Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние физической нагрузки и введения креатина на рецепцию глюкокортикоидов и андрогенов в жировой ткани крыс

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Влияние физической нагрузки и введения креатина на рецепцию глюкокортикоидов и андрогенов в жировой ткани крыс"

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКАЯ ХИМИКО-ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ АКАДЕМИЯ

КОСАРЕВА Ольга Олеговна

ВЛИЯНИЕ ФИЗИЧЕСКОЙ НАГРУЗКИ И ВВЕДЕНИЯ КРЕАТИНА НА РЕЦЕПЦИЮ ГЛЮКОКОРТИКОИДОВ И АНДРОГЕНОВ В ЖИРОВОЙ ТКАНИ КРЫС

Специальность 03.00.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ Диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

На правах рукописи

V

Нь^Щ/-

2 5Д£Кш "

Санкт-Петербург 2000

Работа выполнена в Санкт-Петербургском научно-исследовательском институте физической культуры

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор Рогозкин В.А.

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Михайлов С.С. доктор медицинских наук профессор Галебская Л. В.

Ведущая организация:

Санкт-Петербургский государственный университет

Защита состоится "27" ноября 2000 года в 13 часов на заседании диссертационного Совета К 084.63.01 при Санкт-Петербургской химико-фармацевтической Академии по адресу: 97376, Санкт-Петербург, ул. проф. Попова, 14.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института. Автореферат диссертации разослан ¿^октября 2000 года.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук

Н.В. Кириллова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы. Физические нагрузки сопровождаются многочисленными биохимическими изменениями в организме и существенными эндокринными сдвигами, что обусловлено как специфическими гомеостатическими реакциями, так и активацией механизма общей адаптации [Меньшиков, Волков, 1986; Jeukendrup et al., 1997]. Метаболический эффект гормонов определяется при этом не только их концентрацией в крови, но и чувствительностью организма к гормональному воздействию, что обусловлено, в частности, содержанием в тканях-мишенях гормональных рецепторов, представляющих собой первый молекулярный элемент, который узнает специфический внеклеточный сигнал и посредством селективного связывания затем включает цепь внутриклеточных реакций, на основе которых формируется гормональный ответ. Поскольку по мере развития тренированности происходит ряд адаптационных изменений, касающихся механизмов регуляции обмена веществ, вопрос об изменении тканевой рецепции гормонов под влиянием систематических физических нагрузок является вполне закономерным и традиционно исследовался в секторе биохимии СПб НИИФК [Фельдкорен и соавт., 1995].

Важную роль в адаптации к физическим нагрузкам играют стероидные гормоны, сфера влияния которых охватывает практически все функции организма, в том числе и регуляцию жирового обмена. Стероидные гормоны оказывают влияние на метаболизм жировой ткани и характер её распределения. Известно их липолитическое действие при физических нагрузках [Bjomtorp, 1996]. Представления о жировой ткани как о метаболически инертной претерпели за последние годы значительные изменения [Pond, 1999], поэтому особый интерес представляет изучение механизмов, посредством которых жировые клетки реагируют на гормональные воздействия. В жировой ткани человека и животных идентифицированы рецепторы глкжокортикоидов (РГ) и андрогенов (PA) [Siergen et al., 1995; Dieudonne et al., 1998]. В настоящее время известна корреляция между плотностью рецепторов стероидных гормонов и аккумуляцией триглицеридов в жировой ткани [Ottosson et al„ 1995]. Механизмы, посредством которых осуществляется липолитическое действие стероидов, продолжают изучаться, при этом данные о влиянии физических нагрузок на плотность их рецепторов в жировой ткани в литературе

отсутствуют. В связи с происходящими адаптационными изменениями, касающимися механизмов регуляции обмена веществ, исследование влияния физических нагрузок аэробного характера на процессы связывания глюкокортикоидов и андрогенов в цитозолях жировой ткани представляется актуальным и вносит вклад в изучение механизмов гормональной регуляции процессов мобилизации лшщдных источников энергообеспечения мышечной деятельности.

Цель исследования. Цель настоящего исследования состояла в изучении влияния физических нагрузок и введения креатина на процессы связывания глюкокортикоидов и андрогенов в жировой ткани крыс. Задачи исследования:

1.Разработать радиолигаядный метод определения РГ в цитозолях жировой ткани.

2.0пределить специфинность и основные характеристики связывания глюкокортикоидов в жировой ткани.

3.Изучить влияние однократной и систематической мышечной деятельности аэробного характера на процессы связывания глюкокортикоидов и андрогенов в цитозолях жировой ткани.

4 .Исследовать влияние приёма креатина в период систематических физических нагрузок на процессы связывания глюкокортикоидов в жировой ткани. Научная новизна и практическая значимость исследования. Выполненная работа имеет экспериментальный характер и позволяет судить об особенностях регуляции процессов специфического связывания стероидных гормонов в жировой ткани.

В результате проведённого эксперимента с введением кортикостерона получено представление о протекании рецепторного цикла глюкокортикоидов в подкожной жировой ткани.

Впервые показана реакция рецепторного аппарата стероидных гормонов на однократную физическую нагрузку.

Показаны изменения специфического связывания глюкокортикоидов и андрогенов под влиянием систематической физической нагрузки аэробного характера, позволяющие говорить об их адаптивном характере и зависимости от особенностей метаболизма жировой ткани.

Впервые показано влияние дополнительного приёма креатина в период систематических физических нагрузок аэробного характера на процессы связывания глюкокортикоидов, которые можно рассматривать как адаптивные изменения, направленные на рациональное и эффективное использование энергетических резервов организма.

Положения выносимые па защиту. 1. Определяемое с помощью разработанного нами метода связывание 3Н-Д в цитозоле подкожной жировой ткани имеет рецепторный характер с одним типом связывающих мест и характеризуется высокой специфичностью. Изучение кинетических характеристик связывания 3Н-Д с РГ свидетельствует о высокой стабильности образующихся гормон-рецепторнх комплексов.

2. Повышение концентрации кортикостерона в крови, как экзогенное, вызванное инъекцией гормона, так и эндогенное, обусловленное влиянием однократной физической нагрузки, приводит к изменениям специфического связывания глюкокортикоидов в цитозолях жировой ткани, происходящими в противофазе с изменениями в крови концентраций кортикостерона.

3. Однократная физическая нагрузка вызывает фазовые изменения концентрации РА в цитозолях жировой ткани.

4. Систематическая физическая нагрузка аэробного характера вызывает изменения специфического связывания глюкокортикоидов и андрогенов в цитозолях жировой ткани, которые свидетельствуют об адаптивных изменениях, обусловленные особенностями метаболизма жировой ткани.

5. Приём креатина в период систематических физических нагрузок аэробного характера оказывает влияние на процессы связывания глюкокортикоидов в подкожной жировой ткани.

Аппробация работы. Материалы диссертации были представлены на ежегодных отчётных научных конференциях НИИФК (1998г, 1999г, 2000г), 4 и 5 конгрессах Европейского Колледжа Спортивных Наук (Италия, 1999; Финляндия, 2000).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 7 научных работ в отечественной и зарубежной печати.

Структура и объём диссертации. Диссертация изложена на 110 страницах, содержит 10 таблиц и 15 рисунков. Она состоит из введения, обзора

литературы, методов исследования, результатов и их обсуждения, выводов. Список использованной литературы включает 224 наименования, в том числе 208 на английском языке.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ. Постановка экспериментов на животных. Исследования проводили ка половозрелых беспородных белых крысах-самцах массой 250-350г, полученных из питомника РАМН "Рапполово" и содержавшихся в условиях СПбНИИФК на стандартном лабораторном рационе (А) [Неменова и соавт., 1968] или высокоуглеводном рационе (В) (углеводы 70%, жиры 12%, белки 18%) в зависимости от поставленных задач. В каждой серии опытов экспериментальные и контрольные группы насчитывали по 5-10 крыс. Всего в экспериментах было задействовано около 150 животных. Контрольные группы были представлены животными, находившимися в условиях обычного двигательного режима. Животные экспериментальных групп подвергались функциональным воздействиям однократных или систематических физических нагрузок, представленных плаванием в воде оптимальной температуры 30-32°С, или получали шпралеритонеально инъекцию кортикостерона (1мг/100г веса в 100 мкл диметилсульфоксида (ДМСО)). Однократная физическая нагрузка была представлена плаванием животных в течение 1ч. Моделью систематической физической нагрузки явилось плавание с грузом, составлявшим 4% от массы тела, с постепенным увеличением длительности работы на 2 мин ежедневно, начиная с 4 мин в первый день до 40 мин в конце месячного тренировочного цикла. Однократное и тренировочное воздействия имели выраженную аэробную направленность [Ленкова, Усик, 1981].

Животные, подвергавшиеся систематическим физическим нагрузкам аэробного характера, в зависимости от поставленных задач были разделены на б групп, две из которых на протяжении всего времени тренировок сразу после плавания получали дополнительно через зонд креатин (25мг/кг веса) в 6% растворе глюкозы (табл. 1).

Животных экспериментальных групп исследовали в состоянии относительного покоя после однократной физической нагрузки, через 6 и 48ч отдыха и в случае систематической физической нагрузки через 48ч после последней тренировки.

Животные, подвергавшиеся фармакологическому воздействию, исследовались через 1,2, 4, 8 и 24ч после инъекции кортикостерона.

Таблица 1.

Использованные в эксперименте с систематической физической нагрузкой группы животных

Вид рациона Контрольные группы (1) Экспериментальные группы

Тренировка(2) Тренировка + креатин (3)

стандартный (А) 1А 2А ЗА

углеводный (В) 1В 2В ЗВ

Метод определения специфического связывания андрогенов в глюкокортнкоидов с рецепторами в цитозолях жировой ткани. Специфическое связывание андрогенов (глюкокортнкоидов) определяли in vitro радиолигандным методом [Розен, 1981] с использованием [1,2,6,7-3Н]-Тестостерона (3Н-Т) (уд. активность 3050ТБк/моль, фирма "Изотоп", Россия) или [1,2,4,6,7-3Н]-Дексаметазона (3Н-Д) (уд. активность 1300 ТБк/моль фирма "Изотоп", Россия) в качестве лиганда в цитозолях подкожной и этшдидимиальной жировой ткани. Цитозоли были получены центрифугированием гомогената (ткань/Трис-буфер (рН 7,4 с добавлением активированного декстранопокрытого угля (АУ)) в соотношении 1/1) с последующим удалением липидного слоя. Белок-связанную и свободную фракции разделяли методом сорбции радиоактивного лиганда 4% АУ. Подсчёт радиоактивности осуществляли на сцинтилляционном счётчике Магк-3 (США). Количество рецепторов рассчитывали в фмолях на мг белка (фмоль/мг). Методы определения характеристик связывания 3Н-Д с рецепторами глюкокортнкоидов. Равновесная константа диссоциации Kd и максимальное количество доступных специфических связывающих мест - Вгаах. были определены по результатам связывания лиганда в различных концентрациях (0.21-17.3нМ) с рецепторами в равновесных условиях и вычислялись по методу Скетчарда, позволяющему математически описать закономерности

взаимодействия больших белковых молекул со значительно меньшими по размеру молекулами стероидов в условиях равновесия системы [Scatchard, 1949]. Для характеристики специфичности связывания рецептор-3Н-Д исследовали коргикостерон, альдостерон, тестостерон, прогестерон и эстрадиол (Sigma) в качестве конкурентов. Анализ экспериментальных данных проводили согласно традиционно применяемому методу [Dahlberg, 1981]. Метод определения концентрации белка. В цитозолях жировой ткани определяли содержание белка колориметрическим методом, основанным на взаимодействии белка с красителем Кумасси G-250 [Bradford,* 1976]. Метод определения концентрации тестостерона и кортикостерона в сыворотке крови. Концентрацию тестостерона и кортикостерона в сыворотках крови измеряли методом радионммуиоопре деления (РИО) с применением 3Н-Т, 3Н-Кортикостерона (3Н-К) (3040 ТБК/моль) и антисывороток [Морозов и соавт., 1988].

Статистическую обработку экспериментальных данных проводили, используя критерий Стьюдента. Различия считались достоверными при уровне вероятности р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЯ 1. Разработка метода определения рецепторов глюкокортикоидов в

жировой ткани. Радиолигандные методы определения рецепторов основаны на

использовании их специфической связывающей способности в сочетании с

радиоизотопной индикацией лиганда. Наиболее важными моментами в

процедуре определения специфического рецепторного связывания с помощью

меченых радиоактивных стероидов являются выбор гормона-лигавда и способа

разделения образовавшихся гормон-рецепторных комплексов и несвязавшегося

лиганда. Стероид, используемый в исследованиях в качестве лиганда, должен с

высокой аффинностью и специфичностью связываться с рецепторными

белками; не подвергаться метаболизму в биопрепаратах из данной ткани; не

связываться с транспортными белками крови [Розен, 1981]. Этим условиям

удовлетворяют синтетические глюкокортикоиды, и в частности дексаметазон

[Akner 1993].

В связи с тем, что разделение белок-связанного и свободного радиоактивного лиганда является одним из важных моментов, влияющих на точность измерения

количества рецепторов в пробах цитозоля, была поставлена серия экспериментов, целью которых явилось сравнение методов разделения белок-связанной и свободной фракции 3Н-Д с помощью колоночпой гелеэксклюзионной хроматографии (разделение на колонках с сефадексом LH-20 проводилось в соответствии с общепринятыми правилами [Мшсеш, 1982]) и сорбции свободного 3Н-лиганда АУ, показавшее преимущество последнего. Было определено оптимальное время обработки АУ.

Количество цитоплазматнческих и ядерных рецепторов и их соотношение в клетках-мишенях зависит от гормонального статуса, особенно сильно по гомологичным гормона«. Наши задачи подразумевали оценку количественных изменений связывания глюкокортикоидов в жировой ткани, происходящих при физических нагрузках, поэтому требовался метод дая определения концентрации рецепторов в цитозолях интактных животных. На основе анализа различных методических подходов, позволяющих создать оптимальные условия для определения рецепторного связывания стероидных гормонов, нами был предложен новый методический приём, позволяющий определять этот процесс в жировой ткани негормондефицитных животных. Этот методический подход включал освобождение цитозоля от эндогенного лиганда с помощью добавления АУ в процессе приготовления гомогената ткани [Fishman, 1983; Gorlich et al., 1983]., стабилизацию РГ молибдатом натрия, глицерином и ДТТ [Wright et al., 1981; Kalimi, Hubbard, 1983; Korge, Timpmann, 1983], инкубацию в течение 16 ч при 0°С и последующее разделение гормон-связанного и свободного 3Н-Д с помощью обработки цитозолей в течение 20 мин АУ. Применение этого методического приёма позволило количественно определять концентрации рецепторов глюкокортикоидов в цитозолях жировой ткали интактных крыс, в том числе и в условиях выполнения ими однократной и систематической мышечной деятельности.

2. Общие свойства рецепторов глюкокортикоидов в цитозоле подкожной жировой ткани крыс. Подходящие под определение рецепторов белки должны удовлетворять следующим критериям [Рогозины, 1988; Akner, 1993]: -связывание должно быть специфично;

^связывание должно характеризоваться высокий аффинностью, ограниченной ёмкостью, насыщаемостью, обратимостью;

-посредством рецептора должен осуществляться биологический эффект лиганда.

Исследование общих характеристик определяемого разработанным методом связывания 3Н-Д в цигозоле подкожной жировой ткани позволяет сделать вывод о его рецепторном характере. Был показан насыщающий характер связывания 3Н-Д в цитозоле подкожной жировой ткани в равновесных условиях (рис.1).

- общее (тотальное) севьегние

-следфнеское

• -8- - -неспа+фнеское

5 10 15

Кснцантра^« »«военного ЗНДнМ

Вис Л, Кривые насыщения для связывания 3Н-Д с редакторами глюкокортикоидов в равновесных условиях

Каждая точка представляет собой результат 9-12 параллельных измерений

Анализ в координатах Скетчарда (рис. 2) позволяет говорить о наличии одного типа связывающих мест. РГ характеризуются ёмкостью Втах - 62,5 фмоль/мг белка; их аффинность определяется константой К<( - 4,1нМ. Анализ специфичности связывания (рис. 3) показал, что среди исследованных стероидов наиболее сильным конкурентом к связыванию рецептор-дексаметазон являлся кортикостерон. Если принять его аффинность за 100%, то относительная конкурентоспособность прогестерона, альдостерона и эстрадиола составляет 60%, 34.7% и 3.3%, соответственно. Тестостерон при исследованных концентрациях не конкурировал за связывающие места с дексаметазоном.

Полученные данные об основных характеристиках рецепторов глюкокортикоидов в подкожной жировой ткани и данные о конкурентоспособности различных стероидов к связыванию рецептор-

дексаыетазон согласуются с имеющимися литературными данными о свойствах рецепторов этих гормонов в других жировых депо [Feldman, Loose, 1977; Pedersen et al., 1994] и, таким образом, не противоречат положению об идентичности РГ в разных тканях-мишенях [Feldman, et al., 1978].

а

Q, 15 0,16 0.14 0,12 0.1 0,03 0,03 0,04 0,02 0

sz

—Кз=4,1кЯ-

—г&я*т 62.5 ф*опьА.г бэпа—

10 20 30 40 50 60 70

В. вмэпАгбегез

Рис. 2. График Скетчарда для связывания рецептор-Н-Д

Каждая точка представляет собой результат 9-12 параллельных измерений

120

Рис. 3. Конкурентоспособность различных стероидов по отношенио к связыванию рецептор-3Н-Дексаметазон: 1 - тестостерон; 2 - эстрадиол; 3 -альдостерон; 4 - прогестерон; 5 -кортикостерон

Каждая точка представляет собой результат 9-12 параллельных измерений

3. Связывания 3Н-Дексаметазона с рецепторами после введения кортикостероиа. Изучение распределения рецепторов после однократного введения гормона является наиболее распространённым методическим подходом при анализе рецепторного цикла. Результаты эксперимента по исследованию влияния однократного введения кортикостероиа на связывание 3Н-Д с РГ в цитозоле подкожной жировой ткани представлены на рис. 4. Сопоставление данных об изменениях концентрации кортикостероиа в крови (рис. 5) после его инъекции животным и концентрации РГ в цитозолях жировой ткани указывает на гуморальную регуляцию специфического связывания глюкокортикоидов.

5 200 ................... ................................. ......

с по —-----—>-г-'--

О

0 160 .........................^--. 1 .■ ■ Т.. 1 •-■■ ■ V

CÍ 140 Ь———. -.¡Чч----i— |, --------------,-

0 .- . , ....... , .. ... . |.„.

контроль 1ч 2ч 4ч 8ч 24ч

время после инъекции

Рис. 4. Связывание 3Н-Д в цитозоле подкожной жировой ткани крыс после введения кортикостероиа; различия по отношению к контролю достоверны; -*р<0.001; **р<0,05

Каждая точка представляет собой результат усреднения величин связывания у 5-7 животных (3 параллельные измерения для каждого значения).

Отмеченные после введения кортикостероиа циклические изменения

концентрации РГ, происходили в противофазе с изменениями содержания

кортикостероиа в крови, что объясняется наличием замкнутого внутриклеточного рецепторного цикла [Рогозкин, 1988].

I 1000

£ 800 I

§_ 600 о

§ 400 200 О

• -

$

контроль

1ч

2ч

4ч 8ч 24ч

время после инъекции

Рис. 5. Содержание К в сыворотках крови крыс после интраперитонеального введения в дозе 1мг на ЮОг массы тела; * - различия по отношению к контролю достоверны (р<0.01).

Каждая точка представляет собой результат усреднения величин связывания у 5-7 животных (3 параллельные измерения для каждого значения).

4. Влияние физической нагрузки на связывание глюкокортикоидов и андрогенов в цитозолях подкожной и эпидидимиальной жировой ткани

Однократная физическая нагрузка вызывала фазовые изменения специфического связывания глюкокортикоидов (рис. б) и андрогенов (рис. 7) в цитозолях жировой ткани. Под влиянием однократной физической нагрузки, представляющей собой стрессовое воздействие, происходило достоверное (р^0,05) эндогенное повышение уровня кортикостерона в крови. Согласно полученным данным, изменения специфического связывания 3Н-Д в цитозолях подкожной и эпидидимиальной жировой ткани происходили в противофазе с изменениями в крови концентрации кортикостерона. Такая динамика согласуется с представлениями о существовании рецепторного цикла и объясняется, согласно принятой для глюкокортикоидов модели действия [Акпег, 1993], увеличением при повышении в крови уровней гормона образования гормон-рецепторных комплексов и транслокацией их в ядро. В рамках представлений о ядерной локализации рецепторов можно говорить об

активации гормонтрецертсрньи *рмплексов и более прочном взаимодействии со специфическими ядерньши структурами.

1

во

: 3 70 г

•в- 60 сс

X

50 •10

£ зо

та

т

3 20 со

8 10 о

!

• * X

V* у

у

¿•V 1 - 1

□ связывание ЗН-Д в цитозолях подкожного жира

□ связывание ЗН-Д в цитозолях жира эпидидимиса

контроль после отдых 6ч отдых 48ч

нагрузки условия эксперимента

Рис. 6. Садзывание в цихозолях прдаожнрй и эпидшшмяальнрй жировой ткани крыс после однократной физической нагрузки; * - различия по отношению к контролю достоверны (р<0.001) Каждая точка представляет собой результат усреднения величин связывания у 5-7 животных (3 параллельные измерения для каждого значения).

I- 35 3

1 30 о

I25

Ь" 20

X со

О 15 £

8 10

2

п г

К 5

1

сО-СО

□ связывание ЗН-Т в цитоэоле подкожного жира

□ связывание ЗН-Т в цитозоле жира эпидидимиса

контроль после отдых 6ч отдых48ч нагрузки

условия эксперимента

Вис. 7, Влияние однократной физической нагрузки на связывание 3Н-Т в цитозолях подкожной и элидидимиальной жировой ткани крыс; *- различия по отношению к контролю достоверны (р<0,001). Каждая точка представляет собой результат усреднения величин связывания у 5-7 животных (3 параллельные измерения для каждого значения).

Колебания концентрации тестостерона в крови животных, вызванные однократной физической нагрузкой, не были статистически значимыми и происходили в пределах от 0,8±0,2 до 1,2±0,3 нг/мл. Наши результаты согласуются с существующими экспериментальные данными, показавшими, что в отличии от физических нагрузок высокой интенсивности, вызывающими фазовые изменения содержания тестостерона в крови [Tchaikovsky et al., 1986; Осипова, 1990], длительные аэробные нагрузки не приводят к существенным изменениям концентрации гормона [Гольберг, 1998; Турханова, 1998]. Непосредственно после нагрузки наблюдалась тенденция к повышению концентрации тестостерона в крови, что могло явиться результатом её стрессового воздействия. Известно, что увеличение концентрации гормона в это время обусловлено усилением продукции катехоламинов, которые стимулируют секрецию тестостерона гонадами [Eik-Nes, 1969; Jezova, Vigas, 1981], или АКТГ, который стимулирует секрецию андрогенов семенниками [Гончаров, Кация, 1986]. Несмотря на отсутствие выраженной динамики изменений концентрации тестостерона в крови после однократной физической нагрузки, наши данные о достоверных изменениях связывания 3Н-Т в цитозолях жировой ткани после физической нагрузки свидетельствуют, вероятно, о высокой чувствительности жировой ткани к тестостерону.

Эффект тренированности распространяется на чувствительность организма к гормонам, в том числе и регулирующим активность липаз в жировой ткани. В связи с этим, важным моментом при изучении функционирования рецепторного аппарата глюкокоргикоидов и андрогенов, которые, как известно, способстуют при физических нагрузках протеканию липолиза, является исследование влияния адаптация к тренировочным нагрузкам аэробного характера на процессы связывания в жировой ткани.

При исследовании влияния систематической физической нагрузки аэробного характера на рецепцию глюкокортикоидов не было обнаружено достоверных различий между тренированными и контрольными животными в уровнях цитозольного связывания 3Н-Д в эпидидимиальном жире (связывание составило 60,7±3,6 фмоль/мг). В цитозоле подкожной жировой ткани крыс было отмечено достоверное (р<0,001) снижение концентрации РГ у тренированных животных на 59%.

l

Систематическая физияеска? нагрузка аэробного характера приводила к достоверному (р<0,001) снижению связывания 3Н-Т в цитозолях подкожного и эпидидимиального жира на 36,5% и 69,8%, соответственно. По нашему мнению, снижение рецепторного связывания 3Н-Д в цитозоле подкожной жировой ткани у тренированных животных нельзя объяснить лишь различиями в уровнях циркулирующего в крови кортикостерона, так как эпидидимиальная жаровая ткань не отвечала на систематическую физическую нагрузку изменениями цитозольного связывания глюкокортикоидов. Этот экспериментальный факт даёт, вероятно, основания рассматривать вызванные влиянием тренировки изменения специфического связывания стероидных гормонов в цитозолях жировой ткани животных как адаптивные изменения, обусловленные функциональными особенностями метаболизма жировой ткани и происходящие на уровне транскрипции гена. Можно предположить, что подкожная жировая ткань является жировым депо, принимающим непосредственное участие в энергообеспечении физических нагрузок, и адаптивные изменения специфического связывания глюкокортикоидов и андрогенов под влиянием систематических физических нагрузок аэробного характера в цитозолях этой ткани касаются изменений механизмов гормональной регуляции процессов мобилизации липидных источников эрергробеспеченщ.

5. Влияние приёма креатина после систематических физических нагрузок аэробного характера на процессы связывание глюкокортикоидов в жировой ткани. Данные относительно влияния приёма креатина на эффективность выполнения аэробных упражнений противоречивы. В настоящее время высказывается три возможных причины, которые теоретически могли бы привести к повышению эффективности выполнения упражнений аэробного характера при дополнительном приёме креатина: существование "креатин-креатинфосфатного мостика" [Bessman, Geiger, 1981; Walliman, 1992], который может играть роль при аэробных упражнениях, повышая скорость транспорта энергии от митохоццриальных центров окисления к миофибриллам [Juhn, Taxnopolsky, 1998]; увеличение аэробной буферной способности мышц за счёт повышения активности цитрат-синтазы [Brannon et al., 1997]; увеличение анаэробной буферной способности мышц [Brannon et al., 1997], оказывающей положительное влияние на выполнение существующих в реальных условиях

при любой аэробной работе коротких участков, включающих алактатные механизмы энергообеспечения [Engelhardt et al., 1998].

Мы предположили, что участие в энергетическом метаболизме креатина может повлиять на процессы, затрагивающие активацию гипофизарно-адренокортикальной системы, что может отразиться на связывании глюкокортикоидов в жировой ткани. В связи с тем, что существуют данные об увеличении транспорта креатина в мышцы при употреблении его с глюкозой и простыми углеводами [Green et al., 1996], мы рассматривали влияние приёма креатина на специфическое связывание 3Н-Д в жировой ткани на фоне стандартного лабораторного и высокоуглеводного рационов. Данные эксперимента, представленные в табл. 2, свидетельствуют о достоверных различиях (р<0,001) специфического связывания 3Н-Д в цитозолях жировой ткани животных, получавших креатин в период систематических физических нагрузок, и животных, тренировавшихся в том же режиме без дополнительного его приёма. Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о влиянии креатина на специфическое связывание глюкокортикоидов в цитозоле подкожной жировой ткани при систематической физической нагрузке аэробного характера, которое было более ярко выражено на фоне углеводного рациона.

Таблица 2.

Связывание глюкокортикоидов в цитозолях подкожной жировой ткани при тренировке и дополнительном к ней приёме креатина

Группа животных Связывание 3Н-Д, фмоль/мг

1 2 3

Стандартный рацион (А) 65,2±2,0 26,7+5,2* 60,4±5,1°

Углеводный рацион (В) 73.0±1.3 53.4±3.6* 98.5±2*°

*- различия по отношению к контролю достоверны (р<0,001). ° - различия по отношению к группе 2 достоверны (р<0,001). Средние значения и стандартные ошибки представляют собой результат измерений величин связывания у 5-7 животных (3 параллельных измерения дня каждой величины)

В таблице 3 представлены результаты измерений концентрации кортикостерона в крови через 48ч после последнего тренировочного воздействия.

Таблица 3.

Концентрация кортикостерона в крови после тренировки и дополнительном к ней приёме креатина

Концентрация кортикостерона, нг/мл

Группа животных 1 2 3

Стандартный рацион (А) 109,2±32,1 87,4±14,2 60,5±8,1

Углеводный рацион (В) 156,5±24,0 114,9+11,7 57,4119,12*°

*- различия по отношению к контролю достоверны (р<0,05); 0 - различия по отношению к группе 2 достоверны (р<0,05). Средние значения и стандартные ошибки представляют собой результат измерений концентраций кортикостерона у 5-7 животных (3 параллельных измерения для каждой величины)

Исходя из нашей гипотезы и на основании полученных данных относительно концентраций кортикостерона через 48ч после последней тренировочной нагрузки, можно предположить, что увеличение специфического связывания гяюкокортикоидов в цитозоле жировой ткани при дополнительном приёме креатина в период систематических физических нагрузок аэробного характера явилось результатом меньшей активации гипофизарно-адренокортикальной системы. Также не исключена возможность, что это изменение специфического связывания глюкокортикоидов говорит о направленности вызываемых тренировкой адаптивных изменений на рациональное и эффективное использование энергетических резервов организма.

Заканчивая обсуждения полученных результатов следует отметить, что главный итог работы позволяет рассматривать процессы метаболизма жировой ткани с активным участием гормонального звена внутриклеточной регуляции, включающего глюкокортикоиды и андрогены. Изменения метаболизма в процессе выполнения физических нагрузок наряду с непосредственно рабочим органом, скелетными мышцами, происходят и в таких "метаболически

инертных тканях" как подкожная жировая ткань, что и показано в наших исследованиях на примере изменения связывания глюкокортихоидов и андрогенов. В целом представленные материалы расширяют наши знания о механизмах гормональной регуляции метаболизма в жировой ткани в обычных условиях и в период повышенной двигательной активности.

ВЫВОДЫ

1. Разработан метод определения рецепторов глюкокортикоидов в цитозоле жировой ткани, основанный на использовании их специфической связывающей способности в сочетании с радиоизотопной индикацией лиганда.

2. Определены основные характеристики связывания 3Н-Д в цитозоле подкожной жировой ткани (Ка 4,1нМ и Впах 62,5 фмоль/мг белка) и установлена его высокая специфичность. По этим критериям связывание глюкокортикоидов имеет рецепторный характер с одним типом связывающих мест.

3. Однократное введение животным коргикостерона (1мг/100г веса) вызывало циклические изменения уровня специфического связывания 3Н-Д в цитозоле подкожной жировой ткани, происходящие в противофазе с изменениями концентраций кортикостерона в крови. Минимальные концентрации рецепторов глюкокортикоидов наблюдались через 1 час после инъекции, максимальные, в 3 раза превышающие контрольные величины, были зафиксированы через 8 часов.

4. Однократная физическая нагрузка сопровождалась фазовыми изменениями специфического связывания 3Н-Д и 3Н-Т в цитозолях подкожной и эпидидимиальной жировой ткани.

5. Систематическая физическая нагрузка аэробного характера вызывала снижение специфического связывания андрогенов в цитозолях подкожной и эпидидимиальной жировой ткани.

6. Систематическая физическая нагрузка аэробного характера не вызывала изменений специфического связывания глюкокортикоидов в цитозоле жировой ткани эпидидимиса, но приводила к снижению их рецепции в цитозоле подкожной жировой ткани.

7. "" Введение животным креатина в период систематических физических нагрузок аэробного характера привело к увеличению уровня специфического

связывания глюкокортикоидов в цитозоле подкожной жировой ткани, что в большей степени проявлялось на фоне углеводной диеты.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Косарева О.О., Байкова С.В., Гольберг Н.Д., Пшендин А.И., Фельдкорен Б.И. Влияние физических нагрузок на рецепцию андрогенов и глюкокортикоидов в жировой ткани// Материалы итоговой научной конференции.-СПб, 1998.-c.22-23.

2. Косарева О.О. Влияние физической нагрузки аэробного характера на рецепцию глюкокортикоидов в жировой ткать1/ Материалы итоговой научной конференции.-СПб, 1999.-С.45-46.

3. Косарева О.О., Фельдкорен Б.И. Изучение рецепции глюкокортикоидов в жировой ткани// Сб. Актуальные вопросы клиники и лечения.-СПб, 1999.-c.454-456.

4. Пшеадин А.И., Байкова С,К., Грльберг Н.Д., Косарева Q.Q., Турхавдиа Д.В. Рецепция стероидных гормонов в органах-мишенях и регуляция пластического обмена в скелетных мышцах при адаптации к физическим нагрузкам различного характераН Материалы итоговой научной конференции.-СПб, 1999.-C.39-40.

5. Kosareva 0.0. Effect of physical exercise on the cytosolic androgen and glucocorticoid binding in adipose tissue// Abstr. 4th Annual Congress of the European College of Sport Science.-Rome, 1999.-p.330.

6. Kosareva O. Effect of physical training and additional creatine supplementation on glucocorticoid binding in adipose tissue// Abstr. 5th Annual Congress of the European College of Sport Science.-Jyvaskyla, 2000.-p.411.

7. Golberg N., Kosareva O., Feldkoren В., Rogozkin V. Effect of physical exercise on the cytosolic androgen and glucocorticoid binding in target tissues// Abstr. 5® Annual Congress of the European College of Sport Science.-Jyvaskyla, 2000.-p.288.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Косарева, Ольга Олеговна

Принятые сокращения

Введение

1. Обзор литературы

1.1 Понятие о рецепторе. Общие представления о структуре и свойствах рецепторов стероидных гормонов.

1.2 Общие представления о механизмах действия стероидных гормонов и рецепторнои цикле

1.3 Функционирование рецепторного аппарата стероидных гормонов

1.4 Методы изучения рецепторов стероидных гормонов

1.5 Рецепторы глюкокортикоидов, их общие свойства и структура. Механизмы действия рецепторных комплексов.

1.6 Рецепторы андрогенов

1.7 Влияние стероидных гормонов на метаболизм жировой ткани

1.8 Метаболизм жировой ткани при физических упражнениях

2. Материалы и методы исследования

2.1 Постановка экспериментов на животных 46 2.1.1 Методика проведения физических нагрузок

2.1.2. Методика постановки эксперимента по изучению влияния дополнительного введения кортикостерона

2.2 Препаративные методы

2.2.1 Получение цитозоля жировой ткани

2.2.2 Получение сыворотки крови

2.2.3. Подготовка колонок с сефадексом

2.3 Аналитические методы

2.3.1 Определение связывания андрогенов и глюкокортикоидов с рецепторами в цитозолях жировой ткани

2.3.2 Определение конкурентоспособности стероидов к связыванию рецептор-1Н-Д в цитозоле подкожной жировой ткани

2.3.3 Определение константы скорости диссоциации комплекса Н-Д-рецептор

2.3.4 Определение концентрации белка в цитозоле жировой ткани

2.3.5 Определение концентрации тестостерона и кортикостерона в сыворотке крови 52 2.4. Математические методы

2.4.1 Вычисление К а и В1пах для связывание глюкокортикоидов с рецепторами в цитозоле подкожной жировой ткани

2.4.2 Вычисление константы скорости диссоциации комплексов" Н-Д-рецептор

2.4.3 Статистическая обработка данных 54 3.Результаты исследования

3.1 Разработка метода определения рецепторов глюкокортикоидов в цитозолях жировой ткани

3.2.Общие свойства рецепторов глюкокортикоидов в цитозоле подкожной жировой ткани крыс

3.2.1 Основные характеристики связывающей способности и специфичности связывания рецептор-дексаметазон

3 0 О т-ти ат т* ирр тгт * а тз'эатдлт г\ ттаттг^ттз тла 1-Г ГТ с

IV X XX ХЧ/Ч/ХХХХ^ /\upuiv X V * 1. V X X11V.I1 X X. X V рецепторами

3.3 Динамика связывания Н-Д с рецепторами после введения кортикостерона

3.4 Влияние однократной физической нагрузки на связывание

Н-ТТ т* ттитО'З^ттау гтг\тттгг\"щ"тттд тл ^пмттипт«пт,ипн мгнппкптл ть'^нтд (\Н ^ Х> 1ДХХ X ч/^ ХЛ X. V л X * Щ. «IV! А 1X Я X Ж 11ЧЖX X* 1 X \/Х X У1\11р иг^Ъи X V/ I

3.5 Влияние систематической физической нагрузки аэробного

С1 р СХIV X V р С* ни ^Х^УХч^ХЛ ишш V XX и ЦП 1 1\иии у

3.6 Влияние систематической физической нагрузки с дополнительным введением креатина на связывание 'Н-Д в цитозоле подкожной жировой ткани

3.7 Влияние однократной физической нагрузки на связывание

3Н-Т в цитозолях жировой ткани

3.8 Влияние систематической физической нагрузки аэробного характера на связывание Н-Т в цитозолях жировй ткани 77 4.Обсуждение результатов 80 Выводы 87 Список литературы

Введение Диссертация по биологии, на тему "Влияние физической нагрузки и введения креатина на рецепцию глюкокортикоидов и андрогенов в жировой ткани крыс"

Актуальность темы.

Физические нагрузки сопровождаются многочисленными биохимическими изменениями в организме и существенными эндокринными сдвигами. Метаболический эффект гормонов при этом определяется не только их концентрацией в крови, но и чувствительностью организма к гормональному воздействию, что определяется, в частности, содержанием в тканях-мишенях медиаторов гормональных сигналов - специфических гормональных рецепторов. Поскольку по мере развития тренированности происходит ряд адаптационных изменений, касающихся механизмов регуляции обмена веществ, вопрос об изменении тканевой рецепции гормонов под влиянием тренировки является вполне закономерным и традиционно исследовался в секторе биохимии СПб НИИФК [Фельдкорен и соавт., 1995].

При энергообеспечении физических нагрузок важную роль играют липидные источники, возможности мобилизации и утилизации которых находятся под гормональным контролем. Хорошо известно, что при адаптации к систематической мышечной деятельности возрастают возможности к использованию липидов [Henriksson, 1995]. Другим, не менее важным, звеном в формировании адаптации является возможность мобилизации липидных источников энергообеспечения [Jenkendrup et al., 1997; Hawley et al., 1999]. В связи с тем, что представления о жировой ткани как о метаболически инертной претерпели за последние годы значительные изменения [Pond, 1999], актуальным представляется изучение механизмов, посредством которых жировые клетки реагируют на гормональные воздействия, связанные с регуляцией липолиза.

Большую роль в адаптации к физическим нагрузкам играют стероидные гормоны, сфера влияния которых охватывает практически все функции организма. Стероиды участвуют в регуляции жирового обмена, отвечают за распределение жировой ткани, которое различно у мужчин и женщин, меняется с возрастом и сопровождает различные гормональные нарушения [Bjomtorp, 1996]. Наличие в жировой ткани человека и животных рецепторов глюкокортикоидов (РГ) [Rebuffe-Scrive et al., 1990ь] и андрогенов (PA) [Sjögren et al., 1995; Dieudonne et al., 1998] и известное липолитическое действие этих стероидных гормонов при физических нагрузках послужили предпосылками настоящего исследования. Рабочей гипотезой явилось предположение, что исследование рецепции глюкокортикоидов и андрогенов в жировой ткани позволит точнее представить механизмы гормональной регуляции процессов мобилизации липидных источников энергообеспечения мышечной деятельности.

Цель исследования. Целью настоящего исследования явилось изучение влияния физических нагрузок и введения креатина на процессы связывания глюкокортикоидов и андрогенов в жировой ткани крыс. Задачи исследования.

1. Разработать радиолигандный метод определения РГ в цитозолях жировой ткани.

2. Определить специфичность и основные характеристики связывания глюкокортикоидов в жировой ткани.

3. Изучить влияние однократной и систематической физической нагрузки аэробного характера на связывание глюкокортикоидов и андрогенов в цитозолях жировой ткани.

4. Исследовать влияние приёма креатина в период систематических физических нагрузок на процессы связывания глюкокортикоидов в жировой ткани.

Научная новизна и практическая значимость исследования. В настоящее время известна корреляция между плотностью рецепторов стероидных гормонов и аккумуляцией триглицеридов в жировой ткани [Ottosson et al., 1995; Marin et al., 1996]. Механизмы, посредством которых осуществляется липолитическое действие стероидов, продолжаются изучаться, при этом данные о влиянии физических нагрузок на плотность их рецепторов в жировой ткани в литературе отсутствуют.

Выполненная работа имеет экспериментальный характер и позволяет судить об особенностях регуляции процессов специфического связывания стероидов в жировой ткани.

В результате исследования динамики связывания Н

TIIIT pT^TTTITX T/*Atr4'TTÏT/T\/*Tar\r\FTO

ДСК1/атС1алипа ( л v J J UUVJIW ИЛВ^АЦИИ Aupiiinunvpujiu 1J v / \jdiji\J получено представление о протекании рецепторного цикла глюкокортикоидов в жировой ткани.

Впервые показана реакция рецепторного аппарата стероидных гормонов на однократную физическую нагрузку.

Показаны изменения специфического связывания глюкокортикоидов и андрогенов под влиянием систематической физической нагрузки аэробного характера, свидетельствующие об их адаптивном характере и зависимости от особенностей метаболизма жировой ткани.

Впервые показано влияние приёма креатина в период систематических физических нагрузок аэробного характера на процессы связывания глюкокортикоидов, что можно рассматривать как адаптивные изменения, направленные на рациональное и эффективное использование энергетических резервов организма.

В целом, исследование влияния физических нагрузок на процессы связывания глюкокортикоидов и андрогенов в жировой ткани расширяет наши знания о механизмах гормональной регуляции её метаболизма в период повышенной двигательной активности. Предложенный метод определения РГ может быть рекомендован к использованию в лабораторных исследованиях для оценки связывания глюкокортикоидов в жировой ткани. Показанное в работе влияние физических нагрузок на плотность рецепторов стероидных гормонов, а также полученный теоретический материал о протекании рецепторного цикла глюкокортикоидов в жировой ткани могут быть использованы для оптимизации лечения вызванного метаболическими нарушениями ожирения, в частности, при гормональной терапии. Положения выносимые на защиту.

1. Определяемое с помощью разработанного нами метода связывание 3Н-Д в цитозоле подкожной жировой ткани характеризуется высокой специфичностью и имеет рецепторный характер с одним типом связывающих мест. Изучение кинетических характеристик связывания 'Н-Д с РГ свидетельствует о высокой стабильности образующихся гормон-рецепторнх комплексов.

2. Повышение концентрации К в крови, как экзогенное, вызванное инъекцией гормона, так и эндогенное, обусловленное влиянием однократной физической нагрузки, приводит к изменениям специфического связывания глюкокортикоидов в цитозолях жировой ткани, происходящими в противофазе с изменениями в крови концентраций К.

3. Однократная физическая нагрузка вызывает фазовые изменения концентрации РА в цитозолях жировой ткани.

4. Систематическая физическая нагрузка аэробного характера вызывает изменения специфического связывания глюкокортикоидов и андрогенов в цитозолях жировой ткани, которые носят адаптивный характер и обусловлены особенностями метаболизма жировой ткани.

5. Приём креатина в период систематических физических нагрузок аэробного характера оказывает влияние на процессы связывания глюкокортикоидов в подкожной жировой ткани, что в большей степени проявляется на фоне углеводного рациона.

1. Обзор литературы