Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Идентификация сайтов связывания рецептора глюкокортикоидов: их структура и функция

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Идентификация сайтов связывания рецептора глюкокортикоидов: их структура и функция"

российская академия

наук

сибирское отделение институт цитологии и генетики

На правах рукописи.

■ / ■ 'I

П Л И С О В Сергей Юльевич

УДК 577.214.6:577.218

ИДЕНТИФИКАЦИЯ САЙТОВ СВЯЗЫВАНИЯ РЕЦЕПТОРА ГЛШОКОРТККОВДОВ; ИХ СТРУКТУРА И ФУНКЦИЯ.

(03.00.15 - Генетика)

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на

соискание ученой степени кандидата биологических наук.

* * *

Новосибирск 1993

Работа выполнена в Институте цитологии и генетики

СО РАН, г.Новосибирск. Научный руководитель - кандидат биологических наук,

старший научный сотрудник Меркулова Т.И.

Официальные оппоненты - доктор биологических наук,

Беляева Е.С. Институт цитологии и генетики СО РАН.

кандидат биологических наук, Свинарчук Ф.П. Новосибирский институт биоорганической химии СО РАН.

Ведущая организация - Московский Государственный

Университет, РАН, г.Москва.

-7<7

Защита диссертации состоится " 'января 1994 г. на _ заседании специализированного совета по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук (Д-002.11.01) при Институте цитологии и генетики СО РАН в конференц-зале Института по адресу: 630090, Новосибирск-90, проспект Академика Лаврентьева, 10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института

цитологии и генетики СО РАН.

Автореферат разослан " " 1993 г.

Ученый секретарь специализированного совета

доктор биологических наук " А.Д.Груздев.

Актуальность проблемы.

Исследование механизмов регуляции экспрессии генов - одна из центральных проблем современной молекулярной биологии. Ключевую роль в осуществлении большинства типов регуляции экспрессии генов играют так называемые факторы транскрипции, или белки, способные связываться с определенными участками ДНК, что приводит к изменению уровня транскрипции приленалщх генов. К числу таких белков относятся и рецепторы стероидных гормонов.

Изучение структуры участков ДНК, опознаваемых белками-рецепторами, выявление их в глюкокортикоид-зависимых генах, выяснение их расположения относительно сайтов связывания других регуляторных белков, изучение их возмокного взаимодействия между собой,- все это ведет к пониманию молекулярных механизмов активации и репрессии гормон-зависимых генов.

Актуальность работы обусловлена также необходимостью функционального анализа секвенированных последовательностей ДНК генов, регулируемых глюкокортикоидами, и отсутствием удовлетворительных критериев'поиска сайтов связывания транскрипционных факторов (в т.ч. глюкокортикоидного рецептора) в них. Цель работы* Данная работа посвящена выявлению неизвестных ранее сайтов связывания глюкокортикоидного рецептора в глико-кортикоид-регулируемых генах, изучению влияния их первичной структуры на эффективность связывания с рецептором и выяснению их способности функционировать в качестве глюкокортикоид-зависимых регуляторов транскрипции.

Научная новизна работы. В работе получены принципиально новые данные о том, что специфичность связывания глюкокортикоидного рецептора с ДНК определяется не только присутствием в ДНК общепринятого консенсуса, но и некими характерными особенностями его непосредственного нуклеотидного окружения. Эти данные легли в основу нового компьютерного метода поиска сайтов связывания рецептора глюкокортикоидов, разработанного в Теоретическом Отделе ИЦИГ СО РАН. В данной работе были впервые экспериментально выявлены предсказанные данным методом сайты в генах металлотионеина I мыты (мМТ1) и цитохрома Р450е крысы. Было показано, что каждый из двух сайтов связывания рецептора глюкокортикоидов, выявленных в гене мМТ1, в изолированном виде может выполнять функции элементов глюкокортикоидного

ответа (GRE), способных под действием глкжокортиковдов усиливать экспрессию репортерного гена CAT, находящегося под контролем гетерологичного промотора.

Оказалось, однако, что промотор гена мМТ1, содержащий один из выявленных GRE в своем природном окружении, был практически нечувствительным к глюкокортикоидам. Результаты проведенного делеционного анализа этого района гена мМТ1 говорят в пользу существования дополнительных регуляторных участков, влияющих на проявление функций этого GRE. Теоретическая и практическая ценность работы. Полученные в работе результаты способствуют дальнейшему развитию представлений о структурно-функциональной организации генов. Они также имеют значение для разработки эффективных методов анализа последовательностей ДНК геномов живых организмов. Апробация работы. Результаты работы докладывались на I и II Всесоюзных конференциях "Геном человека" (1990, 1991, Перея-славль-Залесский) и Всесоюзном симпозиуме "Биохимия рецеп-торных систем" (1990, Таллин)

Структура диссертации. Диссертация изложена на 116 стр., она включает 16 рисунков и 1 таблицу, список цитированной литературы содержит 199 наименований. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов исследования, выводов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

Выращивание E.coli, трансформацию их плазмидами, выделение плазмид методом щелочного лизиса, расщепление ДНК ферментами рестрикции, достраивание З'-концов ДНК фрагментом Клонова, электрофорез ДНК в агарозном и полиакриламидном гелях, лиги-рование ДНК, анализ колоний E.coli, содержащих рекомбинантные плазмиды проводили по методам, описанным ранее [Маниатис et.al. 19841. Анализ первичной структуры ДНК проводили по методу Максама и Гилберта CMaxam et.al. 19801.

Были использованы синтезированные олигонуклеотиды: МТдт AGCACTATAGGGAÇATGATGTTÇÇACACGTCACATGG-TCGTCC

МТ2Т gatccgggatgtcgctGGaACAcagTGTTÇCgtgtactgtgcaaactactg МТ43 ■ TCCTACACAGTTÇÇACCCTGTTTACTAAACCCCCGTTTTCTACC

25 GATCCCCCCGGGCATCACCGTGCAGGGGGGACGGTAÇAGAGTGTTÇTGCGAGGGATGCG 111 GATCCTGTTACCATAGTGTAACTTCCTATTCAGGTAÇAATATGTTÇTATACTTGTATTT

КГдт- фрагмент ДНК, вдентичный участку гена МИ мыши от -252 до -209 я.н.; МТ27- аналог МТдт, с транзициями всех оснований за исключением 11-ти консервативных нуклеотидов консенсуса; ИТ43- фрагмент гена МИ мыши от +1011 до +1054 п.н.;25 и 111-фрагменты ДНК, содержащие элементы консенсуса сайтов связывания рецептора глюкокортикоидов в G/C или А/Т богатом окружении соответственно. Плазмиды.

Олигонуклеотиды были клонированы по Smal сайту в pUC18, затем, содержащие их EcoRI-Hindlll фрагменты, переклонированы в рТКСАТ перед репортерным геном CAT и промотором гена ТК HSV. Фрагмент BstEII-BgHI гена MTI мыши ( от -330 до +70 п.н.) был вырезан и встроен в плазмиду рВЬбСАТ, перед геном CAT (рМТВВСАТ). Плазмида рММСАТ и рВЕСАТ были получены в результате встраивания Msp.I-Msp.I (от-305 до -42 п.н.) и BspR.I-Ecl136.II (от -266 до -149 п.н.) фрагментов гена MTI мыши соответственно в pBL5CAT перед промотором гена ТК HSV и геном CAT.

Очистку рецептора глюкокортикоидов из печени крас вели по модифицированному [Плисов и др.1990] методу [Wränge et.al.1989 1. Конечная степень очистки ГлРК сосотавляла около 5000 раз. Связывание ГР-ДНК комплексов с нитроцеллвлозкьаш иемЗранамн.

ор

5 нг меченой ДНК инкубировали с 1-16 иг высокоочшцен-ного ГР. После инкубации пробы пропускали через нитроцеллюло-зные фильтры ВА-85 ("Schleicher шй Schull") и промывали инкубационным буфером. Определяли связанную на них радиоактивность по Черенкову. Метод тормояекия ДНК-зонда в геле.

Цитозоль печени крыс очищали от ДНК-связывакщих белков на колонке с ДНК-целлюлозой. ГР, незадерживающийся на ДНК-целлюлозе, активировали при 25°С, добавляли к нему поли(1)/поли(С), инкубировали 10 мин при комнатной температуре и разносили t Н] ГлРК в пробирки с приготовленной смесью

гэ п

меченого Р ДНК-зонда (2 нг) и 50-кратным избытком немеченой конкурентной ДНК. После инкубации пробы фракционировали в ПААГ.

Культивирование клеток саркомы мыши LTK- вели в среде MEM с 5% эмбриональной сывороткой коров в атмосфере 5% СО^,, 37°С. Временные трансфекции проводили с помощью кальций-фосфатного

метода ГГловер 1988]. Стимуляцию клеток дексаметазоном или ионами кадмия вели 20 часов, после чего определяли активность CAT в экстрактах клеток по методу, описанному ранее [Gorman et.al.1982].

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

К настоящему времени экспериментально идентифицированы уже десятки участков ДНК, специфически опознаваемых глкжокортико-идным рецептором (ГР). При сравнении нуклеотидных последовательностей ряда таких участков была выведена последовательность GGnACAnnnTGTTCT .(консенсус). Авторы, выявившие данный консенсус, предположили, что его присутствия в последовательностях ДНК достаточно для обеспечения специфического взаимодействия с ГР.

До настоящего времени консенсусную последовательность GGnACAmmIGTTCT использовали как единственный критерий для' предсказания положения сайтов связывания ГР в последовательностях ДНК регулируемых глюкокортикоидами генов, допуская то или иное число несовпадений с ней. Так, при использовании совершенного варианта консенсуса были найдены участки связывания ГР в ряде глшокортикоид-зависимых генов [Jalswal et.al. и др.].

В данной работе эта консенсусная последовательность была использована для поиска сайтов связывания ГР в гене металло-тионеина I мыши (мМТ1). Известно,что транскрипция этого гена In vivo находится под контролем глюкокортикоидных гормонов [Hager et.al.1981], однако его районы, связывающиеся с ГР и ответственные за глюкокортикоидную регуляцию, не были найдены. Наиболее близким к консенсусу оказался участок гена, расположенный от -242 до -228 п.н. вверх от точки начала транскрипции.

Двуцепочечный синтетический фрагмент ДНК (МТдт), соответствующий участку гена MTI мыши от г252 до -209 п.н. относительно точки начала транскрипции, содержащий описанную выше характерную для сайтов связывания ГР последовательность, был встроен в плазмиду pUC19 по сайту Smal. Полученная плазмида, рМТдт, была использована в опытах по связыванию с ГР . ДНК связывается с нитроцеллюлозой только в комплексе с белками, а свободная от белка ДНК не задерживается. Из результатов

Рис.1 Специфическое связывание высокоочищенного рецептора глжжокортикоидов с ДНК плазиида рМТдт (1) по сравнению с плазиидой риС19 (2). Типичные результаты одного из пяти экспериментов по задержке комплексов "рецептор-ДИК" на нитроцеллюлозных мембранах. По оси абсцисс - процент меченой ДНК, задержаной на мембране после связывания с рецептором (%), по оси орди-нат-количество рецептора (нг).

опытов, представленных на рис. 1, видно, что ДНК плазмиды рМТдт, содержащей фрагмент гена MTI мыши, в 3-5 раз эффективнее связывает ГР, чем ДНК исходной плазмиды.

В экспериментах по связыванию комплексов ГР/ДНК на нитро-

тэо

целлюлозных мембранах использовали также и смесь меченых Р коротких фрагментов ДНК (рис.2): HlndlII-EcoRI фрагмента плазмиды рМТдт длиной 98 п.н. и как неспецифическую ДНК - Mspl-MspI фрагмент pUC18 длиной 110 п.н. После связывания с очищенным ГР и задержки полученных комплексов на нитроцеллюлозных мембранах, ДНК смывали с' мембран и подвергали электрофорезу. Из результатов экспериментов, представленнцх на рис. 2 видно, что на мембранах преимущественно задерживается, а значит -связывается с ГР, меньший фрагмент, соответствующий исследуемому участку 5'-фланкирующей области гена MTI мыши.

Такие же результаты были получены нами в экспериментах по торможению ДНК в геле (рис.3). Этот метод широко применяется для изучения связывания белков-регуляторов транскрипции с ДНК [Lee et.al. 1984, Murcham et.al. 1987, Phan et.al.1988 и др.]. Из рис.3 видно, что после инкубации меченого ДНК зонда с ГР подвижность полученного комплекса в геле при электрофорезе падает. Если в реакционную смесь добавить избыток немеченного фрагмента ДОК, содержащего район гена мМТ1 от -209 до • -252 п.н., то он эффективно вытесняет меченый ДНК-зонд из

«старт

Рис.2. Электрофореграмма снеси меченых фрагментов ДНК, задергавшихся на нитроцеллюло-зной мембране после связывания с рецептором глюкокортикоидов.

110 п.н,- Мзр1-Мзр1 неспецифический фрагмент ДНК рЦС19; 98 п.н.- ЕсоН1-Н1пс1111 фрагмент рМТдт, содержащий -252/-209 п.н. участок гена МТ1 мыши. 1)- без рецептора, отмывка мембраны 500 мкл инкубационного буфера; 2) ,3),4)- сответственно 10, 20,и 30 мин инкубации с рецептором с последующей 500 мкл отмывкой мембран; 5), 6)- без рецептора, отмывки по 150 и 300 мкл соответственно; 7) и 8)-исходная смесь фрагментов ДНК.

3

4

5

6 7

Рис. 3. Влияние первичной структуры ДНК в окружении консенсуса сайтов связывния рецептора глюкокортикоидов на эффективность связывания ДНК с рецептором.

1 - свободный зонд; 2 - зонд в комплексе с ГР без конкурентной ДНК; 3-7 - вытеснение зонда из комплекса ТР-зонд" различными не-меченными фрагментами конкурентной ДНК:

РуиЫ-ЕсоЮ: фрагмент рШ319 (неспецифическая ДНК); ЕсоМ-Н1пс1111 фрагмент рМТ27; Есой1-Н1пс1111 фрагмент рМТдт; ЕсоН1-Н±шШ1 фрагмент р111; ЕсоН1-Н1пс1111 фрагмент р25;

из комплекса с рецептором глюкокортикоидов. Фрагмент ДНК сходной длины из pUC19, взятый в таком же количестве, вытесняет зонд из комплекса с рецептором существенно хуже. Эффективная конкуренция исследуемого фрагмента гена МИ мыши за рецептор глюкокортикоидов по сравнению с конкуренцией фрагмента ДНК из pUC19 говорит о том, что этот участок гена MTI мыши содержит сайт специфического связывания рецептора глюкокортикоидов .

Таким образом, показано, что в 5•-фланкирующем районе гена МИ мыши на расстоянии от -252- до -209 п.н. вверх от точки начала транскрипции находится участок специфического связывания ГР.

Реальные сайты связывания ГР, как правило, не содержат "идеальной" консенсусной последовательности GGriACAimnTGTTCT, а несовершенные копии такой последовательности часто встречаются в районах ДНК, не способных связываться с ГР. Поэтому нами было выдвинуто предположение, что в процессе специфического взаимодействия ГР с ДНК принимает участие не только район расположения консенсусной последовательности, но и районы ДНК, из его непосредственного окружения. Для выяснения роли нуклеотидного окружения такого консенсуса в связывании с ГР был использован синтетический фрагмент ДНК, в котором от нуклеотидной последовательности природного сайта связывания ГР из гена MTI мыши (МТдт) неизменными были оставлены только 11 пар нуклеотидов, соответствующих наиболее консервативным парам пятнадцатичленного консенсуса, а остальные были заменены путем транзиций ( А на G, Т на 0 ). Этот фрагмент ДНК, обозначенный МТ27, клонировали в плазмиде pUC19 по BamHI сайту рестрикции.

Для этой же цели были также использованы два других синтетических полинуклеотида (25 и 111), содержащих элементы консенсуса сайтов связывания рецептора глюкокортикоидов в G/G или А/Т богатом окружении соответственно. Эти полинуклеотида были клонированы в pUC19,. полученные плазмиды были названы р25 и р111.

HindIII-EcoRI фрагменты гидролиза плазмид рМТдт, рМТ27, р25 и р111, содержащие описанные полинуклеотида, а также PvuII-EcoRI фрагмент pUC19 в качестве контроля неспецифического связывания ГР были использованы как конкурентные ДНК в

экспериментах по торможению ДНК в геле для сравнения их способности связываться с ГР.

Из результатов экспериментов, представленных на рис.3, видно, что лучше всего конкурирует за ГР фрагмент ДНК, содержащий природную последовательность гена мМТ1 (дор.5). Существенно хуже ГР взаимодействует с фрагментом ДНК, в котором от природной последовательности МТдт оставлены неизмененными только 11 консервативных пар нуклеотидов СС-АСА—ТСТТСС, соответствующих общепринятому консенсусу участка связывания ГР, а остальные изменены путем транзиций (дор.4). Такие замены значительно ослабляют сродство фрагмента к ГР, однако, он превосходит по силе связывания фрагмент неспецифической ДНК сходной длины (дор.З).

ЕсоКГ-ШшПИ фрагменты рестрикции плазмид р25 и р111, содержащие идентичные совершенные копии консенсусной последовательности сайта связывания ГР, но в разном нуклеотидном окружении вели себя по-разному. Связывание фрагмента 111, содержащего А/Т богатое окружение консенсусной последовательности ( 72% А/Т п.н. ), соответствовало по силе фрагменту 27 ( дор. 6 ), а фрагмент 25 ( 28% А/Т п.н. ) связывался с ГР лучше, на уровне фрагмента МТдт ( дор. 7 ).

Полученные результаты четко свидетельствуют о том, что в связывании с ГР важны как консервативные элементы консенсусной последовательности, так и их вариабельное ближайшее окружение. Поэтому нам представляется возможным рассматривать последовательность СС-АСА—ТСТТСТ как "ядро" сайта связывания ГР, в окружении которого присутствуют дополнительные особенности строения ДНК, необходимые для функционирования этого сайта. Вероятно, относительная роль "ядра" и "окружения" в связывании с ГР в каждом конкретном случае различна и определяется первичной структурой ДНК в данном участке.

Полученные нами экспериментальные данные и предположение о том, что сайты связывания ГР состоят не только из консервативного "ядра", но и вариабельного "окружения", легли в основу создания нового компьютерного метода, позволяющего выявлять участки связывания ГР в любых заданных последовательностях ДНК. Такой метод был разработан в теоретическом отделе ИЦИГ СОРАН. С его помощью были предсказаны гипотетические сайты связывания ГР в 26 из 28 проанализированых ге-

нов, регулируемых глюкокортикоидами, и в то же время в 21 из 26 последовательностей не связанных с глхжокортикоидной регуляцией гипотетических сайтов не было найдено.

В настоящей работе была проведена экспериментальная проверка существования предсказанных данным методом сайтов связывания ГР в ряде генов.

Один из таких генов - ген цитохрома Р450е крысы. В ближней 5'-фланкирующей области этого гена было предсказано существование двух гипотетических сайтов связывания ГР (-378 и -325 п.н.) (рис.4а). Оба гипотетических сайта содержат последовательности нуклеотидов, сходные с консенсусом сайтов связывания ГР GG-ACA—TGTTCT. В этой области находятся также две близкорасположенные последовательности, гомологичные указанному консенсусу, но не классифицированные данным методом как сайты связывания ГР (рис.46).

Alul фрагменты рестрикции, содержащие либо оба гипотетических сайта (фрагмент I), либо две гомологичные общепринятому консенсусу последовательности (фрагмент II) были использованы как конкурентные ДНК в экспериментах по торможению ДНК в геле (рис.4в). Оказалось, что фрагмент I значительно превосходит по силе связывания с ГР фрагмент II.

Таким образом, показано, что разработанный компьютерный метод предсказания сайтов связывания ГР эффективнее, чем метод поиска по консенсусу. Большая точность этого метода, возможно, объясняется тем, что он создан на основе анализа не только районов ДНК, соответствующих общепринятому консенсусу сайтов связывания ГР, но и их ближайшего нуклеотидного окружения. Мы предполагаем, что элементы окружения консенсуса сайтов связывания ГР либо напрямую опознаются ГР, либо участвуют в формировании правильной донорно-акцепторной поверхности сайта, необходимой для специфического связывания ГР с ДНК.

С помощью этчго метода был предсказан также еще один сайт в гене MTI мыши:- в 3'-фланкирующей области с (+1029 п.н.), содержащий всего всего 7 из 11 элементов консенсуса. Последовательности с таким же числом совпадений с консенсусом часто встречаются в районах ДНК, не связывающихся с ГР, например, в генах а-глобина мыши, TAT крысы и мыши, инсулина человека, в гагазмидах рВН322, pUC19, в фаге М13тр18, в ДНК

Рис.4 Идентификация участка ДНК из ближней 5'-фланкирующей области гена цитохрома Р450е крысы, специфически связывающего рецептор глюкокортикоидов.

А)

А1и I -«О

А1и I >525"

11

IX

А1и I

I» . т

1 2

3*

100 Ър

3

5

В)

1 2 5 4

В)

ОДяАОДттХаТТОТ

\acx0tezgi0gi0T -з?в

Ов4с«ч1сТ(}«Т»Т -525

агвоОегитотсОт -156

аиодгввтатсот -133

КО I II III

а) Схема 5'-фланкирующего района гена цитохрома Р450е крысы: *■ - точка начала транскрипции; * и х - локализация последовательностей ДНК, гомологичных консенсусу ССпАСАпппТСТТСТ; * - предсказанные сайты связываия рецептора;

б) Нуклеотидные последовательности консенсуса и его гомологов (1,2,3,4) во фрагментах I и II. Справа приведены позиции отмеченых точками нуклеотидов относительно точки начала транскрипции.

в) Связывание фрагментов I и II с высокоочшценным рецептором, глюкокортикоидов. О - подвижность свободного зонда; К - подвижность комплекса зонд-рецептор; I, II, III - подвижность зонда в присутствии 30-кратного избытка конкурентной ДНК (соответственно: фрагменты I, II и III, где III - 455 п.н. фрагмент неспецифической ДНК ).

вируса SV40 и т.д. [Селедцов и др.1990). Кроме того, весьма необычно расположение потенциального сайта связывания ГР в 3'-области гена. Известен лишь один пример такого расположения сайта связывания ГР в гене рецептора глюкокортикоидов. Поэтому представлялось интересным экспериментально исследовать способность этого потенциального сайта связываться с рецептором глюкокортикоидов и обеспечивать глюкокортикоидную регуляцию.

С этой целью фрагмент ДНК гена MTI мыши от +924 до +1239 п.н. относительно точки начала транскрипции, содержащий предсказанный сайт связывания ГР был использован в эксперименте по торможению ДНК в геле. В качестве меченого зонда был взят выявленный нами сайт связывания из 5'-фланкирующей области гена MTI мыши. Оказалось, что этот фрагмент ДНК, как и фрагмент МТдт (5'-сайт связывания ГР), способен эффективно конкурировать за рецептор, что говорит о том, что в его состав входит сайт специфического связывания ГР.

До сих пор районы гена MTI мыши, ответственные за его глюкокортикоидную регуляцию, не были найдены так как при клонировании этого гена даже вместе с протяженными фланкирующими его участками генома, он перестает регулироваться глю-кокортикоидами, тогда как регуляция его другими агентами сохраняется. Приины этого явления не ясны.

Представляло существенный интерес исследовать способность выявленных в гене MTI мыши сайтов связывания ГР из его 5'- и 3'-фланкирующих областей обеспечивать глюкокортикоидную регуляцию транскрипции генов.

С этой целью, соответствующие синтезированные полинуклеотида (МТдт и МТ43), были встроены в плазмиду рТКСАТ, перед нечувствительным к глкжокортикоидам промотором гена тимидин-киназы и присоединенной к нему кодирующей частью репортерно-го гена хлорамфениколацетилтрансферазы (САТ).Получеными пла-змидами трансфецировали L-клетки мыши, обрабатывали их дек-саметазоном и-измеряли активность CAT в экстрактах клеток.

Из результатов экспериментов, приведенных на рис.6, видно, что изолированный участок связывания глюкокортикоидного рецептора из 5'-фланкирующей области гена MTI мыши от -252 до -209 п.н. обеспечивает усиление экспрессии гена CAT в 4,7 раза (Р > 0,95 ) под действием дексаметазона. Изменение ори-

- м -

Рис.6 Схены плазыид, использова!Шых для трансфекции LTK" клеток и результаты экспериментов.

-252 -209

рМТ2САТ рМТ4САТ

~5~1-ЛПГ | cat

1—I tk | "саГ

pMTSCAT Г^П—Г^Н tk | car

L>-

pTKCAT

TK 1 cat —-qr-

pBL6CAT -

-330 pMTBBCAT tz

-305

рммсАТ -tz

cat

+70

cat

-42

tk. \ саГ

-266

-149

pBECAT

tk | саГ

+1111 +1154 pMT43CAT-Ьт-|-| tk | cat

sv-40|

sv-4U1

bv-4U|

sv-4U|

sv-401-

sv^OI

sv-40!

sv-4Ul-

sv-401-

Степень индукциии CAT дексаметазоном число экспе- ментов

4,7 ± 0,6 10

3,0 ± 0,2 5

9,5 ± 1 ,9 7

0,9 ± 0,1 9

1,1 ± 0,2 7

1 ,6 ± 0,1 11

1 ,5 - 0,1 3

3,2 ± 0,4 3

4,3 ± 0,8 5

=» - положение и ориентация МТдт - сайта связывания ГР из гена MTI мыши ( от -252 до -209 п.н. ); ТК - промотор гена тимидинкиназы вируса герпеса простого CAT - структурная часть гена хлорамфениколацетилтрансферазы; SV-40 - участки ДНК вируса SV-40, ответственные за сплайсинг и полиаденили-рование; •-»- - точка начала транскрипции. В таблице приведены значения коэффициента индукции экспрессии гена CAT под действием дексаметазона и число опытов, проведенных с использованием соответствующей плазмиды. Коэффициент индукции CAT вычисляли как отношение активности CAT в экстрактах трансфе-цированных плазмидами клеток, обработанных дексаметазоном, к активности CAT из клеток, не обработанных дексаметазоном.

ентации данного фрагмента относительно точки начала транскрипции (рМТ4САТ) существенно не влияет на его регуляторную функцию, удвоение же этого фрагмента (рМТ8САТ) приводит к аддитивному увеличению степени индукции экспрессии репортер-ного гена CAT дексаметазоном. Подобными свойствами обладают уже известные элементы глюкокортикоидного ответа (GRE), обнаруженные в ряде глюкокортикоид-зависимых генов и вирусов. Сайт связывания ГР из 3 ' -фланкирущей области гена MTI мыши также обеспечивает регуляцию экспрессии репортерного гена CAT дексаметазоном в 4,3 раза.

Таким образом, выявленные сайты связывания ГР из 5' и 3'-фланкирующих областей гена MTI мыши способны обеспечивать глхкокортикоидную регуляцию экспрессии репортерного гена CAT, находящегося под контролем гетерологичного промотора.

Нами была исследована также способность GRE, обнаруженного в 5 *-фланкирующем районе гена МТГмыпи, обеспечивать глю-кокортикоидную регуляцию в составе собственного промоторного района. С этой целью этот GRE был вырезан из гена МИ мыши в составе BstEII-BglII фрагмента рестрикции длиной 400 п.н. (от -330 до +70 п.н.) в своем естественном нуклеотидном окружении, в которое входят промотор и точка начала транскрипции гена MTI мыши, и встроен в плазмиду рВЬбСАТ непосредственно перед кодирующей частью репортерного гена CAT ( рис.5, плазмида рМТВВСАТ ). Оказалось, что выявленный нами GRE, находясь в составе естественного для него промоторного района, почти полностью теряет способность осуществлять глюкоко-ртикоидную регуляцию экспрессии присоединенного к нему гена CAT. В то же время этот район, содержащий выявленные ранее элементы, ответственные за регуляцию генов ионами тяжелых металлов (МНЕ) [Stuart et.al., 19841,в наших экспериментах обеспечивал индукцию CAT ( в 15 раз ) ионами кадмия, что свидетельствует- о функциональной целостности использованного промотора.

Эти результаты согласуются с ранее опубликованными данными о том, что интактный клонированный ген MTI мыши, содержащий протяженные фланкирующие его участки генома, избирательно перестает отвечать на глюкокортикоиды после его переноса в клетки мыши tSearle et.al.1984]. Резкое ослабление чувствительности к глюкокортикоидам наблюдалось также и при амп-

лификации этого гена в клетках саркомы мыши, вызванной введением в культуру клеток ионов кадмия tMayo et.al.19821. Не обеспечивает глюкокортикоидной регуляции присоединенного репортерного гена тимидинкиназы также и 5'-фланкирующий район гена MTI мыши длиной 1700 п.н. после переноса его в LTK" клетки, в то время как регуляция ионами тяжелых металлов таких конструкций сохранялась [Stuart et.al.19843. Эндогенный же ген этих клеток отвечал 4-6 кратным усилением транскрипции на введение дексаметазона.

Поскольку выявленный нами 5'-GRE в изолированном виде способен обеспечивать глюкокортикоидную регуляцию, а в составе собственного промоторного района ( от -330 до +70 п.н.) - не способен, то можно предположить, что в этом районе содержится некий регуляторный элемент, подавляющий действие этого GRE. Для локализации этого элемента была создана серия делеционных мутантов промоторной области гена MTI мыши (рис. 5). В экспериментах по трансфекции L-клеток мыши полученными плазмидами, содержащими различные фрагменты 5'- фланкирующей области гена MTI мыши, встроенных перед ТК промотором и геном CAT, изучали их способность обеспечивать глюкокортикоидную регуляцию. Результаты экспериментов представлены на рис.5.

Оказалось, что фрагмент от -305 до -42 п.н. ( плазмида рММСАТ ), содержащий 5'-GRE , также как и район от -330 до +70 п.н. ( плазмида pBDCAT ), практически не способен увеличивать экспрессию гена CAT под действием дексаметазона. Однако, более короткий фрагмент от -26G до -149 п.н. ( плазмида рВЕСАТ ) эффективно регулирует экспрессию гена CAT декса-метазоном. На основании полученных результатов можно сделать предположение о том, что в 5'-фланкирующем районе гона MTI мыши от -305 до -266 п.н., либо от -149 до -42 п.н. находится элемент, препятствующий функции выявленного нами GRE. Природа этого элемента не ясна. Возможно, он представляет собой участок связывания белкового фактора, взаимодействие которого с ДНК, по-видимому, мешает действию GRE в экспериментах по трансфекции гена mMTI. В хроматине этот блокирующий элемент, вероятно, оказывается не занятым белковым фактором либо из-за особенностей структурной организации данного района, либо вследствие его метилирования.

С другой стороны, можно предполагать, что в данном районе гена rnMTI отсутствует участок связывания другого вспомогательного регуляторного белка, необходимого для функционирования этого GRE. Так, известно, что одиночный GRE, встроенный перед минимальным -37-ТК промотором ( -37 п.н. от точки начала транскрипции ), сам по себе может осуществлять глюко-кортикоид-зависимую регуляцию такого промотора [Strahle et.al.f988].Одиночный GRE также обеспечивает регуляцию -105-ТК промотора. Однако, будучи встроенным перед промоторной областью гена TAT на расстоянии -351 п.н. от точка начала транскрипции, либо находясь в своем природном месте в промоторе гена ТО на расстоянии -444 п.н. от старта транскрипции, один GRE уже не может обеспечивать глюкокортикоидную индуци-бельность этих промоторов. Показано, что для его функционирования как GRE на таких расстояниях необходим еще один GRE, либо дополнительный сайт связывания другого регуляторного белка ( например, SP1, NF1, СР1, САССС-связывающий белок ) [Danesh et.al.1987].

Выявленный нами GRE из 5'-фланкирующей области гена MTI мыши в изолированном виде также способен сам по себе придавать глюкокортикоидную чувствительность -105-ТК промотору. В плазмидэ рВЕСАТ этот GRE оказывается на расстоянии -191 п.н. от точки начала транскрипции в -105-ТК промоторе. По-видимому, это расстояние еще позволяет одному GRE обеспечивать регуляцию нижележащего промотора. В конструкции же рММСАТ, содержащей GRE, это расстояние становится равным 29G п.н. На таком расстоянии, возможно, GRE уже не способен сам по себе обеспечивать глюкокортикоидную регуляцию. Для этого ему необходим, как и в экспериментах с -351-TAT и -444-Т0 промоторами, дополнительный регуляторный элемент. По-видимому, такого дополнительного элемента, способного "поддержать" функцию GRE, нет в промоторной области гена МИ мыши. Возможно, по этой причине данный GRE не функционирует в составе плазмиды рВВСАТ и в других описанных ранее экспериментах по трансфекции интактного гена с его фланкирующими областями, либо его 5'-области, присоединенной к репортерно-му гену, где он находится на расстоянии -233 п.н. от точки начала транскрипции гена MTI мыши. Мы предполагаем, что в нативном хроматине, где этот ген регулируется глюкокортикои-

дами, дополнительный ("поддерживающий") элемент находится относительно далеко от GRE, но в результате специфической укладки ДНК он оказывается в непосредственной близости и может кооперировать с GRE в обеспечении глжкокортикоидной регуляции гена MTI мыши. Возможно, таким элементом может служить и выявленный нами второй GRE, расположенный в 3'-фланкирующей области этого гена.

Выводы

1) Показано, что первичная структура ДНК в окружении общепринятого консенсуса сайтов связывания глюкокортикоидного рецептора оказывает влияние на эффективность связывания рецептора.

2) Локализован участок специфического связывания глюкокортикоидного рецептора в ближней 5'-фланкирующей области гена цитохрома Р450е крысы, расположенный от -760 до -225 п.н.

3) Показано, что в 5'-фланкирующем районе гена металлотио-неина I мыши на расстоянии от -252 до -209 п.н. вверх от точки начала транскрипции находится сайт специфического связывания глюкокортикоидного рецептора.

4) Выявлен участок специфического связывания глюкокортикоидного рецептора в 3'-фланкирущей области гена металлотио-неина I мыши, расположенный между +924 и- +1239 п.н. относительно точки начала транскрипции.

5) Показано, что выявленные сайты специфического связывания глюкокортикоидного рецептора из 5'- ( от -252 до -209 п.н.) и 3'-фланкирующих областей ( от +1011 до 1054 п.н.) гена металлотионеина I мыши способны обеспечивать глюкокор-тикоидную регуляцию экспрессии репортерного гена CAT, находящегося под контролем гетерологичного промотора.

6) Обнаружено, что выявленный элемент глюкокортикоидного ответа из 5'-фланкирующей области гена металлотионеина I мыши, находясь в составе естественного для него промоторного района,не обеспечивает глюкокортикоидной регуляции репортерного гена CAT.

• СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1) Плисов С.Ю., Соловьёв В.В., Колчанов H.A., Меркулова

Т.Н., Ба- рэнова Л.В., Меркулов В.М."Выявление участков ДНК, специфичных для регу.иторкых районов контролируемых глхжоко-рпшсоидаж генов яетодоя ко.тъктерного анализа". // "Биополимеры и клетка", Т.2, 1986, С.93-101

2) Плисов C.D., Меркулова Т.И., Соловьёв В.В., Колчакса H.A., Салганик Р.И. "Выявление нуклеапипных последовательностей, специфичных для б'-фланхирухщих районов генов, регулируемых глюкокортикоидсит, летодол кошыотернаго анализа". // "Бкхллетень экспериментальной биологии и медицины", .»4,1986, С.466-468.

3) Плнсов С.Ю., Селедцов И.А.б Меркулова Т.Н. "Сойя связывания глхкакортикоид-рецепторных комплексов в 5э-фланкирупщея районе гена жталлотионеиш I яти; влияние нуклеотидных заяен на эффективность связывания рецептора и на экспрессию маркерного гена". // Всесоюзный сиш. "Биохимия рецепторных систем". Тезисы, С.52, 1990, Таллин.

4) Плнсов С.Ю., Меркулова Т.И., Соловьёв В.В., Селедцов И.А., Никулина Е.Б. "Выявление и анализ участков ДНК генов животных и человека, взаияодействухщих с глюкокортжоий-рецетторн&т кожлексави". // IV Всесоюзн. школа-семинар молодых ученых Рига, 1990, Тезисы С.7.

5) Merkulova T.I., Fllsov S.Y., Seledtsov I.A., Solovyov V.V., Nlkulina E.B. "Detection of glucocortIcold-responelve elemente In DNA sequences by novel computer method." // FEBS Abstracts, 20-th Meeting or FEBS, 1990, P.257.

6) Плисов С.Ю., Меркулова Т.Н., Баранова Л.В., Купарев В.П., Меркулов В.М., Кайкина И.И., Соколенко A.A., Салганик Р.И. "Идентификация сайта связывания глюкокоргщоидного рецептора в 5' -флаАкирукщем районе гена жетгхгллотионеина I мы-ш: влияние нуклеотидных заяен на эффективность связывания." // "Молекулярная биология". 1990. Т.24. С.1109-1116.

7) Plloov S.Y., Herkulova T.I..Seledtsov I.A. Glucocortlco-id-receptor binding Bite at the 5*-flanking region oí a rat cytochrome CYP2B2 gene predicted with novel computer method." // BBA, 1991, V.1095, P.114-116.

3) Плисов C.Ö., Меркулова Т.И., Шкапенко А.Л. "Выявление корсятого участка ДНК в гене яеталлотионеина I лвяш, ответственного за глюкокортикоиЗную регуляцию." // Молекулярная биология. 1994. Т.25 (в печати).