенсивностью экспрессии генов Fra-2 и ИЛ-5 человека.

4. Мишенью дексаметазона в контексте регуляторных элементов гена ИЛ-5 человека является CLEO. При определённых условиях клеточной стимуляции дексаметазон индуцирует экспрессию гена, кодирующего белок GILZ (активируемый глюкокортикоидами белок лейциновая застежка, glucocorticoid-induced leucine zipper). Этот белок ингибирует активность CLEO ИЛ-5, что и приводит к подавлению транскрипции

, гена.

5. Фактор транскрипции GATA-3 непосредственно участвует в регуляции активности промоторов генов ИЛ-5 и ИЛ-4 человека. Вероятнее всего он действует как архитектурный фактор, обеспечивающий специфическую конформацию ДНК, т.е. постоянный контакт GATA-3 с соответствующими элементами генов необходим для создания функционально активной пространственной структуры промоторов.

Научная новизна исследования

- Впервые проведено системное картирование функционально активных элементов регуляторных районов генов ИЛ-5 человека и мыши. В последовательности промоторов этих генов обнаружены новые уникальные элементы - РЭ1/2 и мРЭ1/2. Установлено, что регуляторные элементы РЭ1 и РЭ2 гена человека принимают участие в подавлении индуцированной транскрипции, а мРЭ1 и мРЭ2 гена мыши - в активации транскрипции.

- В составе З'-нетранслируемой области гена ИЛ-5 мыши и найден новый позитивный регуляторный элемент, не имеющий аналогов в гене ИЛ-5 человека.

- В последовательности промоторов генов ИЛ-5 и ИЛ-4 человека обнаружены новые элементы GATA, не имеющие аналогов в генах ИЛ-5 и ИЛ-4 мыши. Установлено, что данные регуляторные элементы участвуют в подавлении базальной и индуцированной транскрипции.

- Впервые идентифицированы ключевые белки, регулирующие экспрессию гена ИЛ-5 человека, и раскрыт механизм инициации и регуляции транскрипции гена. Показано, что элемент CLEO контролирует запуск и интенсивность транскрипции гена ИЛ-5 человека. Основным фактором, регулирующим эти процессы, является белок Fra-2, входящий в состав CLE0-связывающего комплекса АР-1.

- Впервые показано, что механизм подавления транскрипции гена ИЛ-5 человека дексаметазоном связан с экспрессией глюкокортикоид-индуцируемого гена, кодирующего белок GILZ. Выяснено, что этот белок блокирует активность промотора гена ИЛ-5 и его мишенью в контексте регуляторных элементов является CLEO.

- Идентифицированы белки, входящие в состав транскрипционных комплексов, участвующих в регуляции экспрессии гена ИЛ-5 мыши. В результате обнаружены существенные различия в составе факторов транскрипции, регулирующих экспрессию генов ИЛ-5 мыши и человека.

- Впервые показано, что белок GATA-3 непосредственно участвует в регуляции активности промоторов генов ИЛ-5 и ИЛ-4 человека: все функционально активные элементы GATA промоторов данных генов взаимодействуют именно с этим фактором транскрипции. Впервые продемонстрировано, что элементы GATA генов цитокинов участвуют как в индукции, так и в подавлении промоторной активности.

Практическая значимость

Ведущая роль ИЛ-5 в регуляции продукции и активации эозинофилов обусловливает практическую значимость исследований структурно-функциональной организации регуляторных областей гена этого цитокина и механизмов, контролирующих его экспрессию. Так, на основании данных, полученных в настоящей работе можно предположить, что перспективными мишенями для фармакологических препаратов для лечения заболеваний, сопровождающихся эозинофилией, являются регуляторный элемент CLE0 гена ИЛ-5 человека и ядерные белки, определяющие функциональную активность этого элемента.

Практическое значение имеют также данные о различиях в структурно-функциональной организации промоторов и З'-нетранслируемых областей генов ИЛ-5 человека и мыши. Они демонстрируют, что результаты, полученные при исследовании регуляции экспрессии гена ИЛ-5 мыши, не могут адекватно отражать механизмы регуляции экспрессии ИЛ-5 человека.

И, наконец, результаты проделанной работы позволяют рекомендовать перевиваемую линию Т-клеток человека PER-117 в качестве модели для изучения механизмов активации и регуляции экспрессии генов ИЛ-5 и ИЛ-4 человека.

Апробация результатов диссертации и публикации

Основные положения диссертации докладывались на международном симпозиуме «Интерлейкин-5, первое десятилетие» («Interleukin-5, the First Decade», Перт, Австралия, 1997), Десятом Международном иммунологическом конгрессе (Tenth International Congress of Immunology, Нью-Дели, Индия, 1998), ежегодных собраниях Биохимического Общества Великобритании (1995, 1999), международных конференциях по молекулярной и клеточной биологии в рамках программы «Keystone Symposia» (1996, 1998, 2000, 2002), международных конференциях по молекулярной и клеточной биологии, проводимых исследовательским центром Hanson Institute (Аделаида, Австралия, 1994, 1996, 1998, 2000), собраниях международного общества «International Eosinophil Society» (1997, 1999), международных школах по молекулярной и клеточной биологии (Канберра, Австралия, 1995, 1997) и других международных и национальных конференциях.

По материалам диссертации в рецензируемых отечественных и зарубежных изданиях опубликовано 20 статей.

Структура и объём работы

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, главы, содержащей результаты собственных исследований и их обсуждение, и выводов. Работа изложена на 257 страницах машинописного текста, включая 12 таблиц и 86 рисунков. Список цитируемой литературы содержит 382 ссылки.

Благодарности

Автор глубоко признателен профессору Colin J. Sanderson за его постоянный интерес к исследованиям, за поддержку и ценные предложения, касающиеся экспериментальной работы и интерпретации полученных данных.

На разных этапах в работе принимали участие Gretchen Т. F. Schwenger, Susanne Е. Peroni, Anish D. Singh, Monica Senna Salerno, Stéphane Karlen, Marc A. Thomas, Régis Fournier, Monica L. De Boer и другие сотрудники группы профессора Colin J. Sanderson - автор приносит им искреннюю благодарность. Автор также благодарен ведущему научному сотруднику ИЦиГ СО РАН, доктору биологических наук Д. П. Фурман и старшему научному сотруднику ИЦиГ СО РАН, кандидату биологических наук А. В. Катохину за плодотворное сотрудничество при обсуждении представленных в работе результатов исследований.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Выбор перевиваемой клеточной линии

Экспрессия генов цитокинов - индуцибельный процесс. К началу наших исследований работа по изучению механизмов регуляции экспрессии гена ИЛ-5 человека существенно осложнялась отсутствием лимфоцитарной линии клеток человеческого происхождения, индуцибельно продуцирующей ИЛ-5 после стимуляции стандартными Т-клеточными активаторами. Поэтому в качестве этапа, предваряющего исследования структурно-функциональной

организации промотора и механизмов регуляции экспрессии гена ИЛ-5 человека, был проведен поиск Т-клеточных линий человеческого происхождения, обладающих в контексте экспрессии генов лимфокинов свойствами, близкими к свойствам первичных Т-клеток. Один из основных критериев отбора линий клеток - кандидатов на роль клеточной модели нашего исследования - экспрессия в них генов ИЛ-5 и ИЛ-4 после активации культур стандартными клеточными стимуляторами.

В результате тестирования значительного числа Т-клеточных линий нам удалось найти клетки PER-117, в которых после активации происходит экспрессия генов ИЛ-5 и ИЛ-4. Как показано на рис. 1-1, в нестимулированных клетках PER-117 не удаётся выявить присутствие мРНК ИЛ-5 и ИЛ-4 (дорожка 1). Однако в образцах РНК, полученных из активированных культур, мРНК ИЛ-5 и ИЛ-4 присутствуют (дорожка 2). Таким образом, экспрессия генов ИЛ-4 и ИЛ-5 в клетках линии PER-117 является индуцибельной.

Рис. 1-1. Экспрессия мРНК ИЛ-5, ИЛ-4 и ß-actin в интактных и активированных клетках PER-117. Клетки активированы форбол миристат ацетатом (phorbol 12-myristate 13-acetate, PMA) в комбинации с кальциевым ионофором А23187 (calcium ionophore А2.3187, Cal). Определение мРНК проводилось с помощью обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР)

Следует отметить, что РМА активированная продукция ИЛ-5 в клетках PER-117 может быть значительно усилена с помощью ко-активаторов -циклического аденозинмонофосфата (cyclic adenosine monophosphate, cAMP), Cal или анти-С028-антител (anti-CD28 antibody, aCD28) (рис. 1-2). Таким образом, аналогично продукции ИЛ-5 в первичных Т-лимфоцитах, наиболее '»ффеюгивная продукция этого цитокина в клетках PER-117 достигается только v, помощью стимуляции TCR-зависимого сигнального пути в комбинации с о дним из дополнительных сигнальных путей клеточной активации.

PER-117 + +

PMA/Cat - +

1 2

ИЛ-5 «Г

ИГИ ;

ß-actin

Рис. 1-2. Продукция ИЛ-5 в интактных и активированных клетках PER-117:

1 - интактные культуры;

2 - стимуляция клеток с помощью РМА;

3 - РМА в комбинации с Cal;

4 - РМА в комбинации с с AMP;

5 - РМА в комбинации с aCD28

1 2 3 4 5

Важно подчеркнуть, что синтез мРНК и продукция ИЛ-5 в клетках PER-117 подавляются дексаметазоном. Интересно, что эффект дексаметазона на экспрессию гена ИЛ-5 зависит от условий клеточной активации. Дексаметазон

практически полностью подавляет экспрессию этого гена в клетках, активированных РМА или РМА в комбинации с сАМР и aCD28. В культурах же, стимулированных с помощью РМА в комбинации с Cal, дексаметазон лишь слабо понижает уровень синтеза мРНК и продукции ИЛ-5. Аналогичные данные были получены при исследовании эффекта дексаметазона на экспрессию гена ИЛ-5 в первичных Т-лимфоцитах человека. Эти факты в совокупности с данными по активации экспрессии гена ИЛ-5 и продукции данного цитокина в тестируемой культуре дают основания полагать, что регуляция экспрессии гена ИЛ-5 в первичных Т-лимфоцитах и клетках PER-117 осуществляется с помощью, по крайней мере, аналогичных механизмов. Таким образом, клетки PER-117 являются хорошей моделью для изучения механизмов активации и регуляции экспрессии гена ИЛ-5 человека. Тем не менее, необходимо упомянуть, что данные о механизмах экспрессии генов, полученные при использовании этих клеток, как и любых других клеточных линий, должны быть интерпретированы достаточно осторожно, поскольку механизмы, контролирующие экспрессию генов в перевиваемых культурах, могут иметь свои особенности. Поэтому в нашей работе результаты ключевых экспериментов, проведенных с использованием клеток PER-117, всегда проверялись с помощью экспериментов, выполненных на первичных Т-лимфоцитах.

2. Новые регуляторные элементы промотора гена ИЛ-5 человека

Структурно-функциональное картирование регуляторных районов гена ИЛ-5 человека проводилось по следующей схеме: (i) выявление потенциальных регуляторных элементов с помощью футпринтинга и компьютерного анализа последовательности регуляторных районов; (ii) функциональное тестирование потенциальных регуляторных элементов с использованием адресного мутагенеза и репортёрного анализа; (iii) идентификация факторов транскрипции, участвующих в активации этих элементов, с помощью различных модификаций метода задержки ДНК-зондов в геле (electrophoretic mobility shift assay, EMSA).

В результате проделанной работы в составе регуляторной области гена, охватывающей первые 500 пар оснований промотора (п.о.), были выявлены функционально активные элементы, аналоги которых присутствуют в составе промоторов ряда других генов цитокинов. В частности, непосредственно за ТАТА-боксом между позициями -59 и -43 был локализован консервативный лимфокиновый элемент 0 (CLEO), в районе позиции -70 - элемент GATA, а в районе позиции -110 - сайт связывания NF-AT. Далее, в районах позиций -128 и -152 были локализованы два элемента GATA, а в районе позиции -400 ещё один элемент GATA. Столь «настойчивое» повторение этого мотива может говорить о важной роли элементов GATA в регуляции транскрипции гена ИЛ-5. Поэтому исследованию роли элементов GATA в регуляции активности промотора гена ИЛ-5 была посвящена отдельная работа, результаты которой изложены в следующем разделе.

Помимо вышеупомянутых элементов в составе исследуемого фрагмента промотора нам удалось обнаружить два новых регуляторных элемента, РЭ1 и РЭ2. РЭ1 расположен между позициями -90 и -79 в проксимальной области промотора (последовательность CCATTATTAGGC). РЭ2 находиться в дистальной части промотора между позициями -559 и -447 (последовательность TGGCAGTTTCCAT). Мутации последовательностей, участвующих в составе этих элементов во взаимодействии с ядерными белками, приводят к усилению активности промотора в стимулированных культурах первичных Т-лимфоцитов и клетках PER-117 (рис. 2-1 и 2-2). Следовательно, новые элементы обладают способностью подавлять активность промотора гена ИЛ-5 человека. Поскольку функции РЭ1 и РЭ2

проявляются только в условиях клеточной стимуляции, эти элементы участвуют в репрессии индуцированной активности промотора гена ИЛ-5.

Рис. 2-1. А - замены в последовательности РЭ1; Б - экспрессия репортёрных конструкций, содержащих замены в последовательности РЭ1, в РМА/сАМР-активированных клетках PER-117.

Пояснения: репортёрная конструкция -281/+18 несёт фрагмент гена ИЛ-5 человека, расположенный между позициями -281 и +18

Рис. 2-2. Экспрессия базовой (-508/+18) и модифицированных (пК1м, пКЗм и пК1/Зм) репортёрных конструкций, несущих замены в последовательности РЭ2, в PMA/Cal-активированных клетках PER-117. Приведены данные трёх независимых экспериментов: ■эксперимент 1; И- 2; И- 3.

Активность люциферазы в стимулированных культурах выражена относительно активности люциферазы в нестимурованных культурах

Регуляторные области многих генов цитокинов содержат элементы, участвующие в блокаде базальной и индуцированной активности промоторов [Blom et al., 2006]. Довольно часто репрессорные элементы расположены в проксимальной части промоторов в непосредственной близости от регуляторных последовательностей, участвующих в активации транскрипции [Tsuruta et al., 1998]. Один из обнаруженных нами репрессорных элементов, РЭ1, обладает «классической» локализацией: 3'-область этого элемента

РЭ1 GCCATTATTAGGCATTCTC

СС-мутант -91--ТТ--------- -73

ТАТ-мутант -91----CGC-------------73

GC-мутант -91--------------AG------73

Конструкция -281/+18 "~v 1

СС-мутант | -)

ТАТ-мутант — '7Т ;

GC-мутант Дч

0 100 200 300

Относительная активность люциферазы (%)

■507/+18 пК1м пКЗм пК1/Зм

граничит с блоком GATA/CLEO, а 5'-область с блоком GATA/NF-AT, активаторами транскрипции гена ИЛ-5. Расположение же второго репрессора, РЭ2, несколько необычно, - он удалён от насыщенного регуляторными элементами проксимального промотора более чем на 300 п.о.

Идентификация репрессорных элементов существенно дополняет структурно-функциональную карту промотора гена' ИЛ-5 и позволяет по-новому взглянуть на возможные механизмы регуляции экспрессии гена. Так, учитывая локализацию РЭ2, можно предположить, что в реализации механизмов регуляции транскрипции этого гена существенную роль играет пространственная структура промотора.

При идентификации факторов транскрипции, входящих в состав ДНК-белковых комплексов РЭ1 и РЭ2, было выяснено, что оба элемента взаимодействуют с фактором YY1 (рис. 2-3) - многофункциональным ядерным белком, способным как активировать, так и репрессировать промоторы различных генов [Shi et al., 1997].

Проба РЭ1 Проба РЭ2

Антитела H <•> Cfctl Oct? (.| УУ10с«*ГУ1 « H *VI (1 »-At

Конкурентные H H H YY1 и H » *** « m*f H

K2 Î^^lto

Рис. 2-3. Идентификация ядерных белков, взаимодействующих с РЭ1 и РЭ2 с использованием EMSA. А: РЭ1 - факторы транскрипции Octl и YY1 участвуют в образовании комплексов Cl й СЗ; Б: РЭ2 - факторы транскрипции NF-AT и YY1 входят в состав комплексов К1 и КЗ

Следует отметить, что YY1 участвует в регуляции экспрессии генов ряда цитокинов и действует при этом как репрессор транскрипции [Ye et al., 1996а; Ye et al., 1996b], В состав ДНК-белковых комплексов РЭ1 входит также фактор Oct-1. В некоторых случаях этот белок проявляет свойства репрессора промоторной активности [Hoppe-Seyler et al., 1991; Delhase et al., 1996], однако, в основном он выполняет функции активатора транскрипции [Scholer

et al., 1991]. Вместе с YY1 в состав ДНК-белковых комплексов РЭ2 входит фактор транскрипции NF-AT. Согласно данным различных авторов, NF-AT является активатором транскрипции и играет важную роль в регуляции экспрессии многих генов цитокинов, в число которых входит и ИЛ-5 [De Boer ! et al., 1999].

Таким образом, в число факторов, взаимодействующих с РЭ1 и РЭ2, входят репрессор активности промоторов генов цитокинов YY1 и два активатора транскрипции этих генов, Oct-1 и NF-AT. Можно предположить, что в составе ДНК-белковых комплексов РЭ1 и РЭ2 YY1 сохранил свою функцию репрессора, однако, функции Oct-1 и NF-AT неясны. В пределах каждого регуляторного элемента мотив связывания YY1 перекрывается с мотивами связывания Oct-1 или NF-AT. Интересно, что такие комбинации транскрипционных факторов являются уникальными. Не исключено, что эта уникальность может отражать особые механизмы регуляции транскрипции гена ИЛ-5.

3. Роль фактора транскрипции GATA-3 в регуляции активности промоторов генов ИЛ-5 и ИЛ-4 человека

Как упоминалось в разделе 2, на сравнительно небольшом расстоянии от старта транскрипции в составе промотора гена ИЛ-5 человека расположены три элемента GATA, ещё один такой сайт находится в дистальной ¡области промотора. К началу нашей работы роль элементов GATA в регуляции активности промоторов генов ИЛ-5 человека оставалась неясной, что и послужило мотивацией для следующей работы.

3.1. Функции GATA-3-связывающих элементов в регуляции активности промотора гена ИЛ-5 человека

При идентификации белков, формирующих комплексы с элементами GATA промотора гена ИЛ-5, было выяснено, что сайты -70, -152 и -400 взаимодействуют с транскрипционным фактором GATA-3 (рис. 3-1). Сайт GATA-128 промотора гена ИЛ-5 не формирует комплексы с ядерными экстрактами из клеток PER-117.

При оценке функциональной активности элементов GATA, расположенных в промоторе гена ИЛ-5 человека, было обнаружено, что элементы GATA-70 и GATA-152 участвуют в активации промотора, GATA-

128 не обладает функциональной активностью, а САТА-400 принимает участие в подавлении базапьной и индуцированной активности промотора (рис. 3-2).

Проба GATA-70

3 5

Антитела (-) ("> (¿i g g

Конкурентные g |

олигонуклеотиды 4 ' ' « w w

Проба GATA-152

«««¡i (-! ? 9 <■) Н

«.шШш

Проба GATA-400

Í-) Ц § § 15 5 <-)(-)

Рис. 3-1. Идентификация ядерных белков, взаимодействующих с мотивами GATA гена ИЛ-5 человека. Олигонуклеотиды, соответствующие мотивам GATA в районах позиций -70,-152 и -400, обозначены -70, -152 и -400. Олигонуклеотиды, содержащие консенсусные мотивы связывания факторов GATA, Octamer, С/ЕРВ, АР-1 и АР-2, обозначены GATA, Octamer, С/ЕРВ, АР-1 и АР-2

Рис. 3-2. Влияние замен в последовательности сайтов GATA-70 (A), GATA-128(B), ОАТА-152(Б) и GATA-400 (В) на активность промотора гена ИЛ-5 человека: экспрессия репортёрных конструкций в нестимулированных (чёрные столбцы) и РМА/сАМР-активированных (серые столбцы) клетках PER-117. Репортёрные конструкции: 1 - базовая (-508/+18); 2 - мутация сайта GATA-70; 3 - мутация сайта GATA-128; 4 - мутация сайта GATA-152; 5 - мутация сайта GATA-400 в кодирующей цепи, 6 - в некодирующей цепи, 7 - в двух цепях

Таким образом, в результате тестирования функциональной активности четырех элементов GATA промотора гена ИЛ-5 человека были получены данные, указывающие на то, что фактор GATA-3 непосредственно участвует в регуляции транскрипции гена ИЛ-5 человека. Действительно, единственный неактивный в отношении регуляции транскрипции элемент, GATA-128, не взаимодействует с GATA-3. Остальные элементы связывают этот фактор и обладают определёнными функциями в контексте тестируемого фрагмента промотора гена ИЛ-5. Элементы GATA-70 и GATA-152 являются активаторами транскрипции, элемент GATA-400 проявляет свойства репрессора базальной и индуцированной активности промотора. Полярное различие функций элементов GATA, находящихся в составе одного промотора, явление необычное. Является ли это особенностью промотора гена ИЛ-5 или элементы GATA промоторов других генов лимфоцитарных цитокинов обладают такими же характеристиками? Чтобы ответить на этот вопрос мы исследовали роль элементов GATA в регуляции активности промотора гена ИЛ-4 человека.

3.2. Функции GATA-3-связывающих элементов в регуляции активности промотора гена ИЛ-4 человека

В результате компьютерного анализа регуляторной области гена ИЛ-4 человека, расположенной между позициями -1075 и +66, было обнаружено несколько потенциальных сайтов связывания транскрипционных факторов семейства GATA. При тестировании этих сайтов в экспериментах по определению белок связывающей активности было выяснено, что элементы, расположенные между позициями -274/-269 и -860/-852, взаимодействуют с ядерными белками из клеток PER-117 и первичных Т-лимфоцитов. Сайты были названы GATA(-)274 и GATA(-)860. Было установлено, что в состав ДНК-белковых комплексов, образованных этим элементами и ядерными экстрактами входит фактор транскрипции GATA-3.

При функциональном тестировании элемента GATA(-)274 было показано, что этот сайт участвует в активации промотора гена ИЛ-4 человека. Однако при исследовании функциональной активности дистального элемента GATA были получены совершенно иные результаты. Мутация последовательности GATA(-)860 и делеция фрагмента ДНК, содержащего этот элемент, существенно увеличивали эффективность экспрессии

репортёрных конструкций. Активность люциферазы в клетках, трансфицированных конструкциями пИЛ4САТА(-)860мут и пИЛ40АТА(-)860дел, в 3-7 раз превышала активность репортёрного белка в клетках, трансфицированных пИЛ4бк (рис. 3-3).

хЮ1 (cpi)

ао

PMA/cAMP PMA/CU ГМА/»СТ>28

xlO'(cpt) 20

Рис. 3-3. Активность люциферазы в культурах клеток PER-117 и Jurkat, трансфицированных конструкциями, экспрессирующим репортёрный ген под контролем промотора гена ИЛ-4 человека.

Конструкции:

1, пИЛ4бк - содержит фрагмента гена ИЛ-4 человека, расположенный между позициями -1075 и +60;

2, пИЛ4(-)860мут -отличается от пИЛ4бк мутацией мотива GATA в последовательности элемента GATA(-)860, мутация блокирует белоксвязывающую активность сайта;

3, пИЛ4(-)860дел -содержит фрагмента гена ИЛ-4 человека, расположенный между позициями -744 и +60.

НС PMA PMA/cAMP PMA/Cal PMA/.CD28

Обозначения: не - нестимулированные культуры; PMA, cAMP, Cal, aCD28 -культуры, стимулированные соответствующими активаторами

Важно отметить, что мутация GATA(-)860 и делеция этого элемента увеличивают активность репортёрных плазмид не только в стимулированных, но и в нестимулированных культурах PER-117 и Jurkat. Это означает, что

Клетки Jurkat

элемент GATA(-)860 участвует в репрессии как базальной, так и индуцированной активности промотора ИЛ-4. Поскольку GATA(-)860 взаимодействует с фактором транскрипции GATA-3 в интактных культурах и клеточная активация мало влияет на интенсивность этого взаимодействия, можно заключить, что данный фактор является компонентом механизма, сдерживающего базальную активность промотора ИЛ-4 и подавляющего индуцированную транскрипцию гена.

Итак, при исследовании функциональной активности GATA-3-связывающих элементов генов ИЛ-4 и ИЛ-5 человека были получены неоднозначные результаты. Так, установлено, что мотивы GATA-860 гена ИЛ-4 и GATA-400 гена ИЛ-5 участвуют в репрессии йндуцированной и базальной активности промоторов. Таким образом, складывается впечатление, что GATA-3 может действовать как транскрипционный репрессор ИЛ-4 и ИЛ-5. Однако это заключение противоречит нашим же данным о позитивной роли GATA-3-связывающих элементов в активации транскрипции этих генов. Действительно, GATA-70 и GATA-152 промотора ИЛ-5, также как и GATA-274 промотора ИЛ-4 являются активаторами транскрипции. Кроме того, супрессорный эффект GATA-3 на транскрипцию ИЛ-4 и ИЛ-5 не согласуется с устоявшимися представлениями о важнейшей роли этого белка в экспрессии генов цитокинов в Т-хелперах типа 2 (Тх2) [Murphy, Reiner, 2002].

Возникшее противоречие можно разрешить с помощью модели, в которой GATA-3 рассматривается как архитектурный фактор, обеспечивающий специфическую конформацию ДНК. В этом случае постоянный контакт GATA-3 с соответствующими элементами гена необходим для создания функционально активной пространственной структуры промотора. Разрушение одного из сайтов связывания GATA-3 будет вести к частичному изменению такой структуры, что может выражаться в изменении эффективности действия активаторов или репрессоров транскрипции, действующих как через регуляторные элементы промотора, так и через последовательности, расположенные в других областях кластера генов Тх2 цитокинов. В наших экспериментах были использованы фрагменты промоторов, содержащие комплекс регуляторных элементов, среди которых есть репрессоры и активаторы. Вполне вероятно, что мутация дистального мотива GATA резко понижает или отменяет действие транскрипционных

репрессоров, например, РЭ1 и РЭ2 гена ИЛ-5 (раздел 2) и Р2 NRE, NRE-I и NRE-II гена ИЛ-4 [Li-Weber et al., 1992]. В отличие от этого, мутации GATA сайтов, расположенных в проксимальных областях промоторов, ослабляют эффект активаторов транскрипции, например, CLEO ИЛ-5 [Stranick et al., 1995; Thomas et al., 1999] и элемента P гена ИЛ-4 [Aune et al., 2001]. Такая модель действия GATA-3 полностью согласуется с общепринятыми представлениями об участии этого белка в инициации реконструкции хроматина для формирования транскрипционного профиля Тх2 и регуляции экспрессии генов Тх2 цитокинов.

4. Идентификация белков, регулирующих активность консервативного лимфокинового элемента 0 (CLEO) генов ИЛ-5 человека и мыши

Идентификацию белков, взаимодействующих с CLEO гена ИЛ-5 человека, проводили с помощью EMSA ядерных экстрактов из клеток PER-117 и олигонуклеотида CLEOo, последовательность которого соответствовала последовательности промотора гена ИЛ-5 человека между позициями -59 и -38. Ядерные экстракты были получены из интактных клеток и культур PER-117, активированных РМА в комбинации с Cal.

Как показано на рис. 4-1 А, ядерные экстракты из нестимулированных клеток и CLEOo формируют два комплекса, CI и CIII (дорожка 1). Активация клеток не влияет на образование комплекса CI, однако значительно усиливает формирование CIII (дорожка 2). Клеточная стимуляция индуцирует также и образование третьего ДНК-белкового комплекса СИ (дорожка 2). Формирование этого комплекса полностью зависит от стимуляции клеток PER-117.

Рис. 4-1. Идентификация ядерных белков, взаимодействующих с CLEO гена ИЛ-5 человека. А - EMSA с использованием конкурентных олигонуклеотидов (CLEOo, олигонуклеотиды, содержащие консенсусные мотивы связывания факторов транскрипции АР-1, Octamer и NF-AT). Б - EMSA с использованием антител к факторам транскрипции (пояснения в тексте)

Антитела, специфические к белку Oct-1, полностью блокируют формирование комплекса CI (рис. 4-1 Б, дорожка 2), а антитела к фактору Oct-2 изменяют электрофоретическую подвижность комплекса CIII (дорожка 3). Следовательно, Oct-1 входит в состав комплекса CI, a CIII содержит Oct-2.

Как показано на рис. 4-1Б, антитела, распознающие все белки семейства Jun (a-Jun) значительно подавляют интенсивность формирование комплекса CII (дорожка 4). Среди антител, специфических к индивидуальным белкам Jun, сходным эффектом обладают только антитела к Jun D (дорожка 7). Антитела, распознающие все белки семейства Fos, также значительно подавляют формирование комплекса СИ (дорожка 8). Среди антител, специфических к индивидуальным белкам Fos, подобным образом действуют только антитела к Fra-2 (дорожка 12). Следовательно, комплекс CII содержит фактор транскрипции АР-1, состоящий из белков Jun D и Fra-2.

Таким образом, полученные данные позволяют заключить, что ядерные белки клеток PER-117 и CLEO ИЛ-5 человека формируют комплексы, содержащие транскрипционные факторы АР-1 (Jun D/Fra-2), Oct-1 и Oct-2. Такие же комплексы формируют с CLEO ИЛ-5 человека и ядерные белки первичных Т-клеток здоровых доноров.

Для верификации белоксвязывающих мотивов CLEO ИЛ-5 человека были использованы олигонуклеотиды, содержащие замены в

Рис. 4-2. Верификация белоксвязывающих мотивов CLEO ИЛ-5 человека:

А - олигонуклеотиды, содержащие замены последовательности CLEO; Б - влияние замен в последовательности CLEO на формирование ДНК-белковых комплексов.

В EMSA использованы ядерные экстракты из интактных (-) и активированных (+) клеток PER-117

Как показано на рис. 4-2Б, замена триплета AAA, расположенного между позициями -58 и -56, на СТС (проба Ml) приводит к значительному подавлению взаимодействия пробы с факторами Oct-1 и Oct-2, но не влияет на

последовательности CLEO (рис. 4-2А).

CLEO GAAATTATTCATTTCCTCAAAG

Ml -СТС-

М2 -СТС-

мз --------------СТС-

-CTC-

CLE0 М1 М2 МЗ М4

I II » !Г

- + - + - +

~II-1

+ - + Активация

Ш,,„,-ЩЁШ: < - Oct-1

" tiPHpN-/u>-i

, * VШ Oct-5

формирование комплекса AP-l(CII). Замена ТСА на СТС между позициями -51 и -49 (проба МЗ) не оказывает влияния на формирование Oct-1 и Oct-2 содержащих комплексов, однако, эта мутация значительно подавляет формирование комплекса АР-1. В олигонуклеотиде М4 сохранена целостность всех мотивов взаимодействия CLEO с факторами транскрипции, входящими в состав CI-III. Таким образом, можно заключить, что хотя мотивы связывания факторов Octamer и АР-1 в составе последовательности CLEO ИЛ-5 человека перекрываются (проба М2), это не помешает созданию изменённых вариантов CLEO, образующих комплексы только с одним из транскрипционных факторов.

Для оценки функциональной значимости белоксвязывающих мотивов CLEO ИЛ-5 человека на основе базовой конструкции -281/+18, несущей фрагмент гена ИЛ-5 человека, расположенный между позициями -281 и +18, были выполнены плазмиды Octmut, APlmut и Controlmut, содержащие те же замены, что и олигонуклеотиды Ml, МЗ и М4 (рис. 4-2А).

Мутации CLEO не влияют на активность репортёрных конструкций в нестимулированных клетках. Однако после клеточной стимуляции активность экспрессии плазмид, содержащих замены в последовательности CLEO, включая Controlmut, составила всего 10 % от активности экспрессии конструкции -281/+18 (рис. 4-3). Эти данные указывают на то, что мутации в пределах CLEO приводят к практически полной потере активности промотора. Следовательно, вся последовательность CLEO - белоксвязывающие мотивы и участки, не вовлечённые в прямое взаимодействие с факторами транскрипции, - играет важнейшую роль в активации промотора гена ИЛ-5 человека.

_ еша i® -28I/+1«

у. Шша APlmut

Рис. 4-3. Экспрессия репортёрных

конструкций,

содержащих замены в последовательности CLEO ИЛ-5 человека, в клетках PER-117. Пояснения в тексте

Меактивмрованные PMA/Cal клетки

Роль АР-1 в регуляции экспрессии генов цитокинов изучена достаточно подробно. Как следует из названия этого фактора - активирующий белок 1, АР-1 является активатором транскрипции. В противоположность этому, данные о роли факторов Octamer в регуляции экспрессии цитокинов неоднозначны и не позволяют связать эти белки только с одной функцией в отношении контроля транскрипции различных генов. Присутствие Oct-1 и Oct-2 в транскрипционном комплексе CLEO нами обнаружено впервые и функция данных белков в регуляции активности промотора гена ИЛ-5 человека не ясна.

В экспериментах по исследованию роли транскрипционных факторов Oct-1 и Oct-2 в активации CLEO ИЛ-5 помимо репортёрных конструкций были также использованы экспрессионные векторы pCG-Oct-1 и pCG-Oct-2, содержащие кДНК Oct-1 и Oct-2. Экспрессия данных плазмид в клетках PER-117 и Jurkat ведёт к существенному повышению содержания белков Oct-1 и Oct-2 в ядерных экстрактах, полученных из этих культур. Показано, что избыточная продукция факторов Oct-1 и Oct-2 приводит к усилению активности промотора гена ИЛ-5 человека. Таким образом, факторы Oct-1 и Oct-2 действуют как активаторы транскрипции этого гена. Следует отметить, что белок Oct-2 обладает более значительным эффектом, чем Oct-1.

При идентификации белков, взаимодействующих с CLEO гена ИЛ-5 мыши, было установлено, что этот элемент обладает сходной белоксвязывающей активностью с CLEO ИЛ-5 человека. В состав комплексов, образованных CLEO ИЛ-5 мыши и ядерными белками из перевиваемой Т-клеточной линии мыши EL4 и из первичных Т-лимфоцитов мыши, входят транскрипционные факторы Oct-1, Oct-2 (рис. 4-4, дорожки 2 и 3) и АР-1. Однако составы комплексов АР-1 CLEO ИЛ-5 человека и мыши различаются, -последний образован белками FosB и JunB (дорожки 4 и 6).

Рис. 4-4. Идентификация ядерных белков, взаимодействующих с CLEO ИЛ-5 мыши. EMSA ядерных экстрактов из активированных клеток EL4 и олигонуклеотидной пробы, соответствующей CLEO ИЛ-5 мыши, с использованием антител к факторам транскрипции. Стрелкой указан дополнительный комплекс (дорожки 3, 4 и 6)

1 2 3 4 5 6 7

Определение роли факторов Oct-1 и Oct-2 в регуляции транскрипции гена ИЛ-5 мыши было также проведено с использованием репортёрных и экспрессионных конструкций. В результате было установлено, что избыточная продукция факторов Oct-1 и Oct-2 в клетках EL4 приводит к усилению активности промотора гена ИЛ-5 мыши. Однако в отличие от системы регуляции экспрессии гена человека, где ведущая роль принадлежит белку Oct-2, при активации экспрессии гена мыши эффект Oct-1 представляется более мощным, чем Oct-2.

Результаты, полученные при проведении идентификации факторов транскрипции, определяющих активность CLEO ИЛ-5, позволили существенно пополнить наши знания о системе регуляции транскрипции генов ИЛ-5 человека и мыши. Установлено, что в интактных клетках CLEO ИЛ-5 взаимодействует с белками, принадлежащими к семейству факторов транскрипции Octamer, - широко распространенным Oct-1 и лимфоцит-специфическим Oct-2. Клеточная стимуляция значительно усиливает связывание Oct-2 и CLEO, но не влияет на взаимодействие этого элемента с Oct-1. Оба фактора являются активаторами транскрипции генов и обладают определённой видовой «тропносгью». Для гена человека более мощным активатором является Oct-2, для гена мыши - Oct-1.

Следует отметить, что стимуляция клеток индуцирует взаимодействие CLEO с фактором АР-1. Субъединичный состав АР-1 также представляется видоспецифичным: CLEO ИЛ-5 человека связывает комплекс белков Jun D и Fra-2, CLEO ИЛ-5 мыши - FosB и JunB.

5. Регуляторные элементы гена ИЛ-5 мыши

Изложенные выше данные указывают на возможность участия в системе регуляции транскрипции генов ИЛ-5 человека и мыши видоспецифических механизмов. Если это действительно так, то структурно-функциональная организация регуляторных районов этих генов может существенно различаться. Для проверки этого предположения был проведен поиск новых регуляторных элементов гена ИЛ-5.

5.1. Новые регуляторные элементы промотора гена ИЛ-5 мыши

С помощью компьютерного анализа промотора гена ИЛ-5 мыши были обнаружены потенциальные регуляторные элементы, гомологичные РЭ1 и

Таблица 1. Последовательности модифицированных мРЭ1 и мРЭ2, находящихся в составе репортёрных конструкций

РЭ2 гена ИЛ-5 человека. Новые элементы были названы мРЭ1 и мРЭ2. Аналогично РЭ1 и РЭ2 они расположены между позициями -79/-90 и -459/470 соответственно. Оба элемента содержат идентичные инвертированные повторы в 3 п.о., фланкирующие специфические для каждого элемента последовательности размером 5 п.о.

Функциональная активность потенциальных регуляторных элементов была исследована с помощью адресного мутагенеза и репортёрного анализа. В этой работе мы использовали базовую конструкцию

mIL5wt-Luc, содержащую первые 1700 п.о. промотора гена ИЛ-5 мыши [Campbell et al., 1987). На основе данной конструкции была создана коллекция репортёрных плазмид с различными заменами в последовательности промотора (таблица 1).

Как показано на рис. 5-1, мутация в левом плече мРЭ1 приводит к значительному снижению активности промотора. Мутация левого плеча элемента мРЭ2 также существенно понижает активность промотора. Однако замены в правых плечах элементов мРЭ1 и мРЭ2 оказывают незначительное влияние на активность промотора. Слабое влияние на активность промотора оказывает и замена пары нуклеотидов, расположенной выше инвертированных повторов мРЭ1 и мРЭ2.

Конструкция Последовательности модифицированных мРЭ1 и мРЭ2

mlL5wt-Luc мРЭ1мутЛ мРЭЧмутП мРЭ1мутХ мРЭ2мутЛ мРЭ2мутП мРЭ2мутХ мРЭ1/2мут GCXTTTATTAGG CCCTGTTGAGG GACGT TATTAGG CCCTGTTGAGG GOCTTTATTAAA CCCTGTTGAGG ACCTTTATTAGG CCCTGTTGAGG OOCTTTATrAGG CTTCG TTGACG GOCTtTATTAGO CCCTCTTGCAA СЮСГГТАТТАОО TCCrCTTGAOG GAGGTrATTAGG CTTCGTTOAGG

mlL5v*1Luc мР31мутЛ мРЭ1мугП мРЭЧмутХ мРЭ2мутЛ мРЭ2иутП мРЭ2мутХ

Рис. 5-1. Экспрессия репортёрных конструкций, содержащих замены в последовательности мРЭ1 и мРЭ2, в клетках ЕЬ4. Пояснения в тексте

Полученные данные позволяют заключить, что левые части палиндромных последовательностей мРЭ1 и мРЭ2 входят в состав регуляторных элементов, участвующих в активации промотора гена ИЛ-5 мыши. Таким образом, мРЭ1 и мРЭ2 выполняют функции, противоположные функциям РЭ1 и РЭ2, аналогов этих элементов промотора гена ИЛ-5 человека.

5.2. Новый регуляторный элемент З'-нетранслируемой области гена ИЛ-5 мыши

В результате компьютерного анализа последовательности гена ИЛ-5 мыши в области расположения сайта полиаденилирования был обнаружен потенциальный регуляторный район. В последовательности этого района между позициями +4539 и +4578 расположены четыре прямых повтора ATGAATGA (рис. 5-2). Первый и последний повторы отделены от двух центральных повторов четырьмя нуклеотидами и последовательность этого фрагмента гена в целом выглядит симметричной. Весьма существенно, что фрагмент содержит мотивы, имеющие сходство с последовательностями канонических сайтов связывания факторов транскрипции АР-1, Octamer, GATA и c-Ets. Как описано в предыдущих разделах, АР-1, Oct-Î, Oct-2 и GATA-3 являются важнейшими факторами, регулирующими транскрипцию гена ИЛ-5 человека. Поэтому логично было предположить, что данный район З'-нетранслируемой области может участвовать в регуляции транскрипции гена ИЛ-5 мыши.

Обозначения: HindlII (HyBamHI (В) - фрагмент гена ИЛ-5 мыши [Campbell et а)., 1988]; регуляторные элементы гена ИЛ-5 мыши - CLEO, мРЭ1, мРЭ1 и мЗ'-11Э (PC 1/111, повторы ATGAATGA обведены); | экзоны, alu пов-ры - alu повторы; репортёр - ген люциферазы. Конструкция выполнена на основе ментора p-Poly-III

Косвенное подтверждение того, что последовательность, содержащая прямые повторы ATGAATGA, может содержать регуляторные элементы, было получено в результате футпринтинга З'-нетранслируемой области гена

Рис. 5-2. Схема фрагмента гена ИЛ-5 мыши в

составе базовой репортёрной

мРЭ? мР31 и HI

конструкции.

ИЛ-5 мыши. Оказалось, что кодирующая и некодирующая цепи ДНК этого фрагмента гена обладают способностью взаимодействовать с ядерными белками клеток ЕЬ4. Район связывания с ядерными белками 3'-нетранслируемой области, содержащий повторы АТСААТОА, обозначен как мЗ'-ПЭ (рис. 5-2). Делеция этого района из базовой репортёрной конструкции, содержащей фрагмент гена ИЛ-5 мыши размером 9.5 кЬ (рис. 5-2), приводила к 3-х кратному падению уровня экспрессии репортёрного гена (таблица 2). Эти данные однозначно свидетельствуют о том, фрагмент гена, расположенный между позициями +4539 и +4585 содержит новый регуляторный элемент, принимающий участие в активации транскрипции гена ИЛ-5 мыши.

Таблица 2. Результаты пяти независимых экспериментов по исследованию экспрессии базовой конструкции и конструкции с делецией повторов АТОААТСА в активированных

Эксперимент 1 2 3 4 5

Активность люциферазы в клетках, трансфицированных базовой конструкцией (ере) 2756 ±377 2258 ±138 2380 ±253 1577 ±202 1437 ±166

Активность люциферазы в клетках, трансфицированных конструкцией с делецией мЭ'-ПЭ (ерв) 863 ±79 648 ±71 713 ±155 475 ±117 419 ±57

Активность конструкции с делецией мЗ'-ПЭ относительно активности базовой конструкции (%) 31.3 2В.7 38 30.1 29.2

При идентификации факторов транскрипции, входящих в состав ДНК-белковых комплексов мЗ'-ПЭ, были использованы ядерные экстракты из клеток EL4 и первичных лимфоцитов мыши. Оказалось, что Oct-1 участвует в формировании комплекса CI, АР-1 в формировании С2, a Oct-2 входит в состав СЗ (рис. 5-3).

Рис. 5-3. Идентификация ядерных белков, взаимодействующих с мЗ'-ПЭ. ЕМБА ядерных экстрактов из активированных клеток ЕЬ4 и олигонуклеотидной пробы, соответствующей мЗ'-ПЭ, с использованием антител к факторам транскрипции

Нвактивированные клетки Активированные клетки

I->-1

d Ct

При проведении компьютерного анализа последовательности 3'-нетранслируемой области гена ИЛ-5 человека мы не обнаружили мотивов, обладающих сходством с мЗ'-ПЭ. Футпринтинг З'-нетранслируемой области гена человека также не выявил сайтов, взаимодействующих с ядерными белками Т-клеток. Негативный результат был получен и при компьютерном скрининге последовательностей интронов гена ИЛ-5 человека.

Таким образом, результаты проведенных исследований продемонстрировали наличие существенных различий в функциональной и структурной организации регуляторных областей генов ИЛ-5 мыши и человека. Ярким примером функциональных различий структурно схожих районов промоторов являются элементы мРЭ1/2 и РЭ1/2. Действительно, последовательности и локализация этих элементов весьма консервативны для генов ИЛ-5 мыши и человека. Однако в контексте промотора гена мыши мРЭ1/2 действуют как активаторы транскрипции, в составе промотора гена человека они выполняют функции транскрипционного репрессора. Очевидно, что причиной полярного различия функций являются регуляторные белки, взаимодействующие с этими элементами. К сожалению, нам не удалось идентифицировать факторы, активирующие мРЭ1/2. Однако данные предварительного анализа позволяют предположить, что такими факторами могут быть NF-kB подобные белки. Участие белков семейства NF-kB в активации экспрессии генов цитокинов хорошо документировано [Kulms et al., 2006]. Таким образом, данные предварительного анализа факторов транскрипции, активирующих мРЭ1/2, согласуются с результатами функционального тестирования этих элементов промотора.

Кроме того, следует обратить внимание, что состав и локализация регуляторных элементов генов мыши и человека существенно различается. Так, в З'-нетранслируемой области гена мыши расположен позитивный регуляторный элемент; З'-нетранслируемая область гена человека не содержит аналогов этого элемента. Элемент GATA-400, обнаруженный в составе промотора гена человека (раздел 3.1), не имеет аналогов в последовательности гена мыши. В последовательности гена человека между позициями -244 и -237 локализован сайт связывания белков Octamer, участвующий в активации промотора [Mordvinov, Sanderson, 2001]. В соответствующем районе промотора гена мыши такой сайт отсутствует.

Вышеизложенные факты указывают на то, что механизмы регуляции экспрессии генов ИЛ-5 мыши и человека, по крайней мере, не идентичны. Очевидно, различные виды нашли отличающиеся пути тонкой регуляции продукции ИЛ-5. Таким образом, экспериментальные данные, полученные при использовании клеток мыши, не всегда могут адекватно отражать механизмы регуляции экспрессии ИЛ-5 в клетках человека.

6. Механизмы регуляции транскрипции гена ИЛ-5 человека

ИЛ-5 принадлежит к семейству индукторов кроветворения и иммунного ответа, членами которого являются также ИЛ-3, ИЛ-4, ИЛ-13 и ГМ-КСФ [Lampinen et al., 2004]. Гены, кодирующие эти белки, расположены на участке q31 хромосомы 5 человека и соответствующем районе 11-ой хромосомы мыши [McKenzie et al., 1993; Willman et al., 1993]. В активированных Т-лимфоцитах (субпопуляции ТхО и Тх2) эти гены могут экспрессироваться одновременно [Abbas et al., 1996; Stranick et al., 1997] и в литературе часто встречается выражение «активация экспрессии локуса Тх2 цитокинов» [Ansel et al., 2006; Dean, 2006]. Однако есть факты, указывающие на то, что помимо системы инициации экспрессии всех генов данного локуса, существуют регуляторные механизмы, позволяющие адресование индуцировать экспрессию отдельных генов, в частности, экспрессию гена ИЛ-5. Так, при скрининге аллореактивных Т-клеточных клонов, абсолютное большинство которых продуцировало широкий спектр лимфокинов, были обнаружены клоны, продуцирующие только ИЛ-5 [Warren et al., 1985]. При изучении эффекта цитокинов на первичные Т-клетки было показано, что стимуляция лимфоцитов с помощью ИЛ-2 индуцирует синтез мРНК ИЛ-5 и не влияет на экспрессию генов ИЛ-4 и ГМ-КСФ, ближайших соседей ИЛ-5 по локусу 5q31 - хромосомному локусу Тх2 цитокинов [Bohjanen et al., 1990]. При работе с Т-клетками периферической крови пациентов, страдающих инфекционно-аллергической формой бронхиальной астмы, установлено, что эти клетки секретируют повышенное количество ИЛ-5, в то время как уровень продукции других лимфокинов остаётся на низком уровне [Corrigan et al., 1992]. Таким образом, ген ИЛ-5 далеко не всегда ко-экспрессируется с генами других Тх2 цитокинов. Это подразумевает существование селективного контроля экспрессии отдельных генов лимфокинов или, по крайней мере, специфического контроля экспрессии гена ИЛ-5.

6.1. Механизм инициации транскрипции гена ИЛ-5 человека

Инициация экспрессии большинства генов лимфокинов, в частности, активация синтеза мРНК не зависит от синтеза белка de novo. К этому большинству относятся и гены цитокинов, расположенные в локусе 5q31. Исключением является лишь ген ИЛ-5. В ряде работ было показано, что индукция синтеза мРНК ИЛ-5 в первичных Т-клетках невозможна без синтеза белка de novo [Van Straaten et al., 1994; Stranick et al., 1995; Naora et al., 1995].

Рис. 6-1. Влияние CHX на синтез мРНК ИЛ-4, ИЛ-5 и ß-actin в интактных и активированных клетках PER-117 (пояснения в тексте)

Важно отметить, что зависимость инициации экспрессии гена ИЛ-5 от синтеза белка de novo сохранена и в клетках PER-117. Как показано на рис. 61, с помощью ОТ-ПЦР не удаётся обнаружить мРНК ИЛ-5 или ИЛ-4 в интактных клетках PER-117 (дорожка 1). Стимуляция клеток с помощью РМА в комбинации с Cal индуцирует синтез этих мРНК (дорожка 2). Ингибитор белкового синтеза циклогексимцд (cycloheximid, CHX) полностью блокирует активацию синтеза мРНК ИЛ-5, но не влияет на синтез мРНК ИЛ-4 (дорожка 3). Не влияет CHX и на синтез мРНК ИЛ-3, ИЛ-13 и ГМ-КСФ в клетках PER-117. Таким образом, инициация транскрипции гена ИЛ-5 в клетках PER-117 и первичных Т-клетках проходит, скорее всего, по сходным сценариям и наша клеточная модель может быть использована для исследования механизмов специфической регуляции экспрессии ИЛ-5.

Как упоминалось, CLEO играет исключительно важную роль в активации промотора гена ИЛ-5 (рис. 4-2). Следовательно, мы вправе предположить, что именно с этим элементом с наибольшей вероятностью должны взаимодействовать регуляторные белки, участвующие в инициации экспрессии гена ИЛ-5.

Экспрессия ИЛ-5 в клетках PER-1I7 может быть активирована с помощью реагентов, стимулирующих различные сигнальные пути (рис. 1-2).

PMA/Cal - + +

CHX - - +

ИЛ-5 Г- 1

ИЛ-4 1 fWt ví ^'J

р-actin Г " 1

1 2 Э

Не исключено, что условия клеточной стимуляции влияют на белковый состав транскрипционного комплекса CLEO. В этом случае наиболее вероятным кандидатом на роль основного активатора транскрипции гена будет фактор, взаимодействие которого с CLEO индуцируется в условиях всех используемых нами вариантов клеточной стимуляции.

При идентификации факторов транскрипции, связывающих CLEO ИЛ-5 человека при различных условиях клеточной активации, было выяснено, что Oct-1-содержащий комплекс является конститутивным и образуется как в реакциях с ядерными белками из нестимулированных клеток, так и при исследовании экстрактов из активированных клеток (рис. 6-2). Следует отметить, что ни один из использованных вариантов клеточной стимуляции не влияет на интенсивность формирования Oct-1-содержащего комплекса.

Стимуляция клеток i J I I! И Врем в часах

Рис. 6-2. Влияние условий клеточной стимуляции и СНХ на кинетику формирования комплексов О.ЕОИЛ-5 человека и ядерных белков из культур РЕЯ-117 (авторадиограммы с ядерными экстрактами, полученными из СНХ-обработанных клеток, были переэкспонированы по сравнению с другими авторадиограммами)

Комплекс, содержащий фактор транскрипции АР-1, является индуцибельным. Условия клеточной активации не влияют на субъединичный состав этого комплекса - во всех случаях он состоит из белков 1ипО и Рга-2.

тцсш

(WJeJW/C*

0КЙ1 Âfti 4— ôett

Комплекс, содержащий Oct-2, также является индуцибельным, однако, он формируется не при всех условиях клеточной стимуляции. Так, этот комплекс не образуется при РМА/сАМР активированной экспрессии ИЛ-5 (рис. 6-2). Таким образом, индуцибельным компонентом транскрипционного комплекса CLEO, присутствующим при всех условиях клеточной стимуляции, является АР-1. Эти данные говорят о ключевой роли данного фактора в регуляции экспрессии гена ИЛ-5.

При исследовании кинетики формирования комплекса ÁP-1 было обнаружено, что интенсивность его образования зависит от условий клеточной стимуляции (рис. 6-2). РМА является слабым индуктором взаимодействия CLEO с белками. Интенсивность формирования РМА-активированного комплекса АР-1 нарастает медленно и достигает максимума только после 12 часов клеточной стимуляции. РМА в комбинации с сАМР индуцирует АР-1 гораздо быстрее - максимум интенсивности формирования комплекса в этом случае приходится на интервал между 6 и 12 часами клеточной стимуляции. Затем интенсивность формирования комплекса существенно снижается. Комплекс АР-1, индуцированный РМА в комбинации с Cal, достигает максимальной интенсивности после 12 часов клеточной стимуляции и остаётся на этом уровне, по крайней мере, следующие 6 часов.

Существует ли корреляция между кинетикой формирования комплекса АР-1 и экспрессией гена ИЛ-5 в клетках PER-117? Чтобы ответить на этот вопрос, мы провели денситометрический анализ комплекса АР-1, индуцированного различными комбинациями клеточных стимуляторов, и определили кинетику продукции ИЛ-5 при этих условиях клеточной стимуляции.

На основании полученных данных можно заключить, что интенсивность формирования комплекса АР-1 прямо пропорциональна интенсивности продукции ИЛ-5 клетками PER-117 (рис. 6-3). Активация клеток с помощью одновременного использования РМА, сАМР и Cal обеспечивает наиболее высокий уровень индукции комплекса АР-1 (рис. 6-2) и самый высокий уровень экспрессии ИЛ-5 - более 500 пг/мл после 12 часов клеточной стимуляции.

Время в часах

Рис. 6-3. Кинетика продукции ИЛ-5 культурами PER-117 при различных условиях клеточной стимуляции (линии, левая ось) и кинетика формирования комплекса АР-1 CLEO ИЛ-5 человека (столбцы, правая ось). Значения плотности комплекса АР-1 выражены как отношение денситометрических характеристик комплекса АР-1 к денситометрическим данным комплекса Oct-1 CLEO ИЛ-5

СНХ полностью подавляет образование комплексов АР-1 и Oct-2 (рис. 6-2), что указывает на зависимость их образования от синтеза белка de novo. Однако, в отличие от АР-1, формирование Oct-2 содержащего комплекса CLEO не коррелирует с экспрессией ИЛ-5 в клетках PER-117. Продукция ИЛ-5 регистрируется ещё до появления этого комплекса. Следовательно, ведущую роль в инициации транскрипции гена ИЛ-5 играют, вероятно, белки, входящие в комплекс АР-1.

Проверка этого предположения была начата с исследования влияния клеточной активации на синтез белков, взаимодействующих с CLEO ИЛ-5. Как показано на рис. 6-4, ядерные белки из интактных и активированных в различных условиях клеток, содержат Oct-1. Первые 12 часов клеточная активация не влияет на уровень содержания Oct-1, однако, затем содержание этого фактора снижается (дорожки 1-13).

Белки Jun D и Fra-2 не были обнаружены в ядрах интактных клеток. Все использованные варианты клеточной активации индуцируют появление этих факторов в составе ядерных белков. Однако сигнал Fra-2 регистрируется только после 6 часов клеточной стимуляции (рис. 6-4, дорожки 3, 7 и 11), в то

время как сигнал Jun D появляется уже после 2 часов стимуляции (дорожки 2, 6 и 10). Cal и сАМР усиливают РМА-индуцированный синтез Fra-2 (сравните дорожки 3-5, 7-9 и 11-13) и не влияют на синтез Jun D.

Стимуляция клеток

РМА

РМА+сАМР РМА+СЫ

Время (часы) О 2 6 12 18 2 6 12 1ft 2 9 1% 18 ОСИ

Л* «МИМ*»

Fra2

JunD

Oct2

••щ

—пек

— 84 К

— «К

— 51К

— зек

— 51 К — зек Рис. 6-4. Влияние клеточной активации на кинетику синтеза

белков, взаимодействующих с

— 84 К CLEO ИЛ-5 человека.

— вгк Пояснения в тексте

1 2 S 4 S 8 Т « в 10 И 12 la

Oct-2 присутствует в ядрах интактных клеток. Клеточная стимуляция с использованием только РМА или РМА в комбинации с Cal ведёт к увеличению содержания этого фактора в составе ядерных белков (рис. 6-4, дорожки 1-5 и 10-13). Важно отметить, что Cal существенно усиливает действие РМА. Интересно, что сАМР таким эффектом не обладает. Первые 12 часов клеточная стимуляция с помощью РМА в комбинации с сАМР не влияет на содержание Oct-2 в ядрах клеток PER-117. К 18-ти часам в ядерных фракциях, полученных из этих культур, содержание Oct-2 снижается.

На основании полученных данных можно заключить, что в результате активации клеток PER-117, независимо от условий стимуляции, происходит инициация синтеза de novo АР-1-формирующих белков Jun D и Fra-2. Эти данные хорошо согласуются с результатами исследования формирования активного ДНК-белкового комплекса CLEO, обеспечивающего транскрипцию гена ИЛ-5 (рис. 6-2). Таким образом, результаты проведённых экспериментов указывают на ключевую роль Jun D и Fra-2 в механизме зависимости экспрессии гена ИЛ-5 от синтеза белка de novo. Действительно, остальные участники ДНК-белкового комплекса CLEO ИЛ-5, факторы транскрипции Oct-1 и Oct-2, постоянно присутствуют в ядрах клеток PER-117. После 12 часов стимуляции клеток, содержание Oct-1 снижается. Эффект клеточной активации на синтез Oct-2 зависит от условий стимуляции. Активация с

помощью только PMA или PMA в комбинации с Cal усиливает синтез этого белка, в то время как стимуляция РМА в комбинации с сАМР приводит к снижению содержания Oct-2. Эти факты указывают на то, что механизм зависимости экспрессии гена ИЛ-5'от синтеза белка de novo не связан с продукцией факторов Oct-1 и Oct-2.

Суммируя вышеизложенное, можно утверждать, что в значительной мере, если не полностью, механизм зависимости активации экспрессии гена ИЛ-5 от синтеза белка de novo базируется на зависимости инициации транскрипции гена от синтеза de novo субъединиц CLEO ИЛ-5 связывающего фактора АР-1. Несомненно, что этот механизм представляет собой весьма важный, но далеко не единственный уровень контроля инициации экспрессии гена ИЛ-5. Вполне вероятно, что очередной уровень системы контроля может опираться на механизмы регуляции экспрессии генов Jun D и Fra-2. Каков индивидуальный вклад механизмов регуляции экспрессии каждого из этих генов в систему контроля инициации экспрессии гена ИЛ-5?

Чтобы ответить на этот вопрос мы провели исследование синтеза мРНК Jun D и Fra-2 в клетках PER-117. Как видно на рис. 6-5, интактные клетки PER-117 содержат мРНК Jun D и не содержат мРНК Fra-2 (дорожка 1). Клеточная стимуляция с помощью РМА в комбинации с Cal инициирует синтез мРНК Fra-2 и усиливает синтез мРНК Jun D (дорожка 2). Эти данные говорят о конститутивном характере экспрессии гена Jun D и индуцибельном

Fra-2.

РМА/Са/ - +

Fra-2 1 - ■

Jun D

(3-actin —

1 2

Рис. 6-5. Влияние двухчасовой стимуляции с помощью РМА в комбинации с Cal на синтез мРНК Jun D и Fra-2 в клетках PER-117

Итак, данные экспериментов по исследованию синтеза мРНК и белков Jun Э и Рга-2 позволяют представить следующую схему инициации транскрипции гена ИЛ-5. В результате клеточной стимуляции происходит активация экспрессии гена Рга-2 и трансляции мРНК Jun Б. Вероятно, нестимулированные клетки содержат значительное количество мРНК Jun О,

что приводит к наработке в активированных клетках избыточного количества белка, необходимого для сборки CLEO ИЛ-5 связывающего фактора АР-1.

Для проверки этого предположения мы провели ингибиторный анализ экспрессии репортёрной конструкции -509/+44, несущей ген люциферазы под контролем промотора гена ИЛ-5 человека, с использованием антисмысловых РНК Fra-2 и Jun D. Источником антисмысловых РНК служили плазмиды, несущие фрагменты кДНК Fra-2 и Jun D в обратной ориентации, pSI-aFra-2 и pSI-aJun D. Эти конструкции были выполнены на основе экспрессионного вектора pSI, использованного при проведении ингибиторного анализа в качестве контрольной плазмиды.

зоо

SBO.

Î О

О &

100

Нести «купированные клетки

РМА

РИА/С ЛМР

Ко-траисфвкция: pSI

pSI-aFra-2 pShaJun D

PMA/Col

Рис. 6-6. Влияние антисмысловых РНК Рга-2 и .1ип О на активность промотора гена ИЛ-5 человека (кратности индукции определена относительно уровня активности люциферазы в нестимулированных клетках, трансфицированных репортёрной плазмидой и вектором рБ1)

Как показано на рис. 6-6, в результате экспрессии конструкции, кодирующей антисмысловую последовательность к мРНК Рга-2, активность люциферазы существенно снижается по сравнению с уровнем люциферазы в лизатах клеток, трансфицированных контрольным вектором. При экспрессии конструкции, кодирующей антисмысловую последовательность к мРНК 5\т О, такого эффекта не наблюдалось. Эти результаты поддерживают

предположение об избыточном содержании мРНК Jun D в активированных Т-клетках и ещё раз свидетельствуют о том, что белком, регулирующим интенсивность формирования комплекса АР-1, и, соответственно, уровень экспрессии гена ИЛ-5 является Fra-2.

Результаты исследований, изложенные в данном разделе, позволяют утверждать, что ключевым транскрипционным фактором, контролирующим инициацию экспрессии гена ИЛ-5 человека, является АР-1. Действительно, данные экспериментов по изучению кинетики взаимодействия CLEO с ядерными белками и влияния условий клеточной стимуляции на это взаимодействие демонстрируют, что именно АР-1-содержащий комплекс формируется первым, независимо от условий активации клеток. Более того, существует прямая корреляция между кинетикой формирования комплекса АР-1 и активностью экспрессии гена ИЛ-5 в клетках PER-117. Таким образом, можно заключить, что АР-1 контролирует не только инициацию транскрипции гена, но и уровень её активности. Следовательно, существует прямая зависимость между условиями клеточной стимуляции, определяющими активность экспрессии гена ИЛ-5, и интенсивностью синтеза, по крайней мере, одной из субъединиц АР-1.

Нам удалось показать, что такой субъединицей является Fra-2. Cal и сАМР усиливают PMA-индуцированный синтез Fra-2 и не влияют на синтез Jun D. Интересно, что индукция экспрессии гена Fra-2 полностью зависит от клеточной стимуляции - интактные клетки PER-117 не содержат мРНК Fra-2. Здесь уместно вспомнить, что активация экспрессии гена ИЛ-5 невозможна без синтеза белка ofe novo. Это ставит ген ИЛ-5 в особое положение по сравнению с другими генами цитокинов и позволяет говорить о существовании уникальной системы запуска экспрессии ИЛ-5. Согласно нашим данным такая уникальная система базируется на жестком контроле инициации транскрипции ИЛ-5. Жесткость заключается в том, что клеточная активация инициирует экспрессию Fra-2, который в свою очередь запускает экспрессию ИЛ-5. Роль Fra-2 как фактора, лимитирующего как инициацию, так и уровень активности экспрессии гена ИЛ-5 была подтверждена в экспериментах с использованием антисмысловых РНК Fra-2 и Jun D.

Следует отметить, что полученные данные могут иметь существенное значение не только при планировании дальнейших академических

исследований регуляции экспрессии гена ИЛ-5, но и при проведении прикладных работ, направленных на создание нового поколения фармакологических препаратов для лечения астмы и других аллергических заболеваний, сопровождающихся эозинофилией.

6.2. Механизм подавления экспрессии гена ИЛ-5 человека дексаметазоком

В настоящее время для лечения астмы и других аллергических заболеваний, сопровождающихся эозинофилией, активно используются синтетические глюкокортикоиды, в частности, дексаметазон. В результате применения этих препаратов у пациентов понижается содержание ИЛ-5 в легких и периферической крови [Charlesworth et al., 1991; Greenfeder et a!., 2001]. В бронхиалыю-альвеолярных смывах снижается также и количество Т-клеток, экспрессирующих мРНК ИЛ-5 [Robinson et al., 1993]. Однако, несмотря на широкое использование глюкокортикоидов при лечении аллергических заболеваний, механизмы, лежащие в основе действия этих препаратов на экспрессию гена ИЛ-5, изучены далеко не полностью.

Известно, что дексаметазон обладает способностью активировать механизмы, понижающие эффективность экспрессии генов цитокинов на транскрипционном, посттранскрипционном и даже посттрансляционном уровнях [Peppel et al., 1991; Adcock et al., 2001]. He исключено, что эффект дексаметазона на продукцию ИЛ-5 является результатом суммарного действия всех перечисленных механизмов. Однако регуляция экспрессии гена ИЛ-5 происходит на транскрипционном уровне, поэтому вероятнее всего, что основными мишенями дексаметазона в случае ИЛ-5 является именно механизмы транскрипций.

Глюкокортикоиды регулируют транскрипцию генов как с использованием механизма прямого воздействия на промоторную активность гена-мишени, так и опосредовано, активируя экспрессию белка, обладающего свойствами транскрипционного регулятора гена-мишени. Происходит это следующим образом: после проникновения в клетку глюкокортикоиды образуют комплекс с цитоплазматическим глюкокортикоидным рецептором (ГР). Этот комплекс, который чаще называют активированный ГР, перемещается в ядро, где он действует уже как фактор транскрипции. Промоторы ряда генов содержат регуляторные элементы, при взаимодействии

с которыми активированный ГР способен инициировать, усиливать или подавлять транскрипцию этих генов [Hayashi et al., 2004; Barnes, 2006].

Необходимо отметить, что согласно проведённому нами и другими авторами компьютерному анализу последовательности гена ИЛ-5 человека, его регуляторные области не содержат элементов, связывающих активированный ГР. Следовательно, весьма маловероятно, что эффект глюкокортикоидов, в частности, дексаметазона на экспрессию ИЛ-5 достигается в результате прямого взаимодействия активированного ГР с промотором гена. Скорее всего ингибирующее действие дексаметазона на транскрипцию ИЛ-5 осуществляется либо с помощью белка репрессора, экспрессия которого инициирована или усилена этим глюкокортикоидом в активированных Т-клетках, либо в результате подавления активированным ГР экспрессии факторов, обеспечивающих транскрипцию ИЛ-5.

В задачи данного этапа нашей работы входили идентификация регуляторных элементрв гена ИЛ-5 человека, активность которых подавляется дексаметазоном, и исследование механизма этого подавления. В частности, наше внимание было сфокусировано на решении вопроса о том, является ли эффект дексаметазона следствием прямого действия глюкокортикоида на факторы, участвующие в активации транскрипции ИЛ-5, или в данном случае задействованы белки-посредники, ингибирующие взаимодействие факторов транскрипции и регуляторных элементов гена.

Для определения участка промотора, содержащего дексаметазон-чувствигельные регуляторные элементы гена ИЛ-5, были использованы репортёрные конструкции, экспрессирующие люциферазу под контролем различных по размеру фрагментов промотора гена ИЛ-5 человека. Репортёрные конструкции транфицировали в клетки PER-117, часть клеток обрабатывали дексаметазоном. Обработанные глюкокортикоидом и контрольные культуры активировали различными комбинациями клеточных стимуляторов и после 16-ти часовой инкубации в стандартных условиях определяли в них уровень активности люциферазы.

В результате проведения этой серии экспериментов было установлено, эффект дексаметазона на экспрессию конструкций, содержащих первые 2000, 1300,509 и 60 (конструкция CLE0/TATA) п.о. промотора гена ИЛ-5 зависит от условий клеточной активации. Дексаметазон практически полностью подавляет экспрессию репортёрного гена в клетках, активированных РМА или

PMA в комбинации с сАМР и aCD28. В культурах же, стимулированных РМА в комбинации с Cal, дексаметазон не влияет на активность экспрессии этого гена (рис. 6-7). Эти данные согласуются с результатами, полученными при определении чувствительности экспрессии гена ИЛ-5 к действию дексаметазона в первичных Т-лимфоцитах человека и клетках PER-117 (раздел 1) и ещё раз указывают на то, что в определённых условиях клеточной активации дексаметазон не влияет на активность промотора гена ИЛ-5 человека.

i МО §. 12« Ig- 100

¡S 80

4 X

êS. 60 ö Ä

I o

I 29 0

Ь'

ta.

2000 ПН

Í1

PMA

cal

PMA PMA cAMP aCD28

140 130 100 80 «0 40 20 0

1300 пн

PMA

PMA Cal

PMA cAMP

PMA aCD28

1 100 l

tf "

I? «0

л *

§§■40

X ^

1 30

500 ПН,

CLE0/TATA

äl

PMA PMA PMA PMA Cal CAMP aCD28

1 4QÛQ

1 g ЗООО

1 fi 2000

X в 1000

PMA

PMA/Cal

Рис. 6-7. Активность люциферазы в культурах PER-117, трансфицированных конструкциями, содержащими первые 2000 (А), 1300 (Б), 509 (В) и 60 (Г, конструкция CLE0/TATA) п.о. промотора гена ИЛ-5 человека. Обозначения: К -нестимулированные культуры; PMA, PMA/Cal и т.д. - стимуляция различными комбинациями клеточных активаторов; белые столбцы - без дексаметазона; заштрихованные столбцы - обработка дексаметазоном

Поскольку дексаметазон обладал практически одинаковым эффектом на экспрессию репортёрных конструкций, использованных в данных экспериментах, можно заключить, что мишенью дексаметазона в контексте

промотора гена ИЛ-5 является CLEO, регуляторный элемент, обеспечивающий экспрессию минимальной плазмиды CLE0/TATA.

При проведении данной работы было показано, что CLEO выполняет функции ключевого регуляторного элемента промотора гена ИЛ-5 человека (раздел 4). Не исключено, что механизм подавления экспрессии гена ИЛ-5 дексаметазоном может включать ингибирование формирования транскрипционного комплекса С LEO. В ходе экспериментальной работы было выяснено, что аналогично действию дексаметазона на продукцию ИЛ-5, синтез мРНК этого цитокина и активность ИЛ-5 промотора в составе репортерных плазмид, эффект этого глкжокортикоида на формирование белковых комплексов CLEO зависит от условий клеточной активации. Нарушения взаимодействия CLEO и факторов транскрипции возникают в клетках, стимулированных РМА или РМА в комбинации с сАМР и aCD28, в то время как в PMA/Cal активированных культурах дексаметазон не оказывает влияния на ДНК связывающую активность CLEO (рис. 6-8).

Рис. 6-8. Влияние дексаметазона (Деке) на белоксвязывающую активность элемента CLEO ИЛ-5 человека (авторадиограммы с ядерными экстрактами, полученными из РМА/сАМР-стимулированных клеток, были переэкспонированы по сравнению с другими авторадиограммами)

На основании представленных выше данных можно предположить, что чувствительность или устойчивость транскрипции гена ИЛ-5 к действию дексаметазона зависит от спектра веществ, синтез которых индуцирует этот глюкокортикоид в клетках при различных условиях клеточной активации. Вполне возможно, что в реализации репрессорного механизма важную роль играет белок (или белки), синтез которого успешно проходит в РМА, РМА/сАМР и PMA/aCD28 стимулированных культурах. В отличие от этого, клеточная активация с помощью РМА в комбинации с Cal отменяет глюкокортикоидзависимый синтез белка, подавляющего транскрипцию гена

ИЛ-5, или экспрессия такого белка в PMA/Cal стимулированных культурах значительно понижена. В подобных условиях механизм подавления экспрессии гена ИЛ-5 эффективно реализоваться не может.

Ранее было показано, что в Т-клетках дексаметазон индуцирует экспрессию белка GILZ [D'Adamio et al., 1997]. Интересно, что GILZ обладает способностью взаимодействовать с фактором транскрипции АР-1. Предполагается, что в основе дексаметазонзависимого механизма подавления TCR-индуцированной экспрессии генов ИЛ-2 и рецептора ИЛ-2 лежит прямое взаимодействие G1LZ с АР-1. В результате этого взаимодействия АР-1 теряет свою ДНК-связывающую и, как следствие, регуляторную активность [Mittelstadt et al., 2001]. Эти факты позволяют предположить, что в основе дексаметазонзависимого механизма подавления транскрипции гена ИЛ-5 также лежит прямое взаимодействие GILZ с АР-1.

Проверку данного предположения мы начали с исследования возможности индукции синтеза мРНК GILZ в клетках PER-117. Установлено, что синтез этой мРНК происходит только в обработанных дексаметазоном культурах, стимулированных РМА или РМА в комбинации с сАМР и aCD28. В нестимулированных клетках или культурах, обработанных дексаметазоном и активированных РМА в комбинации с Cal, обнаружить мРНК G1LZ не удаётся (рис. .6-9). Таким образом, условия индукции мРНК GILZ дексаметазоном совпадают с условиями, при которых экспрессия гена ИЛ-5 чувствительна к действию этого глюкокортикоида. Использование Cal в качестве ко-активатора приводит к блокаде PMA-индуцированного синтеза мРНК GILZ.

Рис. 6-9. Влияние

дексаметазона

(Деке) на синтез

мРНК GILZ в

культурах PER-117,

стимулированных

различными

комбинациями

клеточных

активаторов

GAPDH

GILZ

Полученные данные указывают на прямую корреляцию между синтезом мРНК и эффектом дексаметазона на экспрессию гена ИЛ-5, что

косвенно подтверждает предположение о возможном участии белка СГЬ2 в реализации дексаметазонзависимого механизма подавления транскрипции ИЛ-5.

Для того чтобы получить прямые свидетельства влияния GlLZ на активность промотора гена ИЛ-5, мы использовали репортёрный анализ в комбинации с эктопической экспрессией данного белка. В результате были получены данные, демонстрирующие, что в РМА/сАМР-стимулированных клетках РЕЯ-117 йИ^ подавляет активность промотора гена ИЛ-5 (рис. 6-10). Аналогичные результаты получены и при проведении экспериментов с использованием РМА/аС028-стимулированных клеток.

а. «

ff Îl с «

-509/+44

140 120 100 80 60 40 20

□ pcDNA3.1 H pcONA3.1-GIL2 ■ pcDNA3.1-Lac2

Н/клетки

PMA/cAMP

Рис. 6-10. Влияния GILZ на экспрессию репортёрных конструкций, содержащих первые 509 (А, плазмида -509/+44) и 60 (Б, плазмида CLE0/TATA) п.о. промотора гена ИЛ-5 человека в нестимулированных (Н/клетки) и РМА/сАМР-активированных культурах PER-117. Для эктопической продукции GILZ использована конструкция pcDNA3.1-GILZ, содержащая кДНК GILZ.B контрольных экспериментах данная конструкция была заменена на плазмиду pcDNA3.1-LacZ, содержащую кДНК LacZ, и базовый вектор pcDNA3.1

Следует отметить, что ингибирующий эффект GILZ на экспрессию конструкции -509/+44 практически не отличается от эффекта этого белка на активность конструкции CLE0/TATA. Это подтверждает данные, полученные в экспериментах по определению мишени дексаметазона в контексте промотора гена ИЛ-5, и указывает на то, что GILZ полностью блокирует активность CLE0.

Роль GILZ как ингибитора активности CLEO ИЛ-5 была подтверждена с помощью экспрессии репортёрной конструкции CLE0/TATA в PMA/Cal-стимулированных клетках PER-117. Как упоминалось выше, в этих условиях клеточной активации дексаметазон не индуцирует экспрессию гена GILZ и, очевидно, как следствие, не влияет на экспрессию репортёрных плазмид в клетках PER-117. Однако избыточная продукция GILZ ингибирует активность конструкции CLE0/TATA в РМА/Са1-стимулированных клетках PER-117 (рис. 6-11). Таким образом, в условиях блокады экспрессии гена GILZ с помощью Cal эктопическая продукция этого белка приводит к подавлению активности CLEO ИЛ-5.

Рис. 6-11. Влияния GILZ на экспрессию репортёрной конструкции CLE0/TATA в нестимулированных и РМА/Са1-активированных культурах PER-117. Пояснения к обозначению экспрессионных конструкций в подписи рис. 6-10

Ещё одно доказательство того, что подавление активности CLEO ИЛ-5 является следствием именно эктопической продукции GILZ, было получено в экспериментах с использованием культуры клеток Jurkat. Дело в том, что эти клетки не содержат функционально активный глюкокортикоидный рецептор [Northrop et ai., 1992]. Следовательно, в культуре Jurkat дексаметазон не может инициировать активность какого-либо механизма, модифицирующего транскрипцию генов. Действительно, обработка клеток Jurkat дексаметазоном при любых условиях клеточной стимуляции не влияет на активность экспрессии репортёрных конструкций, использованных в данном исследовании (рис. 6-12А). Однако эктопическая продукция белка GILZ ингибирует активность конструкции CLE0/TATA в PMA/Cal-стимулированных клетках Jurkat (рис. 6-12Б). Аналогичные результаты получены для РМА/сАМР- и РМА/аС028-стимулированных клеток Jurkat.

5000-

й 4000

о. ®

Ь зооо

2000

1000

PCDNA3.1 PCDNA3.1-GILZ

0~|__I......"ЛП'Ц,——.

Нестимулированные

■тлки

Данные результаты ещё раз указывают на то, что GILZ обладает способностью подавлять транскрипцию гена ИЛ-5, в частности, ингибировать активность CLEO, ключевого регуляторного элемента промотора.

г зо

Контроль Деке

рсОМАЗ.1 pcDNA3.1-GILZ

Рис. 6-I2A. Влияния дексаметазона на экспрессию конструкции CLE0/TATA в РМА/сАМР-стимулированных культурах Jurkat. Б. Влияния GILZ на экспрессию конструкции CLE0/TATA в РМА/Са1-стимулированных культурах Jurkat. Пояснения к обозначению экспрессионных конструкций в подписи рис. 6-10

Вполне вероятно, что в основе этого эффекта лежит прямое взаимодействие GILZ с фактором транскрипции АР-1. В результате GILZ подавляет ДНК-связывающую активность АР-1, происходит нарушение образования ДНК-белковых комплексов CLEO и, как следствие, блокируется активность промотора.

Для проверки данного предположения мы исследовали влияние белка GILZ, наработанного в клетках COS-7, на формирование ДНК-белковых комплексов CLEO ИЛ-5. Как показано на рис. 6-13, GILZ подавляет образование CLEO-белковых комплексов, причём эффективность действия GILZ находится в прямо пропорциональной зависимости от количества этого белка в реакциях связывания.

CLE0O + + + + + + Экстракт +- + ++ +

GILZ

+ ++ +++ ++++

Рис. 6-13. Влияния белка GILZ на взаимодействие ,CLE0 и ядерных экстрактов из РМА/сАМР-активированных клеток PER-117: в реакциях связывания использованы нарастающие количества G1LZ

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о том, что G1LZ препятствует взаимодействию ядерных белков и CLEO ИЛ-5. Эти данные хорошо согласуются с результатами исследований, изложенными в других разделах, и позволяют заключить, что механизм подавления транскрипции ИЛ-5 дексаметазоном заключается в следующем. В определённых условиях клеточной активации глюкокортикоид инициирует в клетках экспрессию GILZ. Этот белок ингибирует активность CLEO, что и приводит к подавлению транскрипции гена. Ингибирование активности CLEO происходит, скорее всего, в результате взаимодействия GILZ и АР-1, однако, для окончательных выводов требуется дополнительная экспериментальная работа.

ВЫВОДЫ

Полученные при выполнении настоящей работы данные позволяют реконструировать систему организации регуляторных районов и механизмы регуляции транскрипции генов ИЛ-5 человека и мыши. Они способствуют дальнейшему развитию представлений о структурно-функциональной организации регуляторных районов генов лимфоцитарных цитокинов, общих и ген-специфических механизмах контроля их экспрессии, а также укрепляют экспериментальную базу исследования этих механизмов. Вышесказанное мотивируются следующими конкретными выводами:

1. Предложена новая клеточная модель для изучения механизмов активации и регуляции экспрессии генов ИЛ-5 и ИЛ-4 человека -перевиваемая линия Т-клеток человека PER-117. Адекватность модели доказана экспериментально:

• Показано, что характер инициации транскрипции генов ИЛ-5 и ИЛ-4 в клетках PER-117 не отличается от характера инициации транскрипции этих генов в Т-лимфоцитах, полученных из периферической крови здоровых доноров.

• Установлено, что механизмы регуляции транскрипции гена ИЛ-5 в клетках PER-117 совпадают с механизмами регуляции транскрипции этого гена в первичных Т-лимфоцитах человека.

• Продемонстрировано, что характер продукции ИЛ-5 в клетках PER-117 не отличается от характера продукции этого белка в первичных Т-лимфоцнтах человека.

2. Проведено структурно-функциональное картирование промотора гена ИЛ-5 человека.

• Показано, что регуляторный элемент CLEO контролирует инициацию транскрипции гена.

• Обнаружены новые уникальные элементы - РЭ1 и РЭ2, обладающие свойствами репрессоров индуцированной активности промотора.

3. Впервые идентифицированы ключевые белки, регулирующие транскрипцию гена ИЛ-5 человека, и установлен механизм инициации и регуляции транскрипции гена.

• Показано, что основным фактором, контролирующим запуск транскрипции, является белок Fra-2, входящий в состав CLEO-связывающего комплекса АР-1.

• Предложена модель инициации и регуляции транскрипции гена ИЛ-5 человека.

4. Впервые показано, что фактор транскрипции GATA-3 непосредственно участвует в регуляции активности промоторов генов ИЛ-5 и ИЛ-4 человека.

• В составе промоторов генов ИЛ-5 и ИЛ-4 человека обнаружены новые элементы GATA, действующие как репрессоры базальной и индуцированной транскрипции.

• Установлено, что все функционально активные элементы GATA промоторов генов ИЛ-5 и ИЛ-4 человека взаимодействуют с фактором GATA-3. Таким образом, этот белок взаимодействует как с регуляторными элементами, участвующими в активации транскрипции, так и с элементами, действующими как репрессоры транскрипции.

• Предложена модель регуляции транскрипции, в которой GATA-3 рассматривается как архитектурный фактор, обеспечивающий функционально активную пространственную структуру промоторов генов ИЛ-5 и ИЛ-4 человека.

5. Впервые показано, что механизм подавления транскрипции гена ИЛ-5 человека дексаметазоном связан с экспрессией глюкокортикоид-индуцируемого гена GILZ. Установлено, что мишенью белка GILZ в контексте промотора гена ИЛ-5 является ключевой регуляторный элемент CLEO.

6. Впервые проведено структурно-функциональное картирование 3'-нетранслируемой области гена ИЛ-5 мыши. Идентифицированы белки, входящие в состав транскрипционных комплексов, участвующих в регуляции экспрессии гена ИЛ-5 мыши. В результате обнаружены существенные различия в организации регуляторных районов и составе факторов транскрипции, регулирующих транскрипцию генов ИЛ-5 мыши и человека.

• В З'-нетранслируемой области гена ИЛ-5 мыши найден новый позитивный регуляторный элемент, не имеющий аналогов в гене ИЛ-5 человека.

• Регуляторные элементы мРЭ1 и мРЭ2 гена ИЛ-5 мыши, аналоги которых в гене человека участвуют в подавлении индуцированной активности промотора, в составе промотора гена мыши действуют как активаторы транскрипции.

• Обнаружены существенные различия в составе белковых комплексов, регулирующих активность элементов CLEO, РЭ1 и РЭ2 генов ИЛ-5 мыши и человека.

7. Найденные различия в струкзурно-функциональной организации регуляторных районов и в составе транскрипционных белковых комплексов указывают на то, что механизмы регуляции экспрессии генов ИЛ-5 мыши и человека, по крайней мере, не идентичны. Таким образом, экспериментальные данные, полученные при исследовании регуляции экспрессии гена ИЛ-5 мыши, не могут адекватно отражать механизмы регуляции экспрессии ИЛ-5 человека и результаты, полученные при использовании гетерологичных систем (клеточные линии мыши - ген человека) должны быть интерпретированы с большой осторожностью.

СПИСОК СТАТЕЙ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Karlen S., Mordvinov V.A. and Sanderson C.J. (1996). How is expression of the interleukin-5 gene regulated? Immunol. Cell Biol.74:218-223.

2. Karlen S., De Boer M., Lipscombe R.J., Lutz W., Mordvinov V.A. and C.J. Sanderson. (1998). Biological and molecular characteristics of interleukin-5 and its receptor. Int. Rev. Immun. 16:227-247.

3. Schwenger G.T.F., Mordvinov V.A.. Karlen S. and Sanderson C.J. (1998). Identification of two palindromic regulatory elements (mPREl-IL5 and mPRE2-IL5) in the murine interleukin-5 promoter. Molecular Immunology 35:149-158.

4. De Boer M.L., Mordvinov V.A,. Thomas M.A. and Sanderson C.J. (1999). Role of nuclear factor of activated T cells (NFAT) in the expression of interleukin-5 and other cytokines involved in the regulation of hemopoetic cells. Int. J. Biochem. Cell Biol. 31, no. 10:1221-1236.

5. Mordvinov V.A.. Peroni S.E., De Boer M.L., Kees U.R. and Sanderson C.J. (1999). A human T-cell line with inducible production of interleukins 5 and 4. A model for studies of gene expression. J. Immunol. Methods 228, no. 1-2:163-168.

6. Mordvinov V.A.. Schwenger G.T.F., Fournier R., De Boer M.L., Peroni S.E., Singh A.D., Karlen S„ Holland J.W. and Sanderson C.J. (1999). Binding of YY1 and Octl to a novel element that downregulates expression of IL-5 in human T cells. J. Allergy Clin. Immunol. 103, no. 6:1125-1135.

7. Sanderson C.J., De Boer M., Senna-Salerno M., Schwenger G.T.F., Thomas M., Mordvinov V.A. and Karlen S. (1999). Regulation of interleukin-5 gene expression. In: Interleukin-5: From Molecule to Drug Target for Asthma (ed: C.J. Sanderson). Marcel Dekker, New York, p 267-287.

8. Schwenger G.T., Fournier R., Hall L.M., Sanderson C.J. and Mordvinov V.A. (1999). Nuclear factor of activated T cells and YY1 combine to repress IL-5 expression in a human T-cell line. J. Allergy Clin. Immunol. 104, no. 4 Pt 1:820827.

9. Thomas M.A., Mordvinov V.A. and Sanderson C.J. (1999). The activity of the human interleukin-5 conserved lymphokine element 0 is regulated by octamer factors in human cells. Eur. J. Biochem. 265, no. 1:300-307.

10. Sanderson C.J., Mordvinov V.A.. Schwenger G.T.F., Thomas M., Fournier R., De Boer M. (1999). Key regulatory elements in the control of IL-5 transcription. Short papers of Eosinophil ¡999, The Biology of the Eosinophil, p. 54.

11. Schwenger G.T.F., Mordvinov V.A.. Fournier R., Czabotar P., Peroni S., Sanderson C.J. IL-5. In: Oppenheim J.: A Compendium of Cytokines and Other Mediators of Host Defense. Academic Press. 2000, v. 1, p. 307-341.

12. Schwenger G.T.F., Mordvinov V.A.. Fournier R., Czabotar P., Peroni S. and Sanderson C.J. (2000). Interleikin-5. In: Academic Press Cytokine Reference Database. D01:10.1006/rwcy.2000.0902.

13. Senna-Salernó M., Mordvinov V. A. and Sanderson, C. J. (2000). Binding of octamer factors to a novel З'-positive regulatory element in the mouse interleukin-5 gene. J. Biol. Chem. 275, no 6:4525-4531.

14. Mordvinov V.A. and Sanderson C.J. (2001). Regulation of Interleukin-5 expression. Archivum Immunologiae et Therapiae Experimentalis 49:345-351.

15. Senna-Salerno M., Schwenger G.T.F., Sanderson C.J. and Mordvinov V. A. (2001). Binding of octamer factors to the murine interleukin-5 conserved lymphokine element 0 in primary T-cells and a T-cell line. Cytokine 15, no. 1:4-9.

16. Schwenger G.T.F., Fournier R., Кок C.C., Mordvinov V.A.. Yeoman D. and Sanderson C.J. (2001). GATA-3 has dual regulatory functions in human interleukin-5 transcription. J. Biol. Chem. 276, no. 51:48502-9.

17. Schwenger G.T. F., Кок C.C., Arthaningtyas E., Thomas M.A., Sanderson C.J., Mordvinov V.A. (2002). Specific activation of human interleukin-5 depends on de novo synthesis of an AP-1 complex. J. Biol. Chem. 211, no. 49:47022-7.

18. Швенгер Г.Т.Ф., Мордвинов B.A.. Сандерсон К.Дж. Фактор транскрипции GATA-3 участвует в подавлении активности промотора гена интерлейкина-4 человека. Биохимия. 2005, т. 70, с. 1289-1294.

19. Мордвинов В.А., Кок Ч.Ч., Артанингтяс Э., Швенгер Г.Т.Ф., Кристоу А., Савдерсон К.Дж. Дексаметазон подавляет активность промотора гена интерлейкина-5 человека. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2005, т. 140, стр. 91-95.

20. Arthaningtyas Е., Kok С.С., Mordvinov V.A.. Sanderson C.J. (2005). The conserved lymphokine element 0 is a powerful activator and target for corticosteroid inhibition in human interleukin-5 transcription. Growth Factors. 23, no. 3:211-21.

МОРДВИНОВ ВЯЧЕСЛАВ АЛЕКСЕЕВИЧ

Автореф. дисс. на соискание ученой степени доктора биологических наук. Подписано в печать 05.05.2008. Заказ № 30. Формат 60x90/16. Усл. печ. л. 3. Тираж 100 экз. Типография Института катализа им. Г.К. Борескова СО РАН

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Мордвинов, Вячеслав Алексеевич

Список использованных сокращений

Введение

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Общие представления о цитокинах

1.2. Общие представления о механизмах регуляции транскрипции генов эукариот.

1.2.1. Коровый промотор

1.2.2. Промоторный и отдаленные регуляторные районы

1.2.3. Белки, контролирующие транскрипцию

1.2.4. Активация факторов транскрипции

1.3. Биологические свойства ИЛ

1.3.1. Активация экспрессии гена ИЛ

1.3.2. Структура гена ИЛ-5 и регуляция его экспрессии

1.4. Влияние глюкокортикоидов на эозинофилию и экспрессию гена ИЛ

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Материалы

2.1.1. Реагенты

2.1.2. Этическая комиссия

2.1.3. Перевиваемые и первичные культуры клеток, их культивирование и стимуляция; бактериальные штаммы

2.1.4. Генно-инженерные конструкции, использованные в экспериментах по футпринтингу и в репортёрном анализе

2.2. Методы

2.2.1. Приготовление электрокомпетентных клеток E.coli и их трансформация

2.2.2. Очистка ДНК и РНК, синтез кДНК, гидролиз с использованием эндонуклез рестрикции и лигирование ДНК, электрофорез и выделение фрагментов ДНК из агарозного геля, направленный мутагенез и секвенирование ДНК

2.2.3. Получение фрагментов ДНК с использованием полимеразной цепной реакции (ПЦР) и ПЦР с детекцией в реальном времени

2.2.4. Трансфекция клеточных культур, определение активности люциферазы и измерение содержания ИЛ-5 человека в культуральной среде

2.2.5. Футпринтинг, методы задержки ДНК-зондов в геле и вестерн-блот

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1. Выбор перевиваемой клеточной линии для исследования структурно-функциональной организации промотора и механизмов регуляции экспрессии гена ИЛ-5 человека

3.1.1. Поиск перевиваемых Т-клеточных линий человеческого происхождения, индуцибельно экспрессирующих гены ИЛ-5 и ИЛ

3.1.2. Продукция ИЛ-5 клетками линии PER

3.1.3. Влияние дексаметазона на экспрессию гена ИЛ-5 в клетках

PER-117 и первичных культурах Т-лимфоцитов

3.1.4. Трансфекция клеток PER

Введение Диссертация по биологии, на тему "Структурно-функциональная организация регуляторных районов и механизмы транскрипции генов интерлейкина-5 человека и мыши"

Актуальность исследования

Множество фактов, полученных при проведении исследований в области молекулярной биологии, иммунологии и физиологии, указывают на существование коммуникационной сети, обеспечивающей связь иммунной, нервной, эндокринной, кроветворной и других систем организма [Eskandari, Sternberg, 2002; Guijarro et al., 2006]. Эта сеть необходима для поддержания гомеостаза организма, взаимной регуляции активности его отдельных систем и формирования согласованных реакций в ответ на внешние воздействия. Важными компонентами коммуникационной сети являются секретируемые клетками факторы, осуществляющие информационную связь между различными системами организма.

Значительная часть этих факторов имеет белковую природу. К ним относятся цитокины - большая группа регуляторных белков, осуществляющих передачу межклеточных сигналов. Нормальная работа коммуникационной сети организма во многом базируется на механизмах, лежащих в основе регуляции экспрессии генов цитокинов. Однако эти механизмы изучены далеко недостаточно, что существенно затрудняет понимание закономерностей взаимодействия клеток различных типов, отдельных систем организма и формирования его реакций. Иными словами, многие общие и частные проблемы физиологии, иммунологии и других биологических дисциплин требуют исследования механизмов регуляции экспрессии генов цитокинов. Следует добавить, что изучение контроля экспрессии как отдельных генов цитокинов, так и генных кластеров, объединяющих гены цитокинов определённого типа, решает также задачи одной из важнейших проблем молекулярной биологии -исследования механизмов регуляции экспрессии генов эукариот.

Таким образом, актуальность исследования контроля экспрессии генов цитокинов определяется как минимум двумя факторами. Во-первых, гены цитокинов являются хорошей моделью для изучения механизмов экспрессии генов эукариот. Во-вторых, данные, полученные при изучении регуляторных механизмов экспрессии генов цитокинов, полезны как для развития академических исследований закономерностей организации и функционирования коммуникационной сети организма, так и для прикладных работ, связанных с поиском возможности коррекции нарушений в работе сети.

Эозинофилы - это циркулирующие в крови и способные проникать в ткани гранулярные лейкоциты. У здоровых людей и животных обнаруживается небольшое количество этих клеток. В норме число эозинофилов в периферической крови человека колеблется от 250 до 450 клеток/мкл. Согласно существующим представлениям, эозинофилы являются эффекторными клетками и представляют в системе иммунитета основное звено противопаразитарной защиты [Voehringer, 2007]. Предполагается, эозинофилы способны атаковать гельминтов и вызывать у них повреждения с помощью таких белков, как большой основной протеин (БОП), эозинофильный катионный протеин (ЭКП), эозинофильная пероксидаза (ЭПО), эозинофильный нейротоксин (ЭН) [Гриншпун, Виноградова, 1983; Хейхоу, Кваглино, 1983; Hogan, 2007].

Следует отметить, что эти белки токсичны не только для паразитов, но и для клеток млекопитающих. Известно, что ЭН способен серьезно повреждать нервные волокна, БОП и ЭКП связывают гепарин и нейтрализуют его противосвертывающую активность, ЭПО в присутствии перекиси водорода и галогенов генерирует окислительные радикалы, которые в свою очередь проникают в клетки окружающей ткани и нарушают многие клеточные процессы [Анаев, 2003]. Таким образом, зрелые эозинофилы в избыточном количестве способны вызывать повреждение тканей и способствовать развитию различных патологий.

Известно достаточно много заболеваний, при которых возникает эозинофилия - возрастание количества эозинофилов [Peros-Golubicic, Smojver-Jezek, 2007; Bain, 2007; Wechsler, 2007; Ogbogu et al., 2007; Zuo, Rothenberg, 2007; Leiferman et al., 2007]. Наиболее часто эозинофилия встречается при различных формах аллергии. К аллергическим заболеваниям или патологическим состояниям, сопровождающимся накоплением зрелых эозинофилов в тканях и возрастанием их числа в периферической крови, относятся бронхиальная астма, отек Квинке, крапивница [Паттерсон и соавт., 2000; Beltrani, 2005; García, 2006; Chanez et al., 2006]. Кроме аллергии, эозинофилия характерна для паразитарных заболеваний (описторхоз, аскаридоз, лямблиоз, трихинеллез и др.), коллагенозов (ревматизм, дерматомиозит, системная красная волчанка), некоторых тяжелых заболеваний крови (хронический миелолейкоз, лимфогранулематоз) и инфекций (скарлатина, сифилис, туберкулез) [Badmos et al., 2006; Lai et al., 2007; Ostezan, Callen, 1996; Thomeer et al., 1999; Bain, Fletcher, 2007; Fletcher, Bain, 2007a; Tefferi, Vardiman, 2007; Ardelean, Pope, 2006; Bass et al., 2001; Martínez-García et al., 2000; Sharma, Bethlem, 1996]. Эозинофилия может возникнуть при применении некоторых лекарственных препаратов (антибиотики, сульфаниламиды и др.) [Valeyrie-Allanore et al., 2007; Maoz, Brenner, 2007; Rupee et al., 2007; Fletcher, Bain, 20076]. Описаны также наследственные формы эозинофилии [Blanchard et al., 2006; Meurer et al., 2006; Simon, Simon, 2007; Zink et al., 2007].

Как уже упоминалось выше, основным фактором, контролирующим созревание и функциональную активность эозинофилов, является ИЛ-5. Широкая распространенность заболеваний, сопровождающихся эозинофилией, подчеркивает актуальность изучения механизмов экспрессии гена ИЛ-5. Структурно-функциональное картирование регуляторных районов гена, идентификация белков, определяющих активность отдельных элементов этих районов, и выяснение механизмов инициации и регуляции транскрипции гена могут дать ключ к пониманию процессов развития эозинофилии. Кроме того, данные, полученные при исследовании механизмов инициации и регуляции транскрипции гена ИЛ-5, могут быть использованы при поиске новых фармакологических препаратов для лечения заболеваний, сопровождающихся эозинофилией.

Цель и задачи исследования

Провести структурно-функциональное картирование регуляторных районов генов ИЛ-5 человека и мыши.

Идентифицировать белки, взаимодействующие с функционально активными элементами регуляторных районов и определить их роль в регуляции транскрипции генов ИЛ-5 человека и мыши. Выяснить основные механизмы инициации и регуляции транскрипции генов ИЛ-5 человека и мыши.

Каждая из поставленных задач представляла собой самостоятельное исследование. Поэтому глава 3, в которой изложены результаты данной работы, разделена на части, соответствующие определённым задачам. Части главы 3 выстроены в порядке хронологии получения результатов, что, с точки зрения автора, объясняет логику развития исследований.

Научная новизна

Согласно современным представлениям, основные события, определяющие активность экспрессии генов, происходят на транскрипционном уровне. Ведущую роль в этих событиях играют регуляторные белки - факторы транскрипции, взаимодействующие с определёнными последовательностями ДНК - регуляторными элементами или функционально активными сайтами регуляторных областей гена [Greenblatt, 1992; Romberg, 2001; Istrail, Davidson, 2005; Kodadek et al., 2006; Romberg, 2007]. Таким образом, набор регуляторных элементов и факторов транскрипции фактически формирует программу экспрессии генов в онтогенезе, определяет её тканеспецифичность и реакции на различные сигналы внешней и внутренней среды. В связи с этим исключительно важное значение имеют исследования, направленные на выявление и изучение функциональных характеристик регуляторных элементов различных генов, идентификацию факторов транскрипции, активирующих эти элементы, выяснение принципов структурно-функциональной организации регуляторных областей генов и механизмов, контролирующих инициацию и уровень транскрипции.

При выполнении данной работы впервые было проведено системное картирование функционально активных элементов регуляторных районов генов ИЛ-5 человека и мыши. В частности, показано, что регуляторный элемент CLEO контролирует инициацию транскрипции гена ИЛ-5 человека. В последовательности промотора этого гена обнаружены новые уникальные элементы - РЭ1 и РЭ2, принимающие участие в подавлении индуцированной транскрипции. В составе промоторов генов ИЛ-5 и ИЛ-4 человека обнаружены новые элементы GATA, действующие как репрессоры базальной и индуцированной транскрипции.

Идентифицированы ключевые белки, регулирующие транскрипцию гена ИЛ-5 человека, и установлен механизм инициации и регуляции транскрипции гена. Продемонстрировано, что основным фактором, контролирующим запуск транскрипции, является белок Fra-2, входящий в состав CLEO-связывающего комплекса АР-1. Кроме того, впервые показано, что механизм подавления транскрипции гена ИЛ-5 человека дексаметазоном связан с экспрессией глюкокортикоид-индуцируемого гена GILZ. Выяснено, что мишенью белка GILZ в контексте промотора гена ИЛ-5 является ключевой регуляторный элемент CLEO.

Впервые проведено структурно-функциональное картирование 3'-нетранслируемой области гена ИЛ-5 мыши и найден новый позитивный регуляторный элемент, не имеющий аналогов в гене ИЛ-5 человека. Обнаружено, что регуляторные элементы мРЭ1 и мРЭ2 гена ИЛ-5 мыши, аналоги которых в гене человека участвуют в подавлении индуцированной активности промотора, в составе промотора гена мыши действуют как активаторы транскрипции.

Идентифицированы белки, входящие в состав транскрипционных комплексов, участвующих в регуляции экспрессии гена ИЛ-5 мыши. В результате обнаружены существенные различия в организации регуляторных районов и составе факторов транскрипции, регулирующих транскрипцию генов ИЛ-5 мыши и человека.

Впервые показано, что фактор транскрипции GATA-3 непосредственно участвует в регуляции активности промоторов генов ИЛ-5 и ИЛ-4 человека. В частности, установлено, что все функционально активные элементы GATA промоторов генов ИЛ-5 и ИЛ-4 человека взаимодействуют с фактором GATA-3. Таким образом, этот белок взаимодействует как с регуляторными элементами, участвующими в активации транскрипции, так и с элементами, действующими как репрессоры транскрипции.

Практическая значимость

Результаты работы позволяют рекомендовать перевиваемую линию Т-клеток человека PER-117 в качестве модели для изучения механизмов активации и регуляции экспрессии генов ИЛ-5 и ИЛ-4 человека. По запросам, сделанным после публикации материалов данной диссертационной работы, данная клеточная линия была передана ряду исследователей из академических учреждений и в фармацевтическую компанию AMRAD Corporation Limited.

Ведущая роль ИЛ-5 в регуляции продукции и активации эозинофилов обусловливает практическую значимость исследований структурно-функциональной организации регуляторных областей гена этого цитокина и механизмов, контролирующих его экспрессию. В частности, согласно результатам данного исследования перспективными мишенями для фармакологических препаратов для лечения заболеваний, сопровождающихся эозинофилией, являются ключевой регуляторный элемент CLEO гена ИЛ-5 человека и ядерные белки, определяющие функциональную активность этого элемента. Кроме того, данные, полученные при выяснении механизма подавления транскрипции гена ИЛ-5 человека дексаметазоном, могут быть использованы при поиске новых фармакологических препаратов для лечения заболеваний, сопровождающихся эозинофилией.

Практическое значение имеют также данные о различиях в структурно-функциональной организации промоторов и З'-нетранслируемых областей генов ИЛ-5 человека и мыши. Эти данные указывают на то, что экспериментальные данные, полученные при исследовании регуляции экспрессии гена ИЛ-5 мыши, не могут адекватно отражать механизмы регуляции экспрессии ИЛ-5 человека.

Основные положения работы, выносимые на защиту

4. Мишенью дексаметазона в контексте регуляторных элементов гена ИЛ-5 человека является CLE0. При определённых условиях клеточной стимуляции дексаметазон индуцирует экспрессию гена, кодирующего белок GILZ. Этот белок ингибирует активность CLE0 ИЛ-5, что и приводит к подавлению транскрипции гена.

Апробация результатов диссертации и благодарности

По материалам диссертации в рецензируемых отечественных и зарубежных изданиях опубликовано 20 статей.

Настоящая работа была выполнена в Институте цитологии и генетики Сибирского отделения Российской академии наук (ИЦиГ СО РАН, г. Новосибирск), университете Западной Австралии (the University of Western Australia, Perth) и Технологическом университете Перта (Curtin University of Technology, Perth, Western Australia). Подавляющее большинство экспериментальных данных было получено в в группе профессора Colin J. Sanderson (Division of Molecular Immunology, TVW Telethon Institute for Child Health Research and the University of Western Australia, Perth; Molecular Immunology Group, Western Australian Institute of Medical Research and the Department of Biomedical Science, Curtin University of Technology, Perth, Western Australia). Автор глубоко признателен профессору Colin J. Sanderson за его постоянный интерес к исследованиям, за поддержку и ценные предложения, касающиеся экспериментальной работы и интерпретации полученных данных.

На разных этапах в работе принимали участие Gretchen T. F. Schwenger, Susanne Е. Peroni, Anish D. Singh, Monica Senna Salerno, Stéphane Karlen, Marc A. Thomas, Régis Fournier, Monica L. De Boer и другие сотрудники группы профессора Colin J. Sanderson - автор приносит им искреннюю благодарность. Автор также благодарен ведущему научному сотруднику ИЦиГ СО РАН, доктору биологических наук Д. П. Фурман и старшему научному сотруднику ИЦиГ СО РАН, кандидату биологических наук А. В. Катохину за плодотворное сотрудничество при обсуждении представленных в работе результатов исследований.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Мордвинов, Вячеслав Алексеевич

выводы

• Продемонстрировано, что характер продукции ИЛ-5 в клетках PER-117 не отличается от характера продукции этого белка в первичных Т-лимфоцитах человека.

2. Проведено структурно-функциональное картирование промотора гена ИЛ-5 человека.

• Показано, что регуляторный элемент CLEO контролирует инициацию транскрипции гена.

• Предложена модель инициации и регуляции транскрипции гена ИЛ-5 человека.

3.6.3. Заключение

Результаты исследований, изложенные в данной главе, позволяют утверждать, что ключевым транскрипционным фактором, контролирующим инициацию экспрессии гена ИЛ-5 человека, является АР-1. Действительно, данные экспериментов по изучению кинетики взаимодействия CLEO с ядерными белками и влияния условий клеточной стимуляции на это взаимодействие демонстрируют, что именно АР-1-содержащий комплекс формируется первым, независимо от условий активации клеток. Более того, существует прямая корреляция между кинетикой формирования комплекса АР-1 и активностью экспрессии гена ИЛ-5 в клетках PER-117. Таким образом, можно заключить, что АР-1 контролирует не только инициацию транскрипции гена, но и уровень её активности. Следовательно, существует прямая зависимость между условиями клеточной стимуляции, определяющими активность экспрессии гена ИЛ-5, и интенсивностью синтеза, по крайней мере, одной из субъединиц АР-1.

Нам удалось показать, что такой субъединицей является Fra-2. Cal и сАМР усиливают PMA-индуцированный синтез Fra-2 и не влияют на синтез Jun D. Интересно, что индукция экспрессии гена Fra-2 полностью зависит от клеточной стимуляции - интактиые клетки PER-117 не содержат мРНК Fra-2. Здесь уместно вспомнить, что активация экспрессии гена ИЛ-5 невозможна без синтеза белка de novo. Это ставит ген ИЛ-5 в особое положение по сравнению с другими генами цитокинов и позволяет говорить о существовании уникальной системы запуска экспрессии ИЛ-5. Согласно нашим данным такая уникальная система базируется на жестком контроле инициации транскрипции ИЛ-5. Жесткость заключается в том, что клеточная активация инициирует экспрессию Fra-2, который в свою очередь запускает экспрессию ИЛ-5. Роль Fra-2 как фактора, лимитирующего как инициацию, так и уровень активности экспрессии гена ИЛ-5 была подтверждена в экспериментах с использованием антисмысловых РНК Fra-2 и Jun D. Следует отметить, что полученные данные могут иметь существенное значение не только при планировании дальнейших академических исследований регуляции экспрессии гена ИЛ-5, но и при проведении прикладных работ, направленных на создание нового поколения фармакологических препаратов для лечения астмы и других аллергических заболеваний, сопровождающихся эозинофилией.

В настоящее время для лечения таких заболеваний используются синтетические глюкокортикоиды, в частности, дексаметазон. Применение этого препарата в медицинской практике требует точного понимания механизма его действия на экспрессию гена ИЛ-5. Нам удалось определить, что дексаметазон подавляет экспрессию гена ИЛ-5 в клетках PER-117 на транскрипционном уровне. Мишенью дексаметазона в контексте регуляторных элементов гена ИЛ-5 человека является CLEO.

Согласно полученным данным механизм подавления транскрипции ИЛ-5 дексаметазоном заключается в следующем. В определённых условиях клеточной активации глюкокортикоид инициирует в Т-клетках экспрессию GILZ. Этот белок ингибирует активность CLEO ИЛ-5, что и приводит к подавлению транскрипции гена. Ингибирование активности CLEO происходит, скорее всего, в результате взаимодействия GILZ и АР-1, однако, для окончательных выводов требуется дополнительная экспериментальная работа.

Данные о том, что эктопическая экспрессия GILZ ведёт к существенному снижению активности CLEO в клетках Jurkat и РМА/Са1-стимулированных клетках PER-117 дают возможность предположить, что вышеизложенный механизм репрессии является основным и белок-белковые контакты активированного ГР и факторов транскрипции, регулирующих активность CLEO, если и происходят, то не играют значительной роли в общей картине действия дексаметазона на транскрипцию гена ИЛ-5.

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Мордвинов, Вячеслав Алексеевич, Новосибирск

1. Анаев Э.Х. Эозинофилы и эозинофилии. Портал о медицине (http://med-ru.com/content/view/3986/86I 2003.

2. Гааль Э., Медьеши Г., Верецкей Л. Электрофорез в разделении биологических молекул. М: Мир, 1982.

3. Гриншпун Г.Д., Виноградова Ю.Е. Эозинофилы и эозинофилии. Терапевтический архив. 1983, № 10, стр. 87—90.

4. Жимулев И.Ф. Современные представления о структуре гена у эукариот. Соросовский образовательный журнал. 2000, т. 6, стр. 17-24.

5. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. М.: Мир, 1984.

6. Мордвинов В.А., Кок Ч.Ч., Артанингтяс Э., Швенгер Г.Т.Ф., Кристоу А., Сандерсон К.Дж. Дексаметазон подавляет активность промотора гена интерлейкина-5 человека. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2005, т. 140, стр. 91-95.

7. Швенгер Г.Т.Ф., Мордвинов В.А., Сандерсон К.Дж. Фактор транскрипции GATA-3 участвует в подавлении активности промотора гена интерлейкина-4 человека. Биохимия. 2005, т. 70, с. 1289-1294.

8. Хейхоу Ф.Г.Дж., Кваглино Д. Гематологическая цитохимия. М.: Москва, 1983.

9. Паттерсон Р., Грэммер Л.К., Гринбергер П.А. Аллергические болезни. Диагностика и лечение. Перевод с английского под редакцией Чучалина А.Г., Гущина И.С., Улумбекова Э.Г., Фассахова P.C. М.: ГЭОТАР МЕДИЦИНА, 2000.

10. Abbas А.К., Murphy К.М., Sher A. Functional diversity of helper T lymphocytes. Nature. 1996, v. 383, p. 787-793.

11. Abdullah A.K., Khan S. Evidence-based selection of inhaled corticosteroid for treatment of chronic asthma. J. Asthma. 2007, v. 44, p. 1-12.

12. Abraham R. Т., Weiss A. Jurkat T cells and development of the T-cell receptor signalling paradigm. Nat. Rev. Immunol. 2004, v. 4, p. 302-308.

13. Adcock I.M., Caramori G. Cross-talk between pro-inflammatory transcription factors and glucocorticoids. Immunol. Cell. Biol. 2001, v. 79, p. 376-384.

14. Akdisa A. Allergy and hypersensitivity: Mechanisms of allergic disease. Current Opinion in Immunology. 2006, v. 18, p. 718-726.

15. Alberts В., Bray D., Lewis J. et al. Molecular Biology of the Cell. 3rd ed. Inc. N.Y.; L.: Garland Publ., 1994, p. 421-432.

16. Allen S.J., Crown S.E., Handel T.M. Chemokine: receptor structure, interactions, and antagonism. Annu. Rev. Immunol. 2007, v. 25, p. 787-820.

17. Alvarez M., Rhodes S.J., Bidwell J.P. Context-dependent transcription: all politics is local. Gene. 2003, v. 313, p. 43-57.

18. Alves N.L., Arosa F.A., van Lier R.A. Common gamma chain cytokines: dissidence in the details. Immunol. Lett. 2007, v. 108, p. 113-120.

19. Ansel K.M., Djuretic I., Tanasa В., Rao A. Regulation of Th2 differentiation and 114 locus accessibility. Annu. Rev. Immunol. 2006, v. 24, p. 607-656.

20. Arai N., Naito Y., Watanabe M., Masuda E.S., Yamaguchi-Iwai Y., Tsuboi A., Heike Т., Matsuda I., Yokota K., Koyano-Nakagawa N., et al. Activation of lymphokine genes in

21. T cells: role of cis-acting DNA elements that respond to T cell activation signals. Pharmacol. Ther. 1992, v. 55, p. 303-318.

22. Aravind L., Anantharaman V., Balaji S., Babu M.M., Iyer L.M. The many faces of the helix-turn-helix domain: transcription regulation and beyond. FEMS Microbiol. Rev. 2005, v. 29, p. 231-262.

23. Ardelean D., Pope E. Incontinentia pigmenti in boys: a series and review of the literature. Pediatr. Dermatol. 2006, v. 23, p. 523-527.

24. Arnone M.I., Davidson E.H. The hardwiring of development: organization and function of genomic regulatory systems. Development. 1997, v. 124, p. 1851-1864.

25. Arthaningtyas E., Kok C.C., Mordvinov V.A., Sanderson C.J. The conserved lymphokine element 0 is a powerful activator and target for corticosteroid inhibition in human interleukin-5 transcription. Growth Factors. 2005, v. 23, p. 211-221.

26. Aune T.M. Transcriptional reprogramming during T helper cell differentiation. Immunol. Res. 2001, v. 23, p. 193-204.

27. Ayroldi E., Migliorati G., Bruscoli S., et al. Modulation of T-cell activation by the glucocorticoid-induced leucine zipper factor via inhibition of nuclear factor kappaB. Blood. 2001, v. 98, p. 743-753.

28. Badmos K.B., Komolafe A.O., Rotimi O. Schistosomiasis presenting as acute appendicitis. East Afr. Med. J. 2006, v. 83, p. 528-532.

29. Bain B.J. Clinical applications of molecular haematology: an overview. J. Assoc. Physicians India. 2007, v. 55, p. 503-506.

30. Bain B.J., Fletcher S.H. Chronic eosinophilic leukemias and the myeloproliferative variant of the hypereosinophilic syndrome. Immunol. Allergy Clin. North Am. 2007, v. 27, p. 377-388.

31. Bao S., McClure S.J., Emery D.L., Husband A.J. Interleukin-5 mRNA expressed by eosinophils and gamma/delta T cells in parasite-immune sheep. Eur. J. Immunol. 1996, v. 26, p. 552-556.

32. Barnes P.J. Corticosteroid effects on cell signalling. Eur. Respir. J. 2006, v. 27, p. 413426.

33. Barnes P.J., Pedersen S., Busse W.W. Efficacy and safety of inhaled corticosteroids. New developments. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 1998, v. 157, p. S1-S53.

34. Bass R.D., Pullarkat V., Feinstein D.I., Kaul A., Winberg C.D., Brynes R.K. Pathology of autoimmune myelofibrosis. A report of three cases and a review of the literature. Am. J. Clin. Pathol. 2001, v. 116, p. 211-216.

35. Beltrani V.S. Suggestions regarding a more appropriate understanding of atopic dermatitis. Curr. Opin. Allergy Clin. Immunol. 2005, v. 5, p. 413-418.

36. Beutler B., Cerami A. The biology of cachectin/TNF a primary mediator of the host response. Annual Review of Immunology. 1989, v. 7, p. 625-655.

37. Beutler B., Cerami A. The history, properties, and biological effects of cachectin. Biochemistry. 1988, v. 27, p. 7575-7582.

38. Biggins J.B., Koh J.T. Chemical biology of steroid and nuclear hormone receptors. Curr. Opin. Chem. Biol. 2007, v. 11, p. 99-110.

39. Birrell M.A., Battram C.H., Woodman P., McCluskie K., Belvisi M.G. Dissociation by steroids of eosinophilic inflammation from airway hyperresponsiveness in murine airways. Respir. Res. 2003, v. 4, p. 3-20.

40. Blanchard C., Wang N., Rothenberg M.E. Eosinophilic esophagitis: pathogenesis, genetics, and therapy. J. Allergy Clin. Immunol. 2006, v. 118, p. 1054-1059.

41. Blom B., Hergen S. Development of human lymphoid cells. Annual Review of Immunology. 2006, v. 24, p. 287-320.

42. Boes M., Ploegh H.L. Translating cell biology in vitro to immunity in vivo. Nature. 2004, v. 430, p. 264-271.

43. Boise L.H., Petryniak B., Mao X., June C.H., Wang C.Y., Lindsten T., Bravo R., Kovary K., Leiden J.M., Thompson C.B. The NFAT-1 DNA binding complex in activated T cells contains Fra-1 and JunB. Mol. Cell. Biol. 1993, v. 13, p. 1911-1919.

44. Borden K.L. RING fingers and B-boxes: zinc-binding protein-protein interaction domains. Biochem. Cell Biol. 1998,v. 76, p. 351-358.

45. Bourke P.F., Van Leeuwen B.H., Campbell H.D., Young I.G. Localization of the inducible enhancer in the mouse interleukin-5 gene that is responsive to T cell receptor stimulation. Blood. 1995, v. 85, p. 2069-2077.

46. Bousquet J., Chanez P., Lacoste J.Y., Barneon G., Ghavanian N., Enander I., Venge P., Ahlstedt S., Simony-Lafontaine J., Godard P., et al. Eosinophilic inflammation in asthma. N. Engl. J. Med. 1990, v. 323, p. 1033-1039.

47. Bronner C., Achour M., Arima Y., Chataigneau T., Saya H., Schini-Kerth V.B. The UHRF family: oncogenes that are drugable targets for cancer therapy in the near future? Pharmacol. Ther. 2007, v. 115, p. 419-434.

48. Bucher P. Weight matrix descriptions of four eukaryotic RNA polymerase II promoter elements derived from 502 unrelated promoter sequences. J. Mol. Biol. 1990, v. 212, p. 563578.

49. Buckingham J.C. Glucocorticoids: exemplars of multi-tasking. Br. J. Pharmacol. 2006, v. 147, p. S258- S268.

50. Bucy R. P., Chan C.-L. H., Cooper M. D. Tissue localization and CD8 accessory molecule expression of Ty8 cells in humans. J. Immunol. 1989, v. 142, p. 3045-3049.

51. Bulger M., Sawado Т., Schübeier D., Groudine M. ChlPs of the beta-globin locus: unraveling gene regulation within an active domain. Curr. Opin. Genet. Dev. 2002, v. 12, p. 170-177.

52. Bunting K., Wang J., Shannon M.F. Control of interleukin-2 gene transcription: a paradigm for inducible, tissue-specific gene expression. Vitam. Horm. 2006, v. 74, p. 105145.

53. Burke L.J., Baniahmad A. Co-repressors 2000. FASEB J. 2000, v. 14, p. 1876-1888.

54. Burke T.W., Kadonaga J.T. The downstream core promoter element, DPE, is conserved from Drosophila to humans and is recognized by TAFII60 of Drosophila. Genes Dev. 1997, v. 11, p. 3020-3031.

55. Burley S.K. X-ray crystallographic studies of eukaryotic transcription factors. Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 1998, v. 63, p. 33-40.

56. Burley S.K, Kamada K. Transcription factor complexes. Curr. Opin. Struct. Biol. 2002, v. 12, p. 225-230.

57. Butterfield J.H., Ackerman S.J., Weiler D., Eisenbrey A.B., Gleich GJ. Effects of glucocorticoids on eosinophil colony growth. J. Allergy Clin. Immunol. 1986, v. 78, p. 450457.

58. Cancelas J.A., Jansen M., Williams D.A. The role of chemokine activation of Rac GTPases in hematopoietic stem cell marrow homing, retention, and peripheral mobilization. Exp. Hematol. 2006, v. 34, p. 976-985.

59. Castro A.G., Silva R.A., Minoprio P., Appelberg R. In vivo evidence for a non-T cell origin of interleukin-5. Scand. J. Immunol. 1995, v. 41, p. 288-292.

60. Chanez P., Vachier I., Bourdin A., Halimi L., Godard P. Difficult asthma. Presse Med. 2006, v. 35, p. 1497-1506.

61. Chen D., Rothenberg E.Y. Interleukin 2 transcription factors as molecular targets of cAMP inhibition: delayed inhibition kinetics and combinatorial transcription roles. J. Exp. Med. 1994, v. 179, p. 931-942.

62. Chen W., Khurana Hershey G.K. Signal transducer and activator of transcription signals in allergic disease. J. Allergy Clin. Immunol. 2007, v. 119, p. 529-541.

63. Cheskis B.J., Greger J.G., Nagpal S., Freedman L.P. Signaling by estrogens. J. Cell. Physiol. 2007, v. 213, p. 610-617.

64. Chinnadurai G. Transcriptional regulation by C-terminal binding proteins. Int. J. Biochem. Cell. Biol. 2007, v. 39, v. 1593-1607.

65. Choder M. Rpb4 and Rpb7: subunits of RNA polymerase II and beyond. Trends Biochem. Sci. 2004, v. 29, p. 674-681.

66. Chomczynski P., Sacchi N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal. Biochem. 1987, v. 162, p. 156-159.

67. Clement L. T. Cellular interactions in the human immune response. In E. R. Stiehm (ed.), Immunologic Disorders of Infants and Children, 4th edn. Philadelphia,PA:W.B. Saunders. 1996, p. 75-93.

68. Cohen S., Fisher B., Yoshida T., Bettigole R.E. Serum migration-inhibitory activity in patients with lymphoproliferative diseases. N. Engl. J. Med. 1974, v. 290, p. 882-886.

69. Comerford I., Litchfield W., Harata-Lee Y., Nibbs R.J., McColl S.R. Regulation of chemotactic networks by 'atypical' receptors. Bioessays. 2007, v. 29, p. 237-247.

70. Conaway J.W., Conaway R.C. Transcription elongation and human disease. Annu. Rev. Biochem. 1999, v. 68, p. 301-319.

71. Conaway J.W., Shilatifard A., Dvir A., Conaway R.C. Control of elongation by RNA polymerase II. Trends Biochem. Sci. 2000, v. 25, p. 375-380.

72. Coombe D.R., Nakhoul A.M., Stevenson S.M., Peroni S.E., Sanderson C.J. Expressed luciferase viability assay (ELVA) for the measurement of cell growth and viability. J. Immunol. Methods. 1998, v. 215, p. 145-150.

73. Corrigan C. J., Kay A. B. T cells and eosinophils in the pathogenesis of asthma. Immunol. Today. 1992, v. 13, v. 501-505.

74. Cony D.B. IL-13 in allergy: home at last. Curr. Opin. Immunol. 1999, v. 11, p. 610-614.

75. Cony D.B., Kheradmand F. Induction and regulation of the IgE response. Nature. 1999, v. 402, p. B18-23.

76. Coulombe B., Burton Z.F. DNA bending and wrapping around RNA polymerase: a "revolutionary" model describing transcriptional mechanisms. Microbiol Mol. Biol. Rev. 1999, v. 63, p. 457-478.

77. Cousins D.J., Richards D., Kemeny D.M., Romagnani S., Lee T.H., Staynov D.Z. DNase I footprinting of the human interleukin 5 gene promoter. Immunology. 2000, v. 99, p. 101-108.

78. Cox J.M., Kays A.R., Sanchez J.F., Schepartz A. Preinitation complex assembly: potentially a bumpy path. Curr. Opin. Chem. Biol. 1998, v. 2, p. 11-17.

79. Coyle A.J., Erard F., Bertrand C., Walti S., Pircher H., Le Gros G. Virus-specific CD8+ cells can switch to interleukin 5 production and induce airway eosinophilia. J. Exp. Med. 1995, v. 181, p. 1229-1233.

80. D'Adamio F., Zollo O., Moraca R., et al. A new dexamethasone-induced gene of the leucine zipper family protects T lymphocytes from TCR/CD3-activated cell death. Immunity. 1997, v. 7, p. 803-812.

81. Davis M.M. A new trigger for T cells. Cell. 2002, v. 110, p. 285-287.

82. Dean A. On a chromosome far, far away: LCRs and gene expression. Trends Genet. 2006, v. 22, p. 38-45.

83. Deppmann C.D., Alvania R.S., Taparowsky E.J. Cross-species annotation of basic leucine zipper factor interactions: Insight into the evolution of closed interaction networks. Mol. Biol. Evol. 2006, v. 23, p. 1480-1492.

84. Di Stefano F., Amoroso A. Clinical approach to the patient with blood eosinophilia. Allerg. Immunol. (Paris). 2005, v. 37, p. 380-386.

85. Diehl A.M. Cytokine regulation of liver injury and repair. Immunological Reviews. 2000, vol. 174, p. 160-171.

86. Dinarello C.A. An update on human interleukin-1: from molecular biology to clinical relevance. J. Clin. Immunol. 1985, v. 5, p. 287-297.

87. Dvir A., Conaway J.W., Conaway R.C. Mechanism of transcription initiation and promoter escape by RNA polymerase II. Curr. Opin. Genet. Dev. 2001, v. 11, p. 209-214.

88. Eckert D., Buhl S., Weber S., Jäger R., Schorle H. The AP-2 family of transcription factors. Genome Biol. 2005, v. 6, p. 246-250.

89. El Hassan M.A., Calladine C.R. Two distinct modes of protein-induced bending in DNA. J. Mol. Biol. 1998, v. 282, p. 331-343.

90. Elwood W., Lotvall J.O., Barnes P.J., Chung K.F. Effect of dexamethasone and cyclosporin A on allergen-induced airway hyperresponsiveness and inflammatory cell responses in sensitized Brown-Norway rats. Am. Rev. Respir. Dis. 1992, v. 145, p. 12891294.

91. Erard F., Wild M.T., Garcia-Sanz J.A., Le Gros G. Switch of CD8 T cells to noncytolytic CD8-CD4- cells that make TH2 cytokines and help B cells. Science. 1993, v. 260, p. 1802-1805.

92. Erb K.J., Le Gros G. The role of Th2 type CD4+ T cells and Th2 type CD8+ T cells in asthma. Immunol. Cell. Biol. 1996, v. 74, p. 206-208.

93. Erlich H.A. PCR Technology. NY.: Stockton Press, 1989.

94. Fainboim L., Chernavsky A., Paladino N., Flores A.C., Arruvito L. Cytokines and chronic liver disease. Cytokine Growth Factor Rev. 2007, v. 18, p. 143-157.

95. Faro-Trindade I., Cook P.R. Transcription factories: structures conserved during differentiation and evolution. Biochem. Soc. Trans. 2006, v. 34, p. 1133-1137.

96. Felsenfeld G., Boyes J., Chung J., Clark D., Studitsky V. Chromatin structure and gene expression. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996, v. 93, p. 9384-9388.

97. Finkelstein M.S., Merigan T.C. Interferon-1968. How much do we understand? Calif. Med. 1968, v. 109, p. 24-34.

98. Fischereder M. Chemokines and chemokine receptors in renal transplantation—from bench to bedside. Acta Physiol. Hung. 2007, v. 94, p. 67-81.

99. Fletcher S., Bain B. Eosinophilic leukaemia. Br. Med. Bull. 2007a, v. 81-82, p. 115127.

100. Fletcher S., Bain B. Diagnosis and treatment of hypereosinophilic syndromes. Curr. Opin. Hematol. 20076, v. 14, p. 37-42.

101. Foley S., Hamid Q. Role of inflammatory T cells and eosinophils in chronic rhinosinusitis. Clin. Allergy Immunol. 2007, v. 20, p. 79-91.

102. Foster P.S., Hogan S.P., Ramsay A.J., Matthaei K.I., Young I.G. Interleukin-5 deficiency abolishes eosinophilia, airways hyperreactivity, and lung damage in a mouse asthma model. J. Exp. Med. 1996, v. 183, p. 195-201.

103. Frolova E.I., Dolganov G.M., Mazo I.A., Smirnov D.V., Copeland P., Stewart C., O'Brien S.J., Dean M. Linkage mapping of the human CSF2 and IL3 genes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1991, v. 88, p. 4821-4824.

104. Fukunaga K., Ishigami T., Kawano T. Transcriptional regulation of neuronal genes and its effect on neural functions: expression and function of forkhead transcription factors in neurons. J. Pharmacol. Sci. 2005, v. 98, p. 205-211.

105. Gabellini N. Transcriptional regulation by cAMP and Ca2+ links the Na+/Ca2+ exchanger 3 to memory and sensory pathways. Mol. Neurobiol. 2004, v. 30, p. 91-116.

106. Galas D.J., Schmitz A. DNAse footprinting: a simple method for the detection of protein-DNA binding specificity. Nucleic Acids Res. 1978, v. 5, p. 3157-3170.

107. Galve-de Rochemonteix B., Wiktorowicz K., Kushner I., Dayer J.M. C-reactive protein increases production of IL-1 alpha, IL-1 beta, and TNF-alpha, and expression of mRNA by human alveolar macrophages. J. Leukoc. Biol. 1993, v. 53, p. 439-445.

108. Garcia G. Allergy-related hypereosinophilia. Presse Med. 2006, v. 35, p. 135-143.

109. Geiduschek E.P., Ouhammouch M. Archaeal transcription and its regulators. Mol. Microbiol. 2005, v. 56, p. 1397-1407.

110. Gelfand E.W., Finkel T. H. The T-lymphocyte system. In E. R. Stiehm (ed.), Immunologic Disorders of Infants and Children, 4th edn. Philadelphia, PA:W. B. Saunders. 1996, p. 14-34.

111. Gerber M., Shilatifard A. Transcriptional elongation by RNA polymerase II and histone methylation. J. Biol. Chem. 2003, v. 278, p. 26303-26306.

112. Gibson P.G. Allergic bronchopulmonary aspergillosis. Semin. Respir. Crit. Care Med. 2006 v. 27, p. 185-191.

113. Giembycz M.A., Lindsay M.A. Pharmacology of the eosinophil. Pharmacol. Rev. 1999, v. 51, p. 213-340.

114. Gluzman Y. SV40-transformed simian cells support the replication of early SV40 mutants. Cell. 1981, v. 23, p. 175-182.

115. Goodrich J.A., Cutler G., Tjian R. Contacts in context: promoter specificity and macromolecular interactions in transcription. Cell. 1996, v. 84, p. 825-830.

116. Crabtree G.R. Calcium, calcineurin, and the control of transcription. J. Biol. Chem. 2001, v. 276, p. 2313-2316.

117. Greenblatt J. Transcription. Riding high on the TATA box. Nature. 1992, v. 360, p. 1627. Comment on: Nature. 1992, v. 360, p. 40-46.

118. Greenfeder S., Umland S.P., Cuss F.M., Chapman R.W., Egan R.W. The2 cytokines and asthma. The role of interleukin-5 in allergic eosinophilic disease. Respir. Res. 2001, v. 2, p. 71-79.

119. Gruart-Gouilleux V., Engels P., Sullivan M. Characterization of the human interleukin 5 gene promoter: involvement of octamer binding sites in the gene promoter activity. Eur. J. Immunol. 1995, v. 25, p. 1431-1435.

120. Gruda M.C., Kovary K., Metz R, Bravo R. Regulation of Fra 1 and Fra 2 phosphorylation differs during the cell cycle of fibroblasts and phosphorylation in vitro by MAP kinase affects DNA binding activity. Oncogene. 1994, v. 9, p. 2537-2547.

121. Gutcher I., Becher B. APC-derived cytokines and T cell polarization in autoimmune inflammation. J. Clin. Invest. 2007, v.l 17, p. 1119-1127.

122. Hagerman P.J. Do basic region-leucine zipper proteins bend their DNA targets . does it matter? Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996, v. 93, p. 9993-9996.

123. Hall I.P. Pharmacogenetics of asthma. Chest. 2006, v. 130, p. 1873-1878.

124. Hallet M.M., Peyrat M.A., Soulillou J.P., Moreau J.F. Simultaneous transcription of eleven cytokines in human alloreactive T lymphocyte clones after stimulation by phorbol ester and A23187. Eur. Cytokine Netw. 1992, v. 3, p. 477-483.

125. Hampsey M. Molecular genetics of the RNA polymerase II general transcriptional machinery. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 1998, v. 62, p. 465-503.

126. Han J., Brown T., Beutler B. Endotoxin-responsive sequences control cachectin/tumor necrosis factor biosynthesis at the translational level. J. Exp. Med. 1990, v. 171, p. 465—475.

127. Harada N., Kikuchi Y., Tominaga A., Takaki S., Takatsu K. BCGFII activity on activated B cells of a purified murine T cell-replacing factor (TRF) from a T cell hybridoma (B151K12). J. Immunol. 1985, v. 134, p. 3944-3951.

128. Hayashi R., Wada H., Ito K., Adcock I.M. Effects of glucocorticoids on gene transcription. Eur. J. Pharmacol. 2004, v. 500, p. 51-62.

129. Heinemeyer T.,Wingender E., Reuter I., Hermjakob H., Kel A.E., Kel O.V., et al. Databases on transcriptional regulation: TRANSFAC, TRRD and COMPEL. Nucleic Acids Res. 1998, v. 6, p. 362-367.

130. Heintzman N.D, Ren B. The gateway to transcription: identifying, characterizing and understanding promoters in the eukaryotic genome. Cell. Mol. Life Sci. 2007, v. 64, p. 386400.

131. Heitzer M.D., Wolf I.M., Sanchez E.R., Witchel S.F., Defranco D.B. Glucocorticoid receptor physiology. Rev. Endocr. Metab. Disord. 2007, v. 8, p. 321-330.

132. Hoffmann A., Natoli G., Ghosh G. Transcriptional regulation via the NF-kappaB signaling module. Oncogene. 2006, v. 25, p. 6706-6716.

133. Hogan S.P. Recent advances in eosinophil biology. Int. Arch. Allergy Immunol. 2007, v. 143, Suppl 1, p. 3-14.

134. Holloway A.F., Rao S., Shannon M.F. Regulation of cytokine gene transcription in the immune system. Mol. Immunol. 2002, v. 38, p. 567-580.

135. Holstege F.C., Clevers H. Transcription factor target practice. Cell. 2006, v. 124, p. 2123.

136. Hoppe-Seyler F., Butz K., zur Hausen H. Repression of the human papillomavirus type 18 enhancer by the cellular transcription factor Oct-1. J. Virol. 1991, v. 65, p. 5613-5618.

137. Huang C.C., Herr W. Differential control of transcription by homologous homeodomain coregulators. Mol. Cell. Biol. 1996, v. 16, p. 2967-2976.

138. Inagaki N., Shiraishi N., Igeta K., Itoh T., Chikumoto T., Nagao M., Kim J.F., Nagai H. Inhibition of scratching behavior associated with allergic dermatitis in mice by tacrolimus, but not by dexamethasone. Eur. J. Pharmacol. 2006, v. 546, p. 189-196.

139. Ishikawa H., Tsuyama N., Obata M., Kawano M.M. Mitogenic signals initiated via interleukin-6 receptor complexes in cooperation with other transmembrane molecules in myelomas. J. Clin. Exp. Hematop. 2006, v. 46, p. 55-66.

140. Istrail S., Davidson E.H. Logic functions of the genomic cis-regulatory code. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2005, v. 102, p. 4954-4959.

141. Jacobsen E.A., Ochkur S.I., Lee N.A., Lee J.J. Eosinophils and asthma. Curr. Allergy Asthma Rep. 2007, v. 7, p. 18-26.

142. Jeltsch A. On the enzymatic properties of Dnmtl: specificity, processivity, mechanism of linear diffusion and allosteric regulation of the enzyme. Epigenetics. 2006, v. 1, p. 63-66.

143. Jenkins F., Cockerill P.N., Bohmann D., Shannon M.F. Multiple signals are required for function of the human granulocyte macrophage colony stimulating factor gene promoter in T cells. J. Immunol. 1995, v. 155, p. 1240-1251.

144. Jenkins M.K., Johnson J.G. Molecules involved in T cell costimulation. Current Opin. Immunol. 1993, v. 5, p. 361-367.

145. Johannessen M., Moens U. Multisite phosphorylation of the cAMP response element-binding protein (CREB) by a diversity of protein kinases. Front. Biosci. 2007, v. 12, p. 1814-1832.

146. Jonat C., Rahmsdorf H.J., Park K.K., et al. Antitumor promotion and antiinflammation: down-modulation of AP-1 (Fos/Jun) activity by glucocorticoid hormone. Cell. 1990, v. 62, p. 1189-1204.

147. Kahn J.D. Topological effects of the TATA box binding protein on minicircle DNA and a possible thermodynamic linkage to chromatin remodeling. Biochemistry. 2000, v. 39, p. 3520-3524.

148. Kamps M.P., Corcoran L., LeBowitz J.H., Baltimore D. The promoter of the human interleukin-2 gene contains two octamer-binding sites and is partially activated by the expression of Oct-2. Mol. Cell. Biol. 1990, v. 10, p. 5464-5472.

149. Karlen S., Beard P. Identification and characterization of novel promoters in the genome of human papillomavirus type 18. J. Virol. 1993, v. 7, p. 4296-4306.

150. Karlen S., Mordvinov V.A., Sanderson C.J. How is expression of the interleukin-5 gene regulated? Immunol. Cell. Biol. 1996a, v. 74, p. 218-223.

151. Karlen S., De Boer M.L., Lipscombe R.J., Lutz W., Mordvinov V.A., Sanderson C.J. Biological and molecular characteristics of interleukin 5 and its receptor. Int. Rev. Immunol. 1998, v. 16, p. 227-247.

152. Karlen S., D'Ercole M., Sanderson C.J. Two pathways can activate the interleukin 5 gene and induce binding to the conserved lymphokine element 0. Blood. 1996b, v. 88, p. 211-221.

153. Kassel O., Herrlich P. Crosstalk between the glucocorticoid receptor and other transcription factors: molecular aspects. Mol. Cell. Endocrinol. 2007, v. 275, p. 13-29.

154. Kastelein R.A., Hunter C.A., Cua D.J. Discovery and biology of IL-23 and IL-27: related but functionally distinct regulators of inflammation. Annu. Rev. Immunol. 2007, v. 25, p. 221-242.

155. Kees U.R., Ford J., Price P.J., Meyer B.F., Herrmann R.P. PER 117: a new human ALL cell line with an immature thymic phenotype. Leukemia Research. 1987, v. 11, p. 489498.

156. Kelly D.A. Current issues in pediatric transplantation. Pediatr. Transplant. 2006, v. 10, p. 712-720.

157. Kiefer F., Vogel W.F., Arnold R. Signal transduction and co-stimulatory pathways. Transpl. Immunol. 2002, v. 9, p. 69-82.

158. Kiley J., Smith R., Noel P. Asthma phenotypes. Curr. Opin. Pulm. Med. 2007, v. 13, p. 19-23.

159. Kishimoto M., Fujiki R., Takezawa S., Sasaki Y., Nakamura T., Yamaoka K., Kitagawa H., Kato S. Nuclear receptor mediated gene regulation through chromatin remodeling and histone modifications. Endocr. J. 2006, v. 53, p. 157-172.

160. Kitagawa K. CREB and cAMP response element-mediated gene expression in the ischemic brain. FEBS J. 2007, v. 274, p. 3210-3217.

161. Klein-Hessling S., Jha M.K., Santner-Nanan B., Berberich-Siebelt F., Baumruker T., Schimpl A., Serfling E. Protein kinase A regulates GATA-3-dependent activation of IL-5 gene expression in Th2 cells. J. Immunol. 2003, v. 170, p. 2956-2961.

162. Kobayashi J. Molecular mechanism of the recruitment of NBSl/hMREll/hRAD50 complex to DNA double-strand breaks: NBS1 binds to gamma-H2AX through FHA/BRCT domain. J. Radiat. Res. 2004, v. 45, p. 473-478.

163. Kodadek T., Sikder D., Nalley K. Keeping transcriptional activators under control. Cell. 2006, v. 127, p. 261-264.

164. Kornberg R.D. The molecular basis of eukaryotic transcription. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2007, v. 104, p. 12955-12961.

165. Kulms D., Schwarz T. NF-kappaB and cytokines. Vitam. Horm. 2006, v. 74, p. 283300.

166. Kutlu A., Bozkurt B., Ciftci F., Bozkanat E. Thl-Th2 interaction: is more complex than a see-saw? Scand. J. Immunol. 2007, v. 65, p. 393-395.

167. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 1970, v. 227, p. 680-685.

168. Lai C.H., Chin C., Chung H.C., Liu H., Hwang J.C., Lin H.H. Clonorchiasis-associated perforated eosinophilic cholecystitis. Am. J. Trop. Med. Hyg. 2007, v. 76, p. 396-398.

169. Lampinen M., Carlson M., Hakansson L.D., Venge P. Cytokine-regulated accumulation of eosinophils in inflammatory disease. Allergy. 2004, v. 59, p. 793-805.

170. Latchman D.S. POU family transcription factors in the nervous system. J. Cell. Physiol. 1999, v. 179, p. 126-133.

171. Lavender P., Cousins D., Lee T. Regulation of Th2 cytokine gene transcription. Chem. Immunol. 2000, v. 78, p. 16-29.

172. Lefstin J.A., Yamamoto K.R. Allosteric effects of DNA on transcriptional regulators. Nature. 1998, v. 392, p. 885-888.

173. Leiferman K.M., Gleich G.J., Peters M.S. Dermatologic manifestations of the hypereosinophilic syndromes. Immunol. Allergy Clin. North Am. 2007, v. 27, p. 415-441.

174. Letai A. Growth factor withdrawal and apoptosis: the middle game. Mol. Cell. 2006, v. 21, p. 728-730.

175. Levine M., Tjian R. Transcription regulation and animal diversity. Nature. 2003, v. 424, p. 147-151.

176. Li B., Carey M., Workman J.L. The role of chromatin during transcription. Cell. 2007, v. 128, p. 707-719.

177. Li L., He S., Sun J.M., Davie J.R. Gene regulation by Spl and Sp3. Biochem. Cell. Biol. 2004, v. 82, p. 460-471.

178. Lim C.P., Cao X. Structure, function, and regulation of STAT proteins. Mol. Biosyst. 2006, v. 2, p. 536-550.

179. Li-Weber M., Eder A., Krafft-Czepa H., Krammer P.H. T cell-specific negative regulation of transcription of the human cytokine IL-4. J. Immunol. 1992, v. 148, p. 19131918.

180. Long X., Miano J.M. Remote control of gene expression. J. Biol. Chem. 2007, v. 282, p. 15941-15945.

181. Macian F., Lopez-Rodriguez C., Rao A. Partners in transcription: NFAT and AP-1. Oncogene. 2001, v. 20, p. 2476-2489.

182. Maher S.G., Romero-Weaver A.L., Scarzello A.J., Gamero A.M. Interferon: cellular executioner or white knight? Curr. Med. Chem. 2007, v. 14, p. 1279-1289.

183. Maoz K.B., Brenner S. Drug rash with eosinophilia and systemic symptoms syndrome: sex and the causative agent. Skinmed. 2007, v. 6, p. 271-273.

184. Martin K.J. The interactions of transcription factors and their adaptors, coactivators and accessory proteins. Bioessays. 1991, v. 13, p. 499-503.

185. Martinez E. Multi-protein complexes in eukaryotic gene transcription. Plant Mol. Biol. 2002, v. 50, p. 925-947.

186. Martínez-García M.A., Cases-Viedma E., Cordero-Rodríguez P.J., Hidalgo-Ramírez M., Perpiñá-Tordera M., Sanchis-Moret F., Sanchis-Aldás J.L. Diagnostic utility of eosinophils in the pleural fluid. Eur. Respir. J. 2000, v. 15, p. 166-169.

187. Mechta F., Piette J., Hirai S.I., Yaniv M. Stimulation of protein kinase C or protein kinase A mediated signal transduction pathways shows three modes of response among serum inducible genes. New Biol. 1989, v. 1, p. 297-304.

188. Metz G.A. Stress as a modulator of motor system function and pathology. Rev. Neurosci. 2007, v. 18, p. 209-222.

189. Meurer J.R., Lustig J.V., Jacob H.J. Genetic aspects of the etiology and treatment of asthma. Pediatr. Clin. North Am. 2006, v. 53, p. 715-725.

190. Mitchell P.J., Tjian R. Transcriptional regulation in mammalian cells by sequence-specific DNA binding proteins. Science. 1989, v. 245, p. 371-378.

191. Mittelstadt P.R., Ashwell J.D. Inhibition of AP-1 by the glucocorticoid-inducible protein GILZ. J. Biol. Chem. 2001, v. 276, p. 29603-29610.

192. Moehren U., Eckey M., Baniahmad A. Gene repression by nuclear hormone receptors. Essays Biochem. 2004, v. 40, p. 89-104.

193. Mordvinov V.A., Peroni S.E., De Boer M.L., Kees U.R., Sanderson C.J. A human T cell line with inducible production of interleukins 5 and 4. A model for studies of gene expression. J. Immunol. Methods. 1999a, v. 228, p. 163-168.

194. Mordvinov V.A., Sanderson C.J. Regulation of IL-5 expression. Arch. Immunol. Ther. Exp. (Warsz). 2001, v. 49, p. 345-351.

195. Mosmann T.R., Coffman R.L. TH1 and TH2 cells: different patterns of lymphokine secretion lead to different functional properties. Annu. Rev. Immunol. 1989, v. 7, p. 145-173.

196. Mossman T. R., Cherwinski H. M., Bond M. W., Giedlin M. A., Coffman R. L. Two types of murine helper T cell clones. I. Definition according to profiles of lymphokine activity and secreted proteins. J. Immunol. 1986, v. 136, p. 2348-2357.

197. Murphy K.M., Reiner S.L. The lineage decisions of helper T cells. Nat. Rev. Immunol. 2002, v. 2, p. 933-944.

198. Millier F., Demény M.A., Tora L. New problems in RNA polymerase II transcription initiation: matching the diversity of core promoters with a variety of promoter recognition factors. J. Biol. Chem. 2007, v. 282, p. 14685-14689.

199. Mygind N., Andersson M. Topical glucocorticosteroids in rhinitis: clinical aspects. Acta Otolaryngol. 2006, v. 126, p. 1022-1029.

200. Nakamura Y., Hoshino M. TH2 cytokines and associated transcription factors as therapeutic targets in asthma. Curr Drug Targets Inflamm Allergy. 2005, v. 4, p. 267-270.

201. Nakamura Y., Ghaffar O., Olivenstein R., Taha R.A., Soussi-Gounni A., Zhang D.H., Ray A., Hamid Q. Gene expression of the GATA-3 transcription factor is increased in atopic asthma. J. Allergy Clin. Immunol. 1999, v. 103, p. 215-222.

202. Naora H., Altin J.G., Young I.G. TCR-dependent and -independent signaling mechanisms differentially regulate lymphokine gene expression in the murine T helper clone D10.G4.1. J. Immunol. 1994, v. 152, p. 5691-5702.

203. Naora H., Young I.G. Comparison of the mechanisms regulating IL-5, IL-4, and three other lymphokine genes in the Th2 clone D10.G4.1. Exp. Hematol. 1995, v. 23, p. 597-602.

204. Narlikar G.J., Fan H.Y., Kingston R.E. Cooperation between complexes that regulate chromatin structure and transcription. Cell. 2002, v. 108, p. 475-487.

205. Nasmyth K. How do so few control so many? Cell. 2005, v. 120, p. 739-746.

206. Ngoc P.L., Gold D.R., Tzianabos A.O., Weiss S.T., Celedon J.C. Cytokines, allergy, and asthma. Curr. Opin. Allergy Clin. Immunol. 2005, v. 5, p. 161-166.

207. Nikolov D.B., Burley S.K. RNA polymerase II transcription initiation: a structural view. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1997, v. 94, p. 15-22.

208. Niwa H. Open conformation chromatin and pluripotency. Genes Dev. 2007, v. 21, p. 2671-2676.

209. Northrop J.P., Crabtree G.R., Mattila P.S. Negative regulation of interleukin-2 transcription by the glucocorticoid receptor. J. Exp. Med. 1992, v. 175, p. 1235-1245.

210. Ogbogu P.U., Rosing D.R., Home M.K. Cardiovascular manifestations of hypereosinophilic syndromes. Immunol. Allergy Clin. North Am. 2007, v. 27, p. 457-475.

211. Okayama Y., Petit-Frere C., Kassel O., Semper A., Quint D., Tunon-de-Lara M.J., Bradding P., Holgate S.T., Church M.K. IgE-dependent expression of mRNA for IL-4 and IL-5 in human lung mast cells. J. Immunol. 1995, v. 155, p. 1796-1808.

212. Ostezan L.B., Callen J.P. Cutaneous manifestations of selected rheumatologic diseases. Am. Fam. Physician. 1996, v. 53, p. 1625-1636.

213. Ouyang W., Ranganath S.H., Weindel K., Bhattacharya D., Murphy T.L., Sha W.C., Murphy K.M. Inhibition of Thl development mediated by GATA-3 through an IL-4 independent mechanism. Immunity. 1998, v. 9, p. 745-755.

214. Ozawa H. Steroid Hormones, their receptors and neuroendocrine system. J. Nippon Med. Sch. 2005, v. 72, v. 316-325.

215. Palancade B., Bensaude O. Investigating RNA polymerase II carboxyl-terminal domain (CTD) phosphorylation. Eur. J. Biochem. 2003, v. 270, p. 3859-3870.

216. Paul C.C., Keller J.R., Armpriester J.M., Baumann M.A. Epstein-Barr virus transformed B lymphocytes produce interleukin-5. Blood. 1990, v. 75, p. 1400-1403.

217. Perlmutter R.M., Levin S.D., Appleby M.W., Anderson S.J., Alberola Ila J. Regulation of lymphocyte function by protein phosphorylation. Ann. Rev. Immunol. 1993, v. 11, p. 451-499.

218. Pedersen A.G., Baldi P., Chauvin Y., Brunak S. The biology of eukaryotic promoter prediction—a review. Comput Chem. 1999, v. 23, p. 191-207.

219. Peppel K., Vinci J.M., Baglioni C. The AU-rich sequences in the 3'-untranslated region mediate the increased turnover of interferon mRNA induced by glucocorticoids. J. Exp. Med. 1991, v. 173, p. 349-355.

220. Peros-Golubicic T., Smojver-Jezek S. Hypereosinophilic syndrome: diagnosis and treatment. Curr. Opin. Pulm. Med. 2007, v. 13, p. 422-427.

221. Pfeuffer I., Klein-Hessling S., Heinfling A., Chuvpilo S., Escher C., Brabletz T., Hentsch B., Schwarzenbach H., Matthias P., Serfling E. Octamer factors exert a dual effect on the IL-2 and IL-4 promoters. J. Immunol. 1994, v. 153, p. 5572-5585.

222. Poole J.C., Andrews L.G., Tollefsbol T.O. Activity, function, and gene regulation of the catalytic subunit of telomerase (hTERT). Gene. 2001, v. 269, p. 1-12.

223. Ponta H., Cato A.C., Herrlich P. Interference of pathway specific transcription factors. Biochim. Biophys. Acta. 1992, v. 1129, p.255-261.

224. Porter B.O., Malek T.R. Thymic and intestinal intraepithelial T-lymphocyte development are each regulated by the gammac-dependent cytokines IL-2, IL-7, and IL-15. Semin. Immunol. 2000, v. 12, p. 465-574.

225. Polikanov Y.S, Rubtsov M.A., Studitsky V.M. Biochemical analysis of enhancer-promoter communication in chromatin. Methods. 2007, v. 41, p. 250-258.

226. Pratt W.B., Silverstein A.M., Galigniana M.D. A model for the cytoplasmic trafficking of signalling proteins involving the hsp90-binding immunophilins and p50cdc37. Cell Signal. 1999, v. 11, p. 839-851.

227. Ptashne M. How eukaryotic transcriptional activators work. Nature. 1988, v. 335, p. 683-689.

228. Pugh B.F. Control of gene expression through regulation of the TATA-binding protein. Gene. 2000, v. 255, p. 1-14.

229. Quintana A., Griesemer D., Schwarz E.C., Hoth M. Calcium-dependent activation of T-lymphocytes. Pflugers Arch. 2005, v. 450, p. 1-12.

230. Randak C., Brabletz T., Hergenrother M., Sobotta I., Serfïng E. Cyclosporin A suppresses the expression of the interleukin 2 gene by inhibiting the binding of lymphocyte-specific factors to the IL-2 enhancer. EMBO J. 1990, v. 9, p. 2529-2536.

231. Ranganath S., Ouyang, W., Bhattarcharya D., Sha W.C., Grape A., Peltz G., Murphy K.M. GATA-3-dependent enhancer activity in IL-4 gene regulation. J. Immunol. 1998, v. 161, p. 3822-3826.

232. Ray A., Prefontaine K.E. Physical association and functional antagonism between the p65 subunit of transcription factor NF-kappa B and the glucocorticoid receptor. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1994, v. 91, p. 752-756.

233. Reiner S.L. Development in motion: helper T cells at work. Cell. 2007, v. 6, p. 33-36.

234. Rincon M., Flavell R.A. AP 1 transcriptional activity requires both T cell receptor mediated and co stimulatory signals in primary T lymphocytes. EMBO J. 1994, v. 13, p. 4370-4381.

235. Rogatsky I., Ivashkiv L.B. Glucocorticoid modulation of cytokine signaling. Tissue Antigens. 2006, v. 68, p. 1-12.

236. Romagnani S. Regulation of the T cell response. Clin. Exp. Allergy. 2006, v. 36, p. 1357-66.

237. Romano R.A., Sinha S., Nagarajan P. Transcriptional control of the differentiation program of interfollicular epidermal keratinocytes. Crit. Rev. Eukaryot. Gene Expr. 2008, v. 18, p. 57-79.

238. Rose-John S., Schooltink H. Cytokines are a therapeutic target for the prevention of inflammation-induced cancers. Recent Results Cancer Res. 2007, v. 174, p. 57-66.

239. Roufosse F., Goldman M., Cogan E. Hypereosinophilic syndrome: lymphoproliferative and myeloproliferative variants. Semin. Respir. Crit. Care Med. 2006, v. 27, p. 158-170.

240. Rudensky A.Y., Gavin M., Zheng Y. FOXP3 and NFAT: partners in tolerance. Cell. 2006, v. 126, p. 253-256.

241. Rupee R.A., Boneberger S., Ruzicka T. Adverse cutaneous drug reactions. Dtsch. Med. Wochenschr. 2007, v. 132, p. 2685-2694.

242. Rupinder S.K., Gurpreet A.K., Manjeet S. Cell suicide and caspases. Vascul. Pharmacol. 2007, v. 46, p. 383-393.

243. Ryan J.J., Kashyap M., Bailey D., Kennedy S., Speiran K., Brenzovich J., Barnstein B., Oskeritzian C., Gomez G. Mast cell homeostasis: a fundamental aspect of allergic disease. Crit. Rev. Immunol. 2007, v. 27, p. 15-32.

244. Salerno M.S., Mordvinov V.A., Sanderson C.J. Binding of octamer factors to a novel 3'-positive regulatory element in the mouse interleukin-5 gene. J. Biol. Chem. 2000, v. 275, p. 4525-4531.

245. Salerno M.S., Schwenger G.T., Sanderson C.J., Mordvinov V.A. Binding of octamer factors to the murine IL-5 CLE0 in primary T-cells and a T-cell line. Cytokine. 2001, v. 15, p. 4-9.

246. Sanderson C.J. Eosinophil differentiation factor (interleukin-5). Immunol. Ser. 1990, v. 49, p. 231-256.

247. Sanderson C.J. IL-5, eosinophils and disease. Blood. 1992, v. 79, p. 3101-3109.

248. Sanderson C.J., O'Garra A., Warren D.J., Klaus G.G. Eosinophil differentiation factor also has B-cell growth factor activity: proposed name interleukin 4. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 1986, v. 83, p. 437-440.

249. Sanderson C.J., Urwin D. Interleukin-5: a drug target for allergic diseases. Curr. Opin. Investig. Drugs. 2000, v. 1, p. 435-441.

250. Sands W.A., Palmer T.M. Regulating gene transcription in response to cyclic AMP elevation. Cell Signal. 2008, v. 20, p. 460-466.

251. Santana M.A., Rosenstein Y. What it takes to become an effector T cell: the process, the cells involved, and the mechanisms. J. Cell Physiol. 2003, v. 195, p. 392-401.

252. Schimpl A., Berberich I., Kneitz B., Kramer S., Santner-Nanan B., Wagner S., Wolf M., Hunig T. IL-2 and autoimmune disease. Cytokine Growth Factor Rev. 2002, v. 13, p. 369-378.

253. Schmoll M., Kubicek C.P. Regulation of Trichoderma cellulase formation: lessons in molecular biology from an industrial fungus. Acta Microbiol. Immunol. Hung. 2003, v. 50, p. 125-145.

254. Scholer H.R. Octamania: the POU factors in murine development. Trends Genet. 1991, v. 7, p. 323-329.

255. Schreiber E., Matthias P., Muller M.M., Schaffner W. Rapid detection of octamer binding proteins with 'mini-extracts', prepared from a small number of cells. Nucleic Acids Res. 1989, v. 17, p. 6419-6423.

256. Schreiber-Agus N., DePinho R.A. Repression by the Mad(Mxil)-Sin3 complex. Bioessays. 1998, v. 20, p. 808-818.

257. Schwenger G.T., Fournier R., Hall L.M., Sanderson C.J., Mordvinov V.A. Nuclear factor of activated T cells and YY1 combine to repress IL-5 expression in a human T-cell line. J. Allergy Clin. Immunol. 1999, v. 104, p. 820-827.

258. Schwenger G.T.F., Fournier R., Kok C.C., Mordvinov V.A., Yeoman, D., Sanderson, C.J. GATA-3 has dual regulatory functions in human interleukin-5 transcription. J. Biol. Chem. 2001, v. 276, p. 48502^8509.

259. Schwenger G.T., Kok C.C., Arthaningtyas E., Thomas M.A., Sanderson C.J., Mordvinov V.A. Specific activation of human interleukin-5 depends on de novo synthesis of an AP-1 complex. J. Biol. Chem. 2002, v. 277, p. 47022-47027.

260. Schwenger G.T., Mordvinov V.A., Karlen S., D'Ercole M., Sanderson C.J. Identification of two novel palindromic regulatory elements in the murine interleukin-5 promoter. Mol. Immunol. 1998, v. 35, p. 149-158.

261. Schwenger G.T.F., Mordvinov V.A., Fournier R., Czabotar P., Peroni S., Sanderson C.J. IL-5. In: Oppenheim J.: A Compendium of Cytokines and Other Mediators of Host Defense. Academic Press. 2000, v. 1, p. 307-341.

262. Schwenger G.T., Sanderson C.J. New directions in understanding interleukin-5 gene expression. Leuk. Lymphoma. 1998, v. 28, p. 443-450.

263. Sekino N., Sekine Y., Ohtsubo E. ISl-encoded proteins, InsA and the InsA-B'-InsB transfrarae protein (transposase): functions deduced from their DNA-binding ability. Adv Biophys. 1995, v. 31, p. 209-222.

264. Sharma O.P., Bethlem E.P. The pulmonary infiltration with eosinophilia syndrome. Curr Opin. Pulm. Med. 1996, v. 2, p. 380-389.

265. Shi Y., Lee J.S., Galvin K.M. Everything you have ever wanted to know about Yin Yang 1. Biochim. Biophys. Acta. 1997, v. 1332, p. 49-66.

266. Shimizu R., Yamamoto M. Gene expression regulation and domain function of hematopoietic GATA factors. Semin. Cell. Dev. Biol. 2005, v. 16, v. 129-136.

267. Sica A., Dorman L., Viggiano V., Cippitelli M., Ghosh P., Rice N., et al. Interaction of NF-kappaB and NFAT with the interferon-gamma promoter. J. Biol. Chem. 1997, v. 272, p. 30412-30420.

268. Siegel M.D., Zhang D.H., Ray P., Ray A. Activation of the interleukin-5 promoter by cAMP in murine EL-4 cells requires the GATA-3 and CLE0 elements. J. Biol. Chem. 1995, v. 270, p. 24548-24555.

269. Simon D., Simon H.U. Eosinophilic disorders. J. Allergy Clin. Immunol. 2007, v. 119, p.1291-1300.

270. Smirnov D.V., Smirnova M.G., Korobko V.G., Frolova E.I. Tandem arrangement of human genes for interleukin-4 and interleukin-13: resemblance in their organization. Gene. 1995, v. 155, p. 277-281.

271. Smith J.B., Herschman H.R. Targeted identification of glucocorticoid-attenuated response genes: in vitro and in vivo models. Proc. Am. Thorac. Soc. 2004, v. 1, p. 275-281.

272. Spahn J.D., Szefler S.J. Steroid therapy for asthma in children. Curr Opin Pediatr. 2007, v. 19, p. 300-305.

273. Sporn M.B., Roberts A.B. Peptide growth factors are multifunctional. Nature. 1988, v. 332, p. 217-219.

274. Stahn C., Löwenberg M., Hommes D.W., Buttgereit F. Molecular mechanisms of glucocorticoid action and selective glucocorticoid receptor agonists. Mol. Cell. Endocrinol. 2007, v. 275, p. 71-78.

275. Stark J., Chan C., George A.J. Oscillations in the immune system. Immunol. Rev. 2007, v. 216, p. 213-231.

276. Staudt L.M., Clerc R.G., Singh H., LeBowitz J.H., Sharp P.A., Baltimore D. Cloning of a lymphoid-specific cDNA encoding a protein binding the regulatory octamer DNA motif. Science. 1988, v. 241, p. 577-580.

277. Staudt L.M., Lenardo M.J. Immunoglobulin gene transcription. Ann. Rev. Immunol. 1991, v. 9, p. 373-398.

278. Stranick K.S., Payvandi F., Zambas D.N., Umland S.P., Egan R.W., Billah M.M. Transcription of the murine interleukin 5 gene is regulated by multiple promoter elements. J. Biol. Chem. 1995, v. 270, p. 20575-20582.

279. Stranick K.S., Zambas D.N., Uss A.S., Egan R.W., Billah M.M., Umland S.P. Identification of Transcription Factor Binding Sites Important in the Regulation of the Human Interleukin-5 Gene. J. Biol. Chem. 1997, v. 272, p. 16453-16465.

280. Sugiura R., Sio S.O., Shuntoh H., Kuno T. Molecular genetic analysis of the calcineurin signaling pathways. Cell. Mol. Life Sci. 2001, v. 58, p. 278-288.

281. Szutorisz H., Dillon N., Tora L. The role of enhancers as centres for general transcription factor recruitment. Trends Biochem. Sci. 2005, v. 30, p. 593-599.

282. Takatsu K., Tominaga A., Harada N., Mita S., Matsumoto M., Takahashi T., Kikuchi Y., Yamaguchi N. T cell-replacing factor (TRF)/interleukin 5 (IL-5): molecular and functional properties. Immunol. Rev. 1988, v. 102, p. 107-135.

283. Tan S., Richmond T.J. Eukaryotic transcription factors. Curr. Opin. Struct. Biol. 1998, v. 8, p. 41-48.

284. Tanaka M.H., Herr W. Differential transcriptional activation by Oct-1 and Oct-2: interdependent activation domains induce Oct-2 phosphorylation. Cell. 1990, v. 60, p. 375386.

285. Taylor P.E., Jacobson K.W., House J.M., Glovsky M.M. Links between Pollen, Atopy and the Asthma Epidemic. Int. Arch. Allergy Immunol. 2007, v. 144, p. 162-170.

286. Tefferi A., Vardiman J.W. The diagnostic interface between histology and molecular tests in myeloproliferative disorders. Curr. Opin. Hematol. 2007, v. 14, p. 115-122.

287. Thomas M.A., Mordvinov V.A., Sanderson C.J. The activity of the human interleukin-5 conserved lymphokine element 0 is regulated by octamer factors in human cells. Eur. J. Biochem. 1999, v. 265, p. 300-307.

288. Thomas M.C., Chiang C.M. The general transcription machinery and general cofactors. Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 2006, v. 41, p. 105-178.

289. Thomas R.S., Tymms M.F., Seth A., Shannon M.F., Kola I. ETS1 transactivates the human GM-CSF promoter in Jurkat T cells stimulated with PMA and ionomycin. Oncogene. 1995, v. 11, p. 2135-2143.

290. Thomeer M., Moerman P., Westhovens R., Van den Eeckhout A., Dequeker J., Demedts M. Systemic lupus erythematosus, eosinophilia and Loffler's endocarditis. An unusual association. Eur. Respir. J. 1999, v. 13, p. 930-933.

291. Thomson A.W., Lotze M.T, eds. The Cytokine Handbook. 4th ed. London, UK: Academic Press; 2003.

292. Ting C.N., Olson M.C., Barton K.P., Leiden J.M. Transcription factor GATA-3 is required for development of the T-cell lineage. Nature. 1996, v. 384, p. 474-478.

293. Towbin H., Staehelin T., Gordon J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1979, v. 76, p. 4350-4354.

294. Trivedi S.G., Lloyd C.M. Eosinophils in the pathogenesis of allergic airways disease. Cell. Mol. Life Sci. 2007, v. 64, p. 1269-1289.

295. Tsuruta L., Arai N., Arai K.-I. Transcriptional control of cytokine genes. International reviews of immunology. 1998, v. 16, p. 581-616.

296. Umetsua D.T., DeKruyffa R.H. Immune dysregulation in asthma. Current Opinion in Immunology. 2006, v. 18, p. 727-732.

297. Valeyrie-Allanore L., Sassolas B., Roujeau J.C. Drug-induced skin, nail and hair disorders. Drug Saf. 2007, v. 30, p. 1011-1030.

298. Van Straaten J.F., Dokter W.H., Stulp B.K., Vellenga E. The regulation of interleukin 5 and interleukin 3 gene expression in human T cells. Cytokine. 1994, v. 6, p. 229-234.

299. Ventura C., Maioli M. Protein kinase C control of gene expression. Crit. Rev. Eukaryot. Gene Expr. 2001, v. 11, v. 243-267.

300. Vielhauer V., Anders H.J., Schlondorff D. Chemokines and chemokine receptors as therapeutic targets in lupus nephritis. Semin. Nephrol. 2007, v. 27, p. 81-97.

301. Vilcek J., Feldmann M. Historical review: Cytokines as therapeutics and targets of therapeutics. Trends Pharmacol. Sci. 2004, v. 25, p. 201-209.

302. Vitetta E.S., Brooks K., Chen Y.W., Isakson P., Jones S., Layton J., Mishra G.C., Pure E., Weiss E., Word C., et al. T-cell-derived lymphokines that induce IgM and IgG secretion in activated murine B cells. Immunol. Rev. 1984, v. 78, p. 137-157.

303. Voehringer D. Allergies and parasites. Dtsch. Med. Wochenschr. 2007, v. 132, p. 991994.

304. Voellmy R., Boellmann F. Chaperone regulation of the heat shock protein response. Adv. Exp. Med. Biol. 2007, v. 594, p. 89-99.

305. Walter M. J., Holtzman M.J. A Centennial History of Research on Asthma Pathogenesis. Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol. 2005, v. 32. p. 483-^89.

306. Ward R.C., Kaufman H.L. Targeting costimulatory pathways for tumor immunotherapy. Int. Rev. Immunol. 2007, v. 26, p. 161-196.

307. Warren D.J., Sanderson C.J. Production of a T-cell hybrid producing a lymphokine stimulating eosinophil differentiation. Immunology. 1985, v. 54, p. 615-623.

308. Warren H.S., Kinnear B.F., Phillips J.H., Lanier L.L. Production of IL-5 by human NK cells and regulation of IL-5 secretion by IL-4, IL-10, and IL-12. J. Immunol. 1995, v. 154, p. 5144-5152.

309. Weaver C.T., Hatton R.D., Mangan P.R., Harrington L.E. IL-17 family cytokines and the expanding diversity of effector T cell lineages. Annu. Rev. Immunol. 2007, v. 25, p. 821-852.

310. Wechsler M.E. Pulmonary eosinophilic syndromes. Immunol. Allergy Clin. North Am. 2007, v. 27, p. 477-492.

311. Wein J., Roberts E. Influence of H-2 isoantibody on electrophoretic behavior of EL4 lymphoma cells. Cancer Res. 1965, v. 25, p. 1753-1758.

312. Weinmann R. The basic RNA polymerase II transcriptional machinery. Gene Expr. 1992, v. 2, p. 81-91.

313. Werner M.H., Burley S.K. Architectural transcription factors: proteins that remodel DNA. Cell. 1997, v. 88, p. 733-736.

314. Werner M.H., Gronenborn A.M., Clore G.M. Intercalation, DNA kinking, and the control of transcription. Science. 1996, v. 271, p. 778-784.

315. Wetzel S.A., Parker D.C. MHC transfer from APC to T cells following antigen recognition. Crit. Rev. Immunol. 2006, v. 26, p. 1-21.

316. Williams A. F., Barclay A. N. The immunoglobulin superfamily-domains for cell surface recognition. Ann. Rev. Immunol. 1988, v. 6, p. 381-405.

317. Winge D. R. Copper-regulatory domain involved in gene expression. Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol. 1998, v. 58, p. 165-195.

318. Wolfe S.A., Nekludova L., Pabo C.O. DNA recognition by Cys2His2 zinc finger proteins. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 2000, v. 29, p. 183-212.

319. Wolffe A.P. Transcription: in tune with the histones. Cell. 1994a, v. 77, p. 13-16.

320. Wolffe A.P. .Architectural transcription factors. Science. 1994b, v. 264, p. 1100-1101.

321. Wolffe A.P. Histone deacetylase: a regulator of transcription. Science. 1996, v. 272, p. 371-372.

322. Wolohan P., Reichert D.E. CoMSIA and docking study of rhenium based estrogen receptor ligand analogs. Steroids. 2007, v. 72, p. 247-260.

323. Wu C. Chromatin remodeling and the control of gene expression. J. Biol. Chem. 1997, v. 272, p. 28171-28174.

324. Wu C., Liu F., Zhou X., Cheng Z., Yang X., Xiao H., Chen Q., Cai K. Effect of protein kinase C on proliferation and apoptosis of T lymphocytes in idiopathic thrombocytopenic purpura children. Cell. Mol. Immunol. 2005, v. 2, p. 197-203.

325. Yang-Yen H.F., Chambard J.C., Sun Y.L., et al. Transcriptional interference between c-Jun and the glucocorticoid receptor: mutual inhibition of DNA binding due to direct protein-protein interaction. Cell. 1990, v. 62, p. 1205-1215.

326. Yarilin A.A., Belyakov I.M. Cytokines in the thymus: production and biological effects. Curr. Med. Chem. 2004, v. 11, p. 447-464.

327. Zhang D.H., Yang L., Cohn L., Parkyn L., Homer R., Ray P., Ray A. Inhibition of allergic inflammation in a murine model of asthma by expression of a dominant negative mutant of GATA 3. Immunity. 1999, v. 11, v. 473-482.

328. Zheng W., Flavell R.A. The transcription factor GATA 3 is necessary and sufficient for Th2 cytokine gene expression in CD4 T cells. Cell. 1997, v. 89, p. 587-596.

329. Zink D.A., Amin M., Gebara S., Desai T.K. Familial dysphagia and eosinophilia. Gastrointest. Endosc. 2007, v. 65, p. 330-334.

330. Zuo L., Rothenberg M.E. Gastrointestinal eosinophilia. Immunol. Allergy Clin. North Am. 2007, v. 27, p. 443-455.

Информация о работе

Мордвинов, Вячеслав Алексеевич
доктора биологических наук
Новосибирск, 2008
ВАК 03.00.03

Диссертация

Структурно-функциональная организация регуляторных районов и механизмы транскрипции генов интерлейкина-5 человека и мыши - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Структурно-функциональная организация регуляторных районов и механизмы транскрипции генов интерлейкина-5 человека и мыши - тема автореферата по биологии, скачайте бесплатно автореферат диссертации

Похожие работы